KR20150008298A

KR20150008298A - 크립토코쿠시스 네오포만스에 의한 진균 감염 치료를 위한 당전이효소 유전자 CnKTR3의 용도

Info

Publication number: KR20150008298A
Application number: KR1020130082241A
Authority: KR
Inventors: 강현아; 이동직
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2013-07-12
Filing date: 2013-07-12
Publication date: 2015-01-22
Also published as: KR101526054B1

Abstract

본 발명은 크립토코쿠시스 네오포만스(Cryptococcus neoformans)에 의한 진균 감염 치료에 활용하기 위한 당전이효소 유전자 CnKTR3의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 CnKTR3 단백질을 포함하는 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; 상기 시험물질을 접촉한 세포에서 CnKTR3 단백질의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및 대조구 시료와 비교하여 상기 CnKTR3 단백질의 발현 또는 활성 정도가 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 항진균제 스크리닝 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 CnKTR3 단백질 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 항진균용 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 CnKTR3 단백질에 대한 상동체가 인체에는 존재하지 않으므로 진균 특이적 α1,2-만노실 전이효소는 항진균제 개발에 매우 유용한 타겟으로 활용될 것으로 사료된다.

Description

크립토코쿠시스 네오포만스에 의한 진균 감염 치료를 위한 당전이효소 유전자 CnKTR3의 용도{Use of the CnKTR3 gene encoding a mannoslytransferase for treating mycoses by Cryptococcus neoformans}

본 발명은 크립토코쿠시스 네오포만스(Cryptococcus neoformans)에 의한 진균 감염 치료에 활용하기 위한 당전이효소 유전자 CnKTR3의 용도에 관한 것이다.

기회감염성 인체 병원균인 크립토코쿠스 네오포만스(Cryptococcus neoformans)는 이형 담자균 강에 속하는 진균의 하나로 주로 전 세계 대부분 지역의 해수와 담수, 토양, 나무, 축산동물 및 조류의 배설물 등의 다양한 자연환경에서 광범위하게 발견된다. 크립토코쿠스속은 Cryptococcus neoformans와 Cryptococcus gatti(혈청형 B, C)로 분류되며 C. neoformans 는 C. neoformans var. neoformans(혈청형 D), C. neoformans var . grubii (혈청형 A)로 나뉜다. 인체에 감염된 것은 1894년에 처음 보고되었으며 급성, 아급성 및 만성으로 폐, 뇌수막 및 전신에 감염을 일으킨다. 크립토코쿠스 네오포만스의 감염은 자연환경에서 효모 형태의 세포가 폐로 흡입되어 일어나며 면역저하 환자에 흔히 감염되지만, 선행질환이 없는 환자도 감염될 수 있다. 정상적인 면역성을 가진 숙주에서 초기 감염은 폐 육아종(granuloma)을 생성하며 항체 반응을 일으키며, 장기 이식과 후천성면역결핍증(AIDS) 등으로 인하여 면역 기능이 저하된 환자에서는 자주 중추 신경계(Central nervous system, CNS)를 감염시켜 생명을 위협하는 뇌수막염을 일으키는 빈도가 높으며 특히 세계의 AIDS 사망률의 주요원인으로 밝혀졌다.

진균의 세포벽은 숙주 내에서 진균을 면역체계로부터 보호하기에 진균의 생존에 필수적이며 숙주에는 존재하지 않는 구조적인 특성을 가지고 있어 진균 감염 치료제 개발의 좋은 타깃이 된다. 세포벽의 가장 바깥쪽에는 여러 단백질이 존재하며 이 단백질들은 세포 밖으로 분비되는 단백질들과 마찬가지로 대부분 N-결합 또는 O-결합 당사슬(N- or O-linked glycan)이 부착된다. 특히 미생물의 세포 상호간 교신(intercellular communication)이나 병원성에 중요한 기능을 담당하는 당단백질은 다량의 O-당사슬 수식이 일어난다.

