KR20150051122A - Method for differentiating glial progenitor cell, astrocyte and oligodendrocyte from embryonic stem cell - Google Patents
Method for differentiating glial progenitor cell, astrocyte and oligodendrocyte from embryonic stem cell Download PDFInfo
- Publication number
- KR20150051122A KR20150051122A KR1020140024179A KR20140024179A KR20150051122A KR 20150051122 A KR20150051122 A KR 20150051122A KR 1020140024179 A KR1020140024179 A KR 1020140024179A KR 20140024179 A KR20140024179 A KR 20140024179A KR 20150051122 A KR20150051122 A KR 20150051122A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- cells
- stem cells
- glial
- embryonic stem
- culturing
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0618—Cells of the nervous system
Landscapes
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
본 발명은 배아줄기세포로부터 신경교전구세포, 성상세포 및 희소돌기 아교세포로의 분화방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method of differentiating embryonic stem cells into glial progenitor cells, astrocytes, and rarely proliferating glial cells.
줄기세포(stem cell)는 생물 조직을 구성하는 생물을 다양한 세포들로 분화할 수 있는 세포로서 배아, 태아 및 성체의 각 조직에서 얻을 수 있는 분화(differentiation)되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭한다. 줄기세포는 분화 자극(환경)에 의하여 특정 세포로 분화가 진행되며, 세포분열이 정지된 분화된 세포와는 달리 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산(self-renewal)할 수 있어 증식(proliferation; expansion)하는 특성이 있으며, 다른 환경 또는 다른 분화 자극에 의해 다른 세포로도 분화될 수 있어 분화에 유연성(plasticity)을 가지고 있는 것이 특징이다.A stem cell is a cell capable of differentiating organisms constituting a biological tissue into various cells, collectively referred to as undifferentiated cells at different stages before differentiation, which can be obtained from each tissue of the embryo, fetus and adult body. Stem cells are differentiated into specific cells by differentiation stimuli (environment), and unlike the differentiated cells in which cell division is stopped, they can self-renew themselves by cell division, ; expansion, and it can be differentiated into other cells by different environments or differentiation stimuli, and is characterized by plasticity in differentiation.
줄기세포는 크게 배아(embryo)에서 얻어지고 모든 세포로 분화될 수 있는 잠재력(totipotent)을 지닌 전분화능(pluripotency)의 배아줄기세포(embryonic stem cell, ES cell)와 각 조직에서 얻어지는 다분화능(multipotency)의 성체줄기세포(adult stem cell)로 구분된다. 배아발생 초기인 포배기(blastocyte)의 세포내괴(inner cell mass)는 장차 태아를 형성할 부분으로서 이 세포내괴로부터 형성된 배아줄기세포는 이론적으로 한 개체를 구성하는 모든 조직의 세포로 분화될 수 있는 잠재력을 지닌 줄기세포이다. 즉, 배아줄기세포는 무제한적으로 증식이 가능한 미분화 세포이고, 모든 세포로 분화할 수 있으며, 성체줄기세포와 달리 배(germ) 세포도 만들 수 있어 다음세대로 유전될 수 있다. 이에 반하여, 태아 발생과정이 진행되어 각 조직이 형성되는 과정에서 도입되면 각각의 조직에는 그 조직에 특이적인 줄기세포(tissue specific stem cells; primary stem cells)가 존재하여 각 조직을 형성하는 분화 과정에 참여하게 된다. 이와 같이 조직 특이적 줄기세포는 일반적으로 분화할 수 있는 그 분화능력이 그 조직을 구성하는 세포로만 한정되게 되며(multipotent or unipotent), 성인이 된 후에도 대부분의 조직에는 각 조직에 특이적인 줄기세포가 남아 있게 되어 정상적 또는 병리적으로 발생하는 세포의 손실을 보충하게 된다.Stem cells are largely derived from pluripotency embryonic stem cells (ES cells) obtained from embryos and totipotent to differentiate into all cells and multipotent stem cells obtained from each tissue ) Adult stem cells are divided into. The inner cell mass of the blastocyte in the early stage of embryogenesis is the part of the embryo that will form the embryo in the future. The embryonic stem cells formed from the inner cell of the embryo can theoretically be differentiated into cells of all the tissues constituting the individual It is a stem cell with potential. In other words, embryonic stem cells are undifferentiated cells capable of proliferating indefinitely, and can differentiate into all cells. Unlike adult stem cells, embryonic stem cells can also be created and inherited to the next generation. In contrast, when embryonic development proceeds and each tissue is introduced during its formation, the tissue-specific stem cells (stem cells) are present in each tissue, . In this way, tissue-specific stem cells are generally limited to multipotent or unipotent cells that are capable of differentiating, and even after becoming adult, most of the tissues contain stem cells specific for each tissue And will compensate for the loss of normal or pathologically occurring cells.
따라서, 배아줄기세포로부터 신경교전구세포, 성상세포 및 희소돌기 아교세포로의 분화방법은 여러 연구에 이용될 수 있어 그 중요성이 매우 크며, 본 발명자들은 지속적인 배양이 가능한 신경교전구세포를 확립하는 방법을 개발함으로써, 본 발명을 완성하였다. Therefore, the method of differentiating embryonic stem cells into glial progenitor cells, astrocytes and rare proliferative glia cells can be used in various studies, and thus, the importance thereof is very high. The inventors of the present invention have developed a method of establishing a glial progenitor cell capable of continuous culture Thereby completing the present invention.
본 발명은 배아줄기세포로부터 신경교전구세포, 성상세포 및 희소돌기 아교세포로의 분화방법을 제공하는 것이다.The present invention provides a method of differentiating embryonic stem cells into glial progenitor cells, astrocytes, and rare prominent glial cells.
상기와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은In order to solve the above problems,
1) 배아줄기세포를 배양하여 배상체를 형성하는 단계;1) culturing embryonic stem cells to form an amphibian;
2) 상기 1)단계의 배상체를 단일 세포로 분리한 후, 분리된 단일 세포를배양하여 신경전구세포의 생성을 유도하는 단계; 2) separating the somata of step 1) into single cells, and then culturing the isolated single cells to induce the production of neural progenitor cells;
3) 상기 2)단계의 신경전구세포를 추가 배양한 후 단일 세포로 분리하고 이를 5 내지 40회 계대 배양하는 단계;를 포함하는 배아줄기세포로부터 신경전구세포로의 분화방법을 제공한다.3) further culturing the neural progenitor cells of step 2), separating the cells into single cells, and culturing them 5 to 40 times in a subculture, to provide a method of differentiating embryonic stem cells into neural precursor cells.
또한 본 발명은, 상기 방법으로 분화된 신경교전구세포를 제공한다.The present invention also provides a glial progenitor cell differentiated by the above method.
