KR20150001075A - 수지상 세포를 표적으로 하는 항체를 비강 경로로 투여하는 호흡기 점막 면역 방법 및 이를 이용한 전달 장치 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 보조제(adjuvant)로 poly IC를 사용하여, Anti-DEC 항체에 결합된 Yersinia pestis LcrV 단백질(Anti-DEC:LcrV)을, 수지상 세포를 표적으로 하여, 비강 경로로 투여하는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 개체의 호흡기 점막 면역 방법에 대한 것이다. 본 발명의 호흡기 점막 면역 방법은, 호흡기를 통한 투여 방식을 통하여, 종래의 방법에 비하여 현저하게 적은 양을 사용하면서도, 충분한 면역력을 제공할 수 있도록 양질의 점막 T 세포 및 B 세포 반응을 유도할 수 있다는 효과가 있다.

Description

수지상 세포를 표적으로 하는 항체를 비강 경로로 투여하는 호흡기 점막 면역 방법 및 이를 이용한 전달 장치{A method of pulmonary mucosal immunizing by intranasal administrating of antibody which is targeting Dendritic Cells and the delivery apparatus using the same}
본 발명은 수지상 세포를 표적으로 하는 항체를 비강 경로로 투여하는 호흡기 점막 면역 방법 및 이를 이용한 전달 장치에 대한 것이다.
엄청난 전염성 및 치사율뿐만 아니라 생물학적 테러에서 페스트 균의 공중 살포의 높은 위험 때문에, 효율적인 폐 전염병 백신을 개발하기 위한 상당한 관심와 노력이 있었다. 호흡기 전염병 질환의 급속한 발병 속도를 고려할 때, 강한 점막 면역을 유도하는 것은 호흡기 전염병 백신을 효과적으로 제공하는데 있어서 매우 중요한 것으로 간주되었다. 따라서, 백신은 세균이 온몸에 퍼지기 전에 세균 박멸을 가속하기 위하여 점막 표면 반응의 지연을 막아야 하며, 이러한 점막 면역의 향상을 위하여 다양한 면역 루트와 보조제(adjuvant)를 포함한 다양한 접근 방법이 시도되었다. 기관지 또는 비강을 통한 백신의 투여는 전신 투여에 비하여 점막 면역을 강화하는 것으로 나타나는데, 이러한 점막 전달의 경우, F1 및/또는 V subunit 백신은 이전에 콜레라 toxin B subunit, 프로테오좀 기반(proteosome-based) 보조제 (ProtollinTM), 톨 유사 수용체 (Toll-like receptor 5 agonist) 또는 편모와 함께 병용 투여되었다. 또, F1-V에 대한 모노클론 항체의 기관지 전달은 에어로졸된 페스트 균에 대하여 쥐들을 방어하기에 충분하였다. 따라서, 높은 항체 레벨이 페스트 균으로부터의 보호와 관련이 있다. 이러한 F1-V subunit 백신은 작은 동물 모델에서 주로 항체 반응을 통하여 폐 전염병에 대한 보호를 제공하며, 페스트 균에 대한 대부분의 연구는 전신 및 점막 표면 둘 다를 이용한 체액성 면역의 유도에 초점을 맞췄다. 그러나, 항체 적정 농도에 상관 없이 아프리칸 녹색 원숭이를 효과적으로 보호하는 데에 어느정도 실패하였다. 따라서, 체액성 면역뿐만 아니라 세포성 면역의 유도가 인간에게 있어 더 나은 보호를 위하여 중요할 수 있다. 성공적인 전염병 백신에 대한 세포성 면역의 역할이 특히 영장류에 대하여 강조되었었지만, 이제는 폐에서 강한 세포 매개 면역을 유도할 수 있는 방법을 요구된다.
스마일리(Smiley)에 의한 최근의 연구는, 폐스트 균으로 항원 자극 받은 T 세포로 전이된 경우, 원시 B 세포가 없는 쥐가 비강으로 도입된 약화된 페스트 균으로부터 보호된 것을 증명한 바 있다. 이 세포들은 열로 죽인 페스트 균으로 시험관에서 확장되었고, T cell, IFN-r 또는 TNF-α의 제거에 의하여 보호가 없어졌다. 이러한 조사는 IFN-r 및 TNF-α의 중화가, 페스트 균을 비강 내로12LD50 로 도입한 것에 대한 F1-V 또는 LcrV-특이 mAb 모노클로날 항체의 적절한 복용량의 투여에 의하여 얻어지는 생존률을 낮춘다는 것을 보여준다. 특히, Th1 및 Th17 세포 반응에 의하여 유도된, 살아 있는 묽은 페스트 균으로 항원 자극 받은(primed) 또는 증폭된(boosted) B 세포 결핍 쥐는, 폐의 D27 변형(strain)에 대하여 보호되었다. 이러한 결과는 효과적인 폐 전염병 백신은 전신에서뿐만 아니라 점막 표면에서도 체액성 및 세포성 면역 모두 강하게 반응으로 항원 자극 하여야 한다는 것을 제시한다.
이러한 LcrV 단백질에 대한 효과적인 세포성 면역을 유도하기 위하여, 우리는 수지상 세포 성숙 자극으로써, Poly IC 및 αCD40의 존재 하에서 LcrV 악성 단백질을 전신으로 DEC-205/CD205 positive 수지상 세포(DCs)을 표적으로 한다.
수지상 세포(Dendritic Cells, DCs)는 면역계에 존재하는 세포 중에서 항원을 전달하는 능력이 가장 강력한 항원제시세포이다. 수지상 세포는 원시 T 세포(naive T cell)를 자극하는 일차면역반응(primary immune response)을 유도할 수 있으며, 면역의 기억을 유도할 수 있는 특성을 갖는 유일한 면역세포이다. 수지상 세포가 강력한 면역반응 활성화 기능을 할 수 있는 것은 항원제시세포(Antigen Presenting Cell)로서 세포 표면에 MHC 분자(I/II) 뿐만 아니라, 보조자극분자(co-stimulatory molecules)를 고농도로 발현하고 있으며, IFN-alpha, IL-12, IL-18 등의 여러 가지의 사이토카인(cytokine)을 분비하기 때문이다. 이러한 수지상 세포는 IFN-alpha, IL-12 등 여러 가지 사이토카인을 분비하기 때문에 항원 특이 세포 살해 T 세포의 생성, Th1 세포의 증식 및 활성화를 유도할 수 있어 면역요법에 유용하게 적용 가능하다.