일반적으로 O-당사슬은 N-당사슬에 비해 짧으며, 효모와 진균들의 경우 주로 만노오스(mannose) 잔기들로 이루어지는 O-만노실화가 다음의 과정을 통해 이루어진다: 소포체(ER, Endoplasmic Reticulum)에서 새롭게 합성되는 분비 또는 막 단백질들이 소포체 내부 또는 소포체 막으로 이동되면서 폴리펩타이드 세린/트레오닌 잔기에 진화적으로 상당히 보존되어 있는 Pmt 단백질에 의해 돌리콜-인산화-만노오스(Dol-P-Man)로부터 만노오스가 부가되어 핵심 O-결합 당사슬이 합성되고, 이어서 골지체(Golgi)로 이동되어 KTR family (KTR 패밀리) 유전자에 의해 코딩되는 α1,2-만노실 전이효소에 의해 GDP-만노오스를 기질로 하여 만노오스가 추가로 부가된다. 전통 효모 사카로마이시스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)에서는 KTR family에 속하는 9개의 유전자(KRE2 / MNT1, KTR1, KTR2, KTR3, KTR4, KTR5, KTR6, KTR7, YUR1)가 O-당사슬의 연장에 관여한다. 병원성 진균인 아스퍼질러스 푸미가터스(Aspergillus . fumigatus)는 3개의 KTR 상동유전자(MNT1, MNT2, MNT3)가 존재하며, 캔디다 알비칸스(Candida albicans)는 5개의 KTR 상동유전자(MNT1, MNT2, MNT3, KTR2, KTR4)가 보고되었다. 한편 이 두 병원성 진균의 α1,2-만노실 전이효소를 코딩하는 KTR 패밀리에 속하는 유전자 결손은 병원성의 약화를 초래하는 것으로 나타났으나, 병원성 진균인 크립토코쿠스 네오포만스에서 KTR 패밀리 관련 유전자에 대하여는 아직 알려진 바가 없다. 이들 KTR 패밀리 유전자 산물인 α1,2-만노실 전이효소에 대한 상동체가 인체에는 존재하지 않으므로 진균 특이적 α1,2-만노실 전이효소는 항진균제 개발에 매우 유용한 타겟으로 활용될 것으로 사료된다.

한편, 한국공개특허 제2012-0053321호에서는 항진균 물질을 생산하는 신규 균주에 관한 것으로, 항진균 물질을 생산하는 스트렙토마이세스 자벤시스 엠제이엠5508 및 이를 유효성분으로 포함하는 식물병원성 진균 방제용 조성물, 이를 유효성분으로 포함하는 병원성 효모 및 병원성 진균에 의한 감염성 질환 치료용 약학 조성물 및 이를 이용한 식물 재배지에서 발병하는 곰팡이 원인균 방제 방법에 대해 개시하고 있지만, 본원발명의 크립토코쿠스 네오포만스 유래 α1,2-만노실 전이효소의 신규 유전자인 CnKTR3에 대한 언급은 없다.

따라서, 본 발명자들은 크립토코쿠스 네오포만스의 세포벽 단백질의 당사슬 구조와 그 생합성에 관한 연구를 수행해 왔다. 이러한 연구의 일환으로써 크립토코쿠스 네오포만스의 O-당사슬의 연장에 관련된 유전자를 찾고, 병원성과의 연관관계를 밝히기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 크립토코쿠스 네오포만스의 α1,2-만노실 전이효소의 신규 유전자를 동정하고, O-당사슬 합성에서의 기능을 규명하였으며, 이 유전자가 결손된 경우 크립토코쿠스 네오포만스의 병원성이 크게 약화됨을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 CnKTR3 단백질을 포함하는 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; 상기 시험물질을 접촉한 세포에서 CnKTR3 단백질의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및 대조구 시료와 비교하여 상기 CnKTR3 단백질의 발현 또는 활성 정도가 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 항진균제 스크리닝 방법을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 다른 목적은 CnKTR3 단백질 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 항진균용 약학 조성물을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 CnKTR3 단백질을 포함하는 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; 상기 시험물질을 접촉한 세포에서 CnKTR3 단백질의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및 대조구 시료와 비교하여 상기 CnKTR3 단백질의 발현 또는 활성 정도가 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 항진균제 스크리닝 방법을 제공한다. 바람직하게는 상기 CnKTR3 단백질은 서열번호 1로 표시된 것을 특징으로 한다.

바람직하게는 상기 CnKTR3 단백질의 발현 또는 활성 정도는 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase chain Reaction, RT-PCR), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 웨스턴 블랏(Western Blotting) 또는 유세포 분석법(FACS)으로 측정할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

상세하게는 상기 진균은 크립토코쿠시스 네오포만스(Cryptococcus neoformans)인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 "시험물질"은 유전자의 발현량에 영향을 미치거나, 단백질의 발현 또는 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 후보 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 CnKTR3 단백질 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 항진균용 약학 조성물을 제공한다.

상세하게는, 상기 CnKTR3 단백질 발현 억제제는 CnKTR3 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하고, 상기 CnKTR3 단백질 활성 억제제는 CnKTR3 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체 및 천연물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 용어 "안티센스 뉴클레오타이드"란 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다.

