KR20150059620A - Method for preparing transferrable nanoscale transferrable membrane and use thereof - Google Patents

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Abstract

Disclosed is a method for manufacturing a free-standing transmissive film which comprises a step of spin-coating a polymer in a sealed chamber in which the relative humidity is controlled, and a step of controlling the humidity in the chamber, wherein the humidity control is carried out using at least one supersaturated salt solution and the density of a film hole is adjusted thereby, and has nanoscale hole and thickness by a non-solvent vapor-induced phase separation method. In addition, disclosed are a film manufactured by the method and a use thereof. The film in accordance with the present invention can be usefully used as a co-culture platform which enables various and adjustable cell co-culture analyses to be performed. The co-culture platform in accordance with the present invention can be usefully used in the investigation of important key factors in developing a medicine for diseases as, a qualitative analysis of paracrine communication between cells, i.e. between tumor cells and different stromal cells, is possible by providing an environment similar with an in vivo environment.

Description

나노스케일의 전달가능한 막의 제조방법 및 그 용도 {METHOD FOR PREPARING TRANSFERRABLE NANOSCALE TRANSFERRABLE MEMBRANE AND USE THEREOF}BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention [0001] The present invention relates to a method of manufacturing a nanoscale transferable membrane,

세포간 상호작용 분석이 가능한 세포 배양 기술에 관한 것이다.
And cell culture techniques capable of analyzing intercellular interactions.

조직내의 세포는 생화학적 또는 기계적 자극에 반응하여 주변 세포와 상호작용을 하거나 또는 세포외메트릭스 (extracellular matrices ECM)와 상호작용하여 조직의 기능 및 항상성을 유지한다. 많은 생물학적 시스템에서, 세포는 직접 접촉 (즉 갭연결, 치밀 (tight) 연결) 또는 수용성 인자의 교환 (즉 사이토카인, 케모카인 및 성장인자를 통한 파라크라인 또는 엔도크라인 신호전달)을 통한 간접적 접촉을 통해 상호 소통 (communication) 한다. Cells in tissues interact with surrounding cells in response to biochemical or mechanical stimuli or interact with extracellular matrices (ECM) to maintain tissue function and homeostasis. In many biological systems, the cells are contacted indirectly through direct contact (i.e., gap junctions, tight junctions) or exchange of water soluble factors (i.e., paracrine or endokrin signaling through cytokines, chemokines, and growth factors) To communicate with each other.

예를 들어 암 발생은 암세포와 주변 다양한 스트로마 세포 (예를 들면 섬유모세포, 근모세포, 면역세포, 중간엽줄기세포) 간의 상호 소통의 결과인 것으로 생각된다. 종양 세포는 성장인자의 분비를 통해 그 스트로마 환경을 계속적으로 조절하며, 이로 인해 스트로마 세포가 파라크라인 방식으로 활성화되어 정상적 조직의 항상성을 와해시켜, 결국 추가의 성장인자 분비와 단백질분해효소의 분비로 이어지도록 한다. 활성화된 스트로마 세포는 또한 성장인자 및 ECM의 분해와 재구축에 관여하는 MMP (matrix metalloproteinases)를 분비하여 종양의 전이를 촉진하게 된다. 이러한 관점에서, 종양과 스트로마 간의 상호적 소통은 원발 종양 부위의 부근은 물론 멀리 떨어진 부위까지로 암의 진행을 촉진하게된다. For example, cancer development is thought to be the result of the interaction between cancer cells and various surrounding stromal cells (eg, fibroblasts, myoblasts, immune cells, mesenchymal stem cells). Tumor cells continuously regulate the stroma environment through the secretion of growth factors, which activates the stromal cells in a paracrine manner and breaks down the homeostasis of normal tissue, resulting in additional growth factor secretion and secretion of proteolytic enzymes Respectively. Activated stromal cells also secrete matrix metalloproteinases (MMPs) involved in the degradation and reconstruction of growth factors and ECM, thereby promoting tumor metastasis. From this perspective, mutual communication between tumor and stroma promotes cancer progression not only in the vicinity of the primary tumor site but also in a distant site.

따라서 암의 발생 및 전이와 관련된 심도깊은 연구를 위해서는 암세포 및 스트로마세포 간의 파라크라인 상호작용에 대한 연구가 뒷받침되어야 하며, 이를 체계적으로 분석할 수 있는 세포 공배양 플랫폼의 개발이 요구된다. Therefore, in order to conduct in-depth studies related to the development and metastasis of cancer, studies on paracrine interactions between cancer cells and stromal cells should be supported, and development of a cell culture platform capable of systematic analysis is required.

종전에는 파라크라인 신호전달과 관련된 연구는 주로 상이한 세포간의 간접적 접촉을 매개하는 막으로 분리된 세포 공배양 플랫폼을 이용하여 수행되었다 (Kim, S. et al. A novel culture technique for human embryonic stem cells using porous membranes. Stem Cells 25, 2601-2609 (2007)). Previously, studies involving paracrine signaling were performed using a cell-culture platform separate from the membrane, which mediates indirect contact between different cells (Kim, S. et al.) A novel culture technique for human embryonic stem cells using porous membranes. Stem Cells 25 , 2601-2609 (2007)).

그러나 위와 같은 막 기재의 공배양 시스템의 경우 사이토카인 매개된 세포-세포 상호작용의 분석이 가능하지 않아 관심있는 세포를 인비보와 같은 상황에서 그 기능을 분석할 수 없는 문제점이 있었다 (Karnoub, A. E. et al. Mesenchymal stem cells within tumour stroma promote breast cancer metastasis. Nature 449, 557-U554, (2007)). 이러한 문제점은 주로, 사용된 막 구멍의 밀도가 낮고, 두께가 마이크로미터 단위인 것에 기인하였다. 더구나 두 종류의 상이한 세포주 간의 밀리미터 단위에 달하는 간격은 외부 용액에 의한 사이토카인 및 효소의 희석을 초래하였으며, 불투명한 막은 영상획득 및 특정세포 분석에도 문제점을 초래하였다. However, in the case of the co-culture system of membrane-based materials as described above, analysis of cytokine-mediated cell-cell interaction is not possible, and there is a problem in that the function of the cell of interest can not be analyzed in the context of invivo (Karnoub, AE et al. Mesenchymal stem cells within tumor stroma promote breast cancer metastasis. Nature 449 , 557-U554, (2007)). This problem is mainly due to the low density of the membrane holes used and the thickness in micrometers. Furthermore, the interval in millimeters between the two different cell lines resulted in the dilution of cytokines and enzymes by the external solution, and opaque membranes also caused problems with image acquisition and specific cell analysis.

다른 종래 기술에 의하면 조직 배양 기판위에서 세포를 공배양하여 세포간 직접적 상호작용을 연구하였다 (Wallace, C. S. & Truskey, G. A. Direct-contact co-culture between smooth muscle and endothelial cells inhibits TNF-alpha-mediated endothelial cell activation. Am J Physiol - Heart C 299, H338-H346, (2010)). 이러한 방법은 인비보와 다소 유사한 환경을 제공하기는 하지만, 상호오염의 문제, 다양한 상이한 세포주의 이용, 개별 세포주의 분석 등에 있어서 한계점은 물론, 각 세포주에서 분비되는 총 사이토카인의 양을 구별할 수 없기 때문에 수용성 인자의 상대적 합성량을 평가하기 어렵다는 것이다 (Cenni, E., Perut, F. & Baldini, N. In vitro models for the evaluation of angiogenic potential in bone engineering. Acta Pharmacol Sin 32, 21-30, (2011)). Other prior art techniques have studied cell-to-cell direct interactions by co-culturing cells on tissue culture plates (Wallace, CS & Truskey, GA Direct-contact co-culture between smooth muscle and endothelial cells inhibits TNF-alpha-mediated endothelial cell activation. Am J Physiol - Heart C 299, H338-H346, (2010)). Although this approach provides a somewhat similar environment to that of invivo, it can be used to distinguish the amount of total cytokine secreted from each cell line as well as the limitations of cross-contamination, utilization of different cell lines, analysis of individual cell lines, (Cenni, E., Perut, F. & Baldini, N. In vitro models for the evaluation of angiogenic potential in bone engineering. Acta Pharmacol Sin 32, 21-30 (2011)).

대한민국 등록특허공보 1353633호 (2008년 8월5일 공개)는 세포 배양 방법 및 세포배양 실행 장치에 관한 것으로 배양배지를 순환시키면서 세포를 배양할 수 있는 장치를 개시하고 있다. Korean Patent Registration No. 1353633 (published on Aug. 5, 2008) discloses a cell culture method and a cell culture execution device, which discloses an apparatus capable of culturing cells while circulating the culture medium.

따라서 암의 발생 및 전이 등을 포함하는 다양한 생물학적 현상에서 중요한 역할을 하는 세포간 상호작용에 관한 심도깊은 연구를 위해, 이를 체계적으로 분석할 수 있는 세포 공배양 플랫폼의 개발이 요구된다.
Therefore, for the in-depth study of intercellular interactions, which plays an important role in various biological phenomena including cancer development and metastasis, it is required to develop a cell culture platform capable of systematic analysis.

세포간 직접 및 간접적 상호작용을 체계적으로 분석할 수 있는 세포 공배양 플랫폼을 제공하고자 한다.
A cell culture platform capable of systematically analyzing the direct and indirect interactions between cells.

한 양태에서 본원은 비용제성 증기유도된 상분리 방법에 의한 나노스케일의 구멍 및 두께를 갖는 프리스탠딩의 전달가능한 막의 제조방법을 제공하며, 상기 방법은 상대 습도가 조절되는 폐쇄 챔버에서 폴리머를 스핀 캐스팅하는 단계 및 상기 챔버의 습도를 조절하는 단계를 포함하며, 상기 습도는 적어도 하나의 과포화된 염 용액을 이용하여 수행되며, 이에 의해 상기 막의 구멍의 밀도가 조절된다. In one aspect, the present disclosure provides a method of making a freestanding, transferable membrane having a nanoscale hole and thickness by a non-solvent vapor-induced phase separation method, the method comprising spin casting the polymer in an enclosed chamber with controlled relative humidity And adjusting the humidity of the chamber, wherein the humidity is performed using at least one supersaturated salt solution, whereby the density of the holes in the membrane is controlled.

본원의 방법에서 막의 두께는 스피닝 속도, 과포화된 염의 농도 및 사용되는 폴리머 및 용매간의 용해도 파라미터에 의해 조절된다. 이러한 조건은 상호 연관적으로 작용하여 막의 두께를 결정한다. 일 구현예에서, 500nm 이하의 나노스케일 막의 제조를 위해서는 용액의 농도 약 4 중량% 이하, 스핀속도는 3000 rpm 이상의 조건이 사용된다. The thickness of the membrane in the process of the invention is controlled by the spinning speed, the concentration of the supersaturated salt and the solubility parameter between the polymer used and the solvent used. These conditions interact to determine the thickness of the film. In one embodiment, for the production of a nanoscale film of 500 nm or less, conditions of a solution concentration of about 4 wt% or less and a spin rate of 3000 rpm or more are used.

본원에 따른 방법에 사용될 수 있는 폴리머는 방법에 사용되는 비용제 또는 용제의 유형을 고려하여 결정된다. 사용되는 폴리머의 종류에 따라 용질 흡착, 막의 수성 및 막의 열적 및 화학적 안정성이 결정된다. 비용제성 증기유도된 상분리 방법에서, 폴리머의 종류에 따라 사용될 수 있는 용제 및 비용제가 결정된다. 그리고 용제는 폴리머의 농도와 함께 막의 형성에 있어 중요한 역활을 한다. 이런 관점에서 상기 조건을 만족하는 각각의 특이적 열역학적 특성 및 혼화성을 갖는 다양한 용제, 비용제, 및 용제-비용제 쌍이 사용될 수 있다. 이러한 폴리머의 예로는 이로 제한되는 것은 아니나, 셀룰로스 아세테이트, 폴리설폰, 폴리에테르설폰, 폴리아릴로니트릴, 셀룰로식, 폴리비닐리덴플루오리드, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리이미드 또는 폴리아미드를 포함하나 이로 제한하는 것이다. The polymer which can be used in the process according to the invention is determined in consideration of the type of solvent or agent used in the process. Depending on the type of polymer used, the solute adsorption, the aqueousity of the membrane and the thermal and chemical stability of the membrane are determined. In the cost-stable vapor-induced phase separation method, the solvent and the cost that can be used depend on the kind of the polymer. And the solvent plays an important role in the formation of the film together with the concentration of the polymer. From this point of view, various solvents, costomers, and solvent-cost pairs having respective specific thermodynamic properties and miscibility that satisfy the above conditions can be used. Examples of such polymers include, but are not limited to, cellulose acetate, polysulfone, polyethersulfone, polyarylonitrile, cellulosic, polyvinylidene fluoride, polytetrafluoroethylene, polyimide or polyamide, .

본원에 따른 방법에서 막의 목적하는 구멍크기를 수득하기 위하여, 상대습도가 조절된다. 상대습도는 염을 사용하여 조절될 수 있고, 이러한 상대습도에 의해 구멍의 크기가 조절되며, 이 경우 물이 비용제로 사용된다. 예를 들면 상대습도의 조절을 위해, 상이한 종류의 과포화 염 용액이 사용되며, 이는 수화 정도가 염의 종류에 따라 다르기 때문이다. 일 구현예에서, 과포화된 염은 LiCl, CaCl2, MgCl2, KCO3, NaBr, NaCl, 또는 KCl을 포함하며, 상기 염은 각각 실온에서 11, 29, 33, 43, 57, 75, 또는 85 % RH의 수득에 사용된다. 일 구현예에서, 본 방법에는 하나 이상의 염이 사용되며, 이러한 염은 CaCl2 및 KCl 이며, 상대습도는 25%부터 85%까지 점진적으로 또는 단계적으로 증가되며, CaCl2 는 상기 상대습도가 25-45% 인 경우에 사용되며, 상기 KCl은 상기 상대습도가 55-85% 인 경우에 사용된다. 일 구현예에서, 상기 상대 습도는 25, 35, 45, 55, 65, 75 및 85%로 단계적으로 증가된다. In order to obtain the desired pore size of the membrane in the process according to the invention, the relative humidity is controlled. The relative humidity can be controlled using a salt, and the relative humidity is used to control the size of the pores, in which case water is used as a cost-reducing agent. For example, to adjust the relative humidity, different types of supersaturated salt solutions are used, since the degree of hydration varies with the type of salt. In one implementation, the supersaturated salt is LiCl, CaCl 2, MgCl 2, KCO 3, NaBr, NaCl, or comprises KCl, the salts at room temperature, respectively 11, 29, 33, 43, 57, 75, or 85 % RH. ≪ / RTI > In one embodiment, the method uses one or more salts, wherein the salts are CaCl 2 and KCl, the relative humidity is increased gradually or stepwise from 25% to 85%, CaCl 2 is greater than 25- 45%, and the KCl is used when the relative humidity is 55-85%. In one embodiment, the relative humidity is increased stepwise to 25, 35, 45, 55, 65, 75 and 85%.

본원에 따른 방법에서 상기 상대습도는 실온 (RT) 또는 30℃에서 조절된다. In the process according to the invention, the relative humidity is adjusted at room temperature (RT) or at 30 占 폚.

다른 측면에서 본원에 따른 방법에 의해 제조된 나노스케일의 관통하는 다수의 구멍을 포함하며 두께가 500 nm 이하인 하나 이상의 프리스탠딩 나노스케일 막 및 상기 막에 의해 분리되는 제1 및 제2 챔버를 포함하는 세포배양 장치를 제공한다. Comprising at least one freestanding nanoscale membrane having a plurality of nanoscale through holes formed by the method according to the invention and having a thickness of 500 nm or less and first and second chambers separated by the membrane Thereby providing a cell culture apparatus.

