KR20150052990A - A Medium for Culturing Donor Cells on Preparation of Cloned Canidae Using Somatic Cell Nuclear Transfer and The Use thereof - Google Patents

A Medium for Culturing Donor Cells on Preparation of Cloned Canidae Using Somatic Cell Nuclear Transfer and The Use thereof Download PDF

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Abstract

The present invention relates to an efficient in vitro culture system using nuclear transfer technology for cloning Canidae and, more specifically, to a culture medium composition which produces an optimal effect in culturing a nuclear donor cell used in somatic cell or stem cell nuclear transfer for Canidae, and the use thereof. The present invention provides a qualitatively or quantitatively enhanced nuclear donor cell which has excellent proliferation ability, stemness (totipotency), reprogramming capability and telomerase activity necessary for cloning Canidae, thus remarkably increasing the efficiency of the successful nuclear transfer in cloning Canidae.

Description

개과 동물 복제용 핵 공여 세포 배양용 배지 및 이의 이용{A Medium for Culturing Donor Cells on Preparation of Cloned Canidae Using Somatic Cell Nuclear Transfer and The Use thereof}[0001] The present invention relates to a medium for nuclear donor cell culture for cloning canines and their use,

본 발명은 핵 이식 기술에 따른 개과 동물(Canidae)의 복제에 있어서의 효율적인 체외(in vitro) 배양체계에 관한 것으로서, 좀 더 상세하게는 개과 동물의 체세포 또는 줄기세포 핵 이식에 사용되는 핵 공여 세포의 배양에 최적의 효과를 나타내는 배지 조성물 및 이의 이용에 관한 것이다.
The present invention relates to an efficient in vitro culture system for the replication of Canidae according to nuclear transfer technology, and more particularly, to a nuclear-donor cell used for somatic cell or stem cell nuclear transfer of canine , And to their use.

생명공학 또는 유전자 조작기술의 발달에 따라 원하는 형질들로 조합한 다양한 재조합 생명체들의 여러가지 생산 성공사례가 발표되어 왔고, 최근에는 예컨대 양 등과 같은 복제 동물들의 생산에 성공한 사례들이 속속 보고되었다.Several successful examples of the production of various recombinant organisms in combination with desired traits have been published in accordance with the development of biotechnology or genetic engineering techniques, and recently, cases of successful production of cloned animals such as sheep have been reported.

체세포 핵 이식을 통한 포유동물 복제기술은 영국 로슬린 연구소의 윌멋(Wilmut) 박사에 의해 6세 된 암컷 양에서 채취한 유선세포를 핵이 제거된 난자에 이식하여 핵 이식란을 생산한 후 생체 내 이식을 통하여 체세포 복제동물인 돌리를 탄생시킴으로써 최초로 성공하였다. 이후 소, 마우스, 염소, 돼지 및 토끼 등에서 체세포 핵이식 방법에 의한 복제된 산자 생산이 보고 되었다(WO9937143A2, EP930009A1, WO9934669A1, WO9901164A1 및 US5,945,577).Mammalian cloning technology using somatic cell nuclear transfer is performed by Dr. Wilmut of the Rosslyn Institute in England. The mammalian cell, which is taken from a female female, 6 years old, is transplanted into a nucleus-free oocyte to produce a nuclear transfer embryo. Was the first to succeed in producing the somatic clone Dolly. Replicated acid production by somatic cell nuclear transfer methods has been reported in cows, mice, goats, pigs and rabbits (WO9937143A2, EP930009A1, WO9934669A1, WO9901164A1 and US5945,577).

복제 동물을 생산하는 기술은 상업적 유용성뿐 아니라, 생체의학과 생물학 연구에 있어서도 그 중요성은 압도적이다. 복제 동물 생산기술의 산업적 적용분야는 고품질의 축산식품 생산, 고부가가치의 약리활성물질 생산, 각종 병원균에 대한 생체저항력 향상동물 생산, 질환 모델 동물의 생산 및 유전자치료 분야에 이르기까지 매우 광범위하다.The technology of producing cloned animals is not only of commercial utility, but also of biomedical and biological research. Industrial applications of cloned animal production technology are very wide ranging from production of high quality animal food, production of high value added pharmacologically active substances, production of animal resistance to various pathogens, production of animal models of disease, and gene therapy.

복제 동물의 다양한 용도 중에서도, 소, 돼지와 같은 산업동물의 복제와 더불어, 요즘 같은 산업화 및 정보화 시대를 거쳐오면서 개, 고양이 등의 애완 동물 및 반려 동물의 복제는 많은 사람들의 관심의 대상이 되고 있다. Among the various uses of clones, cloning of pets and companion animals such as dogs and cats, as well as the cloning of industrial animals such as cows and pigs, has been a subject of interest for many people since the days of industrialization and information .

이 중 특히 반려견에에 대한 심리적 의존도가 급격히 증가하고 있고, 개과 동물의 우수한 능력을 이용하는 검역견이나 마약탐지견과 같은 특수목적견의 필요성도 증가하고 있다. 또한, 인간의 난치질환 연구모델분야에서는 여러 한계가 있는 설치류를 대신하여 개과 동물이 선호되고 있는 추세이다. 개는 인간과 생리학적 특성이 비슷하고 사람과 동물의 유사한 질병 발생 패턴을 을 가지고 있어 병리학적, 생리학적으로도 유사하며, 실제로 인간 질병연구에 응용할 수 있는 유전 질병의 수가 65개의 돼지나 136개의 고양이와 비교해 개는 224개로 월등히 많아 (http://omia.angis.org.au/) 이러한 유전 형질을 이용하여 인간의 질병모델 복제개를 만들면 인간 질병연구에 큰 도움이 되는 중요한 의미가 있다.In particular, psychological dependence on dogs is increasing rapidly, and the need for special purpose dogs such as quarantine dogs and drug detection dogs that utilize the superior ability of canines is also increasing. In addition, in the field of human intractable disease research models, canines are preferred instead of rodents having various limitations. Dogs have similar physiological characteristics to human beings and have similar pathogenesis patterns in humans and animals. They are similar in pathology and physiology. In fact, there are 65 hereditary diseases that can be applied in human disease research, Compared to cats, there are 224 dogs (http://omia.angis.org.au/). Using these genetic traits to clone a human model of disease has important implications for human disease research.

그렇기 때문에 오랜 기간 개복제에 대한 시도가 이루어져왔으나, 현재까지 개 복제는 여전히 성공률이 극히 낮고, 성공하기 어려운 복제로 여겨지고 있으므로, 개과 동물의 복제 효율을 향상시키기 위한 다양한 방법이 필요한 실정이다.
Therefore, attempts have been made to reproduce dogs for a long time, but dog cloning is still considered to be an extremely low success rate and difficult to succeed. Therefore, various methods are needed to improve the efficiency of cloning of canine.

이에 본 발명자들은 체세포 핵이식 방법에 의한 복제개의 향상된 생산방법을 연구하던 중, 핵 공여 세포 제조에 있어서, 특정 물질을 함유하는 특정 배지에 핵 공여 세포를 배양시킴으로써, 개복제에 필요한 증식능, 줄기세포성(전능성), 리프로그래밍능 및 텔로머라아제 활성이 현저히 우수한, 양적 및 질적 모두 향상된 핵 공여 세포를 수득할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
Therefore, the inventors of the present invention have been studying an improved production method of replication by the somatic cell nuclear transfer method. In the process of manufacturing the nuclear donor cell, by culturing the nuclear donor cell in a specific medium containing a specific substance, The present inventors confirmed that nuclear donor cells improved in both quantitative and qualitative quality with remarkably excellent reprogramming ability and telomerase activity can be obtained.

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본 발명의 주요 목적은 개과 동물의 세포 핵 이식에 사용되는 핵 공여 세포의 배양에 특이적으로 적합한 배지를 제공하고자 하는 데 있다.The main object of the present invention is to provide a medium specifically suitable for culturing nuclear donor cells used for cell nuclear transfer of canines.

본 발명의 다른 목적은 상기 배지를 이용하여 개과 동물의 핵 이식란 생산 및 복제 산자 생산의 효율을 높이는 방법을 제공하고자 하는 데 있다.
It is another object of the present invention to provide a method for enhancing the production of nuclear transfer embryos and production of cloned embryos of canine animals using the medium.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은In order to solve the above problems,

기본 배지로서 DMEM(dulbecco modified eagle medium), 성장 인자, 항산화제 및 10~20% FBS(fetal bovine serum) 및 비필수 아미노산을 함유하는, 개과 동물 복제용 핵 공여 세포 배양용 배지를 제공한다. The medium for nucleus donor cell culture for canine reproduction comprising DMEM (dulbecco modified eagle medium), growth factor, antioxidant and 10-20% FBS (fetal bovine serum) and non-essential amino acid as a basic medium is provided.

이 때, 상기 성장 인자는 섬유아세포 증식인자(FGF)이고, 상기 항산화제는 아스코르브산 또는 비타민 C인 것이 바람직하며, 특히 아스코르브산인 것이 가장 바람직하다. 또한, 상기 비필수 아미노산은 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루타민산, 글리신, 프롤린 및 세린을 함유하는 MEM 비필수 아미노산이 바람직하다.
At this time, the growth factor is a fibroblast growth factor (FGF), and the antioxidant is preferably ascorbic acid or vitamin C, and most preferably ascorbic acid. The non-essential amino acids are preferably MEM non-essential amino acids containing alanine, asparagine, aspartic acid, glutamic acid, glycine, proline and serine.

따라서, 본 발명의 가장 바람직한 구체예로서는, 기본 배지로서 DMEM(dulbecco modified eagle medium)(high-glucose), 섬유아세포 증식인자(FGF), 아스코르브산, 비필수 아미노산 및 10~20% FBS를 함유하는,개과 동물 복제용 핵 공여 세포 배양용 배지를 들 수 있고, 더욱 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 0.2 mM 아스크로브산, 10ng/mL의 섬유아세포 증식인자, 10% FBS, 및 1% MEM 비필수 아미노산을 함유하는 DMEM(dulbecco modified eagle medium)(high-glucose) 기반 배지를 사용하였다.
Therefore, the most preferable specific example of the present invention is a culture medium containing DMEM (dulbecco modified eagle medium) (high-glucose), fibroblast growth factor (FGF), ascorbic acid, nonessential amino acid and 10-20% 10 ng / mL of fibroblast growth factor, 10% FBS, and 1% MEM in the case of the present invention, and more specifically, in an embodiment of the present invention, DMEM (dulbecco modified eagle medium) (high-glucose) -based medium containing non-essential amino acids was used.

한편, 상기 핵 공여 세포는 개과 동물 체세포 또는 줄기세포 유래인 것을 사용할 수 있는데, 이 때, 상기 체세포는 유사분열 G2/M단계의 것이 바람직하다.Meanwhile, the nuclear donor cells can be derived from canine somatic cells or stem cells, wherein the somatic cells are preferably of the mitotic G2 / M stage.

체세포는 개과 동물의 난구세포, 상피세포, 섬유아세포, 신경세포, 각질세포, 조혈세포, 멜라닌 세포, 연골세포, 마크로파지, 단구세포, 근육세포, B 림프구, T 림프구, 배아 줄기세포, 배아 생식세포, 태아 유래 세포, 성체 유래 세포, 태좌세포 및 배아세포로 이루어진 그룹 중에서 선택된 어느 하나를 사용할 수 있는데, 바람직하게는 섬유아세포 또는 난구세포를, 가장 바람직하게는 섬유아세포를 사용한다.The somatic cells are selected from the group consisting of cumulus cells, epithelial cells, fibroblasts, neurons, keratinocytes, hematopoietic cells, melanocytes, cartilage cells, macrophages, monocytes, muscle cells, B lymphocytes, T lymphocytes, embryonic stem cells, embryonic germ cells , Embryo-derived cells, adult-derived cells, embryonic cells and embryonic cells. Preferably, fibroblasts or cumulus cells are used, and most preferably fibroblasts are used.