본 발명에서 용어 "작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA)"는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다.

본 발명에서 용어 "짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)"는 목적유전자 siRNA 염기서열의 sense와 상보적인 nonsense 사이에 3-10개의 염기 linker를 연결하는 올리고 DNA를 합성한 후 프라스미드 벡터에 클로닝하거나 또는 shRNA를 레트로바이러스인 렌티바이러스(lentivirus) 및 아데노바이러스(adenovirus)에 삽입하여 발현시키면 loop가 있는 헤어핀 구조의 shRNA (short hairpin RNA)가 만들어지고 세포 내의 Dicer에 의해 siRNA로 전환되어 RNAi 효과를 나타내는 것을 말한다. 상기 shRNA는 siRNA에 비해 비교적 장기간 RNAi 효과를 나타낸다.

본 발명에서 용어 "펩티드 미메틱스(Peptide Minetics)"는 CnKTR3 활성을 이끄는 CnKTR3 단백질의 결합 도메인을 억제하는 펩티드 또는 비펩티드이다.

본 발명에서 용어 "앱타머(Aptamer)"는 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)이다. 앱타머는 고유의 높은 친화성(보통 pM 수준)과 특이성으로 표적분자에 결합할 수 있다는 특성 때문에 단일 항체와 비교가 되고, 특히 "화학 항체"라고 할 만큼 대체 항체로서의 높은 가능성이 있다.

본 발명의 "항체"는 CnKTR3 주입을 통해 제조된 것 또는 시판되어 구입한 것이 모두 사용 가능하다. 또한, 상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 에피토프와 결합할 수 있는 단편 등을 포함한다.

다클론 항체는 상기 CnKTR3을 동물에 주사하고, 해당 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 종래의 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 당업계에 알려진 어떠한 방법에 의해서든 정제될 수 있고, 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 만들어질 수 있다.

단클론 항체는 연속 세포주의 배양을 통한 항체 분자의 생성을 제공하는 어떠한 기술을 사용하여도 제조할 수 있다. 이러한 기술로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 하이브리도마 기술, 사람 B-세포주 하이브리도마 기술 및 EBV-하이브리도마 기술이 포함된다.

본 발명의 약학 조성물은 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스, siRNA 올리고뉴클레오타이드 및 천연물 추출물을 유효성분으로 포함할 수 있다. 본 발명의 항진균용 의약 조성물 또는 항진균 복합 제제는 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다. 본 발명의 항진균용 의약 조성물은 투여를 위해서 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 포함하여 의약 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 의약 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다. 본 발명의 의약 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명의 의약 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 예방 또는 치료 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 예컨대, 성인의 경우, 1일 1회 내지 수회 투여시, 본 발명의 저해제는 1일 1회 내지 수회 투여시, 화합물일 경우 0.1ng/kg~10g/kg, 폴리펩타이드, 단백질 또는 항체일 경우 0.1ng/kg~10g/kg, 안티센스 뉴클레오타이드, siRNA, shRNAi, miRNA일 경우 0.01ng/kg~10g/kg의 용량으로 투여할 수 있다.

본 발명은 크립토코쿠시스 네오포만스에 의한 진균 감염 치료를 위한 당전이효소 유전자 CnKTR3의 용도에 관한 것으로서, 진균 특이적 O-당사슬의 연장에 관여하는 당전이효소의 활성을 억제함으로써 진균 감염을 치료하는 방법을 제공할 수 있다. 이들 KTR 패밀리 유전자 산물인 α1,2-만노실 전이효소에 대한 상동체가 인체에는 존재하지 않으므로 진균 특이적 α1,2-만노실 전이효소는 항진균제 개발에 매우 유용한 타겟으로 활용될 것으로 사료된다.

