KR20150000717A - Il-10 생성 조절 t세포로의 분화 유도용 조성물 - Google Patents

Il-10 생성 조절 t세포로의 분화 유도용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 덱사메타손, 비타민 D3, 및 TGF-β를 포함하는, 미분화 T 세포로부터 IL-10 생성 조절 T세포(IL-10 producing regulatory T cell)로의 분화 유도용 조성물 및 상기 조성물을 처리하여 미분화 T세포를 IL-10 생성 조절 T 세포로의 분화를 유도하는 방법에 관한 것이다.

Description

IL-10 생성 조절 T세포로의 분화 유도용 조성물 {Compositions for induction of IL-10 producing regulatory T cell differentiation}
본 발명은 덱사메타손, 비타민 D3, 및 Transforming growth factor-beta (TGF-β)를 포함하는, 미분화 T 세포로부터 IL-10 생성 조절 T세포(IL-10 producing regulatory T cell)로의 분화 유도용 조성물 및 상기 조성물을 이용한 분화 유도 방법에 관한 것이다.
인터루킨-10(IL-10)은 사이토카인 합성 억제제 인자 또는 Cytokine synthesis inhibitory factor (CSIF)로 공지되어 있으며, 조혈세포, 특히 면역 세포의 강력한 면역조절인자이다. IL-10은 활성화 된 helper T cell 2(Th2) 세포, B세포, 각질세포, 단핵구(monocyte) 및 대식세포(macrophage)와 같은 세포에서 생산되며, T 세포, 단핵세포 및 대식세포를 포함하는 다수의 세포의 활성화를 억제한다. 특히, IL-10은 helper T cell 1(Th1) 세포, 천연 킬러 세포, 단핵구 및 대식세포와 같은 세포의 IL-1, Interferon-γ(IFN-γ), 및 Tumor necrosis factor(TNF)등의 합성을 억제한다.
또한, IL-10은 항원 제시 세포에서 분비하는 사이토카인의 분비를 저해함으로써 그 효과를 발휘하며, 단핵구, 대식세포 또는 수지상세포(dendritic cell)와 같은 항원 제시 세포들의 항원 제시 기능을 억제한다. 따라서, IL-10은 세포성 면역반응에 대한 실질적인 억제자 역할을 담당한다고 볼 수 있다.
이와 관련하여, 미국등록특허 제 6,670,146호에는 덱사메타손과 비타민 D3를 함께 처리하여 IL-10 생성 조절 T 세포를 유도하는 것에 관한 개시가 있으나, 이로부터 생성되는 IL-10의 생성량은 명확하지 않다. 이와 같이 IL-10을 생성하는 세포는 면역조절과 연관성을 가지고 있지만, 이에 대한 세포 유도 방법에 관한 연구는 아직 부족한 실정이다.
또한, 종양세포 증식인자 베타(Transforming growth factor-beta, TGF-β)는 Foxp3+ T세포의 유도와 면역 억제능의 유지에 중요한 역할을 하는 조절 사이토카인으로서, CD4+CD25- T세포가 TGF-β의 존재하에 억제능을 가진 Foxp3+ T세포로 전환되는 것은 알려져 있으나, IL-10의 생성을 조절하는 T세포로의 분화에 관여하는 것에 대해서는 알려진 바 없다.
이러한 배경 하에, 본 발명에서는 마우스의 CD4+ T세포에서 덱사메타손, 비타민 D3, 및 TGF-β로 자극하여 IL-10을 생성하는 조절 T 세포(regulatory T cell)로의 분화를 유도하였다. 그 결과, 기존에 FOXP3+ T 세포를 유도하는 것으로 알려진 TGF-β를 단독으로 처리하거나, 덱사메타손 및 비타민 D3 를 처리한 경우와 비교하여, 덱사메타손, 비타민 D3, 및 TGF-β를 함께 처리 했을 경우, 현저히 상승된 분화 유도 효과를 나타내며 IL-10의 생성이 눈에 띄게 증가한 것을 관찰하였다.
이에 본 발명자들은 이러한 결과를 바탕으로 미분화된 CD4+ T세포에 덱사메타손, 비타민 D3, 및 TGF-β로 자극함으로써 IL-10 생성 조절 T 세포로의 분화를 유도하여 새로운 면역조절 세포 개발에 기여하고자 한다.
