KR20150015779A - 망막의 on/off 이극세포 선택적 유전자 발현 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발병은 망막에 존재하는 ON 또는 OFF 이극세포에 선택적으로 광유전자를 발현시키기 위한 방법으로, 구체적으로는 ON 이극세포에 특이적으로 발현하는 프로모터, 제1 표적 유전자 및 Cre 유전자를 포함하는 제1 벡터 및 ON/OFF 이극세포에 발현하는 프로모터, 제2 표적 유전자 및 loxP 서열을 포함하는 제2 벡터를 포함하는 이극세포에서 선택적 유전자 발현용 키트 및 이를 이극세포에 도입하여 이극세포에서 유전자를 선택적으로 발현시키는 방법에 관한 것이다. 일 구체예에서 개시된 바업을 이용할 경우 광수용체가 없을 경우에도 이극세포에서 빛을 감지할 수 있으며, 이러한 경우 광수용체가 사멸하는 안질환을 갖는 환자에게 효과적인 치료법을 제공할 수 있다.
Description
본 발명은 망막의 이극세포에서 유전자를 선택적으로 발현하는 기술에 대한 것이다.
광유전자를 망막보철에 이용하고자 하는 연구는 2005년 광유전학을 신경과학 분야에 적용하면서 자연스럽게 시작되었으나, 망막세포의 시각신호 네트워크를 고려하여 광유전자를 선택하고 세포 특이적으로 발현하고자 하는 연구는 비교적 최근에 시작되었다. 정상적인 망막에서의 광신호는 가장 먼저 광수용체가 활성화되고, 그 다음으로 ON/OFF 이극세포가 활성화되지만, 광수용체가 어떤 요인에 의해 사멸된 망막에서는 더 이상 광자극에 반응하는 세포가 없기 때문에 광신호가 아예 만들어질 수 없게 된다.
현재까지 시신경으로 시각신호를 전달하는 마지막 세포인 신경절세포에 ON/OFF 선택성 없이 채널로돕신만을 발현시킨 경우, 장님생쥐의 광감응성이 매우 강한 빛으로 자극하였을 경우에 어느 정도 복구되었다는 것이 보고된 바 있다.
그러나, 망막질환과 관련된 특허분석을 통하여 확인한 결과, 망막세포에서 세포선택적 발현기술에 대한 특허는 ON 세포 특이적인 프로모터와 관련된 내용이 대부분이었다. 그러나, 보다 정확한 빛을 감지하기 위하여는 빛을 감지하는 ON 이극세포와 OFF 이극세포에 특이적으로 유전자를 조절할 필요가 있었다.
따라서, 이러한 문제점을 해결하기 위하여 두 종류의 프로모터를 이용하여 제작된 바이러스 벡터를 직접 생쥐의 망막에 투여하고 검증된 내용을 기반으로, 두 바이러스 벡터의 효용성과 유용성을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 정상적인 망막의 시각신호전달 과정과 유사하도록 ON 이극세포와 OFF 이극세포를 동시에 선택적 발현이 가능하도록 하는 벡터를 제작하여 ON/OFF 이극세포에서 유전자를 선택적으로 발현하는 방법에 관한 것이다.
일 양상은 ON 이극세포에 특이적으로 발현하는 프로모터, 제1 표적 유전자 및 Cre 유전자를 포함하는 제1 벡터 및 ON/OFF 이극세포에 발현하는 프로모터, 제2 표적 유전자 및 loxP 서열을 포함하는 제2 벡터를 포함하는 이극세포에서 선택적 유전자 발현용 키트를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "이극세포"는 "bipolar cell"이라고도 하며, 망막(retian)의 일부이다. 이극세포는 광수용체(photoreceptor)와 신경절 세포(ganglion cell)의 사이에 존재한다. 이때, 광수용체는 간상 세포(rod cell)과 원추 세포(cone cell)을 의미한다. 이극 세포는 광수용체에서 받은 신호를 신경절 세포로 전달하는 역할을 한다. 이극세포는 기능에 따라 ON 이극세포와 OFF 이극세포로 구분된다. 본 명세서에서 사용된 용어, "ON 이극세포"는 빛이 존재할 때 탈분극(depolarization)을 일으키는 이극세포를 의미한다. 또한, 빛이 없을 경우에는 과분극(hyperpolarization)을 일으킨다. 또한, "OFF 이극세포"는 빛이 존재할 때는 과분극 상태로 존재하나, 빛이 없을 경우에는 탈분극을 일으키는 이극세포를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "Cre 유전자"는 "Cre 재조합효소" 또는 "Cre recombinase" 또는 "Cyclization recombinase"를 코딩하는 유전자를 의미한다. Cre 재조합효소는 Cre-Lox 재조합을 유발하는데 활용되는 효소이다. 상기 Cre 재조합효소는 P1 박테리아파지에서 유래한 티로신 재조합 효소일 수 있다. 상기 Cre 재조합효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 4의 핵산 서열을 가질 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어, "loxP 서열"는 Cre-Lox 재조합에서 Cre 재조합효소에 의해 인식되어 재조합이 일어나는 부위를 의미한다. 두개의 loxP가 Cre 재조합효소에 의해 인식되어, 두개의 loxP 사이의 유전자가 결실되게 된다. 상기 loxP 서열은 서열번호 25 내지 28 중 어느 하나일 수 있다. 또한, 서열번호 25 및 서열번호 26의 loxP 서열이 하나의 세트로 사용될 수 있다. 또한, 서열번호 27 및 서열번호 28의 loxP 서열이 하나의 세트로 사용될 수 있다. 또한, 두 개의 loxP 서열의 사이에는 제2 표적 유전자가 위치하도록 하여야 한다.
상기 ON 이극세포에 특이적으로 발현하는 프로모터는 이극 세포중 OFF 이극세포에서는 발현을 하지 않으며, ON 이극세포에서만 발현을 하는 유전자에서 유래하는 프로모터일 수 있다. 일 구체예로는 대사성 글루타민산염 수용체 6(mGluR6)를 코딩하는 유전자의 발현을 조절하는 프로모터일 수 있다.
상기 ON/OFF 이극세포에 특이적으로 발현하는 프로모터는 이극 세포중 OFF 이극세포와 ON 이극세포에서 발현을 하는 유전자에서 유래하는 프로모터일 수 있다. 일 구체예로는 호메오박스를 포함하는 전사인자 10(homeobox-containing transcription factor 10, CHX10)를 코딩하는 유전자의 발현을 조절하는 프로모터일 수 있다. 또한, CaBP5 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 일 수 있다.
또한 상기 제1 표적 유전자는 ON 이극세포에서 특이적으로 발현시키기 위한 유전자를 의미한다. 이때, 제1 표적 유전자는 채널로돕신일 수 있다. 상기 채널로돕신은 "channelrhodopsin"이라고 하며, 조류(algae)나 박테리아(bacteria) 등에 존재하는 빛에 민감하게 반응하는 이온 채널 단백질 일 수 있다. 이때, 상기 채널로돕신은 녹조류에서 발견되는 채널로돕신 2(이하, ChR2라고 한다)일 수 있다. 상기 ChR2는 Na+, Ca++ 등의 이온 채널을 조절하며, 푸른 빛이 들어와서 ChR2 이온 채널을 자극할 경우, 이온 채널이 개방되어 Na+, Ca++가 세포안으로 들어와 세포가 탈분극(depolarization)이 일어나게 된다. 또한, 상기 채널로돕신은 볼복스 미생물 유래의 볼복스 채널로돕신 1(Volvox channelrhodopsin-1, VChr1)일 수 있다.
또한, 상기 채널로돕신은 빛에 반응하여 이온을 조절할 수 있는 한 적절한 변형이 이루어 질 수 있다. 변형은 이온 채널을 구성하는 단백질의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의해 이루어 질 수 있다. 또한, 빛에 반응하여 이온을 조절할 수 있는 한 채널로돕신을 코딩하는 핵산의 부가, 치환 또는 결실에 의해 변형될 수 있다.
