KR20150004762A - Method for increasing of stemness in human cells - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to a method for increasing the stemness of a human cell. Particularly, in the present invention, it is confirmed that an HGF from among various growth factors is a major factor which is important in excellently maintaining the characteristics of a stem cell because the same adjusts a telomere length of a mesenchymal stem cell. When the HGF is treated on a mesenchymal stem cell, the expression of a stemness index factor is inceased, and a chromosomal end is extended, so that the lifespan of the cell is extended and aging is controlled. Also, the growth and viability of the cell are improved so that cells can be mass-cultured. It has been confirmed that the limitation of in vitro culturing of existing mesenchymal stem cells can be overcome, so that it has been clarified that the method of the present invention can be effectively used for cell treatment or regenerative medicine.

Description

인간 세포의 줄기세포능을 증대시키는 방법{METHOD FOR INCREASING OF STEMNESS IN HUMAN CELLS}[0001] METHOD FOR INCREASING OF STEMNESS IN HUMAN CELLS [0002]

본 발명은 인간 세포의 줄기세포능(stemness)을 증대시키는 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a method for enhancing stem cell function of a human cell.

줄기세포(stem cell)는 생물 조직을 구성하는 다양한 세포들로 분화(differentiation)할 수 있는 세포로서, 배아, 태아 및 성체의 각 조직에서 얻을 수 있는 분화되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭한다. 줄기세포는 분화 자극(환경)에 의하여 특정 세포로 분화가 진행되며, 분화가 완료되어 세포분열이 정지된 세포와는 달리 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산(self-renewal)할 수 있어 증식(proliferation; expansion)하는 특성이 있으며, 다른 환경 또는 다른 분화 자극에 의해 다른 세포로도 분화될 수 있어 분화에 유연성(plasticity)을 가지고 있는 것이 특징이다.A stem cell is a cell that can differentiate into various cells constituting a biological tissue, and collectively refers to undifferentiated cells in the pre-differentiation stage which can be obtained from each tissue of the embryo, fetus and adult body. Stem cells are differentiated into specific cells by differentiation stimuli (environment). Unlike cells in which the division of cells is completed and the division of cells is completed, the cells can self-renew themselves by cell division, (proliferation), and it can be differentiated into other cells by different environments or differentiation stimuli, and is characterized by having plasticity in differentiation.

줄기세포는 크게 배아(embryo)에서 얻어지고 모든 세포로 분화될 수 있는 잠재력(totipotent)을 지닌 전분화능(pluripotency)의 배아 줄기 세포(embryonic stem cell, ES cell)와 각 조직에서 얻어지는 다분화능(multipotency)의 성체 줄기 세포(adult stem cell)로 구분된다. 배아 발생 초기인 포배기(blastocyte)의 세포내괴(inner cell mass)는 장차 태아를 형성할 부분으로서 이 세포내괴로부터 형성된 배아 줄기 세포는 이론적으로 한 개체를 구성하는 모든 조직의 세포로 분화될 수 있는 잠재력을 지닌 줄기세포이다. 즉, 배아 줄기 세포는 무제한적으로 증식이 가능한 미분화 세포이고, 모든 세포로 분화할 수 있으며 성체 줄기 세포와 달리 배(germ) 세포도 만들 수 있어 다음 세대로 유전될 수 있다.Stem cells are largely derived from pluripotency embryonic stem cells (ES cells) obtained from embryos and totipotent to differentiate into all cells and multipotent stem cells obtained from each tissue ) Adult stem cells are divided into. The inner cell mass of the blastocyte in the early stage of embryogenesis is the part of the embryo that will form the embryo in the future. The embryonic stem cells formed from the inner cell of the embryo can theoretically be differentiated into cells of all the tissues constituting the individual It is a stem cell with potential. In other words, embryonic stem cells are undifferentiated cells capable of proliferating indefinitely. They can differentiate into all cells, and unlike adult stem cells, they can also produce germ cells, which can be inherited to the next generation.

인간 배아 줄기 세포는 인간 배아(blastocyst) 형성시 세포내괴(inner cell mass)만을 분리하여 배양함으로써 제조되는데, 현재 전 세계적으로 만들어진 인간 배아 줄기 세포는 불임시술 뒤 남은 냉동 배아로부터 얻어진 것이다. 이 세포의 특징은 모든 세포로 분화 가능한 잠재력(totipotent)을 갖고 있어, 어떠한 조직 세포로도 분화될 수 있으며, 또한 사멸하지 않고(immortal) 미분화상태에서 배양가능하며 배 세포(germ cell)의 제조도 가능하므로 다음 세대로 유전될 수 있는 특징을 가지고 있다(Thomson et al., Science, 282: 1145-1147, 1998; Reubinoff et al., Nat. Biotechnol., 18: 399-404, 2000).Human embryonic stem cells are produced by isolating and culturing only inner cell mass during the formation of a human embryo (blastocyst). Human embryonic stem cells, which are currently produced globally, are obtained from frozen embryos remaining after sterilization. The characteristics of these cells are totipotent to all cells and can be differentiated into any tissue cell, and can be cultured in an undifferentiated state immortal, and the production of germ cells (Thomson et al., Science, 282: 1145-1147, 1998; Reubinoff et al., Nat Biotechnol., 18: 399-404, 2000).

하지만, 이렇듯 여러 세포로 분화할 수 있는 분화능을 가진 인간 배아 줄기세포를 세포 치료제로 이용하기 위한 다양한 시도는 아직 암화 형성과 면역 거부 반응의 높은 벽을 완전히 제어하지 못하는 상황이다.However, various attempts to utilize human embryonic stem cells having differentiation potential capable of differentiating into various cells as cell therapy agents have yet to completely control the high wall of cancer formation and immune rejection.

최근 이러한 문제점을 극복하기 위한 대안으로 면역 조절 기능을 가지고 있는 것으로 보고되고 있는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell; MSC)가 제시되고 있다. Friendenstein 연구단(Exp Hematol, 4(5):267-274, 1976)에 의해 골수에서 처음 확인된 중간엽 줄기세포(Mesenchymal stem cells; MSCs)는 전능성 세포로, 재생 의학에서 큰 잠재성을 가진다. 상기 MSCs는 생체 내 여러 유형의 중간엽 계통, 예를 들어 골세포(Osteocytes), 연골세포(Chondrocytes), 힘줄세포(tendinocytes),지방세포(Adipocytes), 근육세포(Myocytes), 및 섬유아세포(Fibroblasts) 등으로 분화될 수 있다. 또한, 적절한 배지 조건에서는 신경 세포(Hung SC et al., Stem Cells, 20(6):522-529, 2002; Sanchez-Ramos J et al.,Exp Neurol, 164(2):247-256, 2000), 심근세포(Kadivar M et al., Biochem Biophys Res Commun, 340(2):639-647, 2006), 내피세포(Reyes M et al., Blood, 98(9):2615-2625, 2001), 및 간세포(Kang XQ et al., World J Gastroenterol, 11(47):7461-7465, 2005)로 교차 분화될 수 있다. 게다가 골수 MSCs는 클래스 II가 아닌 클래스 I MHC 항원을 발현하거나, MSCs가 면역원성 활성이 없는 것을 나타내는 상호 자극 분자들을 발현한다(Klyushnenkova E et al., J Biomed Sci, 12(1):47-57, 2005). MSCs는 면역억제 활성을 나타내므로, 이식 촉진제 및 태아 이식(fatal graft) 및 숙주 질환의 억제제로 사용될 수 있다(Le Blanc K et al., Lancet, 363(9419):1439-1441, 2004; El-Badri N.S et al., Exp Hematol, 26(2):110-116, 1998).Recently, mesenchymal stem cells (MSCs) have been reported as having an immunoregulatory function as an alternative to overcome these problems. Mesenchymal stem cells (MSCs), first identified in the bone marrow by the Friendenstein research group (Exp Hematol, 4 (5): 267-274, 1976), are benign cells and have great potential in regenerative medicine. The MSCs can be used in various types of mesenchymal systems in vivo, such as osteocytes, chondrocytes, tendinocytes, adipocytes, myocytes, and fibroblasts ), And the like. Sanchez-Ramos J et al., Exp Neurol., 164 (2): 247-256, 2000), in which neuronal cells (Hung SC et al., Stem Cells, Endothelial cells (Reyes M et al., Blood, 98 (9): 2615-2625, 2001), myocardial cells (Kadivar M et al., Biochem Biophys Res Commun, 340 (2): 639-647, , And hepatocytes (Kang XQ et al., World J Gastroenterol, 11 (47): 7461-7465, 2005). In addition, bone marrow MSCs express non-class II MHC class I antigens, or MSCs express mutually stimulating molecules that show no immunogenic activity (Klyushnenkova E et al., J Biomed Sci, 12 (1): 47-57 , 2005). Since MSCs exhibit immunosuppressive activity, they can be used as transplantation promoters and as an inhibitor of fatal graft and host disease (Le Blanc K et al., Lancet, 363 (9419): 1439-1441, 2004; El- Badri NS et al., Exp Hematol, 26 (2): 110-116, 1998).

MSCs는 골수, 지방 조직, 제대혈(cord blood), 말초혈, 신생아 조직(neonatal tissues), 인간 태반 등의 다양한 성인 조직으로부터 분리될 수 있다(Kassis I et al., Bone Marrow Transplant, 37(10):967-976, 2006; Wang HS et al., Stem Cells, 22(7):1330-1337, 2004; Fukuchi Y et al., Stem Cells, 22(5):649-658, 2004). 그러나 성인 조직에서 수득한 MSCs의 개수에는 한계가 있다.MSCs can be isolated from a variety of adult tissues such as bone marrow, adipose tissue, cord blood, peripheral blood, neonatal tissues, and human placenta (Kassis I et al., Bone Marrow Transplant, 37 (10) Stem Cells, 22 (7): 1330-1337, 2004; Fukuchi Y et al., Stem Cells, 22 (5): 649-658, 2004). However, the number of MSCs obtained from adult tissues is limited.