본 발명의 목적은 덱사메타손, 비타민 D3, 및 TGF-β를 포함하는, 미분화 T 세포로부터 IL-10 생성 조절 T세포(regulatory T cell)로의 분화 유도용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 생체 외에서 미분화 T세포에 상기 조성물을 처리하는 단계를 포함하는, IL-10 생성 조절 T 세포로의 분화 유도 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 덱사메타손, 비타민 D3, 및 TGF-β를 포함하는, 미분화 T 세포로부터 IL-10 생성 조절 T세포(regulatory T cell)로의 분화 유도용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, "덱사메타손" 이란, 글루코코르티코이드 활성을 가지는 코르티코스테로이드 약물로서, 내인성 코티솔 효능의 약 25-30배이다. 이는 많은 염증 및 자가면역성 병변 예컨대 류마티스성 관절염 등을 치료하는데 사용된다. 본 발명에서는 IL-10 생성 조절 T세포(regulatory T cell)로의 분화 유도용 조성물의 일부로 사용될 수 있음을 확인하였다.
본 발명에서 덱사메타손은, 이의 염, 용매화물 또는 동등한 활성을 가지는 유도체를 포함한다. 상기 유도체는 IL-10 생성 조절 T세포로의 분화 유도 능력을 나타내는 한 특별한 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 비독성 에스터를 포함한다. 상기 염은, 당 업계에서 허용되는 비독성 유기 또는 무기 산 부가염 등을 포함한다. 상기 예로는, 덱사메타손의 아세테이트(acetates), 이소니코티네이트(isonicotinates), 포스페이트(phosphates), 소듐 메타설포벤조에이트(sodium metasulfobenzoates), 소듐 포스페이트(sodium phosphates), 헤미숙시네이트(hemisuccinates), 리놀리에이트(linoliates), 팔미테이트(palmitates), 피발레이트(pivalates), 프로피오네이트(propionates), 소듐 숙시네이트(sodium succinates), 테부테이트(tebutates), 발러레이트(valerates), 펜프로피오네이트(phenpropionates), 및 트로선데이트(troxundates)를 포함하나, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "비타민 D3" 는 콜레칼시페롤으로 불리기도 하며, 비타민 D2(에르고칼시페롤)와 함께 비타민 D로서 총괄적으로 언급된다. 주로 간에서 대사작용이 일어나며, 25-히드록시비타민 D3를 생산하며, 이는 활성 비타민 D 호르몬의 프로호르몬(prohormone)이다. 특히, 비타민 D3는 담즙산의 도움을 받아 칼슘과 인산염의 흡수를 촉진하며, 칼슘결합 단백질의 합성을 촉진하여 동물의 골격형성에 도움을 주고 있으며, 면역시스템을 강화시키는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 비타민 D3는 상기 덱사메타손 및 후술하는 TGF-β와 함께 IL-10 생성 조절 T세포(regulatory T cell)로의 분화 유도 물질로서 사용될 수 있음이 규명되었다. 바람직하게, 비타민 D3는 활성형 비타민 D3 를 사용할 수 있으며, 예를 들어, 1α-히드록시콜레칼시페놀, 1α,25-히드록시콜레칼시페놀, 1α,24-디히드록시콜레칼시페놀, 1α,24,25-트리히드록시 콜레칼시페롤 등과 같은 1α-히드록시 비타민 D3 류; 24-히드록시콜레칼시페롤, 25-히드록시콜레칼시페롤, 24, 25-디히드록시콜레칼시페롤, 25, 26-디히드록시콜레칼시페롤 등과 같은 24- 또는 25- 히드록시 비타민 D3 류; 24-옥소콜레칼시페롤, 1α-히드록시-24-옥소콜레칼시페롤, 25-히드록시-24-옥소콜레칼시페롤, 1α,25-히드록시-24-옥소콜레칼시페롤 등과 같은 24-옥소비타민 D3 류; 25-히드록시콜레칼시페롤-26,23-락톤, 25-히드록시콜레칼시페롤-26,23-퍼옥시락톤, 및 1α, 25-히드록시콜레칼시페롤-26,23-락톤, 1α, 25-디히드록시콜레칼시페롤-26,23-퍼옥시락톤 등의 26,23-락톤류의 활성형 비타민 D3 일 수 있다.
