KR20140140477A - Lysin enzyme variant having improved bacteriolytic or antibacterial activity - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to a lysine enzyme variant having enhanced bacteriolytic or antibacterial activity against pathogenic bacteria, and to use thereof. The lysine enzyme variant includes amino acids of SEQ ID NO:1 from which one or more from 66th, 74th, 81th, 94th, 112th, 177th, 193th or 204th amino acid are substituted. The lysine enzyme variant of the present invention can be widely used for a pharmaceutical composition, an antiseptic agent, an antibiotic, and antibacterial agent. Therefore, the lysine enzyme variant is expected to be advantageously used in industries.

Description

용균 또는 항균 능력이 개선된 리신 효소 변이체{Lysin enzyme variant having improved bacteriolytic or antibacterial activity}[0001] The present invention relates to a lysine enzyme variant having improved antibacterial activity,

본 발명은 용균 또는 항균 능력이 개선된 리신 효소 변이체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 66번째, 74번째, 81번째, 94번째, 112번째, 177번째, 193번째 또는 204번째 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 치환된 것을 특징으로 하는 병원성 세균에 대한 용균 또는 항균 능력이 개선된 리신 효소 변이체, 상기 리신 효소 변이체를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 제조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 재조합 벡터를 숙주 세포에 형질전환하여 리신 효소 변이체를 생산하는 방법, 상기 방법에 의해 생산된 리신 효소 변이체, 상기 리신 효소 변이체를 병원성 세균에 처리하여 병원성 세균을 방제하는 방법, 상기 리신 효소 변이체를 유효성분으로 포함하는 병원성 세균 방제용 조성물, 상기 리신 효소 변이체를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물, 항생제 및 소독제에 관한 것이다.The present invention relates to a lysine enzyme mutant having improved lytic activity or antimicrobial activity, and more particularly, to a lysine enzyme mutant having improved lytic activity, Wherein said recombinant vector comprises the gene encoding said lysine enzyme mutant, said recombinant vector comprising said gene, said recombinant vector comprising said gene, said recombinant vector comprising said gene, said recombinant vector comprising said gene, said lysine enzyme mutant having improved antimicrobial activity against pathogenic bacteria, , A method for producing a lysine enzyme mutant by transforming the recombinant vector into a host cell, a lysine enzyme mutant produced by the method, a method for treating a pathogenic bacterium by treating the lysine enzyme mutant with a pathogenic bacterium A composition for inhibiting pathogenic bacteria comprising the lysine enzyme mutant as an active ingredient, It relates to pharmaceutical compositions, antibiotics and disinfectants comprising the enzyme variant, as an active ingredient.

박테리오파지 (bacteriophage)는 세균을 감염시켜 용균 (lysis)시키는 바이러스로 숙주에 침투하여 복제 과정을 통해 증폭한 후 숙주 세포벽을 분해하고 숙주 밖으로 나온다. 이를 위해 세포벽 분해 효소인 리신 (lysin)을 발현하는데, 이 리신 단백질은 세포벽의 경직성과 기계적 강도를 유지하는 펩티도글리칸 (peptidoglycan)을 분해하여 세포벽을 파괴하는 효소이다.Bacteriophage is a virus that infects and lyses bacteria. It penetrates into the host, amplifies it through the replication process, decomposes the host cell wall, and comes out of the host. To this end, lysine, a cell wall degrading enzyme, is expressed. This lysine protein is an enzyme that decomposes peptidoglycan which maintains the stiffness and mechanical strength of the cell wall to destroy the cell wall.

박테리오파지가 생산하는 리신 효소는 박테리아를 사멸시키는 효소 항생제 (enzybiotics)라고 불릴 정도로 우수한 항균력을 갖는다 (Wu et al ., 2012, BMC Microbiology 12: 54). 즉, 효소로 항생제 역할을 할 수 있다는 것이 강조된 것으로 기존의 항생제에 대한 내성 문제가 심각해지면서 항생제로 치료 불가능한 다제-내성 (multi-drug resistant) 병원균에 대하여 그 효용이 부각되고 있다 (Hermoso et al., 2007, Current Opinion in Microbiology 10:461-472).The lysine enzymes produced by bacteriophage have an excellent antibacterial ability, called enzybiotics, which kill bacteria (Wu et al . , 2012, BMC Microbiology 12: 54). In other words, it is emphasized that the enzyme can act as an antibiotic, and as the problem of tolerance to existing antibiotics becomes more serious, the utility of the antibiotics against multi-drug resistant pathogens has been emphasized (Hermoso et al. , 2007, Current Opinion in Microbiology 10: 461-472).