또한 본 발명은, 상기 신경교전구세포를 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 글루타멕스-1(glutamax-1) 첨가제 및 N2를 포함하는 DMEM 배지에서 8 내지 12일 동안 배양하는 단계를 포함하는, 신경교전구세포로부터 성상세포로의 분화방법을 제공한다.The present invention also encompasses culturing the glial progenitor cells for 8 to 12 days in DMEM medium containing fetal bovine serum (FBS), glutamax-1 additive and N2 To provide a method of differentiating from glial precursor cells into astrocytes.
또한 본 발명은, 상기 신경교전구세포를 T3, 글루타멕스-1 첨가제 및 B27을 포함하는 신경 기저 배지(neurobasal medium)에서 8 내지 12일 동안 배양하는 단계를 포함하는, 신경교전구세포로부터 희소돌기 아교세포로의 분화방법을 제공한다.The present invention also relates to a method for the prophylactic and / or therapeutic treatment of glial leukocyte from glial progenitor cells, comprising culturing said glial progenitor cells in a neurobasal medium comprising T3, glutamex-1 additive and B27 for 8 to 12 days Thereby providing a method of differentiating into cells.
본 발명에 따른 배아줄기세포로부터 신경교전구세포, 성상세포 및 희소돌기아교세포로의 분화방법을 이용할 경우, 수득된 신경교전구세포의 지속적인 배양이 가능하며, 상기 신경교전구세포는 성상세포 및 희소돌기 아교세포로의 분화가 가능하여 이와 관련된 독성물질의 스크리닝 및 독성평가에 유용하게 이용될 수 있다. When the method of differentiating embryonic stem cells into glial progenitor cells, astrocytes and rare proliferative glia cells according to the present invention is used, it is possible to continuously cultivate the obtained glial progenitor cells, and the glial progenitor cells can be stellate cells and rare prominent glue It is possible to differentiate into a cell, and thus it can be usefully used for screening and evaluating toxicity of a related toxic substance.
도 1은 마우스 배아줄기세포로부터 신경교전구세포로의 분화 유도과정을 간략히 나타낸 도이다.
도 2는 신경줄기세포의 신경 특이 마커 발현 양상을 확인하기 위해 면역 화학 분석하여 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다(마커: 녹색, 핵염색: 파란색).
도 3은 신경교전구세포의 계대배양 가능 여부 및 형태학적 특징을 확인하기 위해 면역 화학 분석하여 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 신경교전구세포의 특이적 olig2 발현 양상을 확인하기 위해 면역 화학 분석하여 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다(면역 형광 사진, olig2: 녹색, 핵염색: 파란색).
도 5는 신경교전구세포의 LIF 의존적 세포증식 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 신경교전구세포를 계대 수에 따라 면역 화학 분석하여 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 계대에 따른 신경교전구세포의 변화를 RT-PCR을 이용하여 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 신경교전구세포로부터 성상세포(astrocyte)로의 분화에 따른 분화지표 유전자 변화를 RT-PCR로 확인하고 그 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 신경교전구세포로부터 희소돌기 아교세포로의 분화에 따른 분화지표 유전자 변화를 RT-PCR로 확인하고 그 결과를 나타낸 도이다.1 is a diagram schematically illustrating the induction process of differentiation from mouse embryonic stem cells into progenitor precursor cells.
FIG. 2 is a diagram showing the result of immunochemical analysis and microscopic observation (marker: green, nuclear dye: blue) for confirming the expression pattern of neural-specific markers of neural stem cells.
FIG. 3 is a graph showing the result of immunochemical analysis and microscopic observation to confirm the viability and morphological characteristics of progenitor precursor cells.
FIG. 4 is a graph showing the result of immunochemical analysis and microscopic observation (immunofluorescence, olig2: green, nuclear staining: blue) for confirming the specific olig2 expression pattern of the glial progenitor cells.
FIG. 5 shows the results of LIF-dependent cell proliferation of progenitor precursor cells. FIG.
FIG. 6 is a graph showing the results of immunochemical analysis of the progenitor precursor cells according to the passage number and observation with a microscope. FIG.
FIG. 7 is a graph showing the results of comparison of changes in the glial progenitor cells according to the passage using RT-PCR.
FIG. 8 is a graph showing the results of confirming the differentiation index gene changes according to the differentiation from the glial progenitor cells into the astrocytes by RT-PCR.
FIG. 9 is a graph showing the results of confirmation of the differentiation index gene changes by differentiation from glial progenitor cells to rare proliferative glia cells by RT-PCR.
본 발명은, According to the present invention,
1) 배아줄기세포를 배양하여 배상체를 형성하는 단계;1) culturing embryonic stem cells to form an amphibian;
2) 상기 1)단계의 배상체를 단일 세포로 분리한 후, 분리된 단일 세포를배양하여 신경줄기세포의 생성을 유도하는 단계; 2) separating the somata of step 1) into single cells, and then culturing the isolated single cells to induce the production of neural stem cells;
3) 상기 2)단계의 신경줄기세포를 추가 배양한 후 단일 세포로 분리하고 이를 5 내지 40회 계대 배양하는 단계를 포함하는 배아줄기세포로부터 신경교전구세포로의 분화방법을 제공한다.3) further culturing the neural stem cells of step 2), separating the cells into single cells, and culturing them 5- to 40-times subculture, to provide a method of differentiating embryonic stem cells into glial progenitor cells.
또한 본 발명은, 상기 방법으로 분화된 신경교전구세포를 제공한다.The present invention also provides a glial progenitor cell differentiated by the above method.
상기 배아줄기세포는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 마우스 및 토끼로 이루어진 군으로 선택된 1종 이상으로부터 유래하나, 이에 제한되지 않는다. The embryonic stem cells are derived from one or more selected from the group consisting of human, monkey, pig, horse, cattle, sheep, dog, cat, mouse and rabbit, but are not limited thereto.
본 발명의 배아줄기세포로부터 신경교전구세포로의 분화방법에 대해 단계별로 상세히 설명하면 다음과 같다.The method of differentiating embryonic stem cells into progenitor precursor cells according to the present invention will be described step by step.
상기 1) 단계는 배아줄기세포로부터 배상체를 형성하는 단계로, 배아줄기세포를 소태아혈청 (fetal calf serum), 2-머캅토에탄올 (2-mercaptoethanol), L-글루타민, 비필수 아미노산, 페니실린, 스트렙토마이신 및 레티노 산을 포함하는 DMEM(Dulbeco's modified eagle's medium) 배지에서 4 내지 7일 동안 배양함으로서 배상체를 형성할 수 있다.In step 1), embryonic stem cells are cultured in a fetal calf serum, 2-mercaptoethanol, L-glutamine, non-essential amino acids, penicillin , Streptomycin, and retinoic acid for 4 to 7 days in DMEM (Dulbeco's modified eagle's medium).