본 발명에서 용어, "TGF-β" 는 다기능 분비단백질로서, 혈소판이나 태반, 골격 등 여러 조직에서 생산되고 세포의 생장억제, 세포외기질의 생산, 면역능 억제 같은 작용을 한다. 세포독성 T세포, 천연 킬러 세포, 및 마크로파지 등의 증식과 분화를 억제하며, 세포의 형태와 시기에 따라 증식 억제, 전이, 세포사멸, 면역 등의 다양한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있으며, 특히 FOXP3+ T세포의 유도의 면역 억제능의 유지에 중요한 역할을 하는 조절 사이토카인으로 알려져 있다.
또한, TGF-β 는 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3으로 불리는 이소폼(isoform)이 존재하며, 본 발명에서 IL-10 생성 조절 T세포(regulatory T cell)로의 분화 유도용 조성물의 TGF-β는 상기 이소폼(isoform)들을 포함한다.
본 발명에서, "T 세포" 는 각종 병원체에 대한 생체 방어 시스템으로 면역계에서 중심적 역할을 담당하는 세포군의 하나이며, 인체의 흉선에서 생성되며 일련의 분화과정을 거치면서 고유의 특성을 지닌 T세포로 분화하게 된다.
본 " 조절 T 세포"는 CD4와 CD25가 발현되어 있으며, T 세포의 발생을 조절하는 기능을 하고, 면역반응을 억제함으로써 면역의 항상성을 유지하며 자가면역반응 등을 차단한다. 조절 T 세포는 대부분 CD4+ 세포군에 속해 있으며, forkhead box protein3 (FOXP3)를 발현하는 CD4+CD25+ T 세포, TGF-β를 발현하는 T-helper cell 3(Th3), IL-10을 발현하는 조절 T세포 1(regulatory T cell 1, Tr1)의 세 종류가 있다. 바람직하게, 본 발명은 IL-10을 발현하는 조절 T세포로의 분화 유도에 관한 것이다.
본 발명에서, "분화"란 각 단계의 미숙한 세포가 증식분열을 반복해서 기능적 및 형태적으로 성숙한 단계로 진행하는 것으로, "미분화 세포" 란 세포가 미숙한 단계에서 멈추어 아직 분화될 여지를 남겨둔 세포를 말한다.
T 세포의 전구세포가 흉선 안으로 들어가면, 다양한 유전자를 발현시킴으로써 전구세포들이 비만세포(mast cell), 킬러세포, 항원 표현 세포(antigen-presenting cell) 등으로 분화될 수 있다. T 세포는 처음에는 CD4 분자와 CD8 분자를 모두 나타내며, 자가항원 선택과정을 거치면서 세포가 성숙함에 따라 이들 세포는 CD8 분자를 억제하여 보조세포의 기능을 갖는 CD4+ T 세포가 되거나, CD4 분자를 억제하여 세포독성 기능을 가진 CD8+ T세포가 된다. 이 후 항원에 의한 특정 림프구 클론의 자극에 의해 2차 분화가 시작되며, 이 과정은 면역반응과 동일하다.
바람직하게, 본 발명에서 "미분화 T 세포" 란 흉선에서 일정한 형질과 기능을 지닌 세포로 분화되지 못한 T세포를 의미하며, 특히 CD4+ T 세포의 2차 분화과정이 이루어지지 않은 T 세포를 포함한다.
IL-10은 면역세포의 강력한 면역조절인자로서, IL-10의 생성을 촉진하는 조절 T 세포로의 분화를 유도함으로써, 향후 면역과 관련된 질환의 치료에 있어서 세포를 이용한 치료를 도모할 수 있다.
본 발명의 발명자들은 덱사메타손, 비타민 D3 및 TGF-β를 일정한 농도로 혼합하여 IL-10의 생성이 유의하게 증가하는 조절 T 세포로의 분화를 유도하는 조성물을 개발하였으며, 이를 뒷받침하는 실시예 1 및 2에서는 덱사메타손, 비타민 D3, TGF-β를 함께 처리한 경우, 항 염증 사이토카인인 IL-10의 생성량이 상당히 증가함을 관찰하였으며, 특히 TGF-β를 단독으로 처리한 경우 및 덱사메타손과 비타민 D3만을 함께 처리한 경우에 비해서 현저한 증가를 나타내었다.