상기 줄기세포는 배아 또는 성체 유래인 것을 사용할 수 있으나, 윤리적인 문제 등을 고려하여 성체 줄기세포를 사용하는 것이 바람직하다.The stem cells may be embryonic or adult-derived, but it is preferable to use adult stem cells in view of ethical problems and the like.

이러한 성체 유래 줄기세포는 골수, 제대혈, 혈액, 지방, 피부, 위장관, 태반 및 자궁으로 구성된 군으로부터 선택된 조직으로부터 분리할 수 있는데, 본 발명의 일 실시예에서는 개의 지방으로부터 분리하여 사용하였다.
Such adult stem cells can be isolated from tissues selected from the group consisting of bone marrow, umbilical cord blood, blood, fat, skin, gastrointestinal tract, placenta and uterus. In one embodiment of the present invention,

본 발명은 또한, 개과 동물 복제용 핵 공여 세포 배양용 배지의 이용을 제공한다.The present invention also provides use of a medium for nuclear donor cell culture for replicating canine.

일 구체예로써, 개과 동물의 복제를 위하여, 상기 설명한 배지를 이용하는 것을 특징으로 하는, 개과 동물 복제용 핵 공여 세포를 배양하는 방법을 제공한다.As a specific example, there is provided a method for culturing a nuclear donor cell for canine reproduction, which uses the above-described medium for cloning of canine animals.

이 때, 핵 공여세포의 배양은 5계대까지, 바람직하게는 3계대 또는 4계대까지 이루어지는 것이 바람직하고, 각 계대에서의 배양은 90 %컨플루언스 이상의 값에 도달할 때까지 수행되는 것이 바람직하다. 특히, 핵 공여세포의 1차 배양은 7 내지 10일 동안 이루어질 수 있고, 총 배양 기간은 약 14~17일 정도가 소요될 수 있다. At this time, it is preferable that the cultivation of the nuclear donor cells is carried out up to 5 passages, preferably 3 passages or 4 passages, and the culture in each passage is preferably carried out until a value of 90% confluence or more is reached . In particular, the primary culture of nuclear donor cells can be performed for 7 to 10 days, and the total incubation period can take about 14 to 17 days.

다른 구체예로써, 본 발명은 상기 방법으로 배양한 핵 공여 세포를 분리하여 탈핵된 난모 세포에 이식 한 다음 이를 융합시켜 핵 이식란을 제조하는 단계; 및 상기 제조된 핵 이식란을 즉시 대리모에게 이식시켜 발생시키는 단계를 포함하는, 복제된 개과 동물의 생산방법을 제공한다.
In another embodiment, the present invention provides a method for preparing a nuclear transfer embryo, comprising the steps of: isolating nuclear donor cells cultured by the above method, transplanting the nuclear donor cells into enucleated oocytes, And transplanting the produced nuclear transfer embryo to a surrogate mother immediately, thereby producing a cloned canine.

이처럼, 본 발명은 개과 동물의 체세포 핵 이식 산자 생산 효율을 향상시키기 위한 핵 공여 세포 배양에 대하여 유난히 효과가 우수한 배지 조성물 및 이의 모든 용도를 포함한다. Thus, the present invention encompasses a media composition and its use all of which are exceptionally effective for nuclear donor cell culture for improving somatic cell nuclear transfer product production efficiency in canines.

본 발명은 개복제에 필요한 증식능, 줄기세포성(전능성), 리프로그래밍능 및 텔로머라아제 활성이 우수한, 양적 및 질적 모두 향상된 핵 공여 세포를 제공함으로써, 개과 동물의 복제에 있어서의 성공적인 핵이식 효율을 현저히 향상시킨다. 이를 통해 개과 동물을 고효율로 복제할 수 있게 함으로써 개과동물 우량 품종의 번식, 보존, 이종이식, 질환 모델동물 생산 등 수의학, 인류학 및 의학연구 분야의 발달에 기여할 수 있을 것이다.
The present invention relates to a method for producing a nuclear transfer protein in which the nuclear transfer efficiency in nuclear transfer of a canine animal is improved by providing nuclear donor cells both of which are both quantitatively and qualitatively superior in the proliferation, stem cell (omnipotency), reprogramming ability and telomerase activity necessary for dog reproduction ≪ / RTI > This will contribute to the development of veterinary, anthropological and medical research fields such as reproduction, preservation, xenotransplantation, disease model animal production and breeding of good breeds of canine breeds by enabling high efficiency replication of canines.

도 1은 개 체세포(섬유아세포) 유래 핵 공여 세포를 DMEM 및 RCME-P 배지에서 배양하여 단일층을 형성하는데 소요되는 시간을 나타낸 그래프이다.
도 2는 DMEM배지에서의 일차 배양(A) 및 RCME-P배지에서의 일차 배양(B)시 핵 공여 체세포의 형태학적 특성 비교 및 세포 크기 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 DMEM 및 RCME-P 각각의 배지를 사용한 경우에 핵 공여 체세포에서의 유전자 발현 정도를 나타낸 그래프로,(A) 1차 배양기간, (B) 전능성과 관련된 유전자(SOX2, NANOG, DPPA2,Rex1) 발현, (C) 리프로그래밍과 관련된 유전자(HDAC, DNMT1, DNMT3a, DMNT3b, and MeCp2) 발현, (D) 세포사와 연관된 유전자(Bax, and Bcl2) 발현의 수준을 비교한 결과이다.
도 4는 개 지방 줄기세포 유래 핵 공여 세포를 DMEM 및 RCME-P 배지에서 배양한 경우의 여러가지 유전자 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 5는 DMEM 및 RCME-P에서 배양된 핵 공여 체세포에서의 텔로머라아제 활성을 비교한 결과이다.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a graph showing the time taken to form a monolayer by cultivating nuclear donor cells derived from somatic cells (fibroblasts) in DMEM and RCME-P medium.
Fig. 2 shows morphological characteristics and cell size comparison results of the nuclear donor somatic cells in the primary culture (A) in the DMEM medium and the primary culture (B) in the RCME-P medium.
FIG. 3 is a graph showing the degree of gene expression in nuclear donor somatic cells when DMEM and RCME-P media are used, respectively. (A) Primary culture period, (B) Genes related to allergy ( SOX2 , NANOG , DPPA2, Rex1) expression, a result obtained by comparing the level of the (C) associated with the reprogramming gene (HDAC, DNMT1, DNMT3a, DMNT3b, and MeCp2) expression, (D) expressed genes associated with cell death (Bax, Bcl2 and).
FIG. 4 shows the degree of gene expression when cultured in DMEM and RCME-P medium of donor stem cell-derived nuclear donor cells.
FIG. 5 shows the results of comparing telomerase activities in nuclear donor somatic cells cultured in DMEM and RCME-P.

본 발명에서 사용되는 대표적인 용어에 대한 정의는 이하와 같다.
Representative terms used in the present invention are as follows.

"배양"은 생물체나 생물체의 일부(기관 ·조직 ·세포 등)를 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 일로써, 이 경우 외적 조건으로 온도 ·습도 ·빛 ·기체상의 조성(이산화탄소나 산소의 분압) 등이 중요하며, 그 밖에 배양되는 생물체에 가장 중요한 직접적인 영향을 주는 것은 배지(배양기)로, 그 생물체의 직접적인 환경인 동시에 생존이나 증식에 필요한 각종 영양소의 공급장이다. "Cultivation" is the cultivation of an organism or part of an organism (organ, tissue, cell, etc.) under moderately artificially controlled environmental conditions. In this case, external conditions such as temperature, humidity, light, gas phase composition The most important direct effect on the organism cultivated is the culture medium, which is a direct environment for the organism and a supply point for various nutrients necessary for survival and growth.

"체외배양"이란 세포 등이 체내에서 자라는 상태와 구분되는 방법으로 실험실의 인큐베이터(incubator)에서 체내의 환경과 유사한 조건으로 배양하는 일련의 실험실 과정을 의미하는 것으로, 본 발명의 배지 조성물은 핵 공여 세포의 체외배양에 최적화된 배지 조성물이다.The term "in vitro culture" means a series of laboratory procedures in which cells are cultured in an incubator in a laboratory in a manner similar to the environment in the body, Lt; RTI ID = 0.0 > in vitro < / RTI > culture of cells.

'배지' 또는 '배지 조성물'은 당, 아미노산, 각종 영양물질, 혈청, 성장인자, 무기질 등의 세포의 성장 및 증식 등에 필수적인 요소를 포함하는 생체 외에서 세포 등의 성장 및 증식을 위한 혼합물을 말한다. 특히, 본 발명의 배지는 개과 동물의 체세포 핵 이식 산자 생산 효율을 향상시키 위한 핵 공여 세포에 사용되는 배지이다.The term "medium" or "medium composition" refers to a mixture for growth and proliferation of cells, etc., which is essential for growth and proliferation of cells such as sugar, amino acids, various nutrients, serum, growth factors and minerals. In particular, the medium of the present invention is a medium used for nuclear donor cells for improving the somatic cell nuclear transfer product production efficiency of canines.

'핵 이식'은 탈핵된 난자에 다른 세포 또는 핵을 인공적으로 결합시켜 동일한 형질을 갖도록 하는 유전자 조작기술을 말한다.'핵 이식란'은 핵 공여 세포가 도입 또는 융합된 난자를 말한다. 'Nuclear transplantation' refers to a genetic manipulation technique that allows an enucleated oocyte to artificially bind other cells or nuclei to the same trait. "Nuclear oocyte" refers to an oocyte into which nuclear donor cells are introduced or fused.

'복제'는 한 개체와 동일한 유전자 세트를 가진 새로운 개체를 만드는 유전자 조작기술로서 특히 본 발명에서는 개과 동물의 체세포, 배아 세포, 태아 유래 세포 및/또는 성체 유래 세포가 다른 세포의 핵 DNA 서열과 실질적으로 동일한 핵 DNA 서열을 갖는 것을 말한다. 본 발명은 핵 이식 기술을 이용하여 개과 동물을 복제하는 기술에 관한 것이다. 특히, 체세포 핵 이식 기술은 생식과정에서 일반적으로 이루어지는 감수분열 및 반수 염색체 보유 생식세포를 경유하지 않고도 자손을 탄생시킬 수 있는 기술로서 성체가 가진 배수체 보유 체세포를 핵이 제거된 난자에 이식하여 수정란을 생산하고 상기 수정란을 생체 내로 이식하여 새로운 개체를 발생시키는 방법이다.In the present invention, somatic cells, embryonic cells, embryo-derived cells and / or adult-derived cells of a canine are genetically engineered to produce a new individual having the same gene set as that of one individual. Quot; refers to those having the same nucleotide DNA sequence. The present invention relates to techniques for replicating canines using nuclear transfer technology. In particular, somatic cell nuclear transfer technology is a technology that can produce offspring without passing through the meiosis and hemispheric retention cells that are common in the reproductive process. As a technology, transplanted somatic cells are transplanted into the nucleus- And the embryo is transplanted in vivo to generate a new individual.

