KR20150050963A - 세포융합을 통한 줄기세포의 역분화능 측정 방법 - Google Patents

세포융합을 통한 줄기세포의 역분화능 측정 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 줄기세포의 역분화능(reprogramming potential)을 측정하는 방법에 관한 것이다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 신경줄기세포와 배아줄기세포(ESCs)를 융합시킨 하이브리드 세포와 ROCK-억제제의 존재하에 신경줄기세포와 전능성 줄기세포를 융합시킨 하이브리드 줄기세포에서 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase, AP) 양성 반응성 콜로니의 양을 측정하거나 Oct4 유전자의 발현량을 측정함으로써 임의의 줄기세포의 역분화능을 측정할 수 있는 방법을 제공함으로써, 종래 키메라(chimera) 산자 형성 여부에 이용하여 줄기세포의 전능성 및 역분화능(reprogramming potential)을 구별하였던 방법과 비교하여 경제적이고 간단한 방법으로 임의의 줄기세포가 navie pluripotency 또는 primed pluripotency 가운데 어떠한 전능성 유형에 해당되는지 또는 어느 수준의 역분화능을 가지고 있는지 측정할 수 있는 효과가 있다.

Description

세포융합을 통한 줄기세포의 역분화능 측정 방법{A METHOD FOR MEASURING REPROGRAMMING POTENTIAL USE OF CELL FUSION PROTOCOL}
본 발명은 줄기세포의 역분화능(reprogramming potential)을 측정하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 세포융합을 통해 제조된 하이브리드 줄기세포(hybrid stem cell)에서 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase, AP) 양성 반응성 콜로니의 양을 측정하거나 Oct4 유전자의 발현량을 측정함으로써 임의의 줄기세포가 naive pluripotency 또는 primed pluripotency 가운데 어떠한 전능성 유형에 해당하는지 또는 어느 수준의 역분화능을 지니는지 측정하는 방법에 관한 것이다.
최근 줄기세포의 전능성(pluripotency)에 대한 개념은 역분화능(reprogramming potential)의 정도에 따라 naive pluripotency와 primed pluripotency라는 의미로 구분되어 사용된다. 즉, naive pluripotency는 배아줄기세포(embryonic stem cells, ESCs)와 같이 기형종의 형성(teratoma formation) 및 키메라 산자까지도 생산할 수 있는 전능성을 의미한다.
반면, primed pluripotency은 '제한된' 전능성을 의미하는데 배아줄기세포와 달리 기형종은 형성하되, 키메라 산자를 생산할 수 있는 능력이 극히 제한된 상태의 전능성을 말한다. 가장 대표적인 primed pluripotency를 가진 줄기세포의 유형으로 외배엽줄기세포(epiblast stem cells, EpiSCs)가 있다.
배아줄기세포(embryonic stem cells, ESCs) 및 외배엽줄기세포(epiblast stem cells, EpiSCs) 이외에 잘 알려진 전능성 줄기세포로서, 배아암세포(embryonic carcinoma cells, ECCs)가 있는데 대표적으로 P19과 F9, 두 종류가 있다. P19 ECCs는 외배엽줄기세포와 유사하고, F9 ECCs는 배아줄기세포와 유사한 특성을 보이는 것으로 알려져 있다.
줄기세포의 전능성 등을 구별하기 위해 키메라(chimera) 산자 형성 여부를 이용하여 줄기세포의 전능성 및 역분화능(reprogramming potential)을 구별하였던 방법이 있었고, 관련 선행기술로 한국등록특허 제10-1297829호(지방유래줄기세포 분화능력 탐지 마커 및 이의 이용) 등이 있으나, 본원발명과 같이 세포융합을 통해 제조된 하이브리드 줄기세포(hybrid stem cell)에서 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase, AP) 양성 반응성 콜로니의 양을 측정하거나 Oct4 유전자의 발현량을 측정함으로써 임의의 줄기세포가 naive pluripotency 또는 primed pluripotency 가운데 어떠한 전능성 유형에 해당하는지 또는 어느 수준의 역분화능을 지니는지 측정하는 방법을 개시하고 있는 선행문헌은 없다.