상기 조성물의 보다 구체적인 양태로서, 상기 덱사메타손의 농도는 10-8 내지 10-9M 일 수 있으나, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니고, 상기 농도 범위는 미분화 T 세포의 양, 분화 유도 시간 및 기타 실험 조건 등에 따라 통상의 기술자가 적절히 변경하여 실시할 수 있다.
또 하나의 보다 구체적인 양태로서, 상기 비타민 D3의 농도는 10-6 내지 10-8M 일 수 있으나, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니고, 상기 농도 범위는 미분화 T 세포의 양, 분화 유도 시간 및 기타 실험 조건 등에 따라 통상의 기술자가 적절히 변경하여 실시할 수 있다.
또 다른 보다 구체적인 양태로서, 상기 TGF-β의 농도는 4 내지 6ng/mL 일 수 있으나, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니고, 상기 농도 범위는 미분화 T 세포의 양, 분화 유도 시간 및 기타 실험 조건 등에 따라 통상의 기술자가 적절히 변경하여 실시할 수 있다.
또 하나의 보다 구체적인 양태로서, 상기 조성물은 항-CD28 항체, 항- IFN γ항체 및 항-IL-4 항체로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 더 포함할 수 있다. CD28은 T세포의 공동자극수용체로서, 항 CD28항체는 공동자극분자의 신호를 전달하여 T 세포를 활성화시킨다. 또한, IFN γ는 림프구의 분열이나 분화를 조절하는 것으로 알려진 사이토카인이며, IL-4는 naive T 세포의 Th2 세포로의 분화를 유도하는 사이토카인으로서, 본 발명에서 항- IFN γ항체 및/또는 항-IL-4 항체는 T 세포의 분화를 유도하기 위한 물질로 사용될 수 있다.
상기 "항체" 란 항원성 부위에 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 항체는 CD28, IFN γ, IL-4 에 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 단일클론항체, 다클론항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.
또한, 본 발명의 항체에는 키메라 항체, 인간화 항체, 인간항체 등의 특수항체도 포함된다.
나아가, 본 발명에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태 뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등을 예시할 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 하나의 양태로서, 본 발명은 생체 외에서 미분화 T세포에 상기 조성물을 처리하는 단계를 포함하는, IL-10 생성 조절 T 세포로의 분화 유도 방법에 관한 것이다. 상기 방법을 이용하여 조절 T 세포로의 분화를 유도하여, IL-10의 생성을 유의적으로 증가시킬 수 있다.
본 발명은 IL-10 생성 조절 T세포(IL-10 producing regulatory T cell)로의 분화를 높은 효율로 유도하는데 사용할 수 있으며, 이를 통하여 새로운 면역조절 세포 개발에 기여할 수 있다.
도 1은 DBA1J 마우스의 CD4+ T세포에서, TGF-β 를 단독으로 처리한 경우 (1번), 덱사메타손, 비타민 D3 및 TGF-β를 함께 처리한 경우 (2번), 및 덱사메타손 및 비타민 D3를 처리한 경우, 각각 항염증 사이토카인 IL-10의 생성량을 나타낸 것이다.
도 2는 DBA1J 마우스의 CD4+ T세포에서, TGF-β 를 단독으로 처리하거나 (1번), 덱사메타손, 비타민 D3 및 TGF-β를 함께 처리하거나(2번), 덱사메타손 및 비타민 D3를 처리함으로써(3번) 분화가 유도된 조절 T 세포를 각각 24, 48, 72시간 배양하여 생성되는 IL-10의 양을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. IL -10 생성 조절 T 세포로의 분화 유도
DBA1J의 비장세포에서 5×105개의 CD4+ T세포를 분리하고, 1μg/mL 농도의 anti-CD3 350ul로 24-웰 플레이트에 코팅한 다음, 항-CD28 항체(BioLegend, 원바이오) 1μg/mL, 항-IFN γ항체(R&D, 웅비메디텍) 5μg/mL, 항-IL-4 항체(R&D, 웅비메디텍) 5μg/mL, 덱사메타손(Dexamethasone, SigmaAldrich, 시그마알드리치코리아) 5x10-8M, 비타민 D3(SigmaAldrich, 시그마알드리치코리아) 10-7M, 및 TGF-β(Peprotech, 페프로텍코리아) 5ng/mL을 처리한 후 2일 동안 배양하여 IL-10 생성 조절 T 세포로의 분화를 유도하였다.