또한 상기 제2 표적 유전자는 OFF 이극세포에서 특이적으로 발현시키기 위한 유전자를 의미한다. 이때, 제2 표적 유전자는 할로로돕신일 수 있다. 상기 채널로돕신은 "halorhodopsin"이라고 하며, 미생물인 "Natronomonas pharaonis"에서 유래한 이온 수송체이다. 상기 할로로돕신은 "Natronomonas pharaonis halorhodopsin" 또는 "NpHR"라고도 한다. 상기 할로로돕신은 노란 빛에 반응하여 Cl- 이온은 세포 안으로 들여오는 Cl- 수송체(transporter)를 의미한다. 상기 할로로돕신을 가지고 있는 세포가 노란 빛을 받으면, 할로로돕신이 Cl-를 세포 안으로 유입시켜, 세포는 과분극(hyperpolarize)이 일어나게 된다. 또한, 상기 할로로돕신은 빛에 반응하여 이온을 조절할 수 있는 한 적절한 변형이 이루어 질 수 있다. 변형은 이온 채널을 구성하는 단백질의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의해 이루어 질 수 있다. 또한, 빛에 반응하여 이온을 조절할 수 있는 한 할로로돕신을 코딩하는 핵산의 부가, 치환 또는 결실에 의해 변형될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "벡터"는 유전자를 세포에 전달하는 매개체 DNA로서, 클로닝 운반체(cloning vehicle)라고도 한다. 또한, 상기 벡터는 플라스미드, 파지 유래의 DNA 또는 바이러스 유래의 DNA를 이용할 수 있다. 일 구체예로는 바이러스 유래의 DNA가 이용될 수 있으며, 아데노 바이러스 유래의 AAV(adeno-associated virus)가 이용될 수 있다. 또한, 상기 벡터는 멀티클로닝사이트(multicloning site, MCS)를 포함할 수 있다. 멀티클로닝사이트는 여러가지 제한효소(restriction enzyme)이 인식하여 절단할 수 있는 핵산서열을 가지고 있는 DNA이다. 이때, 제한 효소는 EcoRI, BamHI, BgIII 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 다른 양상은 이극 세포에 제1 벡터를 도입하는 단계에 있어서, 상기 제1 벡터는 ON 이극세포에 특이적으로 발현하는 프로모터, 제1 표적 유전자 및 Cre 유전자를 포함하는 것인 단계; 및 이극 세포에 제2 벡터를 도입하는 단계에 있어서, 상기 제2 벡터는 ON/OFF 이극세포에 발현하는 프로모터, 제2 표적 유전자 및 loxP 서열을 포함하는 것인 단계를 포함하는 이극 세포에서 제1 표적 유전자 및 제2 표적 유전자를 선택적으로 발현시키는 방법을 제공한다.
상기 유전자를 선택적으로 발현시키는 방법을 상세히 설명하면 다음과 같다. 먼져, 상기 방법은 ON 이극세포에 특이적으로 발현하는 프로모터, 제1 표적 유전자 및 Cre 유전자를 포함하는 제1 벡터를 이극세포에 도입하는 단계를 포함한다. 이때, 상기 ON 이극세포에 특이적으로 발현하는 프로모터는 이극 세포중 OFF 이극세포에서는 발현을 하지 않으며, ON 이극세포에서만 발현을 하는 유전자에서 유래하는 프로모터일 수 있다. 일 구체예로는 대사성 글루타민산염 수용체 6(mGluR6)를 코딩하는 유전자의 발현을 조절하는 프로모터일 수 있다. 또한, 상기 제1 표적 유전자는 채널로돕신일 수 있다. 상기 채널로돕신은 녹조류에서 발견되는 채널로돕신 2 일 수 있다. 또는 상기 채널로돕신은 VChr1 일 수 있다. 상기에서 사용되는 벡터는 바이러스 유래의 벡터일 수 있으며, 일 구체예로는 아데노 바이러스에서 유래한 벡터일 수 있다.
또한, 이후 ON/OFF 이극세포에 발현하는 프로모터, 제2 표적 유전자 및 loxP 서열을 포함하는 제2 벡터를 이극세포에 도입하는 단계를 포함한다. 상기 ON/OFF 이극세포에 특이적으로 발현하는 프로모터는 이극 세포중 OFF 이극세포와 ON 이극세포에서 발현을 하는 유전자에서 유래하는 프로모터일 수 있다. 일 구체예로는 호메오박스를 포함하는 전사인자 10(homeobox-containing transcription factor 10, CHX10)를 코딩하는 유전자의 발현을 조절하는 프로모터일 수 있다. 또한, 상기 제2 표적 유전자는 OFF 이극세포에서 특이적으로 발현시키기 위한 유전자를 의미한다. 상기 제2 표적 유전자는 할로로돕신일 수 있다. 상기에서 사용되는 벡터는 바이러스 유래의 벡터일 수 있으며, 일 구체예로는 아데노 바이러스에서 유래한 벡터일 수 있다.
상기에서 도입은 제1 벡터 및 제2 벡터를 직접 이극세포에 접촉시킴으로써 세포내로 도입시킬 수 있다. 이때, 이극세포는 망막내에 존재할 경우 제1 벡터 및 제2 벡터를 망막으로 주입하여 이극세포로 상기 벡터를 도입할 수 있다. 망막으로 주입하는 방법은 망막 내외부에서 주사를 이용하여 주입될 수 있으며, 망막하에서 주입될 수 있다. 그러나, 이극세포에 상기 벡터가 도달할 수 있다면 통상의 모든 방법이 적용가능하다.
일 구체예에 따르면, 아데노 바이러스 유래의 벡터를 사용하고, 제1 벡터는 ON 이극세포에서 발현하는 프로모터, 채널로돕신 2 및 Cre 유전자를 포함하고, 제2 벡터에는 ON/OFF 이극세포에서 발현하는 프로모터, 할로로돕신 및 두개의 loxP 서열을 포함할 수 있다. 이때, 제1 벡터가 이극세포로 도입되면, 이극세포의 크로모좀 내부로 제1 벡터에 있는 ON 이극세포에서 발현하는 프로모터, 채널로돕신 2 및 Cre 유전자가 도입되게 된다. 이때, 제2 벡터가 이극세포로 도입되면, ON/OFF 이극세포에서 발현하는 프로모터, 할로로돕신 및 두개의 loxP 서열이 도입되게 된다.
이때, 제2 벡터의 프로모터가 ON/OFF 이극세포에서 모두 발현하기 때문에, ON 이극세포와 OFF 이극세포에서는 할로로돕신이 발현되게 된다. 그러나, 제1 벡터는 ON 이극세포에서만 발현하게 되므로, ON 이극세포에서는 채널로돕신 2만이 발현하게 된다. 그러나, ON 이극세포에서는 제1 벡터에 의해 도입된 Cre 재조합효소가 함께 발현되고, 제2 벡터에 도입된 loxP 사이트를 인지하여 두개의 loxP 서열 사이에 있는 할로로돕신 유전자를 제거하게 된다. 따라서, ON 이극세포에서는 채널로돕신 2만이 발현되고, 할로로돕신은 발현되지 못하게 된다. 반면, OFF 이극세포에서는 제1 벡터가 발현되지 못하므로, 제2 벡터에 의해 할로로돕신만이 발현되게 된다.
본 발명은 기존의 방법과 달리 ON 이극세포와 OFF 이극세포에 동시에 선택적인 광유전자를 발현하도록 하여 시각신호 네트워크를 복원하게 함으로써 난치성 질환의 시각 장애인들에게 시각기능이 회복되도록 하는데 기여할 수 있다.
도 1은 채널로돕신의 빛에 대한 반응을 나타내는 것이다.
도 2는 바이러스에 의한 망막세포 감염 및 바이러스에 의해 감염된 망막세포의 시신경 신호를 측정하는 방법을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 3은 ON 이극세포에 도입하기 위한 ON AAV 벡터의 개열도 및 OFF 이극세포에 도입하기 위한 OFF AAV 벡터의 개열도를 나타낸 것이다.
도 4는 ON AAV에 ChR2와 YFP를 포함시켜 망막으로 유전자를 도입한 후 YFP의 발현을 확인한 것으로, 생쥐망막에서 마커 단백질인 Goa 와의 중첩 정도를 통해 ON 이극세포에서의 발현 선택성을 검증한 것을 나타낸다.
도 5는 광수용체 손상 생쥐모델인 FVB 생쥐에 채널로돕신 AAV를 발현시키고, 광감응성이 회복되었는지 여부를 MEA (Microelectrode Arrays) 실험을 통해 검증한 것을 나타낸다.