세포 치료나 재생의학에서 최소 필요한 세포의 수는 1X109 정도이다. 그러나 조건을 잡고 기준을 정하는 실험까지 포함한다면 그 양은 더욱 늘어난다. 기존의 다양한 기원의 중간엽 줄기세포로 이 정도의 양을 공급하려면 최소 in vitro에서 10번 이상의 계대가 필요하게 된다. 세포는 노화되고 변형되어 더 이상 치료의 개념에 적합하지 않게 된다. 이는 지금의 중간엽 줄기세포의 배양시스템이 가지고 있는 풀어야 할 문제점의 하나이다. 또한 이러한 세포로 조건과 기준을 잡았다 하더라도 치료에 사용할 시에는 이미 그 세포는 바닥이 나고 다른 사람의 중간엽 줄기세포를 써야 하는 경우가 발생하고 그럴 경우 또 다른 세포이용에 따른 부가적인 실험을 다시 거처야 하므로, 기존의 중간엽 줄기세포를 세포치료제로 사용하기 위해서는 이러한 문제점을 해결할 수 있는 새로운 방법 제시가 필요하다.The minimum number of cells required for cell therapy or regenerative medicine is about 1 × 10 9 . However, if we include the experiment to set the condition and set the criterion, the amount will increase more. To supply the amount of the extent to existing mesenchymal stem cells of various origins at least in more than 10 passages are required in vitro . The cells become aged and deformed and no longer fit into the concept of therapy. This is one of the problems that the current mesenchymal stem cell culture system has to solve. In addition, even if the conditions and criteria for these cells are taken, when the cells are used for treatment, the cells are already floated and the mesenchymal stem cells of other human cells must be used. In this case, Therefore, in order to use existing mesenchymal stem cells as a cell therapy agent, a new method for solving such problems is needed.

상기와 같은 문제점을 고려해 볼 때, 세포치료제의 가장 바람직한 재료로 기대되고 있는 중간엽 줄기세포의 체외기간을 늘려, 사용 가능한 세포 수를 다량 확보할 수 있는 방안의 개발이 필요한 실정이다.In view of the above problems, it is necessary to develop a method of securing a large number of usable cells by increasing the in vitro period of the mesenchymal stem cells, which is expected to be the most preferable material of the cell therapy agent.

한편, HGF(hepatocyte growth factor; 간세포성장인자)는 SF(scatter factor; 산란인자)라고도 하며, 간엽 간세포(mesenchymal cell)에 의해 생산되는 다기능성 이종이중체(heterodimer) 폴리펩타이드이다. HGF는 N-말단 핑거 도메인(finger domain) 및 4개의 크링글 도메인(kringle domain)을 포함하는 69 kDa의 알파-체인, 및 키모트립신-유사 세린 프로테아제의 프로테아제 도메인과 유사성을 갖는 34 kDa 베타-체인을 포함하는 구조로 이루어져 있다. 인간 HGF는 생물학적으로 비활성인, 단일 체인 형태의 728개의 아미노산을 갖는 전구체로 합성되고, R494 잔기가 특이적 혈청 세린 프로테아제에 의해 절단되어 생물학적으로 활성인 HGF가 된다. 활성 HGF는 69 kDa의 알파-체인과 34 kDa의 베타-체인이 이황화결합으로 연결된 이종이량체이다. 현재까지 HGF 유전자가 도입된 성체 줄기 세포주, 및 이를 이용한 간 질환의 치료 또는 예방 효과를 토대로, HGF와 줄기 세포와의 연관성이 개시된 적은 있으나(대한민국 공개특허 제10-2012-023656호), 아직까지 중간엽 줄기세포와 HGF와의 관련성에 대해서는 보고된 바 없다.
On the other hand, HGF (hepatocyte growth factor) is also known as SF (scatter factor) and is a multifunctional heterodimer polypeptide produced by mesenchymal cells. HGF is a 34 kDa beta-chain having similarity to the protease domain of the 69 kDa alpha-chain and the chymotrypsin-like serine protease comprising the N-terminal finger domain and the four kringle domains As shown in FIG. Human HGF is synthesized as a biologically inactive, precursor with 728 amino acids in the form of a single chain, and the R494 residue is cleaved by a specific serine protease to become biologically active HGF. Active HGF is a heterodimer with a 69 kDa alpha-chain and a 34 kDa beta-chain linked by disulfide bonds. Based on the adult stem cell line into which the HGF gene has been introduced so far and the therapeutic or preventive effect of the liver disease using the stem cell line, there has been disclosed a connection between HGF and stem cells (Korea Patent Publication No. 10-2012-023656) The relationship between mesenchymal stem cells and HGF has not been reported.

텔로미어(telomere)는 염색체의 말단에 존재하는 DNA의 부분으로, 사람 염색체 유전자의 경우에는 TTAGGG의 반복적인 배열이 계속되는 초기의 상태로는 약 10 kb 정도 길이의 DNA이다. 텔로미어에는 여러 가지 결합 단백질이 결합하여, DNA의 말단끼리 결합해서 환상의 DNA로 되는 것을 억제한다거나, 핵막과 결합하는 등의 기능을 하고 있다. Telomere is a part of DNA that exists at the end of a chromosome. In the initial state where the repetitive arrangement of TTAGGG is continued in the case of a human chromosomal gene, the DNA is about 10 kb in length. In telomeres, various binding proteins bind to each other to inhibit the DNA ends from being bonded to each other to form a circular DNA, or to bind to the nuclear membrane.

텔로미어(Telomeres)는 진핵세포 염색체의 말단에서 발견되며 염색체들의 분해나 말단-대-말단 융합을 방지하는 특별한 구조이다. 텔로머릭(telomeric) DNA는 짧은 염기서열의 직렬 반복(인간의 경우 TTAGGG)으로 구성된 일차적 구조로서, 그 길이는 하등 진핵세포의 수백 bp에서부터 포유동물 세포의 수천 bp까지 변화한다. 텔로머릭 DNA 부분은 동원체(centromere) 영역에서와 같이 GC의 불균형(GC-rich)을 나타낸다. 이러한 성질은 염색체가 복제될 때 종래 DNA 폴리머라제에 의한 G-가닥의 불완전 복제를 야기하여, 노출된 반대 가닥의 C-가닥이 핵산 제거 효소에 의해 분해되거나 텔로머라제에 의한 합성으로 텔로머릭 말단부위가 완성될 수 있다.Telomeres are found at the ends of eukaryotic chromosomes and are a special structure that prevents the breakdown of chromosomes or terminal-to-terminal fusion. Telomeric DNA is a primary structure composed of tandem repeats of short base sequences (TTAGGG in humans) whose length varies from several hundred bp in lower eukaryotic cells to thousands of bp in mammalian cells. The telomeric DNA portion exhibits GC imbalance (GC-rich) as in the centromere region. This property leads to incomplete replication of the G-strand by the conventional DNA polymerase when the chromosome is replicated, so that the C-strand of the exposed opposite strand is degraded by the nucleic acid-removing enzyme or by the telomerase, The site can be completed.

텔로머라제(Telomerase)는 활성 소단위인 TERT (human telomerase reverse transcriptase) 효소와 텔로머릭 DNA의 합성을 위한 주형을 제공하는 RNA 성분인 TR(Telomerase RNA)로 구성된 리보뉴클레오프로테인(ribonucleop rotein) 복합체이다(Greider and Blackburn, 1989). 모든 텔로머라제 활성 소단위에서 보존된(conserved) 도메인은 레트로바이러스 및 레트로 트랜스포존로부터의 역전사효소(RT)의 활성 도메인과 구조적으로 관련되어 있다. 비록 TERT와 TR이 텔로머라제 리보뉴클레오프로테인 구조체의 최소 단위이지만, 다른 단백질들도 이 효소 복합체와 구조적으로 또는 일시적으로 연관되어 있음이 밝혀져 잇다.Telomerase is a ribonucleoprotein complex consisting of telomerase RNA (TR), an RNA component that provides a template for the synthesis of telomeric DNA and telomerase DNA, an active subunit of human telomerase reverse transcriptase (TERT) (Greider and Blackburn, 1989). The conserved domain in all telomerase activity subunits is structurally related to the active domain of the retrovirus (RT) from retrovirus and retrotransposon. Although TERT and TR are minimal units of telomerase ribonucleoprotein constructs, other proteins have also been found to be structurally or temporally related to this enzyme complex.

텔로미어의 주요 기능은 염색체 말단을 캡핑하는 것과 분해, 말단 대 말단 융합, 및 비정형 재조합으로부터 염색체를 보호하는 것이며, 이는 게놈의 안전성 유지 및 세포 증식 조절과도 관련되어 있다. 반복된 세포 분열 후에 텔로미어의 단축(telomere shortening)이 일어나는데, 이는 복제형 노화(senescense)나 세포자살(apoptosis)를 유도하는 세포 주기 제한점 등을 활성화하여 세포 증식을 제한하게 되는데, 이는 유전적으로 불안정한 세포나 암의 기원이 될 변형세포들의 축적을 막는 순기능도 있지만, 노화나 질병이 발생할 때 장기의 항상성과 재생 그리고 생존을 제한하는 역기능도 있다. 텔로미어 단축으로 인한 조직 재생 기능의 감퇴는 줄기 세포의 기능 장애와도 관련이 있으며, 텔로미어 기능 장애는 세포 고유의 제한점들을 활성화시킬 뿐 아니라, 줄기세포를 둘러싼 미세 및 거시환경을 모두 변형시켜 줄기 세포의 기능손상을 유발한다(E Hiyama et al., British Journal of Cancer, 96: 1020-1024, 2007). The main function of telomeres is to protect chromosomes from capping chromosomal ends and from degradation, end-to-end fusion, and atypical recombination, which is also associated with maintaining genomic safety and regulating cell proliferation. Telomere shortening occurs after repeated cell division, which activates senescence or cell cycle limitation leading to apoptosis, limiting cell proliferation, which is a genetically unstable cell Although there are innate functions to prevent the accumulation of transformed cells that will be the origin of cancer, there are also dysfunctions that limit organs homeostasis and regeneration and survival when aging or disease occurs. The decrease in tissue regeneration function due to the shortening of telomeres is also related to the dysfunction of stem cells. Telomeric dysfunction not only activates cell-specific limitations but also modifies the micro and macro environment surrounding the stem cells, (E Hiyama et al., British Journal of Cancer, 96: 1020-1024, 2007).