'핵 공여 세포'는 핵 수용체인 수핵 난자로 핵을 전달하는 세포 또는 세포의 핵을 말한다. '난자'는 바람직하게는 제2차 감수분열 중기까지 도달한 성숙난자를 말한다. 본 발명에서 상기 핵 공여 세포로는 개과 동물의 체세포 또는 줄기세포를 사용할 수 있다.'Nuclear donor cells' refers to nuclei of cells or cells that deliver nuclei to recipient oocytes, which are nuclear receptors. The term " oocyte " preferably refers to a mature oocyte that has reached the middle stage of the second meiosis. In the present invention, somatic cells or stem cells of canine animals can be used as the nuclear donor cells.

'체세포(somatic cell)'란, 다세포 생물을 구성하는 세포 중 생식 세포 이외의 세포이며, 어떤 목적으로 특화하여 그 이외의 세포는 되지 않는 분화된 세포와, 몇종류인가의 다른 기능을 갖는 세포로 분화되는 능력을 갖는 세포를 포함한다.The term "somatic cell" refers to a cell other than a germ cell that constitutes a multicellular organism, a cell that is specialized for a specific purpose and does not become any other cell, and a cell having several different functions Cells that have the ability to differentiate.

'줄기세포(stem cell)'란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 만능성 줄기세포(totipotent stem cell), 전능성 줄기세포(pluripotent stem cell), 다능성 줄기세포(multipotent stem cell)로 분류할 수 있다. 소스에 따라 배아 줄기세포 또는 성체 줄기세포로 분류할 수도 있다. 본 발명에서는 바람직하게는 개과 동물의 성체 줄기세포를 사용할 수 있다."Stem cell" refers to a cell capable of self-replicating and capable of differentiating into two or more cells. The term "totipotent stem cell", "pluripotent stem cell", "pluripotent stem cell" It can be classified as a multipotent stem cell. Depending on the source, it can be classified into embryonic stem cells or adult stem cells. In the present invention, adult stem cells of canine animals are preferably used.

'계대 배양(Subcultury)' 은 세포는 단층으로 자라고 멈추기 때문에 배양 접시에서 세포를 떼어내어 새로운 배양 접시에서 배양하는 방법으로 세포를 증식시키는데 이때 세포를 동물에서 떼어내어 일차, 이차, 삼차 등등 계속하여 배양하는 방법 즉, 주기적으로 새로운 배지를 교환함으로써 세포주를 보존하는 방법을 말한다. 각 단계를 '계대(passage)'라고 일컫는다."Subculture" means that cells grow and monolayer, so cells are removed from the culture dish and cultured in a new culture dish. The cells are then removed from the animal and cultured in primary, secondary, tertiary, etc. That is, a method of preserving a cell line by periodically exchanging a new medium. Each step is called a "passage".

'융합'은 핵 공여 세포와 수핵 난자의 지질막 부분의 결합을 의미한다. 예를 들어, 지질막은 세포의 플라스마 막 또는 핵막이 될 수 있다. 융합은 핵 공여 세포와 수핵 난자가 서로 인접하게 위치해 있는 경우 또는 핵 공여 세포가 수핵 난자의 주란강(perivitelline space) 내에 위치해 있는 경우에 전기적 자극을 가함으로써 일어날 수 있다.'Fusion' refers to the coupling of the nuclear donor cell with the lipid membrane part of the recipient oocyte. For example, a lipid membrane can be a plasma membrane or a nuclear membrane of a cell. Fusion can occur by applying electrical stimulation when the nuclear donor cell and the recipient oocyte are adjacent to each other or when the nuclear donor cell is located in the perivitelline space of the recipient oocyte.

'핵 재프로그래밍(nuclear reprogramming)'는 핵 이식 과정 중 수핵 난자와 공여 세포를 융합한 후 공여 세포주의 핵이 재구성 되어 핵 이식란(복제 수정란)의 정상적인 발생을 유도하는 과정을 말하는 것으로, 일정 시간을 항온 배양하는 것으로 달성할 수 있다. Nuclear reprogramming refers to a process in which a nucleus of a donor cell line is reconstituted to induce the normal development of a nuclear transfer embryo (replication embryo) after fusion of a recipient oocyte and a donor cell during nuclear transfer, Followed by incubation at a constant temperature.

'활성화'는 핵 전이 단계 전, 핵 전이 단계 동안 및 핵 전이 단계 후에 세포가 분열하도록 자극을 주는 것을 말한다. 'Activation' refers to stimulation of cells to divide before, during, and after nuclear transfer.

'산자(living offspring)'는 자궁 밖에서 생존할 수 있는 동물을 말한다. 바람직하게는, 1초, 1분, 한 시간, 하루, 한 주, 한달, 6달 또는 일년 이상 생존할 수 있는 동물을 말한다. 상기 동물은 생존을 위해 자궁 내 환경을 필요로 하지 않는다."Living offspring" refers to an animal that can survive outside the uterus. Preferably, it refers to an animal that can survive for 1 second, 1 minute, 1 hour, 1 day, 1 week, 1 month, 6 months, or 1 year. The animal does not require an intrauterine environment for survival.

'개과 동물(canidae)'은 크게 개족(Tribe Canini)과 여우족(Tribe Vulpini)으로 나눌 수 있고, 개, 늑대, 재칼, 여우, 승냥이, 너구리, 코요테 등이 포함될 수 있다. 바람직하게는 개 또는 늑대가 포함된다. 상기 개는 야생의 늑대가 가축화된 것으로 알려져 있으며 이에 따라 늑대와 개는 염색체 수가 동일하고 임신기간, 성 호르몬의 변화가 유사한 양상을 나타낸다(Seal US et al., Biology Reproduction 1979, 21:1057-1066). 본 발명에 있어서 상기 '개과 동물'이라는 용어에 대하여, '개'로 단순히 줄여서 혼용하여 쓰기도 한다.'Canidae' can be divided into Tribe Canini and Tribe Vulpini, and can include dogs, wolves, jackals, foxes, hunters, raccoons and coyotes. Preferably a dog or a wolf. These dogs are known to be domesticated by wild wolves, so wolves and dogs have the same number of chromosomes and similar gestational age and sex hormone changes (Seal US et al., Biology Reproduction 1979, 21: 1057-1066 ). In the present invention, the term " canine animal " is simply abbreviated as " dog "

"약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다."About" means that the reference quantity, level, value, number, frequency, percentage, dimension, size, quantity, weight or length is 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, , Level, value, number, frequency, percent, dimension, size, quantity, weight, or length that varies from one to three, two, or one percent.

본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "함유하다" 및 "포함하다"란 말은 제시된 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.
Throughout this specification, the words " comprises "and" comprising ", when not explicitly required in the context, include a stated step or element, or group of steps or elements, but not to any other step or element, And that they are not excluded.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.

일반적으로 복제된 개과 동물의 생산방법은 예를 들어, Generally, the method of producing cloned canines is, for example,

(a) 개의 난자로부터 핵을 제거하여 탈핵 난자를 제조하는 단계;      (a) removing the nuclei from the eggs to produce enucleated oocytes;

(b) 개의 조직으로부터 분리한 체세포들에 세포 주기 동기화 유도물질을 첨가하여 배양하는 것을 포함하는 핵 공여 세포 제조단계;(b) a step of preparing a nuclear donor cell comprising culturing somatic cells isolated from the tissues by adding a cell cycle synchronization inducer;

(c) 상기 (a) 단계의 탈핵 난자에 (b) 단계의 핵 공여 세포를 미세주입하고 융합시키는 단계; (c) microinjecting and fusing nuclear donor cells of step (b) into the enucleated oocytes of step (a);

(d) 상기 (c) 단계에서 융합된 난자를 활성화시키는 단계;및(d) activating the oocyte fused in step (c); and

(e) 상기 활성화된 난자를 대리모의 난관에 이식하는 단계를 포함하는 것으로 알려져 있고, 각 단계에 관한 통상적 기술 내용은 당업계에 공지되어 있는 종래의 체세포 핵이식 기술을 이용한 복제 동물의 제조방법 등을 참조하여 이해할 수 있다.(e) transplanting the activated oocyte into the tubal duct of a surrogate mother, and the contents of each step are generally known in the art, including a method for producing cloned animals using conventional somatic cell nuclear transfer technology As shown in FIG.

특히, 본 발명은 상기 방법의 수행 중 이용되는, 개과 동물의 체세포 핵 이식에 따른 복제개 생산에 효율적인 체외 배양체계에 관한 것으로서, 그 중에서도 개과 동물의 핵 이식에 사용되는 핵 공여 세포의 배양에 최적의 효과를 나타내는 배지 조성물(배양액) 및 이의 이용을 제공함을써 개과 동물의 체세포 핵 이식 산자 생산 효율을 향상시킨다.
In particular, the present invention relates to an in vitro culture system that is effective for the production of cloned dogs by somatic cell nuclear transfer of canines, which is used during the execution of the above method, and is particularly suitable for culturing nuclear donor cells used for nuclear transfer of canines (Culture solution) showing the effect of the present invention and its use, thereby improving the somatic cell nuclear transfer product production efficiency of canine animals.

대상 세포Target cell

즉, 본 발명은 체세포 핵이식 기술을 이용한 복제개의 생산에 사용되는 "핵 공여 세포"의 배양에 특이적인 것이다.That is, the present invention is specific to the cultivation of "nuclear donor cells" used for production of cloned dogs using somatic cell nuclear transfer technology.

상기 핵 공여 세포의 일 구체예로서 개과 동물의 체세포를 사용할 수 있다.As a specific example of the nuclear donor cell, canine somatic cells can be used.

본 발명에서 사용될 수 있는 체세포로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 난구세포, 상피세포, 섬유아세포, 신경세포, 각질세포, 조혈세포, 멜라닌 세포, 연골세포, 마크로파지, 단구세포, 근육세포, B 림프구, T 림프구, 배아 줄기세포, 배아 생식세포, 태아 유래 세포, 태좌세포 및 배아세포 등이 있다. 보다 바람직하게는, 태아 유래 세포 및 성체 섬유아세포, 난구세포일 수 있다. 가장 바람직하게는, 개의 태아 및 성체에서 분리한 섬유아세포를 이용한다. 이 세포의 특징은 초기 분리시 다수의 세포를 얻을 수 있고, 세포 배양도 비교적 쉬우며 체외에서 배양 및 조작이 용이하다는 장점을 지니고 있다. The somatic cells that can be used in the present invention include, but are not limited to, cumulus cells, epithelial cells, fibroblasts, neurons, keratinocytes, hematopoietic cells, melanocytes, cartilage cells, macrophages, monocytes, B lymphocytes, T lymphocytes, embryonic stem cells, embryonic germ cells, fetal derived cells, embryonic cells and embryonic cells. More preferably, it may be a fetal-derived cell, an adult fibroblast, or a cumulus cell. Most preferably, fibroblasts isolated from fetuses and adults are used. The characteristics of these cells are that they can obtain a large number of cells at the initial separation, have relatively easy cell culture, and are easy to cultivate and manipulate in vitro.

핵 공여 세포로서 제공되는 상기 체세포는 외과용 표본 또는 생체검사용 표본을 제조하는 방법으로부터 수득될 수 있으며 바람직하게는 유사분열 G2/M단계의 체세포를 사용할 수 있다. The somatic cells to be provided as nuclear donor cells can be obtained from a surgical specimen or a method for preparing a specimen for biopsy, and preferably somatic cells of mitotic G2 / M stage can be used.

또한, 본 발명에서 사용될 수 있는 핵 공여 세포로는 체세포 이외에도 개의 배아 유래 또는 성체 유래의 줄기세포를 사용할 수 있다. In addition to somatic cells, embryo-derived or adult-derived stem cells may be used as nuclear donor cells that can be used in the present invention.