한편, 이러한 호흡기 질병을 치료하기 위한 방법으로 한국 공개 특허 10-2008-0066962에서는 폐 조직에 국소 전달하기 위하여 폐 조직 내의 표적에 결합하는 작용제(예를 들어, 항체 단편, 길항제, 리간드, dAb 단량체)를 피검체에 투여하는 방법을 개시하고 있다. 하지만 상기와 같은 방법만으로는 수지상 세포를 표적으로 하여 충분한 면역 효과를 얻기에는 부족한 실정이다.
따라서, 면역 반응 유도 및 제어에 중추적인 역할을 하고 있는 수지상 세포를 표적으로 하여, 항원을 전달하기 위한 기술의 개발이 요청된다.
대한민국 공개특허 제10-2008-0066962호
본 발명의 목적은, 수지상 세포를 표적으로 하여 항원을 전달함으로써, 종래의 방법에 비하여 현저하게 적은 양으로 양질의 점막 T 세포 및 B 세포 반응을 유도할 수 있도록 비강 경로로 투여하는 호흡기 점막 면역 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 호흡기 점막 면역 방법을 이용한 비강 내 전달 장치를 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 실현하기 위하여,
본 발명은 보조제(adjuvant)로 poly IC를 사용하여, Anti-DEC 항체에 결합된 Yersinia pestis LcrV 단백질(Anti-DEC:LcrV)을, 비강경로로 투여 하여 수지상세포를 표적하는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 개체의 호흡기 점막 면역 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 보조제(adjuvant)로 poly IC를 사용하여, Anti-DEC 항체에 결합된 Yersinia pestis LcrV 단백질(Anti-DEC:LcrV)을, 비강경로로 투여 하여 수지상세포를 표적하기 위한 비강내 전달 장치를 제공한다.
본 발명의 호흡기 점막 면역 방법은, 호흡기를 통한 투여 방식을 통하여, 종래의 방법에 비하여 현저하게 적은 양을 사용하면서도, 충분한 면역력을 제공할 수 있도록 양질의 점막 T 세포 및 B 세포 반응을 유도할 수 있다는 효과가 있다.
도 1은 보조제로 poly IC 및 αCD40를 사용하여 αDEC:LcrV를 예방 접종을 한 후, 점막 표면에서의 면역 반응에 대한 그래프를 나타낸 것이다.
도 2는 αDEC:LcrV의 예방 접종에 따라 수지상세포 표적 항체에 의하여 유도된 T 세포 면역반응에 대한 그래프를 나타낸 것이다.
도 3은 보조제로 poly IC만을 사용하여 prime/boost 전략에 따라 αDEC:LcrV를 예방 접종을 한 후, 점막 표면에서의 세포성 면역 반응에 대한 그래프를 나타낸 것이다.
도 4는 LcrV-특이 폐 세포성 면역의 유도에 대한 표적 효율(targeting efficacy)에 대한 그래프를 나타낸 것이다.
도 5는 αDEC:LcrV의 예방 접종에 따른 점막 표면에서의 체액성 면역 반응에 대한 그래프를 나타낸 것이다.
도 6은 페스트 균의 도입에 따른 생존률에 대한 그래프를 나타낸 것이다.
본 발명은, 보조제(adjuvant)로 poly IC를 사용하여, Anti-DEC 항체에 결합된 Yersinia pestis LcrV 단백질(Anti-DEC:LcrV)을, 비강경로로 투여 하여 수지상세포를 표적하는 것을 특징으로 하는 호흡기 점막 면역 방법에 대한 것이다.
본 발명의 호흡기 점막 면역 방법에 있어서, 상기 Anti-DEC 항체는 특별한 제한은 없으나, 바람직하게는 DEC-205 수용체(receptor)를 이용할 수 있다. 상기 DEC-205 는 CD205로 표현하기도 하며, 수지상 세포 상에서 주로 발견되는 엔도시토시스성(endocytic) 수용체이지만, 또한 B 세포, 뇌 모세혈관, 골수 간질, 또는 소장 융모의 상피 및 폐 기도, 뿐만 아니라 흉선의 피질 상피 및 주변 림프 기관의 T 세포 영역중의 수지상 세포에서도 발견된다.
또한, 상기 폴리 IC (Poly IC)은 폴리이노신산-폴리시티딜산을 말하며, 크기가 불균일한 분자량의 합성 이본쇄 RNA로, TLR3 효능제이나, 또한 항-바이러스 반응 및 유전자 전사후 조절에 관련된 편재하는 효소인, PKR의 강력한 활성인자이다. 상기 폴리 IC로는 당업계에서 사용하는 것이면, 특별히 제한되지 않고 본 발명에 적용할 수 있다.
본 발명에 있어서, Yersinia pestis는 페스트 균을 의미하며, LcrV는 페스트 균에서 발견되는 단백질로서, Yersinia pestis에 대한 V 항원(V antigen) 으로 작용한다.
본 발명의 호흡기 점막 면역 방법은 점막 표면에서 세포성(cellular) 면역 및 체액성(humoral) 면역을 유도할 수 있다.
또한, 본 발명의 호흡기 점막 면역 방법은 국소(local) 면역 또는 시스템(systemic) 면역을 유도할 수 있다.
본 발명의 호흡기 점막 면역 방법은 높은 빈도의 IFN-γ 분비 CD4+ T 세포(IFN-γ secreting CD4+ T cells)를 유도할 수 있다. 상기 IFN-γ는 감마 인터페론(interferon γ)를 의미한다.