도 1은 크립토코쿠스 네오포만스 CnKTR3 유전자에 의해 코딩되는 단백질과 사카로마이시스 세레비지애의 KTR 단백질 패밀리들과 아미노산 서열 상동성을 비교 분석한 것이다.
도 2A는 크립토코쿠스 네오포만스 CnKTR3 유전자 파쇄(gene disruption)를 위한 DNA 카세트와 세포 내 유전자 상동 재조합에 의한 유전자 파쇄 카세트 도입에 관한 모식도를 나타낸다. 서던 블롯에 사용된 프로브(Probe)는 회색 사각형으로 표시하였다. 도 2B는 야생형 균주와 CnKTR3 유전자가 파쇄된 형질전환 균주(Cnktr3Δ)의 genomic DNA를 BglⅡ로 잘라 서던 블롯으로 확인한 결과이다. 야생형(WT)은 4,398 bp, 파쇄균주(Mu)는 1,177 bp 크기의 밴드를 갖게 된다.
도 3은 크립토코쿠스네오포만스 야생형(H99), CnKTR3 유전자 결손 변이주(CnKTR3D), CnKTR3 유전자가 재도입된 CnKTR3D 변이주(CnKTR3D+CnKTR3), 사카로마이세스 세레비시애 야생형(BY4742) 유래의 O-당사슬 프로파일을 비교 분석한 도식이다. 각 효모 균주의 세포벽 단백질들에서 분리 정제된 O-당사슬을 α1-2,3,6 mannosidase (JBM) 처리하기 전(A)과 후(B)를 비교 분석하였다.
도 4는 크립토코쿠스 네오포만스 CnKTR3 유전자 결손 변이주(CnKTR3D)의 생리학적 특징을 분석한 결과이다. 실험에 사용한 배지는 YPD(1% 효모 추출물, 2% 박토-펩톤, 2% 포도당)배지, 그리고 30 ㎍/㎖ 하이그로마이신 B (Hygromycin B), 0.05% SDS (sodium dodecyl sulfate), 0.05% SDS + 1M sorbitol, 1M NaCl, 1M NaCl + 1M sorbitol이 각각 첨가된 YPD 배지이다. 실험에 사용된 균주는 야생형(WT), Cnktr3Δ, Cnktr3Δ+CnKTR3, Cnhxl1Δ 이다.
도 5는 O-당사슬의 연장에 관여하는 CnKTR3 유전자의 결손이 in vivo 상의 병원성에 미치는 영향을 모델 마우스에 감염시켜 생존률을 분석한 도식이다. 실험에 사용된 균주는 야생형(WT), Cnktr3Δ, Cnktr3Δ+CnKTR3이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1 : in silico 분석을 통한 O- 당사슬 생합성 경로 관련 당전이효소 유전자 동정

크립토코쿠스 네오포만스에서 O-당사슬 생합성에 관련된 유전자들을 찾기 위하여 사카로마이시스의 KRE2 / MNT1 유전자군(KRE2 / MNT1, KTR1, KTR2, KTR3, KTR4, KTR5, KTR6, KTR7, YUR1)과 상동성을 보이는 C. neoformans 유전자를 혈청형 A 균주인 H99의 유전자 데이터베이스 (http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/cryptococcus_neoformans/MultiHome.html)에서 탐색한 결과 CNAG_03832.2 후보 유전자를 선별하였다. 이 유전자 만이 KRE2/MNT1 유전자군과 상동성을 보이는 유일한 유전자였으며 a-1,2-만노실전이효소 도메인(a-1,2-mannosyltransferase domain)에 해당하는 서열이 부분적으로 보존되어 있어 CnKTR3이라고 명명하였다(도 1).

실시예 2 : Cn KTR3 유전자 파쇄 변이주 및 재도입 균주 제작

1. 사용 균주 및 배양 조건

본 발명에서는는 하기 표 1에 나타낸 크립토코쿠스 네오포만스를 균주로 사용하였다. 액체 배지로는 이스트 추출물-펩톤-덱스트로스(YPD)을 이용하였고, 30℃에서 220 rpm으로 상기 균주들을 배양하였다.

균주	유전형	참조문헌
C. neoformans H99	항원형 A MATα	J. Clin. Microbiol. 31(12), 3305-3309
Cnktr3Δ	MATαCn03832.2:: NAT #159	본 발명
Cnktr3Δ+CnKTR3	MATαCn03832.2:: NAT #159Cn03832.2-NEO	본 발명
Cnhxl1Δ	MATα hxl1 △:: NAT#229	PLoS Pathog 7(8): e1002177

*각 NAT #는 고유 서명 태그(unique signature tag)를 가진 Nat^r마커를 의미함.

2. 결과

CnKTR3 유전자 결손이 야기하는 성장 특징 및 병원성 변화를 분석하기 위해 기존에 보고된 방법(Microbiology (2002) 148: 2607-2615, Biochem Biophys Res Commun (2009) 390: 983-988)에 따라서, 스플릿마커(split-marker)와 유전자주입 형질전환(biolistic transformation)을 통해 이중 연결 PCR(double joint PCR)에 의해 C. neoformans 항원 A H99균주에서 CnKTR3 유전자를 파쇄하였다(도 2A). 유전자 파쇄에 필요한 프라이머는 하기 표 2에 나타내었다. 금 마이크로캐리어비드 (0.6 μm [Bio-Rad])에 이중 연결 PCR에 의해 제작한 후 분리정제한 CnKTR3 유전자 파쇄 카세트를 코팅하고 항원 A H99균주를 형질전환시켰다. 100 μg/ml 농도의 노르세오트리신(Nourseothricin)을 포함하는 YPD 배지에서 성장이 잘 되는 균주를 선택하여 진단용 PCR을 통해 일차적으로 선별한 후, 유전자 특이적 프로브를 이용한 서던 블롯 분석을 통해 CnKTR3 유전자가 파쇄된 형질전환 균주(Cnktr3Δ)임을 확인하였다(도 2B).