본 발명자는 줄기세포의 역분화능을 측정함에 있어서 세포융합(cell fusion protocol)을 통해 제조된 하이브리드 줄기세포(hybrid stem cell)의 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase, AP) 양성 반응성 콜로니의 양을 측정하거나 Oct4 유전자의 발현량을 측정함으로써, 종래 키메라(chimera) 산자의 형성 여부를 이용하여 전능성 및 역분화능을 확인하였던 방법과 비교하여 경제적이고 간단한 방법으로 줄기세포의 역분화능을 확인할 수 있음을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 목적은 신경줄기세포와 배아줄기세포(ESCs)를 융합시킨 하이브리드 세포와 ROCK-억제제의 존재하에 신경줄기세포와 전능성 줄기세포를 융합시킨 하이브리드 줄기세포에서 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase, AP) 양성 반응성 콜로니의 양을 측정하거나 Oct4 유전자의 발현량을 측정하는 방법을 제공함으로써 결론적으로 임의의 줄기세포의 역분화능을 측정할 수 있는 방법을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 신경줄기세포와 배아줄기세포를 융합시켜 하이브리드 세포를 제조하는 단계;와 (2) ROCK-억제제의 존재하에 신경줄기세포와 전능성 줄기세포를 융합시켜 하이브리드 세포를 제조하는 단계;와 (3) 상기 (1) 및 (2)단계에 의해 제조된 하이브리드 세포를 배양하는 단계; 및 (4) 상기 (3)단계에 의한 배양 후 상기 (1) 및 (2)단계에 의해 제조된 하이브리드 세포에서 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase, AP) 양성 반응성 콜로니의 양을 측정하는 단계;를 포함하는 세포융합을 통한 줄기세포의 역분화능 측정 방법을 제공한다.
상기 (2)단계에서 전능성 줄기세포는 외배엽줄기세포인 것을 특징으로 한다.
상기 (2)단계에서 ROCK-억제제는 Y27632인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 (1) 신경줄기세포와 배아줄기세포를 융합시켜 하이브리드 세포를 제조하는 단계;와 (2) ROCK-억제제의 존재하에 신경줄기세포와 전능성 줄기세포를 융합시켜 하이브리드 세포를 제조하는 단계;와 (3) 상기 (1) 및 (2)단계에 의해 제조된 하이브리드 세포를 배양하는 단계; 및 (4) 상기 (3)단계에 의한 배양 후 상기 (1) 및 (2)단계에 의해 제조된 하이브리드 세포에서 Oct4 유전자의 발현량을 측정하는 단계;를 포함하는 세포융합을 통한 줄기세포의 역분화능 측정 방법을 제공한다.
상기 (2)단계에서 전능성 줄기세포는 외배엽줄기세포인 것을 특징으로 한다.
상기 (2)단계에서 ROCK-억제제는 Y27632인 것을 특징으로 한다.
상기 (4)단계에서 Oct4의 발현에 따라 발광하는 GFP를 이용하여 Oct4 유전자의 발현량을 측정하는 것을 특징으로 한다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 하이브리드 줄기세포(hybrid stem cell)에서 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase, AP) 양성 반응성 콜로니의 양을 측정하거나 Oct4 유전자의 발현량을 측정함으로써 임의의 줄기세포의 역분화능을 측정할 수 있는 방법을 제공함으로써, 종래 키메라(chimera) 산자 형성 여부 이용하여 줄기세포의 전능성 및 역분화능(reprogramming potential)을 구별하였던 방법과 비교하여 경제적이고 간단한 방법으로 navie pluripotency 또는 primed pluripotency 가운데 어떠한 전능성 유형에 해당되는지 또는 어느 수준의 역분화능을 가지고 있는지 측정할 수 있는 효과가 있다.