도 2는 바이러스에 의한 망막세포 감염 및 바이러스에 의해 감염된 망막세포의 시신경 신호를 측정하는 방법을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 3은 ON 이극세포에 도입하기 위한 ON AAV 벡터의 개열도 및 OFF 이극세포에 도입하기 위한 OFF AAV 벡터의 개열도를 나타낸 것이다.
도 4는 ON AAV에 ChR2와 YFP를 포함시켜 망막으로 유전자를 도입한 후 YFP의 발현을 확인한 것으로, 생쥐망막에서 마커 단백질인 Goa 와의 중첩 정도를 통해 ON 이극세포에서의 발현 선택성을 검증한 것을 나타낸다.
도 5는 광수용체 손상 생쥐모델인 FVB 생쥐에 채널로돕신 AAV를 발현시키고, 광감응성이 회복되었는지 여부를 MEA (Microelectrode Arrays) 실험을 통해 검증한 것을 나타낸다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 형질전환용 벡터의 제작
1.1.
ON
-
AAV
벡터 제작
이극 세포중 ON 이극세포에서 발현하는 벡터를 제작하였다. 발현벡터는 pAAV-MCS 벡터(adeno-associated virus multicloning site vector)(Stratagene, 서열 번호 1)를 기반으로 하였다. 먼져, pAAV-MCS 벡터의 CMV 프로모터 부위를 위치지정 돌연변이(site-directed mutagenesis) 방법으로 제거하였다. 이는 EzChangeTM mutagenesis kit(Enzynomics, Korea)를 통하여 수행하였다. 반응 조건은 10X 반응 버퍼(Reaction buffer) 5 ㎕, DNA 폴리머라아제로 nPfu-Forte(Cat. # P410, P425)(2.5 units/㎕) 1 ㎕, dNTP 혼합물 (dATP, dTTP, dCTP, 및 dGTP 각각 2 mM) 4 ㎕, pAAV-MCS 벡터 1 ㎕, 프라이머 1(서열 번호 11 : TCGCGTGCGGCCGCAGGAAC) (10 pmol/㎕) 1 ㎕, 프라이머 2 ( 서열 번호 12: GAATTCCCCGGGGATCCTCT)(10 pmol/㎕) 1 ㎕, 전체가 50 ㎕ 증류수를 혼합하였다. 그 후, 95℃에서 2분 동안 가열시킨 후, 95℃에서 30초, 55℃에서 45초, 72℃에서 2분으로 25사이클 반복한 후, 2℃에서 5분 동안 반응시켰다.
상기에서 수득한 CMV가 제거된 pAAV-MCS 벡터에 mGluR6 프로모터(서열번호 2)를 도입하였다. 이때, mGluR6를 포함하는 벡터(addgene #18817)를 서열번호 13(GAATTCGATCTCCAGA TGGCTAAACT) 및 서열번호 14(GAATTCCAACCAGTCTTGTTTGAGCC)를 갖는 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 그 후, 증폭 산물을 EcoRI으로 절단한 후 증폭 산물을 수득하였다. 또한, CMV가 제거된 pAAV-MCS 벡터를 EcoRI으로 절단하여 수득하였다. 그 후, mGluR6 프로모터와 CMV가 제거된 pAAV-MCS 벡터를 혼합한 후 리가아제로 결합하였다.
또한, 상기에서 mGluR6 프로모터가 결합된 pAAV-MCS 벡터에 Chr2-YFP 서열(서열번호 3)을 도입하였다. 이때, YFP는 황색 형광 단백질을 의미한다. 이때, Chr2-YFP 서열을 포함하는 벡터(addgene #20298)를 서열번호 15(GGATCCCCACCATGGGACTATGGCGGC) 및 서열번호 16(GGATCCCTTGTACAGCTCGTCCATGC)를 갖는 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 그 후, 증폭 산물을 BamHI로 절단한 후 증폭 산물을 수득하였다. 또한, mGluR6 프로모터가 결합된 pAAV-MCS 벡터를 BamHI로 절단하여 수득하였다. 그 후, Chr2-YFP 서열과 mGluR6 프로모터가 결합된 pAAV-MCS 벡터를 혼합한 후 리가아제로 결합하였다.
또한, 상기에서 mGluR6 프로모터 및 Chr2-YFP 서열이 결합된 pAAV-MCS 벡터에 Cre recombinase 서열(서열번호 4)을 도입하였다. 이때, Cre 유전자를 포함하는 벡터(pxCan-Cre)를 서열번호 17(AGATCTATGAGCGGCCCTCCAAAAAA) 및 서열번호 18(AGATCTCTAATCGCCATCTTCCAGCAGGC)를 갖는 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 그 후, 증폭 산물을 BglII로 절단한 후 증폭 산물을 수득하였다. 또한, mGluR6 프로모터 및 Chr2-YFP 서열이 결합된 pAAV-MCS 벡터를 BglII로 절단하여 수득하였다. 그 후, Cre recombinase 서열과 mGluR6 프로모터 및 Chr2-YFP 서열이 결합된 pAAV-MCS 벡터를 혼합한 후 리가아제로 결합하였다.
또한, 상기에서 얻은 Cre recombinase 서열, mGluR6 프로모터 및 Chr2-YFP 서열이 결합된 pAAV-MCS 벡터에 2A 서열(서열 5)을 위치지정 돌연변이 방법을 통하여 삽입하였다. 상기에서 CMV 프로모터를 제거하는 방법과 동일한 방법을 수행하였다. 다만, 이때, 프라이머는 서열번호 19(caggctggagacgtggaggagaaccctggacct atgagcggccctccaaaaaa) 및 서열번호 20(cttcagcaggctgaagttagtagctccgcttcc cttgtacagctcgtccatgc)을 갖는 프라이머를 사용하였다. 다만, 주형은 Cre recombinase 서열, mGluR6 프로모터 및 Chr2-YFP 서열이 결합된 pAAV-MCS 벡터를 사용하였다. 이러한 방법으로 Cre recombinase 서열, mGluR6 프로모터, 2A 서열 및 Chr2-YFP 서열이 결합된 pAAV-MCS 벡터의 서열(서열번호 6)을 확인하였고, 이를 ON-AAV라 명명하였다.
1.2.
OFF
-
AAV
벡터 제작
이극 세포중 OFF 이극세포에서 발현하는 벡터를 제작하였다. 발현벡터는 pAAV-MCS 벡터(Stratagene, 서열 번호 1)를 기반으로 하였다. 먼져, pAAV-MCS 벡터의 CMV 프로모터 부위를 위치지정 돌연변이(site-directed mutagenesis) 방법으로 제거하였다. 이는 EzChangeTM mutagenesis kit(Enzynomics, Korea)를 통하여 수행하였다. 반응 조건은 10X 반응 버퍼(Reaction buffer) 5 ㎕, DNA 폴리머라아제로 nPfu-Forte(Cat. # P410, P425)(2.5 units/㎕) 1 ㎕, dNTP 혼합물 (dATP, dTTP, dCTP, 및 dGTP 각각 2 mM) 4 ㎕, pAAV-MCS 벡터 5 ㎕(적절한지 확인하여 주시기 바랍니다), 프라이머 1(서열 번호 11 : TCGCGTGCGGCCGCAGGAAC) (10 pmol/㎕) 1 ㎕, 프라이머 2 ( 서열 번호 12: GAATTCCCCGGGGATCCTCT)(10 pmol/㎕) 1 ㎕, 전체가 50 ㎕ 증류수를 혼합하였다. 그 후, 95℃에서 2분 동안 가열시킨 후, 95℃에서 30초, 55℃에서 45초, 72℃에서 2분으로 25사이클 반복한 후, 2℃에서 5분 동안 반응시켰다.
상기에서 수득한 CMV가 제거된 pAAV-MCS 벡터에 CHX10 프로모터(서열번호 7)를 도입하였다. 이때, CHX10 프로모터를 포함하는 벡터(addgene #18811)를 서열번호 21(GAATTCGAGAAGAGCACTGG) 및 서열번호 22(GAATTCAAGCTTTTTGCAAAAGCCTA)를 갖는 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 그 후, 증폭 산물을 EcoRI으로 절단한 후 증폭 산물을 수득하였다. 또한, CMV가 제거된 pAAV-MCS 벡터를 EcoRI으로 절단하여 수득하였다. 그 후, CHX10 프로모터와 CMV가 제거된 pAAV-MCS 벡터를 혼합한 후 리가아제로 결합하였다.