또한, 본 발명의 호흡기 점막 면역 방법은 IFN-γ /TNF-α/IL-2 분비 다관능 CD4+ T 세포 (IFN-γ /TNF-α/IL-2 secreting multifunctional CD4+ T cells)의 유도에 효과적이다. 상기 TNF-α는 종양 괴사 인자-α (Tumor necrosis factor-α)를 의미하고, 상기 IL-2는 인터류킨2 (interleukin 2)를 의미한다.
또한, 본 발명은 보조제(adjuvant)로 poly IC를 사용하여, Anti-DEC 항체에 결합된 Yersinia pestis LcrV 단백질(Anti-DEC:LcrV)을, 비강경로로 투여 하여 수지상세포를 표적하기 위한 비강내 전달 장치를 제공한다.
상기 비강내 전달 장치는 본 발명의 호흡기 점막 면역 방법을 이용하거나, 본 발명의 호흡기 점막 면역 방법을 사용하는 것이라면 특별한 제한은 없다.
본 발명의 비강내 전달 장치는 점막 표면에서 세포성(cellular) 면역 및 체액성(humoral) 면역을 유도할 수 있다. 또한, 본 발명의 비강내 전달 장치는 국소(local) 면역 또는 시스템(systemic) 면역을 유도할 수 있다.
본 발명의 비강내 전달 장치는 높은 빈도의 IFN-γ 분비 CD4+ T 세포(IFN-γ secreting CD4+ T cells)를 유도할 수 있다.
또한, 본 발명의 비강내 전달 장치는 IFN-γ /TNF-α/IL-2 분비 다관능CD4+ T 세포 (IFN-γ /TNF-α/IL-2 secreting multifunctional CD4+ T cells)의 유도에 효과적이다.
본 발명에 있어서, 수지상 세포는 항원을 전달하는 능력이 가장 강력한 항원제시세포이기 때문에 크기가 큰 재조합 단백질 또는 펩타이드, 암분쇄물, 리보핵산, 암세포와의 융합 또는 apoptotic 또는 necrotic 암세포 등 항원의 형태에 국한되지 않고 항원의 흡입와 항원의 프로세싱을 통하여 MHC I/II 분자에 제시할 수 있는 능력을 갖으며, 특정 항원에 국한되지 않고 이용 가능하다.
이하, 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되지 않고 다양하게 수정 및 변경될 수 있다.
실시예
본 발명에 있어서, 실험 재료 및 실험 방법은 다음과 같이 진행하였다.
실험용 쥐
C57BL/6 (H-2b), BALB/c (H-2d), and C3H/HeJ (H-2k) 쥐를 Taconic에서 구입하고, DEC-205-/- 쥐 (C57BL/6 back-ground)를 잭슨 연구소에서 구입하였다. 모든 쥐는 특정 병원균 없는 상태에서 유지되었고, 애니멀 케어 및 사용위원회의 지침(Institutional Animal Care and Use Committee)에 따라 5주 내지 7주의 연령의 쥐를 사용하였다.
융합 항체 및 단백질의 설계 및 생산
융합 αDEC:LcrV 항체, 제어(control) Ig:LcrV 항체, 및 수용성 LcrV 단백질을 "Eur J Immunol 2008;38(January (1)):20-9; Do Y, Park CG, Kang YS, Park SH, Lynch RM, Lee H, et al."에서 기재된 대로 생산하였으며, 상기 제어(control) Ig:LcrV 항체는 Negative control로 사용된 anti-DEC-205에 대한 isotype 항체 를 의미한다.
USAMRIID (U.S. Army Medical Research Institute of Infectious Diseases)로부터의 재조합 F1-V 단백질이 "Biotechnol Prog 2005;21(September-October (5)):1490-510.; Powell BS, Andrews GP, Enama JT, Jendrek S, Bolt C, Worsham P, et al."에서와 같이 설명되었다. 또한, Limulus Amebocyte Lysate 분석, QCL-1000 (Bio Whittaker, Walkersville, MD) 을 이용할 때, 모든 단백질은 0.125 units/mg 이하의 내독소를 가졌다.
예방 접종 방법
쥐의 뒷다리 끝부분에 피하주사하거나, 또는 비강으로 주사하여, 융합 항체, 제어 lg 항체 또는 수용성 LcrV 단백질 융합 항체를 총 25 ㎕주사하였고, 보조제로서 50ug의 poly IC (pIC, InVivogen, San Diego, CA)를 주사하였다. 또, F1-V subunit 단백질은 alhydrogel (2.0% Alhydrogel(Al(OH)3), Superfos Biosector, Vedbaek, Denmark)을 보조제로 주어졌다.
LcrV 펩타이드
전체 LcrV 서열에 걸쳐 11 아미노산(aa)이 오버랩핑(overlapping) 된 15-mer peptide 를 록펠러 대학에서 합성하였다. 상기 라이브러리는 10 펩티드로 구성된 펩티드 넘버 8을 제외하고 11 펩티드의 8개 풀(Pool)로 나누었다.
세포 내 사이토카인 착색 (ICS) 및 표면 착색
폐 T 세포의 세포 내 사이토카인 착색 (ICS)을 위해, 폐를 채취하여 단일 세포 현탁액을 제조 하였다. 관류(perfusion)는 간단하게, 우심실을 통해 1 mM의 EDTA를 포함하는 인산완충식염수(PBS, phosphate buffered saline)를 주사하여 수행되었다. 폐를 채취하여, 기계적으로 절단한 후, Collagenase/DNase (Roche, Indianapolis, IN)로 효소적으로 소화시켰다. 상기 세포를 세척한 후, 6시간 동안, 항-CD28+ 펩티드 풀, 혹은 항-CD28+각각의 활성 펩티드로 자극하였다. medium (세포 배양액, 즉 펩타이드가 없이)만으로 자극시킨 그룹을 negative control로 사용하였다. 상기 6시간 중 2시간이 지난 후, 세포 내 사이토 카인을 축적하기 위해, 4 시간 동안 브레펠딘 A (brefeldin A) 를 첨가하였다. 세포를 세척하고, Fcγ 수용체를 CD16/CD32 항체로 차단한 후, 항-쥐-CD3(anti-mouse-CD3), 또는 CD4 mAbs에서 20분간 4℃로 착색하였다. 이 후, Cytofix/Cytoperm PlusTM (BD PharMingen, San Jose, CA)으로 고정하였고, 세포들은 실온에서 15분간 세포 속의 IFNγ, IL-2, or TNF-α를 착색하였다. 모든 mAbs는 BD PharMingen에서 구입하였으며, 데이터는 FACS Calibur를 이용하여 수집하였고, FlowJo (Tree Star, Ashland, OR)를 이용하여 분석하였다. 몇몇의 실험, 비장, 종격동 림프절 및 기도 림프구는 위에서 설명한대로 수집하여 착색하였다.