성체 유래 줄기세포의 예를 들면, 유방, 골수, 제대혈, 혈액, 간장, 피부, 위장관, 태반, 및 자궁 등으로 구성된 군에서 유래된 조직으로부터 분리, 사용할 수 있다. 성체 줄기세포는 배아줄기세포와 달리 원하는 방향으로 분화되지 않은 세포가 암을 유발할 가능성이 매우 희박하여 임상적으로 매우 중요한 장점을 갖고 있다. 개로부터 배아 줄기세포를 수득하거나 개의 다양한 조직으로부터 성체 줄기세포를 분리하는 방법은 당업계에 공지되어 있는 통상적인 방법을 사용할 수 있다. Adult stem cells can be isolated from tissues derived from the group consisting of breast, bone marrow, umbilical cord blood, blood, liver, skin, gastrointestinal tract, placenta, uterus and the like. Unlike embryonic stem cells, adult stem cells have very important clinical significance because they are unlikely to induce cancer cells that do not differentiate into the desired direction. Methods for obtaining embryonic stem cells from a dog or for separating adult stem cells from various tissues of dogs can be performed by conventional methods known in the art.

줄기세포를 사용할 경우, 줄기세포의 특성상 일반적으로 초기 배아 발달에 필수적이라 여겨지고 있는, 미분화 유전자들이 발현되고 있다는 점이 그 장점으로 부각될 수 있다.When stem cells are used, the undifferentiated genes, which are considered to be essential for early embryonic development due to the characteristics of the stem cells, can be expressed as an advantage thereof.

이처럼, 본 발명에서의 핵 공여 세포로는 개로부터 유래된 체세포 또는 줄기세포를 사용할 수 있고, 본 발명의 일 실시예에서는 체세포인 섬유아세포를 사용하였다.
As the nuclear donor cells in the present invention, somatic cells or stem cells derived from a dog can be used. In one embodiment of the present invention, fibroblasts, which are somatic cells, are used.

배지 조성물Medium composition

본 발명은 일 관점에서, 상기 개과 동물의 복제에 사용되는 핵 공여 세포의 배양에 특히 효과적인 배지 조성물에 관한 것으로 하기와 같은 구성을 포함한다.
In one aspect, the present invention relates to a culture medium composition which is particularly effective for culturing a nuclear donor cell used for replicating the canine, comprising the following composition.

기본배지Basic badge

본 발명에서 사용될 수 있는 기본 배지는, 개과 동물의 복제를 위한 핵 공여 세포를 인 비트로에서 배양하기 위한 배지로서, 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분만을 포함하는 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium: CCMM)일 수 있다. 즉, 세포가 살아가기 위해 필요한 필수적인 당, 아미노산, 물 등이 포함된 혼합물로서, 혈청, 영양 물질 및 각종 성장인자를 제외한 기본 배지이다.The basic medium that can be used in the present invention is a medium for culturing nucleus donor cells for in vitro replication in cannulas, which is a cell culture minimum medium containing only carbon source, nitrogen source and trace element components (CCMM ). That is, it is a mixture containing essential saccharide, amino acid, and water necessary for cell survival, and is a basic medium excluding serum, nutrients and various growth factors.

에너지 공급원으로서 다당류(polysaccharides), 단당류(monosaccharides), 유기산(organic acid), 아미노산(amino acid), 알콜(alcohol), 다환식 함유물(polycyclic compounds), 세루로오스(cellurose), 헤미셀루로오스(hemicellurose), 리그닌(lignin) 등의 여러가지 탄소원을 이용할 수 있다. 상기 다당류로는 덱스트린, 스타치 등을, 이당류로는 수크로오스, 말토오스, 트레할로오스, 만니톨 등을, 단당류로는 글루코스, 만노스, 프록토오스, 갈락토오스 등을 예로 들 수 있다.As energy sources, polysaccharides, monosaccharides, organic acids, amino acids, alcohols, polycyclic compounds, cellurose, hemicelluloses, (hemicellurose), lignin (lignin) and the like can be used. Examples of the polysaccharide include dextrin and starch. Examples of the disaccharide include sucrose, maltose, trehalose and mannitol. Examples of the monosaccharide include glucose, mannose, fructose, and galactose.

본 발명의 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium: CCMM)는 인위적으로 합성하여 제조하여 사용하거나 상업적으로 제조된 배지를 사용할 수 있다. 상업적으로 제조된 배지는 예를 들면, TCM-199, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), EDM(Endothelial differentiation medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), K-SFM (Keratinocyte-SFM;Keratinocyte serum free medium) 등이 있는데, 가장 바람직하게는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)배지를 사용한다.
The cell culture minimum medium (CCMM) of the present invention can be artificially synthesized, manufactured or used, or a commercially produced medium can be used. Commercially produced media include, for example, TCM-199, Dulbecco's Modified Eagle's Medium, EDM (Endothelial Differentiation Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), K- ; Keratinocyte serum free medium), and most preferably DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) medium.

배지의 필수 성분Essential ingredient of medium

본 발명의 개과 동물의 복제를 위한 핵 공여 세포 배양용 배지는 상기 설명한 기본 배지에, 필수 성분으로서 이하와 같은 구성성분을 포함하는 것을 특징으로 한다. 각 배지 구성 성분의 함유량은 당업자들이 적절히 조절할 수 있음은 자명할 것이다.The medium for nuclear donor cell culture for replicating canine of the present invention is characterized in that the basic medium described above contains the following components as essential components. It will be apparent that the content of each medium component can be appropriately adjusted by those skilled in the art.

본 발명의 배지는 성장 인자를 더 함유한다. The medium of the present invention further contains a growth factor.

이러한 성장 인자를 함유함으로써 핵 공여 세포의 증식이 한층 더 촉진된다. By containing such a growth factor, proliferation of nuclear donor cells is further promoted.

성장 인자의 바람직한 예로서는 상피 성장 인자(EGF), 섬유아세포 증식인자(FGF), 인슐린 유사 성장 인자(IGF), 트랜스포밍 성장 인자(TGF), 신경 성장 인자(NGF), 뇌 유래 신경 영양 인자(BDNF), 혈관 내피 세포 증식 인자(VEGF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구 매크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 에리스로포이에틴(EPO), 트롬보포이에틴(TPO), 간세포 증식 인자(HGF) 등을 들 수 있고, 본 발명에서 가장 바람직하게는 섬유아세포 증식인자(fibroblast growth factor, FGF)를 사용한다. FGF는 in vivo 상태에서 다양한 형태의 세포증식을 야기할 수 있다.Preferred examples of growth factors include epithelial growth factor (EGF), fibroblast growth factor (FGF), insulin like growth factor (IGF), transforming growth factor (TGF), nerve growth factor (NGF) ), Vascular endothelial growth factor (VEGF), granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), erythropoietin (EPO), thrombopoietin (TPO), hepatocyte growth factor ), And the fibroblast growth factor (FGF) is most preferably used in the present invention. FGF may cause various forms of cell proliferation in vivo.

섬유아세포 증식인자(FGF)의 바람직한 함량은 10∼ 50 ng/mL이며, 이의 함량이 10 ng/mL 미만이면 특별한 효과가 없으며, 50ng/mL을 초과하면 세포에 독성을 가진다.The preferred content of fibroblast growth factor (FGF) is 10 to 50 ng / mL. If the content of the fibroblast growth factor (FGF) is less than 10 ng / mL, there is no particular effect.

또한, 본 발명의 배지는 단백질 영양분을 더 함유한다.In addition, the medium of the present invention further contains protein nutrients.

예를 들면, FBS(fetal bovine serum), 혈청 대체물, 알부민, 또는 필수 아미노산 및 비필수 아미노산, 예컨대 글루타민 등을 함유할 수 있다. 가장 바람직하게는 FBS(fetal bovine serum)을 사용하며 바람직한 함량은 10~20% 이다. For example, fetal bovine serum (FBS), serum substitutes, albumin, or essential amino acids and non-essential amino acids such as glutamine. Most preferably, fetal bovine serum (FBS) is used and the preferable content is 10 to 20%.

또한, 본 발명의 배지는 항산화제를 더 함유한다.In addition, the medium of the present invention further contains an antioxidant.

항산화제는 비제한적으로, 천연 항산화제인 토코페놀(Tocopherol), 쎄사몰(Sesamol), 진저론(Gingeron), 캡사이신(Capsaicin), 퀘르세틴(Quercetin), 갈릭산(Garlic acid); 합성항산제인 BHA, BHT, TBHQ; 효과상승제인 구연산, 아스코르브산; 항산화성 생체 기능 분자인 수용성 항산화제 비타민 C, 지용성 항산화제 비타민 E, 유비퀴논 (CoQ), 카로테노이드 등을 선택하여 사용할 수 있고, 가장 바람직하게는 아스코르브산 또는 비타민 C를 사용한다. Antioxidants include, but are not limited to, natural antioxidants Tocopherol, Sesamol, Gingeron, Capsaicin, Quercetin, Garlic acid; Synthetic antioxidants BHA, BHT, TBHQ; Ascorbic acid, ascorbic acid; Water-soluble antioxidant vitamin C, lipid-soluble antioxidant vitamin E, ubiquinone (CoQ), carotenoid, and the like, and most preferably, ascorbic acid or vitamin C is used.

본 발명의 일 실시예에서는 아스코르브산을 사용하였는데, 특히, 아스코르브산은 콜라겐 생합성에 중요한 역할을 담당하는 바, 예를 들어, 섬유아세포 배양에서의 아스코르브산 일차 배양에서의 세포 증식을 촉진시키고(Shima and others 2011), 체외에서 산화 스트레스로부터 세포가 안정 상태를 유지할 수 있도록 하기 때문에 세포 생존능도 향상시킬 수 있다. 아스코르브산의 바람직한 함량은 0.1~1mM 이다.In one embodiment of the present invention, ascorbic acid is used. In particular, ascorbic acid plays an important role in collagen biosynthesis, for example, promoting cell proliferation in ascorbic acid primary culture in fibroblast culture (Shima and others 2011), allowing cells to remain stable from oxidative stress in vitro and thus improve cell viability. The preferred content of ascorbic acid is 0.1 to 1 mM.

또한, 본 발명의 배지는 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 비필수 아미노산을 포함하며, 바람직하게는 하기와 같은 구성성분을 함유하는 MEM 비필수 아미노산(Non-Essential Amino Acids, NEAA)(100X) 용액을 사용한다. 바람직한 함량은 약 0.5~3%, 더욱 바람직하게는 약 1%이다. Further, the medium of the present invention is characterized by containing an amino acid. Preferably, MEM non-essential amino acids (NEAA) (100X) solution containing nonessential amino acids and preferably containing the following components are used. The preferred content is about 0.5 to 3%, more preferably about 1%.

Figure pat00001

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그러므로, 본 발명인 개과 동물의 복제를 위한 핵 공여 세포 배양용 배지 조성물은, 가장 바람직한 구체예로써, 기본 배지로서 DMEM(dulbecco modified eagle medium )(high glucose)를 사용하며, 아스코르브산, 섬유아세포증식인자(FGF), MEM 비필수 아미노산(MEM Non-Essential Amino Acids) 및 FBS(Fetal bovine serum)를 함유한다. 본 발명의 실시예에서는 이러한 본 발명의 배지를 "RCME-P"로 명명하여 사용한다.Therefore, the culture medium for nuclear donor cell culture for replication of canine of the present invention is most preferably used as a basic medium using DMEM (dulbecco modified eagle medium) (high glucose), and ascorbic acid, fibroblast growth factor (FGF), MEM Non-Essential Amino Acids, and Fetal Bovine Serum (FBS). In the examples of the present invention, such a medium of the present invention is named "RCME-P".