또한, 상기에서 CHX10 프로모터가 결합된 pAAV-MCS 벡터에 NpHR-mCherry 서열(서열번호 3)을 도입하였다. 이때, mCherry는 적색 형광 단백질을 의미한다. 이때, NpHR-mCherry 서열을 포함하는 벡터(Addgene, #26966에서 YFP를 mCherry로 치환)를 서열번호 23(GGATCCCCACCATGGACAGAGACCCTG) 및 서열번호 24(GGATCCTCACTTGTACAGCTCGTCCA)를 갖는 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 그 후, 증폭 산물을 BamHI로 절단한 후 증폭 산물을 수득하였다. 또한, CHX10 프로모터가 결합된 pAAV-MCS 벡터를 BamHI로 절단하여 수득하였다. 그 후, NpHR-mCherry 서열과 CHX10 프로모터가 결합된 pAAV-MCS 벡터를 혼합한 후 리가아제로 결합하였다.
또한, 상기에서 얻은 NpHR-mCherry 서열과 CHX10 프로모터가 결합된 pAAV-MCS 벡터에 loxP 서열(서열 9)을 위치지정 돌연변이 방법을 통하여 삽입하였다. 상기에서 CMV 프로모터를 제거하는 방법과 동일한 방법을 수행하였다. 다만, 이때, N 말단과 C 말단 두 부분에 위치지정 돌연변이를 통하여 loxP 서열을 도입하였다. 이를 위하여 프라이머는 서열번호 25(ACATTATACGAAGTTATAGATCTACGGGTGGCATCCC) 및 서열번호 26(ATGCTATACGAAGTTATTCACTTGTACAGCTCGTCCA)을 갖는 프라이머를 사용하였다. 또한, 서열번호 27(ACATTATACGAAGTTATCCACCATGACAGAGACCCTG) 및 서열번호 28(ATGCTATACGAAGTTAAAGCTTTTTGCAAAAGCCTA)을 갖는 프라이머를 사용하였다. 다만, 주형은 NpHR-mCherry 서열과 CHX10 프로모터가 결합된 pAAV-MCS 벡터를 사용하였다. 이러한 방법으로 NpHR-mCherry 서열과 CHX10 프로모터 및 loxP 서열이 결합된 pAAV-MCS 벡터의 서열(서열번호 10)을 확인하였고, 이를 OFF-AAV라 명명하였다.
실시예
2. 형질전환용 벡터의 도입
실시예 1에서 제작한 ON-AAV 벡터 및 ON-AAV 벡터를 혼합한 후 마우스 안구에 직접 주입하여, 마우스의 안구를 ON-AAV 및 ON-AAV로 감염시켰다. 상기 바이러스 벡터로 감염된 마우스는 격리시켜 2주 동안 격리시켜 키웠다. 이때, 마우스는 BALB/c 마우스를 이용하였다. 이때, 마우스는 대한바이오링크에서 구입하였다. 또한, Balb/c 마우스는 안구가 투명하여 바이러스 주입시 내부가 잘 보이기 때문에 사용하였습니다. 그리고, 바이러스가 PBS(phosphate bufferd saline) 용액에 넣어 사용하였다.
실시예
3.
이극세포에서
도입된 벡터의 발현 확인
3.1. 마우스 안구에서
이극
세포 추출 및 단백질 발현 여부 확인
상기 마우스에서 YFP 및 Goα 단백질의 발현을 확인하기 위하여 ON-AAV 벡터를 주입한 후 2주 후에 공초점 현미경을 이용하여 면역조직화학법으로 컨포컬 이지밍(confocal imaging)을 수행하였다.
먼저, 마우스에 마취제를 주사하여 마취를 시켰다. 마취제는 zoletil 및 ruompun을 3:1로 혼합한 것을 사용하였다. 그 후, 스트레이트 포셉(forceps)으로 안구를 적출하였다. 아이볼(eye ball)에 구멍을 내고 미세가위로 주위를 돌려 절제하여 아이컵을 획득하였다. 아이컵(eyecup)을 해부한 후, pH 7.4의 0.1 mol/L 포스페이트 버퍼에 4% 파라포름알데히드가 들어있는 용액에 담갔다. 그후, 렌즈를 제거하고, 공막(sclera)과 망막색소상피(retinal pigment epithelium, RPE)와 망막을 분리하였다. 망막을 Nylon mesh(mettler toledo, USA) 위에 올려놓았다. 그 후, 버퍼 용액을 필터 페이퍼를 이용하여 제거하였다. 그 후, 망막을 Nylon mesh를 바르게 펴서 위치시켰다. 그후, 포셉 및 필터 페이퍼를 이용하여 유리체(vitreous body)를 제거하였다. 그후, 버퍼 용액을 필터 페이퍼를 이용하여 제거하였다.
조직에 밤새도록 수크로오즈가 스며들었으며, 이것들은 다음날 드라이 아이스에서 적당한 절단 온도 컴파운드(optimal cutting temperature compound )에서 동결하였다. 조직을 Microm HM 525 cryostat (Thermo Scientific, Walthman, MA, USA)을 이용하여 10 마이크론으로 연속하여 절단하였다. 절단된 조직을 래빗 항-그린 플루오레슨스 단백질(GFP 및 이의 변이체), IgG (dilution 1:200; Abcam, Cambridge, MA, USA) 및 mouse anti-Goα IgG (dilution 1:200; Abcam, Cambridge, MA, USA)에 대한 1차 항체로 면역표지 되었다. 이때, 상기 항체는 3% 우태아혈청 알부민과 5% 정상 염소 혈청(normal goat serum)을 포함한 블럭킹 용액(blocking solution)으로 희석되었다.
그 후, 상기 안구 절편은 chick IgY (Jackson ImmunoResearch Laboratory, West Grove, PA, USA; Alexa Fluor 488, dilution, 1:500) 및 마우스 IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratory, West Grove, PA, USA; Alexa Fluor 555, dilution, 1:500)에 대한 2차 항체로 인큐베이션되었다.
그후, 최종적으로 상기 절편은 세척한 후 DAPI를 포함한 안티페이딩 마운트 배지(antifading mounting medium)로 슬라이드 글라스에 올려진 후, Nikon A1 confocal microscope로 관찰하였다. 그 결과, 도면 4에서 보는 바와 같이 삽입된 단백질이 발현함을 확인하였다.
3.2.
이극
세포에서
광자극에
따른 신호 검출
Laser Photo-stimulation system에서 광자극에 따른 시신경 신호를 측정하였다. 상기에서 기술한 마우스 안구에서 안구를 적출하고, 분리한 망막을, 망막 절세포(retinal ganglion cell, RGC) 쪽을 아래로 가게 하여 MEA 전극에 위치시켰다. 그 후, Nyloon string Anchor를 위에 덮고, aerated ames medium을 MEA 전극에 순환시켰다. 그후, multi-electrode array에다가 적출한 망막 조직을 올린 후, 광자극을 주었다. 그 후, 256 channel MEA amplifier 위에 MEA 전극을 위치시키고, 광자극을 주며 신호를 측정하였다. 광자극은 13 mW/mm2 의 세기, 473 nm 파장의 빛으로 가했으며 자극의 주기는 5초로 2초간의 자극(ON 구간)과 3초간의 자극 정지(OFF 구간)가 반복되도록 하였다. 신호의 측정은 10 kHz의 Sampling Rate로 수행하였고 200Hz 고대역 통과 필터와 와 60Hz 의 노치필터로 신호를 처리한 후 분석하였다. 결과, 빛을 준 2초의 ON 구간 동안 신경 신호가 생성되었다가 빛을 껐을 경우에는 신경 신호가 없어짐을 확인하였다.