도 1 은 외배엽줄기세포(epiblast stem cells, EpiSCs)의 낮은 역분화능(reprogramming potential)을 나타냄. (A) EpiSCs와 배아줄기세포(embryonic stem cells, ESCs)의 역분화능을 융합 하이브리드 줄기세포(hybrid stem cell)의 콜로니 형성 비율 비교를 통해 분석함. Y-27632는 ROCK 억제제이며, 데이터는 3번의 실험을 통한 전체 콜로니수를 의미함. (B) 및 (C) 트립신 처리로 완전히 분리된 EpiSCs는 ROCK 억제제 존재 유무 모두에서 배양되어 생존율을 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase, AP) 양성 반응성 콜로니를 계산하여 측정함.
도 2 는 (A) 역분화된 체세포 게놈의 Oct4-GFP(green fluorescent protein) 이식유전자 활성 시간을 통해 F9 및 P19 배아암세포의 역분화능을 관찰한 결과, (B) bisulfite sequencing 방법에 의해 P19 하이브리드에서 Oct4 조절 부위(프로모터와 근위의 인핸서)의 DNA 메틸화 상태 분석 결과(오픈 및 채워진 원형은 각각 비메틸화 및 메틸화된 CpGs를 나타냄), (C) Xist/Tsix RNA FISH에 의해 X 염색체 상태를 관찰한 결과(DNA는 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; blue)로 대비염색되었으며, Xist/Tsix RNA는 불활성 X 염색체(Xi)에서 큰 시그널로, 활성 X 염색체(Xㅳ; pluripotent cell type)에서 핀포인트 시그널로, 활성 X 염색체(Xa; somatic cell type)에서 노 시그널로 탐지됨).
도 3 은 Sox2 유전자 발현 수준에 따른 P19 하이브리드 세포의 변화.
도 4 는 (A) Sox2 유전자 과발현 이후, Sox2 단백질 수준을 웨스턴 블롯으로 측정한 결과(BETA-ACTIN은 로딩 대조군임), (B) Sox2 유전자를 과발현하는 P19 융합 하이브리드 세포를 형광 현미경 하에서 Oct4-GFP 활성 시간을 모니터한 결과, (C) AP 염색법에 의한 콜로니 형성 비율, (D) FACS에 의한 역분화 비율, (E) 융합 15일째 bisulfite sequencing 방법에 의해 P19-Sox2 하이브리드에서 Oct4 조절 부위(프로모터와 근위의 인핸서)의 역분화 패턴 분석 결과(오픈 및 채워진 원형은 각각 비메틸화 및 메틸화된 CpGs를 나타냄), (F) 융합 15, 20, 30일째 Xist/Tsix RNA FISH에 의해 P19-Sox2 하이브리드에서 X 염색체 상태를 관찰한 결과(DNA는 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; blue)로 대비염색되었으며, 각각의 패널은 X 염색체 상태가 체세포 유형(큰 시그널)과 일치하는 역분화되지 않은 세포의 퍼센트를 나타내고 삽입된 작은 사진은 X 염색체 상태가 전능 세포 유형(세 개의 핀포인트 시그널)과 일치하는 역분화된 세포의 퍼센트를 나타냄).
도 5 외배엽 근원이 아닌 세포의 역분화능에 Sox2 유전자가 미치는 영향을 나타냄. (A) Sox2 유전자를 과발현하는 F9 ECCs는 라운드 형태로 더욱 응축된 콜로니를 보이고 다른 형태학적 모습을 나타냄, (B) 네오마이신 선별 일주일 후 AP 염색법에 의한 콜로니 형성 비율로서 데이터는 3번 실험을 통해 계산된 전체 콜로니 수를 나타냄, (C) F9 하이브리드 세포와 F9-Sox2 하이브리드 세포의 형태학적 비교를 나타냄, (D) FACS를 이용하여 Oct4-GFP 양성 세포수 계산을 통한 F9 및 F9-Sox2 하이브리드의 역분화능을 나타냄.