상기 2) 단계는 배상체로부터 신경줄기세포로의 생성을 유도하는 단계로, 상기 1) 단계에서 수득한 배상체를 단일 세포로 분리한 후, 분리된 단일 세포를 N2이 첨가된 DMEM/F12 배지 및 B27이 첨가된 신경 기저 배지(neurobasal medium supplemented with B27)를 포함하는 N2/B27 배지에서 5 내지 9일 동안 배양함으로서 신경줄기세포의 생성을 유도할 수 있다.The step 2) is a step of inducing the production of neural stem cells from the supernatant. After separating the supernatant obtained in the step 1) into single cells, the isolated single cells are cultured in DMEM / F12 medium supplemented with N2 B27 medium supplemented with B27 (neurobasal medium supplemented with B27) for 5 to 9 days to induce the production of neural stem cells.
상기 3) 단계는 신경줄기세포를 추가 배양한 후 단일 세포로 분리하여 5 내지 40회 계대배양하여 신경교전구세포를 얻는 단계로, 상기 계대배양은 29회 실시하는 것이 바람직하다. 상기 추가 배양은 5 내지 9일 배양한 후 단일 세포로 분리한다. 상기 추가배양은 1 내지 3회 실시할 수 있다. 또한, 계대 배양은 FGF-2(Fibroblast growth factor), EGF (Epidermal growth factor) 및 LIF(leukemia inhibitory factor)를 포함하는 N2/B27 배지에서 배양하는 것이 바람직하다.
In the step 3), neural stem cells are further cultured and then separated into single cells and cultured 5 to 40 times to obtain glial progenitor cells. The subculture is preferably performed 29 times. The additional culture is incubated for 5-9 days and then separated into single cells. The additional culture may be carried out one to three times. The subculture is preferably cultured in N2 / B27 medium containing FGF-2 (Fibroblast growth factor), EGF (Epidermal growth factor) and LIF (leukemia inhibitory factor).
또한 본 발명은, 상기 신경교전구세포를 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 글루타맥스-1 첨가제 및 N2를 포함하는 DMEM 배지에서 8 내지 12일 동안 배양하는 단계를 포함하는, 신경교전구세포로부터 성상세포로의 분화방법을 제공한다.The present invention also relates to a method for the prophylactic and / or therapeutic treatment of glial precursor cells, comprising culturing said glial progenitor cells in a DMEM medium containing fetal bovine serum (FBS), glutamax-1 additive and N2 for 8 to 12 days To an astrocyte.
상기 성상 세포는 신경교전구세포에 비해 GFAP(glial fibrillary acidic protein), galC(Galactocerebrosidase) 및 olig2(oligodendrocyte lineage transcription factor 2)의 발현은 증가하고, Tuj1(neuronal class III beta tubulin)의 발현은 감소한다.
The expression of glial fibrillary acidic protein (GFAP), galactocerebrosidase (GFAP) and olig2 (oligodendrocyte lineage transcription factor 2) is increased and the expression of Tuj1 (neuronal class III beta tubulin) is decreased in the astrocytes as compared with the glial progenitor cells.
또한 본 발명은, 상기 신경교전구세포를 T3, 글루타멕스-1 첨가제 및 B27를 포함하는 신경 기저 배지(neurobasal medium)에서 8 내지 12일 동안 배양하는 단계를 포함하는, 신경교전구세포로부터 희소돌기 아교세포로의 분화방법을 제공한다.The present invention also relates to a method for producing glial progenitor cells from glial progenitor cells, comprising culturing said glial progenitor cells in a neurobasal medium comprising T3, glutamex-1 additive and B27 for 8 to 12 days Thereby providing a method of differentiating into cells.
상기 희소돌기 아교세포는 GFAP, galC 및 olig2의 발현은 증가하고, Tuj1의 발현은 감소한다.
The rare prominent glial cells have increased expression of GFAP, galC and olig2, and decreased expression of Tuj1.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
It will be apparent to those skilled in the art that various modifications and variations can be made in the present invention without departing from the spirit or scope of the invention as defined by the appended claims. It will be obvious to you.
실시예 1. 마우스 배아줄기세포로부터 신경전구세포로의 분화 유도 Example 1 Induction of Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells into Neural Progenitor Cells
마우스 배아줄기세포로부터 신경교전구세포로의 분화유도 과정을 간략히 도 1에 나타내었다.The process of inducing differentiation from mouse embryonic stem cells into progenitor precursor cells is briefly shown in Fig.
실시예 1-1. 배상체 형성Example 1-1. Formation of body
마우스 배아줄기세포를 배상체 분화배지에서 배양하여 배상체로의 분화를 유도하였다.Mouse embryonic stem cells were cultured in a differentiating medium to induce differentiation into somata.
보다 구체적으로, 마우스 배아줄기세포(NVRQS 11F)를 2×104개/ml 농도로 배상체(embryoid body, EB) 분화 배지에 넣어 5~6일 동안 37℃, 5%의 CO2가 유지되는 배양기에서 배양하였다. 상기 배상체 분화 배지는 20% 소태아혈청(fetal calf serum), 0.1mM 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol), 2 mM L-글루타민, 0.1 mM MEM 비필수아미노산(mininal essential medium nonessential amino acid), 엠브리오맥스 뉴클레오시드(EmbryoMax nucleosides) 및 50 U/ml 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 DMEM(Dulbeco's modified eagle's medium)이며, 10-8M의 레티노 산(retinoic acid)을 첨가하였다.
More particularly, the mouse embryonic stem cells (NVRQS 11F) to 2 × 10 compensation of four / ml of body (embryoid body, EB) into the differentiation medium 5-6 days 37 ℃, which is 5% to keep CO 2 for Lt; / RTI > The repertoire differentiation medium was prepared by adding 20% fetal calf serum, 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 2 mM L-glutamine, 0.1 mM MEM nonessential amino acid, , EmbryoMax nucleosides, and 50 U / ml penicillin / streptomycin, and 10 -8 M retinoic acid was added.
실시예 1-2. 배상체에서 신경줄기세포로의 분화 유도Examples 1-2. Induction of differentiation from neurons into neural stem cells
상기 실시예 1-1에서 분화된 배상체를 단일 세포로 분리(single cell dissociation) 시킨 후 7일 동안 신경줄기세포 유도 분화 배지에 추가 배양하여, 신경줄기세포로의 분화를 유도시켰다. 상기 신경줄기세포 유도 분화 배지는 N2 (Gibco 17502-048)이 첨가된 DMEM/F12 기반 배지 50% 및 B27(Gibco 17504-044)이 첨가된 신경 기저 배지(neurobasal medium supplemented with B27) 50%를 포함하는 N2/B27 배지이다. 상기 신경줄기세포 유도 분화 배지에 배상체를 접종하고, 37℃, 5%의 CO2가 유지되는 배양기에서 배양하여 신경줄기세포를 수득하였다.