최근에는 중간엽 줄기세포와 텔로미어 길이 및 텔로머라제 활성, 및 이를 통한 분화 조절에 대한 연구가 이루어지고 있으나(Melissa A. Baxter et al., Stem cells, 22: 675-682, 2004; Dominik Parsch et al., J. Mol. MEd., 82: 49-55, 2004), 아직까지 이에 대한 명확한 기전에 대해서는 보고된 바 없다.
In recent years, mesenchymal stem cells, telomere length and telomerase activity, and their differentiation control have been studied (Melissa A. Baxter et al., Stem cells, 22: 675-682, 2004; Dominik Parsch et al. al., J. Mol. MEd., 82: 49-55, 2004), yet no clear mechanism has yet been reported.

또한, Nanog, Oct4, Sox2 및 c-Myc 와 같은 유전자들은 줄기세포능(stemness) 관련 지표로서, 이들의 발현양이 높을수록 줄기세포의 배양 수율이 우수하고 줄기세포 특성이 우수하게 유지되고 있음을 알 수 있기 때문에 연구에 유용하게 이용되고 있다.
In addition, genes such as Nanog, Oct4, Sox2, and c-Myc are indicators related to stem cell function, and the higher the expression level thereof, the better the yield of stem cells and the better the stem cell characteristics are maintained It is useful for research.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 성장 인자인 HGF가 인간 세포인 중간엽 줄기세포의 줄기세포능을 조절할 수 있는 중요한 인자임을 확인하고, 이를 통해 기존의 중간엽 줄기세포의 체외 배양의 한정성을 극복할 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명의 방법이 세포치료 및 재생의학에 필요한 세포를 만들어 낼 수 있는 적합한 발명임을 제시하고자 한다.Disclosure of Invention Technical Problem [8] Accordingly, the present invention has been made in order to solve the above-mentioned problems in the prior art, and it has been confirmed that HGF as a growth factor is an important factor that regulates stem cell function of mesenchymal stem cells, It is possible to overcome the limitation of the in vitro culture of stem cells, thereby suggesting that the method of the present invention is a suitable invention capable of producing cells necessary for cell therapy and regenerative medicine.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
However, the technical problem to be solved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other matters not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the following description.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 세포 배양액에 HGF(hepatocyte growth factor)를 처리하는 단계를 포함하는 인간 세포의 줄기세포능(stemness)을 증대시키는 방법을 제공한다.In order to achieve the object of the present invention, the present invention provides a method for increasing the stemness of a human cell comprising the step of treating a cell culture medium with a hepatocyte growth factor (HGF).

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 방법은 인간 세포의 염색체 말단을 연장시키는 것일 수 있다.In one embodiment of the invention, the method may be to extend the chromosomal end of a human cell.

본 발명의 다른 실시예에 있어서, 상기 방법은 인간 세포의 수명을 연장시키는 것일 수 있다.In another embodiment of the invention, the method may be to prolong the life of human cells.

본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 방법은 인간 세포의 노화를 억제하는 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the method may be to inhibit the aging of human cells.

본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 방법은 인간 세포의 성장을 증대시키는 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the method may be to increase the growth of human cells.

본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 방법은 인간 세포의 생존력을 증대시키는 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the method may be to increase the viability of human cells.

본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 방법은 중배엽으로의 분화 효율을 증가시키는 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the method may be to increase the efficiency of differentiation into mesoderm.

본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 세포는 인간 줄기세포일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the cell may be a human stem cell.

본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 세포는 중간엽 줄기세포인 것일 수 있다.
In another embodiment of the present invention, the cell may be a mesenchymal stem cell.

본 발명의 방법을 이용하여 인간 중간엽 줄기세포의 장기 및 대량 배양이 가능하고, 분화능을 유지한 상태의 줄기 세포를 높은 수율로 확보할 수 있으므로, 본 발명의 방법은 세포치료 및 재생의학에 효과적으로 이용될 수 있다. 또한, 본 발명에서는 HGF가 세포의 노화 표시자인 텔로미어의 길이를 연장시키는 효과가 있음을 밝혔으므로, 이를 노화 방지 인자로써도 적용할 수 있다.
Since the mesenchymal stem cells of the present invention can be cultured in a long term and in a large volume using the method of the present invention, and the stem cells having the pluripotency can be obtained at a high yield, the method of the present invention is effective for cell therapy and regenerative medicine Can be used. In addition, since HGF has an effect of extending the length of telomer, which is an aging indicator of cells, the present invention can be applied as an anti-aging factor.

도 1은 BM-MSC와 ES-MSC 각각의 세포에서 텔로미어의 길이를 real time quantitative PCR을 통해 확인한 결과이다.
도 2는 ES-MSC, BM-MSC 및 UCB-MSC에서 대표적 성장인자의 분비량을 ELISA를 통해 확인한 결과이다.
도 3은 ES-MSC 및 BM-MSC에서 HGF를 처리 유무에 따른 텔로미어 길이 변화를 예상한 그림이다.
도 4는 BM-MSC에 HGF를 처리하는 방법(A), HGF가 처리된 세포에서 얻어진 gDNA를 이용한 real time gDNA PCR 결과(B), 및 HGF가 처리된 각 세포에서 살아있는 세포수, 죽은 세포수, 및 전체 세포수를 확인한 결과(C)이다.
도 5는 ES-MSC에 neuHGF를 처리하는 방법(A), neuHGF가 처리된 세포에서 얻어진 gDNA를 이용한 real time gDNA PCR 결과(B), 및 neuHGF가 처리된 각 세포에서 살아있는 세포수, 죽은 세포수, 및 전체 세포수를 확인한 결과(C)이다.
도 6은 BM-MSC에 HGF 처리에 따른 TERT 및 RAD51 mRNA 발현 변화를 real time PCR을 통해 확인한 결과이다.
도 7은 ES-MSC에 neuHGF 처리에 따른 TERT 및 RAD51 mRNA 발현 변화를 real time PCR을 통해 확인한 결과이다.
도 8은 BM-MSC 및 ES-MSC에서 자연적으로 발현되는 TERT 및 RAD51 단백질 발현양을 western blot을 통해 확인한 결과이다.
도 9는 BM-MSC에서 HGF 처리에 따른 TERT 및 RAD51 단백질 발현 변화를 western blot을 통해 확인한 결과이다.
도 10은 BM-MSC에 HGF 처리에 따른 Oct4 및 Nanog mRNA 발현 변화를 real time PCR을 통해 확인한 결과이다.
도 11은 BM-MSC에서 HGF 처리에 따른 Oct4 및 Nanog 단백질 발현양을 western blot을 통해 확인한 결과이다.
FIG. 1 shows the results of real time quantitative PCR of telomere lengths in BM-MSC and ES-MSC cells, respectively.
FIG. 2 shows the results of ELISA analysis of typical growth factors in ES-MSC, BM-MSC and UCB-MSC.
FIG. 3 is a graph showing changes in telomere length with and without HGF treatment in ES-MSC and BM-MSC.
FIG. 4 shows the results of real-time gDNA PCR (B) using gDNA obtained from cells treated with HGF, (B) the method of treating HGF with BM-MSC, , And the total number of cells (C).
5 shows the results of real-time gDNA PCR (b) using g-DNA obtained from cells treated with neuHGF (B), and the number of living cells, dead cells , And the total number of cells (C).
FIG. 6 shows the results of real-time PCR analysis of changes in TERT and RAD51 mRNA expression by BMD-MSC with HGF treatment.
FIG. 7 shows the results of real time PCR analysis of the expression of TERT and RAD51 mRNA in ES-MSC according to neuHGF treatment.
FIG. 8 shows the results of western blot analysis of the amount of TERT and RAD51 protein expressed naturally in BM-MSC and ES-MSC.
FIG. 9 shows the results of western blot analysis of changes in TERT and RAD51 protein expression by HGF treatment in BM-MSC.
FIG. 10 shows the results of real time PCR analysis of changes in Oct4 and Nanog mRNA expression in BM-MSC following HGF treatment.
Fig. 11 shows the results of western blot analysis of the amounts of Oct4 and Nanog protein expressed by HGF treatment in BM-MSC.