도 6 은 (A) Sox2 유전자를 과발현하는 EpiSCs(Epi-Sox2)의 OCT4, Nanog 및 Sox2 단백질 수준을 웨스턴 블롯으로 관찰한 결과, (B) 증가된 콜로니 형성 비율을 갖는 Epi-Sox2로서 데이터는 3번의 실험에서 얻은 전체 콜로니 수를 나타냄, (C) Epi-Sox2 하이브리드에서 신경줄기세포 마커의 발현 정도를 RT-PCR로 측정한 결과, (D) 대조군과 Epi-Sox2 하이브리드에서 Oct4 및 Nanog 프로모터 부위의 DNA 메틸화 상태를 bisulfite sequencing으로 비교한 결과, 융합 7일째 (E)는 XX, (F)는 XY EpiSC 하이브리드 및 Epi-Sox2 하이브리드에서의 Xist/Tsix RNA FISH에 의한 X 염색체 상태를 관찰한 결과.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실험예 1. 세포배양 및 융합
P19, F9 및 293T(ATCC)를 젤라틴-코팅된 플레이트에서 배양하고, 15% 우태아혈청(fetal calf serum), 1X 페니실린/스토렙토마이신/글루타민 및 1X 비필수아미노산이 함유된 고글루코즈 DMEM을 표준 배양 배지로 이용하였다. 배아줄기세포(ESCs)는 LIF가 혼합된 표준 배양 배지에서 배양되었다. 신경줄기세포주(NSC)는 16.5-dpc OG2/ROSA26 암컷 마우스의 뇌 조직에서 유도되었고, 20 ng/ml 표피생장인자(EGF), 20 ng/ml bFGF, B27 보충물, 8 mM HEPES 및 1X 페니실린/스트렙토마이신/글루타민이 함유된 DMEM-F12 배지에서 배양되었다. Feeder-free 외배엽줄기세포(EpiSCs)는 조정배지에서 배양되었다. 조사된 CF-1 마우스 배아 섬유아세포(MEFs)를 5×104 cells/cm2의 밀도로 분주하여 20 % 세럼 대체물, 1X 페니실린/스트렙토마이신/글루타민, 1X 비필수아미노산, 1X β-메캅토에탄올 및 5 ng/ml bFGF가 함유된 녹아웃 DMEM 배지에서 24 시간 동안 배양하였고, 조정배지는 여과하여 5 ng/ml bFGF를 첨가하였다. Feeder-free 외배엽줄기세포(EpiSCs)의 계대배양을 위해 콜로니를 콜라겐나아제Ⅳ와 함께 5분간 37℃에서 배양한 후 세포 스크레이퍼로 분말화하였다. 세포괴(cell clumps)는 FCS-코팅된 플레이트에 다시 플레이트하여 24 시간 마다 배지를 교환하였다.
전능 세포와 신경줄기세포(NSCs)를 융합하였다. 전능 세포를 NSCs와 1:1로 혼합하여 PBS로 세척하고 130g으로 5분간 원심분리한 다음, 예열된 50% 폴리에틸렌 글리콜 1500 수용액(PEG1500) 1 ml를 세포 펠릿에 첨가하였다. DMEM 20 ml를 세포 현탁액에 첨가하고 세포를 130g으로 5분간 원심분리하여 PEG를 제거하고 DMEM으로 세척한 후, ECC, ESC 및 EpiSC 배지에서 각각 배양하였다. 융합 하이브리드 세포는 post-fusion 24 시간 후 300 ㎍/ml 네오마이신을 처리하여 선별하고, 콜로니 형성 비율은 post-fusion 1 주일 후 알칼린 포스페이트(AP)로 염색된 콜로니 수로 계산되었다.