프라이머	서열 (5' to 3') ^a	목적
M13Fe	GTAAAACGACGGCCAGTGAGC	유전자 파쇄 카세트 제작
M13Re	CAGGAAACAGCTATGACCATG	유전자 파쇄 카세트 제작
NSL2	AACTCCGTCGCGAGCCCCATCAAC	유전자 파쇄 카세트 제작
NSR2	AAGGTGTTCCCCGACGACGAATCG	유전자 파쇄 카세트 제작
CN_3832.2D_L1	TAAGTAAGACGGTGTGCG	CnKTR3 파쇄 카세트 제작
CN_3832.2D_L2	GCTCACTGGCCGTCGTTTTACGGAATCATCATCTTGGCC	CnKTR3 파쇄 카세트 제작
CN_3832.2D_R1	CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGGTAACAGATGGAGTGTC	CnKTR3 파쇄 카세트 제작
CN_3832.2D_R2	TTGCTCTGTGGCAGACTA	CnKTR3 파쇄 카세트 제작
CN_3832.2D_Sc_F	GGCTAGTATCAAAGCGGT	CnKTR3 파쇄 진단
CnD-ACTsqB(B79y)	TGTGGATGCTGGCGGAGGATA	CnKTR3 파쇄 진단
CN_03832_cp_F2_Sal1	CCACGTCGACCTGACATCGCTTGAGTTG	CnKTR3 재도입
CN_03832_cp_B_Bgl2	ATGCGGCCGCAGAACGAGAATGGTGGCA	CnKTR3 재도입

상기 제작된 Cnktr3Δ 돌연변이에 활성을 지닌 CnKTR3 유전자가 재도입 균주(Cnktr3Δ+CnKTR3)를 제조하기 위하여, 1.2 kb의 프로모터, 1.7 kb의 ORF (Open Reading Frame), 및 0.8 kb의 터미네이터(terminator)를 포함하는 CnKTR3 유전자 단편을 제한효소 사이트가 포함된 프라이머 CN_03832_cp_F2_Sal1와 CN_03832_cp_B_Bgl2를 이용하여 PCR을 통해 증폭하고 NEO 마커(Neomycin/G418-resistant marker)를 가지고 있는 pJAFS1 벡터(James A. Fraser 제공, Centre for Infectious Disease Research, School of Chemistry and Molecular Biosciences, The University of Queensland, Brisbane, QLD 4072, Australia)에 서브클로닝하여 pJAFS1-CnKTR3를 제작하였다. 염기서열 분석을 통해 확인 된 pJAFS1-CnKTR3를 BstZ17Ⅰ 제한효소로 절단한 후 CnKTR3 파쇄 돌연변이 균주를 형질전환시켜 CnKTR3 재도입 균주(Cnktr3Δ+CnKTR3)를 제작하였다.

실시예 3 : Cn ktr3 Δ 돌연변이균주의 O- 당사슬 프로파일 분석

1. 세포벽 단백질의 O-당사슬 분석

각 균주들을 100 ㎖ YPD 배지에서 220 rpm으로 30℃에서 24시간 동안 배양 한 뒤 DMSO (dimethyl sulfoxide, Sigma)에 현탁하여 캡슐 다당류를 제거하고 세척하여 10-㎖ citrate buffer (0.1M, pH 7.0)에 재현탁하였다. 121℃에서 2시간 동안 고압증기 멸균을 수행하여 세포표면 단백질들을 유리하고 Concanavalin A로 정제하여 만노오스가 결합된 단백질을 얻은 뒤 Hydrazine monohydrate (TCI)를 첨가하여 60℃에서 4 시간 반응시켜 O- 당사슬을 분리하였다. 분리한 당사슬은 2-aminobenzoic acid(2-AA)와 80℃에서 45분간 반응하여 환원 말단에 표지하고 TSK-gel amide(4.6 * 250mm, 5 um,) 컬럼과 용매 A(2% acetic acid, 1% tetrahydrofuran in acetonitrile)와 용매 B(5% acetic acid, 3% triethylamine, 1% tetrahydrofuran in water)를 사용하여 HPLC (Waters 2690)로 검출하였다. 검출된 O-당사슬은 jack bean α-mannosidase (JBM, 150mU/μL, Prozyme)를 처리하여 당사슬 절단 여부를 확인하였다.

