KR20150044492A - 화학적 동위원소 치환법을 이용한 혈액 내 뇌성 나트륨 이뇨 펩타이드 질량분석법 - Google Patents

화학적 동위원소 치환법을 이용한 혈액 내 뇌성 나트륨 이뇨 펩타이드 질량분석법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 심혈관 관련 질환에 대한 진단 및 예후 평가를 위해 널리 사용되는 바이오마커인 뇌성 나트륨이뇨 펩타이드에 대한 화학적 동위원소 표지법을 이용한 동위원소-희석 질량분석법 기반 정량분석 방법에 관한 것으로, 상기 화학적 동위원소 표지기술을 이용한 혈액 내 뇌성 나트륨이뇨 펩타이드의 정량분석 방법은 기존의 항체를 이용한 면역분석법에 비해 보다 정확한 뇌성 나트륨이뇨 펩타이드 특이적 정량분석 기술이다.

Description

화학적 동위원소 치환법을 이용한 혈액 내 뇌성 나트륨 이뇨 펩타이드 질량분석법{Mass spectrometry for quantitative determination of serum brain natriuretic peptide by chemical isotope replacement}
본 발명은 화학적 동위원소 치환법을 이용한 심혈관질환 진단 바이오마커인 뇌성 나트륨이뇨 펩타이드 특이적 질량분석법에 관한 것이며, 상기 질량분석법을 통해 얻은 실험결과를 통해 심혈관질환 여부를 판단하고 그 예후를 평가하는 방법에 관한 것이다.
최근 국내·외적으로 텐덤 질량분석장치(tandem mass spectrometry, MS/MS)와 융합된 분석기술의 발전에 기인하여, 세포 내 존재하는 다양한 단백질에 대한 특성 연구 및 정성·정량적 분석이 가능한 프로테오믹스(proteomics) 분야의 연구가 활발히 이루어지고 있다. 특히 인간의 삶의 질 향상과 연관된 질환들에 대한 원인을 단백질 수준에서 규명하는 데에 목적을 두고 있다. 특히 세포, 조직, 혈청 등의 생체 시료에 대한 단백질 특이적 안정 동위원소 표지 기술(stable isotope-labeling method)의 개발을 통하여 정상인과 환자 간 단백질 시료의 정량적 비교가 가능하게 되었으며, 이는 다양한 질환 조기 진단용 바이오마커의 발굴 및 임상진단 분야에 기여하였다. 그러나, 상기 안정 동위원소 표지 기술을 이용한 단백질의 정량분석을 위해서는 SILAC(stable isotope labeling with amino acids in cell culture), MeCAT(metal-coded affinity tags), TMT(tandem mass tags) 등과 같은 세포 관련 숙련자 또는 고가의 동위원소가 치환된 아미노산과 복잡한 전처리 기술이 필요하다는 문제점이 있다.
상기 문제점으로 인해 대부분의 임상 진단 평가에는 단백질 마커 특이적 항체를 이용한 면역분석법(immunoassay)이 가장 널리 사용되고 있다. 특히 심혈관 관련 질환에 대한 진단 및 예후 평가를 위해 뇌성 나트륨이뇨 펩타이드(brain natriuretic peptide, BNP) 단백질 마커의 정량적 추이 변화를 면역분석법을 통해 진단하고 있으나, 면역분석법의 항원-항체 비특이적 반응 및 형광 표지(fluorescein labeling) 기술의 낮은 재현성으로 인해 뇌성 나트륨이뇨 펩타이드의 정량적 측정 불확실성이 크다는 단점을 가지고 있으며, 가격이 비싼 효소의 활용과 오랜 반응 시간 소요 등의 문제로 인해 효과적으로 상기 진단 및 예후 평가를 수행하기에는 비효율적인 점이 많아 다른 대안이 필요한 실정이다.