실험예 2. 웨스턴 블롯 및 면역세포화학
웨스턴 블롯은 anti-Nanog (Cosmo Bio, REC-RCAB0002PF, 1:500), anti-Oct4 (Abcam, ab19857, 1:400) 및 anti-Sox2 (Abcam, ab15830, 1:3000) 1차 항체를 이용하여 수행되었고, Anti-Sox2 (Chemicon, 2003600, 1:1000) 및 anti-Oct4 (Abcam, ab19857, 1:500) 항체는 면역세포화학에 이용되었다.
실험예 3. Xist/Tsix 형광동소혼성화(FISH, fluorescence in situ hybridization)
융합 하이브리드 세포는 Roboz 슬라이드에 올려 PBS 상 4% 파라포름알데하이드로 10분간 상온에서 고정시킨 후 70% 에탄올로 세척하여 FISH에 이용될 때까지 4℃에서 70% 에탄올로 보관하였으며, Xist/Tsix RNA는 Xist RNA FISH 프로브로 검출하였다.
실험예 4. DNA 메틸화 분석
Oct4와 Nanog 조절인자의 DNA 메틸화 상태를 측정하기 위해, EpiTect Bisulfite Kit (Qiagen)를 이용하여 지노믹 DNA를 아황산수소나트륨으로 처리하여 모든 메틸화되지 않은 시토신 잔기를 우라실로 전환시켰다. 이후, SuperTaq 폴리머라아제를 이용하여 94℃에서 30초간 변성, 타겟 부위에 따른 적당한 온도로 30초간 어닐링, 94℃에서 5분간 1차 변성을 갖는 72℃에서 30초간 확장, 72℃에서 10분간 마지막 확장 과정을 40 cycles 반복하여 PCR 증폭하였다.
프라이머 서열과 어닐링 온도는 아래와 같다.
endogenous Oct4 첫 번째 센스 :
5'-TTTGTTTTTTTATTTATTTAGGGGG-3'
endogenous Oct4 첫 번째 안티센스 :
5'-ATCCCCAATACCTCTAAACCTAATC-3'(299 bp, 45℃)
endogenous Oct4 두 번째 센스 :
5'-GGGTTAGAGGTTAAGGTTAGAGGG-3'
endogenous Oct4 두 번째 안티센스 :
5'-CCCCCACCTAATAAAAATAAAAAAA-3'(161 bp, 55℃)
Nanog 첫 번째 센스 :
5'-TTTGTAGGTGGGATTAATTGTGAA-3'
Nanog 첫 번째 안티센스 :
5'-AAAAAATTTTAAACAACAACCAAAAA-3'(312 bp, 45℃)
Nanog 두 번째 센스 :
5'-TTTGTAGGTGGGATTAATTGTGAA-3'
Nanog 두 번째 안티센스 :
5'-AAAAAAACAAAACACCAACCAAAT-3'(188 bp, 55℃)
증폭된 산물은 1% 아가로즈 겔로 전기영동하여 분석하고, PCR 산물을 PCR 2.1-TOPO 벡터를 이용하여 서브클론(subclone)시켰다. 재구축된 플라스미드는 QIAprep Spin Miniprep kit (Qiagen)를 이용하여 정제하고 개별 클론을 시퀀스(GATC-biotech, Germany)하였다.
실험예 5. 렌티바이러스 벡터를 이용한 벡터 제조 및 형질도입
GFP(green fluorescent protein)를 Sox2로 대체하여 pLVTHM-Sox2를 제조하였다. 재조합 렌티바이러스는 리포펙타민 2000(Invitrogen)을 이용하여 pLVTHM 12 ㎍, psPax2 8.5 ㎍ 및 pMD2.G 3 ㎍으로 293T 세포를 형질주입시켜 제조하였다. 형질주입 후 24 시간 및 48 시간에 상층액을 모아 26,000 rpm으로 2 시간 동안 4℃에서 원심분리하고, 상층액이 제거된 바이러스 펠릿을 DMEM 200 ㎕에 재부유시켜 ―80℃에서 보관하였다.