2. 결과

크립토코쿠스 네오포만스에서 CnKTR3의 기능이 O-당사슬 생합성에 관여하는 지를 분석하기 위해, Cnktr3Δ 돌연변이 균주의 세포벽 단백질에 부착된 O-당사슬 프로파일을 분석하였다. 야생형 균주에서 추출한 O-당사슬과 비교하였을 때 Cnktr3Δ 돌연변이 균주의 O-당사슬은 주로 1개의 만노오스만이 세포벽 단백질에 결합하는 양상을 보였으며, Cnktr3Δ 돌연변이 균주에 CnKTR3 유전자를 재도입시킨 Cnktr3Δ+CnKTR3 균주에서는 다시 O-당사슬의 연장이 회복되는 양상을 보였다. 이는 PMT 유전자군에 의해 만노오스가 결합한 이후에 CnKTR3p에 의한 O-당사슬 연장이 이루어지지 못함을 나타낸다(도 3A). 또한 야생형 균주에서 추출한 O-당사슬에서 jack bean α-mannosidase를 처리하였을 때 돌연변이 균주와 동일한 당사슬 길이를 갖게 되고, 돌연변이 균주에서 추출한 O-당사슬은 더 이상 변화가 없는 결과에 의해 뒷받침된다(도 3B).

실시예 4 : Cn ktr3 Δ 돌연변이 균주의 스트레스 감수성 분석

1. 스트레스 민감도 분석

각 균주들을 2 ㎖ YPD배지에 220 rpm으로 30℃에서 16 시간 동안 전 배양하여, 무균물 100 ㎕에 처음 OD₆₀₀ 값을 1.0으로 시작하여 연속적으로 1/10 비율로 희석하여 30 ㎍/㎖ 하이그로마이신 B(Hygromycin B), 0.05% 도데실 황산나트륨 (sodium dodecyl sulfate, SDS), 0.05% SDS + 1M sorbitol, 1M NaCl, 1M NaCl + 1M sorbitol이 각각 첨가된 YPD 배지에 2 ㎕씩 접종하고 30℃에서 2일 동안 배양하였다.

2. 결과

O-당사슬 생합성 결손을 확실하게 보이는 크립토코쿠스 네오포만스 Cnktr3Δ 돌연변이 균주의 표현형 분석 결과 39℃에서 Cnktr3Δ 돌연변이 균주의 성장이 약간 느렸고 NaCl과 SDS에 대하여 높은 민감성을 보였다. 특이하게도 NaCl에 대한 민감성은 sorbitol을 첨가해 줌으로써 회복되었으나 SDS에 대한 민감성은 sorbitol을 넣어줌으로써 오히려 증가되었다. Cnktr3Δ 돌연변이 균주에 CnKTR3 유전자를 다시 도입해 준 형질전환 균주에서는 야생형 수준으로 성장이 회복되었다(도 4). 이러한 사실은 세포벽 단백질의 O-당사슬 연장에 관여하는 CnKTR3 유전자가 세포벽의 합성과 유지에 중요함을 시사한다.

실시예 5 : Cn KTR3 유전자 결실이 in vivo 상의 병원성에 미치는 영향 분석

1. 크립토코쿠시스 마우스 모델을 통한 CnKTR3 유전자 결실 돌연변이의 병원성 분석

야생형, Cnktr3Δ 돌연변이 균주 및 CnKTR3 재도입 균주(Cnktr3Δ+CnKTR3)를 YPD 배지에 30℃에서 16 시간 배양한 후에 PBS(phosphate buffered saline) 버퍼 용액에 세척을 한 후에 ㎖당에 2 X 10⁶ cell이 되도록 효모 세포 수를 맞추어 주었다. 각 야생형, 돌연변이 균주, 및 재도입 균주당 10 마리씩 4-6 주의 A/J 마우스(Jackson Laboratory, 18-22g)의 비강 안쪽에 10⁵ 세포 수만큼 주입시키는 방법으로 감염을 시켰다. 마우스의 생존은 하루에 1번씩, 8주 동안 관찰하였다.