일 구현예에서 본원에 따른 장치에 포함되는 상기 제1 및 제2 챔버는 상기 나노스케일 막의 관통하는 다수의 구멍을 통해 소통가능하다. 다른 구현예에서, 상기 제1 및 제2 챔버는 세포 배양 배지를 포함하며, 상기 제1 챔버는 제1 세포를 포함하며, 상기 제2 챔버는 제2 세포를 포함할 수 있으며, 상기 제1 및 제2 세포는 동일하거나 상이할 수 있으며, 상기 제1 또는 제2 세포는 각각 한 종류의 세포로 구성되거나 또는 제1 세포 및 제2 세포 중 하나 이상은 두 종류 이상의 세포가 혼합된 것일 수 있다. In one embodiment, the first and second chambers included in the device according to the present invention are communicable through a plurality of through-holes of the nanoscale membrane. In another embodiment, the first and second chambers comprise a cell culture medium, wherein the first chamber comprises a first cell and the second chamber comprises a second cell, The second cells may be the same or different, and each of the first and second cells may be composed of one kind of cells, or one or more of the first and second cells may be a mixture of two or more kinds of cells.

본원에 따른 장치는 제1 챔버 및 상기 제2 챔버 사이에 하나 이상의 중간 챔버 (intermediate chamber)를 포함하며, 상기 중간 챔버는 상기 제1 및 상기 제2 챔버 각각과 나노스케일 막에 의해 분리된다. An apparatus according to the present invention comprises at least one intermediate chamber between a first chamber and a second chamber, said intermediate chamber separated by a respective one of said first and second chambers and a nanoscale membrane.

일 구현예에서 본원에 장치에서 상기 중간 챔버는 두 개 내지 열 개를 포함할 수 있다. In one embodiment, in the apparatus herein, the intermediate chamber may comprise from two to ten.

다른 구현예에서, 상기 제1, 제2 및 중간 챔버는 세포 배양 배지를 포함하며, 상기 적어도 하나의 챔버는 동일 또는 상이한 세포 또는 상이한 세포의 혼합물을 포함한다. In another embodiment, the first, second and intermediate chambers comprise a cell culture medium, wherein the at least one chamber comprises the same or a different cell or a mixture of different cells.

다른 구현예에서, 본원의 장치에 포함되는 나노스케일 막의 구멍 밀도는 제곱 센티미터 당 105 내지 106 이다. In another embodiment, the pore density of the nanoscale membrane included in the apparatus is from 10 5 to 10 6 per square centimeter.

다른 구현예에서, 본원의 장치에 포함되는 나노스케일 막의 구멍의 평균 크기는 50 내지 100nm이다. In other embodiments, the average size of the pores of the nanoscale membrane included in the apparatus is from 50 to 100 nm.

다른 측면에서 본원은 또한 두 종류 이상 세포의 공배양 방법으로, 상기 방법은 두 개 이상의 챔버를 포함하는 본원에 따른 방법에 의해 제조된 나노스케일 막을 제공하는 단계, 상기 나노스케일 막이 두 개 이상 포함되는 경우, 상기 막은 위아래 또는 좌우 방향으로 층으로 배열되고, 상기 각 막에 세포를 씨딩하는 단계, 상기 각 막에 씨딩되는 세포는 동일 또는 상이한 종류이거나, 두 종류 이상의 세포의 혼합 세포이고, 그리고, 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하며, 상기 세포는 상기 막의 구멍을 통해 서로 소통가능한 것이다. In another aspect, the invention also provides a method for co-culturing more than two types of cells, the method comprising: providing a nanoscale membrane made by the method according to the present invention comprising two or more chambers; The membrane is arranged in layers in an up-and-down direction or a left-to-right direction, and the cells are seeded in the respective membranes, the cells to be seeded in the respective membranes are the same or different kinds, or mixed cells of two or more kinds of cells, Culturing the cells, wherein the cells are capable of communicating with each other through the pores of the membrane.

일 구현예에서, 배양 중 세포는 치밀연결 또는 갭연결을 포함하는 직접 접촉에 의한 소통, 또는 파라크라인 또는 엔도크라인 신호전달을 포함하는 가용성 인자의 교환에 의한 간접 소통을 통해 소통한다. In one embodiment, the cells during culture communicate through indirect contact by direct contact, including dense or gap connections, or by exchange of soluble factors, including paracrine or endocrin signaling.

일 구현예에서, 본원에 따른 방법에 의해 배양가능한 세포는 동물, 식물, 박테리아 진균류, 이스트 또는 조류 (algae)유래이다. 일 구현예에서 세포는 암세포 또는 스트로마 세포이며, 암세포 및 스트로마 세포는 상이한 막에 씨딩된다. In one embodiment, the cells that can be cultured by the method according to the present invention are derived from an animal, a plant, a bacterial fungus, an yeast or an algae. In one embodiment, the cells are cancer cells or stromal cells, and the cancer cells and stromal cells are seeded in different membranes.

일 구현예에서, 막의 상대적 위치는 변할 수 있거나, 또는 상기 막 중의 적어도 하나는 새로운 막으로 대체될 수 있으며, 상기 새로운 막은 이미 존재하는 막에 씨딩된 세포와 동일 또는 상이한 것일 수 있다. In one embodiment, the relative position of the membrane may be varied, or at least one of the membranes may be replaced by a new membrane, and the new membrane may be the same or different from the cells seeded in an existing membrane.

다른 측면에서 본원은 또한 본원에 따른 방법에 의해 제조된 막, 하나 이상의 세포배양 배지, 하나 이상의 세포 주 및 상기 세포를 공배양하는 안내서를 포함하는 세포 공배양 키트를 제공한다. In another aspect, the disclosure also provides a cell co-culture kit comprising a membrane produced by the method according to the invention, one or more cell culture medium, one or more cell lines, and a guide for co-culturing the cells.

본원에 따른 방법은 프리스탠딩이 가능한 투명한 나노구멍크기를 갖는 전달가능한 막 (Transparent, Nanoporous, Transferrable, TNT)의 제조가 가능하다. 본원에 따른 방법에 의해 제조된 막은 다양하며 조절가능한 세포 공배양 분석을 가능하게 하는 공배양 플랫폼으로 유용하게 사용될 수 있다. 본원에 따른 공배양 플랫폼은 인비보와 유사한 환경을 제공하여 세포간 예를 들면 암세포 및 상이한 스트로마 세포간의 파라크라인 소통의 정성적 분석이 가능하여, 질환의 치료제 개발에 중요한 주요 인자의 규명에 유용하게 사용될 수 있다. The method according to the present invention makes it possible to manufacture transparent, nanoporous, transferrable, TNT with transparent nano-hole size that can be freestanding. Membranes prepared by the method according to the present invention can be usefully used as a co-cultivation platform that allows for various and adjustable cell co-culture assays. The co-cultivation platform according to the present invention provides an environment similar to that of the invivo, enabling qualitative analysis of paracrine communication between cells, for example, cancer cells and different stromal cells, and is useful for identifying important factors in the development of therapeutic agents for diseases Lt; / RTI >

또한 본원에 따른 막 또는 막을 포함하는 장치는 상이한 종류의 세포를 동시에 공배양하여 관심있는 특정 세포를 분석할 수 있는 수단을 제공한다. 또한 본원의 TNT 막은 아래 위 또는 좌우의 층으로 배열되어 다양한 세포 분석 및 조직 공학 등의 응용분야에 사용될 수 있다. 예를 들면 줄기세포의 분화, 신경시스템에서의 세포간 소통을 막 구멍의 밀도 및/또는 크기는 물론 함께 배양되는 다른 세포의 종류, 또는 세포의 순서를 세밀하게 조절하면서 분석할 수 있다.
Also, an apparatus comprising a membrane or membrane according to the present invention provides a means for simultaneously co-culturing different types of cells to analyze specific cells of interest. In addition, the TNT membrane of the present invention can be arranged in the lower or left and right layers and can be used for various cell analysis and tissue engineering applications. For example, stem cell differentiation, cell-to-cell communication in the nervous system can be analyzed while fine-tuning the density and / or size of membrane pores as well as the type of other cells to be cultured, or the sequence of cells.

본원에 따른 세포배양 장치는 교차 오염 없이, 다양한 세포를 이용하여 간편하게 세포간 간접적 및/또는 직접적 접촉을 통한 소통 (communication)이 가능한 세포 배양에 유용하게 사용되어 세포간 상호작용을 통한 다양한 생물학적 현상의 규명에 유용하게 사용될 수 있다. The cell culture apparatus according to the present invention is useful for cell culture that can communicate easily through intercellular indirect and / or direct contact using various cells without cross-contamination, and can be used for various biological phenomena It can be useful for identification.

나아가 본원에 따른 공배양 방법 및 장치는 세포간 소통을 통해 세포의 특정 표현형, 특징을 결정짓는 사이토카인과 같은 주요 인자의 규명에 유용하게 사용될 수 있다. Further, the co-culturing method and apparatus according to the present invention can be useful for identification of major factors such as cytokines that determine specific phenotypes and characteristics of cells through intercellular communication.

또한 본원에 따른 장치 및 막은 TNT 막을 이용한 공배양을 통해 두 종류 이상의 세포를 동시에 배양하여, 함께 존재하는 세포를 인비보에서와 같이 관찰에 유용하게 사용될 수 있다. Also, the device and membrane according to the present invention can be used to coexist two or more types of cells simultaneously by co-culturing using TNT membrane, and to observe coexisting cells as in the case of invivo.

또한 본원에 따른 방법을 이용한 TNT membrane sequential co-culture 방법 은 암세포 진행 연구에 사용될 수 있으며, 신호전달 분자의 스크리닝을 통해 암치료제 표적 분자의 발굴에 유용하게 사용될 수 있으며, 또한 세포를 포함하는 주변인자의 연속적 변화를 통해 줄기세포의 분화 조절 연구에도 유용하게 사용될 수 있다. In addition, the TNT membrane sequential co-culture method using the method according to the present invention can be used for the study of cancer cell progression, and can be useful for the screening of signal transduction molecules to be useful for the discovery of target molecules for cancer therapy, , Which can be used to study the regulation of differentiation of stem cells.

본원에 따른 TNT를 포함하는 세포배양 플랫폼은 세포의 층쌓기 및 층분리가 용이하여, 세포 공배양을 통해 편리하고, 간편하며, 저렴하게 세포간 소통의 상세한 분석에 유용하게 사용될 수 있다.
The cell culture platform including TNT according to the present invention can be conveniently used for detailed analysis of intracellular communication through convenient and simple and inexpensive cell co-cultivation by facilitating layering and layer separation of cells.

도 1a는 비용제성 (물) 증기 유도된 상분리 (VIPS)를 이용하여, 왼편에 기재된 상대적 습도가 조절되는 폐쇄 스핀 코팅 챔버에서 제조된 나노구멍의 프리스탠딩 CA 막의 제조과정을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 1b는 공기 쪽 면 (a), 기질 쪽 면 (b)의 AFM 영상과 공기 쪽 면의 공기 (c) 및 물 (d)과 접촉한 면의 AFM 영상이다.
도 2a는 본원의 방법에 따라 제조된 TNT 막의 특징을 규명한 것으로, 투명성, 나노스케일의 구멍, 및 수성 환경에서 초박의 TNT 막의 전달성을 보여준다.
도 2b는 본원에 따른 막을 이용하여 파라크라인 신호전달 분석을 위한 MDA-MB-231 및 hMSC의 공배양을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2c는 상이한 RH 조건 (45, 65, 및 85 %)에서 4 중량%의 아세톤 CA용액으로 제조된 TNT 막의 AFM 영상이다. TNT 막에서 구멍의 크기 및 수는 RH로 조절하였으며, 스케일바는 500nm이다.
도 2d는 MDA-MB-231 및 hMSC 간의 사이토카인 매개된 소통에 의해 야기된 RANTES 발현에 미치는 구멍크기의 영향을 나타낸 결과이다.
도 2e는 비용제 액체 유도된 상분리 (LIPS)에 의해 제조된 마이크로포러스의 10 μm 두께의 CA 막의 SEM 영상이다.
도 2f는 막의 두께가 RANTES 발현에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 3a 내지 도 3e는 TNT 막을 층으로 배열하여 이를 암세포와 스트로마 세포간 파라크라인 소통 또는 신호전달 분석에 이용한 것과 관련된 것이다.
도 3a는 TNT 막을 층으로 배열하여 사용하는 세포배양 방법을 사용하여 MDA-MB-231 및 세 종류의 상이한 스트로마 세포를 공배양하는 것을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 3b는 루미네슨스 기재 방법을 이용한 사이토카인 분석 결과로, 이 결과는 MDA-MB-231 세포 (M)와 상이한 세 종류의 세포 [hMSC (H), NIH-3T3 (N) 및 C2C12 (C), 각각 MH, MN 로 MC 칭함]를 이틀간 공배양 후, 이의 세포배양 배지로부터 수득한 것이며, 결과는 다수의 독립적인 실험결과이며, means ± standard deviation. (*; P <0.05, ***; P< 0.01)로 나타냈다.
도 3c는 트랜스웰 시스템을 이용한 M의 이동 분석결과로, 560nm에서의 흡광도(O.D)가 이동의 정도를 나타내고, 아래 젤 사진은 M의 비교 침투성 분석을 위한 젤라틴 자이모그래피 결과로, 밴드의 강도는 활성 MMP의 활성정도를 나타낸다.
도 3d는 콘포칼 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM)을 이용하여 수득한 상이한 두 종류의 세포주(N: Green 및 M: Red)를 포함하는 다중으로 쌓인 TNT 막의 형광 영상을 나타내고 TNT 상의 세포의 DIC 영상은 광학현미경으로 수득하였다.
도 3e는 TNT 막을 이용하여 다층으로 배열된 세 종류의 상이한 세포주 배양 후 사이토카인 분석 결과를 나타낸다.
도 4a 및 도 4b는 MDA-MB-231 (a) 및 hMSC (b)세포간의 갭연결을 칼세인 AM 염색으로 관찰한 결과이다. 칼세인 AM은 갭연결을 통해서만 전달 될 수 있는 것으로, 갭연결을 통한 직접적 소통이 가능하면, 세포간 물리적 접촉은 없음을 나타낸다.
도 5a 내지 도 5d는 TNT 막을 통한 단백질 확산 결과를 나타낸다.
도 5a는 나노스케일 TNT 막의 두께가 MDA-MB-231 및 hMSC 간의 파라크라인 소통에 의해 촉발된 RNATES 발현/분비에 미치는 영향을 나타낸다.
도 5b는 세포간의 거리가 RNATES 분비에 미치는 영향을 나타낸다.
도 5c는 TNT 막의 나노스케일 구멍을 통한 단백질의 확산을 나타낸다. 삽입도면은 TNT 막을 통한 모델단백질로 EGF의 확산을 측정하는 실험장치를 도식적으로 나타낸다.
도 5d는 모델단백질로 EGF 단백질을 이용하여 TNT 막의 층의 갯수에 따른 단백질 확산 정도를 나타내는 결과이다.
도 6a 및 6b는 TNT 막을 이용하여 연속적 세포 전달 및 셔플링 분석 (TNT-CTS, cell transfer and shuffling) 결과이다.
도 6a는 암 전이 (metastasis) 및 전이-모방 TNT-CTS 분석을 도식적으로 나타낸 것으로, M을 포함하는 TNT 막은 스트로마 세포 (H, N 또는 C)와 배양된 후에 스트로마 세포를 포함하는 다른 TNT 막층으로 전달되었다.
도 6b는 M 과 하룻동안 공배양된, 스트로마 세포 시스템을 이용한 사이토카인 분석 결과로, H (적색)로 미리 활성화된 M을 N (노란색) 또는 C (청색)으로 옮긴 경우의 결과이다.
도 6c는 N (노란색)로 미리 활성화된 M을 H (적색) 또는 C (청색)으로 옮긴 경우의 결과이다.
도 6d는 C (청색)로 미리 활성화된 M을 H (적색) 또는 N (노란색)으로 옮긴 경우의 결과이다.
도 7a 내지 도 7e는 본원에 따른 막을 포함하는 다양한 장치를 나타낸다. FIG. 1A schematically illustrates the fabrication process of a free standing CA film of a nano-hole fabricated in a closed spin coating chamber in which the relative humidity is controlled as described on the left, using non-volatile (water) vapor induced phase separation (VIPS).
1B is an AFM image of the AFM image of the air side surface (a) and the substrate side surface (b), and the surface of the air side (c) and the surface of the air side in contact with the water (d).
Figure 2a shows the characterization of TNT membranes prepared according to the process of the present invention, showing transparency, nanoscale pores, and the transfer of ultra-thin TNT membranes in an aqueous environment.
Figure 2b is a schematic representation of the co-culture of MDA-MB-231 and hMSC for paracrine signaling assay using membranes according to the present invention.
Figure 2C is an AFM image of a TNT film made with 4 wt% acetone CA solution at different RH conditions (45, 65, and 85%). The size and number of pores in the TNT membrane were controlled by RH and the scale bar was 500 nm.
Figure 2d shows the effect of pore size on RANTES expression caused by cytokine mediated communication between MDA-MB-231 and hMSC.
Figure 2e is a SEM image of a 10 占 퐉 thick CA membrane of microporous prepared by costless liquid induced phase separation (LIPS).
Figure 2f shows the effect of membrane thickness on RANTES expression.
Figures 3A-3E relate to arranging the TNT membrane in layers and using it in cancer cell and stromal cell paracrine communication or signal transduction assays.
3A schematically shows the co-culture of MDA-MB-231 and three different stromal cells using a cell culture method using TNT membranes arranged in layers.
3B shows the result of cytokine analysis using the luminescence-based method. This result shows that three kinds of cells (hMSC (H), NIH-3T3 (N) and C2C12 (C) different from MDA-MB- ), MH and MN, respectively] were co-cultured for two days and then obtained from the cell culture medium thereof. The results are the results of several independent experiments, and mean ± standard deviation. (*; P <0.05, ***; P <0.01).
FIG. 3C shows the results of the migration analysis of M using the transwell system. The absorbance (OD) at 560 nm shows the degree of migration, and the lower gel photograph shows the result of gelatin zymography for the comparative permeability analysis of M, Indicates the degree of activity of the active MMP.
FIG. 3D shows fluorescence images of multi-deposited TNT membranes containing two different cell lines (N: Green and M: Red) obtained using a conforma laser scanning microscope (CLSM), and DIC images of TNT- Obtained by microscope.
Figure 3E shows cytokine assay results after culturing three different cell lines arranged in multiple layers using TNT membranes.
4A and 4B show the results of observation of the gap junction between MDA-MB-231 (a) and hMSC (b) cells by Carl Zeiss AM staining. Calcine AM can be delivered only through a gap connection, indicating that no direct intercellular physical contact is possible through the gap connection.
Figures 5A-5D show the results of protein diffusion through the TNT membrane.
Figure 5a shows the effect of thickness of nanoscale TNT membrane on RNATES expression / secretion induced by paracrine interaction between MDA-MB-231 and hMSC.
Figure 5b shows the effect of intercellular distance on the secretion of RNates.
Figure 5c shows the diffusion of the protein through nanoscale holes in the TNT membrane. The inset shows diagrammatically an experimental device for measuring the diffusion of EGF into a model protein through a TNT membrane.
FIG. 5D shows the degree of protein diffusion according to the number of layers of TNT membrane using EGF protein as a model protein.
6A and 6B are the results of continuous cell transfer and shuffling analysis (TNT-CTS) using a TNT membrane.
Figure 6a schematically depicts metastasis and metastasis-mimetic TNT-CTS analysis, wherein the TNT membrane containing M is incubated with stromal cells (H, N or C) and then into another TNT membrane layer containing stromal cells .
FIG. 6B shows the result of cytokine analysis using a stromal cell system co-cultured with M for one day, in which M previously activated with H (red) was transferred to N (yellow) or C (blue).
FIG. 6C shows the result when M previously activated with N (yellow) is shifted to H (red) or C (blue).
FIG. 6D shows the result when M previously activated in C (blue) is shifted to H (red) or N (yellow).
Figures 7A-7E show various devices including membranes according to the present invention.