anti-LcrV 항체 ELISA 분석
LcrV 특이 항체를 검출하기 위하여, ELISA 플레이트 (BD Falcon, San Jose, CA) 바닥을 LcrV 단백질(5ug/ml)로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 플레이트는 PBST (PBS and Tween 20, 0.1%)로 3번 세척하였고 PBST-BSA 5%로 1시간 동안 37℃에서 차단하였다. 혈청, 기관지 세척(BAL) 유체 또는 비강 세척의 연속적인 희석이 추가되었고, 1시간 동안 37℃로 배양하였다. 서양 고추냉이 과산화효소 (Southern Biotech, Birmingham, AL) 로 연결된 다양한 두번 째 염소 항 쥐 (goat anti-mouse) Fc 특이 항체가 첨가되었고, 실온에서 15분동안 o-phenylenediamine (Sigma) 태블릿으로 형상화 되었다. 상기 항체 타이터(titer) 계산은 OD450에서 0.1의 값을 보이는 가장 높은 희석의 역수를 log 값으로 표현하였다.
Y. 페스트 균 도입 및 보호 분석
보호 분석은 Northeast Biodefense Center's Small Animal Core at the Public Health Research Institute (PHRI, Newark, NJ) 에서 수행 하였다. 쥐는 Institutional Animal Care and Use Committee guidelines of the Public Health Research Institute (PHRI) 의 지침에 따라 관리하였다. 쥐의 각 그룹 (그룹 당 n=10)은 비강 경로에서 25ul이상으로 105 콜로니 형성 유닛(colony forming units) 또는 페스트 균의 CO92 변형의 100 LD50 으로 접종되었고, 쥐는 14일 동안 하루에 2번씩 관찰하였다.
통계
생존 데이터는 로그 순위 테스트를 통해 분석 하였다. 면역 반응의 차이는 짝 또는 짝지어지지 않은 학생의 t-검정을 적절하게 이용하여 통계상 유의한 의미를 비교하였다.
실시예 1. DEC-205 + 수지상 세포를 표적으로 하는 LcrV 단백질에 의한 폐의 면역 반응의 유도
점막 표면에서의 면역을 일으키는 수지상 세포를 표적으로 하는 접근방식 의 능력을 검사하기 위하여, 쥐를 TLR3 리간드 poly IC 및 agonistic αCD40의 보조제의 존재 하에서 비강 경로를 통하여 αDEC:LcrV를 예방 접종시켰다. 이에 대하여, alhydrogel과 F1-V 재조합 단백질의 결합을 비교예 (reference)로 사용되었다. PBS 혹은 항원을 전달하지 않는 항-DEC (empty)가 음성 대조군으로 포함되었다. 여기서 BALB/c 쥐는 비강 또는 피하 어느 쪽에서도, 50 ug의 poly IC와 25 ug의 αCD40 mAb의 존재 하에서, PBS, 알루미늄으로 흡착된 F1-V (10 ug), DEC:LcrV (10 ug), DEC:empty (10 ug)로 예방 접종되었다. 예방접종 후 10일 후, 폐를 채취하였고, LcrV 활성화 펩티드인 LKIYSVIQAEINKH으로 다시 자극하여, 항원 특이 폐 IFN-γ 또는 IL-2 분비 CD4+ T 세포가 세포 내 사이토카인 착색 (ICS)에 의하여 판별되었다. 상기 데이터는 αDEC:LcrV를 이용한 예방접종의 비강 경로가 항원 특이 폐 IFN-γ 또는 IL-2 분비 CD4+ T 세포를 유도하는 것을 나타낸다.
다음으로, 비경구 백신접종이 전신 면역에 더하여 점막 반응을 유도하는지 여부를 테스트하기 위하여 피하 경로의 예방접종을 수행하였다. 피하 경로의 예방접종에서, 항원 특이 T 세포 반응은, 비록 비강루트에 의한 예방접종에 비교하여 낮기는 하지만, αDEC:LcrV를 받은 그룹의 폐에서 유도되었다. IFN-γ+ (upper) or IL-2+ (lower) secreting CD3+/CD4+ pulmonary T cells의 빈도가 %로 나타내졌다.
중요한 것은, 대상 DC 의 이점을 증명하기 위한 각각의 경로에서도, 우리는 F1-V 재조합 단백질로 면역된 그룹에서 이러한 T 세포 반응을 감지할 수 없었다는 것이다.
기도의 항체는 페스트 균의 분무 감염에 대하여 즉각적인 보호를 제공할 수 있다. 도 1B의 데이터는 보조제의 존재 하에 αDEC:LcrV의 단독 예방접종이 비강 경로 예방접종에서 뿐만이 아니라 피하 경로 예방접종에서도 BAL(기관지폐포세척)에서 항원 특이 항체를 유도하는 것을 보여준다. 주요 isotype은 IgG1, IgG2b 및 IgG2a였다. 흥미롭게도, "Th1-polarized response"와 자주 관련된 IgG2a (BALB/c) isotype이 도 1B의 그룹 3에서와 같이 αDEC:LcrV로 예방 접종된 그룹에서 발견되었다. BAL에서의 각각의 IgG isotypes 에 대한 항-LcrV 항체 농도. 예방 접종 및 주사 경로는 (A)에서와 같았다. 데이터는 각 그룹마다 3개의 쥐를 사용한 3개의 독립 실험으로부터의 평균값이며, 비슷한 결과를 갖는다. 도 1B의 그룹 2를 살펴보면 종래의 연구에서와 같이, F1-V 서브유닛 백신이 강한 체액성 면역 유도에 효과적이었다.