본 발병은 망막에 존재하는 ON 또는 OFF 이극세포에 선택적으로 광유전자를 발현시키기 위한 방법으로, 구체적으로는 ON 이극세포만에 빛에 반응하는 채널로돕신을 발현시킬 경우 광수용체가 없이도 빛을 감지할 수 있다. 즉, 광자극에 의해 탈분극되는 채널로돕신을 동일한 시각신호를 생성하는 ON 이극세포에서 발현시키고, 광자극에 의해 과분극되는 할로로돕신을 OFF 이극세포에 선택적으로 발현시킨다면, 기존의 시각신호 네트워크를 복원하는 효과를 가질 것으로 기대되며, 이러한 방법을 이용할 경우 광수용체가 사멸하는 질환에 효과적인 치료방법으로 활용될 수 있을 것이다.
<110> Korea Institute of science and technology
<120> A method for selective gene expression in the retinal ON/OFF
bipolar cell
<130> PN101
<160> 16
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 4650
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pAAV-MCS
<400> 1
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120
actccatcac taggggttcc tgcggccgca cgcgtggagc tagttattaa tagtaatcaa 180
ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa 240
atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg 300
ttcccatagt aacgtcaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt 360
aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg 420
tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc 480
ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc 540
agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca 600
ttgacgtcaa tgggagtttg ttttgcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa 660
caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag 720
cagagctcgt ttagtgaacc gtcagatcgc ctggagacgc catccacgct gttttgacct 780
ccatagaaga caccgggacc gatccagcct ccgcggattc gaatcccggc cgggaacggt 840
gcattggaac gcggattccc cgtgccaaga gtgacgtaag taccgcctat agagtctata 900
ggcccacaaa aaatgctttc ttcttttaat atactttttt gtttatctta tttctaatac 960
tttccctaat ctctttcttt cagggcaata atgatacaat gtatcatgcc tctttgcacc 1020
attctaaaga ataacagtga taatttctgg gttaaggcaa tagcaatatt tctgcatata 1080
aatatttctg catataaatt gtaactgatg taagaggttt catattgcta atagcagcta 1140
caatccagct accattctgc ttttatttta tggttgggat aaggctggat tattctgagt 1200
ccaagctagg cccttttgct aatcatgttc atacctctta tcttcctccc acagctcctg 1260
ggcaacgtgc tggtctgtgt gctggcccat cactttggca aagaattggg attcgaacat 1320
cgattgaatt ccccggggat cctctagagt cgacctgcag aagcttgcct cgagcagcgc 1380
tgctcgagag atctacgggt ggcatccctg tgacccctcc ccagtgcctc tcctggccct 1440
ggaagttgcc actccagtgc ccaccagcct tgtcctaata aaattaagtt gcatcatttt 1500
gtctgactag gtgtccttct ataatattat ggggtggagg ggggtggtat ggagcaaggg 1560
gcaagttggg aagacaacct gtagggcctg cggggtctat tgggaaccaa gctggagtgc 1620
agtggcacaa tcttggctca ctgcaatctc cgcctcctgg gttcaagcga ttctcctgcc 1680
tcagcctccc gagttgttgg gattccaggc atgcatgacc aggctcagct aatttttgtt 1740
tttttggtag agacggggtt tcaccatatt ggccaggctg gtctccaact cctaatctca 1800
ggtgatctac ccaccttggc ctcccaaatt gctgggatta caggcgtgaa ccactgctcc 1860
cttccctgtc cttctgattt tgtaggtaac cacgtgcgga ccgagcggcc gcaggaaccc 1920
ctagtgatgg agttggccac tccctctctg cgcgctcgct cgctcactga ggccgggcga 1980
ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc 2040
agctgcctgc aggggcgcct gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg cggtatttca 2100
caccgcatac gtcaaagcaa ccatagtacg cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg 2160
gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt 2220
tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc 2280
gggggctccc tttagggttc cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg 2340
atttgggtga tggttcacgt agtgggccat cgccctgata gacggttttt cgccctttga 2400
cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca aactggaaca acactcaacc 2460
ctatctcggg ctattctttt gatttataag ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa 2520
aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg cgaattttaa caaaatatta acgtttacaa 2580
ttttatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc cagccccgac 2640
acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct gctcccggca tccgcttaca 2700
gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag gttttcaccg tcatcaccga 2760
aacgcgcgag acgaaagggc ctcgtgatac gcctattttt ataggttaat gtcatgataa 2820
taatggtttc ttagacgtca ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt 2880
gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa 2940
tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta tgagtattca acatttccgt gtcgccctta 3000
ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag 3060
taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca 3120
gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg agcactttta 3180
aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc 3240
gccgcataca ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc 3300
ttacggatgg catgacagta agagaattat gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca 3360
ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc 3420
acaacatggg ggatcatgta actcgccttg atcgttggga accggagctg aatgaagcca 3480
taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac 3540
tattaactgg cgaactactt actctagctt cccggcaaca attaatagac tggatggagg 3600
cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg 3660
ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg 3720
gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag tcaggcaact atggatgaac 3780
gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc 3840
aagtttactc atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct 3900
aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc 3960
actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc 4020
gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg 4080
atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa 4140
atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc 4200
ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt 4260
gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa 4320
cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc 4380
tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc 4440
cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct 4500
ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat 4560
gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc 4620
tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt 4650
<210> 2
<211> 200
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mGluR6 promoter
<400> 2
gatctccaga tggctaaact tttaaatcat gaatgaagta gatattacca aattgctttt 60
tcagcatcca tttagataat catgtttttt gcctttaatc tgttaatgta gtgaattaca 120
gaaatacatt tcctaaatca ttacatcccc caaatcgtta atctgctaaa gtacatctct 180
ggctcaaaca agactggttg 200
<210> 3
<211> 1718
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chr2-YFP
<400> 3
ccaccatgga ctatggcggc gctttgtctg ccgtcggacg cgaacttttg ttcgttacta 60
atcctgtggt ggtgaacggg tccgtcctgg tccctgagga tcaatgttac tgtgccggat 120
ggattgaatc tcgcggcacg aacggcgctc agaccgcgtc aaatgtcctg cagtggcttg 180
cagcaggatt cagcattttg ctgctgatgt tctatgccta ccaaacctgg aaatctacat 240
gcggctggga ggagatctat gtgtgcgcca ttgaaatggt taaggtgatt ctcgagttct 300
tttttgagtt taagaatccc tctatgctct accttgccac aggacaccgg gtgcagtggc 360
tgcgctatgc agagtggctg ctcacttgtc ctgtcatcct tatccgcctg agcaacctca 420
ccggcctgag caacgactac agcaggagaa ccatgggact ccttgtctca gacatcggga 480
ctatcgtgtg gggggctacc agcgccatgg caaccggcta tgttaaagtc atcttctttt 540
gtcttggatt gtgctatggc gcgaacacat tttttcacgc cgccaaagca tatatcgagg 600
gttatcatac tgtgccaaag ggtcggtgcc gccaggtcgt gaccggcatg gcatggctgt 660
ttttcgtgag ctggggtatg ttcccaattc tcttcatttt ggggcccgaa ggttttggcg 720
tcctgagcgt ctatggctcc accgtaggtc acacgattat tgatctgatg agtaaaaatt 780
