KR20150042670A - Method for generation of neuronal precursor cells, neurons, oligodendrocytes, astrocytes or dopaminergic neurons from somatic cell by neural-specific and neurotrophic factors - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 신경특이인자 및 신경영양인자를 이용하여 체세포로부터 신경전구세포, 신경세포, 희소돌기아교세포, 별아교세포 또는 도파민 신경세포를 유도하는 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게 본 발명은 신경특이인자인 Ascl1(achaete-scute complex homolog 1) 및 Nurr1(Nuclear receptor related-1)을 레트로바이러스 벡터를 이용하여 체세포에 도입시키고 다양한 사이토카인을 처리함으로써 체세포를 신경전구세포(neuronal precursor cells), 신경세포(neurons), 희소돌기아교세포(oligodendrocytes), 별아교세포(astrocytes) 또는 도파민신경세포(dopaminergic neurons)로 유도하는 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a method of inducing neural progenitor cells, neuron cells, rare prominent glue cells, astrocytic cells or dopaminergic neurons from somatic cells using neuron specific factors and neurophysiologists. More particularly, the present invention relates to a method of introducing somatic cells into neural progenitor cells by introducing nerve-specific factors such as Ascl1 (achaete-scute complex homolog 1) and Nurr1 (Nuclear receptor related-1) into somatic cells using retroviral vectors, to neuronal precursor cells, neurons, oligodendrocytes, astrocytes, or dopaminergic neurons. < Desc / Clms Page number 2 >
척추동물에 있어서 신경계의 발생은 낭배기가 지나 기관형성과정 중 가장 먼저 일어나는 과정으로 낭배의 외배엽으로부터 생성되는 신경판(neural plate)이 신경관(neural tube)을 형성 후 신경계의 중추신경 부분(뇌와 척수)으로 발달하게 되며, 신경관이 닫힌 후 여분의 신경관 세포 및 표피 판에 의해 말초신경계(체성신경계, 운동신경 및 감각신경; 자율신경계, 소화, 호흡, 땀 같은 신진대사와 관련된 신경)가 형성된다. In vertebrates, the development of the nervous system is the first step in the process of organogenesis through cystic exhaustion. The neural plate, which is generated from the ectoderm of the cyst, forms the neural tube, Spinal cord), and after the neural tube is closed, extra neural tube and epidermal plate form peripheral nervous system (nervous system, motor nerve and sensory nerve, autonomic nervous system, nervous system related to metabolism such as digestion, respiration, sweat) .
이러한 신경계발생에 따른 분화과정은 복잡하고 정교한 유전자들의 유도과정 및 관련 단백질들의 상호작용을 통해서 신경조직발생(neurogenesis), 뉴런이동(neuronal migration), 프로세스 아웃그로스(process outgrowth) 그리고 시냅스 형성(synapse formation)의 일련의 연속적인 과정으로 신경계가 발달한다. 그러나 발생 초기에 만들어지는 신경세포는 세포분열을 거의 하지 않으며, 성장함에 따라 복잡한 신경돌기구조를 형성할 뿐이기에 물리적 손상이나 유전적 또는 비유전적인 원인에 따른 신경계질환 및 퇴행성 신경계장애의 치료방법은 현재 약물 치료, 유전자치료 및 세포 대체 치료법 이외에 효과적인 치료법이 없는 실정이다. The differentiation process of this neural development is characterized by neurogenesis, neuronal migration, process outgrowth and synapse formation through the induction process of complex and elaborate genes and the interaction of related proteins ), The nervous system develops. However, since neurons produced at the early stage of development rarely undergo cell division and form only complex neurite structures as they grow, the treatment methods of neuronal diseases and degenerative nervous system disorders due to physical damage or genetic or non-genetic causes There are no effective treatments other than drug therapy, gene therapy and cell replacement therapy.
세포 대체 치료법에 있어서는 인간의 뇌에서 신경줄기세포를 직접 분리하여 사용하는 방법, 성체줄기세포를 이용 신경세포를 유도하는 방법, 배아 및 유도 만능줄기세포를 이용 신경줄기세포 및 신경전구세포로 유도하는 방법들이 시도되고 있다. In cell replacement therapy, methods for directly using neural stem cells in a human brain, inducing neural cells using adult stem cells, inducing neural stem cells and neural progenitor cells using embryonic and induced pluripotent stem cells It is being tried.
체세포를 이용한 신경세포 유도 분야는 미국의 Wernig 그룹에서 자체 발굴한 신경특이 인자(Ascl1, Brn2, Myt1l)를 사용하여 생쥐의 피부세포로부터 직접 신경세포를 유도하는데 성공 후 (2010년, Nature), 최근에는 인간의 피부세포로부터 신경세포를 유도하는 데 성공함으로써 체세포를 이용한 신경세포 유도 연구가 임상적용에 이용될 것으로 기대된다. 뿐만 아니라 스웨덴의 Parmar그룹은 인간의 피부세포를 도파민 신경특이인자 (Lmx1a, FoxA2)를 사용하여 기능성 있는 도파민 신경세포를 유도하는 데 성공하였다 (2011년, PNAS). 독일의 Hans R. Scholer 그룹은 생쥐의 체세포를 이용 신경줄기세포를 유도하고 생쥐에 이식하여 신경줄기세포를 이용한 치료제의 가능성을 보여줬고 (2012년, Cell Stem Cell), 스웨덴의 Malin Parmar 그룹은 신경특이인자(Ascl1, Brn2, Myt1l)가 탑재된 doxycycline 유도성 렌티바이러스(lentivirus)가 삽입된 인간의 섬유아세포와 희소돌기아교세포를 생쥐에 이식 후 생쥐의 뇌에서 신경세포를 발현시키는 동물실험에 성공함으로써, 신경계질환의 신약연구 및 세포대체 요법에 있어서 새로운 치료방법의 가능성을 높여주고 있다 (2013년, 3월 PNAS). 하지만 위의 모든 그룹의 연구결과에서는 신경세포 유도효율이 낮다는 문제점이 있어 이에 대한 개선 방안이 필요하다.In the field of neuron induction using somatic cells, we succeeded in inducing neurons directly from the skin cells of mice using the nerve-specific factors (Ascl1, Brn2, Myt1l) discovered by Wernig group in USA (Nature, 2010) Is expected to be used for clinical application by succeeding to induce nerve cells from human skin cells. In addition, the Parmar group in Sweden succeeded in inducing functional dopaminergic neurons using dopamine neurotrophins (Lmx1a, FoxA2) in human skin cells (2011, PNAS). In Germany, Hans R. Scholer group showed the possibility of treatment with neural stem cells (2012, Cell Stem Cell), inducing neural stem cells using mouse somatic cells and transplanting them into mice, Malin Parmar group in Sweden Ascl1, Brn2, and Myt1l), human fibroblasts and rare proliferating glial cells with doxycycline-inducible lentivirus have been transplanted into mice and succeeded in animal experiments to express neurons in the brain of mice. (PNAS, March 2013), which is expected to increase the likelihood of new therapies in new drug studies and cell replacement therapies. However, the results of all the above groups show that the induction efficiency of neurons is low.
본 발명의 배경기술로는 대한민국 등록특허 10-0838013(2008.06.12)에는 인간 배아줄기세포로부터 고효율로 신경전구세포, 신경세포 및 도파민 신경세포의 분화를 유도하는 방법에 대해 기재되어 있고, 대한민국 등록특허 10-0880948(2009.02.04)에는 Nurr1 계열의 전사인자(transcription factor)를 이용하여 신경 전구세포(neural precursor cell)를 기능적, 형태적으로 성숙한 도파민성 신경세포 (dopaminergic neuron)로 분화시키는 방법 및 이에 이용되는 조성물에 대해 개시되어 있다. 또한, 본 발명자들은 International society for stem cell research 학회(2012.06.13)에서 Ascl1을 이용하여 체세포로부터 신경 전구세포 등으로의 직접전환 방법에 대해 포스터 발표한 바가 있다.As a background of the present invention, Korean Patent Registration No. 10-0838013 (2008.06.12) describes a method for inducing the differentiation of neural progenitor cells, neurons and dopamine neurons in high efficiency from human embryonic stem cells, Patent No. 10-0880948 (2009.02.04) discloses a method of differentiating neural precursor cells into functional and morphologically mature dopaminergic neurons using Nurr1 transcription factors and The compositions used therefor are disclosed. In addition, the inventors of the International Society for stem cell research (Jun. 13, 2012) have posters on the direct conversion method from somatic cells to neural progenitor cells using Ascl1.
그러나, Acl1 및 Nurr1을 도입하고 신경영양인자와 함께 유도 배양함으로써 체세포로부터 신경전구세포, 신경세포, 별아교세포, 희소돌기아교세포 및 도파민 신경세포를 효과적으로 유도할 수 있는 방법에 대해 알려진 바는 없다.
However, there is no known method for efficiently inducing neural progenitor cells, neuronal cells, astrocytic cells, rare prominent glial cells, and dopaminergic neurons from somatic cells by introducing Acl1 and Nurr1 and inducing culture with neurons.