2. 결과

세포벽 단백질의 O-당사슬 연장에 관여하는 유전자인 CnKTR3가 in vivo 상의 병원성에 대하여 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해, Cnktr3Δ 돌연변이 균주의 병원성을 마우스 모델을 통해 조사하였다. 그 결과 Cnktr3Δ 돌연변이 균주의 병원성이 야생형에 비해 현저하게 저하됨을 확인할 수 있었다. 이에 반해 CnKTR3 유전자를 재도입시킨 Cnktr3Δ+CnKTR3 균주는 야생형 균주와 거의 동일한 병원성을 보였다. 상기 결과는 세포벽 단백질에 존재하는 O-당사슬 생합성에 주요한 기능을 갖는 CnKTR3 유전자가 크립토코쿠스의 병원성에 매우 큰 영향을 끼치고 있음을 보여준다(도 5). CnKTR3 유전자 산물인 α1,2-만노실 전이효소에 대한 상동체가 인체에는 존재하지 않으므로 이와 같은 병원성에 중요한 영향을 미치는 진균 특이적 α1,2-만노실 전이효소는 항진균제 개발에 매우 유용한 타겟으로 활용될 것이다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Use of the CnKTR3 gene encoding a mannoslytransferase for treating mycoses by Cryptococcus neoformans <130> ADP-2013-0292 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 374 <212> PRT <213> Cryptococcus neoformans <400> 1 Met Ala Gly Gly Leu Val Phe Leu Leu His Val Leu Leu Ser Val His 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Arg Glu Lys Thr Ser Ile Leu Asn Leu Leu Pro Gln Gln 20 25 30 Asp Gly Trp Arg Glu Gly Gln Pro Pro Pro Asn Ser Ala Ile Pro Pro 35 40 45 Val Val Gly Asp Leu Ala Glu Asn Glu Ala Ala Leu Glu Gly Arg Arg 50 55 60 Lys Ala Asn Ala Val Phe Val Val Leu Ala Arg Asn Ser Asp Leu Trp 65 70 75 80 Pro Phe Leu Asp Ser Met Arg Gln Met Glu Asp Arg Phe Asn His Trp 85 90 95 Ala Lys Tyr Asp Tyr Val Phe Leu Asn Glu Glu Asp Phe Ser Asp Glu 100 105 110 Phe Lys Arg Tyr Thr Gln Ser Met Thr Lys Ala Lys Cys Tyr Tyr Gly 115 120 125 Lys Ile Asp Pro Glu His Trp Tyr Gln Pro Glu Trp Ile Asp Glu Asp 130 135 140 Lys Ala Ser Lys Ala Arg Glu Glu Met Ile Arg Lys Lys Val Ile Tyr 145 150 155 160 Gly His Ser Val Pro Tyr Arg Asn Met Cys Arg Phe Asn Ser Gly Phe 165 170 175 Phe Phe Arg His Pro Leu Leu Ala Asn Tyr Asp Tyr Tyr Trp Arg Ile 180 185 190 Glu Pro Ser Val Lys Phe Phe Cys Asp Leu Ala Tyr Asp Pro Phe Leu 195 200 205 Val Met Gln Asp Gln Asn Lys Val Tyr Gly Phe Thr Leu Ser Leu Phe 210 215 220 Glu Tyr Ile Glu Thr Ile Pro Thr Leu Trp Asp Ala Val Lys Glu Phe 225 230 235 240 Ile Gly Glu His Pro Asp Tyr Leu Pro Glu Gly Asn Ala Met Gln Phe 245 250 255 Leu Ser Asp Asp Gly Gly Glu Thr Tyr Asn Lys Cys His Phe Trp Ser 260 265 270 Asn Phe Glu Ile Gly Asp Leu Asn Phe Trp Arg Ser Gln Pro Tyr Met 275 280 285 Glu Phe Phe Asp Phe Leu Asp Lys Lys Gly Gly Phe Tyr Tyr Glu Arg 290 295 300 Trp Gly Asp Ala Pro Val His Ser Ile Gly Ala Ala Leu Phe Ala Lys 305 310 315 320 Lys Glu Gln Ile His Phe Phe Asp Asp Ile Gly Tyr Arg His Glu Pro 325 330 335 Phe Gln His Cys Pro Gln Gly Asp Ala His Thr Arg Gly Asn Cys Trp 340 345 350 Cys Asp Gln Ala Asn Asn Phe Asp Trp Glu Trp Tyr Ser Cys Thr Lys 355 360 365 Lys Tyr Thr Glu Met Phe 370 <210> 2 <211> 1727 <212> DNA <213> Cryptococcus neoformans <400> 2 atggctggag gattagtcgt cagtcctcag ctatccatca tctagtgaaa tcaggcgttg 60 atgtccccta cagttcctcc tccacgtcct cctatccgtt caccctactt accgagagaa 120 aacctcaatc ttgaatcttt tgcctcaaca agacgggtgg cgtgagggcc aaccacctcc 180 caattccgcc atccctccag tcgttggcga tctggcagaa aatgaggccg ctttggaggg 240 aagaagaaaa gccaacgcgg tcttcgtcgt tttgggtgag tacctcgcag ccatgcttgt 300 aaaaggttgt ctcgcacaat atttaattat gaatcgctgc ttagcccgga attcggattt 360 gtggccgttc ctcgactcta tgcgacagat ggaggatcga ttcaatcact gggctaaata 420 tgattatgtt tttttgaacg aggaggtaaa tatcgtattt tggtcggaat ggggacaatc 480 ggctgaatca ataattttag gacttctctg acgagttcaa gcggtacact caatcaatga 540 ccaaagccaa atgttactac ggcaagattg atcccgaaca ttggtaccag cctgaatggt 600 aagacggata tgatgtttcc cattgttgga acctctattg atgattttca tcgtaggatc 660 gatgaagaca aggctagcaa ggctcgagag gaaatgataa ggaaaaaggt catttacggc 720 cactctgtcc cttaccgaaa catgtgccga ttcaactctg gcgtacgtac gatcatgtga 780 agcttcgatg aagagactaa cagctcatca gttcttcttc cgacaccccc ttctcgccaa 840 ttatgattac tactggcgaa tcgagccctc tgtcaagttc ttttgtgatc tcggtaagtc 900 aaagagctct tacgttaaac ttgtctttgc taatatcatc gcgctacggc tagcctacga 960 ccccttcctt gtcatgcagg atcagaataa ggtgtatggc ttcacccttt ccctgttcga 1020 gtacatcgag accattccca ctctctggga tgccgtcaaa ggtaaggtaa tataacgcga 1080 aatctgacag ttgctgatac gagaaatgaa gaattcatcg gagaacatcc cgattatctt 1140 cctgaaggca atgcaatgca attcctaagc gatgacggcg gtgagaccta caacaagtgc 1200 cactgtgagt ctgaatgtat ctatcacttc aatgtaatgt gtgattgatc attgccaaag 1260 tctggtccaa ctttgagatt ggggacctta acttctggcg atctcagcct tacatggagt 1320 tctttgattt ccttgacaag aagggtggat tctattacga gcggtgggga gatgcgcccg 1380 tgcactcaat cggtgccgca ctcttcgcta agaaggagca gatccatttc tttgatgaca 1440 ttggctacag gcacgaaccg ttccaggtaa ggaaattctc tctggactag tcgtgaagtt 1500 gctcctgaca atcatcgtag cattgccctc aaggtgacgc tcataccagg ggtaactgtt 1560 ggtgtgatca agccaataac tttgattggg aatggtgagt tgttgtgttg tgtcgatttc 1620 aggcctttac atgtaaacgt gctgattttg tcttcatagg tactcttgca ctaagaaata 1680 tacagaaatg ttctaatatg tttatttgca tgaatttaac gcgcttg 1727