EpiSCs, P19 ECC 및 F9 ECC 세포를 5×104 cells/well의 밀도로 24-well 플레이트에 분주하고 24 시간 후, 농축된 바이러스 20 ㎕를 배지에 첨가하여 16 시간 동안 배양한 뒤 세포를 세척하였다. 48 시간 후, 바이러스 형질도입을 증가시키기 위해 상기 과정을 한번 더 반복하였다.
실험예 6. 유세포 분석기
FACS 분류를 위해, 세포를 0.25% 트립신 EDTA로 분리하고, 10% FCS가 함유된 DMEM으로 중화하고, PBS로 세척한 뒤, 40-㎛ 나일론 메시로 여과하여 큰 세포 클러스터를 제거하였다. 세포를 5×106 cells/ml로 재부유시켜 FACSAria cell sorter (BD Biosciences)로 분석하고, GFP 양성세포를 100-㎛ 노즐을 이용하여 FACS에 의해 분리하였다.
실험결과.
(1) 배아줄기세포와 달리 외배엽줄기세포의 역분화능에 대한 연구는 부족하다. 도 1.은 신경줄기세포를 배아줄기세포 또는 외배엽줄기세포와 융합하여 얻은 하이브리드 줄기세포의 역분화능 비교 및 소분자화합물 ROCK-억제제(Y-27632)의 효과를 나타낸다. ROCK-억제제는 세포자살을 저해하여 인간 배아줄기세포를 단일 세포로 성장하게 한다. 네오마이신 저항성을 가진 신경줄기세포를 배아줄기세포와 융합시켜 얻은 하이브리드 줄기세포와 ROCK-억제제(Y27632) 존재 하에 신경줄기세포를 외배엽줄기세포와 융합시켜 생성된 하이브리드 줄기세포의 역분화능을 칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase, AP) 양성 반응성 콜로니 숫자로 비교 및 대조하였다.
그 결과, 외배엽줄기세포와 융합시킨 하이브리드 세포는 배아줄기세포와 융합시킨 하이브리드 줄기세포보다 AP 양성 반응성 콜로니의 수가 적었다(도 1A). 이는 외배엽줄기세포가 전능성을 가진 줄기세포임에도 불구하고 배아줄기세포보다 낮은 수준의 제한된 전능성을 가지고 있음을 의미한다. 또한, ROCK-억제제 존재 하에 외배엽줄기세포의 생존율이 단일 세포 단위로 분해한 후 배양했음에도 불구하고 3.6배 향상(외배엽줄기세포는 ROCK 억제제 부재시 단일 세포 단위로 분해하였을 때 생존이 불가능함)되었고(도 1B), 신경줄기세포를 외배엽줄기세포와 융합하였을 경우, AP 양성 반응성 콜로니의 수가 ROCK 억제제를 처리하지 않았을 때보다 더 많이 관찰(도 1C)되었다. 따라서, ROCK-억제제에 의해 세포 융합 후 외배엽줄기세포의 융합 효율이 증진되었음을 알 수 있었다.
(2) 도 2.는 외배엽줄기세포와 유사한 '제한된 전능성'을 보이는 P19 ECCs의 역분화능을 나타낸다. 배아줄기세포와 유사한 배아암세포(ECCs)인 F9 ECCs와, 외배엽줄기세포와 유사한 배아암세포(ECCs)인 P19 ECCs를 이전의 실험과 같이 신경줄기세포와 융합시켜 생성된 하이브리드 줄기세포의 역분화능을 전능성 줄기세포에 특이적으로 발현하는 Oct4의 발현에 따라 발광하는 GFP 형광 발현시기 및 정도를 통해 비교 및 대조하였다.