본 발명은 상기 종래 기술의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명자는 생쥐의 체세포인 섬유아세포를 이용, 신경특이인자인 Acl1 및 Nurr1을 도입하고 신경영양인자와 함께 유도 배양함으로써 신경전구세포, 신경세포, 별아교세포, 희소돌기아교세포 및 도파민 신경세포가 유도되고 분화가 효과적으로 일어남을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.Disclosure of the Invention The present invention has been conceived to solve the above problems of the prior art. The present inventors have succeeded in inducing neuronal progenitor cells, neurons, and neurons by introducing nerve specific factors Acl1 and Nurr1 using fibroblasts, which are somatic cells of mice, Cells, astrocytes, spindle-shaped glial cells, and dopamine neurons were induced and differentiation was observed to be effective. Thus, the present invention was completed.
본 발명의 목적은 체세포에 Ascl1 및 Nurr1을 도입하는 것을 특징으로 하여 신경전구세포, 신경세포, 별아교세포, 희소돌기아교세포 및 도파민 신경세포로의 유도 및 분화방법을 제공하는 데 있다.It is an object of the present invention to provide a method for inducing and differentiating neural progenitor cells, neurons, astrocytes, rare prominent glue cells and dopaminergic neurons by introducing Ascl1 and Nurr1 into somatic cells.
본 발명의 다른 목적은 Ascl1 및 Nurr1가 도입된 체세포를 이용하여 뇌 또는 신경계 질환 치료용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a composition for treating brain or neurological diseases by using Ascl1 and Nurr1-introduced somatic cells.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.
Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.
본 발명의 일 양태에 의하면, 본 발명은 체세포에 Ascl1(achaete-scute complex homolog 1) 및 Nurr1(Nuclear receptor related-1)을 도입하는 제1단계; 및 상기 체세포를 신경세포 유도배지에서 배양하는 제2단계를 포함하는 체세포로부터 신경전구세포(neuronal precursor cells), 신경세포(neurons), 희소돌기아교세포(oligodendrocytes), 별아교세포(astrocytes) 또는 도파민 신경세포(dopaminergic neurons)를 유도하는 방법을 제공한다.According to an aspect of the present invention, there is provided a method for producing a somatic cell, comprising the steps of: introducing Ascl1 (achaete-scute complex homolog 1) and Nurr1 (nuclear receptor related-1) into somatic cells; Neuronal precursor cells, neurons, oligodendrocytes, astrocytes, or dopaminergic neurons from somatic cells including a second step of culturing the somatic cells in a neural cell induction medium. Lt; RTI ID = 0.0 > (dopaminergic < / RTI > neurons).
본 발명의 다른 양태에 의하면, 본 발명은 Ascl1 및 Nurr1가 도입된 체세포; 또는 이들이 분화된 세포를 유효성분으로 함유하는 뇌 또는 신경계 질환 치료용 조성물을 제공한다.
According to another aspect of the present invention, the present invention provides a somatic cell into which Ascl1 and Nurr1 have been introduced; Or a cell differentiated therefrom as an effective ingredient.
이하, 본 발명에 대해 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 Ascl1 및 Nurr1을 도입하는 것을 특징으로 하는 다양한 신경세포(신경전구세포, 신경세포, 별아교세포, 희소돌기아교세포 및 도파민 신경세포)로의 유도 및 분화방법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a method for inducing and differentiating various nerve cells (neural progenitor cells, neuron cells, astrocytic cells, rare prominent glue cells and dopaminergic neurons) characterized by introducing Ascl1 and Nurr1 do.
따라서 본 발명은 체세포에 Ascl1 및 Nurr1을 도입하는 제1단계; 및 상기 체세포를 신경세포 유도배지에서 배양하는 제2단계를 포함하는 체세포로부터 신경전구세포(neuronal precursor cells), 신경세포(neurons), 희소돌기아교세포(oligodendrocytes), 별아교세포(astrocytes) 또는 도파민 신경세포(dopaminergic neurons)를 유도하는 방법을 제공한다.Therefore, the present invention relates to a method for producing Asc1 and < RTI ID = 0.0 > Nurr1 < / RTI > Neuronal precursor cells, neurons, oligodendrocytes, astrocytes, or dopaminergic neurons from somatic cells including a second step of culturing the somatic cells in a neural cell induction medium. Lt; RTI ID = 0.0 > (dopaminergic < / RTI > neurons).
본 발명에 있어, 출발 체세포 (모세포)의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 임의의 체세포를 이용할 수 있다. 예를 들어, 태아기(embryonic period)의 체세포 이외에 성숙한 (matured) 체세포를 이용해도 된다. 유도 신경줄기세포를 질병의 치료에 이용하는 경우에는 환자로부터 분리된 체세포를 이용하는 것이 바람직하며, 예를 들어, 질병에 관여하는 체세포나 질병치료에 관여하는 체세포 등을 이용할 수 있다. 바람직하게는 상기 체세포는 섬유아세포이며, 본 발명에서 섬유아세포는 인간과 마우스, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 동물 유래의 모든 섬유아세포를 포함한다.In the present invention, the starting somatic cell (parent cell) is not particularly limited, and any somatic cell can be used. For example, matured somatic cells may be used in addition to somatic cells of the embryonic period. When inducing neural stem cells are used for the treatment of diseases, somatic cells isolated from the patient are preferably used. For example, somatic cells involved in disease or somatic cells involved in disease treatment can be used. Preferably, the somatic cell is a fibroblast. In the present invention, the fibroblast includes all fibroblasts derived from an animal such as human and mouse, horse, sheep, pig, goat, camel,
상기 체세포에 Ascl1 및 Nurr1의 도입은, 바이러스 벡터를 이용하여 이루어질 수 있으며, 상기 바이러스 벡터로는 이에 제한되지는 않으나 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 허피스 바이러스 벡터, 아비폭스바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 등이 있다. 특히, 레트로바이러스를 이용하는 방법이 바람직하다. 상기 레트로바이러스 벡터는 바이러스 유전자가 모두 제거되었거나 또는 변경되어 비-바이러스 단백질이 바이러스 벡터에 의해 감염된 세포 내에서 만들어지도록 제작된 것이다. 유전자 요법을 위한 레트로바이러스 벡터의 주요 장점은 다량의 유전자를 복제세포 내에 전달하고, 세포 DNA 내로 전달된 유전자를 정확하게 통합하며, 유전자 형질 감염 후 연속적인 감염이 유발되지 않는 것이다.
The introduction of Ascl1 and Nurr1 into the somatic cell may be carried out using a viral vector, and the viral vector may be a retrovirus vector, an adenovirus vector, a herpes virus vector, an avipox virus vector, a lentivirus vector, etc. . Particularly, a method using a retrovirus is preferable. The retroviral vector is constructed such that all of the viral genes have been removed or altered so that the non-viral proteins are made in cells infected with the viral vector. The main advantage of retroviral vectors for gene therapy is that they transfer a large number of genes into the cloned cells, accurately integrate the genes transferred into the cellular DNA, and do not lead to subsequent infection after gene transfection.
상기 신경세포 유도배지는 신경세포를 유도하는 배지로써, 이에 한정되는 것을 아니나 바람직하게 하이 글루코스(high glucose) DMEM/F12이며, 이에 한정되는 것은 아니나 보다 구체적인 실시예에 의하면 상기 배지는 상기 하이 글루코스(high glucose) DMEM/F12 배지에 10% FBS, 2mM L-glutamin, 1% ITS, 1% N2 supplement, 1% B27, 1% ascobic acid, 및 1% penicillin/streptomycin 용액을 포함시켜 이용하였다.
The neural cell induction medium is a medium for inducing neuron cells, but is not limited to, but preferably high glucose DMEM / F12. According to a more specific embodiment, 1% ITS, 1% N2 supplement, 1% B27, 1% ascorbic acid, and 1% penicillin / streptomycin solution in DMEM / F12 medium supplemented with 10% FBS.
본 발명은 특히, 다양한 신경세포의 유도 및 분화방법에 있어 신경영양인자를 이용하여 다양한 신경세포를 유도 및 분화시키는 것을 특징으로 한다. 즉, 이는 체세포의 증식능력을 높이며 신경세포의 발달과 유지에 관여하는 신경영양인자의 조합을 이용하여, 효과적으로 다양한 신경세포를 유도 및 분화하는 방법을 제공한다. In particular, the present invention is characterized in inducing and differentiating various neurons using neurons in the induction and differentiation of various neurons. That is, it provides a method of effectively inducing and differentiating various neurons by using a combination of neurons that are involved in the development and maintenance of nerve cells, which increase somatic cell proliferation ability.
본 발명의 구체적인 일 양태에 의하면, 본 발명의 신경전구세포(neuronal precursor cells)로의 유도 방법은, 상기 신경세포 유도배지에 bFGF(basic fibroblast growth factor) 및 EGF(epithelial growth factor)를 더 포함하여 신경전구세포(neuronal precursor cells)를 유도하는 제2단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.According to a specific embodiment of the present invention, the method for inducing neuronal precursor cells of the present invention further comprises bFGF (basic fibroblast growth factor) and EGF (epithelial growth factor) And a second step of inducing neuronal precursor cells.