The specimens differentiated in Example 1-1 were separated into single cells (single cell dissociation) and further cultured in neural stem cell-derived differentiation medium for 7 days to induce differentiation into neural stem cells. The neural stem cell-derived differentiation medium contained 50% of DMEM / F12-based medium supplemented with N2 (Gibco 17502-048) and 50% of neurobasal medium supplemented with B27 supplemented with B27 (Gibco 17504-044) N2 / B27 medium. The neural stem cells were inoculated into the neural stem cell-derived differentiation medium and cultured in an incubator maintained at 37 ° C and 5% CO 2 to obtain neural stem cells.
실시예 1-3. 신경줄기세포의 면역 화학 분석 Examples 1-3. Immunochemical analysis of neural stem cells
상기 실시예 1-2에서 수득한 신경줄기세포가 정상적으로 분화되었는지 확인하기 위하여, 면역 화학 분석을 실시하였다. 이때 신경줄기세포는 상기 실시예 1-1의 배상체 분화배지로 5 내지 6일 분화를 유도하고 이를 단일 세포로 분리한 후 다시 7일간 분화하여, 총 12~13일 배양한 신경줄기세포를 이용하였다.In order to confirm whether the neural stem cells obtained in Example 1-2 were properly differentiated, immunochemical analysis was carried out. At this time, the neural stem cells were induced with differentiation medium for 5-6 days in the medium of Example 1-1, separated into single cells, differentiated again for 7 days, and used for neural stem cells cultured for 12 to 13 days in total.
보다 구체적으로, 배양액을 걷어내고 신경줄기세포를 PBS 완충액으로 세척한 후 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)에 25분간 고정하였다. 이를 세척 완충액 (rinse buffer)(0.04% 트윈 20(tween 20)이 첨가된 트리스 완충액(Tris buffer))으로 세척하고 0.1% 트리톤(Triton)-X-100/PBS로 투과(permeabilization)한 후 세척 완충액으로 다시 세척하였다. 4% 정상 산양 혈청(normal goat serum)이 포함된 블로킹 완충액(blocking buffer)으로 실온에서 30분간 반응시킨 후 하기 표 1에 나타낸 1차 항체를 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 세척 완충액으로 3회 세척 후 하기 표 1에 나타낸 2차 항체를 실온에서 1시간 동안 반응시키고 세척 완충액으로 3회 세척한 후 염색 시약(Hoechst33342, invitrogen)을 이용하여 1:10000으로 핵을 염색하였다. 형광현미경 (Axiovert 200M, Carl Zeiss)으로 염색을 확인하고 사진을 찍어 관찰하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.More specifically, the culture broth was removed and neural stem cells were washed with PBS buffer and fixed in 4% paraformaldehyde for 25 minutes. This was washed with a rinse buffer (Tris buffer with 0.04% tween 20), permeabilized with 0.1% Triton-X-100 / PBS, washed with washing buffer Lt; / RTI > After reacting with blocking buffer containing 4% normal goat serum for 30 minutes at room temperature, the primary antibody shown in Table 1 was reacted at room temperature for 1 hour. After washing three times with washing buffer, the secondary antibody shown in Table 1 was reacted at room temperature for 1 hour, washed three times with washing buffer, and stained with 1: 10000 using a staining reagent (Hoechst 33342, Invitrogen). The staining was confirmed with a fluorescence microscope (Axiovert 200M, Carl Zeiss), and photographs were taken and observed. The results are shown in Fig.
Secondary antibody
배아줄기세포의 전분화능(pluripotency)을 나타내는 마커로는 Oct4, Sox2를, 신경줄기세포 마커로는 네스틴(Nestin) 및 무사시(musashi)를, 신경세포 마커로는 Tuj1(neuronal class III tubulin)을, 콜린성 신경세포 마커로는 HB9 및 Islet1을, 도파민성 신경세포 마커로는 TH를, 증식하는 세포의 마커로는 PCNA(proliferating cell nuclear antigen)를, 신경교세포 마커로는 olig2(oligodendrocyte lineage transcription factor 2)를, 성상세포 마커로는 GFAP(glial fibrillary acidic protein)를 이용하였다. Nestin and musashi as neural stem cell markers and Tuj1 (neuronal class III tubulin) as neuronal markers were used as markers indicating pluripotency of embryonic stem cells, HB9 and Islet1 as cholinergic neuron markers, TH as a dopaminergic neuron marker, PCNA (proliferating cell nuclear antigen) as a proliferating cell marker, and olig2 (oligodendrocyte lineage transcription factor 2) as a glial cell marker, And glial fibrillary acidic protein (GFAP) as an astrocytic marker.
도 2에 나타난 바와 같이, 신경줄기세포 마커인 네스틴, 무사시 및 Sox2가 강하게 발현되고, 배아줄기세포 마커인 oct4의 발현은 분리된 세포에 따라 발현도가 다르게 나타나 배상체에서 신경줄기세포로의 분화가 정상적으로 이루어졌음을 확인하였다.
As shown in FIG. 2, the neural stem cell markers nestin, Musashi, and Sox2 are strongly expressed, and the expression of oct4, an embryonic stem cell marker, is different depending on the cells to be separated, and the differentiation into neural stem cells .
실시예 1-4. 신경줄기세포의 추가배양Examples 1-4. Further cultivation of neural stem cells
상기 실시예 1-2에서 수득한 신경전구세포를 세포 배양 플라스크에 하나씩 옮겨 37℃, 5%의 CO2가 유지되는 배양기에서 7일간 추가적으로 배양하였다. 상기 배양 과정을 2회 반복한 후 단일세포로 분리시켜 배양하여 신경교전구세포를 유지 배양하였다.The neural progenitor cells obtained in Example 1-2 were transferred one by one to a cell culture flask and further cultured in an incubator maintained at 37 ° C and 5% CO 2 for 7 days. The culturing process was repeated twice, and then the cells were separated into single cells, cultured, and the glial progenitor cells were cultured.
보다 구체적으로, 상기 실시예 1-1에서 분화된 배상체를 단일세포로 분리한 후 이를 7일간 배양하여 신경줄기세포(neural stem cell)를 다수 포함하는 콜로니를 형성했으며, 상기 콜로니를 떼내어 배양하면 신경줄기세포에서 신경전구세포 (progenitor cell)로 분화되며, 그 후 신경으로 분화하는 전구세포 (neuronal progenitor cell)와 신경교세포로 분화하는 전구세포 (glial progenitor cell)로 분화됨을 확인하였다. 이 중 신경교전구세포를 수득하기 위하여 콜로니를 다른 배양 플레이트에 옮겨 7일간 추가적으로 배양하는 것으로 2회 반복 배양하였다. More specifically, the specimens differentiated in Example 1-1 were separated into single cells and cultured for 7 days to form colonies containing many neural stem cells. When the colonies were cultured and removed It is differentiated into neuronal progenitor cells in neural stem cells and then differentiated into neuronal progenitor cells and glial progenitor cells that differentiate into neurons. In order to obtain the glial precursor cells, the colonies were transferred to another culture plate and cultured for 2 additional times by further culturing for 7 days.