물론 항생제에 의존하는 치료가 세균 감염 치료의 주류를 이루고 있다. 하지만 다제-내성 (multi-drug resistant) 병원균의 출몰이 빈번해지고, 기존의 모든 항생제에 내성이 생기도록 (pan-resistant) 조작된 박테리아의 제작마저 가능해지면서 바이오테러와 바이오전쟁 병원균의 위협이 현실로 다가오고 있다. 따라서 기존의 전통적인 항생제에 내성을 갖는 박테리아의 치료를 위한 새로운 개념의 항생제 개발이 필요하다. 또한 그러한 항생제의 타겟이나 치료 방법은 기존의 항생제와는 확실히 다른 것이라면 더욱 의미 있는 치료 효과를 기대할 수 있을 것이다.Of course, antibiotic-dependent therapy is the mainstay of treatment for bacterial infections. However, with the advent of multi-drug resistant pathogens and frequent production of pan-resistant, engineered bacteria that are resistant to all existing antibiotics, the threat of bioterrorism and bio-warfare pathogens is a reality. It is approaching. Therefore, it is necessary to develop a new concept of antibiotics for the treatment of bacteria which are resistant to conventional antibiotics. In addition, the target and treatment method of such antibiotics can be expected to have a more meaningful therapeutic effect if they are clearly different from conventional antibiotics.

바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis)는 동물 및 사람에게 치명적인 탄저병을 일으키는 치명적인 병원균이다. 호흡기로 흡입했을 경우의 치사율은 거의 100%에 가까울 정도로 무서운 병원균이다. 바실러스 안트라시스 균은 잘 알려진 항생제 시프로플록사신 (ciprofloxacin) 같은 항생제로 치료 가능하지만, 체내에서 생산된 독소로 인해 그 후유증이 심각하다. 또한 자연적으로 또는 인위적으로 항생제 내성이 생긴 변이주들이 출몰하거나 제작될 가능성이 있어서 기존의 항생제가 무용지물이 될 가능성이 상존한다. 실제 구 소련에서 그러한 탄저 균주가 만들어진 적이 있다고 보고된 바 있다.Bacillus anthraquinone system (Bacillus anthracis ) is a deadly pathogen causing fatal anthrax to animals and humans. The mortality rate when inhaled into the respiratory tract is almost 100%, which is a terrible pathogen. Bacillus anthracis can be treated with antibiotics such as the well-known antibiotic ciprofloxacin, but its sequela is severe due to toxins produced in the body. In addition, there is a possibility that existing antibiotics may become obsolete because mutants with natural or artificial antibiotic resistance are likely to appear or be produced. In fact, it has been reported that such anthrax strains have been produced in the former Soviet Union.

기존 항생제에 내성이 생긴 바실러스 안트라시스 균을 제어하는 방법 중 하나는 세균에 특이적인 파지 (phage)를 활용하거나 그 파지가 내는 용균 효소인 리신 (lysin)을 활용하는 것이다. 바실러스 안트라시스 세균-특이적인 용균 효소인 리신은 여러 종류가 알려져 있는데, 그 중에서도 PlyPH 리신이 활성이 높은 것으로 보고되었다 (Yoong et al ., 2006, Journal of Bacteriology 188:2711-2714). 용균효소인 리신은 앞에 기술한 것처럼 파지가 숙주 밖으로 나올 때 숙주의 세포벽을 분해하는 역할을 한다. 따라서 용균 효소의 활성에 의존하여 바실러스 안트라시스에 대한 항균력 차이가 발생하는 것은 당연할 것이다.One of the ways to control Bacillus anthracis, which is resistant to existing antibiotics, is to utilize a bacterial-specific phage or utilize the lysin, a lytic enzyme that provides the phage. Several kinds of lysine, Bacillus anthracis bacteria-specific lytic enzyme, have been known, among which PlyPH lysine has been reported to be highly active (Yoong et al . , 2006, Journal of Bacteriology 188: 2711-2714). Lysine, a lysine enzyme, plays a role in degrading the cell wall of the host when the phage exits the host, as described above. Therefore, it is natural that a difference in antibacterial activity against Bacillus anthracis occurs depending on the activity of lytic enzyme.