상기 신경전구세포로의 유도에 있어서 사용한 신경영양인자는 분열촉진 단백질(mitogenic protein)의 일종인 bFGF(basic fibroblast growth factor)와 EGF(epithelial growth factor)으로써 체세포의 유사분열을 촉진하고, 뉴런의 분화 및 증식과 재생, 세포의 생존력을 높이기 위해 사용된다.The neurophysiologists used for induction into the neural progenitor cells are bFGF (basic fibroblast growth factor) and EGF (epithelial growth factor), which are mitogenic proteins, to promote somatic cell mitosis, It is used for proliferation and regeneration, and for enhancing cell viability.
이에 한정되는 것은 아니나, 상기 신경전구세포(neuronal precursor cells)로 유도시 10~30 ng/ml bFGF 및 10~30 ng/ml EGF를 포함한 신경세포 유도배지에서 17일 이상 유도하는 것이 바람직하다. It is preferable to induce neuronal precursor cells for at least 17 days in a neural cell induction medium containing 10 to 30 ng / ml bFGF and 10 to 30 ng / ml EGF.
본 발명에서 만들어진 신경전구세포라 함은 신경전구세포의 표식인자를 가지며 분화 후에 신경세포를 만들 수 있는 세포들을 말하며, 이에 한정되는 것은 아니나 본 발명에 의해 유도된 신경전구세포(neuronal precursor cells)는 nestin과 sox1에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 발현하는 것을 특징으로 한다.
Neuronal progenitor cells produced by the present invention are cells capable of forming neurons after having different markers, including but not limited to neuronal precursor cells. Neuronal precursor cells derived from the present invention include nestin And < RTI ID = 0.0 > sox1. ≪ / RTI >
본 발명의 구체적인 다른 양태에 의하면, 본 발명의 신경세포(neurons) 유도방법은 bFGF 및 EGF를 더 포함하는 신경세포 유도배지에서 배양하는 제2단계; bFGF/EGF이 포함되지 않은 신경세포 유도배지에서 배양하여 신경세포(neurons)를 유도하는 제3단계를 포함한다.According to another specific embodiment of the present invention, the neurons induction method of the present invention comprises a second step of culturing in a neural cell induction medium further comprising bFGF and EGF; and a third step of inducing neurons by culturing in a nerve cell induction medium not containing bFGF / EGF.
상기 신경세포로의 유도 및 분화에 있어서 사용한 신경영양인자는 신경전구세포 유도에 사용된 동일한 인자(bFGF 및 EGF)이고, 신경세포로의 분화를 시키기 위해서 상기의 분열촉진 단백질(mitogenic protein)이 결여된 배지에 추가로 배양한다. The neurophysiologist used for induction and differentiation into the neuron is the same factor (bFGF and EGF) used for the induction of neural progenitor cells, and in order to differentiate into neurons, Incubate further in medium.
이에 한정되는 것은 아니나, 상기 신경세포 (neurons) 유도시 10~30 ng/ml bFGF 및 10~30 ng/ml EGF를 포함하는 신경세포 유도배양 배지에서 12일 이상 동안 배양한 후, 17일 이상 bFGF/EGF가 포함되지 않은 신경세포 유도배양 배지에서 신경세포를 유도하는 것이 바람직하다.After incubation for at least 12 days in a neuron-induced culture medium containing 10 to 30 ng / ml bFGF and 10 to 30 ng / ml EGF during the induction of neurons, bFGF / EGF-induced neuronal cell-derived culture medium.
본 발명에 있어 신경세포라 함은 신경세포의 표식인자 및 신경 특이 전기적 특성을 갖는 세포들을 말하며, 이에 한정되는 것은 아니나 본 발명에 의해 유도된 신경세포(neurons)는 Tuj1과 MAP2에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 발현하는 것을 특징으로 한다.
In the present invention, the term "nerve cell" refers to cells having nerve cell markers and nerve specific electrical characteristics, but the neurons derived by the present invention are not limited to one or more genes selected from Tuj1 and MAP2 Is expressed.
본 발명의 또 다른 구체적인 양태에 의하면, 본 발명에 의한 희소돌기아교세포(oligodendrocytes)로의 유도 및 분화 방법은 bFGF 및 EGF를 더 포함하는 신경세포 유도배지에서 배양하는 제2단계; bFGF, EGF, 및 PDGF가 포함된 신경세포 유도배지에서 배양하는 제3단계; 및 PDGF가 포함된 신경세포 유도배지에서 배양하여 희소돌기아교세포(oligodendrocytes)를 유도하는 제4단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.According to another specific embodiment of the present invention, the method for inducing and differentiating oligodendrocytes according to the present invention comprises a second step of culturing in a neural cell induction medium further comprising bFGF and EGF; bFGF, EGF, and PDGF in a neural cell-derived medium; And PDGF to induce oligodendrocytes. The fourth step is to induce oligodendrocytes.
상기 희소돌기아교세포로의 유도 및 분화에 있어서 사용한 신경영양인자는 신경전구세포 유도에 사용된 동일한 인자(bFGF 및 EGF) 그리고 희소돌기아교세포의 증식에 중요한 기능을 하는 분열촉진 단백질(mitogenic protein)인 PDGF(platelet-derived growth factor)가 사용된다. The neurophysiologist used for induction and differentiation into the spindle-like glue cells is the mitogenic protein (bFGF and EGF) used for the induction of neural progenitor cells and the mitogenic protein Platelet-derived growth factor (PDGF) is used.
이에 한정되는 것은 아니나, 희소돌기아교세포(oligodendrocytes)로의 유도 시 10~30 ng/ml bFGF 및 10~30 ng/ml EGF를 포함하는 신경세포 유도배양 배지에서 3일 이상 동안 배양 후, 9일 이상 동안은 bFGF/EGF 및 200 ng/ml PDGF가 포함된 신경세포 유도배양 배지에서 유도하고, 그 후 10일 이상 동안은 bFGF/EGF가 제거된 PDGF 및 신경세포 유도배양 배지에 유도하고, 그 후 9일 이상 동안은 신경세포 유도배양액만으로 희소돌기아교세포를 유도하는 것이 바람직하다.But are not limited to, culturing for at least 3 days in a neuronal cell-derived culture medium containing 10 to 30 ng / ml bFGF and 10 to 30 ng / ml EGF when induced into oligodendrocytes, Were induced in neuronal cell culture medium containing bFGF / EGF and 200 ng / ml PDGF, and then for 10 days or more, induced into bFGF / EGF-depleted PDGF and neuronal cell culture medium, It is desirable to induce rarely proliferating glial cells only by the neuronal cell culture medium.
본 발명에 있어, 희소돌기아교세포(oligodendrocytes)는 희소돌기아교세포의 표식인자를 가지며 신경세포 사이의 신호를 전달하는 세포를 말하며, 이에 한정되는 것은 아니나 본 발명에 의해 유도된 희소돌기아교세포는 O4, MBP 및 MAG으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 발현하는 것을 특징으로 한다.
In the present invention, oligodendrocytes refer to cells that have markers of rare prominent glial cells and transmit signals between neurons, including, but not limited to, rare oligodendrocytes derived by the present invention O4, MBP, and MAG.
본 발명의 또 다른 구체적인 양태에 의하면, 본 발명에 의한 별아교세포(astrocytes)로의 유도 및 분화 방법은 bFGF 및 EGF를 더 포함하는 신경세포 유도배지에서 배양하는 제2단계; bFGF, EGF 및 CNTF가 포함된 신경세포 유도배지에서 배양하는 제3단계; 및 bFGF/EGF가 포함되지 않고, CNTF가 포함된 신경세포 유도배지에서 배양하여 별아교세포(astrocytes)를 유도하는 제4단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.According to another embodiment of the present invention, there is provided a method for inducing and differentiating astrocytes according to the present invention, comprising the steps of: (a) culturing in astrocyte induction medium containing bFGF and EGF; bFGF, EGF and CNTF in a neural cell-derived medium; And a fourth step of culturing astrocytes in a neural cell induction medium containing CNTF without bFGF / EGF, and inducing astrocytes.
상기 별아교세포(astrocytes)로의 유도 및 분화 방법에서 사용한 신경영양인자는 신경전구세포 유도에 사용된 동일한 인자(bFGF 및 EGF) 그리고 분열촉진 단백질(mitogenic protein)인 CNTF(ciliary neurotropic factor)가 사용된다. 상기 CNTF(ciliary neurotropic factor)는 신경전달물질(neurotransmitter) 합성과 신경극발아(neurite outgrowth) 촉진 및 별아교세포, 희소돌기아교세포, 신경세포의 생존조절, 신경네트워크가 형성됨에 따라 수상돌기와 축색돌기의 신장에 중요한 기능을 한다고 알려진 분열촉진 단백질(mitogenic protein)이다.The neurofilament used in induction and differentiation into astrocytes is the same factor (bFGF and EGF) used for the induction of neural progenitor cells and CNTF (ciliary neurotropic factor) used as a mitogenic protein. The ciliary neurotropic factor (CNTF) is a neurotransmitter capable of stimulating neurotransmitter synthesis, neurite outgrowth promotion, and astrocyte cells, rarely proliferating glial cells, neuronal cell survival, It is a mitogenic protein known to play an important role in kidneys.