보다 구체적으로, 본 발명의 가장 바람직한 일 실시예에서는, 0.2 mM 아스크로브산, 10ng/mL의 섬유아세포증식인자, 10% FBS, 및 1% NEAA를 함유하는 DMEM(high glucose,Invitrogen) 기반 배지를 RCME-P로 사용하였다.
More specifically, in a most preferred embodiment of the invention, a DMEM (high glucose, Invitrogen) -based medium containing 0.2 mM ascorbic acid, 10 ng / mL fibroblast growth factor, 10% FBS, and 1% NEAA Were used as RCME-P.

배지의 임의 성분Any component of the medium

이 외에도, 본 발명의 배지는 필요에 따라 하기 임의 성분들을 포함할 수 있다. In addition to this, the medium of the present invention may optionally contain the following optional components.

예를 들어, 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin) 또는 겐타마이신(gentamicin) 등의 항생제를 추가로 포함할 수 있다. For example, antibiotics such as penicillin, streptomycin or gentamicin may be further included.

또한, 체세포의 증식 또는 유지를 위한 배양에 사용할 수 있는 것 외에 배양하는 세포가 줄기세포인 경우에는 줄기세포의 분화 유도를 위해서 사용할 수도 있다. 줄기세포의 분화 유도에 사용하는 경우에는 분화 유도제가 더 첨가된다. 분화 유도제로서는 사이토카인(각종 인터류킨, 에리스로포이에틴, 트롬보포이에틴 등), 콜로니 자극 인자(예를 들면, G-CSF 등), 스테로이드 호르몬(덱사메타손 등), 인돌(인도메타신 등), 티아졸리딘 유도체(로시글리타존 등) 등을 예시할 수 있다. 이들 중 1개 또는 복수종을 사용할 수 있다.Further, in addition to being available for culturing for the growth or maintenance of somatic cells, if the cells to be cultured are stem cells, they may be used for inducing differentiation of stem cells. When used for inducing differentiation of stem cells, a differentiation inducing agent is further added. Examples of the differentiation inducing agent include cytokine (various interleukins, erythropoietin, thrombopoietin, etc.), colony stimulating factors (e.g. G-CSF etc.), steroid hormones (dexamethasone etc.) Derivatives (such as rosiglitazone), and the like. One or more of these may be used.

또한, 중성 완충제(예컨대 인산염 및/또는 고농도 중탄산염) 및 지질(지방산, 콜레스테롤, 혈청의 HDL 또는 LDL 추출물) 및 일반적인 보존액 배지에서 발견되는 기타 성분(예컨대 인슐린 또는 트랜스페린, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드, 피루빈산염, 임의의 이온화 형태 또는 염인 당원, 예컨대 글루코스, 셀레늄, 글루코코르티코이드, 예컨대 히드로코르티존 및/또는 환원제, 예컨대 β-메르캅토에탄올)을 함유할 수도 있다.It is also possible to use other components found in conventional preservative medium such as neutral buffer (e.g., phosphate and / or high concentration bicarbonate) and lipids (fatty acid, cholesterol, serum HDL or LDL extracts) and other components such as insulin or transferrin, nucleoside or nucleotide, Such as glucose, selenium, glucocorticoids such as hydrocortisone and / or a reducing agent such as? -Mercaptoethanol).

또한, 배지는 세포가 서로 유착하거나, 용기벽에 유착하거나, 너무 큰 다발을 형성하는 것을 방지할 목적으로, 항응집제 (anti-clumping agent)를 포함할 수 있다.In addition, the culture medium may contain an anti-clumping agent for the purpose of preventing the cells from adhering to each other, adhering to the container wall, or forming an excessively large bundle.

이러한 임의 성분의 첨가는 당업계의 통상의 지식을 가진 자가 공지 기술 및 실험 설계의 내용에 따라 적절히 수행할 수 있을 것이다.
Addition of such arbitrary components may be appropriately performed by those skilled in the art according to the contents of known techniques and experimental designs.

배양 방법Culture method

한편, 본 발명은 다른 관점에서 상기 개과 동물의 복제를 위한 핵 공여 세포 배양용 배지를 이용하는 방법에 관한 것으로, 예를 들어, 핵 공여 세포 배양용 배지를 이용하여 개과 동물의 핵 이식에 사용되는 핵 공여 세포의 배양 및 생산방법에 관한 것이다.On the other hand, the present invention relates to a method of using a medium for nuclear donor cell culture for cloning of canine animals from a different viewpoint. For example, a nucleus donor cell culture medium To a method for culturing and producing donor cells.

일 구체예를 간단히 설명한다.One specific example will be briefly described.

개과 동물로부터 조직의 일부를 무균적으로 절개하여 상기 외과용 표본 또는 생체검사용 표본을 수득하고 이를 미세하게 세절하여 트립신으로 처리한 다음 상기 설명한 핵 공여 세포 배양용 배지에서 배양한다. 예를 들어, 개의 피부 조직을 분리하여 일반적인 일차 배양방법과 동일하게 1mm*1mm의 크기로 자른 조직을 본 발명의 RCME-P 배지에서 배양하기 시작하여 90 %의 컨플루언스 상태에 도달할 때까지 배양액을 3-4일에 1회씩 추가해주는 방법으로 하여 컨플루언스 상태에 도달할 때까지의 배양한다. 1차 배양에는 평균 약 7일이 소요된다. A part of the tissue is aseptically incised from the canine to obtain the surgical specimen or the specimen for biopsy, finely minced and treated with trypsin, and then cultured in the nuclear donor cell culture medium described above. For example, dog tissues were separated and cultured in a RCME-P medium of the present invention in a size of 1 mm * 1 mm in the same manner as a general primary culture method, until a 90% confluence state was reached The culture is added once every 3-4 days and cultured until reaching the confluence state. The primary culture takes about 7 days on average.

상기 배지에서 3-4일 배양 후에 배양 접시(dish)에 자라는 것을 확인하고, 핵 이식에 이용하기 위하여 계대 배양을 실시한다. 각각 목적하는 %컨플루언스에 도달함에 따라 새로운 배지로 옮겨 배양하고, 이렇게 계대 배양된 세포에 대해 트립신 처리하여 단일세포로 제조하여 핵이식을 위한 최종 핵 공여 세포로 사용한다. 즉, RCME-P배양액을 이용하여 계대 배양 및 동결하고 90% 컨플루언스 상태에 도달할 때 세포를 분리하여 최종 핵 공여세포로 사용한다. After culturing in the medium for 3-4 days, it is confirmed that it grows in a dish, and subculture is carried out for use in nuclear transfer. After reaching the desired% confluence, they are transferred to a new medium and cultured. These subcultured cells are treated with trypsin to prepare single cells and used as final nuclear donor cells for nuclear transfer. That is, cells are separated and used as final nuclear donor cells when subculturing and freezing using a RCME-P culture and reaching a 90% confluence state.

‘~% 컨플루언스’는 세포 배양에 있어서 단위 면적당 세포수(세포농도)를 상대적으로 나타내는, 당업자들이 실험에 있어서 자주 사용하는 단위이다.'~% Confluence' is a unit frequently used by those skilled in the art, which relatively shows the cell number per unit area (cell concentration) in cell culture.

본 발명의 방법에 있어서, 평균적 계대수는 1~5계대이며, 가장 바람직하게는 3~4계대로 사용한다. 또한, 세포를 조직에서 분리하여 계대하기 위해서는 일차 배양시 90%이상의 컨플루언스일 때 사용하는 것이 바람직하다. 또한 각 계대에서 배양시 요구되는 컨플루언스 값은 모두 90% 이상이다. 최종 공여 세포 수득시 요구되는 컨플루언스값 또한 90% 이상에 해당된다. In the method of the present invention, the average number of passages is 1 to 5 passages, and most preferably 3 to 4 passages. In order to separate cells from tissues and pass them through, it is preferable to use them at confluence of 90% or more in the primary culture. Also, the confluence values required for culturing in each passage are all above 90%. The confluence value required to obtain the final donor cell is also at least 90%.

본 발명에서 최종 핵 공여 세포를 수득하기 위한 배양의 총 기간은 약 14~17일, 바람직하게는 약 15일 정도일 수 있고, 특히, 1차 배양에 걸리는 시간은 약 7~10일이다. In the present invention, the total period of the culture for obtaining the final nuclear donor cells may be about 14 to 17 days, preferably about 15 days, and particularly, the time for the primary culture is about 7 to 10 days.

상기 배양은 통상의 체외 배양용 용기, 예를 들어, CO2 인큐베이터, 디쉬, 바이오리액터 등을 이용하여 당업자가 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식에 의해 적절히 온도, 습도 등의 조건을 맞추어 수행할 수 있다.
The culturing can be carried out by suitably adjusting conditions such as temperature and humidity by a person skilled in the art using conventional in vitro culture containers, for example, a CO 2 incubator, a dish, a bioreactor, etc. can do.

이와 같은 본 발명에 따른 배지 및 이의 이용 방법은, 생물반응장치 시스템(bioreactor systems) 등을 이용한 체외 배양을 통해 복제개 생산을 위한 핵 공여 세포의 효과적인 생산에 적용시킬 수 있을 것이다.The medium and the method of using the same according to the present invention can be applied to the efficient production of nuclear donor cells for the production of cloned dogs through in vitro culture using bioreactor systems and the like.

특히, 지금까지 일반적으로 사용해왔던 DMEM 배지에 비해, 본 발명의 RCME-P의 배지를 사용하여 배양하는 경우, 핵 공여 세포의 증식 효율이 현저히 우수하다. Particularly, when cultured using the medium of RCME-P of the present invention, the proliferation efficiency of the nuclear donor cell is remarkably superior to the DMEM medium conventionally used so far.

본 발명의 일 실시예에서 DMEM 1차 배양 배지는 단일층이 되기까지 15일 이상이 걸린 반면, RCME-P 1차 배양 배지는 단지 9일만이 소요되었는 바, 이러한 효과를 확인할 수 있었다.In one embodiment of the present invention, the DMEM primary culture medium took more than 15 days to become a monolayer, whereas the RCME-P primary culture medium took only 9 days, confirming this effect.

또한, 본 발명의 RCME-P의 배지를 이용하여 배양한 핵 공여 세포는 줄기세포성(전능성) 및 리프로그래밍 능력; 그리고 텔로머라아제 활성도 매우 우수한 특성을 보유한다. In addition, nuclear donor cells cultured using the RCME-P medium of the present invention have stem cell (osmolality) and reprogramming ability; And telomerase activity has very good properties.

본 발명의 실시예에서 확인한 바와 같이, DMEM 배양된 핵 공여 세포(체세포 및 줄기세포 모두)에서는 줄기세포성 관련 유전자인 Sox2, Nanog, Oct4, Stella, Rex1의 발현 수준이 현저히 낮게 나타났고, 리프로그래밍과 관련된 유전자 HDAC1, DNMT1, MeCP2의 발현 및 텔로머라아제 활성 역시 RCME-P의 배지의 경우보다 낮게 나타났다.As shown in the examples of the present invention, expression levels of Sox2, Nanog, Oct4, Stella and Rex1, which are stem cell related genes, were significantly lower in DMEM-cultured nuclear donor cells (both somatic and stem cells) Expression of the genes HDAC1, DNMT1, MeCP2 and telomerase activity were also lower than those of the RCME-P medium.

즉, RCME-P 배지 및 이의 이용을 포함하는 본 발명은 배양된 핵 공여 세포는 개복제에 필요한 증식능, 줄기세포성(전능성), 리프로그래밍능 및 텔로머라아제 활성이 현저히 우수한, 양적 및 질적 모두 향상된 핵 공여 세포를 제공한다.That is, the present invention including the RCME-P medium and its use is characterized in that the cultured nuclear donor cell has both the quantitative and qualitative characteristics such as the proliferative capacity, stem cell (omnipotency), reprogramming ability and telomerase activity necessary for dog reproduction Thereby providing improved nuclear donor cells.