gttgggggtt gttgggacac tacctgcgcg tcctgatcca cgagcacata ttgattcacg 840
gagatatccg caaaaccacc aaactgaaca tcggcggaac ggagatcgag gtcgagactc 900
tcgtcgaaga cgaagccgag gccggagccg tgccagcggc cgccaagagc aggatcacca 960
gcgagggcga gtacatcccc ctggaccaga tcgacatcaa cgtggtgagc aagggcgagg 1020
agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca 1080
agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg accctgaagt 1140
tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc accttcggct 1200
acggcctgca gtgcttcgcc cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt 1260
ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact 1320
acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga 1380
agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca caagctggag tacaactaca 1440
acagccacaa cgtctatatc atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca 1500
agatccgcca caacatcgag gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca 1560
cccccatcgg cgacggcccc gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc taccagtccg 1620
ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg 1680
ccgccgggat cactctcggc atggacgagc tgtacaag 1718
<210> 4
<211> 1083
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nlsCre
<400> 4
atgagcggcc ctccaaaaaa gaagagaaag gtagaagacc cgggcggccg catgtccaat 60
ttactgaccg tacaccaaaa tttgcctgca ttaccggtcg atgcaacgag tgatgaggtt 120
cgcaagaacc tgatggacat gttcagggat cgccaggcgt tttctgagca tacctggaaa 180
atgcttctgt ccgtttgccg gtcgtgggcg gcatggtgca agttgaataa ccggaaatgg 240
tttcccgcag aacctgaaga tgttcgcgat tatcttctat atcttcaggc gcgcggtctg 300
gcagtaaaaa ctatccagca acatttgggc cagctaaaca tgcttcatcg tcggtccggg 360
ctgccacgac caagtgacag caatgctgtt tcactggtta tgcggcggat ccgaaaagaa 420
aacgttgatg ccggtgaacg tgcaaaacag gctctagcgt tcgaacgcac tgatttcgac 480
caggttcgtt cactcatgga aaatagcgat cgctgccagg atatacgtaa tctggcattt 540
ctggggattg cttataacac cctgttacgt atagccgaaa ttgccaggat cagggttaaa 600
gatatctcac gtactgacgg tgggagaatg ttaatccata ttggcagaac gaaaacgctg 660
gttagcaccg caggtgtaga gaaggcactt agcctggggg taactaaact ggtcgagcga 720
tggatttccg tctctggtgt agctgatgat ccgaataact acctgttttg ccgggtcaga 780
aaaaatggtg ttgccgcgcc atctgccacc agccagctat caactcgcgc cctggaaggg 840
atttttgaag caactcatcg attgatttac ggcgctaagg atgactctgg tcagagatac 900
ctggcctggt ctggacacag tgcccgtgtc ggagccgcgc gagatatggc ccgcgctgga 960
gtttcaatac cggagatcat gcaagctggt ggctggacca atgtaaatat tgtcatgaac 1020
tatatccgta acctggatag tgaaacaggg gcaatggtgc gcctgctgga agatggcgat 1080
tag 1083
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2A
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ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60
ggacct 66
<210> 6
<211> 6251
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ON-AAV
<400> 6
acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt 60
ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt 120
ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc 180
gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa 240
gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct 300
ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta 360
actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg 420
gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc 480
ctaactacgg ctacactaga aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta 540
ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg 600
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tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg 720
tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta 780
aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg 840
aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg 900
tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc 960
gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg 1020
agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg 1080
aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag 1140
gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat 1200
caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc 1260
cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc 1320
ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa 1380
ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac 1440
gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt 1500
cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc 1560
gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa 1620
caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca 1680
tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat 1740
acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa 1800
aagtgccacc tgacgtctaa gaaaccatta ttatcatgac attaacctat aaaaataggc 1860
gtatcacgag gccctttcgt ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca 1920
tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc agacaagccc 1980
gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggctg gcttaactat gcggcatcag 2040
agcagattgt actgagagtg caccataaaa ttgtaaacgt taatattttg ttaaaattcg 2100
cgttaaattt ttgttaaatc agctcatttt ttaaccaata ggccgaaatc ggcaaaatcc 2160
cttataaatc aaaagaatag cccgagatag ggttgagtgt tgttccagtt tggaacaaga 2220
gtccactatt aaagaacgtg gactccaacg tcaaagggcg aaaaaccgtc tatcagggcg 2280
atggcccact acgtgaacca tcacccaaat caagtttttt ggggtcgagg tgccgtaaag 2340
cactaaatcg gaaccctaaa gggagccccc gatttagagc ttgacgggga aagccggcga 2400
acgtggcgag aaaggaaggg aagaaagcga aaggagcggg cgctagggcg ctggcaagtg 2460
tagcggtcac gctgcgcgta accaccacac ccgccgcgct taatgcgccg ctacagggcg 2520
cgtactatgg ttgctttgac gtatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa 2580
ataccgcatc aggcgcccct gcaggcagct gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg 2640
ggcaaagccc gggcgtcggg cgacctttgg tcgcccggcc tcagtgagcg agcgagcgcg 2700
cagagaggga gtggccaact ccatcactag gggttcctgc ggccgctcgg tccgcacgtg 2760
gttacctaca aaatcagaag gacagggaag ggagcagtgg ttcacgcctg taatcccagc 2820
aatttgggag gccaaggtgg gtagatcacc tgagattagg agttggagac cagcctggcc 2880
aatatggtga aaccccgtct ctaccaaaaa aacaaaaatt agctgagcct ggtcatgcat 2940
gcctggaatc ccaacaactc gggaggctga ggcaggagaa tcgcttgaac ccaggaggcg 3000
gagattgcag tgagccaaga ttgtgccact gcactccagc ttggttccca atagaccccg 3060
caggccctac aggttgtctt cccaacttgc cccttgctcc ataccacccc cctccacccc 3120
ataatattat agaaggacac ctagtcagac aaaatgatgc aacttaattt tattaggaca 3180
aggctggtgg gcactggagt ggcaacttcc agggccagga gaggcactgg ggaggggtca 3240
cagggatgcc acccgtagat ctctaatcgc catcttccag caggcgcacc attgcccctg 3300
tttcactatc caggttacgg atatagttca tgacaatatt tacattggtc cagccaccag 3360
cttgcatgat ctccggtatt gaaactccag cgcgggccat atctcgcgcg gctccgacac 3420
gggcactgtg tccagaccag gccaggtatc tctgaccaga gtcatcctta gcgccgtaaa 3480
tcaatcgatg agttgcttca aaaatccctt ccagggcgcg agttgatagc tggctggtgg 3540
cagatggcgc ggcaacacca ttttttctga cccggcaaaa caggtagtta ttcggatcat 3600
cagctacacc agagacggaa atccatcgct cgaccagttt agttaccccc aggctaagtg 3660
ccttctctac acctgcggtg ctaaccagcg ttttcgttct gccaatatgg attaacattc 3720
tcccaccgtc agtacgtgag atatctttaa ccctgatcct ggcaatttcg gctatacgta 3780
acagggtgtt ataagcaatc cccagaaatg ccagattacg tatatcctgg cagcgatcgc 3840
tattttccat gagtgaacga acctggtcga aatcagtgcg ttcgaacgct agagcctgtt 3900
ttgcacgttc accggcatca acgttttctt ttcggatccg ccgcataacc agtgaaacag 3960
cattgctgtc acttggtcgt ggcagcccgg accgacgatg aagcatgttt agctggccca 4020
aatgttgctg gatagttttt actgccagac cgcgcgcctg aagatataga agataatcgc 4080