본 발명에서는 N-말단 촉매 도메인 (N-terminal catalytic domain) 및 C-말단 세포벽 결합 도메인 (C-terminal cell wall binding domain)으로 구성된 리신 PlyPH3을 개량하여 항균력이 개선된 리신 효소 변이체를 제공하고자 한다.In the present invention, lysine PlyPH3 comprising an N-terminal catalytic domain and a C-terminal cell wall binding domain is modified to provide a lysine enzyme variant having improved antibacterial activity.

한편, 한국등록특허 제0914163호에는 '황색포도상구균에 특이적인 포도비리대 박테리오파지 유래의 항균 단백질'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제0988771호에는 '엔테로코쿠스 및 스트렙토코쿠스 특이적 사멸능을 갖는 신규한 리신 단백질'이 개시되어 있다. 그러나 본 발명에서와 같이 용균 또는 항균 능력이 개선된 리신 효소 변이체에 대해서는 개시된 바가 없다.Korean Patent No. 0914163 discloses an antimicrobial protein derived from bacteriophage which is specific to Staphylococcus aureus, and Korean Patent No. 0988771 discloses an antimicrobial protein specific for Enterococcus and Streptococcus. ≪ RTI ID = 0.0 > lysine < / RTI > However, lysine enzyme mutants having improved lytic or antibacterial activity as in the present invention have not been disclosed.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 탄저균인 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis)에 대한 항균 능력을 가진 PlyPH3 리신 효소 단백질 코딩 유전자를 변이시킨 후, 항균 및 용균 능력이 향상된 PlyPH3 리신 효소 변이체를 선발하였고, 선발한 PlyPH3 리신 효소 변이체의 염기서열을 결정하여 변이 아미노산 서열을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.The present invention is derived by the request as described above, the inventors of Bacillus anthracis anthraquinone system (Bacillus anthracis) was then mutated to PlyPH3 lysine enzyme protein coding gene with antibacterial ability, antibacterial and lytic capacity selection improved PlyPH3 lysine enzyme variant to confirm the mutant amino acid sequence to determine the nucleotide sequence of the selected PlyPH3 lysine enzyme variants Thereby completing the present invention.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열 중 66번째, 74번째, 81번째, 94번째, 112번째, 177번째, 193번째 또는 204번째 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 치환된 것을 특징으로 하는 병원성 세균에 대한 용균 또는 항균 능력이 개선된 리신 효소 변이체를 제공한다.In order to solve the above-mentioned problems, the present invention provides a polypeptide having an amino acid sequence in which any one or more amino acids of the 66th, 74th, 81st, 94th, 112th, 177th, 193rd or 204th amino acids of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 And a lysine enzyme mutant having improved antibacterial activity against pathogenic bacteria.

또한, 본 발명은 상기 리신 효소 변이체를 코딩하는 유전자를 제공한다.The present invention also provides a gene encoding the lysine enzyme mutant.

또한, 본 발명은 상기 리신 효소 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.The present invention also provides a recombinant vector comprising a gene encoding the lysine enzyme mutant.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.The present invention also provides a host cell transformed with the recombinant vector.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 숙주 세포에 형질전환하여 리신 효소 변이체 코딩 유전자를 발현하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 리신 효소 변이체의 생산 방법을 제공한다.Also, the present invention provides a method for producing a lysine enzyme mutant, which comprises transforming the recombinant vector into a host cell to express a lysine enzyme mutant coding gene.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 리신 효소 변이체를 제공한다.The present invention also provides a lysine enzyme mutant produced by the above method.

또한, 본 발명은 상기 리신 효소 변이체를 병원성 세균에 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 병원성 세균의 방제 방법을 제공한다.Also, the present invention provides a method for controlling pathogenic bacteria, which comprises treating the pathogenic bacteria with the lysine enzyme mutant.

또한, 본 발명은 상기 리신 효소 변이체를 유효성분으로 포함하는, 병원성 세균 방제용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for controlling pathogenic bacteria, comprising the lysine enzyme mutant as an active ingredient.