이에 한정되는 것은 아니나, 별아교세포(astrocytes) 유도시 10~30 ng/ml bFGF 및 10~30 ng/ml EGF를 포함하는 신경세포 유도배양 배지에서 3일 이상 동안 배양된 후, 9일 이상 동안은 bFGF/EGF 및 200 ng/ml CNTF가 포함된 신경세포 유도배양액으로 유도하고, 그 후 10일 이상 동안은 bFGF/EGF가 제거된 CNTF 및 신경세포 유도배양액으로 유도하고, 그 후 9일 이상 동안은 신경세포 유도배양액만으로 별아교세포로 유도하는 것이 바람직하다.But are not limited to, cultured for at least 3 days in a neuronal cell-derived culture medium containing 10 to 30 ng / ml bFGF and 10 to 30 ng / ml EGF when inducing astrocytes, bFGF / EGF and 200 ng / ml CNTF, and then induced into bFGF / EGF-depleted CNTF and neuronal cell culture media for more than 10 days, It is preferable to induce astrocytes only by the neuron-inducing culture medium.
본 발명에 있어 별아교세포(astrocytes)는 별아교세포의 표식인자를 가지며신경 조직을 지지하는 신경 아교를 이루는 세포를 말하며, 이에 한정되는 것은 아니나 본 발명에 의해 유도된 별아교세포는 GFAP 및 S100b에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 발현하는 것을 특징으로 한다.
In the present invention, astrocytes refer to astrocytes that have astrocyte markers and support neural tissues. Astrocyte cells induced by the present invention are selected from GFAP and S100b And expressing one or more genes.
본 발명의 또 다른 구체적인 양태에 의하면, 본 발명에 의한 도파민 신경세포의 유도 및 분화 방법은 bFGF 및 EGF를 더 포함하는 신경세포 유도배지에서 배양하는 제2단계; bFGF, EGF 및 FGF8b가 포함된 신경세포 유도배지에서 배양하는 제3단계; bFGF/EGF가 포함되지 않고, Shh/FGF8b가 포함된 신경세포 유도배지에서 배양하는 제4단계; 및 신경세포 유도배지에서 도파민 신경세포(dopaminergic neurons)로 유도하는 제5단계를 포함한다. According to another embodiment of the present invention, there is provided a method for inducing and differentiating dopamine neurons according to the present invention, comprising the steps of: (a) culturing in a neural cell induction medium further comprising bFGF and EGF; bFGF, EGF and FGF8b in a neural cell-derived medium; a fourth step of culturing in a neural cell induction medium containing no ShF / FGF8b but no bFGF / EGF; And a fifth step of inducing dopaminergic neurons in the neuronal cell-derived medium.
상기 도파민 신경세포의 유도 및 분화에 있어서 사용한 신경영양인자는 신경전구세포 유도에 사용된 동일한 인자(bFGF 및 EGF) 그리고 SHH(Sonic Hedgehog) 및 FGF-8b(fibroblast growth factor-8b)가 사용된다. SHH(Sonic Hedgehog)는 전뇌(forebrain), 척수(spinal cord), 눈(eye) 및 팔(limb) 등의 발달에 중요한 기능을 한다고 알려져 있고, FGF-8b(fibroblast growth factor-8b)는 중뇌(midbrain), 후뇌(hindbrain), 눈(eye), 귀(ear), 팔(limb) 및 심장(heart)의 발달에 중요한 기능을 한다고 알려진 성장인자(growth factor)이다. The neurophysiologic agents used for the induction and differentiation of dopamine neurons include the same factors (bFGF and EGF) and SHH (Sonic Hedgehog) and FGF-8b (fibroblast growth factor-8b) used to induce neural progenitor cells. It is known that SHH (Sonic Hedgehog) plays an important role in development of the forebrain, spinal cord, eye and limb. FGF-8b (fibroblast growth factor-8b) It is a growth factor known to play an important role in the development of the brain, midbrain, hindbrain, eye, ear, limb and heart.
이에 한정되는 것은 아니나, 도파민 신경세포(dopaminergic neurons) 유도시 10~30 ng/ml bFGF 및 10~30 ng/ml EGF를 포함하는 신경세포 유도배지에서 3일 이상 동안 배양한 후, 9일 이상 동안은 bFGF/EGF 및 200 ng/ml Shh 와 100 ng/ml FGF8b가 포함된 신경세포 유도배양액으로 유도하고, 그 후 10일 이상 동안은 bFGF/EGF가 제거된 Shh/FGF8b 및 신경세포 유도배양액으로 유도하고, 그 후 9일 이상 동안은 신경세포 유도배양액만으로 도파민 신경세포(dopaminergic neurons)로 유도하는 것이 바람직하다.But are not limited to, culturing for at least 3 days in neural cell induction medium containing 10 to 30 ng / ml bFGF and 10 to 30 ng / ml EGF in the induction of dopaminergic neurons, Were induced into neuronal cell culture medium containing bFGF / EGF and 200 ng / ml Shh and 100 ng / ml FGF8b, and then induced into bFGF / EGF-depleted Shh / FGF8b and neuronal cell culture medium for more than 10 days , And it is preferable to induce dopaminergic neurons with neuron-inducing culture medium for more than 9 days.
본 발명에 있어 도파민 신경세포라 함은 도파민 신경세포의 표식인자를 가지며 배지 내로 도파민을 분비하고 동물모델에 이식했을 때 기능회복을 보이는 세포를 말한다. 이에 한정되는 것은 아니나, 본 발명에 의한 도파민 신경세포(dopaminergic neurons)는 Lmx1a, Aadc, Vmat2, Th 및 Tuj1로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 발현하는 것을 특징으로 한다.
In the present invention, a dopaminergic neuron refers to a cell that has a marking function of dopaminergic neuron, which secretes dopamine into the medium and regenerates when transplanted into an animal model. The dopaminergic neurons according to the present invention are characterized by expressing at least one gene selected from the group consisting of Lmx1a, Aadc, Vmat2, Th and Tuj1.
또한, 본 발명의 다른 양태에 의하면, 본 발명은 Ascl1 및 Nurr1가 도입된 체세포; 또는 이들이 분화된 세포를 유효성분으로 함유하는 뇌 또는 신경계 질환 치료용 조성물을 제공한다.Also, according to another aspect of the present invention, there is provided a method for producing a recombinant vector comprising: a somatic cell into which Ascl1 and Nurr1 are introduced; Or a cell differentiated therefrom as an effective ingredient.
상기 뇌 또는 신경계질환은 파킨슨병, 신경통, 관절염, 두통, 정신분열증, 간질, 뇌졸증, 불면증, 치매, 우울증, 디스키네시아, 알츠하이머 질환, 루이제 치매, 헌팅톤 질환, 뚜렛 증후군, 불안, 학습 및 기억 손상, 퇴행성 신경질환 등의 신경계의 기능 감소 또는 이상으로 인하여 뇌 또는 신경계에 나타나는 질환을 말한다. Wherein said brain or neurological disease is selected from the group consisting of Parkinson's disease, neuralgia, arthritis, headache, schizophrenia, epilepsy, stroke, insomnia, dementia, depression, dyskinesia, Alzheimer's disease, Louie's Disease, Huntington's disease, Which is caused by a decrease or malfunction of the nervous system such as damage, degenerative nerve disease, or the like.
본 발명의 치료용 조성물은 투여 방식에 따라 허용 가능한 담체를 포함하여 적절한 제제로 제조될 수 있다. 투여 방식에 적합한 제제는 공지되어 있으며 전형적으로 막을 통과하는, 이동을 용이하게 하는 제제를 포함할 수 있다.The therapeutic composition of the present invention may be prepared into a suitable preparation including an acceptable carrier depending on the administration mode. Formulations suitable for the mode of administration are known and may include formulations that facilitate passage, typically through the membrane.
또한, 본 발명의 치료용 조성물은 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 비경구용 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제 또는 동결건조제제, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽 또는 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 치료용 조성물은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 결합체, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 또는 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다.In addition, the therapeutic composition of the present invention can be used in the form of a general pharmaceutical preparation. The parenteral preparation may be in the form of a sterilized aqueous solution, a non-aqueous solvent, a suspension, an emulsion or a lyophilized preparation, or a tablet, troch, capsule, elixir, suspension, syrup or wafer in the case of oral administration. May be formulated in unit dosage ampoules or multiple doses. In addition, the therapeutic composition of the present invention may be administered together with a pharmaceutically acceptable carrier. For oral administration, for example, binders, lubricants, disintegrants, excipients, solubilizers, dispersants, stabilizers, suspending agents, coloring matters or fragrances may be used. In the case of injections, buffering agents, preservatives, An isotonic agent, an isotonic agent, a stabilizer, etc. may be used in combination. In the case of topical administration, a base, an excipient, a lubricant, a preservative and the like may be used.