DBA1J 마우스는 다른 마우스 계통에 비해 조절 T세포를 유도하기 어려운 것으로 알려져 있다. 특히, 면역억제 기능을 가진 조절 T 세포를 유도하는 방법 중에서, 기존에 Foxp3를 발현하는 조절 T 세포를 유도하는 것으로 알려진 TGF-β 처리 조건(1번 조건) 및 IL-10 생성 조절 T 세포를 유도하는 것으로 알려진 덱사메타손 및 비타민 D3 처리 조건 (3번 조건)과 비교하여, 본 발명과 같이 덱사메타손, 비타민 D3 및 TGF-β 를 함께 처리 했을 경우(2번 조건) 항 염증 사이토카인 IL-10의 생성이 다른 조건에 비해 상승적으로 증가함을 관찰하였다 (표 1 및 도 1 참조).
자극제

마우스
항- CD28 항체
항- IFN -γ항체
항- IL -4 항체
TGF -β 		덱사메타손
+ 비타민 D 3
1
DBA1J 		O O O O -
2 O O O O O
3 O O O - O
실시예 2. IL -10 사이토카인 측정 ( ELISA )
덱사메타손, 비타민 D3, TGF-β 의 처리에 따른 조절 T 세포의 분화조건에서 IL-10 의 생성 정도를 sandwich ELISA를 이용하여 조사하였다. 96-웰 플레이트에 단일클론성 항IL-10항체(R&D, 웅비메디텍) 4μg/mL 으로 4℃에서 밤새 반응시키며, 반응 후 차단용액 (1% BSA/PBST)으로 비 특이적 결합을 차단하였다. IL-10 recombinant (R&D, 웅비메디텍)를 1/2씩 연속 희석하여 standard 로 사용하였으며, 세포배양 상층액을 넣고 실온에서 2시간동안 반응시켰다. 그 후, biotinylated anti-IL-10를 넣어 2시간동안 실온에서 반응시켰으며, 반응 후 4회 세척한 후, ExtraAvidin-Alkaline Phosphatase conjugate 를 희석하여 넣고 실온에서 2시간동안 반응시켰다. 반응 후 PNPP/DEA 용액을 넣고 발색하였으며, 발색 후 405 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
상기 실시예 1의 1번, 2번, 3번의 조건대로 생성한 각각의 조절 T 세포를 24, 48, 72시간 배양하여 생성되는 IL-10의 양을 확인한 결과, 2번 조건에서 생성되는 IL-10의 양이 매우 높음을 관찰하였으며, 특히 72시간이 지나면 10000pg/ml 정도의 상당히 높은 농도의 IL-10이 생성되었다(도 2).

Claims (6)

  1. 덱사메타손, 비타민 D3, 및 종양세포 증식인자 베타(Transforming growth factor-beta, TGF-β)를 포함하는, 미분화 T 세포로부터 IL-10 생성 조절 T세포(regulatory T cell)로의 분화 유도용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 덱사메타손의 농도는 10-8 내지 10-9M 인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 비타민 D3의 농도는 10-6 내지 10-8M 인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 TGF-β의 농도는 4 내지 6 ng/mL 인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 항-CD28 항체, 항- IFN γ항체 및 항-IL-4 항체로 이루어진군에서 선택되는 1종 이상을 더 포함하는 조성물.
  6. 생체 외에서 미분화 T세포에 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 조성물을 처리하는 단계를 포함하는, IL-10 생성 조절 T 세포로의 분화 유도 방법.
KR1020130073185A 2013-06-25 2013-06-25 Il-10 생성 조절 t세포로의 분화 유도용 조성물 KR101518370B1 (ko)

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