그리고, 이러한 본 발명의 우수한 공여 세포는 분리하여 탈핵 난자에 이식되어 개과 동물의 핵 이식란을 형성한 후, 궁극적으로 대리모에 이식되어 산자를 출생시킴으로써 높은 효율로 복제개를 생산하는데 사용된다.These excellent donor cells of the present invention can be isolated and transferred to a enucleated oocyte to form a nuclear transfer embryo of a canine animal, and ultimately transplanted to a surrogate mother to be born to produce a cloned dog with high efficiency.

이 때, 수행되는 핵 공여 세포의 미세주입 및 융합에 의한 핵 이식란의 제조방법, 융합된 핵 이식란의 활성화 방법, 대리모 난관에로의 이식방법 등의 관련 기술은 당업계에 공지된 방법을 참조로 할 수 있다.Herein, related technologies such as a method of preparing a nuclear transfer embryo by microinjection and fusion of a nuclear donor cell, a method of activating a fused nuclear transfer embryo, a method of implanting the embryo into a surrogate embryo, and the like are described with reference to a method known in the art can do.

그러므로, 본 발명은 또 다른 관점에서 RCME-P 배지를 이용하여 개과 동물의 핵 이식란 생산 및 복제 산자 생산의 효율을 높이는 방법에 관한 것이다.Therefore, the present invention, in another aspect, relates to a method for enhancing the production of nuclear embryos and production of cloned embryos of canine animals using RCME-P medium.

이처럼, 본 발명은 핵 공여 세포를 양적으로 및 질적으로 향상시킴으로써, 복제개의 생산에 있어서 종래 극히 낮았던 임신 성공률을 높이는 효과가 있다. 따라서 본 발명의 방법은 복제 효율이 너무 낮아 실용화가 어려웠던 문제점을 개선하여 실질적으로 복제 개를 생산의 효율을 높이는데 적용될 수 있을 것이다.
Thus, by quantitatively and qualitatively improving nuclear donor cells, the present invention has the effect of increasing the pregnancy success rate, which was extremely low in the production of the cloned dog. Therefore, the method of the present invention can be applied to improve the production efficiency of the replica dog by improving the problem that the replica efficiency is too low to be practically used.

[[ 실시예Example ]]

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these examples are for illustrative purposes only and that the scope of the present invention is not construed as being limited by these examples.

재료 및 방법Materials and methods

1. 개 체세포 배양 및 준비1. Cultivation and preparation of somatic cells

우선, SCNT(체세포 핵이식, somatic cell nuclear transfer)을 위한 섬유아세포의 1차 배양을 하고자 하였다.First, primary culture of fibroblasts for SCNT (somatic cell nuclear transfer) was performed.

7년생 수컷 비글로부터 전신마취 하에서 복부의 전층 피부(abdominal full thickness skin)를 잘라내었다. 수집하자마자, 상기 피부 조각을 얼음 위에서 PBS(phosphate buffered saline)(Invitrogen, Carlsbad, CA)에 두고 실험실로 옮겼다. 각 피부 조직들을 1 cm×0.5 cm 조각들로 손질하여 자르고, 작은 조각들(1mm×1mm)로 미세하게 저며서 조직 배양 디쉬 상에 균등하게 분포하도록 하고, 각 배양 배지: Abdominal full thickness skin was cut from 7-year-old male beagle under general anesthesia. Upon collection, the skin pieces were placed on ice in phosphate buffered saline (Invitrogen, Carlsbad, CA) and transferred to the laboratory. Each skin tissue was trimmed with 1 cm x 0.5 cm pieces, minced into small pieces (1 mm x 1 mm) and evenly distributed on a tissue culture dish, and each culture medium:

- 10% FBS (Invitrogen), 페니실린-스트렙토마이신(P/S; Invitrogen)로 보충된 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium, high glucose; Invitrogen) 및- Dulbecco's modified Eagle's medium, high glucose (Invitrogen) supplemented with 10% FBS (Invitrogen), penicillin-streptomycin (P / S; Invitrogen)

- RCME-P (개 MSC 배양을 위한 K-Stemcell 배지; K-Stemcell Ltd, Seoul, Korea)- RCME-P (K-Stemcell culture medium for MSC culture; K-Stemcell Ltd, Seoul, Korea)

에서 배양시켰다. Lt; / RTI >

이 때, 상기 RCME-P 배지는 0.2 mM 아스크로브산, 10ng/mL의 섬유아세포증식인자, 10% FBS, 및 1% NEAA를 함유하는 DMEM(high glucose,Invitrogen) 기반 배지이다.At this time, the RCME-P medium is DMEM (high glucose, Invitrogen) -based medium containing 0.2 mM ascorbic acid, 10 ng / mL fibroblast growth factor, 10% FBS, and 1% NEAA.

모든 샘플들을, 60 mm2 조직 배양 디쉬에서 37℃ 하 5% CO2 를 함유하는 대기에서 배양하였다. 목적하는 컨플루언스에 이를때까지 상기 배지를 2~3일마다 교환하였다. 1차 배양시 90% 이상의 컨플루언스에 도달하기까지 요구된 일수를 각 샘플마다 기록하였다. All samples were incubated in a 60 mm 2 tissue culture dish at 37 ° C in an atmosphere containing 5% CO 2 . The medium was changed every 2-3 days until the desired confluence was reached. The number of days required to reach confluence of 90% or more in the primary culture was recorded for each sample.

각 1차 배양 배지로부터 세포를 수득한 후, 수득한 세포를, 10% FBS, 페니실린-스트렙토마이신로 보충된 RCME-P로 5계대까지 배양하였다.After obtaining cells from each primary culture medium, the cells obtained were cultured in RCME-P supplemented with 10% FBS, penicillin-streptomycin to 5 passages.

0계대(passage 0)에서, 샘플들의 형태를 평가하였다(Leica 도립 현미경을 이용하는 광학 현미경, 100X 배율). 0.01% EDTA(ethylenediamine-tetraacetic acid)에서 0.25% 트립신으로 37℃ 하 2.5분 동안 반응시킨 후 세포들을 수득하고, 원심분리에 의해 수집한 후, 0계대에서 냉동보존 하였다. SCNT전에, 2~5계대에서의 세포들을 트립신-EDTA 처리로 분해하고(disaggregated), 공여 세포의 크기 측정을 위해 자동화된 세포 계수기(Countess, Invitrogen)를 사용하였다.
At passage 0, the morphology of the samples was evaluated (optical microscope using Leica ontop microscope, 100X magnification). Cells were obtained after incubation at 37 ° C with 0.25% trypsin in 0.01% EDTA (ethylenediamine-tetraacetic acid) for 2.5 minutes, collected by centrifugation, and stored frozen in 0 passages. Prior to SCNT, cells in 2-5 passages were disaggregated with trypsin-EDTA treatment and an automated cell counter (Countess, Invitrogen) was used to size donor cells.

2. 개과 2. Canine 난모Smear 세포( cell( CanineCanine oocyteoocyte ) 수집, 체세포 핵 이식 및 배아 이식) Collection, somatic cell nuclear transfer and embryo transfer

in vivo 성숙된 난모세포의 회복을 위해, 난모세포 공여 개의 혈장 황체호르몬(plasma progesterone) 농도를 Immulite 1000 (Siemens Healthcare Diagnostics Inc., Flanders, NJ)를 이용하여 모니터링하였다. For the recovery of mature oocytes in vivo, the plasma progesterone concentrations of the oocytes were monitored using Immulite 1000 (Siemens Healthcare Diagnostics Inc., Flanders, NJ).

난모세포 공여 개의 혈장 황체호르몬 농도가 4ng/ml 또는 그 이상으로 상승하면 배란일로 판단하였다. 배란일로부터 3일 후, 10% (v/v) BSA(bovine serum albumin; Invitrogen) 및 2mM NaHCO3로 보충된 Hepes-완충된 조직 배양 배지(TCM)-199 에서 in vivo 성숙된 난모세포들을 난관 밖으로 쏟아내어 수집하였다. 그리고 핵 이식을 수행하였다(Kim and others 2013). When oocyte donation plasma levels of plasma progesterone rises to 4 ng / ml or more, it was judged to be the day of ovulation. Three days after ovulation day, in vivo mature oocytes in Hepes-buffered tissue culture medium (TCM) -199 supplemented with 10% (v / v) bovine serum albumin (Invitrogen) and 2 mM NaHCO 3 Pouring and collecting. And nuclear transfer (Kim and others 2013).

수집 후, 0.1% (v/v) 히알루로니다아제로 보충된 TCM-199에서 in vivo 성숙된 난모세포들을 적운 모양의 세포들로부터 벗겨내었다. 그리고, 밀려나간 극체와 함께 난모세포들을 선별하여 사이토칼라신 (cytochalasin) B (5μg/ml) 및 Hoechst (5μg/ml)에 노출시켰다. After collection, mature oocytes matured in vivo in TCM-199 supplemented with 0.1% (v / v) hyaluronidase were stripped from the cumulus shaped cells. The oocytes were then screened and exposed to cytochalasin B (5 μg / ml) and Hoechst (5 μg / ml) along with the extruded polar body.

UV광 하에 미세한 니들 피펫으로 흡입법에 의해 중기 염색체를 제거하였다. 각 배지에서 1차 배양된 단일 공여 세포들을 난황 주위 공간(perivitelline space) 내로 옮겼다The mid-term chromosome was removed by inhalation with a fine needle pipette under UV light. The primary cultured single donor cells in each medium were transferred into the perivitelline space

0.1mM MgSO4, 0.5mM Hepes, 및 0,05% (w/v) BSA를 함유하는 0.26M 만니톨 용액에서, 전기-세포 융합 기구(Electro-Cell Fusion apparatus) (NEPA GENE Co.)로 복류의 직류 전기 4.0 kV/cm를 15 μs 동안 이용하여 공여 세포-세포질체 복합체(a couplet of donor cell-cytoplast complexes)를 융합하도록 유도시켰다Cell fusion apparatus (NEPA GENE Co.) in a 0.26 M mannitol solution containing 0.1 mM MgSO 4 , 0.5 mM Hepes, and 0.05% (w / v) BSA. A direct current of 4.0 kV / cm for 15 μs was induced to fuse a couplet of donor cell-cytoplast complexes

10μM 칼슘 이노포어(Sigma-Aldrich Corp.)를 함유하는 mSOF (modified synthetic oviductal fluid)에서 재프로그래밍(reconsulted) 배아를 4분동안 배양함으로써 화학적 활성화를 수행하였다. Chemical activation was performed by incubating the reconsulted embryos in mSOF (modified synthetic oviduct fluid) containing 10 μM calcium inopore (Sigma-Aldrich Corp.) for 4 minutes.

39℃, 5% CO2, 5% O2 및 90% N2의 대기에서, 클론화된(복제된) 배아들을 1.9Mm 6-DMAP(dimethylaminopurine) 함유된 40μl mSOF 내로 4시간 동안 트랜스퍼하였다. 재구축된 클론화된 배아들을 동기화된 수령체(synchronized recipients)의 난관 내에 트랜스퍼하였다. 전신 마취 하에, 재구축된 배아들을 3.5 Fr Tom-cat catheter (Sherwood, St. Louis, MO, USA)를 이용하여 난관의 팽대 부분(ampullary portion)에 삽입하였다 .
Cloned (replicated) embryos were transferred into 40 μl mSOF containing 1.9 Mm 6-DMAP (dimethylaminopurine) in the atmosphere of 39 ° C, 5% CO 2 , 5% O 2 and 90% N 2 for 4 hours. The reconstituted cloned embryos were transferred into the fallopian tubes of synchronized recipients. Under general anesthesia, reconstructed embryos were inserted into the ampullary portion of the fallopian tube using a 3.5 Fr Tom-cat catheter (Sherwood, St. Louis, Mo., USA).