그 결과, F9 ECCs와 융합한 F9 하이브리드 줄기세포의 경우, Oct4-GFP가 48 시간 이내 발광한 반면, P19 ECCs와 융합한 P19 하이브리드 줄기세포의 경우, 최소 7일에서 9일 사이에 Oct4-GFP 형광을 발색하였다(도 2A). 또한, Oct4 유전자의 프로모터(promoter) 및 인핸서(enhancer)의 메틸화 여부를 관찰한 결과, P19 ECCs와 융합한 경우, 융합 후 30일 정도가 경과하여도 탈메틸화 현상이 완전히 이루어지지 않은 것으로 나타났다(도 2B). 탈메틸화된 경우, Oct4 유전자가 발현이 작동하고 메틸화된 경우, 유전자 발현이 제한적이다. 한편, Female(XX)의 신경줄기세포를 F9 또는 P19 male(XY)의 배아암세포와 융합하였을 경우, X 염색체의 재활성화가 F9와 융합하였을 경우 7일 이내로 진행되었으나, P19와 융합하였을 경우 한 달 이상이 지난 시점에서도 완벽하게 재활성화가 이뤄지지 못한 것으로 나타났다(도 2C). X 염색체의 재활성화 여부에 따라 역분화능 정도를 판단할 수 있다.
따라서, 외배엽줄기세포 또는 외배엽줄기세포와 유사한 전능성을 보이는 P19 배아암세포의 역분화능이 서로 매우 유사하고, 배아줄기세포 또는 F9 배아암세포와 비교하였을 때 제한된 전능성을 나타내는 것을 알 수 있었다.
(3) 도 3.은 Sox2 유전자 발현 수준에 따른 P19 하이브리드 줄기세포의 변화를 나타낸다. 배아줄기세포, F9 ECCs 및 P19 ECCs의 전능성 유지에 필수적인 유전자 발현 수준을 qPCR과 웨스턴 블롯을 통해 비교한 결과, P19 ECCs의 Nanog, Sox2의 발현 수준이 배아줄기세포와 F9 ECCs보다 낮게 나타났다(도 3A 및 4A). 낮은 수준의 Sox2 발현 수준을 높이기 위해 P19 ECCs에 Sox2 유전자를 과발현시킨 후, 신경줄기세포와 세포를 융합시킨 하이브리드 줄기세포를 배양한 결과, Sox2 유전자가 과발현되었을 경우 하이브리드 줄기세포의 형태가 배아줄기세포처럼 콜로니 형태로 성장하는 것을 확인하였다(도 3C). 이는 P19 ECCs는 제한된 전능성을 갖고 Sox2 과발현시 P19 ECCs의 역분화능이 향상될 수 있음을 나타낸다.
(4) 도 4.는 Sox2 과발현에 따른 역분화능 향상 결과를 나타낸다. Sox2 유전자를 과발현시킨 P19 ECCs와 신경줄기세포를 융합한 후, 1주일 동안 네오마이신 처리를 통해 Sox2 과발현된 P19 하이브리드 줄기세포를 다양한 각도를 통해 분석하였다.
그 결과, Oct4-GFP의 발현 시기가 F9 하이브리드 줄기세포와 유사한 시기에 발현되었고, AP 양성 반응 콜로니의 수도 증가하였으며, Oct4-GFP 양성을 보이는 역분화된 상태의 세포수가 약 20배 정도 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 4B 내지 D). 또한, Oct4 유전자의 프로모터와 인핸서 지역의 탈메틸화가 완벽하게 이루어졌고, 98.4% 이상의 X 염색체 재활성화가 융합 후 20일 이내 진행된 것을 확인할 수 있었다(도 4E 및 F).
상기 결과는 Sox2 유전자를 과발현시킴으로써 제한된 전능성 또는 역분화능을 보이는 P19 ECCs를 ESCs 또는 F9 ECCs와 유사한 전능성 상태로 향상시킬 수 있음을 의미하고, Sox2 유전자가 줄기세포의 전능성 및 역분화능을 향상시킬 수 있는 결정적인 인자로 작용할 수 있음을 나타낸다.