한 양태에서 본원은 비용제성 증기유도된 상분리 방법에 의한 나노스케일의 구멍 및 두께를 갖는 프리스탠딩의 전달가능한 막의 제조방법 및 이에 의해 제조된 막에 관한 것이다.In one aspect, the present disclosure relates to a process for the preparation of a free-standing transferable membrane having nanoscale holes and thicknesses by a cost-stable vapor-induced phase separation method and a membrane produced thereby.

본원에 따른 방법은 상대 습도가 조절되는 폐쇄 챔버에서 폴리머를 스핀 캐스팅하는 단계; 및 적어도 하나의 과포화된 염 용액을 이용하여 상기 챔버의 습도를 조절하는 단계를 포함하며, 이에 의해 상기 막의 구멍 크기가 조절된다. The method according to the present invention comprises spin casting a polymer in an enclosed chamber in which relative humidity is controlled; And adjusting the humidity of the chamber using at least one supersaturated salt solution, whereby the pore size of the membrane is controlled.

본원에 따른 방법에 의해 제조된 막은 투명하고, 관통하는 나노크기의 구멍을 가지며, 전달가능한 막으로, 두께는 500nm 이하이며, 후술하는 바와 같이 관통하는 나노크기의 구멍을 통해 막에서 배양되는 세포간 소통이 가능하다. 또한 본원의 방법에 따라 제조된 막은 프리스탠딩이 가능하여 지지체와 같은 별도의 기판이 필요하지 않아, 층배열 및 층분리가 용이하다. The membranes prepared by the process according to the present invention are transparent, have penetrating nano-sized pores, and are transmissible membranes, having a thickness of 500 nm or less, and are intercellularly cultured in membranes through nano- Communication is possible. Also, the film produced according to the method of the present invention can be freestanded, and a separate substrate such as a support is not required, so that layer arrangement and layer separation are easy.

비용제성 증기유도된 상분리 방법에 관한 일반적인 사항은 Guillen, Y. Pan, M. Li, and E. M. V. Hoek, Preparation and Characterization of Membranes Formed by Nonsolvent Induced Phase Separation: A Review, Ind . Eng . Chem . Res . 2011, 50, 3798-3817에 기재된 것을 참조할 수 있다. General Considerations on Non-Cost Steam-Induced Phase Separation Methods, Guillen, Y. Pan, M. Li, and EMV Hoek, Preparation and Characterization of Membranes Formed by Nonsolvent Induced Phase Separation: A Review, Ind . Eng . Chem . Res . 2011, 50, 3798-3817.

본원에 따른 방법에서 막의 두께는 스피닝 속도, 과포화된 염의 농도 및 사용되는 폴리머 및/또는 용매간의 용해도 파라미터에 의해 조절된다. 이러한 조건은 상호 연관적으로 작용하여 막의 두께를 결정한다. 일 구현예에서, 500nm 이하의 나노스케일 막의 제조를 위해서는 용액의 농도 약 4 중량% 이하, 스핀속도는 3000 rpm 이상이의 조건이 사용된다. The thickness of the membrane in the process according to the invention is controlled by the spinning speed, the concentration of the supersaturated salt and the solubility parameter between the polymer and / or solvent used. These conditions interact to determine the thickness of the film. In one embodiment, for the preparation of nanoscale membranes of 500 nm or less, a concentration of solution of about 4 wt% or less and a spin rate of at least 3000 rpm is used.

본원의 방법에 따라 제조되는 나노스케일 막은 막이 사용되는 구체적 목적에 맞추어 적합하게 제작될 수 있다. 예를 들면 막을 통한 세포간 소통이 가능한 막을 그 두께, 구멍의 크기 및 개수 (밀도)의 조절을 통해 적합한 막을 제조할 수 있다. 일 구현예에서, 본원의 방법에서 막은 약 500nm 이하로 제조되며, 예를 들면 490nm 이하, 또는 480nm 이하 또는 470nm 이하로 제조될 수 있다. The nanoscale membranes prepared according to the methods herein may be suitably tailored to the specific purpose for which they are to be used. For example, a membrane capable of intercellular communication through a membrane can be prepared by adjusting its thickness, hole size and number (density). In one embodiment, the membranes in the process of the present invention are made up to about 500 nm, for example less than or equal to 490 nm, or less than or equal to 480 nm, or less than or equal to 470 nm.

본원에 따른 방법에 사용되는 폴리머는 사용되는 용제 또는 비용제의 종류를 고려하여 선택된다. 폴리머는 생적합성 유기성 폴리머로, 낮은 정전하, 높은 기계적 강도, 및/또는 미세구조의 조절이 쉬운 물성을 갖는 물질이다. 사용되는 폴리머의 종류에는 사용되는 폴리머의 종류에 따라 용질 흡착, 막의 수성 및 막의 열적 및 화학적 안정성이 결정된다. 비용제성 증기유도된 상분리 방법에서, 폴리머의 종류에 따라 사용될 수 있는 용제 및 비용제가 결정된다. 그리고 용제는 폴리머의 농도와 함께 막의 형성에 있어 중요한 역활을 한다. 이런 관점에서 상기 조건을 만족하는 각각의 특이적 열역학적 특성 및 혼화성을 갖는 다양한 용제, 비용제, 및 용제-비용제 쌍이 사용될 수 있다. 이러한 폴리머의 예로는 이로 제한되는 것은 아니나, 셀룰로스 아세테이트, 폴리설폰, 폴리에테르설폰, 폴리아릴로니트릴, 셀룰로식, 폴리비닐리덴플루오리드, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리이미드 또는 폴리아미드를 포함하나 이로 제한하는 것이다. The polymers used in the process according to the invention are chosen in consideration of the type of solvent or cost agent used. Polymers are biocompatible organic polymers, materials with low electrostatic charge, high mechanical strength, and / or ease of control of microstructure. Depending on the type of polymer used, the type of polymer used determines the solute adsorption, the aqueousity of the membrane, and the thermal and chemical stability of the membrane. In the cost-stable vapor-induced phase separation method, the solvent and the cost that can be used depend on the kind of the polymer. And the solvent plays an important role in the formation of the film together with the concentration of the polymer. From this point of view, various solvents, costomers, and solvent-cost pairs having respective specific thermodynamic properties and miscibility that satisfy the above conditions can be used. Examples of such polymers include, but are not limited to, cellulose acetate, polysulfone, polyethersulfone, polyarylonitrile, cellulosic, polyvinylidene fluoride, polytetrafluoroethylene, polyimide or polyamide, .

본원에 따른 방법에서 막의 목적하는 구멍크기 및/또는 밀도를 수득하기 위하여, 상대습도가 조절될 수 있다. 상대습도는 과포화염을 사용하여 조절될 수 있고, 이러한 상대습도에 의해 구멍의 크기가 조절되며, 이 경우 물이 비용제로 사용된다. 예를 들면 상대습도의 조절을 위해, 상이한 종류의 과포화 염 용액이 사용되며, 이는 수화 정도가 염의 종류에 따라 다르기 때문이다. 일 구현예에서, 과포화된 염은 LiCl, CaCl2, MgCl2, KCO3, NaBr, NaCl, 또는 KCl을 포함하며, 상기 염은 각각 실온에서 11, 29, 33, 43, 57, 75, 또는 85 % RH의 수득에 사용된다. 일 구현예에서, 본 방법에는 하나 이상의 염이 사용되며, 이러한 염은 CaCl2 및 KCl 이며, 상대습도는 25%부터 85%까지 점진적으로 또는 단계적으로 증가되며, CaCl2는 상기 상대습도가 25-45% 인 경우에 사용되며, 상기 KCl은 상기 상대습도가 55-85% 인 경우에 사용된다. 일 구현예에서, 상기 상대 습도는 25, 35, 45, 55, 65, 75 및 85%로 단계적으로 증가된다. In order to obtain the desired pore size and / or density of the membrane in the process according to the invention, the relative humidity can be controlled. The relative humidity can be controlled using supersaturated salts, and the relative humidity is used to control the size of the pores, in which case water is used as a cost-reducing agent. For example, to adjust the relative humidity, different types of supersaturated salt solutions are used, since the degree of hydration varies with the type of salt. In one implementation, the supersaturated salt is LiCl, CaCl 2, MgCl 2, KCO 3, NaBr, NaCl, or comprises KCl, the salts at room temperature, respectively 11, 29, 33, 43, 57, 75, or 85 % RH. &Lt; / RTI &gt; In one embodiment, the method uses one or more salts, wherein the salts are CaCl 2 and KCl, the relative humidity is increased gradually or stepwise from 25% to 85%, CaCl 2 is greater than 25- 45%, and the KCl is used when the relative humidity is 55-85%. In one embodiment, the relative humidity is increased stepwise to 25, 35, 45, 55, 65, 75 and 85%.

본원에 따른 일 구현예에서는 본원에 따른 실시예에 기재된 바와 같이 유기성 폴리머로서, 셀룰로스아세테이트를 사용한 비용제성 유도된 상분리 방법 및 상대 습도 (RH) 조절을 통해 목적하는 막의 다공성 구조를 수득하였으며, 구체적으로 상이한 종류의 과포화 염 용액으로 패킹된 폐쇄 챔버에서 수증기를 이용하여 상대습도를 조절하여 구멍의 크기를 조절하였다. In one embodiment according to the present disclosure, a porous structure of the desired membrane is obtained by way of a non-solvent-derived phase separation method and relative humidity (RH) control using cellulose acetate as an organic polymer as described in the examples according to the present application, In a closed chamber packed with different types of supersaturated salt solutions, the size of the pores was controlled by adjusting the relative humidity using water vapor.

본원에 따른 방법에서, 막의 구멍의 크기 및 밀도는 본원에 개시된 내용을 기초로 막이 사용되는 구체적 목적에 맞추어 제조될 수 있다. 일구현예에서는 막의 구멍의 크기는 약 100nm 내지 500nm이다. 막의 크기는 막에서 배양되는 세포의 종류 및 분석하고자 하는 상호작용의 종류에 따라 상이할 수 있다. 예를 들면 세포간 생화학 물질의 전달을 포함하는 파라크라인 신호전달의 경우, 400nm 미만의 구멍 크기가 바람직하고, 세포간 직접 접촉에 상호작용 분석이 필요한 경우에는 적어도 400nm 구멍크기가 바람직하다. In the process according to the present application, the size and density of the pores of the membrane can be tailored to the specific purpose for which the membrane is used based on the disclosure herein. In one embodiment, the pore size of the membrane is about 100 nm to 500 nm. The size of the membrane may differ depending on the type of cell cultured in the membrane and the type of interaction to be analyzed. For example, in the case of paracrine signaling involving the delivery of intercellular biochemicals, a pore size of less than 400 nm is preferred and a pore size of at least 400 nm is preferred if interaction analysis is required for intracellular direct contact.

본원에 따른 나노스케일 막의 구멍의 밀도 또한 구체적 목적에 적합하도록 제작된 것이 사용될 수 있다. 본원에 따른 일 구현예에서는 고밀도의 막이 사용되며 예를 들면 제곱 cm 당 약 106 내지 약 1012 의 밀도가 사용될 수 있다. 특히 제곱 cm 당 약 105 내지 약 106 의 밀도가 사용될 수 있다.
The density of the pores of the nanoscale membrane according to the present invention may also be prepared so as to be suitable for a specific purpose. In one embodiment according to the present invention, a dense film is used, for example, a density of from about 10 6 to about 10 12 per square cm can be used. In particular from about 10 &lt; 5 &gt; to about 10 &lt; 6 &gt; per square cm can be used.

다른 측면에서 본원에 따른 방법에 의해 제조된 나노스케일의 관통하는 다수의 구멍을 포함하며 두께가 500 nm 이하인 하나 이상의 프리스탠딩 나노스케일 막 및 상기 막에 의해 분리되는 제1 및 제2 챔버를 포함하는 세포배양 장치를 제공한다. Comprising at least one freestanding nanoscale membrane having a plurality of nanoscale through holes formed by the method according to the invention and having a thickness of 500 nm or less and first and second chambers separated by the membrane Thereby providing a cell culture apparatus.

일 구현예에서 본원에 따른 장치에 포함되는 상기 제1 및 제2 챔버는 상기 나노스케일 막의 관통하는 다수의 구멍을 통해 소통가능하다. In one embodiment, the first and second chambers included in the device according to the present invention are communicable through a plurality of through-holes of the nanoscale membrane.