또한, 단일층으로 자라는 세포가 배양 플레이트의 60~70%로 자랐을 때, accutase 혹은 trypsin/EDTA로 세포를 떼내고 적절한 세포 농도로 배양 플레이트에 다시 추가배양하였다.In addition, when cells growing in monolayer grew to 60-70% of the culture plate, cells were detached with accutase or trypsin / EDTA and further cultured again at the appropriate cell concentration on the culture plate.
그 결과, 단일층 (monolayer) 상태의 부착 세포 (adherent cell)로 증식함을 확인하였다. 또한, 지속적으로 추가 배양하여 4계대까지는 동일한 성상을 유지하는 것이 관찰되어 신경교전구세포의 계대배양이 가능함을 확인하였다.
As a result, it was confirmed that the cells proliferated into monolayer adherent cells. In addition, it was observed that the same characteristics were maintained up to the fourth passage by continuous culturing, and it was confirmed that subculture of the glial progenitor cells was possible.
실시예 2. 신경교전구세포의 계대배양 및 특징 확인Example 2: Subculture of glial precursor cells and characterization
실시예 2-1. 신경교전구세포의 계대배양 및 면역 화학 분석Example 2-1. Subculture and immunochemical analysis of glial precursor cells
상기 실시예 1에서 확립된 신경교전구세포를 지속적으로 계대배양하여, 지속적인 계대배양의 가능 여부와 형태학적 특징 변화, 신경교전구세포로의 분화여부를 확인하기 위하여, 면역 화학 분석을 수행하였다.The glial progenitor cells established in Example 1 were continuously subcultured to perform immunochemical analysis in order to confirm the possibility of continuous subculture, morphological characteristics change, and differentiation into progenitor precursor cells.
보다 구체적으로, 상기 실시예 1에서 확립된 신경교전구세포를 N2/B27, 20ng/ml FGF-2(Fibroblast growth factor), 20ng/ml의 EGF (Epidermal growth factor) 및 1% LIF (Leukemia Inhibitory factor)를 포함하는 배지에 넣어 37℃, 5%의 CO2가 유지되는 배양기에서 배양하였다. 배지는 2일마다 0.25% 트립신(trypsin)-EDTA(Gibco)으로 세포를 부유시켜 계대배양 하였다. In detail, the glial progenitor cells established in Example 1 were incubated with N2 / B27, 20 ng / ml FGF-2 (Fibroblast growth factor), 20 ng / ml EGF (Epidermal growth factor) and 1% LIF (Leukemia inhibitory factor) , And cultured in an incubator maintained at 37 ° C and 5% CO 2 . The medium was subcultured by suspending cells with 0.25% trypsin-EDTA (Gibco) every 2 days.
상기 확립된 신경교전구세포의 특성 및 계대 후 형태학적 변화 여부를 확인하기 위하여, 2계대 배양한 신경전구세포를 상기 실시예 1-3과 같은 방법으로 면역 화학 분석을 실시하였다. 1차 항체로서 항-Oct4, 항-Sox2, 항-네스틴, 항-무사시 및 항-olig2를 이용하고 녹색으로 염색하였다. 2차 항체로는 상기 표 1에 기재되어 있는 것으로 사용하였다. 핵은 염색 시약(hoechst33342)을 이용하여 파란색으로 염색하였으며, 형광현미경으로 염색을 확인하였다. 그 결과를 도 3 및 4에 나타내었다. In order to confirm the characteristics of the established glial progenitor cells and morphological changes after the passage, the neural progenitor cells cultured in the second passage were subjected to immunochemical analysis in the same manner as in Example 1-3. Anti-Ot4, anti-Sox2, anti-nestin, anti-Musashi and anti-olig2 were used as primary antibodies and stained in green. The secondary antibody was used as described in Table 1 above . Nuclei were stained blue using a staining reagent (hoechst33342), and staining was confirmed by fluorescence microscopy. The results are shown in Figs. 3 and 4. Fig.
도 3에 나타낸 바와 같이, 신경줄기세포 마커인 네스틴 및 무사시가 현저히 발현됨을 확인하였고, 배아줄기세포 마커인 Oct4가 적게 발현됨을 확인하였다. As shown in FIG. 3, nestin and musculus, which are neural stem cell markers, were markedly expressed, and it was confirmed that Oct4, an embryonic stem cell marker, was less expressed.
또한, 도 4에 나타낸 바와 같이, 신경교전구세포에서 희소돌기 아교세포 (oligodendrocyte)의 마커인 olig2가 현저하게 발현됨을 확인하였다.In addition, as shown in Fig. 4, it was confirmed that olig2, a marker of oligodendrocyte, was remarkably expressed in glial progenitor cells.
따라서, 본 발명의 신경교전구세포는 지속적인 계대배양이 가능하며 신경교전구세포로의 분화가 진행 된 세포주임을 확인하였다.
Thus, it was confirmed that the glial progenitor cells of the present invention are cell lines capable of continuous subculture and differentiated into progenitor precursor cells.
실시예 2-2. 신경전구세포의 LIF 성장인자 의존성 확인Example 2-2. Identification of LIF Growth Factor Dependence in Neural Progenitor Cells
상기 실시예 2-1 신경교전구세포의 LIF(Leukemia inhibitory factor) 성장인자 의존성을 확인하기 위하여, 신경교전구세포를 계대배양 시 1%의 LIF 성장인자를 추가하는 그룹과, 또는 추가하지 않은 그룹으로 나누었다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.In order to confirm the dependence of LIF (Leukemia inhibitory factor) growth factor on the proliferation of the glial progenitor cells of Example 2-1, the glial progenitor cells were divided into a group to which 1% of LIF growth factor was added or a group to which no LIF growth factor was added . The results are shown in Fig.
도 5에 나타난 바와 같이, LIF 성장인자를 제거하여 배양한 그룹에서 배양 후 4일부터 세포의 부착능이 현저히 감소하여 사멸됨을 확인하였다.
As shown in FIG. 5, it was confirmed that the adhesion of cells was significantly decreased from day 4 after culturing in the group cultured by removing the LIF growth factor, and died.
실시예 3. 신경교전구세포의 계대에 따른 신경교세포 계통(glial lineage) 양상 확인Example 3 Confirmation of the glial lineage pattern according to the passage of glial progenitor cells
실시예 3-1. 신경교전구세포의 계대 수에 따른 면역 화학 분석 Example 3-1. Immunochemical analysis of neuroblastoma cells according to number of passages
상기 실시예 2-1의 계대배양 방법을 이용하여, 신경교전구세포의 계대에 따른 분화지표 단백질 마커 발현 및 변화를 확인하기 위한 면역 화학 분석을 실시하였다.Immunohistochemical analysis was performed using the subculture method of Example 2-1 to confirm the expression and change of the differentiation index protein marker according to the passage of the glial progenitor cells.