따라서, 상기 심혈관 질환에 대한 조기 진단 및 검증을 위해 보다 정확하고 용이한 시료 전처리 기술 및 정량 분석법개발이 필요한 점을 인식하여, 화학적 동위원소 치환법을 이용한 혈액 내 뇌성 나트륨 이뇨 펩타이드 질량분석법을 개발하게 되어 본 발명을 완성하였다.
본 발명에서는 상기 면역분석법의 항원-항체 비특이적 반응 및 형광 표지(fluorescein labeling) 기술의 낮은 재현성과 동위원소 표지 기술의 복잡한 시료 전처리 과정을 동시에 극복할 수 있는 iCCM(isotope-coded carbamidomethylation) 동위원소 표지 및 이를 이용한 질량분석기 기반 뇌성 나트륨이뇨 펩타이드 특이적 정량분석법을 제공하고자 한다.
본 발명은 a) 뇌성 나트륨이뇨 펩타이드, 트로포닌 I 또는 트로포닌 T 단백질에 단백질 환원제를 첨가하여 반응시키는 단계; b) a)단계의 단백질 혼합물을 각각 요오드아세트아미드(IAA)와 요오드아세트아미드의 동위원소와 반응시키는 단계; 및 c) b)단계에서 얻은 두 종류의 단백질에 대하여 질량분석기를 이용한 질량 스펙트럼을 얻는 단계; 를 포함하는 질량분석법에 관한 것이다.
트로포닌 I는 일반 골격근에서는 발견이 되지 않고, 성인의 심근에만 존재하므로 심근 손상 이외에 크레아틴 키나아제 동질효소(CK-MB)가 증가되어 있을 상황에서는 혈중에서 검출되지 않아 심근 손상에 매우 특이하며, 심근 경색 크기와도 연관성을 나타낸다. 또한 급성심혈관질환시에 그 발현량이 급격히 증가하는 것으로 알려져 있어서, 이러한 단백질의 검출은 급성심혈관질환의 초기 진단에 매우 중요하다. 한편, 트로포닌 T는 심근 손상이 있을 때 지속적으로 혈중으로 유리되어 그 농도가 증가된다. 심장질환 후 24 시간 이내에 최고값을 보이고, 9일 이상 계속하여 최고값 이상으로 존재하기 때문에 크레아틴 키나아제, 크레아틴 키나아제 동질효소보다 진단 시간대가 넓어 높은 예민도 및 특이도를 가지므로 심근 경색증의 초기 및 이후 진단에 유용하고 경색 크기의 추정에도 유리하다.
상기 a)단계에서 단백질 환원제는 제한되지는 않지만, 예를 들면 디티오트레이톨, 디티오에리트리톨, 트리스 2-카르복시에틸 포스핀 또는 트리부틸 포스핀을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 디티오트레이톨을 사용할 수 있다. 상기 b)단계에서 반응은 시스테인-시스테인 재결합을 막기 위하여 시스테인의 티올기의 반응성을 비가역적 형태로 변경하는 역할을 한다. 상기 효소처리 과정에서 단백질에 대한 효소 처리 향상을 위해, 우선 단백질의 시스테인-시스테인(cystein-cystein) 결합에 의해 형성된 이황결합(disulfide bond)을 디티오트레이톨(DTT)와 같은 환원제를 이용하여 단백질 변성(denaturation)시킨 후, 시스테인-시스테인 재결합(refolding)을 막기 위해 시스테인의 티올기(thiol group, -SH)에 대하여 알킬화제(alkylating agent)인 요오드아세트아미드를 첨가하여 시스테인의 티올기 반응성을 비가역적 형태로 변경한다. 상기 요오드아세트아미드에 의한 화학적 수식(chemical modification)을 통해 최종적으로 단백질 시료에 대한 효소 처리 효율 향상 및 재현성을 확보할 수 있다. 상기 요오드아세트아미드에 의한 시스테인 특이적 CM(carbamidomethylation) 과정을 통해 시스테인 기에 57.05 Da의 증가가 발생하게 되며, 본 발명은 상기 CM 기반 화학적 수식 방법을 이용한 BNP 정량분석용 동위원소 표지 방법을 특징으로 한다.