본원에서 세포간 소통이란, 직/간접적 소통을 포함하는 것으로, 직접적 세포간 소통은 갭연결 (Gap junction), 치밀 연결 (tight junction)을 통한 물질 교환 등을 포함하는 세포간 소통이며, 간접적 소통은 분비되는 사이토카인, 케모카인 및/또는 성장인자 등을 포함하는 수용성 인자의 교환 통한 파라크라인 또는 엔도크라인 신호전달을 통한 소통을 의미한다. Intercellular communication in this context includes direct / indirect communication. Direct intercellular communication is intercellular communication including gap junction, mass exchange through tight junction, and indirect communication. Quot; refers to communication through paracrine or endocrin signaling through the exchange of soluble factors, including secreted cytokines, chemokines, and / or growth factors, and the like.

본원의 방법에 따라 제조된 막은 본원에 따른 장치가 사용되는 구체적 목적에 적합한 성능 개선을 위해 양쪽 또는 한쪽 표면 및/또는 구멍에 추가의 물질을 포함하도록 변형되거나 또는 코팅될 수 있다. 예를 들면 본원에 따른 일 구현예에서는 세포 부착을 향상시키기 위하여 코팅될 수 있으며, 예를 들면 폴리도파민을 사용할 수 있으며, 기타 Ku, S. H., et al., General functionalization route for cell adhesion on non-wetting surfaces. Biomaterials 31, 2535-2541 (2010))을 참조할 수 있다. 다른 구현예에서는 다양한 생물학적 제제 예를 들면 수용체, 항체, 리간드 또는 세포 표면에 존재하는 물질과 상호작용할 수 있는 저분자, 고분자 화합물 등으로 변형될 수 있다. Membranes prepared according to the process of the present application may be modified or coated to include additional materials on both or one of the surfaces and / or pores for improved performance suited to the specific purpose for which the device according to the invention is used. For example, in one embodiment according to the present application, it can be coated to enhance cell adhesion, for example, polydodamine can be used, and other methods such as Ku, SH, et al., General functionalization route for cell adhesion on non-wetting surfaces. Biomaterials 31, 2535-2541 (2010)). In other embodiments, it can be modified into a variety of biological agents such as receptors, antibodies, ligands or small molecules, polymeric compounds, etc. that can interact with substances present on the cell surface.

본원에 따른 일 구현예에서 본원에 따른 장치는 두 개 이상, 예를 들면 제1 및 제2 챔버를 포함하며, 각 챔버는 층을 이루어 존재할 수 있으며, 각 챔버는 나노스케일 막에 의해 분리되며, 각 챔버는 상기 막에 형성된 구멍을 통해 소통 가능하다. In one embodiment according to the present application, an apparatus according to the present invention comprises two or more, for example, first and second chambers, each chamber may be a layer, each chamber being separated by a nanoscale membrane, Each chamber is communicable through a hole formed in the membrane.

본원에 따른 장치의 각 챔버의 전부 또는 일부는 세포배양 배지 및 세포간 상호작용 규명을 위해 다양한, 동일 또는 상이한 세포(주) 또는 혼합 세포주를 포함할 수 있다. 각 챔버에 포함되는 세포는 동물, 식물, 박테리아, 진균류, 이스트 또는 앨지(algae) 유래일 수 있으며, 한 구현예에서는 동물 유래의 암세포 또는 스트로마 세포이나, 이로 제한하는 것은 아니다. All or a portion of each chamber of the device according to the present application may comprise various, identical or different cell (s) or mixed cell lines for cell culture medium and cell-cell interactions. The cells contained in each chamber may be from animals, plants, bacteria, fungi, yeast or algae, and in one embodiment, but not limited to, animal-derived cancer cells or stromal cells.

본원에 따른 다른 구현예에서 본원에 따른 장치는 제1 챔버 및 상기 제2 챔버 사이에 중간 챔버로 예를 들면 추가의 제3 챔버, 제4 챔버 또는 제5 챔버를 포함하며, 상기 각 챔버는 상기 제1 및 상기 제2 챔버 사이에 위치하며 각각과 나노스케일 막에 의해 분리된다. 일 구현예에서 중간 챔버의 숫자는 2 내지 10개이다. In another embodiment according to the present application, an apparatus according to the invention comprises, for example, an additional third chamber, a fourth chamber or a fifth chamber as an intermediate chamber between the first chamber and the second chamber, And are separated by a nanoscale film and between the first and second chambers, respectively. In one embodiment, the number of intermediate chambers is 2 to 10.

일 구현예에서는 본원에 따른 장치는 3개의 챔버를 포함하여, 제3 챔버는 제1 챔버 및 제2 챔버 사이에 위치하며, 막에 의해 분리된다. In one embodiment, the device according to the invention comprises three chambers, the third chamber being located between the first chamber and the second chamber, separated by a membrane.

일 구현예에서, 본원의 장치에 포함되는 막의 밀도는 제곱 cm 당 105 내지 106 범위의 밀도를 가지며 구멍의 평균 직경은 약 50-100nm이다. In one embodiment, the density of the films included in the apparatus herein has a density in the range of 10 5 to 10 6 per square cm and the average diameter of the holes is about 50-100 nm.

본원에 따른 나노스케일 막은 하우징 예를 들면 배양 접시 등과 같은 용기에 도입되어 이와 함께 사용될 수 있다. Nanoscale membranes according to the present application may be introduced into a container such as a housing, e.g., a culture dish, and used together therewith.

본원에 따른 하우장은 임의의 세포 배양에 적합한 적절한 물질로 제조될 수 있으며, 예를 들면 유리, 세라믹, 폴리카보네이트, 비닐, 폴리비닐클로라이드, 폴리디메틸실록산, 아크릴, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리에틸설폰 또는 메탈로 제조될 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다. The topsheet according to the present disclosure may be made of any suitable material suitable for any cell culture and may be formed from any suitable material suitable for cell culture, such as glass, ceramic, polycarbonate, vinyl, polyvinyl chloride, polydimethylsiloxane, acrylic, polypropylene, polyethylene, But is not limited thereto.

또한 본원에 따른 장치에 포함되는 하우징은 본원의 장치가 사용되는 구체적 용도에 따라 임의의 구조를 취할 수 있다. 예를 들면 세포배양 또는 원심분리에 사용되는 시험관 등의 형태, 또는 세포배양 플레이트의 형태 등을 취할 수 있거나 또는 유체장치와 연결될 수 있으며, 커버를 포함할 수 있다. The housing included in the device according to the present invention may also take any structure depending on the specific application in which the device is used. For example, in the form of a test tube used for cell culture or centrifugation, or in the form of a cell culture plate, or may be connected to a fluid device, and may include a cover.

본원에 따른 장치는 임의의 다양한 형태를 가질 수 있다. 본원에 따른 일 구현예에서는, 도 7a 및 도 7b를 참조하면, 예를 들면 제1 챔버 및 제2 챔버를 포함하고, 하나 이상의 나노스케일 막은 상기 제1 및 제2 챔버 사이에 위치한다. 이러한 형태의 장치는 전형적으로 플레이트 또는 시험관 및 상기 플레이트 또는 시험관에 위치된 나노스케일 막을 포함하며, 막에 의해 상기 플레이트 또는 시험관이 제1 및 제2 챔버로 나뉠 수 있다. 다른 구현예에서는 상기 제1 챔버 및 제2 챔버 사이에 하나 이상의 중간 챔버 (또는 제3 챔버)를 추가로 포함할 수 있으며, 도 7c 내지 도 7e를 참조할 수 있다. 본원에 따른 일 구현예에서는 두 개이상의 중간 챔버를 포함하며, 각 챔버는 층상구조 형태로 쌓여 사용될 수 있다. The device according to the present invention may have any of various forms. In one embodiment according to the present application, referring to FIGS. 7A and 7B, for example, it includes a first chamber and a second chamber, and at least one nanoscale membrane is located between the first and second chambers. Devices of this type typically include a plate or test tube and a nanoscale membrane positioned in the plate or test tube, wherein the membrane or test tube can be divided into a first and a second chamber. In other embodiments, one or more intermediate chambers (or third chambers) may be further included between the first chamber and the second chamber, see Figures 7C-7E. In one embodiment according to the present application, the chamber includes two or more intermediate chambers, and each chamber may be stacked and used in the form of a layered structure.

본원의 일 구현예에 따른 도 3a 내지 도 3e를 참조하면 본원에 따른 장치의 각 챔버는 세포 배양 배지를 포함할 수 있으며, 각 나노스케일의 막의 한측 또는 양측에는 동일 또는 상이한 세포가 위치할 수 있다. 본원에 따른 장치를 이용하여 공배양 되는 세포는 막을 통해서만 상호작용하며 각 막에는 단일층으로 존재하며, 이러한 조건을 만족하는 막에서 다양한 배열을 가질 수 있거나, 양면 또는 한 면에 위치할 수 있다. 3A-3E according to one embodiment of the present disclosure, each chamber of the device according to the present disclosure may include a cell culture medium, and the same or different cells may be located on one or both sides of each nanoscale membrane . Cells co-cultured using the device according to the present application interact only through the membrane and are present in a single layer in each membrane, and can have a variety of arrangements in the membranes satisfying these conditions, or can be located on both sides or one side.

본원에 따른 장치에 포함되는 다수의 챔버는 그 전부가 세포배양 배지를 포함할 수 있으며, 그 전부 또는 일부의 챔버가 세포(주)를 포함할 수 있다. 세포는 막의 두 면 중 한 면 이상에 위치할 수 있다. 본원에 따른 장치에서 배양되는 세포는 단일층으로 존재하여 막의 구멍을 통해서만 다른 세포와 소통한다. The plurality of chambers included in the device according to the present invention may all include cell culture medium, and all or a portion of the chambers may contain cells. Cells can be located on more than one side of the membrane. The cells cultured in the device according to the present invention exist as a single layer and communicate with other cells only through the pores of the membrane.

전술한 바와 같이 세포간 상호작용 분석이 필요한 다양한 세포주가 본원의 장치에 포함될 수 있으며, 예를 들면 본원에 따른 장치의 각 챔버의 전부 또는 일부는 세포배양 배지 및 세포간 상호작용 규명을 위해 다양한, 동일 또는 상이한 세포(주) 또는 혼합 세포주를 포함할 수 있다. 각 챔버에 포함되는 세포는 동물, 식물, 박테리아, 진균류, 이스트 또는 조류(algae) 유래일 수 있다. Various cell lines that require cell-cell interactions analysis as described above may be included in the apparatus of the present application, for example all or part of each chamber of the device according to the present invention may be used for various cell culture media, The same or different cell (s) or a mixed cell line. The cells contained in each chamber may be derived from animals, plants, bacteria, fungi, yeast or algae.

또한 조직에서 분리된 일차 세포 또는 확립된 세포를 포함한다. 이러한 세포는 간, 신장, 폐, 위, 이자, 신경, 근육, 세포 및 뼈와 같은 장기의 유래는 물론 다양한 암조직 유래의 세포, 줄기세포 예를 들면 골수줄기세포, 암줄기세포, 중간엽줄기세포, 면역세포 예를 들면 T 세포, 수지상 세포, 항원제시세포, 표피세포 예를 들면 케라티노사이트, 혈관세포 예를 들면 혈관내피세포, 혈관근세포, 신경세포를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 확립된 세포로는 예를 들면 HeLa 세포, FL 세포, KB 세포, HepG2 세포, WI-88 세포, MA104 세포, BSC-1 cells, Vero 세포, CV-1 세포, BHK-21 세포, L 세포, CHL 세포, BAE 세포, BRL cells, PAE 세포, MDA-MB-231 세포 또는 이의 조합이 사용될 수 있다. It also includes primary cells or established cells isolated from tissues. Such cells may be derived from a variety of cancer tissue-derived cells, stem cells such as bone marrow stem cells, cancer stem cells, mesenchymal stem cells, or stem cells, as well as organs such as liver, kidney, lung, stomach, , But are not limited to, immune cells such as T cells, dendritic cells, antigen presenting cells, epidermal cells such as keratinocytes, vascular cells such as vascular endothelial cells, vascular myocytes, and neuronal cells. Examples of established cells include HeLa cells, FL cells, KB cells, HepG2 cells, WI-88 cells, MA104 cells, BSC-1 cells, Vero cells, CV-1 cells, BHK- Cells, BAE cells, BRL cells, PAE cells, MDA-MB-231 cells or a combination thereof may be used.

한 구현예에서는 동물 유래의 암세포 또는 이와 상호작용하는 스트로마 세포 예를 들면 섬유모세포 (Fibroblast), 근모세포 (Myoblast) 및 중간엽줄기세포 (Mesenchymal Stem cell)을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다. One embodiment includes, but is not limited to, animal-derived cancer cells or stromal cells that interact therewith, such as fibroblasts, myoblasts and mesenchymal stem cells.

세포배양 배지는 사용되는 세포에 맞추어 적절한 것이 사용될 수 있으며, 예를 들면 일반적인 Fisher's medium (Gibco), Basal Media Eagle (BME), Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM), Iscoves's Modified Dulbecco's Media, Minimum Essential Media (MEM), McCoy's 5A Media, 및 RPMI 배지가 사용될 수 있거나, 또는 특수한 배지로서 MyeloCuht™ (Stem Cell Technologies) 및 Opti-Cell™ (ICN Biomedicals) 또는 무혈청배지로서 StemSpan SFEM™ (StemCell Technologies), StemPro 34 SFM (Life Technologies), Marrow-Gro (Quality Biological Inc.)가 사용될 수 있으며, 내피세포의 경우 EBM2 (Bio Whittaker), 골수세포의 경우 McCoy's 5A medium (Gibco) 등이 사용될 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다. 이러한 배지는 혈청, 항생제, 아미노산 및/또는 호르몬 등의 보충제를 포함할 수 있다.
The cell culture medium may be appropriately selected depending on the cell to be used. For example, the cell culture medium may be used as appropriate, for example, a medium such as Fisher's medium (Gibco), Basal Media Eagle (BME), Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM), Iscoves's Modified Dulbecco's Medium ), McCoy's 5A Media, and RPMI medium can be used, or StemSpan SFEM ™ (StemCell Technologies), StemPro 34 SFM ™ (Stem Cell Technologies) and Opti-Cell ™ (ICN Biomedicals) (Life Technologies) and Marrow-Gro (Quality Biological Inc.) can be used. EBM2 (Bio Whittaker) for endothelial cells and McCoy's 5A medium (Gibco) for bone marrow cells can be used but not limited thereto. Such media may include supplements such as serum, antibiotics, amino acids and / or hormones.

다른 측면에서 본원은 두 개 이상의 세포를 공배양 하는 방법에 관한 것으로 본원의 방법에 따라 제조된 하나 이상의 나노스케일 막 또는 본원에 따른 장치를 제공하는 단계, 상기 나노스케일 막이 두 개 이상 포함되는 경우, 상기 막은 위아래 또는 좌우 방향으로 층으로 배열되고, 상기 각 막에 세포를 씨딩하는 단계, 상기 각 막에 씨딩되는 세포는 동일 또는 상이한 종류이거나, 두 종류 이상의 세포의 혼합 세포이고, 그리고, 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하며, 상기 세포는 상기 막의 구멍을 통해 서로 소통가능하다. In another aspect, the present invention is directed to a method of co-culturing two or more cells comprising providing at least one nanoscale membrane or device according to the present invention made according to the method of the present invention, when the nanoscale membrane comprises two or more nanoscale membranes, Wherein the membrane is arranged in layers vertically or horizontally and the cells are seeded in the respective membranes, the cells to be seeded in the respective membranes are the same or different kinds, or mixed cells of two or more kinds of cells, Wherein the cells are able to communicate with each other through a hole in the membrane.

본원에 따른 세포 공배양 방법에서 막의 상대적 위치는 가변적이며, 채용되는 막의 일부 또는 전부를 새것으로 교체할 수 있다. 새로운 막은 기존의 막과 동일 또는 상이한 세포를 포함할 수 있다. In the cell culture method according to the present invention, the relative position of the membrane is variable, and part or all of the membrane employed can be replaced with a new one. The new membrane may contain the same or different cells as the existing membrane.