이러한 데이터들은 모두 점막 경로를 통한 수지상 세포 표적화 전략이 점막 부분에서 결합된 체액성/세포성 면역을 유도하는 것이 수용성 단백질로 비경구로 접근하는 것보다 더욱 효과적이라는 것을 보여주었다.
실시예 2. poly IC 단독으로 LcrV 단백질와 사용하여 DEC-205+ 수지상 세포로 표적화 하는 경우의 광범위한 폐 CD4 + T 세포 면역의 유도
강한 면역을 유도하기 위한 보조제로서 Poly IC 및 αCD40의 결합은 도 1에서와 같이 하기 논문의 연구에서 사용되었다. anti-CD40는 Poly IC와는 달리 인간에게 사용하는 것이 쉽지 않을 수 있기 때문에, 50ug의 poly IC을 "Targeting of LcrV virulence protein from Yersinia pestis to dendritic cells protects mice against pneumonic plague. Eur J Immunol 2010;40(October (10)):2791-6."에서 설명된 바와 같이, 항원 자극(priming) 및 증폭(boosting)시에 보조제로서 테스트하였다.
이러한 방법이 점막 표면에서 상이한 MHC haplotype들로 Th1 type 면역을 유도하는데 효과적인지를 테스트 하기 위하여, H-2b (C57BL/6), H-2d (BALB/c), 및 H-2k (C3H/HeJ) 쥐들이 POLY IC의 존재 하에서 αDEC:LcrV 또는 isotype 항체 (음성대조군으로 사용) 의하여 비강 경로로 항원 자극(primed) 되고, 증폭(boosted) 되었다.
T 세포에 의한 항원 특이 IFN-γ 생산의 측정은, 도 2A에서와 같이 BALB/c이 3개의 풀을 인식하는 반면에, C57BL/6 및 C3H/HeJ가 적어도 2개의 상이한 펩타이드들에 대응한다는 것으로 나타났다. 이에 더해 우리는, 도 2B에서와 같이, DEC-205 KO 쥐가 αDEC:LcrV에 대한 면역 반응을 탑재(mount)하지 못함에 따라, DEC-205의 표현에 종속된다는 것을 알 수 있었다. 이러한 데이터들은 보조제로 poly IC 단독으로 함께 한 DEC에 표적화된(targeted) LcrV 로 항원 자극(priming)과 증폭(boosting)하는 것이 광범위한 폐 CD4+ T 세포 면역을 유도한다는 것을 알려준다.
실험예 3. 항원 자극(prime)/증폭(boost) 전략에서 poly IC로 LcrV이 DEC-205+ 수지상 세포를 표적으로 하는 것의 강한 점막 CD4 + T 세포 면역의 유도
점막 백신 반응을 증가시키기 위하여, 상이한 항원 자극(prime)/증폭(boost) 처방 계획을 부과하였다. 쥐들은 피하 경로의 αDEC:LcrV로 첫번째 항원 자극(first primed) 되었고, 피하 경로의 αDEC:LcrV 또는 수용성 LcrV로 증폭(boosted) 되었다. 6~10일 후, 폐를 채취하였고, 도 3A와 같이 항원 특이 IFN-γ+CD4 T 세포가 ICS에 의하여 측정되었다. 도 3A에서와 같이, 피하 경로의 항원 자극(prime)/증폭(boost) 전략이 감지할만한 LcrV-특이 폐 IFN-γ+ CD4+ T 세포를 유도하는데 비해, 1회 투여의 면역 또는 F1-V와 alhydrogel의 결합으로 항원 자극(prime)/증폭(boost) 하는 것은 상기와 같은 유도를 나타내지 못하였다.
다음으로, 국소 면역 반응을 증진시키기 위한 시도로, 피하 경로의 αDEC:LcrV로 항원 자극(primed)되고, 비강 경로로 증폭(boosted)된 쥐들에 대해서 연구하였다. 비강 경로로 증폭(Boost)하는 것은 피하 경로로 증폭(boost) 하는 것에 비하여 폐 내의 LcrV 특이 IFN-γ+CD4+ T 세포의 빈도를 4배나 증진시켰다.
IFN-γ+CD4+ T 세포 반응을 다양한 위치에서 특성을 나타내기 위하여, 도 3C 및 표 1에서와 같이 쥐를 비강으로 항원 자극(primed) 및 증폭(boosted)시켰으며, 비장(spleen)뿐만이 아니라, 폐 조직(parenchyma), 기도 (기관지 세척액: BAL fluid), 종격동 림프절(mediastinal lymph nodes)으로부터의 세포를 분석하여 시스템(systemic) 면역 및 국소(local) 면역의 유도 여부를 실험하였다.
항원 특이 IFN-γ+CD4 T 세포의 레벨은 비장의 것과 비교하여 각각 폐 조직(parenchyma) 및 기도 (기관지 세척액: BAL fluid)에서 8배 및 16배 높았다.
표 1 및 도 3C에서와 같이, αDEC:LcrV로 증폭(boosting)된 것은 수용성 LcrV 단백질로 증폭(boosting) 되는 것보다 더 효과적이었다.
반대로 표 1을 참고하면, F1-V로 예방 접종하는 것 또는 αDEC:LcrV+ poly IC로 한번 예방 접종하는 것은 감지할만한 항원, 특히 IFN-γ+CD+ T 세포를 유도하지 못하였다. 이러한 데이터는 DEC로 표적화된 단백질 백신은 폐에서, 특히 백신의 국소 투여로 강한 점막 면역을 유도한다는 것을 보여준다. 하기 표 1에서, DEC-V는 αDEC:LcrV이고, V는 LcrV이며, αDEC:LcrV 및 LcrV 단백질 면역용 poly IC가 보조제로 사용되었고, 및 F1-V 재조합 단백질용 alhydrogel 가 사용되었다.