본 발명자들은 배아 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(ES-MSC)가 골수 유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC)에 비해 성장속도도 빠르고, 건강한 상태로 배양을 유지할 수 있는 기간 또한 길다는 점에 착안하여, 이러한 차이를 유발하는 인자를 밝히기 위해 연구를 수행한 결과, 다양한 성장 인자 중 HGF가 중간엽 줄기세포의 줄기세포능(stemness)을 조절할 수 있는 중요한 핵심 인자임을 확인하였다. 따라서, 중간엽 줄기세포에 HGF를 처리할 경우, 텔로미어(telomere), 즉 염색체 말단 부분을 연장시킬 수 있으며, 세포의 수명을 연장시키거나 노화를 억제할 뿐 아니라, 세포의 성장 및 생존력을 증대시켜 세포를 대량으로 배양하여 기존의 중간엽 줄기세포의 체외 배양의 한정성을 극복할 수 있음을 밝혔으며, 줄기세포능의 지표로 이용되는 Oct4 및 Nanog 등의 발현을 증가시킬 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명의 방법이 세포치료 및 재생의학에 효과적으로 적용될 수 있다는 사실을 규명하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
The inventors of the present invention found that the ES-MSC derived from embryonic stem cells is faster than BM-MSCs and has a longer period of being able to maintain culture in a healthy state. As a result, HGF was found to be an important key factor controlling the stemness of mesenchymal stem cells. Therefore, when HGF is treated on mesenchymal stem cells, it is possible to extend the telomere, i.e., the chromosomal terminal portion, to prolong cell life or inhibit aging, and to increase cell growth and viability The present inventors have shown that the expression of Oct4 and Nanog, which are used as an indicator of stem cell function, can be increased by culturing a large number of cells, thereby overcoming the limitation of in vitro culture of existing mesenchymal stem cells, The inventors of the present invention have found that the method of the present invention can be effectively applied to cell therapy and regenerative medicine, and have completed the present invention based thereon.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 세포 배양액에 HGF(hepatocyte growth factor)를 처리하는 단계를 포함하는 줄기세포능(stemness)을 증대시키는 방법을 제공한다.
The present invention provides a method for enhancing stemness comprising the step of treating a cell culture medium with HGF (hepatocyte growth factor).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 세포 배양액은 인간 세포 배양액이고, 상기 인간 세포는 중간엽 줄기세포이며, 상기 중간엽 줄기세포는 골수, 지방 조직, 제대혈, 말초혈, 신생아 조직, 인간 태반 등 인체의 여러 조직과 만능 줄기세포에서 유래할 수 있으며, 골수에서 유래한 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
According to a preferred embodiment of the present invention, the cell culture fluid is a human cell culture fluid, and the human cells are mesenchymal stem cells, and the mesenchymal stem cells are selected from the group consisting of bone marrow, adipose tissue, cord blood, peripheral blood, neonatal tissue, But may be derived from various tissues of the human body and pluripotent stem cells, and is preferably derived from bone marrow, but is not limited thereto.

본 명세서에서 용어 "줄기세포(stem cell)"는 생물 조직을 구성하는 다양한 세포들로 분화할 수 있는 세포로서, 조직 및 기관의 특수화된 세포를 형성하도록 비제한적으로 재생할 수 있는 미분화 세포들을 지칭한다. 줄기세포는 발달 가능한 만능성 또는 다능성 세포이다. 줄기세포는 2개의 딸 줄기세포, 또는 하나의 딸줄기세포와 하나의 유래(전이(transit)) 세포로 분열될 수 있으며, 이후에 조직의 성숙하고 완전한 형태의 세포로 증식된다.As used herein, the term "stem cell" refers to a cell capable of differentiating into various cells constituting a biological tissue, and refers to undifferentiated cells capable of regenerating unrestrictedly to form specialized cells of tissues and organs . Stem cells are pluripotent or pluripotent cells that can develop. Stem cells can divide into two daughter stem cells, or one daughter stem cell and one derived (transit) cell, and then multiply into the mature and complete form of the tissue.

본 명세서에서 용어 "중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell; MSC)"는 생체내 여러 유형의 중간엽 계통, 예를 들어 골세포(Osteocytes), 연골세포(Chondrocytes), 힘줄세포(tendinocytes),지방세포(Adipocytes), 근육세포(Myocytes), 및 섬유아세포(Fibroblasts) 등으로 분화가 가능한 다분화능(multipotency)을 가진 줄기세포를 의미하며, 골수, 지방 조직, 제대혈(cord blood), 말초혈, 신생아 조직(neonatal tissues), 인간 태반 등의 다양한 성인 조직으로부터 분리될 수 있다.As used herein, the term " mesenchymal stem cell (MSC) "refers to various types of mesenchymal systems in vivo, such as osteocytes, chondrocytes, tendinocytes, Refers to stem cells having multipotency capable of differentiating into adipocytes, myocytes, and fibroblasts. The term "stem cells" includes bone marrow, adipose tissue, cord blood, peripheral blood, neonatal tissue neonatal tissues, the human placenta, and the like.

본 명세서에서 사용되는 용어 "세포 배양액"은 배양된 세포가 포함되어 있는 배지를 의미하고, 상기 "배지"는 당업계에서 통상적으로 이용되는 동물세포용 배지를 의미한다. 본 발명에서 이용될 수 있는 배지는 동물세포의 배양에 통상적으로 이용되는 어떠한 배지도 가능하며, 예를 들어, Eagles's MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959)), α-MEM (Stanner,C.P. et al., Nat. New Biol. 230:52(1971)), Iscove's MEM (Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147:923(1978)), 199 배지 (Morgan et al., Proc. Soc. Exp. Bio. Med., 73:1(1950)), CMRL 1066, RPMI 1640 (Moore et al., J. Amer. Med. Assoc. 199:519(1967)), F12 (Ham, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53:288(1965)), F10 (Ham, R.G. Exp. Cell Res. 29:515(1963)), DMEM (Dulbecco's modification of Eagle's medium, Dulbecco, R. et al., Virology 8:396(1959)), DMEM과 F12의 혼합물 (Barnes, D. et al., Anal. Biochem. 102:255(1980)), Way-mouth's MB752/1 (Waymouth, C. J. Natl. Cancer Inst. 22:1003(1959)),McCoy's 5A (McCoy, T.A., et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 100:115(1959)) 및 MCDB 시리즈 (Ham, R.G. et al., In Vitro 14:11(1978)) 등이 이용될 수 있다. 바람직하게는 α-MEM, Eagles's MEM, Iscove's MEM, 199 배지, CMRL 1066, RPMI 1640, F12, F10, DMEM, Way-mouth's MB752/1 및 McCoy's 5A로 구성된 군으로부터 선택되며, 가장 바람직하게는 α-MEM 배지일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.As used herein, the term "cell culture fluid" means a medium containing cultured cells, and the term " medium "means an animal cell culture medium commonly used in the art. The medium which can be used in the present invention may be any medium conventionally used for culturing animal cells, for example, Eagle's MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130: 432 (1959) Iscove's MEM (Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147: 923 (1978)), 199 medium (Moore et al., J. Amer. Med. Assoc. 199: 519 (1967)), CMRL 1066, RPMI 1640 (Moore et al., Proc. Soc. Exp. Bio. Med., 73: ), F12 (Ham, Proc. Natl. Acad Sci. USA 53: 288 (1965)), F10 (Ham, RG Exp. Cell Res. 29: 515 (1963)), Dulbecco's modification of Eagle's medium, Dulbecco (Barnes, D. et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980)), Way-mouth's MB752 / 1 (Waymouth, 100: 115 (1959)) and the MCDB series (Ham, RG (1959)), McCoy's 5A (McCoy, TA, et al., Proc. Soc. Exp. Biol. et al., In Vitro 14: 11 (1978)). Preferably selected from the group consisting of? -MEM, Eagles' MEM, Iscove's MEM, 199 medium, CMRL 1066, RPMI 1640, F12, F10, DMEM, Way-mouth's MB752 / 1 and McCoy's 5A, MEM medium, but is not limited thereto.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 배지는 혈청을 추가적으로 포함한다. 본 발명에서 배지에 포함되는 혈청은 당업계에서 인식하는 목적으로 첨가되며, 중간엽 줄기세포의 증식에 있어서 성장인자(growth factors)의 공급원으로서 중요한 역할을 한다. 이용될 수 있는 혈청은, 바람직하게는 FBS(fetal bovine serum), BCS(bovine calf serum), 말 혈청(horse serum) 또는 인간 혈청(human serum)이며, 가장 바람직하게는 FBS일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.According to a preferred embodiment of the present invention, the medium of the present invention further comprises serum. In the present invention, the serum contained in the medium is added for the purpose recognized in the art and plays an important role as a source of growth factors in the proliferation of mesenchymal stem cells. Serum that can be used is preferably fetal bovine serum (FBS), bovine calf serum (BCS), horse serum or human serum, most preferably FBS, It is not.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 혈청의 배지 내 함량은 4-30 중량%이다. 보다 바람직하게는 본 발명의 혈청의 배지 내 함량은 5-15 중량%이며, 가장 바람직하게는 약 10 중량%이다.
According to a preferred embodiment of the present invention, the content of serum of the present invention in the medium is 4-30% by weight. More preferably, the content of the serum of the present invention in the medium is 5-15% by weight, and most preferably about 10% by weight.

본 발명은 또한, 상기 본 발명의 방법에 의해 유도 활성화된 줄기세포를 포함하는 세포 치료제를 제공한다. 구체적으로, 상기 세포 치료제는 지방세포, 골세포, 연골세포, 근육세포, 신경세포, 심근세포 형성 등에 이용될 수 있다.The present invention also provides a cell therapy agent comprising stem cells induced by the method of the present invention. Specifically, the cell therapeutic agent can be used for adipocyte, bone cell, cartilage cell, muscle cell, neuron, and myocardial cell formation.

본 발명에서 사용된 용어 "세포 치료제"는 인간으로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 또는 조직으로 질병의 치료, 진단 또는 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA 규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식, 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 또는 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다. 세포치료제는 세포의 분화 정도에 따라 크게 체세포치료제, 줄기세포치료제로 분류되며 본 발명은 특히 줄기세포 치료제에 관한 것이나, 이에 한정되지 않는다.
The term "cell therapeutic agent" used in the present invention is a cell or tissue prepared from a human by separation, culture and special manipulation, and is used for the purpose of treatment, diagnosis or prevention of disease (US FDA regulation) Diagnosis, or prevention through a series of actions, such as alive, homologous, or xenogeneic cell propagation, screening, or otherwise altering the biological characteristics of a cell, in order to restore function of the cell it means. The cell therapy agent is classified into a somatic cell treatment agent and a stem cell treatment agent according to the degree of cell differentiation, and the present invention is not limited to the stem cell treatment agent.