또한, 본 발명은 상기 리신 효소 변이체를 유효성분으로 포함하는, 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis) 또는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 의해 유발되는 질환의 치료용 약학적 조성물을 제공한다.In addition, the present invention is Bacillus anthraquinone system (Bacillus including the lysine enzyme variant as an active ingredient anthracis or Bacillus cereus . The present invention also provides a pharmaceutical composition for the treatment of diseases caused by anthracis or Bacillus cereus .

또한, 본 발명은 상기 리신 효소 변이체를 유효성분으로 포함하는 항생제를 제공한다.In addition, the present invention provides an antibiotic comprising the lysine enzyme mutant as an active ingredient.

또한, 본 발명은 상기 리신 효소 변이체를 유효성분으로 포함하는 소독제를 제공한다.The present invention also provides a disinfectant comprising the lysine enzyme mutant as an active ingredient.

본 발명에서는 탄저병을 일으키는 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis) 및 식중독을 일으키는 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus)에 대한 사멸능이 향상된 plyPH3 리신 변이체를 확인하였다. 본 발명의 리신 변이체는 약학 조성물, 소독제, 항생제 및 항균제로 광범위하게 활용될 수 있으므로, 산업적으로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다.Bacillus According to the present invention causes a Bacillus anthraquinone system (Bacillus anthracis), and food poisoning that causes anthrax cereus (Bacillus cereus ) was identified. The lysine mutant of the present invention can be widely used as a pharmaceutical composition, a disinfectant, an antibiotic, and an antibacterial agent, so that it can be industrially useful.

도 1은 박테리오파지에서 분리한 리신과 본 발명에서 제조한 리신 변이체의 용균 활성을 비교하기 위해 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)가 도말된 평판배지에 리신 또는 리신 변이체를 세포 표면에 발현하는 대장균을 접종하여 각 리신 변이체의 투명환 (halo) 역가를 비교한 결과를 나타낸다.
도 2는 PlyPH3 리신을 대장균의 표면에서 발현시키기 위해 사용한 빙핵활성 단백질 INP (ice-nucleation protein)를 포함하는 표면 발현 벡터의 모식도를 나타낸다.
도 3은 빙핵활성 단백질 INP에 의한 PlyPH3의 세포 표면 발현 및 투명환 역가를 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 변이-유발 (error-prone) PCR에 의한 PlyPH3 라이브러리의 제조를 나타낸다.
도 5는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)에서 리신의 발현 및 투명환 역가를 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 확보된 PlyPH3 리신 변이체의 변이 위치를 확인하기 위해 PlyPH3과 78.0%의 상동성을 갖는 plyB의 촉매 도메인 (catalytic domain)의 아미노산 서열을 비교한 결과를 나타낸다.
도 7은 PlyPH3 리신 변이체의 변이 위치를 단백질 3차 구조상에서 나타낸 것이다.
도 8은 PlyPH3(4342PlypH)과 극히 유사한 PlyPH 및 AmpD 리신의 아미노산 서열을 비교한 결과를 나타낸다.Brief Description of the Drawings Fig. 1 is a view for comparing the lysine activity of lysine isolated from bacteriophage and the lysine mutant prepared in the present invention by inoculating E. coli expressing lysine or lysine mutant on a cell surface with Bacillus cereus- The results of comparing the translational halo of each lysine mutant are shown.
Fig. 2 is a schematic diagram of a surface expression vector containing an ice nucleating protein INP (ice-nucleation protein) used for expressing PlyPH3 lysine on the surface of E. coli.
FIG. 3 shows the results of confirming cell surface expression and transparency of PlyPH3 by the ice nucleating activity protein INP.
Figure 4 shows the preparation of the PlyPH3 library by error-prone PCR.
Figure 5 is a graphical representation of Bacillus subtilis subtilis ), and the results of confirming the expression of lysine and the translocation of the lysine.
FIG. 6 shows the result of comparing the amino acid sequences of the catalytic domain of plyB having the homology of 78.0% with PlyPH3 in order to confirm mutation positions of the obtained PlyPH3 lysine mutant.
Fig. 7 shows the position of the mutation of the PlyPH3 lysine mutant on the protein tertiary structure.
Figure 8 shows the comparison of the amino acid sequences of PlyPH and AmpD lysine, which are very similar to PlyPH3 (4342PlypH).