Claims

CnKTR3 단백질을 포함하는 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계;
상기 시험물질을 접촉한 세포에서 CnKTR3 단백질의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및
대조구 시료와 비교하여 상기 CnKTR3 단백질의 발현 또는 활성 정도가 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 항진균제 스크리닝 방법.
제1항에 있어서, 상기 CnKTR3 단백질의 발현 또는 활성 정도는 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase chain Reaction, RT-PCR), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 웨스턴 블랏(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것을 특징으로 하는 항진균제 스크리닝 방법.
제1항에 있어서, 상기 CnKTR3 단백질은 서열번호 1로 표시된 것을 특징으로 하는 항진균제 스크리닝 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 진균은 크립토코쿠시스 네오포만스(Cryptococcus neoformans)인 것을 특징으로 하는 항진균제 스크리닝 방법.
CnKTR3 단백질 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 항진균용 약학 조성물.
제5항에 있어서, 상기 CnKTR3 단백질 발현 억제제는 CnKTR3 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 항진균용 약학 조성물.
제5항에 있어서, 상기 CnKTR3 단백질 활성 억제제는 CnKTR3 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체 및 천연물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 항진균용 약학 조성물.
제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 진균은 크립토코쿠시스 네오포만스(Cryptococcus neoformans)인 것을 특징으로 하는 항진균용 약학 조성물.