3. 정량적 3. Quantitative PCRPCR 에 의한 공여 세포에서 유전자의 상대적 빈도(The relative frequency of genes in donor cells by relativerelative abundance)의 측정 abundance

트립신-EDTA 처리에 의해, 공여 세포들을 수집하고 멸균된 PBS에서 세척하였다. 각 배양 배지에서 1차 배양된 공여 세포로부터 easy-spinTM (DNA-free) Total RNA Extraction Kit (iNtRON Biotechnology, Inc., Kyunggi, Korea)를 이용하여 전체 RNA를 추출하였다.By trypsin-EDTA treatment, donor cells were harvested and washed in sterile PBS. Total RNA was extracted from donor cells cultured in each culture medium using an easy-spin ™ (DNA-free) Total RNA Extraction Kit (iNtRON Biotechnology, Inc., Kyunggi, Korea).

각 샘플의 cDNA를 합성하기 위해, 20μl 반응물에서 임의의 헥사머 및 superscript TM III 역전사효소 (Invitrogen)를 이용하여 50℃에서 50분 동안 역전사를 수행하였다. In order to synthesize the cDNA of each sample, reverse transcription was carried out in 20 μl reaction at 50 ° C. for 50 minutes using any hexamer and superscript ™ III reverse transcriptase (Invitrogen).

Takara Bio Inc. 가이드라인에 따라 Real time RT-PCR (RT-qPCR)을 행하였다. 2μl cDNA, 1μl 정방향 프라이머, 1μl 역방향 프라이머, 8μlSYBR Premix Ex Taq, 0.4μl ROX Reference (Takara Bio Inc. Shiga, Japan) 및 7.6 μl Nuclease-free water (Ambion Inc., Austin, TX)를 첨가함으로써 전체 20μl PCR 반응물을 제조하였다. 7300 Real Time PCR Cycler System (Applied Biosystems, Foster City, CA)을 이용하여 상기 반응을 수행하였다.Takara Bio Inc. Real-time RT-PCR (RT-qPCR) was performed according to the guidelines. 2 μl cDNA, 1 μl forward primer, 1 μl reverse primer, 8 μl SYBR Premix Ex Taq, 0.4 μl ROX Reference (Takara Bio Inc. Shiga, Japan) and 7.6 μl Nuclease-free water (Ambion Inc., Austin, TX) PCR reactions were prepared. The reaction was performed using a 7300 Real Time PCR Cycler System (Applied Biosystems, Foster City, Calif.).

RT-qPCR에 대한 열적 프로파일을 10분동안 95°C에서, 이어서 95°C에서 10초 동안 40 사이클, 60°C에서 20초 동안, 그리고 72°C에서 40초 동안 행하였다. The thermal profile for RT-qPCR was performed at 95 ° C for 10 minutes followed by 40 cycles of 10 seconds at 95 ° C, 20 seconds at 60 ° C, and 40 seconds at 72 ° C.

정방향 및 역방향 프라이머들을 Primer Express 2.0 software program (Applied Biosystems)을 이용하여 고안하고, 프라이머 서열들 및 증폭된 프래그먼트의 대략적 사이즈들을 표 1에 기재하였다. 실험한 모든 유전적 전사 수준은 β-actin 발현 수준으로 정상화하였다. Forward and reverse primers were devised using the Primer Express 2.0 software program (Applied Biosystems), and the primer sequences and the approximate sizes of the amplified fragments are shown in Table 1. All genetic transcription levels tested were normalized to β-actin expression levels.

Figure pat00002
Figure pat00002

4. 4. 텔로머라아제Telomerase 활성 분석 Activity analysis

텔로머라아제 PCR ELISA 키트 (Roche Molecular Biochemicals, Manheim, Germany) 를이용하여 각 배지에서 배양된 공여 세포의 텔로머라아제 활성을 측정하였다.Telomerase activity of donor cells cultured in each medium was measured using a telomerase PCR ELISA kit (Roche Molecular Biochemicals, Manheim, Germany).

2백만개의 세포를 4°C에서 10분 150 ×g 로 원심분리하여 페렛화를 한다. lysis buffer (PRO-PREP protein extraction solution; iNtRON Biotechnology, Inc.)를 추가하고 30분간 배양한다. 150 ×g, 10분간 재원심분리하여, 상층액을 수집하고 단백질 농도를 Bradford assay (Nanodrop2000; Thermo fischer scientific)를 이용해 측정한다. 텔로머라아제 활성 분석은 TRAP assay 를 기본으로하여 실시하였고, 2가지 배양액으로부터 회수된 세포의 단백질 농도는 동일 농도로 희석하여 본 실험을 진행하였다.Millions of cells are ferreted by centrifugation at 150 ° C for 10 minutes at 4 ° C. Add lysis buffer (PRO-PREP protein extraction solution, iNtRON Biotechnology, Inc.) and incubate for 30 minutes. 150 × g for 10 min. The supernatant is collected and the protein concentration is measured using the Bradford assay (Nanodrop 2000; Thermo fischer scientific). Telomerase activity analysis was performed based on the TRAP assay. Protein concentrations of the cells recovered from the two cultures were diluted to the same concentration.

5. 통계학적 분석5. Statistical analysis

통계학적 분석은 GraphPad Prism 4.02 (Graphpad Software Inc, San Diego, CA, USA)를 이용하여 수행하였다. 데이터들은 2원 분산분석(two-way ANOVA) 및 이어서 Barfornis post test에 의해 분석하였다. P value가 0.05 이하일 때 유의미한 것으로 간주하였다.
Statistical analysis was performed using GraphPad Prism 4.02 (Graphpad Software Inc, San Diego, Calif., USA). Data were analyzed by two-way ANOVA followed by Barfornis post test. P value <0.05 was considered significant.

실시예Example 1 : 개과 세포 배양에서 1차  1: Primary cells in canine cell culture 컨플루언스Confluence 및 형태에 도달하기까지 걸리는 시간의 측정 And the time it takes to reach shape

1-1 증식 효율1-1 Proliferation Efficiency

분리된 세포들이 컨플루언트된 단일층이 되기 위해 필요한 날짜 수를 각 세포 배양 배지에 대해 나타내었다(DMEM 및 RCME-P).The number of days required for the isolated cells to become a confluent monolayer was expressed for each cell culture medium (DMEM and RCME-P).

그 결과, 도 1에 도시한 바와 같이, 1차 컨플루언스에 이르기까지의 시간이 배양 배지에 따라 현저하게 상이하였다. DMEM 1차 배양 배지는 15일 이상이 걸린 반면, RCME-P 1차 배양 배지는 단지 9일이 걸렸다.As a result, as shown in Fig. 1, the time until reaching the primary confluence was significantly different depending on the culture medium. DMEM primary culture medium took more than 15 days whereas RCME-P primary culture medium took only 9 days.

즉, 본 발명의 RCME-P의 배지를 사용하는 경우, 핵 공여 세포의 증식 효율이현저히 우수함을 알 수 있었다.
That is, when the RCME-P medium of the present invention was used, it was found that the proliferation efficiency of nuclear donor cells was remarkably excellent.

1-2 1-2 표현형적Phenotypic 특성 characteristic

또한, 1차 배양 동안 표현형 형태를 조사하기 위해, 배양 형태를 평가하였다. In addition, the culture form was evaluated to investigate the phenotype form during the primary culture.

그 결과, 도 2에 도시한 바와 같이, 모든 세포들이 초기 배양에서 전형적인 방추형 세포형을 나타내었고, 세포 크기에서도, 2개의 배양된 배지로부터의 공여 세포들 사이에 차이는 그다지 없었다. 즉, 배지의 종류는 배양된 세포의 형태와 크기에는 큰 영향을 미치지 않았다.
As a result, as shown in Fig. 2, all the cells showed a typical spindle cell type in the initial culture, and there was not much difference between the donor cells from the two cultured media, even at the cell size. That is, the type of medium did not affect the shape and size of the cultured cells.

실시예Example 2 : 두 배양 배지에서 배양된 공여 세포에서 재프로그래밍, 줄기세포성( 2: reprogramming in donor cells cultured in both culture medium, stem cell ( stemnessstemness ) 관련 유전자의 발현 변화) Expression Change of Related Gene

2종류의 각 배지에서 배양된 공여 세포에서 다양한 유전자 전사의 상대적 빈도를 도 3에 도시하였다. The relative frequency of various gene transcription in donor cells cultured in each of the two different media is shown in Fig.

RCME-P와 비교하여, DMEM 배양된 세포에서는 줄기세포성 관련 유전자인 Sox2, Nanog, Oct4, Stella, Rex1 (P<0.05)의 발현 수준이 현저히 감소하였음을 확인할 수 있었다. Compared with RCME-P, the expression levels of Sox2, Nanog, Oct4, Stella, and Rex1 (P <0.05) in stem cell-related genes were significantly decreased in DMEM-cultured cells.

또한, DMEM 배양 세포들은 또한 RCME-P 유래 세포보다 리프로그래밍과 관련된 유전자 HDAC1, DNMT1, MeCP2의 발현이 현저히 감소된 것으로 나타났지만, DNMT3a, DNMT3b는 그러하지 않았다. In addition, DMEM cultured cells also showed significantly reduced reprogramming-related genes HDAC1, DNMT1, and MeCP2 expression than RCME-P derived cells, but DNMT3a and DNMT3b did not.

그리고, 세포사멸 관련 유전자들인 bax 및 bcl2의 비율에서는 두 배지에서 큰 차이는 보이지 않았다.The ratio of bax and bcl2, the apoptosis related genes, did not show any significant difference in the two media.

이러한 결과를 통해, 본 발명의 RCME-P의 배지를 사용하여 배양된 핵 공여 세포의 경우가 개 복제에 필요한 줄기세포성 및 리프로그래밍능이 현저히 우수함을 알 수 있었다.
These results indicate that the nuclear donor cell cultured using the RCME-P medium of the present invention is significantly superior in stem cell and reprogramming ability for dog cloning.

추가예Additional examples : 개 지방줄기세포를 핵 공여 세포로 사용한 경우 : When embryonic stem cells are used as nuclear donor cells

공지의 방법을 참조하여, 개의 지방 조직으로부터 줄기세포를 분리하여 핵 공여 세포로 사용하여 유전자의 발현 수준을 살펴보았다.With reference to known methods, stem cells were isolated from adipose tissue and used as nuclear donor cells to examine expression levels of genes.

그 결과, 도 4에 도시한 바와 같이, 전능성과 관련된 유전자는 DPPA2 유전자를 제외하고 모두 발현 정도에 차이가 있었으며, 특히, 리프로그래밍과 관련된 유전자 중 DNMT1 또한 RCME-P 배지에서 배양된 세포에서 발현 정도가 높았다. 이는 체세포를 공여 세포로 사용한 경우와 유사한 결과였다.
As a result, as shown in FIG. 4, the expression level of all genes except for DPPA2 gene was different from that of allogeneic genes, and DNMT1 among reprogramming related genes was also expressed in cells cultured in RCME-P medium Respectively. This was similar to the case when somatic cells were used as donor cells.