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열 중 66번째, 74번째, 81번째, 94번째, 112번째, 177번째, 193번째 또는 204번째 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 치환된 것을 특징으로 하는 병원성 세균에 대한 용균 또는 항균 능력이 개선된 PlyPH3 리신 효소 변이체를 제공한다.In order to accomplish the object of the present invention, the present invention provides a polypeptide having an amino acid sequence of any one of 66th, 74th, 81st, 94th, 112th, 177th, 193rd or 204th amino acids of the amino acid sequence of SEQ ID NO: And a PlyPH3 lysine enzyme mutant having improved antibacterial activity against pathogenic bacteria.

본 발명의 일 구현 예에 따른 상기 리신 효소 변이체는 서열번호 1의 81번째 아미노산인 아스파르트산이 아스파라긴(N, Asparagine)으로 치환된 변이체(D81N), D81N 변이체에 추가로 서열번호 1의 아미노산 서열 중 177번째 아미노산인 이소루신(I, Isoleucine)이 루신(L, Lecine)으로, 193번째 아미노산인 글루탐산(E, Glutamic acid)이 아스파르트산으로 및 204번째 아미노산인 이소루신이 페닐알라닌(F, Phenylalanine)으로 치환된 변이체(D81N/I177L/E193D/I204F), D81N/I177L/E193D/I204F 변이체에 추가로 서열번호 1의 아미노산 서열 중 112번째 아미노산인 아르기닌(R, Arginine)이 루신으로 치환된 변이체(D81N/R112L/I177L/E193D/I204F), 상기 D81N 변이체에 추가로 서열번호 1의 아미노산 서열 중 74번째 아미노산인 글루타민(Q, Glutamine)이 루신으로 치환된 변이체(Q74L/D81N), Q74L/D81N 변이체에 추가로 서열번호 1의 아미노산 서열 중 94번째 아미노산인 리신(K, Lysine)이 아르기닌으로 치환된 변이체(Q74L/D81N/K94R) 또는 66번째 아미노산인 이소루신이 발린(V, Valine)으로 치환된 변이체(I66V/Q74L/D81N)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The lysine enzyme mutant according to an embodiment of the present invention comprises a variant (D81N) in which aspartic acid as the amino acid at position 81 of SEQ ID NO: 1 is substituted with asparagine (N, Asparagine), a mutant (D81N) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: (I, Isoleucine), which is the first amino acid, is replaced by leucine (L, Lecine), and the 193th amino acid, glutamic acid, is replaced by aspartic acid and the 204th amino acid is replaced by phenylalanine (D81N / I197D / I204F), a mutant in which arginine (R, Arginine), which is the 112th amino acid of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, was substituted with leucine in addition to the D81N / I177L / E193D / I204F mutant (Q74L / D81N) in which glutamine (Q, Glutamine) which is the 74th amino acid of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted by leucine in addition to the above D81N mutant, and Q74L / D81N mutant SEQ ID NO: (Q74L / D81N / K94R) in which the lysine (K, Lysine), which is the 94th amino acid of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, is substituted with arginine or the mutant (I66V / Q74L / D81N). ≪ / RTI >

본 발명의 상기 병원성 세균은 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis) 또는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The pathogenic bacteria of the present invention is Bacillus anthraquinone system (Bacillus anthracis , or Bacillus cereus .

또한, 본 발명은 상기 리신 효소 변이체를 코딩하는 유전자를 제공한다.The present invention also provides a gene encoding the lysine enzyme mutant.

본 발명의 리신 효소 변이체를 코딩하는 유전자는 D81N 리신 효소 변이체를 코딩하는 유전자, D81N/I177L/E193D/I204F 리신 효소 변이체를 코딩하는 유전자, D81N/R112L/I177L/E193D/I204F 리신 효소 변이체를 코딩하는 유전자, Q74L/D81N 리신 효소 변이체를 코딩하는 유전자, Q74L/D81N/K94R 리신 효소 변이체를 코딩하는 유전자 또는 I66V/Q74L/D81N 리신 효소 변이체를 코딩하는 유전자일 수 있다.The gene encoding the lysine enzyme mutant of the present invention is a gene encoding D81N lysine enzyme mutant, a gene encoding D81N / I177L / E193D / I204F lysine enzyme mutant, a gene encoding D81N / R112L / I177L / E193D / I204F lysine enzyme mutant A gene encoding a Q74L / D81N lysine enzyme mutant, a gene encoding a Q74L / D81N / K94R lysine enzyme mutant, or a gene encoding an I66V / Q74L / D81N lysine enzyme mutant.