상기 실시예 1-3의 면역 화학 분석방법과 동일하게 수행하였으며, 1차 항체로 항-네스틴, 항-무사시, 항-Sox2, 항-Oct4를 사용하였고 2차 항체로 항-마우스 및 래빗 IgG FITC, TRITC 등을 사용하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다. 첫째줄은 17계대, 둘째줄은 20계대, 셋째줄은 23계대, 넷째줄은 26계대, 다섯째줄은 29계대한 것을 나타낸 것이다. Anti-nestin, anti-Muscle, anti-Sox2 and anti-Ot4 were used as the primary antibodies and the secondary antibodies were anti-mouse and rabbit IgG FITC, and TRITC were used. The results are shown in Fig. The first row shows 17 passages, the second row has 20 passages, the third row has 23 passages, the fourth row has 26 passages, and the fifth row has 29 passages.
도 6에 나타난 바와 같이, 20계대 이후부터는 배아줄기세포 마커인 Oct4의 발현이 미약함을 확인하였고, 신경교전구세포 마커인 네스틴 및 무사시가 현저하게 발현됨을 확인하였다. 또한, 29계대까지 안정적으로 신경교전구세포 마커를 발현하는 신경교전구세포임을 확인하였다.
As shown in FIG. 6, it was confirmed that the expression of Oct4, an embryonic stem cell marker, was weak from 20th passage and nestin precursor cell markers nestin and musashi were remarkably expressed. In addition, it was confirmed that it is a progenitor precursor cell expressing the glial progenitor cell marker stably up to the 29th passage.
실시예 3-2. RT-PCR을 이용한 신경교전구세포 계대에 따른 유전자 발현 및 변화 확인 Example 3-2. Gene expression by RT-PCR in neuronal precursor cell line And change confirmation
상기 실시예 2-1의 계대배양 방법을 이용하여, 신경교전구세포의 계대에 따른 분화지표 단백질 마커 발현 및 변화를 확인하기 위한 RT-PCR을 수행하였다.Using the subculture method of Example 2-1, RT-PCR was performed to confirm expression and change of differentiation index protein markers according to the passage of glial progenitor cells.
보다 구체적으로, 신경교전구세포 유전자의 발현 여부를 확인하기 위하여, 각 계대 수 별 세포로부터 분리해 낸 전체 RNA 500 ng을 주형으로 사용하여 2단계 RT-PCR을 실시하였다. Accupower cycleScript RT premix 키트 (bioneer)를 사용하여 역전사(reverse transcription)를 실시하였고, 이를 이용하여 iQ SYBR Green supermix (Biorad) 로 real-time PCR을 수행하였다. PCR 반응에 사용한 프라이머 세트의 염기서열은 oct4 유전자 증폭의 경우 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머를, sox2 유전자 증폭의 경우 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머를, 네스틴 유전자 증폭의 경우 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머를, 무사시 유전자 증폭의 경우 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머를, TB3(Tuj1) 유전자 증폭의 경우 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 프라이머를, GFAP 유전자 증폭의 경우 서열번호 11 및 서열번호 12로 표시되는 프라이머를, olig2 유전자 증폭의 경우 서열번호 15 및 서열번호 16으로 표시되는 프라이머를 이용하였다. 반응에 사용한 프라이머 세트의 염기서열은 하기 표 2에 나타내었다. PCR 기기는 iCycler thermal cycler (Biorad)를 이용하였으며 PCR 반응조건은 95℃에서 3분간 변성(denaturation)을 한 뒤 95℃에서 10초, 60℃에서 10초, 72℃에서 20초의 PCR 반응을 45번 반복하고, 95℃에서 1분간 중합(polymerization) 반응을 수행하였다. 대조군으로서 β-액틴의 발현 여부와 비교하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.More specifically, in order to confirm the expression of the glial progenitor cell gene, 2-step RT-PCR was performed using 500 ng of the total RNA isolated from cells in each passage as a template. Reverse transcription was performed using Accupower cycleScript RT premix kit (bioneer) and real-time PCR was performed using iQ SYBR Green supermix (Biorad). The nucleotide sequence of the primer set used in the PCR reaction was as follows: primer represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 for oct4 gene amplification; primer represented by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 for sox2 gene amplification; 7 and SEQ ID NO: 8 in the case of the Musashi gene amplification and SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 in the case of the TB3 (Tuj1) gene amplification, respectively; The primers represented by SEQ. ID. NO. 11 and SEQ ID NO. 12 for GFAP gene amplification and the primers represented by SEQ ID NO. 15 and SEQ ID NO. 16 for olig2 gene amplification were used. The nucleotide sequence of the primer set used in the reaction is shown in Table 2 below. PCR was performed using an iCycler thermal cycler (Biorad). The PCR reaction conditions were denaturation at 95 ° C for 3 minutes, followed by PCR at 95 ° C for 10 seconds, 60 ° C for 10 seconds, and 72 ° C for 20 seconds. And the polymerization reaction was carried out at 95 DEG C for 1 minute. And compared with the expression of? -Actin as a control, and the results are shown in Fig.
방향gene
direction
도 7에 나타낸 바와 같이, 배아줄기세포 마커인 Oct4의 경우, 20계대 이후 급격히 감소함을 확인하였고, 신경전구세포 마커인 네스틴 및 무사시는 배아줄기세포에 비해 약간 증가된 양상을 보임을 확인하였다. 또한, 신경세포 마커인 TB3, 성상세포 마커인 GFAP 및 희소돌기 아교세포 마커인 Olig2은 현저히 높은 발현율을 나타냄을 확인하였다. 또한, 선발된 20 계대 이후의 세포는 신경교세포에 가까운 전구세포, 즉 신경교전구세포로 확인되었다.
As shown in FIG. 7, it was confirmed that Oct4, an embryonic stem cell marker, was abruptly decreased after
실시예 4. 신경교전구세포의 신경교세포 계통으로의 분화능 확인Example 4. Confirmation of the differentiation potential of the glial progenitor cells into the glial cell line
실시예 4-1. 성상세포(astrocyte)로의 분화 Example 4-1. Differentiation into astrocytes
상기 실시예 2에서 확립된 신경교전구세포를 폴리-L-오르니틴으로 코팅된 플레이트에서 DMEM 배지, 글루타멕스-1 첨가물, N2 첨가물 및 FBS를 가하여 10일간 분화를 유도하고 상기 실시예 3과 같이 RT-PCR을 수행하였다. PCR 반응에 사용한 프라이머 세트의 염기서열은 네스틴 유전자 증폭의 경우 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머를, TB3 유전자 증폭의 경우 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 프라이머를, GFAP 유전자 증폭의 경우 서열번호 11 및 서열번호 12로 표시되는 프라이머를, Galc 유전자 증폭의 경우 서열번호 13 및 서열번호 14으로 표시되는 프라이머를, olig2 유전자 증폭의 경우 서열번호 15 및 서열번호 16으로 표시되는 프라이머를 이용하였다. 반응에 사용한 프라이머 세트의 염기서열은 상기 표 2에 나타내었다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.The glial progenitor cells established in Example 2 DMEM medium, glutamex-1 adduct, N2 adduct and FBS were added to the plate coated with poly-L-ornithine to induce differentiation for 10 days and RT-PCR was performed as in Example 3 above. The base sequence of the primer set used in the PCR reaction was as follows: the primers represented by SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 for nestin gene amplification; the primers represented by SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 for TB3 gene amplification; 13 and SEQ ID NO: 14 for Galc gene amplification, and primers represented by SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16 for olig2 gene amplification, Respectively. The nucleotide sequence of the primer set used in the reaction is shown in Table 2 above. The results are shown in Fig.