또한, 본 발명의 치료용 조성물을 이용하여 뇌 또는 신경계 질환을 치료하는 방법은 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질이 도입되는 일반적인 경로를 통하여 투여하는 것을 포함할 수 있다. 상기 투여방법으로는 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장 내 투여가 있으나, 이에 제한되지 않는다. 그러나 경구 투여시, 세포가 소화될 수 있으므로 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서 분해되는 것을 보호하기 위해 제형화하는 것이 바람직하다.In addition, the method for treating brain or neurological diseases using the therapeutic composition of the present invention may include administration through a general route in which a predetermined substance is introduced into a patient by an appropriate method. Such administration methods include, but are not limited to, intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, oral administration, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration and rectal administration. However, upon oral administration, the cells may be digested, so that the oral composition is preferably formulated to coat the active agent or protect it from being decomposed from above.
또한, 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 바람직한 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제 또는 점적 주사제 등이다. 주사제는 생리식염액 또는 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스테르 (예로, 올레인산에칠 등), 알코올류(예로, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜 또는 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제 (예로, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제 (예로, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약제학적 담체를 포함할 수 있다. In addition, the pharmaceutical composition may be administered by any device capable of transferring the active substance to the target cell. Preferred modes of administration and formulations are intravenous, subcutaneous, intradermal, intramuscular or drip injectable. The injectable solution may be a non-aqueous solvent such as an aqueous solvent such as a physiological saline solution or a ring gel solution, a vegetable oil, a higher fatty acid ester (for example, oleic acid), an alcohol (for example, ethanol, benzyl alcohol, propylene glycol or glycerin) (For example, ascorbic acid, sodium hydrogen sulfite, sodium pyrophosphate, BHA, tocopherol, EDTA and the like), an emulsifier, a buffer for pH control, a microbial growth inhibitor Preservatives (for example, mercury nitrate, thimerosal, benzalkonium chloride, phenol, cresol, benzyl alcohol, etc.).
바람직하게는 본 발명의 치료용 조성물을 이용하여 뇌 또는 신경계 질환을 치료하는 방법은, 본 발명의 치료용 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 상기 약학적 유효량은 질환의 종류, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법, 투여 횟수, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 투여량은 이에 한정되지 않고, 예를 들어 약 1,000 내지 10,000,000 세포, 혹은 그 이상 일수도 있으나, 고용량이 되면 암세포로 변할 가능성을 완전히 배제할 수 없으므로 2,000,000 내지 4,000,000 정도가 바람직할 수 있다.
Preferably, the method for treating a brain or neurological disease using the therapeutic composition of the present invention comprises administering a therapeutically effective amount of the therapeutic composition of the present invention. The pharmaceutically effective amount may be appropriately selected depending on the kind of the disease, the age, body weight, health, sex, sensitivity of the patient to the drug, administration route, administration method, administration frequency, And can be readily determined by those skilled in the art depending on the factors. The dosage is not limited thereto. For example, it may be about 1,000 to 10,000,000 cells or more, but it may be preferable that the dose is 2,000,000 to 4,000,000 because it is impossible to completely eliminate the possibility of the cancer cell becoming a high dose.
상술한 바와 같이, 본 발명에 따라서 Ascl1 및 Nurr1가 동시에 도입된 체세포는 신경영양인자가 포함된 배지에서 다양한 신경세포(신경전구세포, 신경세포, 희소돌기아교세포, 별아교세포 및 도파민 신경세포)로 높은 효율로 유도 및 분화된다. As described above, according to the present invention, the somatic cells into which Ascl1 and Nurr1 are simultaneously introduced are highly expressed in various neurons (neural progenitor cells, neurons, rare prominent glue cells, astrocytes and dopaminergic neurons) in a medium containing neurotrophic factor Efficiency is induced and differentiated.
따라서 본 발명은 다양한 신경계질환을 치료하기 위한 세포 대체요법과 신약개발에 있어서 약물효과 검정에 매우 유용하게 활용될 수 있다.
Therefore, the present invention can be very usefully used for cell replacement therapy for treating various neurological diseases and drug effects in the development of new drugs.
도 1a 및 도 1b는 생쥐에서 분리된 섬유아세포에 대해 섬유아세포 특이적으로 발현되는 세포내 마커(Vimentin)와 신경세포내 특이적인 마커들(Nestin, Sox1 및 Tuj1)을 이용한 면역형광염색법으로 확인한 결과를 나타내며, 분리 후 증식된 섬유아세포(passage number 2)는 신경세포의 마커가 발현하지 않으며(0%), 섬유아세포 특이적인 마커(100%)가 발현하는 특징을 보여준다(* p<0.01).
도 1c는 레트로바이러스를 이용, 신경세포인자인 Ascl 및 Nurr1이 도입된 생쥐의 섬유아세포가 약 30일 이후 신경세포, 별아교세포 및 희소돌기아교세포와 형태적으로 유사한 모양을 보여주는 도면이다(100배로 관찰한 결과).
도 2a는 레트로바이러스를 이용, 생쥐의 섬유아세포에 신경세포인자인 Ascl 및 Nurr1를 도입 후 신경영양인자(bFGF와 EGF)를 이용한 신경전구세포(neuronal precursor cells)로 유도하기 위한 유도과정을 나타내는 모식도이다.
도 2b는 2a에서 표기된 방법으로 생쥐의 섬유아세포가 신경전구세포로 변화하는 대표이미지를 보여주는 도면이다(100배로 관찰한 결과).
도 2c~2d는 신경전구세포(neuronal precursor cells)로 유도된 세포를 면역형광염색방법으로 확인한 결과를 보여주는 도면이다.
도 2e는 도 2c~2d의 면역형광염색방법으로 확인된 결과를 수치화시킨 유도효율을 보여주는 도면이다(* p<0.01).
도 2f는 유도 전 생쥐의 섬유아세포 및 유도 후 신경전구세포(neuronal precursor cells)에서 신경전구세포의 마커인 nestin, sox1 및 mussashi-1의 발현을 확인한 RT-PCR 결과를 보여주는 도면이다.
도 3a는 레트로바이러스를 이용, 생쥐의 섬유아세포에 신경세포인자인 Ascl 및 Nurr1를 도입 후 신경영양인자(bFGF 및 EGF)와 신경세포 유도배지(neuronal induction media, NI)를 이용한 신경세포(neurons)로 유도 및 분화시키기 위한 과정을 나타내는 모식도이다.
도 3b는 3a에서 표기된 방법으로 생쥐의 섬유아세포(mouse embryonic fibroblast)가 신경세포(neurons)로 변화하는 대표이미지를 보여 주는 도면이다(100배로 관찰한 결과).
도 3c는 신경세포(neurons)로 유도 및 분화된 세포를 면역형광염색방법으로 확인한 결과를 보여주는 도면이다.
도 3d는 도 3c의 면역형광염색방법으로 확인한 결과를 수치화시킨 유도효율을 보여주는 도면이다(* p<0.01).
도 3e는 유도 전 생쥐의 섬유아세포(mouse embryonic fibroblast) 및 유도 후 신경세포(neurons)에서 신경세포의 마커인 tuj1 및 map2의 발현을 확인한 RT-PCR 결과를 보여주는 도면이다.
도 4a는 레트로바이러스를 이용, 생쥐의 섬유아세포에 신경세포인자인 Ascl 및 Nurr1를 도입 후 신경영양인자(bFGF, EGF 및 PDGF)와 신경세포 유도배지(neuronal induction media, NI)를 이용한 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)로 유도 및 분화시키기 위한 과정을 나타내는 모식도이다.
도 4b는 도 4a에서 표기된 방법으로 생쥐의 섬유아세포가 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)로 변화하는 대표이미지를 보여 주는 도면이다(100배로 관찰한 결과).
도 4c는 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)로 유도 및 분화된 세포를 면역형광염색방법으로 확인한 결과를 보여주는 도면이다.
도 4d는 도 4c의 면역형광염색방법으로 확인한 결과를 수치화시킨 유도효율을 보여주는 도면이다(* p<0.01).
도 4e는 유도 전 생쥐의 섬유아세포 및 유도 후 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)에서 희소돌기아교세포의 마커인 MBP 및 MAG의 발현을 확인한 RT-PCR결과를 보여주는 도면이다.
도 5a는 레트로바이러스를 이용, 생쥐의 섬유아세포에 신경세포인자인 Ascl 및 Nurr1를 도입 후 신경영양인자(bFGF, EGF 및 CNTF)와 신경세포 유도배지(neuronal induction media, NI)를 이용한 별아교세포(astrocyte)로 유도 및 분화시키기 위한 과정을 나타내는 모식도이다.