Prime Boost Spleen Lung MedLN Airway T cells
DEC-V DEC-V 0.41±0.03 2.46±0.6 0.21±0.01 6.0±0.9
DEC-V V 0.07±0.03 0.57±0.27 0.05±0.04 4.56±1.2
F1-V F1-V 0.01±0.03 0±0.03 0±0.01 0±0.01
DEC-V PBS 0.01±0.01 0.01±0 0±0 0±0
F1-V PBS 0.01±0 0±0 0.01±0 0±0
PBS DEC-V 0.01±0.01 0±0.01 0.02±0.01 0.03±0.02
PBS V 0.01±0 0±0.03 0±0.02 0.79±0.7
PBS F1-V 0.01±0 0±0.01 0±0 0±0
MedLN: mediastinal lymph node
실시예 4. 표적화(targeting)하지 않은 단백질 백신에 비하여 강한 점막 면역을 유도하는 DEC-205+ DCs로의 LcrV의 표적화 (targeting)
αDEC를 통한 LcrV의 표적 전달(targeted delivery)의 가치를 평가하기 위하여, αDEC:LcrV가 증가된 투여량 (쥐 마다 0.1, 1, 또는 10ug의 항체를 투여하면, 해당되는 LcrV 단백질의 양은 각각 0.03, 0.3, 또는 3ug이 된다.)에 대한 반응을, 비강 경로의 50ug의 poly IC의 존재하에서 수용성 LcrV 단백질 (쥐당 0.3, 3, 또는 3ug)을 투여한 때의 반응과 비교하였다. 4~6주 후, 쥐들은 같은 투여량으로 비강 경로로 증폭(boosted)되었고, 6~10일 후 항원 특이 IFN-γ/IL-2/TNF-α 분비 CD4+ T 세포를 탐지하기 위하여 폐를 채취하였다. 도 4에서 나타난 바와 같이, 동일한 T 세포 반응을 얻기 위하여, anti-DEC 항체로 융합될 때보다, 적어도 10 배 많은 수용성 LcrV가 필요하였다. 쥐들이 3 및 30ug의 수용성 LcrV로 면역되었을 때 IL-2+/TNF-α+T 세포의 숫자가 정체기에 들어서는데 비하여, 쥐들이 0.3 및 3ug의 αDEC:LcrV로 면역되었을 때는 그 숫자가 현저하게 증가했다. 이러한 데이터는 폐에서 LcrV-특이 세포 면역의 유도 능력의 증가에 대한 항원 표적화의 가치를 보여준다. 또한, 종전의 발명과 마찬가지로, F1-V와 alhydrogel의 결합으로 항원 자극(prime) 및 증폭(boost) 된 그룹에서 IFN-γ+ IL-2+TNF-α+CD4+ T 세포 반응은 발견할 수 없었다.
실시예 5. 강한 점막 체액성 면역을 위한, DEC-205+ 수지상 세포로의 LcrV의 표적화의 항원 자극
점막 표면에서 체액성 면역을 찾기 위하여, 기관지 세척액 (BAL fluid)을 채취하여, ELISA로 항-LcrV 항체를 측정하여 도 5에서와 같이 나타내었다. poly IC의 존재 하에 αDEC:LcrV을 피하 경로로 한번 예방 접종한 것은, 도 5A에서와 같이 기관지 세척액 (BAL fluid)에서 감지할만한 LcrV 특이 항체를 유도하였으나, 항원 자극(prime) 및 증폭(boost) 면역은 점막 항체 반응을 약 10배로 더 강화시켰다. 기관지 세척액 (BAL fluid)에서의 항체의 농도는 αDEC:LcrV로 증폭(boost) 한 것에 비하여 수용성 LcrV 단백질로 증폭(boost)이 수행된 곳에서 더 높았다. 이와 같이 αDEC:LcrV로 면역시키는 것이 IgG 아이소타입 (IgG1, IgG2a, IgG2b)의 광범위한 스펙트럼을 나타냈지만, 도 5A에서와 같이 F1-V로 면역된 쥐로부터 lgG2a 가 기관지 세척액 (BAL fluid)에서 나타나지 않았다.
다음으로, αDEC:LcrV의 비강 투여에 따른 기관지 세척액 (BAL fluid)에서 체액성 면역 반응을 실험하여 도 5B에 나타내었다. 도 5A와 도 5B를 비교해보면, 피하 경로에 비하여 비강 경로는 BAL 항체 농도를 10~30배로 증가시켰고, 항-LcrV 항체의 농도는 도 5B에서와 같이 DEC-표적화(targeted) 된 단백질로 증폭(boosting) 하는 것에 비하여 αDEC:LcrV로 항원 자극(primed)되고 수용성 LcrV 단백질로 증폭(boosted) 된 그룹에서 높았다.
실시예 4에서 살펴본 바와 같이, F1-V와 anhydrogel가 결합되어 비강 경로로 예방 접종한 것에 따른 폐에서 강한 IFN-γ 반응을 감지할 수 없었지만, 도 5A 및 5B에서와 같이 기관지 세척액 (BAL fluid)에서의 체액성 면역이 발견되었다. 항체의 isotype이 실험되었고, isotype 중 lgG2a 가 DEC-표적화된 그룹에서 가장 강한 반면, lgG1 및 lgG2b는 항상 우세하였다. 흥미롭게도, lgA 반응은 도 5B에서와 같이, 비강 면역에 따른 기관지 세척액 (BAL fluid) 에서 감지되었으나, 도 5A에서와 같이 피하 면역에서는 감지되지 않았다. 이는 점막 특이 항체를 증진시키기 위해서는 lgA와 같은 국소 면역이 필요하다는 것을 말해준다.
또, 우리는 ELISA 방식으로 비강 세척액을 체취하고 테스트하여 호흡 경로의 상층부에서 항-LcrV 항체를 측정하였으며, 도 5C에서와 같이 F1-V 면역 그룹뿐만 아니라 DEC-표적화된 그룹에서도 lgG 항-LcrV 항체를 관찰하였다.