도 8에 나타낸 바와 같이, 성상세포로의 분화 시, 신경세포 마커인 TB3(Tuj1)의 발현은 감소함을 확인하였고, 신경전구세포 마커인 네스틴의 발현이 약간 증가하는 양상을 보임을 확인하였고, 신경교세포 계통 마커인 GFAP, galC 및 olig2의 발현이 현저히 증가함을 확인하였다.
As shown in FIG. 8, when the cells were differentiated into astrocytes, the expression of TB3 (Tuj1), a neuronal cell marker, was decreased and the expression of nestin, a neural progenitor cell marker, was slightly increased , And the expression of GFAP, galC and olig2, which are markers of the glial cell lineage, were significantly increased.
실시예 4-2. 희소돌기 아교세포로 분화Example 4-2. Differentiation into rare prominent glue cells
상기 실시예 2에서 확립된 신경교전구세포를 폴리-L-오르니틴/라미닌으로 코팅된 플레이트에 신경 기질 배지(nerobasal medium), 글루타멕스-1 첨가물, B27 첨가물 및 T3을 첨가하여 10일간 분화를 유도하고 상기 실시예 3과 같은 조건으로 RT-PCR을 수행하였다. PCR 반응에 사용한 프라이머 세트의 염기서열은 네스틴 유전자 증폭의 경우 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머를, TB3 유전자 증폭의 경우 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 프라이머를, GFAP 유전자 증폭의 경우 서열번호 11 및 서열번호 12로 표시되는 프라이머를, Galc 유전자 증폭의 경우 서열번호 13 및 서열번호 14으로 표시되는 프라이머를, olig2 유전자 증폭의 경우 서열번호 15 및 서열번호 16으로 표시되는 프라이머를 이용하였다. 반응에 사용한 프라이머 세트의 염기서열은 상기 표 2에 나타내었다. 그 결과를 도 9 에 나타내었다. The glial progenitor cells established in Example 2 were inoculated into poly-L-ornithine / laminin-coated plates for 10 days by adding nerobasal medium, glutamex-1 additive, B27 additive and T3 And RT-PCR was carried out under the same conditions as in Example 3 above. The base sequence of the primer set used in the PCR reaction was as follows: the primers represented by SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 for nestin gene amplification; the primers represented by SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 for TB3 gene amplification; 13 and SEQ ID NO: 14 for Galc gene amplification, and primers represented by SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16 for olig2 gene amplification, Respectively. The nucleotide sequence of the primer set used in the reaction is shown in Table 2 above. The results are shown in Fig.
도 9 에 나타낸 바와 같이, 희소돌기 아교세포로 분화 시, 신경세포 마커인 TB3(Tuj1)의 발현이 감소함을 확인하였고, 신경전구세포 마커인 네스틴의 발현이 증가하고, 신경교세포 계통 마커인 GFAP, galC 및 olig2의 발현은 현저히 증가함을 확인하였다.
As shown in Fig. 9, it was confirmed that the expression of nerve cell marker TB3 (Tuj1) was decreased when differentiated into spindle-shaped glial cells, and the expression of nestin, a neural progenitor cell marker, Expression of GFAP, galC and olig2 was significantly increased.
<110> Animal and plant quaratine agency <120> Method for differentiating glial progenitor cell, astrocyte and oligodendrocyte from embryonic stem cell <130> 1.49-1P <150> KR 10-2013-0131627 <151> 2013-10-31 <160> 16 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of oct4 <400> 1 gagaagagta tgaggct 17 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primer of oct4 <400> 2 gaagccgaca acaatga 17 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of sox2 <400> 3 aagggttctt gctgggtttt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primer of sox2 <400> 4 agaccacgaa aacggtcttg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of nestin <400> 5 ccagagctgg actggaactc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primer of nestin <400> 6 acctgcctct tttggttcct 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of Musashi <400> 7 tagttcgagg gacaggctct 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primer of Musashi <400> 8 gttgagggac aggcagtagc 20 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of tb3(tuj1) <400> 9 gcctttggac acctattca 19 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primer of tb3(tuj1) <400> 10 agtcacaatt ctcacactct t 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of GFAB <400> 11 ctccaagatg aaaccaacct 20 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primer of GFAB <400> 12 ctcctcctcc agcgattc 18 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of Galc <400> 13 ccaaccaact acaaggatga t 21 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primer of Galc <400> 14 caaacacgcc agtctgat 18 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of olig2 <400> 15 ctgctggcgc gaaactacat 20 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primer of olig2 <400> 16 cgctcaccag tcgcttcat 19 <110> Animal and plant quaratine agency <120> Method for differentiating glial progenitor cell, astrocyte and 자막 <130> 1.49-1P <150> KR 10-2013-0131627 <151> 2013-10-31 <160> 16 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of oct4 <400> 1 gagaagagta tgaggct 17 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primer of oct4 <400> 2 gaagccgaca acaatga 17 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of sox2 <400> 3 aagggttctt gctgggtttt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primer of sox2 <400> 4 agaccacgaa aacggtcttg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of nestin <400> 5 ccagagctgg actggaactc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primer of nestin <400> 6 acctgcctct tttggttcct 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of Musashi <400> 7 tagttcgagg gacaggctct 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primer of Musashi <400> 8 gttgagggac aggcagtagc 20 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of tb3 (TuJ1) <400> 9 gcctttggac acctattca 19 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primer of tb3 (TuJ1) <400> 10 agtcacaatt ctcacactct t 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of GFAB <400> 11 ctccaagatg aaaccaacct 20 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primer of GFAB <400> 12 ctcctcctcc agcgattc 18 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of Galc <400> 13 ccaaccaact acaaggatga t 21 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primer of Galc <400> 14 caaacacgcc agtctgat 18 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of olig2 <400> 15 ctgctggcgc gaaactacat 20 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primer of olig2 <400> 16 cgctcaccag tcgcttcat 19
Claims (9)
2) 상기 1)단계의 배상체를 단일 세포로 분리한 후, 분리된 단일 세포를배양하여 신경줄기세포의 생성을 유도하는 단계;
3) 상기 2)단계의 신경줄기세포를 추가 배양한 후, 단일 세포로 분리하고 이를 5 내지 40회 계대 배양하는 단계를 포함하는 배아줄기세포로부터 신경교전구세포로의 분화방법.1) culturing embryonic stem cells to form an amphibian;
2) separating the somata of step 1) into single cells, and then culturing the isolated single cells to induce the production of neural stem cells;
3) further culturing the neural stem cells of step 2), separating the cells into single cells, and culturing them 5- to 40-times subculture, to differentiate into embryonic stem cell-derived progenitor cells.