본원에 따른 방법에서 상기 소통은 직접 또는 간접 소통을 포함하는 것이며, 이러한 소통은 앞서 설명한 바를 참조할 수 있다. 일 구현예에서 소통은 세포간 물리적 접촉없는 막을 통한 소통이다. 본원에 따른 방법은 세포 상호작용 및/또는 소통의 분석이 필요한 다양한 세포를 이용하여 수행될 수 있으며, 이에 대하여는 앞서 언급한 바를 참조할 수 있다. 일 구현예에서 세포는 동물 유래의 암세포 또는 스트로마 세포이며, 암세포 및 이와 상호작용하는 스트로마 세포가 사용된다. In the method according to the present invention, the communication includes direct or indirect communication, and such communication can be referred to as described above. In one embodiment, communication is through a membrane without intercellular physical contact. The method according to the present invention can be carried out using various cells requiring analysis of cell interaction and / or communication, and the above-mentioned methods can be referred to. In one embodiment, the cells are cancerous cells or stromal cells derived from an animal, and cancer cells and stromal cells interacting therewith are used.

기타 본원의 방법에 사용되는 장치, 나노스케일 막 및 세포의 종류 등은 앞서 언급한 바를 참조할 수 있다. Other apparatuses, nanoscale membranes and types of cells used in the method can be referred to above.

다른 측면에서 본원은 본원에 따른 세포배양 장치 또는 본원의 방법에 따라 제조된 막을 포함하는 세포 공배양 키트에 관한 것이다. 본원에 따른 키트는 추가로 하나 이상의 세포 배양 배지; 하나 이상의 세포주; 및/또는 키트를 이용한 상기 하나 이상 세포주의 공배양 방법에 관한 안내서를 추가로 포함할 수 있다.
In another aspect, the invention is directed to a cell culture kit according to the present invention or a cell culture kit comprising a membrane produced according to the method of the present invention. The kit according to the present invention may further comprise at least one cell culture medium; One or more cell lines; And / or a kit for co-culturing said one or more cell lines with a kit.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, embodiments are provided to facilitate understanding of the present invention. However, the following examples are provided only for the purpose of easier understanding of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.

실시예Example

실시예Example 1 다공성  1 Porous 프리스탠딩Free standing 폴리머Polymer 박막 필름의 제조 및 특징 규명 Preparation and Characterization of Thin Films

평균 분자량(Mn)이 30,000g/mol (39.8wt% 아세틸 표지 정도)인 셀룰로스 아세테이트 (CA)는 Aldrich에서 수득한 상태로 사용하였다. CA는 아세톤 용매에 4 wt% 농도로 용해하였다. CA 박막 필름의 다공성 구조를 수득하기 위하여, 섭씨 30도에서 상대적 습도 (RH)가 조절되는 폐쇄된 습한 챔버의 자동 스핀 코팅기를 이용하여 회전속도 3000rpm으로 20초 동안 스핀하여 CA 용액을 스핀 캐스팅 하였다. 물은 CA 폴리머에 대하여 비용제성이기 때문에, CA 박막의 다공성 구조는 비용제성 증기 유도된 막 분리 (N-VIPS)로 수득될 수 있으며, 구멍의 숫자는 상이한 종류의 과포화 염 용액으로 패킹된 폐쇄 챔버에서 RH (즉, 수증기압)로 조절될 수 있다 (CaCl2 및 KCl: 각각 RH 25-45% 및 55-85% ). 나노구멍을 갖는 CA 막은 습한 환경의 VIPS로 제조되었기 때문에, 45% RH에서 디스크리트한 구멍이 65% RH에서 점차적으로 최대 구멍 밀도를 갖는 잘 디파인된 구멍으로 전환되며, 최종적으로 85% RH에서 바이모달 구멍 형태를 갖게 되었다. 막의 두께는 RH 와 관련없이 500nm에서 유지되었다. CA막의 평균 두께는 동일한 조건에서 제조된 6개의 상이한 막의 평균값이다. CA 막 두께 평균치는 65% RH에서는 482.25nm 이었으며, 표준편차는 6.99nm이었으며, 이는 본원의 방법에 따라 제조된 나노스케일 다공성 막의 매우 균일한 두께를 가지는 것을 나타낸다. 프리스탠딩 CA 박막은 막을 물에 침지한 상태에서 Si 기판에서 벋겨내는 방식으로 쉽게 수득하거나 또한 프리스탠딩 CA 박막 필름은 시료를 충분히 말린 후 CA 코팅된 NaCl 기판을 물에 10분간 침지하여 수득하였다. Cellulose acetate (CA) having an average molecular weight (Mn) of 30,000 g / mol (about 39.8 wt% acetyl label) was used as obtained in Aldrich. CA was dissolved in acetone at a concentration of 4 wt%. To obtain the porous structure of the CA thin film, the CA solution was spin cast by spun for 20 seconds at a rotational speed of 3000 rpm using an automatic spin coater of a closed humid chamber whose relative humidity (RH) was controlled at 30 degrees Celsius. Since the water is cost-insoluble to the CA polymer, the porous structure of the CA membrane can be obtained with cost-effective vapor-induced membrane separation (N-VIPS), and the number of holes can be controlled in a closed chamber packed with different types of supersaturated salt solutions To RH (i.e., water vapor pressure) (CaCl 2 and KCl: RH 25-45% and 55-85% RH, respectively). Because CA membranes with nano holes are manufactured with VIPS in a humid environment, cavities that are discrete at 45% RH are converted to well-defined cavities with gradual maximum hole density at 65% RH, and finally bimodal at 85% Hole type. The thickness of the film was maintained at 500 nm irrespective of RH. The average thickness of the CA membranes is an average value of six different membranes prepared under the same conditions. The CA membrane thickness average was 482.25 nm at 65% RH and the standard deviation was 6.99 nm, indicating that the nanoscale porous film prepared according to the method of this invention had a very uniform thickness. The free standing CA thin film was easily obtained in such a manner that the film was removed from the Si substrate with the film immersed in water or the free standing CA thin film was obtained by sufficiently drying the sample and then immersing the CA coated NaCl substrate in water for 10 minutes.

막 두께의 영향을 보기위해 다공성의 10-μm 두께의 CA 필름은 비용제성 액체 유도된 상분리 (N-LIPS)를 이용하여 다음과 같이 제조하였다. 20 wt%의 CA 용액을 2-에틸-1,3-헥산디올에 용해 한 후 10μm 측벽으로 제조된 Si 웨이퍼상에 적가하였으며, 블레이드 (Blade) 방법을 이용하여 캐스팅 하였다. 제조한 CA 필름은 물에 1시간 동안 침지한 후 진공에서 12시간 동안 건조하여, 기판으로부터 필름을 분리하였다. CA 필름의 표면 형태는 AFM (diInnova, Veeco Instruments Inc.) 및 FE-SEM (JSM-6701F, JEOL)으로 촬영하였다. CA 박막의 두께는 스텝 높이 측정으로 수득하였다 (AlphaStep IQ (Rev. Al-1), KLA Tencor). 세포 부착을 향상시키기 위하여, CA 막을 우선 도파민 하이드로클로리드(Sigma) 용액에서 16시간 동안 두어 폴리도파민으로 코팅하였다. 도파민 하이드로클로리드는 2 mg/ml의 농도로 10mM 트리스 완충액에 용해하였으며, 용액의 pH는 묽은 NaOH 용액으로 8.5로 조정하였다. To investigate the effect of film thickness, a porous 10-μm thick CA film was prepared using a cost-free liquid-induced phase separation (N-LIPS) as follows. 20 wt% CA solution was dissolved in 2-ethyl-1,3-hexanediol, dropped on a Si wafer prepared with 10 μm sidewalls, and cast using a blade method. The prepared CA film was immersed in water for 1 hour and then dried in a vacuum for 12 hours to separate the film from the substrate. The surface morphology of the CA film was taken with AFM (diInnova, Veeco Instruments Inc.) and FE-SEM (JSM-6701F, JEOL). The thickness of the CA thin film was obtained by step height measurement (AlphaStep IQ (Rev. Al-1), KLA Tencor). To enhance cell adhesion, the CA membrane was first coated with polypodamine in a dopamine hydrochloride (Sigma) solution for 16 hours. Dopamine hydrochloride was dissolved in 10 mM Tris buffer at a concentration of 2 mg / ml and the pH of the solution was adjusted to 8.5 with dilute NaOH solution.

결과는 도 1a 내지 2f에 기재되어 있다. 도 1a는 비용제성 (물) 증기 유도된 상분리 (VIPS)를 이용하여, 왼편에 기재된 상대적 습도가 조절되는 폐쇄 스핀 코팅 챔버에서 제조된 나노구멍의 프리스탠딩 CA 막의 제조과정을 도식적으로 나타낸 것이다. 도 1b는 공기 쪽 면 (a), 기질 쪽 면 (b)의 AFM 영상과 공기 쪽 면의 공기 (c) 및 물 (d)과 접촉한 면의 AFM 영상이다. 이에 나타난 바와 같이 구멍이 구조가 수성 환경에서도 변하지 않는 것으로 나타났다. The results are shown in Figures 1A-2F. FIG. 1A schematically illustrates the fabrication process of a free standing CA film of a nano-hole fabricated in a closed spin coating chamber in which the relative humidity is controlled as described on the left, using non-volatile (water) vapor induced phase separation (VIPS). 1B is an AFM image of the AFM image of the air side surface (a) and the substrate side surface (b), and the surface of the air side (c) and the surface of the air side in contact with the water (d). As shown, the holes did not change in the aqueous environment.

도 2a에 나타난 바와 같이, 본원의 방법에 따라 제조된 막은 프리스탠딩이 가능하며 초박 TNT 막의 투명성, 나노포러스성 및 전이성을 갖는다. 이러한 투명성은 나노미터 스케일의 두께 (482 ± 7 nm) 및 구멍 직경 (≤ 500 nm)에 기인한다. 즉 본원이 방법에 따라 제조된 막은 잘 규정된(defined) 나노크기의 다공성 구조를 갖는 수성환경, 예를 들면 세포 배양 배지와 같은 액체 상태에서 투명성과 전달성과 같은 특유의 특성을 가진다. 도 2c에 나타난 바와 같이 상이한 RH 조건 (45, 65, 및 85 %)에서 제조된 TNT 막의 AFM 영상은 본원에 따른 막은 상대습도의 조절을 통해 구멍크기의 조절이 가능한 것을 나타낸다. 이러한 막은 파라크라인을 통한 세포간 소통에 기능할 수 있음은 도 2d에 기재되어 있다. 도 2d는 MDA-MB-231 및 hMSC 간의 사이토카인 매개된 소통에 의해 야기된 RANTES 발현에 미치는 구멍 크기의 영향을 나타낸 결과로, 고밀도 나노구멍 (50-100nm)의 475 nm-두께의 RH 65 %에 제조된 막의 효과가 가장 좋은 것으로 나타났다. 나아가 기존의 PET (polyethylene terephthalate) 막과 비교하여 고동도의 분비물질 (RANTES)이 본원의 막을 이용한 세포간 소통 실험에서 확인되었다. 또한 도 2e는 비용제 액체 유도된 상분리 (LIPS)에 의해 제조된 마이크로포러스의 10 μm 두께의 CA 막의 SEM 영상으로 이를 이용하여 세포간 소통에 미치는 막의 두께를 RNATES 농도로 확인하였다. 도 2f에 나타난 바와 같이 세포간 소통이 막의 두께로 인한 세포간 거리에 의해 영향을 받는 것을 나타낸다.
As shown in FIG. 2A, the films prepared according to the method of the present invention are free-standing and have transparency, nanoporous properties, and transparency of ultra-thin TNT films. This transparency is due to nanometer scale thickness (482 7 nm) and hole diameter (500 nm). That is, membranes prepared according to the method herein have specific properties such as transparency and transportability in a liquid environment such as an aqueous environment with well-defined nanoscale porous structure, for example, a cell culture medium. AFM images of TNT films prepared at different RH conditions (45, 65, and 85%), as shown in Figure 2c, indicate that the membrane according to the present invention is capable of adjusting the pore size through the adjustment of relative humidity. The ability of these membranes to function in intercellular communication via paracrine is shown in Figure 2d. Figure 2d shows the effect of pore size on the expression of RANTES caused by cytokine mediated communication between MDA-MB-231 and hMSC, resulting in a 475 nm-thick RH 65% of high density nano pores (50-100 nm) The best results were obtained from the membrane. Furthermore, compared to conventional PET (polyethylene terephthalate) membranes, the secretion material of high stringency (RANTES) was confirmed in intercellular communication experiments using the membrane of the present invention. Figure 2E also shows the SEM image of a 10 μm thick CA membrane of microporous membranes prepared by LIPS (Cost-Liquid Induced Phase Separation), which was used to confirm the membrane thickness on intercellular communication by RNATES concentration. As shown in FIG. 2f, the intercellular communication is affected by the intercellular distance due to the membrane thickness.

실시예 2 본원의 방법에 의해 제조된 막을 이용한 세포 Example 2 Cells using membranes prepared by the method of the present invention 공배양Co-culture

본원에 사용된 세포는 다음과 같다: MDA-MB-231(ATCC Num. HTB-26), NIH-3T3 (ATCC Num. CRL-1658), 및 C2C12 (ATCC Num. 1772) 세포는 ATCC (American type culture collection)에서 수득하였으며, 인간 중간엽줄기세포(hMSC)는 Merk Millipore (Part # SCC034, MA, USA)에서 구입하였다. 배양은 다음과 같이 하였다. 전이성 유방암 세포주인 MDA-MDA-231은 100 units/ml 페니실린 스트렙토마이신 및 10% 소태아혈청 (FBS)을 포함하는 RPMI 배지 (Gibco, USA)에서 배양하였다. NIH-3T3 및 C2C12 세포는 10% 소태아혈청 (FBS) 및 항생제를 포함하는 DMEM에서 배양하였다. hMSC은 중간엽줄기세포 증폭 배지(SCM015, Merk Millipore, USA)에서 배양하였다. hMSC는 4 내지 8 계대 사이의 것을 사용하였으며, 모든 세포주는 37℃, 5% CO2.에서 배양되었다. Cells used herein are as follows: MDA-MB-231 (ATCC Num. HTB-26), NIH-3T3 (ATCC Numbers CRL-1658), and C2C12 culture collection), and human mesenchymal stem cells (hMSC) were obtained from Merk Millipore (Part # SCC034, MA, USA). The culture was performed as follows. MDA-231, a metastatic breast cancer cell line, was cultured in RPMI medium (Gibco, USA) containing 100 units / ml penicillin streptomycin and 10% fetal bovine serum (FBS). NIH-3T3 and C2C12 cells were cultured in DMEM containing 10% fetal bovine serum (FBS) and antibiotics. hMSCs were cultured in mesenchymal stem cell amplification medium (SCM015, Merk Millipore, USA). hMSCs were used between 4 and 8 passages, and all cell lines were cultured at 37 ° C, 5% CO 2 .

도 3a는 사이토카인 분석을 위해 실시예 1에서 제조된 TNT 막을 층으로 배열하여 사용하는 세포배양 방법을 사용하여 MDA-MB-231 및 세 종류의 상이한 스트로마 세포를 공배양하는 것을 도식적으로 나타낸 것이다. 세포 공배양을 위한 층 쌓기는 다음과 같이 수행하였다: 유방암 세포 (6.6 X 104 개) 및 스트로마 세포 (3.3 X 104개)를 2:1의 세포수 비로 투명한, 위에서 제작한 나노포러스의 전이성 (TNT, Transparent, nanoporous, transferable) 셀룰로스 아세테이트(CA)막에 씨딩하였다. 사용된 hMSC는 7 계대 미만의 세포주였다. 세포배양 동안 TNT 막이 뜨는 것을 막기 위하여, TNT 막과 거의 동일한 직경의 스테인레스 링으로 막을 눌렀다. 세포 시딩 4시간 후 (4시간은 CA 막에의 세포 부착에 충분한 시간으로, 전이성 암세포와 스트로마 세포의 직접 접촉이 방지될 수 있다), 암세포가 배양된 막 및 스트로마 세포가 배양된 필름을 클린한 웰에서 쌓아 세포-세포 상호작용을 관찰하였다. 공배양 효과의 보다 면밀한 관찰을 위해, 세포를 37℃, 5% CO2. 조건에서 2일간 배양하였다. 3A schematically shows the co-culture of MDA-MB-231 and three different stromal cells using a cell culture method using the TNT membranes prepared in Example 1 arranged in layers for cytokine analysis. Layers for cell co-culture were performed as follows: breast cancer cells (6.6 X 10 4 ) and stromal cells (3.3 X 10 4 cells) were transfected with a 2: 1 cell ratio, (TNT, Transparent, nanoporous, transferable) cellulose acetate (CA) membrane. The hMSC used was cell line of less than 7 passages. To prevent the TNT membrane from floating during cell culture, the membrane was pressed with a stainless ring of approximately the same diameter as the TNT membrane. After 4 hours of cell seeding (4 hours can prevent direct contact between metastatic cancer cells and stromal cells with sufficient time for cell adherence to the CA membrane), the cultured cancer cells and the stromal cell culture were cleaned Cell-cell interactions were observed in the wells. For a closer look than the effect of co-culture, the cells 37 ℃, 5% CO 2. Lt; / RTI &gt; for 2 days.