F1-V와 alhydrogel의 결합으로 예방 접종된 쥐에서만 비강 세척액에서의 lgA 반응이 감지되었다. 다음과 같이 비강 면역에서 혈청 lgG 반응을 측정할 때, αDEC:LcrV로 항원 자극(primed)되고 수용성 LcrV 단백질로 증폭(boosted) 된 그룹에서의 항-LcrV이 αDEC:LcrV로 증폭(Boosted) 된 그룹 보다 농도가 더 높았다.
가장 높은 항체 농도는 도 5C에서와 같이, F1-V와 alhydrogel의 결합으로 면역된 그룹에서 감지되었다. 함께 보면, 이러한 데이터는 poly IC를 보조제로 한 DEC-표적화된 단백질 백신이 점막 표면에서 효과적인 체액성 면역을 유도하는 것을 보여준다.
실시예 6. 비강 경로를 통하여 DEC-205+ 수지상 세포로 LcrV를 표적화 하는 것이, 피하 경로를 통한 표적화에 비하여, 쥐를 호흡기 전염병에 대하여 더 잘 보호함.
호흡기 전염병으로부터 보호하기 위한, 점막 DEC-표적화 된 단백질이 보조된 백신의 효율성을 연구하기 위하여, 쥐를 비강 경로 또는 피하 경로를 통하여 αDEC:LcrV 와 poly IC의 결합으로 항원 자극(prime) 및 증폭(boost) 하였다.
F1-V를 피하 경로로 예방접종을 하는 것이 양성 대조군(positive control)으로 포함되었다. 증폭(Boosted) 된 후 6주 뒤에, 비강경로로 강력한 페스트균 CO92 변형 100LD50을 쥐에 투여하였고, 14일간 생존여부를 주의 깊게 살펴보았다. 예상대로, 식염수로 예방 접종된 쥐들이 살아남지 못한 것에 반하여, 도 6에서와 같이 F1-V로 예방접종을 하는 것은 100%의 보호되었다. 흥미롭게도, 도 6A에서와 같이, 피하 경로로 한 것이 단지 33%의 쥐를 보호하는데 비하여, poly IC와 함께 αDEC:LcrV 비강 경로로 한 것은, 쥐 중 56%를 보호하였다. 비록 이러한 데이터는 새로운 접근법으로서 DEC를 표적화 하는 것이 기존의 F1-V 백신보다 더 좋은 보호를 제공하는 것은 아니라는 것을 보여주지만, 이러한 데이터는 비강 경로의 면역 방법이 비경구 면역을 넘는 보호적 이점이 있다는 것을 명백히 보여준다.
상시 실시예 1 내지 6에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따르면 독특한 수지상 세포 subset 타겟팅의 설계에 의하여, 폐의 강한 CO92 페스트균 감염에 대하여 쥐들이 보호되었다. 상기 실시예 1 내지 6에 의하면, 폐 전염병에 대하여 새로운 점막 백신으로서 DEC-20+ 수지상 세포 표적화 전략을 이용하는 것의 가치를 확인 할 수 있었다. 종래의 피하 경로의 면역 방법에 비하여, 비강 경로의 DEC-표적화 된 전달은, 점막 표면에서의 항체 반응뿐만 아니라 Th1 체액성 면역의 효율도 증가시킨다. 즉, 비경구 전달에 비하여 유사한 폭의 반응을 달성할 수 있었다.
최근 Wang et al 에서 보고된 바와 같이, TLR3 수용체 및 MDA5를 통해 나타나는 Poly IC 의 사용은 국소 면역을 자극하는데 중요한 열쇠일 수 있다. 항-CD40의 부재에서 보조제로서 Poly IC에 대한 관심은, 암환자에 대한 좋은 안정성 기록 및 다른 작용제에 비하여 붉은털 원숭이(rhesus macaques)에서 단백질 항원에 대한 반응을 위한 보조제로서 좋은 능력을 보여준 종래의 연구에 따른 것이다.
본 발명에 있어서, DEC-표적화 된 LcrV 단백질에 의하여 유도된 점막 면역의 효율을 비교하기 위하여, 항원 자극(prime) 및 증폭(boost) 전략 경로의 상이한 조합을 하였다. 도 3A 및 도5A에서와 같이, 피하 경로의 αDEC:LcrV에 의한 항원 자극(prime) 및 증폭(boost)은 점막 표면에서 세포성 및 체액성 면역을 유도할 수 있다. 도 3B에서와 같이, 피하 경로에 의해 항원 자극(prime) 되고 비강 경로로 증폭(boost) 하는 것은 IFN-γ 분비 점막 T 세포의 빈도를 증가시켰으며, 이러한 비강 증폭(boost)은 마치 예르시니아(Yersinia)에 대한 자연적 침입 경로의 모사와 같았고, 증폭(boost)을 위해서는 점막 경로가 바람직하다는 것으로 설명될 수 있다. 따라서, 도 3C, 도5B 및 도C에서와 같이, 비강 경로를 통한 항원 자극(prime) 및 증폭(boost) 이 점막 표면에서 가장 강한 항원-특이 세포성 및 체액성 면역을 유도한다면 백신에 대한 최선의 전략일 수 있다. 종래의 연구는 활성화된 T 세포의 대부분이 폐, 간, 신장과 같이 림프섬유가 없는(nonlymphoid) 섬유로 이동하는 것을 보여주었고,, 본 발명은 점막 항원 자극 (priming)이 이러한 국소 면역을 도와주는데 이점이 될 수 있다는 것을 보여주었다. 이러한 보호의 정확한 작동 메커니즘은 불명확하지만, 폐 수지상 세포에 의한 강화된 항원의 존재 및/또는 모아진 기억 및 원시 T 세포가 주요 원인일 수 있다. 또한, 작동 T 세포로부터의 염증성 케모카인즈(inflammatory chemokines) 는 미성숙 수지상 세포 및 자연 살해 세포(natural killer cells)를 포함한 다른 면역 세포들을 불러 모으는데 매우 중요한 역할을 한다.