상기 b)단계에서 요오드아세트아미드의 동위원소는 제한되지는 않지만, 요오드아세트아미드-13C2, D2를 사용할 수 있다. BNP 정량분석용 동위원소 표지를 위하여, 요오드아세트아미드와 그 동위원소인 요오드아세트아미드-13C2, D2를 97% 이상의 순도를 가진 두 개의 표준 BNP 단백질 용액에 각각 반응시킴으로써, 두 개의 시스테인기를 가지고 있는 BNP는 두 곳의 CM 반응에 의해 분자량이 증가하며, 최종적으로는 요오드아세트아미드와 그 동위원소인 요오드아세트아미드-13C2, D2에 의해 생성된 BNP-CM2과 BNP-iCCM2의 분자량은 각각 3578.12, 3586.12 Da을 갖게 되어, 두 BNP 단백질 시료 간 8 Da의 분자량 차이가 발생할 수 있다. 따라서, 상기 요오드아세트아미드와 요오드아세트아미드의 동위원소는 바람직하게는 3 내지 5 Da의 분자량 차이를 가질 수 있다.
상기 c)단계의 질량분석기는 제한되지는 않지만, 예를 들면 액체크로마토그래피-전기분무 이온화-텐덤 질량분석법(LC-ESI-MS/MS)을 사용할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 c) 단계에 추가로 d) 상기 c)단계에서 얻은 질량 스펙트럼으로부터 상기 단백질 및 단백질 동위원소가 심혈관질환 진단 또는 예후 평가를 위한 물질로의 적합성을 판단하는 단계를 포함하는 심혈관질환 진단 및 예후 평가 방법에 관한 것이다.
본 발명의 뇌성 나트륨이뇨 펩타이드 정량분석법을 통해 고가의 동위원소 치환 펩타이드 또는 복잡한 단백질 동위원소 표지 전처리 방법에 의한 정량분석에서 야기되는 시간 및 경제적 손실을 최소화할 수 있으며, 정량 측정 불확실성 감소와 단백질 동위원소 표지 전처리 과정에서 야기되는 부반응을 줄일 수 있는 효과가 있다. 본 발명의 iCCM을 이용한 뇌성 나트륨이뇨 펩타이드 동위원소-표지 기반 정량분석법은 저렴한 요오드아세트아미드와 요오드아세트아미드-13C2, D2를 이용함으로써, 뇌성 나트륨이뇨 펩타이드 단백질 정량분석을 위한 동위원소 표지 전처리 과정이 30분 이내에 이루어지며, 이는 상기 일반적 정량분석법에 비해 보다 정확한 심혈관 질환 진단에 큰 응용성이 있다 할 수 있다.
도 1은 IAA를 이용한 BNP 단백질의 CM 반응에 대한 개요 및 LC-ESI-FT orbitrap-MS 분석결과이며,
도 2는 CM 기반 IAA와 동위원소 IAA-13C2, D2를 이용한 BNP-CM2와 BNP-iCCM2에 대한 구조적 차이 및 질량분석을 통한 분자량 측정결과이며,
도 3은 BNP-CM2과 BNP-iCCM2의 혼합물에 대한 LC-ESI-FT orbritrap-MS 분석을 통해 검출된 BPC 및 질량 스펙트럼이며,
도 4는 400 pg BNP-iCCM2가 첨가된 혈청 시료에 대한 BPC 및 BNP-CM2과 BNP-iCCM2 특이적 질량 스펙트럼이며,
도 5는 400 pg BNP-iCCM2가 첨가된 혈청 시료에 대한 BNP-CM2과 BNP-iCCM2 특이적 XIC 분석 결과이다.