실시예 3 Example 3 파라크라인Paracrine 소통을 통한  Through communication 세포간Intercellular 소통 확인 Confirm communication

세포간 소통은 도 3a에 나타난 바와 같이 전이성 세포주로 유방암 세포주인 [MDA-MB-231 (M)]와 상이한 세종류의 스트로마 세포인 [hMSC (H), fibroblast NIH-3T3 (N), 및 myoblast C2C12 (C)]를 실시예 1에서 제조된 막을 이용하여 다음과 같이 분석하였다. 암세포는 다양한 엔도크라인 및 파라크라인 신호를 분비하여 MSC를 끌어들이며, Fibroblast와 myoblast는 사이토카인을 분비하여 암세포의 성장과 전이에 기능을 한다 (Nicolini, A., Carpi, A. & Rossi, G. Cytokines in breast cancer. Cytokine & amp ; Growth Factor Reviews 17, 325-337 (2006)). 따라서 4 종류의 상이한 세포주 [전이성 세포주 (M) 및 세 종류의 스트로마 세포주 (H, N 및 C)]를 사용하여 암세포와 스트로마 세포간의 상호작용을 분석하였다. 도 3b에 나타난 바와 같이 루미넥스 비드 기재의 현탁 어레이 시스템을 사용한 세포 층쌓기 공배양 결과로부터 MbottomHtop 에서 RNATES 농도가 가장 유의적으로 증가하였으며, VEGF 양은 MbottomNtop 및 MbottomCtop 에서 증가되는 것으로 나타났다.
Cellular interactions are mediated by three types of stromal cells [hMSC (H), fibroblast NIH-3T3 (N), and myoblast) different from the breast cancer cell line [MDA-MB-231 C2C12 (C)] was analyzed using the membrane prepared in Example 1 as follows. Cancer cells secrete various endocrine and paracrine signals to attract MSCs. Fibroblasts and myoblasts secrete cytokines and function in cancer cell growth and metastasis (Nicolini, A., Carpi, A. & Rossi, G. Cytokines in breast cancer. Cytokine & amp ; Growth Factor Reviews 17, 325-337 (2006)). Therefore, the interaction between cancer cells and stromal cells was analyzed using four different cell lines (metastatic cell line (M) and three types of stromal cell lines (H, N and C)). As shown in FIG. 3B, from the results of cell layer stacking using a suspension array system of luminex beads, M bottom H top , And VEGF levels were increased in M bottom N top and M bottom C top .

실시예 4 사이토카인 분석Example 4 cytokine assay

상이한 공배양 세포주의 세포 배양 배지에서 루미넥스 비드 기재의 현탁 어레이 시스템을 이용하여 다양한 사이토카인, 케모카인, 및 성장 인자의 농도를 측정하였다. 24시간 후에 배지를 수집하여 조건에 따른 사이토카인의 농도를 측정하였다. 실시예 2와 같이 세포를 공배양하였다. 세포 배양 후에, Milliplex Map (Merk Millipore, MA, USA)를 제조자의 방법대로 사용하여 17개의 상이한 사이토카인[EGF, FGF-2, G-CSF, GM-CSF, IFNγ, RANTES, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, TGFα, TNFα, 및 VEGF]에 대한 분석을 수행하였다. Milliplex Map은 루미넥스를 기반으로 한 것으로 내부에 두 개의 형광 염료로 칼라 코딩된 마이크로구를 사용한다. The concentration of various cytokines, chemokines, and growth factors was measured using a luminex bead-based suspension array system in cell culture media of different co-cultured cell lines. After 24 hours, the medium was collected and the concentration of cytokines was measured according to the conditions. Cells were co-cultured as in Example 2. After cell culture, 17 different cytokines (EGF, FGF-2, G-CSF, GM-CSF, IFNγ, RANTES, IL-1α, IL) were measured using Milliplex Map (Merk Millipore, MA, USA) IL-2, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, TGFα, TNFα and VEGF. The Milliplex Map is based on Luminex and uses two microspheres internally with two fluorescent dyes.

요약하면, 시료를 특이적 바이오티닐화된 항체로 코팅된 비드와 인큐베이션한 후, 상기 반응 혼합물을 스트렙타비딘 PE 컨쥬게이트와 인큐베이션하였다. 마이크로구로부터 유래된 신호는 레이저로 검출하며, 레이저는 내부의 염료를 여기시켜 마이크로구 세트를 마킹하게 된다. 6회의 독립적인 실험을 수행하였으며 에러바를 계산하였다. 데이터의 노말라이즈를 위해 MDA-MB-231 세포 배양 배지에서 배경 신호를 수득하고 각 사이토카인의 표준곡선을 수득하였다. Briefly, after incubating the sample with beads coated with a specific biotinylated antibody, the reaction mixture was incubated with streptavidin PE conjugate. Signals originating from the microspheres are detected by a laser, which excites the dye inside to mark the microsphere set. Six independent experiments were performed and error bars were calculated. Background signals were obtained in MDA-MB-231 cell culture medium for normalization of data and standard curves of each cytokine were obtained.

결과는 도 3b에 기재되어 있다. 세포 단독을 이용한 경우, hMSC (H) 세포에서 매우 높은 농도의 RANTES가 검출되었다. NIH-3T3 (N) 및 C2C12 (C) 세포에서는 상대적은 높은 양의 VEGF (vascular endothelial growth factor)가 검출되었다. 공배양의 경우 상당히 증가한 양의 RANTES가 MbotHtop에서 관찰되었으며, 증가한 VEGF는 MbotNtop 및 MbotCtop의 경우에서 관찰되었다. 이러한 결과는 MDA-MB-231에 의한 사이토카인의 유도 및 변화를 나타내는 것으로, 이러한 유도 및 변화는 주변의 스트로마 세포 종류와 밀접하게 관련되어 있으며, 본원의 TNT 막이 세포-세포 소통의 정확한 분석을 위한 공배양 플랫폼으로 작용할 수 있음을 나타내는 것이다.
The results are shown in Figure 3b. When cell alone was used, a very high concentration of RANTES was detected in hMSC (H) cells. Relatively high amounts of VEGF (vascular endothelial growth factor) were detected in NIH-3T3 (N) and C2C12 (C) cells. In co-culture, considerably increased amounts of RANTES were observed in M bot H top , and increased VEGF was observed in M bot N top and M bot C top . These results indicate that induction and changes of cytokine by MDA-MB-231 are closely related to the types of surrounding stromal cells, and the TNT membrane of the present invention can be used for accurate analysis of cell-cell communication And can act as a co-culture platform.

실시예 5: 세포의 이동(Example 5: Cell migration ( MigrationMigration ) 분석) analysis

이어 전이성 암세포의 이동 변화를 관찰하였다. 이를 위해 트랜스웰 시스템(ECM 508, Merck Millipore, MA, USA) 및 젤라틴 자이모그래피를 사용하였다. Then, the migration of metastatic cancer cells was observed. For this, a Transwell system (ECM 508, Merck Millipore, MA, USA) and gelatin zymography were used.

트랜스웰 시스템 분석의 경우 우선 각 세포주를 세포농도 1.0x 105개의 세포로 CA 필름 상에 배양하고 세가지의 상이한 공배양 조건에서 세포 (유방암 세포 : 스트로마세포의 비 = 2:1, 총 세포 농도. = 1.0 X 105)를 2일 동안 배양하였다. 이어 배지를 수집하여 500μl를 이동분석 키트 (ECM508,Merk-Millipore,USA)의 바닥의 피더트레이에 추가하여 배지의 사이토카인이 암세포의 이동에 미치는 영향을 분석하였다. MDA-MB-231 세포는 37℃,5% CO2 조건에서 배양하였으며 10% FBS를 포함하는 RPMI 배지에서 컨플루언시 100% 까지 배양하였다. 이어 상기 세포를 수확하여 1 x 106cells/mL 농도로 현탁한 후 이 중 300μl를 각 웰에 추가한 후 8μm 포어크기의 미세구멍 폴리카보네이트 막을 포함하는 인서트 웰의 상부에 놓았다. 플레이트의 커버를 덮고 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 배양하였다. 이동하는 세포는 막의 구멍을 통하여 이동하였으며 바닥 피더 트레이에 로딩된 일부 신호 분자에 반응하여 폴리카르보네이트 막의 바닥에 붙었다. 인서트의 상측으로부터 배지와 세포를 파이펫을 이용하여 조심스럽게 제거하였다. 이어 인서트 챔버를 400μl의 세포 염색 용액을 포함하는 새로운 웰로 옮긴 후, 실온에서 20분간 배양하였다. 이어 챔버를 물로 수회 세정하였다. 이어, 비 이동 세포 층은 면봉으로 제거하고, 염색된 인서트 챔버를 200μl의 추출완충액을 포함하는 새로운 웰에 넣고, 15분동안 실온에 두었으며, 이 과정에서 하측의 염색은 인서트 챔버를 앞뒤로 수회 가볍게 흔들어 제거하였다. 마지막으로 추출된 용액 100μl를 96 웰 플레이트로 옮기고 560nm에서 흡광도를 측정하였다. For transwell system analysis, each cell line is first cultured on CA film at a cell concentration of 1.0 × 10 5 cells, and the cells (breast cancer cells: ratio of stromal cells = 2: 1, total cell concentration, = 1.0 X 10 5 ) was cultured for 2 days. The medium was then collected and 500 μl was added to the feeder tray at the bottom of the migration assay kit (ECM508, Merk-Millipore, USA) to analyze the effect of cytokine in the medium on the migration of cancer cells. MDA-MB-231 cells were cultured at 37 ° C in 5% CO 2 and cultured up to 100% confluency in RPMI medium containing 10% FBS. The cells were harvested and suspended at a concentration of 1 x 10 6 cells / mL, 300 μl of which was added to each well, and then placed on top of an insert well containing a microporous polycarbonate membrane of 8 μm pore size. The cover of the plate was covered and incubated at 37 ° C and 5% CO 2 for 24 hours. The migrating cells migrated through the membrane aperture and adhered to the bottom of the polycarbonate membrane in response to some signaling molecules loaded into the bottom feeder tray. The medium and cells were carefully removed from the top of the insert using a pipette. The insert chamber was then transferred to a new well containing 400 [mu] l of cell staining solution and incubated at room temperature for 20 minutes. The chamber was then rinsed several times with water. The non-migrating cell layer was then removed with a cotton swab and the dyed insert chamber was placed in a new well containing 200 μl of extraction buffer and allowed to sit at room temperature for 15 minutes during which the dyeing of the lower side was repeated several times And shaken. Finally, 100 μl of the extracted solution was transferred to a 96-well plate and absorbance was measured at 560 nm.

젤라틴 자이모그래피 분석은 다음과 같이 수행하였다. 공배양 조건에서 세포 배양 후, 배지를 수집하였다. 자이모그래피 분석은 MMP의 발현을 결정하기 위한 것으로, 모든 조건화 배지를 정량한 후, 시료 완충액을 추가하여 희석하였다. (시료완충액은 0.5M 중 Tris HCl 0.2 M, SDS 4%, Glycerol 40%, Bromophenol blue 0.004%을 포함하였으며, 멀캡토에탄올을 포함하지 않았으며 끓이지 않았다. 위와 같이 준비된 시료를 0.2% 젤라틴 기질을 포함하는 10% SDS-polyacrylamide 젤에 로딩하여 분리하였다. 이어 젤을 2.5% Triton X-100을 포함하는 50 mM Tris-HCl (pH 7.4)에서 세척한 후, 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) 완충액으로 세척하고, 이어 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.02% sodium azide 및 10 mM CaCl2.을 포함하는 완충액에 인큐베이션하였다. 이어 젤은 탈이온수에 세척하고 0.25% Coomassie Blue로 염색하고, 10% 아세트산을 포함하는 10% 메탄올 용액에서 탈염색하였다. Gelatin zymography analysis was performed as follows. After cell culture under co-culture conditions, medium was collected. The zymography assay was used to determine the expression of MMP. All conditioned media were quantitated and diluted by addition of sample buffer. (The sample buffer contained 0.2 M Tris HCl, 4% SDS, 40% Glycerol, 0.004% Bromophenol blue, and did not contain any mercaptoethanol and did not boil.) The samples prepared above were mixed with 0.2% gelatin substrate The gel was washed with 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) containing 2.5% Triton X-100 and then eluted with 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) And then incubated in a buffer containing 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.02% sodium azide and 10 mM CaCl 2. The gel was washed with deionized water, stained with 0.25% Coomassie Blue, And decolorized in a 10% methanol solution containing acetic acid.

결과는 도 3c에 기재되어 있다. 이동분석에서, 공배양 시료 (MbotHtop,MbotNtopandMbotCtop) 의 흡광도가 단독 배양 (M,N 및 C) 보다 높은 것으로 나타났으며, 이는 공배양된 세포의 영향으로 인한 MDA-MB-231 세포의 이동을 나타낸다. 종양세포는 침투를 위해 기저 막을 통과해야 하며, 이를 위해 MMP (matrix metalloproteinase) 가 필요하기 때문에 이는 암 전이의 중요 마커로 작용한다. 젤라틴 자이모그래피 분석 결과 도 3c의 젤사진에 나타난 바와 같이 공배양된 MDA-MB-231 및 스트로마 세포에서 단독 배양세포와 비교하여 높은 농도의 MMP가 관찰되었다. 아울러 RNATES는 파라크라인 방식을 통해 암세포의 전이, 침투, 이동을 증가시키며 MMP9의 발현을 증가시키는 것으로 알려져 있다 (Azenshtein, E. et al. The CC Chemokine RANTES in Breast Carcinoma Progression. Cancer Research 62, 1093-1102 (2002)). VEGF 또한 전이, 이동 침투에 중요한 요소로서 스트로마 섬유모세포에서 분비된다 (Mishra, P. et al. Chemokines at the crossroads of tumor-fibroblast interactions that promote malignancy. Journal of Leukocyte Biology 89, 31-39). 이러한 결과는 MbotNtopandMbotCtop 공배양에 의해 상술한 인자의 발현이 증가했으며, 이에 의해 MDA-MB-231 세포의 이동 및 침투가 발생하였음을 나타낸다. 이러한 결과는 본원에 따른 공배양 방법이 세포간 소통을 통해 세포의 특정 표현형, 특징을 결정짓는 사이토카인과 같은 주요 인자의 규명에 유용하게 사용될 수 있음을 나타내는 것이다.
The results are shown in Figure 3c. In the migration assay, the absorbance of co-cultured samples (MbotHtop, MbotNtopandMbotCtop) was higher than that of single cultures (M, N and C), indicating the migration of MDA-MB-231 cells due to the effect of co-cultured cells . Tumor cells must pass through the basement membrane for penetration, and MMP (matrix metalloproteinase) is required for this, which acts as an important marker of cancer metastasis. As a result of gelatin zymography analysis, a high concentration of MMP was observed in co-cultured MDA-MB-231 and stromal cells as compared with single cultured cells as shown in the gel photograph of FIG. 3C. In addition, RNATES is known to increase the expression, proliferation, and migration of cancer cells and the expression of MMP9 through the paracrine method (Azenshtein, E. et al. The CC Chemokine RANTES in Breast Carcinoma Progression. Cancer Research 62, 1093-1102 (2002)). VEGF is also secreted in stromal fibroblasts as an important factor in metastasis and migration penetration (Mishra, P. et al. Chemokines at the crossroads of tumor-fibroblast interactions that promote malignancy. Journal of Leukocyte Biology 89, 31-39). These results M N bot top andM bot C top was the expression of the factors described above by the co-culture is increased, whereby the movement and represents the penetration of the MDA-MB-231 cells has occurred. These results indicate that the co-culture method according to the present invention can be useful for identifying key factors such as cytokines that determine specific phenotypes and characteristics of cells through intercellular communication.