(5) 도 5는 Sox2 유전자 과발현에 따른 F9 하이브리드 세포의 역분화능 향상 효과를 나타낸다. Sox2 유전자 과발현에 따른 역분화능 향상 메커니즘이 다른 유형의 줄기세포에서도 적용되는지 확인하기 위해 F9 ECCs에 Sox2 유전자를 과발현시켰다.
그 결과, 배아줄기세포와 더욱 흡사한 형태학적, 분자학적 특성을 갖는 상태로 전환되는 것을 알 수 있었다. 더욱 구체적으로, 모양이 응축된 형태로 바뀌고, AP 양성 반응성 콜로니의 색이 진하게 나타났으며, Oct4-GFP 발현이 집중적으로 강하게 나타났다. 또한, Sox2 유전자를 과발현시킨 F9 ECCs를 신경줄기세포와 융합하였을 경우, 일반 F9 ECCs보다 약 12배 이상의 효율로 역분화된 것을 확인할 수 있었다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

Claims (7)

  1. (1) 신경줄기세포와 배아줄기세포를 융합시켜 하이브리드 세포를 제조하는 단계;
    (2) ROCK-억제제의 존재하에 신경줄기세포와 전능성 줄기세포를 융합시켜 하이브리드 세포를 제조하는 단계;
    (3) 상기 (1) 및 (2)단계에 의해 제조된 하이브리드 세포를 배양하는 단계; 및
    (4) 상기 (3)단계에 의한 배양 후 상기 (1) 및 (2)단계에 의해 제조된 하이브리드 세포에서 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase, AP) 양성 반응성 콜로니의 양을 측정하는 단계;를 포함하는 세포융합을 통한 줄기세포의 역분화능 측정 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 (2)단계에서 전능성 줄기세포는 외배엽줄기세포인 것을 특징으로 하는 세포융합을 통한 줄기세포의 역분화능 측정 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 (2)단계에서 ROCK-억제제는 Y27632인 것을 특징으로 하는 세포융합을 통한 줄기세포의 역분화능 측정 방법.
  4. (1) 신경줄기세포와 배아줄기세포(ESCs)를 융합시켜 하이브리드 세포를 제조하는 단계;
    (2) ROCK-억제제의 존재하에 신경줄기세포와 전능성 줄기세포를 융합시켜 하이브리드 세포를 제조하는 단계;
    (3) 상기 (1) 및 (2)단계에 의해 제조된 하이브리드 세포를 배양하는 단계; 및
    (4) 상기 (3)단계에 의한 배양 후 상기 (1) 및 (2)단계에 의해 제조된 하이브리드 세포에서 Oct4 유전자의 발현량을 측정하는 단계;를 포함하는 세포융합을 통한 줄기세포의 역분화능 측정 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 (2)단계에서 전능성 줄기세포는 외배엽줄기세포인 것을 특징으로 하는 세포융합을 통한 줄기세포의 역분화능 측정 방법.
  6. 제 4 항에 있어서,
    상기 (2)단계에서 ROCK-억제제는 Y27632인 것을 특징으로 하는 세포융합을 통한 줄기세포의 역분화능 측정 방법.
  7. 제 4 항에 있어서,
    상기 (4)단계에서 Oct4의 발현에 따라 발광하는 GFP를 이용하여 Oct4 유전자의 발현량을 측정하는 것을 특징으로 하는 세포융합을 통한 줄기세포의 역분화능 측정 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US20110136145A1 (en) * 2008-05-22 2011-06-09 The Johns Hopkins University Methods for promoting fusion and reprogramming of somatic cells
WO2012087965A2 (en) * 2010-12-22 2012-06-28 Fate Therapauetics, Inc. Cell culture platform for single cell sorting and enhanced reprogramming of ipscs

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