이하 본 발명을 실시예와 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명한다. 그러나 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위가 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
(실시예 1) 요오드아세트아미드(IAA)를 이용한 뇌성 나트륨이뇨 펩타이드(BNP) 특이적 카르바미드메틸화(CM) 및 질량분석기(MS) 스펙트럼
BNP(분자량: 3464.02 Da), DTT, IAA, 동위원소 IAA-13C2, D2는 Sigma-Aldrichㄾ에서 구매하였다. 표준 BNP 단백질에 대한 CM 반응성 및 표지의 효율 검증을 위해 BNP 단백질 1 mg을, 50 mM NH4CO3 1 mL 용액에 용해시킨 후, 1 mg DTT를 추가하여 37℃에서 2시간 동안 가볍게 흔들어주면서 반응시켰다. 상기 NH4CO3 용액에 40 mM IAA 용액을 20 μL 첨가하고 실온 암실에서 30분 동안 반응시켰다. 상기 IAA에 의한 시스테인 특이적 CM 과정을 통해 얻은 BNP-CM2 단백질에 대하여 FT orbitrap-MS를 이용한 질량 스펙트럼을 조사하여 도 1에 도식화하였다.
도 1은 상기 CM 전처리된 표준 BNP 단백질 1 ng을 C8(5 μm, 200 Å)이 충진된 모세관(75 μm 내부직경, 360 μm 외부직경)을 이용하여 분리한 후, FT orbitrap-MS를 이용하여 얻은 BPC(base peak chromatogram)와 19.2 분에 검출된 질량 스펙트럼을 나타낸다. BNP 단백질의 고유분자량인 3464.02 Da에서 두 개의 CM 반응에 의해 114.10 Da가 증가된 형태인 3578.12 Da의 BNP-CM2가 99% 이상 검출됨을 확인하였다. 특히, [M+4H+]4+, [M+5H+]5+, [M+6H+]6+ 및 [M+7H+]7+ 등의 다중 수소 이온(multiply hydride ion)을 확인할 수 있었다.
(실시예 2) IAA와 동위원소 IAA-13C2, D2를 이용한 BNP 특이적 CM 및 iCCM 동위원소-표지 효율 비교
BNP 단백질에 각각 IAA와 IAA-13C2, D2를 이용한 CM 반응을 통해, 서로 다른 분자량을 갖는 BNP-CM2와 BNP-iCCM2를 만들고 이를 질량분석기를 통해 분석하여 얻은 질량 스펙트럼을 도 2에 도시하였다.
IAA에 의해 생성된 BNP-CM2와 동위원소 IAA-13C2, D2에 의해 생성된 BNP-iCCM2를 중량비 1:1 로 혼합한 후, LC-ESI-FT orbitrap-MS 분석법을 통해 BPC를 측정하고 19분에 용리된 질량 스펙트럼을 확보하여 도 3에 도시하였다.
도 2에서와 같이 IAA에 의해 생성된 BNP-CM2(3578.12 Da)와 BNP-iCCM2(3586.12 Da)에 대한 전구체 이온(precursor ion) 중 [M+6H+]6+ 이온에 대하여 질량/전하량인 m/z값을 비교한 결과 각각 597.6393과 598.9790임을 확인할 수 있었으며, 두 단백질 간 차이가 약 1.333 Da (+6)이 나타남을 확인하였다. 이 결과를 토대로 두 단백질 간 분자량 차이가 8 Da이 나타남을 확인하였으며, 이는 CM 반응에 의한 결과와 동일한 효율임을 알 수 있었다. 특히 IAA-13C2, D2를 이용한 BNP-iCCM2의 질량 스펙트럼에서와 같이 IAA에 의해 나타나는 m/z 값이 597.6393을 갖는 BNP-CM2 생성물이 발견되지 않음은 BNP-iCCM2의 동위원소 표지 물질의 생성 효율이 100%에 가깝게 이루어졌음을 의미한다.
도 3에서와 같이, BNP-CM2와 BNP-iCCM2 단백질이 혼합된 상태에서 두 단백질 간 m/z의 차이가 1.333 Da를 나타내었다. 또한, 서로 다른 화학 반응에 의해 생성된 단백질의 혼합 전처리 과정에서도 두 단백질의 정량적 변화가 발견되지 않은 점은 혈청이나 뇨와 같은 다양한 형태의 매질 내에 존재하는 단백질 혼합물 시료에도 상호 부반응 없이 정량적 비교 연구에 응용 가능한 동위원소 표지 방법이라 할 수 있다.