본 발명은 HGF(Hepatocyte growth factor)를 포함하는 인간 세포의 줄기세포능(stemness)을 증대시키는데 유용한 세포 배양 배지를 제공한다.
The present invention provides a cell culture medium useful for increasing the stemness of a human cell comprising HGF (Hepatocyte growth factor).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 HGF는 1-100 ng/ml의 농도로 배지내에 포함되는 것이 바람직하고, 1-10 ng/ml의 농도로 포함되는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.According to a preferred embodiment of the present invention, the HGF of the present invention is preferably contained in the medium at a concentration of 1-100 ng / ml, more preferably 1-10 ng / ml, It is not.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 배지는 혈청을 추가적으로 포함하고, 본 발명의 배지에는 혈청 이외에 줄기세포를 효율적으로 배양하기 위해 통상적인 줄기세포 배양용 조성물로 당업계에 알려진 어떠한 성분도 포함될 수 있다.
According to a preferred embodiment of the present invention, the culture medium of the present invention additionally contains serum, and in the culture medium of the present invention, any composition known in the art as a composition for culturing stem cells in order to efficiently cultivate stem cells other than serum .

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in order to facilitate understanding of the present invention. However, the following examples are provided only for the purpose of easier understanding of the present invention, and the present invention is not limited by the following examples.

[[ 실시예Example ]]

실시예Example 1.  One. BMBM -- MSCMSC Wow ESES -- MSCMSC 간 텔로미어 길이 비교 Liver Telomere Length Comparison

본 발명자들은 배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(ES-MSC)가 기존의 골수 유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC)에 비해 체외 배양시 성장속도도 빠르고 건강한 상태로 배양을 유지할 수 있는 기간이 길며, 세포치료제로서의 효능도 우수한 것으로 나타남에 따라, 그 원인을 분석하고자 실험을 수행하였다.The present inventors have found that ES cell MSCs have a longer growth period and a longer period of time in which they can maintain a healthy state when cultured in vitro, compared with BM-MSCs derived from bone marrow cells (BM-MSC) , And as an excellent cell therapeutic agent, the experiment was conducted to analyze the cause thereof.

먼저, 체외 배양 기간의 차이를 유발할 수 있는 잣대로 BM-MSC 세포와 ES-MSC 각각 세포의 텔로미어 길이를 Real-Time Quantitative PCR을 수행하여 그 길이를 비교해 보았다.
First, the telomere lengths of BM-MSC and ES-MSC cells were measured by real-time quantitative PCR and compared with each other.

BM-MSC는 Lonza에서 구매하여 사용하였고, ES-MSC는 하기의 방법에 의해 제작 및 배양하였다. BM-MSC was purchased from Lonza, and ES-MSC was prepared and cultured by the following method.

(1) (One) 배아체Embryonic body 형성 formation

미분화 상태로 유지되던 서울대병원 인간 배아줄기세포(동양인#1, 남성, STO feeder)에 대하여 단백질분해효소(dispase, 2mg/ml)로 처리하고 미세 작업으로 분리한 다음 bFGF가 없는 배아줄기세포 배지에서 부유 상태로 14일간 배양하였다.The human embryonic stem cell (SNP # 1, male, STO feeder), which was maintained in undifferentiated state, was treated with protease (2 mg / ml) And cultured for 14 days in a floating state.

(2) (2) 중간엽Intermediate lobe 줄기세포로의 분화 유도 Induction of differentiation into stem cells

14일간의 부유 배양으로 만들어진 배아체를 조직 배양 접시에 부착시킨 다음 자연적으로 중간엽 줄기세포의 분화를 유도하였다. 상기 배아체를 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)에 FBS(fetal bovine serum)를 첨가(10% v/v)한 배지에서 16일간 배양하면서 중간엽 줄기세포의 분화유도를 관찰하였다. After 14 days of suspension culture, embryos were attached to a tissue culture dish and naturally differentiated mesenchymal stem cells were induced. The embryoid bodies were cultured in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) supplemented with fetal bovine serum (FBS) (10% v / v) for 16 days to induce differentiation of mesenchymal stem cells.

(3) 분화유도된 (3) 중간엽Intermediate lobe 줄기세포의 유지 및 증식 배양  Stem cell maintenance and proliferation culture

상기 실시예 1-(2)에서 배아체 부착 후 16일간 배양하여 분화유도된 중간엽 줄기세포에 대하여 효소(Trypsin-EDTA, 0.25% Trypsin with EDTA 4Na) 를 처리하고 단일 세포로 해체시킨 다음 다시 조직 배양 접시에 부착시켰다. 이 후 배양액 총 500㎖ 중 hEGF 0.5㎖ (human Epidermal Growth Factor), VEGF 0.5㎖ (Vascular Endothelial Growth Factor), hFGF-B 2㎖ (human Fibroblast Growth Factor-basic), IGF-1 0.5㎖ (Insulin-like Growth Factor), 히드로코르티손 (hydrocortisone) 0.2㎖ 및 아스코르브산 0.5㎖ 과 기본 배지 470㎖이 첨가된 배지 (EGM-2MV, CC4147, Lonza) 를 이용하여 37℃에서 유지 및 증식 배양시켰다.
The mesenchymal stem cells that were cultured for 16 days after adhering the embryos in Example 1- (2) were treated with enzyme (Trypsin-EDTA, 0.25% Trypsin with EDTA 4Na), disassembled into single cells, And attached to a culture dish. After that, 0.5 ml of human epidermal growth factor (VEGF), 0.5 ml of vascular endothelial growth factor (hGF), 2 ml of human fibroblast growth factor (basic factor), 0.5 ml of insulin- (EGM-2MV, CC4147, Lonza) supplemented with 0.2 ml of growth factor, 0.2 ml of hydrocortisone, 0.5 ml of ascorbic acid and 470 ml of a basic medium.

각각 배양된 BM-MSC 및 ES-MSC에서 TRIzol 방법을 통해 RNA를 분리하고, 추출된 1ug에 해당하는 양의 RNA와 RNase-free water를 섞어 총량 9 ul가 되도록 만든 다음, 70℃에서 10분 동안 가열해준 후, 샘플을 바로 얼음 위로 옮긴 다음, RT-reaction mixture(25mM MgCl2, 10X RT bufer, 10mM dNTP mixture, RNasin, Oli해 (dT) primer, AMV Reverse Transcriptase) 11ul를 넣어 vortexing하여 섞어주었다. 이후, 50℃에서 1시간, 95℃에서 5분, 4℃ 지속 조건으로 PCR을 수행하여, 각 세포에서 cDNA를 제작하였다. RNA was isolated from each cultured BM-MSC and ES-MSC by the TRIzol method, and the amount of RNA extracted with 1 ug of RNase-free water was mixed to make a total amount of 9 μl. Then, the mixture was incubated at 70 ° C for 10 minutes After heating, the sample was immediately transferred onto ice and vortexed by adding 11 μl of the RT-reaction mixture (25 mM MgCl 2, 10 × RT Buffer, 10 mM dNTP mixture, RNasin, Oli solution (dT) primer and AMV Reverse Transcriptase). Thereafter, PCR was carried out at 50 ° C for 1 hour, 95 ° C for 5 minutes, and 4 ° C, and cDNA was prepared from each cell.

다음으로, 상기 제작된 cDNA를 Power SYBR Green PCR master mix(cat#ABS-4367659)를 이용하여, Real-time PCR을 수행하였다. 이때, 서열번호 1 및 2의 terlomere primer를 이용하였으며, 대조군으로 acidic ribosomal phosphoprotein O를 코딩하는 36B4를 증폭할 수 있는 서열번호 3 및 4의 36B4 primer를 이용하였다. Next, the prepared cDNA was subjected to real-time PCR using Power SYBR Green PCR master mix (cat # ABS-4367659). At this time, terlomere primers of SEQ ID NOS: 1 and 2 were used, and 36B4 primers of SEQ ID NOS: 3 and 4 were used as a control group to amplify 36B4 coding for acidic ribosomal phosphoprotein O. [

이때, 구체적인 PCR 조건은 하기 [표 1]과 같으며, 기본적으로, 보고자 하는 target은 한 sample 당 3번씩 반복 실험을 수행하였다.
At this time, the specific PCR conditions are as shown in Table 1 below. Basically, repeated target experiments were repeated three times per one sample.

Real time Quantitative PCR condition of telomere lengthReal time Quantitative PCR condition of telomere length Telomere conditionTelomere condition 36B4 condition36B4 condition 50℃ 2min50 ° C 2 min 50℃ 2min50 ° C 2 min 95℃ 10min95 ° C 10 min 95℃ 10min 95 ° C 10 min 95℃ 15sec95 ° C 15 sec 95℃ 15sec95 ° C 15 sec 54℃ 2min54 ° C 2 min 58℃ 1min58 ° C 1 min for 40 cyclefor 40 cycles for 40 cyclefor 40 cycles

그 결과, BM-MSC에 비해 ES-MSC에서 텔로미어의 길이가 약 2배 이상 유의적으로 긴 것을 확인하였다(도 1).
As a result, it was confirmed that the length of the telomere in ES-MSC was significantly longer than that of BM-MSC by about two times or more (Fig. 1).

실시예Example 2.  2. BMBM -- MSCMSC Wow ESES -- MSCMSC 에서 대표적 성장인자의 분비량 확인Of the growth factor

상기 실시예 1에서 BM-MSC와 ES-MSC에서 텔로미어의 길이 차이를 발생시키는 유발 인자를 발굴하기 위하여, 각각의 세포에서 대표적 성장인자인 FGF-2, VEGF, HGF의 분비량을 확인하기 위하여, ELISA를 수행하였다. In order to identify the inducing factors that cause the telomere length difference in BM-MSC and ES-MSC in Example 1, in order to determine the secretion amounts of FGF-2, VEGF and HGF, representative growth factors in each cell, Respectively.