gaacatcttc aggttctgcg ggaaaccatt tccggttatt caacttgcac catgccgccc 4140
acgaccggca aacggacaga agcattttcc aggtatgctc agaaaacgcc tggcgatccc 4200
tgaacatgtc catcaggttc ttgcgaacct catcactcgt tgcatcgacc ggtaatgcag 4260
gcaaattttg gtgtacggtc agtaaattgg acataggtcc agggttctcc tccacgtctc 4320
cagcctgctt cagcaggctg aagttagtag ctccgcttcc cttgtacagc tcgtccatgc 4380
cgagagtgat cccggcggcg gtcacgaact ccagcaggac catgtgatcg cgcttctcgt 4440
tggggtcttt gctcagggcg gactggtagc tcaggtagtg gttgtcgggc agcagcacgg 4500
ggccgtcgcc gatgggggtg ttctgctggt agtggtcggc gagctgcacg ctgccgtcct 4560
cgatgttgtg gcggatcttg aagttcacct tgatgccgtt cttctgcttg tcggccatga 4620
tatagacgtt gtggctgttg tagttgtact ccagcttgtg ccccaggatg ttgccgtcct 4680
ccttgaagtc gatgcccttc agctcgatgc ggttcaccag ggtgtcgccc tcgaacttca 4740
cctcggcgcg ggtcttgtag ttgccgtcgt ccttgaagaa gatggtgcgc tcctggacgt 4800
agccttcggg catggcggac ttgaagaagt cgtgctgctt catgtggtcg gggtagcggg 4860
cgaagcactg caggccgtag ccgaaggtgg tcacgagggt gggccagggc acgggcagct 4920
tgccggtggt gcagatgaac ttcagggtca gcttgccgta ggtggcatcg ccctcgccct 4980
cgccggacac gctgaacttg tggccgttta cgtcgccgtc cagctcgacc aggatgggca 5040
ccaccccggt gaacagctcc tcgcccttgc tcaccacgtt gatgtcgatc tggtccaggg 5100
ggatgtactc gccctcgctg gtgatcctgc tcttggcggc cgctggcacg gctccggcct 5160
cggcttcgtc ttcgacgaga gtctcgacct cgatctccgt tccgccgatg ttcagtttgg 5220
tggttttgcg gatatctccg tgaatcaata tgtgctcgtg gatcaggacg cgcaggtagt 5280
gtcccaacaa cccccaacaa tttttactca tcagatcaat aatcgtgtga cctacggtgg 5340
agccatagac gctcaggacg ccaaaacctt cgggccccaa aatgaagaga attgggaaca 5400
taccccagct cacgaaaaac agccatgcca tgccggtcac gacctggcgg caccgaccct 5460
ttggcacagt atgataaccc tcgatatatg ctttggcggc gtgaaaaaat gtgttcgcgc 5520
catagcacaa tccaagacaa aagaagatga ctttaacata gccggttgcc atggcgctgg 5580
tagcccccca cacgatagtc ccgatgtctg agacaaggag tcccatggtt ctcctgctgt 5640
agtcgttgct caggccggtg aggttgctca ggcggataag gatgacagga caagtgagca 5700
gccactctgc atagcgcagc cactgcaccc ggtgtcctgt ggcaaggtag agcatagagg 5760
gattcttaaa ctcaaaaaag aactcgagaa tcaccttaac catttcaatg gcgcacacat 5820
agatctcctc ccagccgcat gtagatttcc aggtttggta ggcatagaac atcagcagca 5880
aaatgctgaa tcctgctgca agccactgca ggacatttga cgcggtctga gcgccgttcg 5940
tgccgcgaga ttcaatccat ccggcacagt aacattgatc ctcagggacc aggacggacc 6000
cgttcaccac cacaggatta gtaacgaaca aaagttcgcg tccgacggca gacaaagcgc 6060
cgccatagtc ccatggtggg gatccccggg gaattcacgc gtgcggccgc aggaacccct 6120
agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc 6180
aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag 6240
ctgcctgcag g 6251
<210> 7
<211> 390
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CHX10 promoter
<400> 7
gaattcgaga agagcactgg ctggggctgc ttgcccgcta atcccagctg ccattaaaat 60
attaaagata aatctaatcg tctctttatc caaaataagc gacttttgtg tggggagaaa 120
acgtctaacc ccttaggagg agaattagtt ctaatgcatc aaatggaatt gctcgagatc 180
tgcgatctgc atctcaatta gtcagcaacc atagtcccgc ccctaactcc gcccatcccg 240
cccctaactc cgcccagttc cgcccattct ccgccccatc gctgactaat tttttttatt 300
tatgcagagg ccgaggccgc ctcggcctct gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt 360
tttggaggcc taggcttttg caaaaagctt 390
<210> 8
<211> 1652
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NpHR-mCherry
<400> 8
ccaccatgac agagaccctg cctcccgtga ccgagagtgc cgtggccctt caagccgagg 60
ttacccaaag ggagttgttc gagttcgtgc tgaacgaccc tttgcttgca agcagtctct 120
atatcaacat cgcacttgca ggactgagta tactgctgtt cgtttttatg acccgaggac 180
tcgatgatcc acgggcaaaa cttattgctg tgtcaaccat ccttgtgcct gtcgtcagca 240
ttgcctccta cactggattg gcgagcggcc tgacaatttc cgttcttgaa atgccagcgg 300
gccattttgc agaaggcagc tcagtgatgc tgggaggaga agaggtagat ggtgtagtca 360
ccatgtgggg acggtatctc acctgggcac tttccacgcc catgattctc ctcgctctgg 420
gtctcctggc cggaagcaat gctacaaagc tcttcacagc tatcactttc gatatcgcta 480
tgtgcgtgac tggccttgcc gcggccctga ctacctcctc ccacctcatg agatggttct 540
ggtacgctat cagttgtgca tgctttctgg tggtcttgta tatcctgctg gtggagtggg 600
cacaggacgc caaagccgcg ggaaccgctg acatgttcaa taccctgaag ctgttgacag 660
tagtgatgtg gctggggtat ccaattgtgt gggctcttgg agtcgagggt atcgcggtgt 720
tgcccgttgg ggtgacgagc tggggatatt ctttcctgga tatcgtggca aagtacattt 780
tcgcattctt gctcctgaac tatctgacgt caaacgaatc tgtcgtgtcc ggcagcattt 840
tggatgttcc atctgcttct gggaccccgg ctgatgatgc ggccgccaag agcaggatca 900
ccagcgaggg cgagtacatc cccctggacc agatcgacat caacgtggtg agcaagggcg 960
aggaggataa catggccatc atcaaggagt tcatgcgctt caaggtgcac atggagggct 1020
ccgtgaacgg ccacgagttc gagatcgagg gcgagggcga gggccgcccc tacgagggca 1080
cccagaccgc caagctgaag gtgaccaagg gtggccccct gcccttcgcc tgggacatcc 1140
tgtcccctca gttcatgtac ggctccaagg cctacgtgaa gcaccccgcc gacatccccg 1200
actacttgaa gctgtccttc cccgagggct tcaagtggga gcgcgtgatg aacttcgagg 1260
acggcggcgt ggtgaccgtg acccaggact cctccctgca ggacggcgag ttcatctaca 1320
aggtgaagct gcgcggcacc aacttcccct ccgacggccc cgtaatgcag aagaagacca 1380
tgggctggga ggcctcctcc gagcggatgt accccgagga cggcgccctg aagggcgaga 1440
tcaagcagag gctgaagctg aaggacggcg gccactacga cgctgaggtc aagaccacct 1500
acaaggccaa gaagcccgtg cagctgcccg gcgcctacaa cgtcaacatc aagttggaca 1560
tcacctccca caacgaggac tacaccatcg tggaacagta cgaacgcgcc gagggccgcc 1620
actccaccgg cggcatggac gagctgtaca ag 1652
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> loxP
<400> 9
ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttat 34
<210> 10
<211> 5530
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> OFF-AAV
<400> 10
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120
actccatcac taggggttcc tgcggccgca cgcgtgaatt cgagaagagc actggctggg 180
gctgcttgcc cgctaatccc agctgccatt aaaatattaa agataaatct aatcgtctct 240
ttatccaaaa taagcgactt ttgtgtgggg agaaaacgtc taacccctta ggaggagaat 300
tagttctaat gcatcaaatg gaattgctcg agatctgcga tctgcatctc aattagtcag 360
caaccatagt cccgccccta actccgccca tcccgcccct aactccgccc agttccgccc 420
attctccgcc ccatcgctga ctaatttttt ttatttatgc agaggccgag gccgcctcgg 480
cctctgagct attccagaag tagtgaggag gcttttttgg aggcctaggc ttttgcaaaa 540
agcttataac ttcgtatagc atacattata cgaagttatc caccatgaca gagaccctgc 600
ctcccgtgac cgagagtgcc gtggcccttc aagccgaggt tacccaaagg gagttgttcg 660
agttcgtgct gaacgaccct ttgcttgcaa gcagtctcta tatcaacatc gcacttgcag 720
gactgagtat actgctgttc gtttttatga cccgaggact cgatgatcca cgggcaaaac 780
ttattgctgt gtcaaccatc cttgtgcctg tcgtcagcat tgcctcctac actggattgg 840
cgagcggcct gacaatttcc gttcttgaaa tgccagcggg ccattttgca gaaggcagct 900
cagtgatgct gggaggagaa gaggtagatg gtgtagtcac catgtgggga cggtatctca 960
cctgggcact ttccacgccc atgattctcc tcgctctggg tctcctggcc ggaagcaatg 1020
ctacaaagct cttcacagct atcactttcg atatcgctat gtgcgtgact ggccttgccg 1080
cggccctgac tacctcctcc cacctcatga gatggttctg gtacgctatc agttgtgcat 1140
gctttctggt ggtcttgtat atcctgctgg tggagtgggc acaggacgcc aaagccgcgg 1200
gaaccgctga catgttcaat accctgaagc tgttgacagt agtgatgtgg ctggggtatc 1260
caattgtgtg ggctcttgga gtcgagggta tcgcggtgtt gcccgttggg gtgacgagct 1320
ggggatattc tttcctggat atcgtggcaa agtacatttt cgcattcttg ctcctgaact 1380
atctgacgtc aaacgaatct gtcgtgtccg gcagcatttt ggatgttcca tctgcttctg 1440
ggaccccggc tgatgatgcg gccgccaaga gcaggatcac cagcgagggc gagtacatcc 1500
ccctggacca gatcgacatc aacgtggtga gcaagggcga ggaggataac atggccatca 1560
tcaaggagtt catgcgcttc aaggtgcaca tggagggctc cgtgaacggc cacgagttcg 1620
agatcgaggg cgagggcgag ggccgcccct acgagggcac ccagaccgcc aagctgaagg 1680