도 5b는 도 5a에서 표기된 방법으로 생쥐의 섬유아세포가 별아교세포(astrocyte)로 변화하는 대표이미지를 보여 주는 도면이다(100배로 관찰한 결과).
도 5c는 별아교세포(astrocyte)로 유도 및 분화된 세포를 면역형광염색방법으로 확인한 결과를 보여주는 도면이다.
도 5d는 도 5c의 면역형광염색방법으로 확인한 결과를 수치화시킨 유도효율을 보여주는 도면이다(* p<0.01).
도 5e는 유도 전 생쥐의 섬유아세포 및 유도 후 별아교세포(astrocyte)에서 별아교세포의 마커인 GFAP 및 S100b의 발현을 확인한 RT-PCR 결과를 보여주는 도면이다.
도 6a는 레트로바이러스를 이용, 생쥐의 섬유아세포에 신경세포인자인 Ascl 및 Nurr1를 도입 후 신경영양인자(bFGF, EGF, SHH 및 FGF8b)와 신경세포 유도배지(neuronal induction media, NI)를 이용한 도파민 신경세포(dopaminergic neurons)로 유도 및 분화시키기 위한 과정을 나타내는 모식도이다.
도 6b는 도 6a에서 표기된 방법으로 도파민 신경세포(dopaminergic neurons)로 유도 및 분화된 세포를 면역형광염색방법으로 확인한 도면이다.
도 6c는 도 6b의 면역형광염색방법으로 확인한 결과를 수치화시킨 유도효율을 보여주는 도면이다(* p<0.01).
도 6d는 유도 전 생쥐의 섬유아세포 및 유도 후 도파민 신경세포(dopaminergic neurons)에서 도파민 신경세포의 마커인 Lmx1a, Aadc, Vmat2, Th 및 Tuj1의 발현을 확인한 RT-PCR 결과를 보여주는 도면이다. FIGS. 1A and 1B show results obtained by immunofluorescence staining using intracellular markers (Vimentin) and nerve cell specific markers (Nestin, Sox1 and Tuj1) expressed in fibroblasts in the fibroblasts isolated from mice (0%) and fibroblast-specific markers (100%) were expressed (* p <0.01), and the proliferated fibroblasts after separation showed no marker of neuronal cells (0%).
FIG. 1C is a diagram showing a morphologically similar shape of fibroblasts of mice into which nerve cell factors Ascl and Nurr1 have been introduced, using retroviruses, after about 30 days, with neurons, astrocytes and rare dendritic cells (100 times Observed results).
FIG. 2A is a schematic diagram showing an induction process for inducing neuronal precursor cells using neurotrophins (bFGF and EGF) by introducing neuronal factors Ascl and Nurr1 into fibroblasts of mice using retrovirus .
FIG. 2B is a view showing a representative image (100-fold observation) in which fibroblasts of mice are transformed into neural progenitor cells by the method shown in 2a.
FIGS. 2c to 2d are diagrams showing the result of confirming cells induced by neuronal precursor cells by immunofluorescence staining method. FIG.
FIG. 2E is a graph showing the induction efficiency obtained by quantifying the results obtained by the immunofluorescence staining method of FIGS. 2C to 2D (* p <0.01).
FIG. 2f shows RT-PCR results of nestin, sox1 and mussashi-1, which are markers of neural progenitor cells, in fibroblasts and induced neuronal precursor cells of preinduction mice.
FIG. 3A is a graph showing changes in neurons (neurons) using neurons (bFGF and EGF) and neuronal induction media (NI) after introducing neuronal factors Ascl and Nurr1 into fibroblasts of mice using retrovirus FIG. 2 is a schematic view showing a process for inducing and differentiating the cells.
FIG. 3B is a view showing a representative image (100-fold observation) of a mouse embryonic fibroblast transformed into neurons by the method described in 3a.
FIG. 3c is a diagram showing the result of confirming cells induced and differentiated by neurons by immunofluorescence staining method.
FIG. 3D is a graph showing the induction efficiency obtained by quantifying the results obtained by the immunofluorescence staining method of FIG. 3C (* p <0.01).
FIG. 3E shows RT-PCR results of the expression of tuj1 and map2, which are markers of neuronal cells, in the mouse embryonic fibroblasts and post-induction neurons of preinduction mice.
FIG. 4A is a graph showing the results of immunohistochemical analysis of reticulocyte cells using neuronal inducers (bFGF, EGF and PDGF) and neuronal induction media (NI) after introducing neuronal factors Ascl and Nurr1 into fibroblasts of mice using retrovirus (oligodendrocyte). < / RTI >
FIG. 4B is a view showing a representative image (100-fold observation result) in which fibroblasts of mice are changed into oligodendrocyte cells by the method shown in FIG. 4A.
FIG. 4C is a diagram showing the result of confirming cells induced and differentiated by oligodendrocyte by immunofluorescence staining method. FIG.
FIG. 4D is a graph showing the induction efficiency obtained by quantifying the results obtained by the immunofluorescence staining method of FIG. 4C (* p <0.01).
FIG. 4E is a graph showing RT-PCR results of MBP and MAG, which are markers of rare prominent glue cells, in fibroblasts and induced oligodendrocytes of preinduction mice.
5a is a graph showing the results of immunohistochemical staining for astrocytes using neurotrophic factor (bFGF, EGF and CNTF) and neuronal induction media (NI) after introduction of Ascl and Nurr1 as neuronal cell factors into fibroblasts of mice using retrovirus ) And a method for inducing and differentiating the same.
FIG. 5B is a view showing a representative image (100-fold observation) of a fibroblast of a mouse transformed into astrocyte by the method shown in FIG. 5A.
FIG. 5c is a diagram showing the result of confirming cells induced and differentiated by astrocyte by immunofluorescence staining method. FIG.
FIG. 5D is a graph showing the induction efficiency obtained by quantifying the results obtained by the immunofluorescence staining method of FIG. 5C (* p <0.01).
FIG. 5E is a graph showing RT-PCR results showing the expression of GFAP and S100b, markers of astrocytes in fibroblasts and induced astrocytes of preinduction mice.
FIG. 6A is a graph showing the results of immunohistochemical analysis of dopaminergic neurons using neurons (bFGF, EGF, SHH and FGF8b) and neuronal induction media (NI) after introducing neuronal factors Ascl and Nurr1 into fibroblasts of mice using retrovirus (Dopaminergic neurons). ≪ / RTI >
FIG. 6B is a diagram showing cells induced and differentiated into dopaminergic neurons by immunofluorescence staining method according to the method shown in FIG. 6A.
FIG. 6C is a graph showing the induction efficiency obtained by quantifying the results obtained by the immunofluorescence staining method of FIG. 6B (* p <0.01).
FIG. 6D is a graph showing RT-PCR results showing the expression of Lmx1a, Aadc, Vmat2, Th, and Tuj1 as markers of dopamine neurons in fibroblasts and induced dopaminergic neurons of preinduction mice.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .
실시예Example 1: 생쥐의 섬유아세포 분리 및 증식 1: Fibroblast Isolation and Proliferation in Mice
과배란이 유도된 5.5주령의 ICR계 생쥐의 암컷을 14~15일째 되는 날 경추파열법으로 생쥐를 도살하여 자궁으로부터 태아를 적출하였다. 적출된 태아의 머리, 척추, 내장 및 다리를 제거한 후 복부의 표피조직을 잘게 조각내고 0.05% trypsin으로 조직을 풀어준 후 10 cm 페트리 디쉬(petri dish)당 4마리의 태아 조직을 DMEM high-glucose+10% FBS, 2mM L-glutamine+1% non-essential amino acid+0.1 mM β-mercaptoethanol+1% penicillin-streptomycin을 첨가한 배지에 37℃, 5% CO2, 95% 습도가 유지되는 배양기에서 5일간 배양하였다(passage number 0). 페트리 디쉬(petri dish)에 단일세포층이 80~90% 유지되면, 2회 계대배양(passage number 2)을 통해서 증식시켜, 10% DMSO가 포함된 동결보존액으로 1X106 cell/ml의 농도로 cryovial에 1ml씩 분주하여 Nalgene freezing container에 넣고 80℃ deep freezer에서 하루 동안 동결시킨 후 액체 질소에서 냉동 보관하였다.
Females of 5.5-week-old ICR mice induced superovulation were slaughtered by cervical rupture on
실시예Example 2: 분리 후 증식된 생쥐의 섬유아세포를 2: Fibroblasts of mice proliferated after isolation 면역형광염색방법으로By immunofluorescence staining method 확인 Confirm
생쥐의 섬유아세포(P1)를 2.5X104 cell/ml의 농도로 24-well plate에서 1일간 배양 후 섬유아세포 특이적인 마커(Vimentin)와 신경세포 특이적인 마커(Nestin, Sox1 및 Tuj1)를 이용, 면역형광염색방법으로 확인하였다. 그 결과는 도 1a 및 도 1b에 도시하였다. 분리 후 증식된 섬유아세포(passage number 2)는 신경세포의 마커가 발현하지 않으며(0%), 섬유아세포 특이적인 마커(100%)가 발현하는 특징을 보여준다.