구체적으로, 96 well plate의 각 well당 coating solution(carbonate-bicabonate buffer capsules, sigma)에 희석시킨 항원 50 ul(250ng/well)을 넣고, 37℃ 인큐베이터에서 2시간 동안 놓아두거나, 혹은 4℃에서 18시간 동안 놓아두어 항원을 코팅시켰다. 이후, 항원이 들어있는 coating solution을 제거하고, 각 well에 200ul의 blocking solution을 넣은 다음, 37℃에서 30분 내지 1시간 동안 반응시켰다. 그 다음, blocking solution을 제거하고, 300ul의 TBST(0.1M Tris-buffered ssaline, pH7.4 with 0.1% Tween 20)를 넣고, 5분 동안 washing하였다. (50 ng / well) diluted in a coating solution (carbonate-bicabonate buffer capsules, Sigma) per 96 well plate was placed in a 37 ° C incubator for 2 hours, For a period of time to coat the antigen. Subsequently, the coating solution containing the antigen was removed, 200 ul of blocking solution was added to each well, and the mixture was reacted at 37 ° C for 30 minutes to 1 hour. The blocking solution was then removed and 300 ul of TBST (0.1 M Tris-buffered ssaline, pH 7.4 with 0.1% Tween 20) was added and washed for 5 minutes.

이후, 96 well plate의 각 well당 coating solution에 희석시킨 1차 항체(HGF antibody(ab83760, 1:1000 희석); VEGF antibody(ab1316, 1:1000 희석); bFGF antibody(ab126861, 1:1000 희석)) 50 ul을 넣어, 37℃ 인큐베이터에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응시킨 plate는 TBST buffer를 이용하여, 3번 washing한 다음, 1차 항체와 직접적으로 반응하는, HRP가 labeling되어 있는 2차 항체(Secondary HGF antibody-Anti Rabbit IgG HRP(Sigma aldrich A0545-1ML, 1:1000 희석); Secondary VEGF antibody-Donkey anti-mouse igG HRP(sc-2314, 1:1000 희석); Secondary bFGF antibody-Anti-Rabbit IgG HRP(Sigma aldrich A0545-1ML, 1:1000 희석)) 50 ul를 넣어, 37℃ 인큐베이터에서 1시간 동안 반응시켰다. (1: 1000 dilution), bFGF antibody (ab126861, 1: 1000 dilution), VEGF antibody (ab1316, 1: 1000 dilution), and the diluted primary antibody (HGF antibody ), And reacted in an incubator at 37 占 폚 for 1 hour. The reacted plate was washed three times with TBST buffer and then incubated with a secondary antibody (Secondary HGF antibody-Anti Rabbit IgG HRP (Sigma aldrich A0545-1ML, 1) labeled directly with the primary antibody Secondary bFGF antibody-Anti-Rabbit IgG HRP (Sigma aldrich A0545-1ML, 1: 1000 dilution) was added to 50 ul of a secondary VEGF antibody-Donkey anti-mouse igG HRP And allowed to react for 1 hour in a 37 ° C incubator.

그 다음, 2차 항체가 담긴 caoting solution을 제거하고, TBST buffer를 이용하여 5번 washing한 후, substrate(4mg OPD and 5ul hydrogen peroxide in citrate-phosphate buffer)를 이용하여 반응시키고, 1N H2SO4를 이용하여 반응을 중지시키고, ELISA reader를 이용하여 492nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. After washing with TBST buffer for 5 times, the reaction was carried out using 4 mg of OPD and 5 μl of hydrogen peroxide in citrate-phosphate buffer, and 1N H 2 SO 4 , And the absorbance at 492 nm was measured using an ELISA reader.

그 결과, 배아 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(ES-MSC)에서만 HGF 성장인자가 현저히 분비됨을 확인하였다(도 2).
As a result, it was confirmed that HGF growth factor was secreted only in embryonic stem cell-derived mesenchymal stem cells (ES-MSC) (FIG. 2).

실시예Example 3.  3. HGFHGF 처리 유무에 따른 줄기 세포의 텔로미어 길이 변화 및 세포 성장 확인 Changes in telomere length and cell growth of stem cells according to treatment status

상기 실시예 2의 결과를 토대로, HGF 성장인자가 줄기세포의 텔로미어 길이를 조절하는 데 중요한 핵심 인자임을 확인하기 위하여, HGF를 차단하였을 경우에는 기존 HGF가 다량 발현되면 ES-MSC에서는 텔로미어의 길이가 짧아지고, HGF를 처리하였을 경우에는 기존 HGF가 소량 발현되던 BM-MSC에서 텔로미어의 길이가 길어질 것이라는 가정하에(도 3), 이를 실험적으로 확인하였다.
Based on the results of Example 2, in order to confirm that HGF growth factor is a key factor in regulating the telomere length of stem cells, when HGF is blocked, when the existing HGF is expressed in a large amount, the length of telomere in ES- (Fig. 3), when the HGF was treated, the length of the telomere in the BM-MSC in which a small amount of existing HGF was expressed would become longer (FIG. 3).

3-1. 3-1. HGFHGF 처리에 따른  Depending on the treatment BMBM -- MSCMSC 의 텔로미어 길이 변화 및 세포 성장 확인Of telomere length and cell growth

우선적으로, HGF 처리에 따른 BM-MSC의 텔로미어 길이 변화를 확인하기 위하여, recombinant HGF를 세포에 처리하였다.First, recombinant HGF was treated on the cells to confirm the telomere length change of BM-MSC following HGF treatment.

구체적으로, 60mm plate에 BM-MSC의 confluency 가 60% 되도록 cell을 준비하고, HGF를 처리하기 전, media를 새것으로 갈아준 다음, HGF(R&D Systems (cat no. 294-HG-005)) 10 ng/ml을 처리하고 24h 동안 놓아두었다. 이를 24시간 간격으로 5일 동안 반복하고, 5일 후에, gDNA 및 Protein lysis buffer, RNA lysis buffer를 이용하여 gDNA, Protein, RNA 샘플을 수거하였다. 이후, 얻어진 sample을 이용하여, 상기 실시예 1에 기재된 방법과 같이, Real time gDNA PCR을 수행하여 HGF 처리에 따른 텔로미어 길이를 비교하였다. Specifically, cells were prepared so that the confluency of BM-MSC was 60% on a 60 mm plate, and the medium was replaced with a new one before HGF treatment, and then HGF (R & D Systems (Cat No. 294-HG-005) ng / ml was treated and left for 24 h. This was repeated for 5 days at intervals of 24 hours. After 5 days, gDNA, protein and RNA samples were collected using gDNA and protein lysis buffer and RNA lysis buffer. Using the obtained samples, real time gDNA PCR was performed as in the method described in Example 1 to compare telomere lengths according to HGF treatment.

이와 함께, automated cell counter를 이용하여, 세포 생존율, 총 세포수, 살아있는 세포수, 죽은 세포수를 측정하여, HGF 처리 유무에 따른 줄기 세포의 성장 및 생존력 증대 효과를 확인하였으며, 이때, 사용 기기로는 Countess  automated cell counter (Invitrogen)를 이용하였고, 사용재료로는 Countess Cell Counting Chamber Slides (Invitrogen, Cat#. C10228) 및 Trypan blue stain 0.4% (Invitrogen, Cat#. T10282, Lot#. 1144043)을 이용하였다.In addition, the cell viability, the total number of cells, the number of living cells and the number of dead cells were measured using an automated cell counter to confirm the growth and viability of stem cells according to the presence or absence of HGF treatment. (Invitrogen, Cat #. T10282, Lot #. 1144043) was used as a countess cell counting chamber slides (Invitrogen, Cat # C10228) and 0.4% Trypan blue stain Respectively.

구체적으로, 하기의 방법을 토대로 세포수를 측정하였다. Specifically, the number of cells was measured based on the following method.

우선, 세포 원심분리기로 세포를 tube의 바닥으로 모은 후(Cell Down), 상층액을 제거하고, 1ml media를 넣고 pipetting 하여 세포를 풀어준 후, media 4ml를 더 넣어서 최종 볼륨이 5ml 되도록 하였다. Effendorf tube에 Trypan blue와 상기 media에 희석시킨 세포를 1:1로 넣어주었으며(각각 10μl 씩), pipetting으로 잘 섞어준 후, Countess  Cell Counting Chamber Slides에 10μl를 넣어주었다. 그 다음, Countess  automated cell counter 기계를 이용하여, ml당 총 세포 수와 살아있는 세포 수, 죽은 세포 수 및 생존율이 측정하였다. First, the cells were collected on the bottom of the tube using a cell centrifuge (Cell Down), and the supernatant was removed. 1 ml of media was added, and the cells were released by pipetting. Then, 4 ml of media was added to make a final volume of 5 ml. Trypan blue and diluted cells in the media were added to the Effendorf tube (1: 1 each) (10 μl each), mixed well by pipetting, and 10 μl was added to the Countess Cell Counting Chamber Slides. Then, total cell number, viable cell count, dead cell count and survival rate per ml were measured using a Countess automated cell counter machine.

그 결과, HGF가 발현되지 않던 BM-MSC에 HGF를 처리할 경우, 처리하지 않은 경우에 비해 약 8배 정도 텔로미어의 길이가 길어졌음을 확인하였으며(도 4B), 세포의 성장이 증가하였을 뿐 아니라, 죽은 세포수도 줄어들었음을 확인하였다(도 4C).
As a result, when HGF was treated with BM-MSC, in which HGF was not expressed, it was confirmed that the telomer length was increased about 8 times as compared with the case without treatment (Fig. 4B) , And the number of dead cells was reduced (Fig. 4C).