상기 배아줄기세포는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 마우스 및 토끼로 이루어진 군으로 선택된 1종 이상으로부터 유래한 것을 특징으로 하는, 배아줄기세포로부터 신경교전구세포로의 분화방법.The method according to claim 1,
Wherein said embryonic stem cells are derived from at least one selected from the group consisting of human, monkey, pig, horse, cow, sheep, dog, cat, mouse and rabbit. Way.
상기 1)단계의 배양은 소태아혈청 (fetal calf serum), 2-머캅토에탄올 (2-mercaptoethanol), L-글루타민, 비필수 아미노산, 페니실린, 스트렙토마이신 및 레티노 산을 포함하는 DMEM(Dulbeco's modified eagle's medium) 배지에서 수행하는 것을 특징으로 하는, 배아줄기세포로부터 신경교전구세포로의 분화방법.The method according to claim 1,
The culture in step 1) is carried out in a DMEM (Dulbeco's modified eagle's) containing fetal calf serum, 2-mercaptoethanol, L-glutamine, non-essential amino acids, penicillin, streptomycin and retinoic acid The present invention relates to a method for differentiating embryonic stem cells into progenitor precursor cells.
상기 2)단계의 배양은 N2가 첨가된 DMEM/F12 배지 및 B27이 첨가된 신경 기저 배지(neurobasal medium supplemented with B27)를 포함하는 N2/B27 배지에서 수행하는 것을 특징으로 하는, 배아줄기세포로부터 신경교전구세포로의 분화방법.The method according to claim 1,
Wherein the culture in step 2) is carried out in N2 / B27 medium containing DMEM / F12 medium supplemented with N2 and neurobasal medium supplemented with B27. Differentiation into progenitor cells.
상기 3)단계의 계대 배양은 FGF-2(Fibroblast growth factor), EGF (Epidermal growth factor) 및 LIF(leukemia inhibitory factor)를 포함하는 N2/B27 배지에서 수행하는 것을 특징으로 하는, 배아줄기세포로부터 신경교전구세포로의 분화방법.The method according to claim 1,
The subculture of step 3) is carried out in N2 / B27 medium containing FGF-2 (Fibroblast growth factor), EGF (Epidermal growth factor) and LIF (leukemia inhibitory factor) Differentiation into progenitor cells.
상기 신경교전구세포는 네스틴(nestin), 무사시(musashi) 및 Sox2를 발현하는 것을 특징으로 하는 신경교전구세포.The method according to claim 6,
Wherein said glial progenitor cells express nestin, musashi and Sox2.
Culturing the glial progenitor cells of claim 6 for 8 to 12 days in a neurobasal medium comprising T3, glutamex-1 additive and B27 to a dilated glomeruli cell Differentiation method.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020130131627 | 2013-10-31 | ||
KR20130131627 | 2013-10-31 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20150051122A true KR20150051122A (en) | 2015-05-11 |
KR101636966B1 KR101636966B1 (en) | 2016-07-11 |
Family
ID=53388707
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020140024179A KR101636966B1 (en) | 2013-10-31 | 2014-02-28 | Method for differentiating glial progenitor cell, astrocyte and oligodendrocyte from embryonic stem cell |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
KR (1) | KR101636966B1 (en) |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20120009157A1 (en) * | 2009-02-03 | 2012-01-12 | Hideyuki Okano | Culture method of embryoid bodies and/or neural stem cells derived from human differentiated cell-derived pluripotent stem cells |
-
2014
- 2014-02-28 KR KR1020140024179A patent/KR101636966B1/en active IP Right Grant
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20120009157A1 (en) * | 2009-02-03 | 2012-01-12 | Hideyuki Okano | Culture method of embryoid bodies and/or neural stem cells derived from human differentiated cell-derived pluripotent stem cells |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR101636966B1 (en) | 2016-07-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Conti et al. | Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities? | |
JP2008201792A (en) | Embryonic stem cell and neural progenitor cell derived therefrom | |
CN106893692A (en) | For the cell culture platform that unicellular sorting is reprogramed with enhanced IP SC | |
TWI493034B (en) | Neuronal epithelial cells differentiated by universal stem cells and the medium used and their differentiation methods | |
Choi et al. | A novel feeder-free culture system for expansion of mouse spermatogonial stem cells | |
CN104540936A (en) | Stem cell culture medium and method for culturing stem cells using same | |
Lim et al. | In Vitro Culture‐Induced Pluripotency of Human Spermatogonial Stem Cells | |
CN103555661A (en) | Culture method free of multipotential stem cell without serum and feeder layer | |
CN106754657B (en) | Serum-free medium for monkey embryonic stem cells | |
US9163214B2 (en) | Method for culturing stem cells | |
Yamasaki et al. | Long-term serial cultivation of mouse induced pluripotent stem cells in serum-free and feeder-free defined medium. | |
CN101294146B (en) | System for inducing nerve stem cell differentiation and inducing method thereof | |
CN104946581B (en) | A kind of special culture media and method for cultivating pig cytotrophoblast stem cells | |
Garg et al. | Cardiomyocytes rhythmically beating generated from goat embryonic stem cell | |
Chen et al. | Trophic factor induction of human umbilical cord blood cells in vitro and in vivo | |
Abdyyev et al. | In vitro derived female hPGCLCs are unable to complete meiosis in embryoid bodies | |
Zhou et al. | Species origin of exogenous transcription factors affects the activation of endogenous pluripotency markers and signaling pathways of porcine induced pluripotent stem cells | |
CN114276984B (en) | Method for transdifferentiating female germ stem cells into functional sperm and application | |
KR101636966B1 (en) | Method for differentiating glial progenitor cell, astrocyte and oligodendrocyte from embryonic stem cell | |
KR101335485B1 (en) | Methods for Separating and Culturing of Neural Precursor Cell from Pluripotent Stem Cells | |
CN116769695A (en) | Culture medium and method for producing human cells and tissues from teratomas, organoids and embryoid bodies | |
CN106085951B (en) | Method for establishing tree shrew spermatogonial stem cell line capable of being continuously passaged | |
CN104774803A (en) | Novel embryonic stem cell culturing system and embryonic stem cell line establishment method | |
Asadi et al. | Derivation of ES-like cell from neonatal mouse testis cells in autologous sertoli cells co-culture system | |
Kim et al. | Generation of in vivo neural stem cells using partially reprogrammed cells defective in in vitro differentiation potential |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
E902 | Notification of reason for refusal | ||
AMND | Amendment | ||
E601 | Decision to refuse application | ||
AMND | Amendment | ||
X701 | Decision to grant (after re-examination) |