Fibroblasts (P1) of mice were cultured on a 24-well plate at a concentration of 2.5 × 10 4 cells / ml for 1 day. Then, fibroblast-specific markers (Vimentin) and nerve cell specific markers (Nestin, Sox1 and Tuj1) Immunofluorescent staining. The results are shown in Figs. 1A and 1B. After separation, proliferated fibroblasts (2) exhibit no neuronal marker expression (0%) and fibroblast-specific markers (100%).
실시예Example 3: 3: Ascl1Ascl1 및 And Nurr1Nurr1 에 의한 신경세포 유도 능력 여부 확인Whether or not the neurons are inducible by
도 1c에서처럼 생쥐의 섬유아세포에 Ascl1 와 Nurr1을 함께 형질도입하고 신경세포 유도배지(DMEM/F12+1% ITS+1% N2 supplement+1% B27+1% ascobic acid+1% penicillin/streptomycin)를 이용, 약 30일 유도한 결과 신경세포, 별아교세포 및 희소돌기아교세포와 형태적으로 유사한 모양으로 변화됨을 확인할 수 있었다.
Asc1 and Nurr1 were transfected into the fibroblasts of the mice as shown in FIG. 1c, and neuronal cell-derived medium (DMEM / F12 + 1% ITS + 1% N2 supplement + 1% B27 + 1% ascorbic acid + 1% penicillin / streptomycin) The results showed that the morphological changes were similar to those of neurons, astrocytes, and rare dendritic cells.
실시예Example 4: 4: Ascl1Ascl1 , , Nurr1Nurr1 및 And bFGFbFGF // EGFEGF 에 의한 신경전구세포 유도 능력 여부 확인 및 신경전구세포의 특성 확인To determine the ability to induce neural progenitor cells and to characterize neural progenitor cells
도 2a에서처럼 생쥐의 섬유아세포에 Ascl1 와 Nurr1을 함께 형질도입시키고 신경세포 유도배지(DMEM/F12+1% ITS+1% N2 supplement+1% B27+1% ascobic acid+1% penicillin/streptomycin) 및 20 ng/ml bFGF 와 20 ng/ml EGF를 사용하여, 약 17일 유도하였다. Asc1 and Nurr1 were co-transfected into fibroblasts of the mouse as shown in FIG. 2A, and neuronal induction medium (DMEM / F12 + 1% ITS + 1% N2 supplement + 1% B27 + 1% ascorbic acid + 1% penicillin / streptomycin) 20 ng / ml bFGF and 20 ng / ml EGF.
그 결과 도 2b에서처럼 생쥐의 섬유아세포는 신경전구세포의 전형적인 형태인 세포질 부분이 줄어들고, 둥근 형태의 세포로 변화됨을 확인할 수 있었다. 도 2c~2d에서처럼 면역형광염색방법을 이용 신경전구세포의 마커로 확인한 결과 도 2e에서처럼 신경전구세포의 마커인 Sox1의 발현은 약 16.82±3.17%, Nestin의 발현은 약 19.68±3.51% 발현됨을 확인할 수 있었다. 또한 도 2f에서처럼 신경전구세포의 마커 유전자의 발현을 RT-PCR 방법으로 확인한 결과, nestin, sox1 및 mussash1이 유도된 신경전구세포에서 발현됨을 확인할 수 있었다.
As a result, as shown in FIG. 2B, the fibroblasts of the mouse showed that the cytoplasmic portion, which is a typical form of neural progenitor cells, was reduced and changed into a round-shaped cell. As shown in FIGS. 2c to 2d, the expression of Sox1 and Nestin in the neuroepithelial cell markers were 16.82 ± 3.17% and 19.68 ± 3.51%, respectively, as shown in FIG. 2e I could. As shown in FIG. 2f, the expression of the marker gene of neural progenitor cells was confirmed by RT-PCR, and nestin, sox1 and mussash1-induced neuronal progenitor cells were expressed.
실시예Example 5: 5: Ascl1Ascl1 , , Nurr1Nurr1 및 And bFGFbFGF // EGFEGF 에 의한 신경세포 유도 능력 여부 확인 및 신경세포의 특성 확인To determine the ability to induce neurons and to characterize neurons
도 3a에서처럼 생쥐의 섬유아세포에 Ascl1 와 Nurr1을 함께 형질도입시키고 신경세포 유도배지(DMEM/F12+1% ITS+1% N2 supplement+1% B27+1% ascobic acid+1% penicillin/streptomycin) 및 20 ng/ml bFGF 와 20 ng/ml EGF를 사용하여 약 12일 유도한 후, bFGF/EGF가 제거된 신경세포 유도배지에서 약 16일 배양하였다. Asc1 and Nurr1 were co-transfected into fibroblasts of mice as shown in FIG. 3A, and neuronal induction medium (DMEM / F12 + 1% ITS + 1% N2 supplement + 1% B27 + 1% ascorbic acid + 1% penicillin / streptomycin) 20 ng / ml bFGF and 20 ng / ml EGF for about 12 days and then cultured for about 16 days in bFGF / EGF-depleted neuron-derived medium.
그 결과 도 2b에서처럼 생쥐의 섬유아세포는 신경세포의 전형적인 형태인 세포질 부분이 줄어들고, 긴 가지 형태의 세포로 변화됨을 확인할 수 있었다. 도 2c에서처럼 면역형광염색방법을 이용 신경세포의 마커로 확인한 결과 도 2d에서처럼 신경전구세포의 마커인 Tuj1의 발현은 약 51±3.02% 발현됨을 확인할 수 있었다. 또한 도 2e에서처럼 신경세포의 마커 유전자의 발현을 RT-PCR 방법으로 확인한 결과, Tuj1 및 MAP2가 유도된 신경세포에서 발현됨을 확인할 수 있었다.
As a result, as shown in FIG. 2b, the fibroblasts of mice showed that the cytoplasmic portion, which is a typical type of neuron, was reduced and changed into a long branch-shaped cell. As shown in FIG. 2C, the expression of Tuj1, a marker of neural progenitor cells, was found to be about 51. + -. 3.02% as shown in FIG. 2d by the marker of neuron using immunofluorescence staining method. As shown in FIG. 2E, the expression of the marker gene of the neuron was confirmed by RT-PCR, and it was confirmed that it was expressed in Tuj1 and MAP2-induced neurons.
실시예Example 6: 6: Ascl1Ascl1 , , Nurr1Nurr1 및 And bFGFbFGF // EGFEGF // PDGFPDGF 에 의한 희소돌기아교세포 유도 능력 여부 확인 및 희소돌기아교세포의 특성 확인To confirm the ability of the oligodendrocytes to induce the oligodendrocytes and to characterize the oligodendrocytes
도 4a에서처럼 생쥐의 섬유아세포에 Ascl1 와 Nurr1을 함께 형질도입시키고 신경세포 유도배지(DMEM/F12+1% ITS+1% N2 supplement+1% B27+1% ascobic acid+1% penicillin/streptomycin) 및 20 ng/ml bFGF 와 20 ng/ml EGF를 사용하여 약 3일 유도한 후, 200 ng/ml PDGF를 추가로 하여 약 10일 처리 후 bGFF/EGF를 제거하고 200 ng/ml PDGF와 신경세포 유도배지에서 약 11일 배양하고 PDGF가 제거된 신경유도배지에서 약 10일 동안 배양하였다. Asc1 and Nurr1 were transfected into the fibroblasts of the mice as shown in FIG. 4a, and the cells were cultured in a neural cell-derived medium (DMEM / F12 + 1% ITS + 1% N2 supplement + 1% B27 + 1% ascorbic acid + 1% penicillin / streptomycin) The cells were treated with 20 ng / ml bFGF and 20 ng / ml EGF for about 3 days, followed by treatment with 200 ng / ml PDGF for about 10 days. Then, bGFF / EGF was removed and 200 ng / For about 11 days and cultured in neural induction medium with PDGF removed for about 10 days.
그 결과 도 4b에서처럼 생쥐의 섬유아세포는 희소돌기아교세포의 전형적인 형태인 세포질 부분이 넓게 퍼지며 여러 개의 가지가 형성된 세포로 변화됨을 확인할 수 있었다. 도 4c에서처럼 면역형광염색방법을 이용 희소돌기아교세포의 마커로 확인한 결과 도 4d에서처럼 희소돌기아교세포의 마커인 O4의 발현이 약 60±7.95% 발현됨을 확인할 수 있었다. 또한 도 4e에서처럼 신경세포의 마커 유전자의 발현을 RT-PCR 방법으로 확인한 결과, Mbp 및 Mag가 유도된 희소돌기아교세포에서 발현됨을 확인할 수 있었다.