3-2. 3-2. HGFHGF 차단에 따른  Due to interception ESES -- MSCMSC 의 텔로미어 길이 변화 및 세포 성장 확인Of telomere length and cell growth

다음으로, HGF 차단에 따른 ES-MSC의 텔로미어 길이 변화를 확인하기 위하여, Neutralizing HGF 항체(neuHGF)를 세포에 처리하였다. Next, in order to confirm telomere length change of ES-MSC due to HGF blockade, Neutralizing HGF antibody (neuHGF) was treated to the cells.

구체적으로, 60mm plate에 ES-MSC의 confluency 가 60% 되도록 cell을 준비하고, Neutralizing HGF 항체를 처리 하기 전, media를 새것으로 갈아준 다음, Neutralizing HGF 항체(abcam (cat no. ab10678)) 0.5ug/ml을 처리하고 24h 동안 놓아주었다. 이를 24시간 간격으로 5일 동안 반복하고, 5일 후에, gDNA 및 Protein lysis buffer, RNA lysis buffer를 이용하여 gDNA, Protein, RNA 샘플을 수거하였다. 이후, 얻어진 sample을 이용하여, 상기 실시예 1에 기재된 방법과 같이, Real time gDNA PCR을 수행하여 HGF 처리 유무에 따른 텔로미어 길이를 비교하였다. Specifically, cells were prepared so that the confluency of ES-MSC was 60% on a 60-mm plate, and the media was replaced with a Neutralizing HGF antibody (abcam (cat no. Ab10678)) of 0.5 μg / ml and treated for 24 h. This was repeated for 5 days at intervals of 24 hours. After 5 days, gDNA, protein and RNA samples were collected using gDNA and protein lysis buffer and RNA lysis buffer. Then, real time gDNA PCR was performed using the obtained samples as in the method described in Example 1 to compare telomere lengths with and without HGF treatment.

아울러, 상기 실시예 3-1에 기재된 세포수 측정 방법을 이용하여, HGF 차단 후, ES-MSC의 세포수 변화를 확인하였다. In addition, the number of cells of ES-MSC after HGF blockade was confirmed using the cell count measuring method described in Example 3-1.

그 결과, HGF가 강하게 발현되던 ES-MSC에 neutralizing HGF 항체를 처리하여 HGF를 차단할 경우, 처리하지 않은 경우에 비해 약 절반 정도로 텔로미어의 길이가 줄어들었음을 확인하였으며(도 5B), 세포의 성장이 줄어들었을 뿐 아니라, 죽은 세포수도 증가하였음을 확인하였다(도 5C).
As a result, it was confirmed that when HGF was blocked by treating neutralizing HGF antibody with ES-MSC, in which HGF was strongly expressed, the length of telomer was reduced to about half that of untreated ES (Fig. 5B) (Fig. 5C), as well as the number of dead cells increased.

상기 결과를 통하여, HGF는 중간엽 줄기세포의 염색체 말단을 연장시킴으로써, 세포의 수명을 연장시키고, 노화를 억제할 뿐 아니라, 성장 및 생존력을 증대시킬 수 있음을 알 수 있었다.
From the above results, it was found that HGF prolongs the life span of the mesenchymal stem cells, prolongs the cell life, inhibits aging, and increases the growth and viability.

실시예Example 4.  4. 중간엽Intermediate lobe 줄기세포에서  In stem cells HGFHGF 의 텔로미어 연장 기전 규명Of telomere extension

상기 실시예 3에서 확인한 바와 같이, 중간엽 줄기세포에서 HGF 유무에 따라 염색체 말단인 텔로미어의 길이가 조절됨에 있어, 그 기전을 확인하기 위하여, 텔로미어 연장과 관련된 대표적 인자인 TerT와 함께 최근에 알려진 RAD51의 발현이 HGF와 상관성이 있는지를 확인하였다.
As confirmed in Example 3, in order to confirm the mechanism of the telomeres, the length of the chromosomal ends of the mesenchymal stem cells was regulated according to the presence or absence of HGF. In order to confirm the mechanism, Was correlated with HGF.

4-1. 4-1. RealReal timetime PCRPCR 결과 확인 Check the result

우선, 상기 실시예 3-1 및 3-2의 방법과 같이, BM-MSC에 HGF를 처리한 세포 및 ES-MSC에 neuHGF를 처리한 세포에서 TERT와 RAD51의 mRNA 발현율을 비교하였으며, 이때, 상기 실시예 1의 real time PCR 방법을 이용하였다. First, mRNA expression ratios of TERT and RAD51 were compared in cells treated with HGF and cells treated with neuHGF in ES-MSC as in Examples 3-1 and 3-2, Real time PCR method of Example 1 was used.

구체적으로, RAD51 및 TERT mRNA 발현율 비교를 위한 Real time PCR은 서열번호 5 및 6의 프라이머(hRAD51 증폭 프라이머), 및 서열번호 7 및 8의 프라이머(hTERT 증폭 프라이머)를 이용하였으며, 그 구체적인 PCR 조건은 하기 [표 2]와 같다.
Specifically, the primers (hRAD51 amplification primer) of SEQ ID NOs: 5 and 6 and the primers (hTERT amplification primer) of SEQ ID NOs: 7 and 8 were used for real time PCR for comparison of RAD51 and TERT mRNA expression ratios. As shown in Table 2 below.

Real time PCR condition for TERT and RAD51 mRNA expression level identificationReal time PCR condition for TERT and RAD51 mRNA expression level identification 50℃ 2min
95℃ 10sec
50 ° C 2 min
95 ° C 10 sec
95℃ 15sec
60℃ 1min
95 ° C 15 sec
60 ° C 1 min
40 cycle40 cycles
95℃ 15sec
60℃ 1min
95℃ 30sec
60℃ 15sec
95 ° C 15 sec
60 ° C 1 min
95 ° C 30 sec
60 ° C 15 sec

그 결과, 중간엽 줄기세포에 HGF를 처리할 경우, RAD51 mRNA 발현이 증가하고, HGF를 차단할 경우, RAD51 mRNA의 발현이 감소함을 확인하였다(도 6 및 7).
As a result, the expression of RAD51 mRNA was increased when HGF was treated with mesenchymal stem cells, and the expression of RAD51 mRNA was decreased when HGF was blocked (FIGS. 6 and 7).

4-2. 4-2. WesternWestern blotblot 결과 확인 Check the result

중간엽 줄기세포에 HGF 처리 유무에 따른 TERT 및 RAD51의 단백질 발현양을 확인하기 위하여, ES-MSC 및 BM-MSC에서 TERT 및 RAD51의 native expression level 및 BM-MSC에 HGF를 처리한 후의 protein expression level을 western blot을 수행하여 확인하였다.The expression level of TERT and RAD51 in ES-MSC and BM-MSC and protein expression level after treatment with HGF in BM-MSC were examined in order to confirm the amount of protein expression of TERT and RAD51 according to presence or absence of HGF treatment in mesenchymal stem cells Were confirmed by western blotting.

구체적으로, western blot은 상기 실시예 2의 방법을 토대로 수행하였으며, 이때 사용된 1차 항체 및 2차 항체의 종류 및 희석 비율을 하기 [표 3]과 같다.Specifically, western blot was performed based on the method of Example 2, and the types and dilution ratios of the primary antibody and the secondary antibody used were as shown in Table 3 below.

ProteinProtein Size
(kDa)
Size
(kDa)
Primary ABPrimary AB Secondary ABSecondary AB ECLECL
TERTTERT 122122 Anti-Telomerase reverse transcriptase antibody [Y182](Abcam ab32020)
1:1000 D
Anti-Telomerase reverse transcriptase antibody [Y182] (Abcam AB32020)
1: 1000 D
anti-rabbit IgG(Whole molecule)-peroxidase antibody produced in goat (Sigma-Aldrich A0545)

1:2000 D
anti-rabbit IgG (Whole molecule) -peroxidase antibody produced in goat (Sigma-Aldrich A0545)

1: 2000 D
1h1h
RAD51RAD51 3737 Rad51 (D4B10) Rabbit mAb(Cell signaling #8875)
1:500 D
Rad51 (D4B10) Rabbit mAb (Cell signaling # 8875)
1: 500 D
anti-rabbit IgG(Whole molecule)-peroxidase antibody produced in goat (Sigma-Aldrich A0545)

1:2000 D
anti-rabbit IgG (Whole molecule) -peroxidase antibody produced in goat (Sigma-Aldrich A0545)

1: 2000 D
20min20min
Positive control
(α-tubulin)
Positive control
(α-tubulin)
5555 1:10000 D1: 10000 D anti-mouse IgG(Whole molecule)-peroxidase antibody produced in goat (Sigma-Aldrich A4416)

1:2000 D
anti-mouse IgG (Whole molecule) -peroxidase antibody produced in goat (Sigma-Aldrich A4416)

1: 2000 D
5s5s

그 결과, native 상태에서는 ES-MSC에서 BM-MSC에 비해 많은 양의 RAD51의 단백질 발현양이 현저히 많음을 확인하였고(도 8), BM-MSC에 HGF를 처리하면, RAD51의 양이 현저히 증가함을 확인하였다(도 9).As a result, in the native state, it was confirmed that the amount of RAD51 protein expressed in ES-MSC was significantly higher than that of BM-MSC (Fig. 8), and the amount of RAD51 was significantly increased when BM- MSC was treated with HGF (Fig. 9).

상기와 같은 결과를 통하여, HGF가 RAD51의 transcriptionally activation을 통해 중간엽 줄기세포의 텔로미어 길이를 조절함을 알 수 있었다.
These results suggest that HGF regulates the telomeric length of mesenchymal stem cells through transcriptionally activation of RAD51.