본 발명의 실시예 1 내지 6은 한번의 DEC-표적화 된 단백질의 비경구 예방접종이라도 면역 시스템이 충분히 효과적으로 항원-특이 기억T 세포를 활성화 시킬 수 있도록 항원 자극(prime)한다는 것을 보여주었다. 이는, 비강 경로에 기반한 점막 백신을 개발하는 어려움에 비하면 커다란 이점이다. 그러나, 실시예 1 내지 6을 고려할 때, 예를 들어 DEC-표적화 된(targeted) 단백질 백신을 비강 경로로 사용하면 점막 표면에서 T 및 B 세포 면역을 강화하는 것에 크게 도움이 될 수 있다.
도 6에서와 같이, 폐 전염병의 형태로 강한 CO92 변형을 높은 투여량 또는 100 LD50로 사용한 경우의 생존률의 데이터 역시 DEC-표적화 된 단백질 백신의 점막 전달의 이점을 보여주었다. 이는 백신접종에 따른 혈청 항체 농도(titers)가 두 그룹 사이에서 비슷하기 때문에, 피하 전달 그룹에 비교하여, DEC- 표적화 된 단백질의 점막 전달에 의하여 유도된, 강화된 점막 T 및 B 세포 면역의 잠재적인 능력을 보여준다.
도 6에서와 같이, 100%의 쥐의 보호를 제공하기 위하여 Alhydrogel로 유도되는 F1-V를 피하 투여한 것만큼 높은 혈청 항체 농도(titer)가 필요하지만, DEC- 표적화 된 백신에 의하여 유도된 강화된 점막 T 세포 면역의 가치는 영장류 실험이나, 임상 적용에 더 효율적일 것이다.
DEC-205+ 수지상 세포 표적화 전략의 또 다른 가치는, 도 2A 및 도 4에서와 같이, 전형적인 비-표적화된(non-targeted) 수용성 단백질에 비교할 때 더 적은 양의 항원으로, 광범위하고도 강한 항원-특이 T 세포 반응이 유도된다는 것이다. 또한, 실시예 1 내지 6에 의하면, 임상적으로 사용 가능한 보조제인 poly IC가, DEC-205+ 수지상 세포 표적화된 백신에게 효과적인 점막 보조제라는 것을 알 수 있다. 다른 보조제가 테스트되었지만, 보조제로 "Escherichia coli 055:B5"로부터의 지질다당류(lipopolysaccharide)를 사용한 것은, LPS(지질다당류 (lipopolysaccharide))가 Th1 면역을 유도하는데 적어도 10배가 약하다는 점에서, poly IC에 비교할 때 약한 활성을 나타내었다. 자주 사용되는 또 다른 보조제인, TLR5 작용제 플라젤린(agonist flagellin)는 DEC-targeted 백신 또는 F1-V 단백질 백신 처리 중 어디에서도 폐 세포성 면역을 유도하지 못했다. 이는 유사한 항원들에 대한 Th2 치우친 (Th2 biased) 반응을 보여주는 플라젤린에 대한 다른 연구와 동일하였다. 따라서, poly IC를 보조제로 한 DEC-표적화 된 백신 전략은 항원 절약(antigen sparingness) 뿐만 아니라 증명된 안전성에 의해 미래의 임상 적용에 사용될 수 있는 잠재력을 갖는다.

Claims (12)

  1. 보조제(adjuvant)로 poly IC를 사용하여, Anti-DEC 항체에 결합된 Yersinia pestis LcrV 단백질(Anti-DEC:LcrV)을, 비강경로로 투여 하여 수지상세포를 표적하는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 개체의 호흡기 점막 면역 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    점막 표면에서 세포성(cellular) 면역 및 체액성(humoral) 면역을 유도하는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 개체의 호흡기 점막 면역 방법.
  3. 청구항 1에 있어서,
    국소(local) 면역 또는 시스템(systemic) 면역을 유도하는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 개체의 호흡기 점막 면역 방법.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 Anti-DEC 항체는 DEC-205 수용체를 이용하는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 개체의 호흡기 점막 면역 방법.
  5. 청구항 1에 있어서,
    높은 빈도의 IFN-γ 분비 CD4+ T 세포(IFN-γ secreting CD4+ T cells)를 유도하는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 개체의 호흡기 점막 면역 방법.
  6. 청구항 1에 있어서,
    IFN-γ /TNF-α/IL-2 분비 다관능CD4+ T 세포 (IFN-γ /TNF-α/IL-2 secreting multifunctional CD4+ T cells)를 유도하는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 개체의 호흡기 점막 면역 방법.
  7. 보조제(adjuvant)로 poly IC를 사용하여, Anti-DEC 항체에 결합된 Yersinia pestis LcrV 단백질(Anti-DEC:LcrV)을, 수지상 세포를 표적으로 하여, 비강 경로로 투여하기 위한 비강내 전달 장치.
  8. 청구항 7에 있어서,
    점막 표면에서 세포성(cellular) 면역 및 체액성(humoral) 면역을 유도하는 것을 특징으로 하는 비강내 전달 장치.
  9. 청구항 7에 있어서,
    국소(local) 면역 또는 시스템(systemic) 면역을 유도하는 것을 특징으로 하는 비강내 전달 장치.
  10. 청구항 7에 있어서,
    상기 Anti-DEC 항체는 DEC-205 수용체를 이용하는 것을 특징으로 하는 비강내 전달 장치.
  11. 청구항 7에 있어서,
    높은 빈도의 IFN-γ 분비 CD4+ T 세포(IFN-γ secreting CD4+ T cells)를 유도하는 것을 특징으로 하는 비강내 전달 장치.
  12. 청구항 7에 있어서,
    IFN-γ /TNF-α/IL-2 분비 다관능CD4+ T 세포 (IFN-γ /TNF-α/IL-2 secreting multifunctional CD4+ T cells)를 유도하는 것을 특징으로 하는 비강내 전달 장치.
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KR1020130073719A KR20150001075A (ko) 2013-06-26 2013-06-26 수지상 세포를 표적으로 하는 항체를 비강 경로로 투여하는 호흡기 점막 면역 방법 및 이를 이용한 전달 장치

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