실시예 6: Example 6: 공배양Co-culture 세포의  Cell 액틴Actin 염색 dyeing

사층 쌓기를 통한 공배양 후, 세포배양 배지를 수확하고, 세포는 PBS 용액으로 2회 세척하였다. 세포를 이어 4% 포름알데하이드/PBS에서 15분간 고정하였다. 세포를 이어 PBS 용액으로 3회 세척 (각 5분씩)하였다. 비특이적 결합을 막기위해서, 1 % BSA/PBS/0.3 % tween 20으로 15분 처리한 후 PBS 용액으로 세척하였다. 이어 각 층을 분리하여 빈 웰로 옮긴 후 세포를 개별적으로 표지하였다. Phalloidin-Tetramethyl rhodamine isothiocyanate (TRITC) (Sigma-Aldrich, CA, USA) 및 phalloidin-Fluorescein isothiocyanate (FITC) (Sigma-Aldrich, CA, USA)을 5% PBS 용액으로 희석하였다. Phalloidin-TRITC 용액을 MDA-MB-231을 포함하는 웰에 추가하고 Phalloidin-FITC 용액을 세 종류의 스트로마 세포염색에 사용하였다. 이어 세포를 PBS로 2회 세척하였다. 마지막으로 염색한 세포 시료를 마운팅 완충액 (Abcam, United Kingdom)으로 마운트한 후 콘포칼 레이저 스캐닝 현미경(Nikon, Japan)으로 관찰하였다. After co-cultivation through four-layer stacking, the cell culture medium was harvested and the cells were washed twice with PBS solution. Cells were then fixed in 4% formaldehyde / PBS for 15 min. Cells were washed three times with PBS solution (5 min each). To prevent nonspecific binding, the cells were treated with 1% BSA / PBS / 0.3% tween 20 for 15 minutes and then washed with PBS solution. Each layer was then separated and transferred to vacant wells and cells were individually labeled. Phalloidin-Tetramethyl rhodamine isothiocyanate (TRITC) (Sigma-Aldrich, CA, USA) and phalloidin-Fluorescein isothiocyanate (FITC) (Sigma-Aldrich, CA, USA) were diluted with 5% PBS solution. Phalloidin-TRITC solution was added to wells containing MDA-MB-231 and Phalloidin-FITC solution was used for staining three types of stromal cells. The cells were then washed twice with PBS. Finally, stained cell samples were mounted with mounting buffer (Abcam, United Kingdom) and observed with a conforcer laser scanning microscope (Nikon, Japan).

공배양 중에 하층 및 상층 세포간의 교차 오염여부를 확인하기 위하여, 생 유방암 세포주를 염색하였다. 각 플레이트에 염색시약 (BacMam, Invitrogen, USA)을 제조자의 방법대로 이용하였으며, GFP 표지 분자를 살아있는 유방암 세포의 액틴 염색에 사용하였다. 염색 후에 층을 쌓아서 세포 다층을 형성하고 2일 동안 배양한 후 각 층을 분리하여 형광 이미지를 수득하였다. During co-culture, a fresh breast cancer cell line was stained to confirm cross contamination between the lower and upper layer cells. Each plate was coated with a staining reagent (BacMam, Invitrogen, USA) according to manufacturer's instructions, and GFP labeled molecules were used for actin staining of live breast cancer cells. After dyeing, the layers were stacked to form cell multilayers and cultured for 2 days, after which each layer was separated to obtain fluorescence images.

결과는 도 3d에 있다. 본원에 따른 TNT 막은 투명성으로 인해 인시츄 상태에서 광학현미경 또는 콘포칼 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM)을이용하여 각 층의 세포 형태의 모니터링이 가능하다. 또한 다층으로 쌓인 세포 배양 조건에서 영양분 및 산소 구배에 의해 유도되는 세포의 사멸을 관찰한 경우, 본원에 따른 막을 사용한 배양에서 공배양에서 4층에서까지 모든 세포주가 살아있었으며, 공배양에 의한 교차감염도 없었고, 증식도 정상적이었다. The result is shown in FIG. Due to the transparency of the TNT membrane according to the present invention, it is possible to monitor the cell morphology of each layer using an optical microscope or a confocal laser scanning microscope (CLSM) in situ state. In addition, when cell death induced by nutrients and oxygen gradient was observed under the cell culture conditions of multilayered cells, all the cell lines from the co-culture to the fourth layer were alive in the culture using the membrane according to the present invention, and cross- And the proliferation was normal.

나아가 사이토카인 분석을 수행한 결과 다층에서 세포간 소통이 유지되었음을 나타낸다 (도 3e 참조). 도 3e는 TNT 막을 이용하여 다중으로 쌓인 세 종류의 상이한 세포주 배양 후 사이토카인 분석 결과를 나타내며, 이러한 결과는 본원에 따른 TNT 막을 이용한 공배양에서 세포는 파라크라인 신호전달을 통해 상호 인지하며, 이로 인해 함께 배양되는 세포의 종류의 따라 상이한 양 및 종류의 사이토카인이 분비될 수 있음을 나타낸다. 이러한 본원의 세포배양 플랫폼은 두 종류 이상의 세포를 동시에 배양하여, 함께 존재하는 세포를 인비보에서와 같이 관찰에 유용하게 사용될 수 있다.
Furthermore, cytokine analysis indicates that intercellular communication is maintained in the multilayer (see FIG. 3e). FIG. 3E shows the result of cytokine analysis after culturing three different cell lines multiplied by TNT membrane. These results indicate that in co-culture using TNT membrane according to the present invention, cells are mutually recognized through paracrine signaling, Indicating that different amounts and types of cytokines may be secreted depending on the type of cells that are co-cultured. Such a cell culture platform of the present invention can be useful for observing coexisting cells as in an in vivo by culturing two or more kinds of cells simultaneously.

실시예 7: Example 7: TNTTNT -- CTSCTS ( ( TNTTNT membranemembrane -- basedbased cellcell transfertransfer andand shufflingshuffling ) 분석 ) analysis

본원에 따른 TNT 막을 이용한 전이 (translocation) 및 재배열에 의한 셔플링 분석은 MDA-MB-231 세포와 세 종류의 스트로마 세포간의 상호 소통에 의해 특이적으로 분비되는 사이토카인의 스크리닝을 위해 고안되었다. Transfection and rearrangement shuffling analysis using the TNT membrane according to the present invention was designed for the screening of cytokines specifically secreted by interaction between MDA-MB-231 cells and three types of stromal cells.

우선, 세포를 본원의 TNT 막에 씨딩한 후 다음의 조합으로 층을 쌓았다 [MDA-MB-231과 hMSC / MDA-MB-231과 NIH-3T3 / MDA-MB-231과 C2C12]. 24시간 배양 후에 배지를 수집하여 사이토카인을 분석하였으며, 한 종류의 스트로마 세포와 공배양된 MDA-MB-231 TNT 막을 다른 종류의 스트로마 세포를 포함하는 TNT 막으로 다음과 같이 옮겼다:[hMSC→NIH-3T3, C2C12 / NIH-3T3 →hMSC, C2C12 / C2C12→hMSC, NH-3T3].MDA-MB-231 and hMSC / MDA-MB-231 and NIH-3T3 / MDA-MB-231 and C2C12 cells were seeded in the TNT membrane of the present invention. After culturing for 24 hours, medium was collected and analyzed for cytokines. MDA-MB-231 TNT membranes co-cultured with one kind of stromal cells were transferred to TNT membranes containing different types of stromal cells as follows: [hMSC → NIH -3T3, C2C12 / NIH-3T3? HMSC, C2C12 / C2C12? HMSC, NH-3T3].

결과는 도 6a 내지 6d에 있다. TNT 막의 전달성에 근거한 TNT-CTS 분석을 수행한 결과, 전이성 암세포에 의한 스트로마 세포의 활성 히스토리를 추적할 수 있으며, 전이성 암세포와 스트로마 세포의 순서를 조절할 수 있었다. 이러한 결과는 암세포와 세 종류의 상이한 스트로마 세포의 연속적 공배양을 통해 전이성 세포와 세 종류의 상이한 스트로마 세포간의 전이 과정에서의 연속적(sequential) 신호전달을 통해 복잡한 인비보의 종양 미세환경을 모방하고 단순화하여 체계적인 암연구 수행이 가능한 것을 나타낸다 (도 6a). 동일한 스트로마 세포를 공배양 과정에서 상이한 순서로 배양한 경우 상이한 사이토카인 및 성장인자의 상이한 발현을 관찰 할 수 있었다. 특히 MH에서 생산되는 주요 단백질 종류 및 양은 배양 순서에 따라 크게 변하는 것으로 나타났다. RANTES는 전-배양이 없는 경우는 주요 단백질이었으나 (도 6b), M을 각각 N 및 C와 전 배양한 경우 FGF-2 및 IL-5가 주 단백질인 것으로 나타났다 (도 6c 및 6d). The results are shown in Figs. 6A to 6D. TNT-CTS analysis based on TNT membrane transport was able to track the activity history of stromal cells by metastatic cancer cells and regulate the order of metastatic cancer cells and stromal cells. These results mimic and simplify the complex microvasculature of invasive cells through sequential co-cultivation of cancer cells and three different stromal cells through sequential signaling during the transition between metastatic cells and three different stromal cells (Fig. 6A). Different cultures of the same stromal cells in the co-cultivation procedure could observe different expression of different cytokines and growth factors. In particular, the major protein types and amounts produced by MH were found to vary greatly depending on the culture order. RANTES was the major protein in the absence of pre-culture (FIG. 6b), but when M was preincubated with N and C, FGF-2 and IL-5 were the major proteins (FIGS. 6c and 6d).

이러한 본원의 TNT 막을 이용한 연속 공배양 (shuffling, 셔플링)은 활성화된 스트로마 세포에서 오토크라인 신호전달 뿐만아니라 암세포 전이과정에서 상이한 유형의 스트로마 세포의 파라크라인에 의한 연속적 활성화 연구에 유용하게 사용될 수 있다. 나아가 공배양 세포의 종류가 동일한 경우에도 세포의 순서에 따라서 발현되는 사이토카인이 상이한 것으로 나타났다. 예를 들면 FGF-2는 MN 상호작용의 연속효과 하에서 MH에서 증가하였으며, 반면 IL-5는 MC 상호작용의 영향 하에서 MH에서 발현이 증가한 것으로 나타났다. 특히 FGF2 및 IL-5의 농도로부터 연속공배양에서 스트로마 세포 간에 상승작용이 있는 것으로 나타났다 (단독 배양 M과 비교). Such shuffling (shuffling) using the TNT membrane of the present invention is useful for the autocrine signal transduction in activated stromal cells as well as for the continuous activation of paracrine of different types of stromal cells in the process of cancer cell metastasis . Furthermore, even when the types of co-cultured cells were the same, the cytokines expressed in the order of the cells were different. For example, FGF-2 increased in MH under the continuous effect of MN interaction, whereas IL-5 increased expression in MH under the influence of MC interaction. In particular, the concentration of FGF2 and IL-5 showed a synergistic effect between stromal cells in continuous co-culture (compared to single culture M).

이러한 TNT 막 셔플링 공배양 방법은 암세포 진행 연구에 사용될 수 있으며, 신호전달 분자의 스크리닝을 통해 암치료제 표적 분자의 발굴에 유용하게 사용될 수 있으며, 또한 세포를 포함하는 주변인자의 연속적 변화를 통해 줄기세포의 분화 조절 연구에도 유용하게 사용될 수 있다. This TNT membrane shuffling co-culturing method can be used for the study of cancer cell progression, and can be useful for the screening of signaling molecules and can be used for the digestion of target molecules for cancer therapy. Also, And may be useful for studying the regulation of cell differentiation.

본원에 따른 TNT를 포함하는 세포배양 플랫폼은 세포의 층쌓기 및 층분리가 용이하여, 세포 공배양을 통해 편리하고, 간편하며, 저렴하게 세포간 소통의 상세한 분석에 유용하게 사용될 수 있다. 또한 저렴한 비용으로 단순 세포 공배양에도 사용될 수 있다. The cell culture platform including TNT according to the present invention can be conveniently used for detailed analysis of intracellular communication through convenient and simple and inexpensive cell co-cultivation by facilitating layering and layer separation of cells. It can also be used for simple cell co-culture at low cost.

실시예 8: Example 8: 갭연결Gap connection ( ( JunctionJunction )을 통한 유방암 세포주 및 ) &Lt; / RTI &gt; hMSChMSC 간의  Liver 세포간Intercellular 소통 확인 Confirm communication

전이성 유방암 (MDA-MB-231)을 단지 갭연결을 통해 전달되는 칼세인-AM (2.5 μM, Sigma-Aldrich, CA, USA) 으로 표지하였다. 표지된 유방암 세포는 TNT 막에서 비표지된 hMSC와 함께 공배양하였다. 배양 2일 후에, 칼세인-AM 전달정도는 형광현미경으로 관찰하였다 (Carl Zeiss, Germany; 10x objective lens). 결과는 도 4a 및 4b에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이 칼세인 AM은 갭연결을 통해서만 전달 될 수 있는 것으로, 갭연결을 통한 직접적 소통이 가능하며, 세포간 직접적 물리적 접촉은 없음을 나타낸다.
Metastatic breast cancer (MDA-MB-231) was labeled with calcein-AM (2.5 μM, Sigma-Aldrich, CA, USA) delivered only through the gap junction. Labeled breast cancer cells were co-cultured with unlabeled hMSCs in TNT membranes. Two days after incubation, the degree of calcein-AM delivery was monitored by fluorescence microscopy (Carl Zeiss, Germany; 10x objective lens). The results are shown in Figures 4A and 4B. As can be seen, the curcane AM can be delivered only through the gap connection, allowing direct communication through the gap connection and no direct physical contact between the cells.

실시예 9: 막을 통해 Example 9: 확산된Diffused 표피성장인자 ( Epidermal growth factor ( EGFEGF )의 정량)

막 두께의 증가에 따른 EGF의 나노포러스 막을 통한 확산을 조사하였다. 막 두께 조절을 위해 단층의 TNT 막을 3층, 5층, 및 8층으로 쌓았다. TNT 막 및 쌓인 막을 챔버의 웰 사이에 정치하였으며, 막이 웰을 분리하였다. 이어 EGF 단백질을 포함하는 PBS 용액을 각 웰에 추가하고, 동일 부피의 PBS를 다른 웰에 추가하였다. 단백질 확산은 막의 양 측에 있는 용액 중의 농도 차이로 계산하였다. 섭씨 37도에서 이틀간 배양 후에, 브래드포드 분석법(Bio-Rad, CA, USA)을 이용하여 확산된 단백질을 정량하였다. The diffusion of EGF through the nanoporous membrane was investigated with increasing film thickness. TNT films of single layer were stacked in layers 3, 5, and 8 to control film thickness. The TNT film and the deposited film were placed between the wells of the chamber, and the membranes separated the wells. A PBS solution containing EGF protein was then added to each well, and an equal volume of PBS was added to the other wells. Protein diffusion was calculated as the difference in concentration in the solution on both sides of the membrane. After two days of incubation at 37 degrees Celsius, the diffused protein was quantified using Bradford assay (Bio-Rad, CA, USA).