실시예Example 3 :  3: DMEMDMEM 및  And RCMERCME -P에서 1차 배양된 개과 동물 섬유아세포에서의 -P in primary cultured canine fibroblasts 텔로머라아제Telomerase 활성 activation

연속적(계대적) 배양 동안 1차 배양 배지로부터 텔로머라아제 활성의 변화를 알아보기 위하여, RTA(relative telomerase activities)을 평가하였다. To determine the change in telomerase activity from the primary culture medium during continuous (relative) culture, the relative telomerase activities (RTA) were evaluated.

그 결과, 도 5에 도시한 바와 같이, DMEM 및 RCME-P에서 배양된 공여 세포에서 RTA에서의 감소가 눈에 띄었다. 1차 배양 배지에 따른 확실한 차이 또한 분명하게 관찰되었다. As a result, as shown in Fig. 5, reduction in RTA was observed in donor cells cultured in DMEM and RCME-P. Certain differences according to the primary culture medium were also clearly observed.

이러한 결과는, 텔로머레이즈 활성이 전능성과 비례하는 바, 이전 실시예에서의 전능성 관련 유전자 발현의 결과와 일치하는 것으로, DMEM 배지보다 RCME-P의 배양액에서 텔로머레아제 활성이 높게 나타남을 확인할 수 있었다.
These results are in agreement with the results of the expression of allele-related genes in the previous examples, as the telomerase activity is proportional to the osmolality, confirming that telomerase activity is higher in the culture medium of RCME-P than in DMEM medium I could.

실시예Example 4 : 상이한 배지에서 배양된 공여 세포 유래 배아의  4: Embryonic-derived embryos cultured in different media inin vivovivo 발달 비교 Development comparison

하기 표 2에 나타나 있는 바와 같이, DMEM 유래 세포들을 공여 세포로 사용한 경우에는, 전체 163개의 클론화된(복제) 배아들을 11마리의 수령체 내로 이식하였다.As shown in Table 2 below, when DMEM-derived cells were used as donor cells, a total of 163 cloned (replicate) embryos were transplanted into 11 recipients.

Figure pat00003
Figure pat00003

RCME-P 유래 세포들의 경우에는, 181개의 형성된 배아들을 11마리의 수령체 내로 이식하였다. 각 그룹에서, 두 수령체(DMEM 유래 세포 18.18%, RCME-P 유래 세포 36.36% : 전체 수령체들에 대한 임신)가 이식된 복제 배아들로 임신이 되었으며, 대리모의 임신율은 유의하게 RCME-P 그룹이 더 높았다 (P<0.05). In the case of RCME-P derived cells, 181 embryos were implanted into 11 recipients. In each group, two recipients (18.18% of DMEM-derived cells, 36.36% of RCME-P derived cells: pregnancy for all recipients) became pregnant with transplanted embryos and the pregnancy rate of the surrogate mothers was significantly higher than that of RCME-P Group was higher (P <0.05).

DMEM 배양 세포로부터 유래된 복제 배아로 임신한 수령체는 2마리의 복제 강아지를 출산하였다(1.2%, 이식받은 배아에 대한 출산, 표 2). 이러한 출산율은 RCME-P 유래세포와 비교하여 현저하게 낮은 경우에 해당한다(4.41%, P<0.05).The recipient of the pregnancy with a cloned embryo derived from a DMEM cultured cell gave birth to two cloned pups (1.2%, giving birth to the implanted embryo, Table 2). These fertility rates are significantly lower (4.41%, P <0.05) compared to RCME-P derived cells.

즉, 본 발명의 RCME-P의 배지를 사용하여 배양된 핵 공여 세포로 체세포 핵이식을 수행하는 경우에 복제개 생산율을 높일 수 있음을 확인하였다. That is, it was confirmed that when the somatic cell nuclear transfer is performed with the nuclear donor cell cultured using the RCME-P medium of the present invention, the replication yield can be increased.

Claims (18)

기본 배지로서 DMEM(dulbecco modified eagle medium), 섬유아세포 증식인자(FGF), 항산화제 및 10~20% FBS(fetal bovine serum) 및 비필수 아미노산을 함유하는, 개과 동물 복제용 핵 공여 세포 배양용 배지.
A medium for nuclear donor cell culture for canine reproduction, which contains DMEM (dulbecco modified eagle medium), fibroblast growth factor (FGF), antioxidant and 10-20% FBS (fetal bovine serum) .
제1항에 있어서, 상기 항산화제는 아스코르브산 또는 비타민 C인 것을 특징으로 하는, 개과 동물 복제용 핵 공여 세포 배양용 배지.
The culture medium for nuclear donor cell for canine reproduction according to claim 1, wherein the antioxidant is ascorbic acid or vitamin C.
제2항에 있어서, 상기 항산화제는 아스코르브산인 것을 특징으로 하는, 개과 동물 복제용 핵 공여 세포 배양용 배지.
3. The culture medium for nuclear donor cell for canine reproduction according to claim 2, wherein the antioxidant is ascorbic acid.
제1항에 있어서, 상기 비필수 아미노산은 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루타민산, 글리신, 프롤린 및 세린을 함유하는 MEM 비필수 아미노산인 것을 특징으로 하는 개과 동물 복제용 핵 공여 세포 배양용 배지.
The culture medium for incubating a nuclear donor cell for canine reproduction according to claim 1, wherein the nonessential amino acid is an MEM nonessential amino acid containing alanine, asparagine, aspartic acid, glutamic acid, glycine, proline and serine.
제1항에 있어서, 기본 배지로서 DMEM(dulbecco modified eagle medium)(high-glucose), 섬유아세포 증식인자(FGF), 아스코르브산, 비필수 아미노산 및 10~20% FBS를 함유하는, 개과 동물 복제용 핵 공여 세포 배양용 배지.
The method according to claim 1, wherein the base medium is a medium for replicating canine animals containing DMEM (dulbecco modified eagle medium) (high glucose), fibroblast growth factor (FGF), ascorbic acid, Medium for nuclear donor cell culture.
제5항에 있어서, 상기 배지는 0.2 mM 아스크로브산, 10ng/mL의 섬유아세포 증식인자, 10% FBS, 및 1% MEM 비필수 아미노산을 함유하는 DMEM(dulbecco modified eagle medium)(high-glucose) 기반 배지인 것을 특징으로 하는 개과 동물 복제용 핵 공여 세포 배양용 배지
6. The method of claim 5, wherein the medium is selected from the group consisting of dulbecco modified eagle medium (DMEM) containing 0.2 mM ascorbic acid, 10 ng / mL fibroblast growth factor, 10% FBS, ) -Containing culture medium for nuclear donor cell for canine reproduction
제1항에 있어서, 상기 핵 공여 세포는 개과 동물 체세포 또는 줄기세포 유래인 것을 특징으로 하는 개과 동물 복제용 핵 공여 세포 배양용 배지.
2. The culture medium for nuclear donor cell for canine reproduction according to claim 1, wherein the nuclear donor cell is derived from canine somatic cells or stem cells.
제7항에 있어서, 상기 체세포는 유사분열 G2/M단계의 체세포인 것을 특징으로 하는 개과 동물 복제용 핵 공여 세포 배양용 배지.
8. The culture medium for nuclear donation cell for canine reproduction according to claim 7, wherein the somatic cell is a somatic cell of a mitotic G2 / M stage.
제7항에 있어서, 상기 체세포는 개과 동물의 난구세포, 상피세포, 섬유아세포, 신경세포, 각질세포, 조혈세포, 멜라닌 세포, 연골세포, 마크로파지, 단구세포, 근육세포, B 림프구, T 림프구, 배아 줄기세포, 배아 생식세포, 태아 유래 세포, 성체 유래 세포, 태좌세포 및 배아세포로 이루어진 그룹 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 개과 동물 복제용 핵 공여 세포 배양용 배지.
8. The method of claim 7, wherein the somatic cells are selected from the group consisting of cumulus cells, epithelial cells, fibroblasts, neurons, keratinocytes, hematopoietic cells, melanocytes, cartilage cells, macrophages, monocytes, muscle cells, B lymphocytes, T lymphocytes, Wherein the culture medium is any one selected from the group consisting of embryonic stem cells, embryonic germ cells, fetal-derived cells, adult-derived cells, embryonic stem cells, and embryonic cells.
제9항에 있어서, 상기 체세포는 개과 동물의 섬유아세포 또는 난구세포인 것을 특징으로 하는 개과 동물 복제용 핵 공여 세포 배양용 배지.
[Claim 11] The culture medium for nuclear donor cell for canine reproduction according to claim 9, wherein the somatic cell is a fibroblast or a cumulus cell of a canine animal.
제7항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아 또는 성체 유래인 것을 특징으로 하는 개과 동물 복제용 핵 공여 세포 배양용 배지.
8. The culture medium for nuclear donor cell for canine reproduction according to claim 7, wherein the stem cells are embryonic or adult-derived.
제10항에 있어서, 상기 성체 유래 줄기세포는 골수, 제대혈, 혈액, 지방, 피부, 위장관, 태반 및 자궁으로 구성된 군으로부터 선택된 조직 유래인 것을 특징으로 하는 개과 동물 복제용 핵 공여 세포 배양용 배지.
[Claim 11] The culture medium for culturing canine donor cells for canine reproduction according to claim 10, wherein the adult stem cells are derived from a tissue selected from the group consisting of bone marrow, umbilical cord blood, blood, fat, skin, gastrointestinal tract, placenta and uterus.
개과 동물의 복제를 위하여, 제1항 또는 제5항의 배지를 이용하는 것을 특징으로 하는, 개과 동물 복제용 핵 공여 세포를 배양하는 방법.
A method for culturing a nuclear donor cell for canine reproduction, characterized in that the medium of claim 1 or 5 is used for cloning of canine.
제13항에 있어서, 핵 공여세포의 배양은 3계대 또는 4계대까지 이루어지는 것을 특징으로 하는 개과 동물 복제용 핵 공여 세포를 배양하는 방법.
14. The method for culturing a nuclear donor cell for canine reproduction according to claim 13, wherein the culturing of the nuclear donor cells is carried out in three or four passages.
제13항에 있어서, 핵 공여세포의 각 계대에서의 배양은 90 %컨플루언스 이상의 값에 도달할 때까지 이루어지는 것을 특징으로 하는 개과 동물 복제용 핵 공여 세포를 배양하는 방법.
14. The method for culturing a nuclear donor cell for canine replication according to claim 13, wherein the culturing in each passage of the nuclear donor cell is performed until a value of 90% confluence or more is reached.
제13항에 있어서, 핵 공여세포의 1차 배양은 7 내지 10일 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 개과 동물 복제용 핵 공여 세포를 배양하는 방법.
14. The method according to claim 13, wherein the primary culture of the nuclear donor cell is performed for 7 to 10 days.
제14항에 있어서, 핵 공여세포의 배양은 총 14~17일 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 개과 동물 복제용 핵 공여 세포를 배양하는 방법.
15. The method according to claim 14, wherein the culturing of the nuclear donor cell is performed for a total of 14 to 17 days.
제14항 내지 제17항 중 어느 한 항의 방법으로 배양한 핵 공여 세포를 분리하여 탈핵된 난모 세포에 이식 한 다음 이를 융합시켜 핵 이식란을 제조하는 단계; 및 상기 제조된 핵 이식란을 즉시 대리모에게 이식시켜 발생시키는 단계를 포함하는, 복제된 개과 동물의 생산방법.17. A method for producing a nuclear transfer embryo, comprising the steps of: isolating nuclear donor cells cultured by the method of any one of claims 14 to 17, transplanting the cells into enucleated oocytes, and then fusing them to prepare nuclear transfer embryos; And generating said nuclear transfer embryo by transplanting said nuclear transfer embryo to a surrogate mother immediately.
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