(실시예 3) CM 기반 동위원소 표지법을 이용한 혈청 BNP 단백질 정량분석
상기 실시예 1 및 실시예 2의 BNP 특이적 동위원소 표지 전처리 방법을 토대로 실제 혈청 시료에 포함된 BNP 단백질을 정량하였다. 심혈관환자의 혈청 시료 500 μL를 IAA에 의해 CM 처리하고, 400 pg BNP-iCCM2를 혼합한 후 C18 SPE 카트리지를 사용하여 ACN:H2O가 10:90 (v/v) 비율로 혼합된 용액에 의해 용리된 시료를 LC-ESI-FT orbitrap-MS를 사용해 BPC와 질량스펙트럼을 확보하였다.
도 4에 다양한 형태의 단백질 및 펩타이드 혼합물이 검출되었음을 확인하였으며, 특히 24분에 검출된 질량분석 스펙트럼에서 m/z가 592 내지 606의 범위에서 BNP-CM2와 BNP-iCCM2에 의해 생성되는 m/z가 597.6393과 598.9790인 이온을 확인하였다.
도 5는 혈청에 존재하는 BNP-CM2에 의해 검출되는 m/z값이 597.6393 (+6), 716.9556 (+5)인 것과 혈청에 첨가된 400 pg BNP-iCCM2에 의해 나타나는 598.9790 (+6), 718.5556 (+5)인 이온들에 대한 단일 이온 관측(SIM) 모드(mode)를 통해 얻은 XIC(extracted ion chromatogram)이다. 도 5의 결과를 토대로 동위원소 표지된 BNP-iCCM2 단백질의 정량적 정보를 통하여 실제 혈청에 존재하는 BNP 단백질에 대한 정량적 평가가 가능한 질량분석법임을 확인하였다. 또한 최상위 정량분석법인 동위원소 희석 질량분석법(isotope-dilution mass spectrometry, ID-MS)에 큰 응용성을 가짐을 확인하였다.

Claims (7)

  1. a) 뇌성 나트륨이뇨 펩타이드, 트로포닌 I 또는 트로포닌 T 단백질에 단백질 환원제를 첨가하여 반응시키는 단계;
    b) a)단계의 단백질 혼합물을 각각 요오드아세트아미드와 요오드아세트아미드의 동위원소와 반응시키는 단계; 및
    c) b)단계에서 얻은 두 종류의 단백질에 대하여 질량분석기를 이용한 질량 스펙트럼을 얻는 단계;
    를 포함하는 질량분석법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 a)단계에서 단백질 환원제는 디티오트레이톨, 디티오에리트리톨, 트리스 2-카르복시에틸 포스핀 또는 트리부틸 포스핀인 질량분석법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 b)단계에서 반응은 시스테인-시스테인 재결합을 막기 위하여 시스테인의 티올기의 반응성을 비가역적 형태로 변경하는 질량분석법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 b)단계에서 요오드아세트아미드의 동위원소는 요오드아세트아미드-13C2, D2인 질량분석법.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 요오드아세트아미드와 요오드아세트아미드의 동위원소는 3 내지 5 Da의 분자량 차이를 가지는 질량분석법.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 c)단계의 질량분석기는 LC-ESI-MS/MS인 질량분석법.
  7. 제 1항에 추가로 d) 상기 c)단계에서 얻은 질량 스펙트럼으로부터 상기 단백질 및 단백질 동위원소가 심혈관질환 진단 또는 예후 평가를 위한 물질로의 적합성을 판단하는 단계를 포함하는 심혈관질환 진단 및 예후 평가 방법.
KR1020130123364A 2013-10-16 2013-10-16 화학적 동위원소 치환법을 이용한 혈액 내 뇌성 나트륨 이뇨 펩타이드 질량분석법 KR101531835B1 (ko)

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