As a result, as shown in FIG. 4b, the fibroblasts of the mouse were found to have a wide spreading cytoplasmic portion, which is a typical form of the spindle-shaped glue cells, and changed into cells with multiple branches. As shown in FIG. 4C, the expression of O4, a marker of the glomerular glial cell, was expressed by about 60 ± 7.95% as shown in FIG. 4d by immunofluorescence staining using a marker of the spindle glue cell. In addition, as shown in FIG. 4E, the expression of the marker gene of the neuron was confirmed by RT-PCR, and it was confirmed that it was expressed in Mbp and Mag-induced rare dendritic cells.
실시예Example 7: 7: Ascl1Ascl1 , , Nurr1Nurr1 및 And bFGFbFGF // EGFEGF // CNTFCNTF 에 의한 별아교세포 유도 능력 여부 확인 및 신경전구세포의 특성 확인To determine the ability of astrocytes to induce astrocytes and to characterize neuronal progenitor cells
도 5a에서처럼 생쥐의 섬유아세포에 Ascl1 와 Nurr1을 함께 형질도입시키고 신경세포 유도배지(DMEM/F12+1% ITS+1% N2 supplement+1% B27+1% ascobic acid+1% penicillin/streptomycin) 및 20 ng/ml bFGF 와 20 ng/ml EGF를 사용하여 약 3일 유도한 후, 200 ng/ml CNTF를 추가로 하여 약 10일 처리 후 bGFF/EGF를 제거하고 200 ng/ml CNTF와 신경세포 유도배지에서 약 11일 배양하고 CNTF가 제거된 신경유도배지에서 약 10일 동안 배양하였다. As shown in FIG. 5a, Ascl1 and Nurrl were transfected into fibroblasts of mice and cultured in neural cell-derived medium (DMEM / F12 + 1% ITS + 1% N2 supplement + 1% B27 + 1% ascorbic acid + 1% penicillin / streptomycin) After incubation for approximately 3 days with 20 ng / ml bFGF and 20 ng / ml EGF, bGFF / EGF was removed after approximately 10 days of addition of 200 ng / ml CNTF and 200 ng / ml CNTF and neuronal induction For about 11 days and cultured in neural induction medium with CNTF removed for about 10 days.
그 결과 도 5b에서처럼 생쥐의 섬유아세포는 별아교세포의 전형적인 형태인 세포질 부분이 다소 넓어져 여러 개의 가지가 형성된 세포로 변화됨을 확인할 수 있었다. 도 5c에서처럼 면역형광염색방법을 이용 별아교세포의 마커로 확인한 결과 도 5d에서처럼 별아교세포의 마커인 GFAP의 발현이 약 3.0±0.24% 발현됨을 확인할 수 있었다. 또한 도 5e에서처럼 별아교세포의 마커 유전자의 발현을 RT-PCR 방법으로 확인한 결과, GFAP 및 S100b가 유도된 별아교세포에서 발현됨을 확인할 수 있었다.
As a result, as shown in FIG. 5b, the fibroblasts of mice were found to be changed into cells having multiple branches because the cytoplasmic part, which is a typical type of astrocytic cells, was somewhat wider. As shown in FIG. 5c, the expression of GFAP, a marker of astrocytic cells, was 3.0 ± 0.24% as shown in FIG. 5d. In addition, as shown in FIG. 5E, the expression of the marker gene of astrocytes was confirmed by RT-PCR, and it was confirmed that GFAP and S100b-expressing astrocytes were expressed.
실시예Example 8: 8: Ascl1Ascl1 , , Nurr1Nurr1 및 And bFGFbFGF // EGFEGF // SHHSHH // FGF8bFGF8b 에 의한 도파민 신경세포 유도 능력 여부 확인 및 도파민 신경세포의 특성 확인Of dopaminergic neurons and their properties
도 6a에서처럼 생쥐의 섬유아세포에 Ascl1 와 Nurr1을 함께 형질도입시키고 신경세포 유도배지(DMEM/F12+1% ITS+1% N2 supplement+1% B27+1% ascobic acid+1% penicillin/streptomycin) 및 20 ng/ml bFGF 와 20 ng/ml EGF를 사용하여 약 3일 유도한 후, 200 ng/ml Shh 및 100 ng/ml FGF8b를 추가로 하여 약 9일 처리 후 bGFF/EGF를 제거하고 Shh/FGF8b와 신경세포 유도배지에서 약 10일 배양하고 Shh/FGF8b가 제거된 신경유도배지에서 약 9일 동안 배양하였다. 그 결과, 도 6b에서처럼 면역형광염색방법을 이용 도파민 신경세포의 마커로 확인한 결과 도 6c에서처럼 도파민 신경세포의 마커인 Th의 발현이 약 2.74±0.58% 발현됨을 확인할 수 있었다. 또한 도 6d에서처럼 도파민 신경세포의 마커 유전자의 발현을 RT-PCR 방법으로 확인한 결과, Lmx1a, Aadc, Vmat2, Th 및 Tuj1이 유도된 도파민 신경세포에서 발현됨을 확인할 수 있었다.
Asc1 and Nurr1 were transfected into fibroblasts of mice as shown in FIG. 6A, and neuron-derived medium (DMEM / F12 + 1% ITS + 1% N2 supplement + 1% B27 + 1% ascorbic acid + 1% penicillin / streptomycin) After about 3 days of induction with 20 ng / ml bFGF and 20 ng / ml EGF, bGFF / EGF was removed after about 9 days of addition of 200 ng / ml Shh and 100 ng / ml FGF8b, and Shh / FGF8b And nerve cell induction medium for about 10 days and cultured for about 9 days in Shh / FGF8b-depleted neural induction medium. As a result, as shown in FIG. 6B, it was confirmed by the marker of dopamine neuron using immunofluorescence staining method that the expression of Th, which is a marker of dopamine neuron, was 2.74 ± 0.58% as shown in FIG. 6C. In addition, as shown in FIG. 6d, the expression of the marker gene of dopamine neuron was confirmed by RT-PCR, and it was confirmed that Lmx1a, Aadc, Vmat2, Th and Tuj1 were induced in dopamine neurons.
이상에서 설명한 본 발명은 전술한 실시예 및 도면에 의해 한정되는 것은 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능함은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백할 것이다.It will be apparent to those skilled in the art that various modifications and variations can be made in the present invention without departing from the spirit or scope of the invention. It will be clear to those who have.
Claims (13)
상기 체세포를 신경세포 유도배지에서 배양하는 제2단계를 포함하는 체세포로부터 신경전구세포(neuronal precursor cells), 신경세포(neurons), 희소돌기아교세포(oligodendrocytes), 별아교세포(astrocytes) 또는 도파민 신경세포(dopaminergic neurons)를 유도하는 방법.A first step of introducing Ascl1 (achaete-scute complex homolog 1) and Nurr1 (Nuclear receptor related-1) into somatic cells; And
A second step of culturing the somatic cells in a neuronal cell-derived medium, the method comprising culturing neuronal precursor cells, neurons, oligodendrocytes, astrocytes or dopaminergic neurons lt; RTI ID = 0.0 > dopaminergic < / RTI > neurons.
bFGF 및 EGF이 포함되지 않은 신경세포 유도배지에서 배양하여 신경세포(neurons)를 유도하는 제3단계를 포함하는 방법.[2] The method of claim 1, further comprising: a second step of culturing the neural cell induction medium further comprising bFGF (basic fibroblast growth factor) and EGF (epithelial growth factor); And
and a third step of culturing in neural cell-derived medium not containing bFGF and EGF to induce neurons.
bFGF, EGF, 및 PDGF가 포함된 신경세포 유도배지에서 배양하는 제3단계; 및
PDGF가 포함된 신경세포 유도배지에서 배양하여 희소돌기아교세포(oligodendrocytes)를 유도하는 제4단계를 포함하는 방법.The method according to claim 1, further comprising the step of culturing the neural cell induction medium further comprising bFGF and EGF;
bFGF, EGF, and PDGF in a neural cell-derived medium; And
Culturing the cells in a neural cell-derived medium containing PDGF to induce oligodendrocytes.
bFGF, EGF 및 CNTF가 포함된 신경세포 유도배지에서 배양하는 제3단계; 및
CNTF가 포함된 신경세포 유도배지에서 배양하여 별아교세포(astrocytes)를 유도하는 제4단계를 포함하는 방법.The method according to claim 1, further comprising the step of culturing the neural cell induction medium further comprising bFGF and EGF;
bFGF, EGF and CNTF in a neural cell-derived medium; And
And a fourth step of inducing astrocytes by culturing in a neural cell induction medium containing CNTF.
bFGF, EGF, Shh 및 FGF8b가 포함된 신경세포 유도배지에서 배양하는 제3단계;
Shh 및 FGF8b가 포함된 신경세포 유도배지에서 배양하는 제4단계; 및
신경세포 유도배지에서 도파민 신경세포(dopaminergic neurons)로 유도하는 제5단계를 포함하는 방법. The method according to claim 1, further comprising the step of culturing the neural cell induction medium further comprising bFGF and EGF;
bFGF, EGF, Shh, and FGF8b;
Shh and FGF8b in a neuronal cell-derived medium; And
And a fifth step of inducing dopaminergic neurons in the neural cell-derived medium.
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