tgaccaaggg tggccccctg cccttcgcct gggacatcct gtcccctcag ttcatgtacg 1740
gctccaaggc ctacgtgaag caccccgccg acatccccga ctacttgaag ctgtccttcc 1800
ccgagggctt caagtgggag cgcgtgatga acttcgagga cggcggcgtg gtgaccgtga 1860
cccaggactc ctccctgcag gacggcgagt tcatctacaa ggtgaagctg cgcggcacca 1920
acttcccctc cgacggcccc gtaatgcaga agaagaccat gggctgggag gcctcctccg 1980
agcggatgta ccccgaggac ggcgccctga agggcgagat caagcagagg ctgaagctga 2040
aggacggcgg ccactacgac gctgaggtca agaccaccta caaggccaag aagcccgtgc 2100
agctgcccgg cgcctacaac gtcaacatca agttggacat cacctcccac aacgaggact 2160
acaccatcgt ggaacagtac gaacgcgccg agggccgcca ctccaccggc ggcatggacg 2220
agctgtacaa gtgaataact tcgtatagca tacattatac gaagttatag atctacgggt 2280
ggcatccctg tgacccctcc ccagtgcctc tcctggccct ggaagttgcc actccagtgc 2340
ccaccagcct tgtcctaata aaattaagtt gcatcatttt gtctgactag gtgtccttct 2400
ataatattat ggggtggagg ggggtggtat ggagcaaggg gcaagttggg aagacaacct 2460
gtagggcctg cggggtctat tgggaaccaa gctggagtgc agtggcacaa tcttggctca 2520
ctgcaatctc cgcctcctgg gttcaagcga ttctcctgcc tcagcctccc gagttgttgg 2580
gattccaggc atgcatgacc aggctcagct aatttttgtt tttttggtag agacggggtt 2640
tcaccatatt ggccaggctg gtctccaact cctaatctca ggtgatctac ccaccttggc 2700
ctcccaaatt gctgggatta caggcgtgaa ccactgctcc cttccctgtc cttctgattt 2760
tgtaggtaac cacgtgcgga ccgagcggcc gcaggaaccc ctagtgatgg agttggccac 2820
tccctctctg cgcgctcgct cgctcactga ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc 2880
gggctttgcc cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agctgcctgc aggggcgcct 2940
gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg cggtatttca caccgcatac gtcaaagcaa 3000
ccatagtacg cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc 3060
gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt 3120
ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc tttagggttc 3180
cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg atttgggtga tggttcacgt 3240
agtgggccat cgccctgata gacggttttt cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt 3300
aatagtggac tcttgttcca aactggaaca acactcaacc ctatctcggg ctattctttt 3360
gatttataag ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa 3420
aaatttaacg cgaattttaa caaaatatta acgtttacaa ttttatggtg cactctcagt 3480
acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc cagccccgac acccgccaac acccgctgac 3540
gcgccctgac gggcttgtct gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc 3600
gggagctgca tgtgtcagag gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag acgaaagggc 3660
ctcgtgatac gcctattttt ataggttaat gtcatgataa taatggtttc ttagacgtca 3720
ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat 3780
tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa 3840
aggaagagta tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt 3900
tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag 3960
ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt 4020
tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg 4080
gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag 4140
aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta 4200
agagaattat gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg 4260
acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta 4320
actcgccttg atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac 4380
accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt 4440
actctagctt cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca 4500
cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag 4560
cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta 4620
gttatctaca cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag 4680
ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt 4740
tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat 4800
aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta 4860
gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa 4920
acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt 4980
tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag 5040
ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta 5100
atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca 5160
agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag 5220
cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa 5280
agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga 5340
acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc 5400
gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc 5460
ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt 5520
gctcacatgt 5530
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer 1
<400> 11
tcgcgtgcgg ccgcaggaac 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer 2
<400> 12
gaattccccg gggatcctct 20
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 13
gaattcgatc tccagatggc taaact 26
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 14
gaattccaac cagtcttgtt tgagcc 26
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 15
ggatccccac catgggacta tggcggc 27
<210> 16
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 16
ggatcccttg tacagctcgt ccatgc 26
Claims (12)
- ON 이극세포에 특이적으로 발현하는 프로모터, 제1 표적 유전자 및 Cre 유전자를 포함하는 제1 벡터 및 ON/OFF 이극세포에 발현하는 프로모터, 제2 표적 유전자 및 loxP 서열을 포함하는 제2 벡터를 포함하는 이극세포에서 선택적 유전자 발현용 키트.
- 청구항 1에 있어서, 상기 ON 이극세포에 특이적으로 발현하는 프로모터는 mGluR6 프로모터인 이극세포에서 선택적 유전자 발현용 키트.
- 청구항 1에 있어서, 상기 ON/OFF 이극세포에 특이적으로 발현하는 프로모터는 CHX10 프로모터인 것인 이극세포에서 선택적 유전자 발현용 키트.
- 청구항 1에 있어서, 상기 Cre 유전자는 서열번호 4의 핵산 서열을 포함하는 것인 이극세포에서 선택적 유전자 발현용 키트.
- 청구항 1에 있어서, 상기loxP 서열은 서열번호 25 내지 28 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함하는 것인 이극세포에서 선택적 유전자 발현용 키트.
- 이극 세포에 제1 벡터를 도입하는 단계에 있어서, 상기 제1 벡터는 ON 이극세포에 특이적으로 발현하는 프로모터, 제1 표적 유전자 및 Cre 유전자를 포함하는 것인 단계; 및
이극 세포에 제2 벡터를 도입하는 단계에 있어서, 상기 제2 벡터는 ON/OFF 이극세포에 발현하는 프로모터, 제2 표적 유전자 및 loxP 서열을 포함하는 것인 단계를 포함하는 이극 세포에서 제1 표적 유전자 및 제2 표적 유전자를 선택적으로 발현시키는 방법. - 청구항 6에 있어서, 상기 ON 이극세포에 특이적으로 발현하는 프로모터는 mGluR6 프로모터인 것인 방법.
- 청구항 6에 있어서, 상기 ON/OFF 이극세포에 특이적으로 발현하는 프로모터는 CHX10 프로모터인 것인 방법.
- 청구항 6에 있어서, 상기 제1 표적 유전자는 채널로돕신인 것인 방법.
- 청구항 6에 있어서, 상기 제2 표적 유전자는 할로로돕신인 것인 방법.
- 청구항 6에 있어서, 상기 Cre 유전자는 서열번호 4의 핵산 서열을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 6에 있어서, 상기loxP 서열은 서열번호 25 내지 28 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함하는 것인 방법.
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Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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KR1020130091597A KR101594421B1 (ko) | 2013-08-01 | 2013-08-01 | 망막의 on/off 이극세포 선택적 유전자 발현 방법 |
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US20090281163A1 (en) * | 2008-05-09 | 2009-11-12 | President And Fellows Of Harvard College | Regulatory elements that mediate retinal cell-specific gene expression |
US20120093772A1 (en) * | 2008-05-20 | 2012-04-19 | Alan Horsager | Vectors for delivery of light sensitive proteins and methods of use |
-
2013
- 2013-08-01 KR KR1020130091597A patent/KR101594421B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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US20090281163A1 (en) * | 2008-05-09 | 2009-11-12 | President And Fellows Of Harvard College | Regulatory elements that mediate retinal cell-specific gene expression |
US20120093772A1 (en) * | 2008-05-20 | 2012-04-19 | Alan Horsager | Vectors for delivery of light sensitive proteins and methods of use |
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