실시예Example 5.  5. BMBM -- MSCMSC Wow ESES -- MSCMSC of 줄기세포능Stem cell ability 확인 Confirm

본 발명자들은 BM-MSC와 ES-MSC가 기본적으로 줄기세포능(stemness)의 차이를 가지는지 확인하고자, 줄기세포능 관련 인자로 가장 일반적인 유전자 마커 Oct4와 Nanog의 발현을 살펴본 결과, ES-MSC에서 Oct4와 Nanog의 발현 정도가 BM-MSC에 비해 더 높은 것을 알 수 있었다. 이에, BM-MSC에 HGF를 처리할 경우 Oct4와 Nanog의 발현 정도도 높아지는지 확인하였다.
The present inventors have examined the expression of Oct4 and Nanog, which are the most common stem cell function-related factors, in ES-MSC in order to confirm whether BM-MSC and ES-MSC basically have a difference in stemness. The expression levels of Oct4 and Nanog were higher than BM-MSC. Therefore, it was confirmed that the expression level of Oct4 and Nanog was increased when BM-MSC was treated with HGF.

5-1. 5-1. RealReal timetime PCRPCR 결과 확인 Check the result

상기 실시예 3-1의 방법과 같이, BM-MSC에 HGF를 처리한 세포에서 Oct4와 Nanog의 mRNA 발현율을 비교하였으며, real time PCR은 상기 실시예 1의 방법으로 수행하되, 서열번호 9 및 10의 프라이머(Nanog 증폭 프라이머), 및 서열번호 11 및 12의 프라이머(Oct4 증폭 프라이머)를 이용하였다.As in the case of Example 3-1, mRNA expression ratios of Oct4 and Nanog were compared in BM-MSC treated cells with HGF, real time PCR was performed by the method of Example 1, and SEQ ID NOS: 9 and 10 (Nanog amplification primer) and the primers of SEQ ID NOs: 11 and 12 (Oct4 amplification primer) were used.

그 결과, BM-MSC에 HGF를 처리할 경우, Oct4 및 Nanog의 mRNA 발현이 모두 증가함을 확인하였다(도 10).
As a result, it was confirmed that the expression of Oct4 and Nanog mRNA was increased when BM-MSC was treated with HGF (FIG. 10).

5-2. 5-2. WesternWestern blotblot 결과 확인 Check the result

BM-MSC에서 HGF 처리에 따른 Oct4와 Nanog의 단백질 발현양을 확인하기 위하여, BM-MSC에 HGF를 처리한 후의 protein expression level을 western blot을 수행하여 확인하였다.In order to confirm the expression levels of Oct4 and Nanog proteins in BM-MSC by HGF treatment, the protein expression level of BM-MSC after HGF treatment was confirmed by western blotting.

구체적으로, western blot은 상기 실시예 2의 방법을 토대로 수행하였으며, 이때 사용된 1차 항체 및 2차 항체의 종류 및 희석 비율은 하기 [표 4]와 같다.
Specifically, western blot was performed based on the method of Example 2, and the types and dilution ratios of the primary antibody and the secondary antibody used were as shown in Table 4 below.

ProteinProtein Size
(kDa)
Size
(kDa)
Primary ABPrimary AB Secondary ABSecondary AB ECLECL
Oct4Oct4 4343 santacruz
anti-Oct4 antibody sc-9081
1:2000 D
santacruz
anti-Oct4 antibody sc-9081
1: 2000 D
Anti-Goat IgG (whole molecule)Peroxidase antibody produced in rabbit(Sigma-Aldrich A5420)

1:3000 D
Anti-goat IgG (whole molecule) Peroxidase antibody produced in rabbit (Sigma-Aldrich A5420)

1: 3000 D
7min7min
NanogNanog 3535 abcam
anti-Nanog ab
ab-75484
1:2000 D
abcam
anti-Nanog ab
ab-75484
1: 2000 D
anti-mouse IgG(Whole molecule)-peroxidase antibody produced in goat (Sigma-Aldrich A4416)

1:2000 D
anti-mouse IgG (Whole molecule) -peroxidase antibody produced in goat (Sigma-Aldrich A4416)

1: 2000 D
20min20min
Positive control
(α-tubulin)
Positive control
(α-tubulin)
5555 1:10000 D1: 10000 D anti-mouse IgG(Whole molecule)-peroxidase antibody produced in goat (Sigma-Aldrich A4416)

1:2000 D
anti-mouse IgG (Whole molecule) -peroxidase antibody produced in goat (Sigma-Aldrich A4416)

1: 2000 D
5s5s

그 결과, BM-MSC에 HGF를 처리하면 Oct4 및 Nanog의 단백질 수치가 현저하게 증가함을 확인하였다(도 11).
As a result, it was confirmed that when HGF was treated with BM-MSC, protein levels of Oct4 and Nanog were significantly increased (FIG. 11).

상기 결과로부터, HGF가 중간엽 줄기세포의 줄기세포능을 높일 수 있음을 알 수 있다. 중간엽 줄기세포의 줄기세포능이 높아진다는 것은 Osteoblast, myoblast, adipocyte, chondrocyte, fibloblast 등 다양한 중배엽 계통(mesoderm lineage) 세포로의 분화 가능성이 높아진다는 것을 의미하므로, 세포치료제로서 더 많은 영역의 질환에 적용 가능할 것으로 기대된다.
From the above results, it can be seen that HGF can enhance stem cell performance of mesenchymal stem cells. The increased mesenchymal stem cell stem cell activity means that the possibility of differentiation into various mesoderm lineage cells such as osteoblast, myoblast, adipocyte, chondrocyte, and fibloblast is increased, It is expected to be possible.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.It will be understood by those skilled in the art that the foregoing description of the present invention is for illustrative purposes only and that those of ordinary skill in the art can readily understand that various changes and modifications may be made without departing from the spirit or essential characteristics of the present invention. will be. It is therefore to be understood that the above-described embodiments are illustrative in all aspects and not restrictive.

<110> SEOUL NATIONAL UNIVERSITY HOSPITAL <120> METHOD FOR INCREASING OF STEMNESS IN HUMAN CELLS <130> PB14-12102 <150> KR 10-2013-0077493 <151> 2013-07-03 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Telomere forward primer <400> 1 ggtttttgag ggtgagggtg agggtgaggg tgagggt 37 <210> 2 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Telomere reverse primer <400> 2 tcccgactat ccctatccct atccctatcc ctatcccta 39 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 36B4 forward primer <400> 3 cagcaagtgg gaaggtgtaa tcc 23 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 36B4 reverse primer <400> 4 cccattctat catcaacggg tacaa 25 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hRAD51 forward primer <400> 5 gcataaatgc caacgatgtg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hRAD51 reverse primer <400> 6 gtggtgaaac ccattggaac 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hTERT forward primer <400> 7 ggagtagcag agggaggccg 20 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hTERT reverse primer <400> 8 agccagtctc accttcaacc gc 22 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanog forward primer <400> 9 accttccaat gtggagcaac 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanog reverse primer <400> 10 gaatttggct ggaactgcat 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oct4 forward primer <400> 11 gaggcaacct ggagaatttg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oct4 reverse primer <400> 12 tagcctgggg taccaaaatg 20 <110> SEOUL NATIONAL UNIVERSITY HOSPITAL <120> METHOD FOR INCREASING OF STEMNESS IN HUMAN CELLS <130> PB14-12102 <150> KR 10-2013-0077493 <151> 2013-07-03 <160> 12 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Telomere forward primer <400> 1 ggtttttgg ggtgagggtg agggtgaggg tgagggt 37 <210> 2 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Telomere reverse primer <400> 2 tcccgactat ccctatccct atccctatcc ctatcccta 39 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 36B4 forward primer <400> 3 cagcaagtgg gaaggtgtaa tcc 23 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 36B4 reverse primer <400> 4 cccattctat catcaacggg tacaa 25 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hRAD51 forward primer <400> 5 gcataaatgc caacgatgtg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hRAD51 reverse primer <400> 6 gtggtgaaac ccattggaac 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hTERT forward primer <400> 7 ggagtagcag agggaggccg 20 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hTERT reverse primer <400> 8 agccagtctc accttcaacc gc 22 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanog forward primer <400> 9 accttccaat gtggagcaac 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanog reverse primer <400> 10 gaatttggct ggaactgcat 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oct4 forward primer <400> 11 gaggcaacct ggagaatttg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oct4 reverse primer <400> 12 tagcctgggg taccaaaatg 20

Claims (8)

세포 배양액에 HGF(hepatocyte growth factor)를 처리하는 단계를 포함하는 인간 세포의 줄기세포능(stemness)을 증대시키는 방법.
A method for enhancing stem cell function of a human cell comprising the step of treating a cell culture medium with HGF (hepatocyte growth factor).
제1항에 있어서,
상기 방법은 인간 세포의 염색체 말단을 연장시키는 것을 특징으로 하는, 방법.
The method according to claim 1,
Wherein said method extends the chromosomal end of a human cell.
제1항에 있어서,
상기 방법은 인간 세포의 수명을 연장시키는 것을 특징으로 하는, 방법.
The method according to claim 1,
Wherein said method prolongs the life span of human cells.
제1항에 있어서,
상기 방법은 인간 세포의 노화를 억제하는 것을 특징으로 하는, 방법.
The method according to claim 1,
Wherein said method inhibits aging of human cells.
제1항에 있어서,
상기 방법은 인간 세포의 성장을 증대시키는 것을 특징으로 하는, 방법.
The method according to claim 1,
Wherein said method enhances growth of human cells.
제1항에 있어서,
상기 방법은 인간 세포의 생존력을 증대시키는 것을 특징으로 하는, 방법.
The method according to claim 1,
Wherein said method enhances the viability of human cells.
제1항에 있어서,
상기 방법은 중배엽으로의 분화 효율을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 방법.
The method according to claim 1,
Wherein said method increases the efficiency of differentiation into mesoderm.
제1항에 있어서,
상기 세포는 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 방법.
The method according to claim 1,
Wherein said cells are mesenchymal stem cells.
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