나아가 TNT 막을 통한 단백질 확산의 분석을 증명하기 위하여, 장치를 제조하였다. TNT 막은 두 챔버 사이에 위치하며, 챔버는 10% FBS를 포함하는 PBS 중에 80 μg/ml의 EGF (E9644, Sigma Aldrich, USA) (EGF 챔버) 또는 10% FBS를 포함하는 PBS만 포함(완충액 챔버)하였다. EGF는 막을 통해 EGF 챔버에서 완충액 챔버로 확산되었다. 배양시간 증가에 따라 측면에서 챔버 용액 일부를 제거하여 상이한 시간 지점 (1, 3, 6, 12, 및 24 h) 에서의 EGF의 양을 샌드위치 ELISA를 이용하여 정량하였다. 웰의 바닥은 EFG에 대한 토끼 폴리클로날 항체(ab9695, Abcam, Cambridge, England) 로 코팅되어 있었다. 정확한 정량을 위해 표준시료로 0, 1, 5, 10, 50 및 100 μg/ml의 EGF (ab10409, Abcam)를 사용하였다. 각 웰을 TBST 완충액으로 세척한 후 항 마우스 항체-호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP)를 2차 항체로 사용하여 분석하고, 발색 기질은 TMB (3,3', 5,5' tetramethylbenzidine) (N301, Waltham, MA, USA)을 사용하였으며, 흡광도는 450nm에서 측정하였다. To further demonstrate the analysis of protein diffusion through the TNT membrane, a device was prepared. The TNT membrane is located between the two chambers and the chamber contains only PBS containing 80 μg / ml EGF (E9644, Sigma Aldrich, USA) (EGF chamber) or 10% FBS in PBS containing 10% FBS ). EGF was diffused through the membrane from the EGF chamber into the buffer chamber. The amount of EGF at different time points (1, 3, 6, 12, and 24 h) was quantitated using a sandwich ELISA by removing a portion of the chamber solution from the side as the incubation time increased. The bottoms of the wells were coated with rabbit polyclonal antibody to EFG (ab9695, Abcam, Cambridge, England). For accurate quantification, 0, 1, 5, 10, 50 and 100 μg / ml EGF (ab10409, Abcam) were used as standard samples. Each well was washed with TBST buffer and analyzed using anti-mouse antibody-horseradish peroxidase (HRP) as a secondary antibody. The chromogenic substrate was TMB (3,3 ', 5,5' tetramethylbenzidine) (N301 , Waltham, Mass., USA), and the absorbance was measured at 450 nm.

결과는 도 5a 내지 도 5d에 기재되어 있다. 파라크라인 신호전달에 미치는 막 두께의 영향은 10μm 두께의 20 중량% CA 막 및 480nm 두께의 4 중량 % CA 막 및 PET 막을 이용하여 측정하였다. 도 5a에 나타난 바와 같이, 65% RH에서 제조된 480nm 두께의 4 중량 % CA 막을 이용한 경우에 가장 많은 RANTES 발현이 관찰되었다. 층쌓기의 층을 늘려 세포간의 사이토카인의 분비에 미치는 거리를 조사한 시험을 통해 세포간 파라크라인 소통의 결과로서 분비된 RNATES 양은 세포간 거리와 강한 상관관계를 나타냈다 (도 5b). 파라크라인 신호전달에서 신호전달 분자는 근접한 위치의 표적세포에 영향을 미치며, 분비세포에서 거리가 멀어질수록 신호전달 분자가 확산되면서 농도구배가 형성된다. 이러한 관점에서 공배양된 세포간의 근접한 거리는 세포간 신호분석에서 중요한 파라미터이고, 본원에 따른 막의 경우 상이한 세포주 간에 마이크로미터 이하의 거리를 유지하는 환경을 제공할 수 있다. The results are shown in Figures 5A-5D. The effect of the film thickness on the paracrine signal transmission was measured using a 10 wt% 20 wt% CA film and a 480 wt% 4 wt% CA film and a PET film. As shown in FIG. 5A, the highest RANTES expression was observed when a 4 wt% CA film of 480 nm thickness prepared at 65% RH was used. By increasing the layer thickness and examining the distance to the secretion of cytokines between cells, the amount of RNATES secreted as a result of intercellular paracrine communication showed a strong correlation with the intercellular distance (FIG. 5b). In paracrine signaling, a signaling molecule affects a target cell in close proximity. As the distance from the secretory cell increases, a concentration gradient is formed as the signaling molecule diffuses. In this respect, the proximity distance between co-cultured cells is an important parameter in intercellular signal analysis, and in the case of the membrane according to the present invention, it is possible to provide an environment maintaining a sub-micrometer distance between different cell lines.

나아가 상술한 바와 같이 하나의 챔버는 EGF를 포함하는 완충액으로 채워져 있고, 다른 챔버는 완충액만 있는 챔버를 사용하여 EGF 확산을 시험한 결과, 막을 가로질러 EGF의 농도구배가 생성된 것으로 나타났으며, 확산된 EGF의 농도는 층의 갯수가 많아 질수록 감소하였다 (도 5c 및 5d). 특히 EGF에 대한 ELSIA 분석 결과 EGF는 6시간 배양에서 포화된 것으로 나타났다. 단백질 농도는 24시간 배양 후에도 동일하였다. 이러한 결과는 본원의 방법에 의해 제조된 나노스케일의 구멍 및 마이크로미터 아래의 두께를 갖는 TNT 막은 다른 챔버에 있는 세포사이에서 단백질을 효율적으로 전달 할 수 있음을 나타내며, 또한 6시간이 막을 통한 단백질 확산에 중요함을 나타낸다. 이러한 결과는 본원에 따른 잘 규정된 다공성의 초박 TNT 막이 세포간 소통의 연구에 중요한 신호전달 물질의 확산에 효과적임을 나타내는 것이다.
Further, as described above, one chamber was filled with a buffer containing EGF, and the other chamber was tested for EGF diffusion using a buffer only chamber, resulting in a gradient of EGF concentration across the membrane, The concentration of diffuse EGF decreased as the number of layers increased (FIGS. 5C and 5D). In particular, ELISA analysis of EGF revealed that EGF was saturated in the culture for 6 hours. Protein concentrations were the same after 24 hours of incubation. These results indicate that the TNT membrane with nanoscale holes and below-micrometer thickness produced by the method of the present invention is able to efficiently transfer proteins between cells in different chambers, . These results indicate that the well-defined porous ultra-thin TNT membrane according to the present invention is effective in spreading signaling substances important for the study of intercellular communication.

이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.
While the present invention has been described in connection with what is presently considered to be the preferred embodiments, it is to be understood that the invention is not limited to the disclosed embodiments, but, on the contrary, .

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다. All technical terms used in the present invention are used in the sense that they are generally understood by those of ordinary skill in the relevant field of the present invention unless otherwise defined. The contents of all publications referred to herein are incorporated herein by reference.

Claims (22)

비용제성 증기유도된 상분리 방법에 의한 나노스케일의 구멍 및 두께를 갖는 프리스탠딩의 전달가능한 막의 제조방법으로, 상기 방법은 상대 습도가 조절되는 폐쇄 챔버에서 폴리머를 스핀 코팅하는 단계 및 상기 챔버의 습도를 조절하는 단계를 포함하며, 상기 습도는 적어도 하나의 과포화된 염 용액을 이용하여 수행되며, 이에 의해 상기 막의 구멍의 밀도가 조절되는 것인, 방법,
A method of manufacturing a freestanding, transferable membrane having nanoscale holes and thicknesses by a non-solvent vapor-induced phase separation method, the method comprising spin coating a polymer in an enclosed chamber in which relative humidity is controlled, Wherein the humidity is performed using at least one supersaturated salt solution whereby the density of the pores of the membrane is regulated,
제 1 항에 있어서,
상기 폴리머는 셀룰로스 아세테이트, 폴리설폰, 폴리에테르설폰, 폴리아릴로니트릴, 셀룰로식, 폴리비닐리덴플루오리드, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리이미드 또는 폴리아미드인, 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the polymer is selected from the group consisting of cellulose acetate, polysulfone, polyethersulfone, polyarylonitrile, cellulosic, polyvinylidene fluoride, polytetrafluoroethylene, polyimide or polyamide.
제 1 항에 있어서,
상기 과포화된 염은 LiCl, CaCl2, MgCl2, KCO3, NaBr, NaCl, 또는 KCl인, 방법.
The method according to claim 1,
Salt of the supersaturation is LiCl, CaCl 2, MgCl 2, KCO 3, NaBr, The method of NaCl, or KCl.
제 1 항에 있어서,
상기 과포화된 염은 CaCl2 및 KCl이고, 이 경우 상기 상대 습도는 25%부터 85%까지 증가되고, 상기 CaCl2 는 상기 상대습도가 25-45% 인 경우에 사용되며, 상기 KCl은 상기 상대습도가 55-85% 인 경우에 사용되는 것인, 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the supersaturated salt is CaCl 2 and KCl, wherein the relative humidity is increased from 25% to 85%, the CaCl 2 is used when the relative humidity is 25-45%, the KCl is the relative humidity Is 55-85%.
제 1 항에 있어서,
상기 상대 습도는 점진적으로 증가되거나, 또는 25, 35, 45, 55, 65, 75 및 85%로 단계적으로 증가되는 것인, 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the relative humidity is incrementally increased or stepwise increased to 25, 35, 45, 55, 65, 75 and 85%.
제 1 항에 있어서,
상기 상대습도는 상온 또는 30℃에서 조절되는 것인, 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the relative humidity is adjusted at room temperature or 30 &lt; 0 &gt; C.
제 1 항에 있어서, 상기 막의 두께는 스피닝 속도, 폴리머 농도 또는 폴리머의 용제에 대한 용해도 중 하나 이상에 따라 결정되는 것인, 방법.
The method of claim 1, wherein the thickness of the film is determined according to at least one of a spinning speed, a polymer concentration, or a solubility of the polymer in a solvent.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 의해 제조된 나노스케일의 관통하는 다수의 구멍을 포함하며 두께가 500 nm 이하인 하나 이상의 프리스탠딩 나노스케일 막 및 상기 막에 의해 분리되는 제1 및 제2 챔버를 포함하는 세포배양 장치.
10. A nanostructured film comprising at least one free standing nanoscale film comprising a plurality of nanoscale penetrating holes made according to any one of claims 1 to 7 and having a thickness of 500 nm or less and a first and a second A cell culture apparatus comprising a chamber.
제 8 항에 있어서,
상기 제1 및 제2 챔버는 상기 나노스케일 막의 관통하는 다수의 구멍을 통해 소통가능한 것인, 세포배양 장치.
9. The method of claim 8,
Wherein the first and second chambers are communicable through a plurality of through-holes of the nanoscale membrane.
제 8 항에 있어서,
상기 제1 및 제2 챔버는 세포 배양 배지를 포함하며, 상기 제1 챔버는 제1 세포를 포함하며, 상기 제2 챔버는 제2 세포를 포함하는, 세포배양 장치.
9. The method of claim 8,
Wherein the first and second chambers comprise a cell culture medium, wherein the first chamber comprises a first cell and the second chamber comprises a second cell.
제 10 항에 있어서, 상기 제1 세포 및 상기 제2 세포는 동일하거나 상이하며, 또는 상기 제1 세포 및 제2 세포 중 하나 이상은 두 가지 이상의 상이한 세포의 혼합물인, 세포배양 장치.
11. The cell culture apparatus according to claim 10, wherein the first cell and the second cell are the same or different, or at least one of the first cell and the second cell is a mixture of two or more different cells.
제 8 항에 있어서,
상기 장치는 상기 제1 챔버 및 상기 제2 챔버 사이에 하나 이상의 중간 챔버를 포함하며, 상기 중간 챔버는 상기 제1 및 상기 제2 챔버 각각과 나노스케일 막에 의해 분리되는 것인, 세포배양 장치.
9. The method of claim 8,
Wherein the apparatus comprises one or more intermediate chambers between the first chamber and the second chamber, wherein the intermediate chamber is separated by the nanoscale film and the first and second chambers, respectively.
제 12 항에 있어서, 상기 중간 챔버는 두 개 내지 열 개를 포함하는 것인, 세포배양 장치.
13. The cell culture apparatus according to claim 12, wherein the intermediate chamber includes two to ten cells.
제 12 항에 있어서,
상기 제1, 제2 및 중간 챔버는 세포 배양 배지를 포함하며, 상기 적어도 하나의 챔버는 동일 또는 상이한 세포 또는 상이한 세포의 혼합물을 포함하는 것인, 세포 배양 장치.
13. The method of claim 12,
Wherein the first, second and intermediate chambers comprise a cell culture medium, wherein the at least one chamber comprises the same or a different cell or a mixture of different cells.
제 8 항에 있어서,
상기 나노스케일 막의 구멍 밀도는 제곱 센티미터 당 105 내지 106 인, 세포 배양 장치.
9. The method of claim 8,
Wherein the hole density of the nanoscale membrane is 10 &lt; 5 &gt; to 10 &lt; 6 &gt; per square centimeter.
제 8 항에 있어서,
상기 구멍의 평균 크기는 50 내지 100nm인, 방법.
9. The method of claim 8,
Wherein the average size of the holes is 50 to 100 nm.
두 종류 이상 세포의 공배양 방법으로,
두 개 이상의 챔버를 포함하는 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 나노스케일 막을 제공하는 단계, 상기 나노스케일 막이 두 개 이상 포함되는 경우, 상기 막은 위아래 또는 좌우 방향으로 층으로 배열되고,
상기 각 막에 세포를 씨딩하는 단계, 상기 각 막에 씨딩되는 세포는 동일 또는 상이한 종류이거나, 두 종류 이상의 세포의 혼합 세포이고, 그리고,
상기 세포를 배양하는 단계를 포함하며, 상기 세포는 상기 막의 구멍을 통해 서로 소통가능한 것인, 세포의 공배양 방법.
By co-culturing two or more kinds of cells,
Providing a nanoscale membrane according to any one of claims 1 to 6, wherein the nanoscale membrane comprises two or more chambers; when the nanoscale membrane comprises more than one of the nanoscale membranes, the membranes are arranged in layers up, down,
The method comprising the steps of: seeding cells in each of the above-mentioned membranes, wherein cells to be seeded in the respective membranes are the same or different types, or mixed cells of two or more kinds of cells,
Culturing the cell, wherein the cell is capable of interacting with each other through a hole in the membrane.
제 17 항에 있어서,
상기 소통은 치밀연결 또는 갭연결을 포함하는 직접 접촉에 의한 소통, 또는 파라크라인 또는 엔도크라인 신호전달을 포함하는 가용성 인자의 교환에 의한 간접 소통인, 세포의 공배양 방법.
18. The method of claim 17,
Wherein said communication is indirect communication by direct contact involving dense or gap connections, or exchange of soluble factors including paracrine or endocrin signaling.
제 17 항에 있어서,
상기 세포는 동물, 식물, 박테리아 진균류, 이스트 또는 조류 (algae)유래인, 세포의 공배양 방법.
18. The method of claim 17,
Wherein said cells are derived from animals, plants, bacterial fungi, yeast or algae.
제 19 항에 있어서,
상기 세포는 암세포 또는 스트로마 세포이며, 상기 암세포 및 스트로마 세포는 각각 상이한 막에 씨딩되는 것인, 세포의 공배양 방법.
20. The method of claim 19,
Wherein said cells are cancer cells or stromal cells, and said cancer cells and stromal cells are each seeded with a different membrane.
제 17 항에 있어서,
상기 막의 상대적 위치는 변할 수 있거나, 또는 상기 막 중의 적어도 하나는 새로운 막으로 대체될 수 있으며, 상기 새로운 막은 이미 존재하는 막에 씨딩된 세포와 동일 또는 상이한 것인, 방법.
18. The method of claim 17,
Wherein the relative position of the membrane can be varied or at least one of the membranes can be replaced with a new membrane and the new membrane is the same or different from the cells seeded in an existing membrane.
하나 이상의 세포배양 배지, 하나 이상의 세포 주 및 상기 세포를 공배양하는 안내서를 포함하는 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 막을 포함하는 세포 공배양 키트. A cell co-culture kit comprising one or more cell culture media, one or more cell lines, and a membrane according to any one of claims 1 to 6, including a guide for co-culturing the cells.
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