또한, 본 발명은 상기 리신 효소 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.The present invention also provides a recombinant vector comprising a gene encoding the lysine enzyme mutant.

용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.The term "recombinant expression vector" means a bacterial plasmid, a phage, a yeast plasmid, a plant cell virus, a mammalian cell virus, or other vector. In principle, any plasmid and vector can be used if it can replicate and stabilize within the host. An important characteristic of the expression vector is that it has a replication origin, a promoter, a marker gene and a translation control element.

리신 효소 변이체를 코딩하는 합성 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.Expression vectors containing synthetic gene sequences encoding lysine enzyme variants and appropriate transcription / translation control signals can be constructed by methods known to those skilled in the art. Such methods include in vitro recombinant DNA technology, DNA synthesis techniques, and in vivo recombination techniques. The DNA sequence can be effectively linked to appropriate promoters in the expression vector to drive mRNA synthesis. The expression vector may also include a ribosome binding site and a transcription terminator as a translation initiation site.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.The present invention also provides a host cell transformed with the recombinant vector.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법, 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 유전자총-매개 형질전환 방법 (bombardment), 아그로박테리움-매개 형질전환법, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 DEAE-덱스트란 처리법 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The method of delivering the vector of the present invention into a host cell can be carried out by the CaCl2 method, Hanahan, D., J. MoI. Biol., 166: 557-580 (1983) An electric drilling method or the like. In addition, when the host cell is a eukaryotic cell, it can be produced by a method such as gene bombardment, Agrobacterium-mediated transformation, microinjection, calcium phosphate precipitation, electroporation, liposome- The vector may be injected into the host cell by DEAE-dextran treatment or the like, but is not limited thereto.

본 발명의 재조합 벡터는 리신 효소 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로, 본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.The recombinant vector of the present invention may be a recombinant vector containing a gene encoding a lysine enzyme mutant. Any host cell known in the art may be used as a host cell capable of successively cloning and expressing the vector of the present invention in a stable manner Such as E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, Bacillus subtilis, Bacillus subtilis, and the like, but are not limited thereto.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 숙주 세포에 형질전환하여 리신 효소 변이체 코딩 유전자를 발현하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 리신 효소 변이체의 생산 방법을 제공한다.Also, the present invention provides a method for producing a lysine enzyme mutant, which comprises transforming the recombinant vector into a host cell to express a lysine enzyme mutant coding gene.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 리신 효소 변이체 코딩 유전자는 D81N 리신 효소 변이체를 코딩하는 유전자, D81N/I177L/E193D/I204F 리신 효소 변이체를 코딩하는 유전자, D81N/R112L/I177L/E193D/I204F 리신 효소 변이체를 코딩하는 유전자, Q74L/D81N 리신 효소 변이체를 코딩하는 유전자, Q74L/D81N/K94R 리신 효소 변이체를 코딩하는 유전자 또는 I66V/Q74L/D81N 리신 효소 변이체를 코딩하는 유전자일 수 있다.In the method according to one embodiment of the present invention, the lysine enzyme mutant coding gene is a gene encoding D81N lysine enzyme mutant, a gene encoding D81N / I177L / E193D / I204F lysine enzyme mutant, D81N / R112L / I177L / E193D / A gene encoding an I204F lysine enzyme mutant, a gene encoding a Q74L / D81N lysine enzyme mutant, a gene encoding a Q74L / D81N / K94R lysine enzyme mutant, or a gene encoding an I66V / Q74L / D81N lysine enzyme mutant.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 리신 효소 변이체를 제공한다. The present invention also provides a lysine enzyme mutant produced by the above method.

본 발명의 일 구현 예에 따른 상기 리신 효소 변이체는 D81N, D81N/I177L/E193D/I204F, D81N/R112L/I177L/E193D/I204F, Q74L/D81N, Q74L/D81N/K94R 또는 I66V/Q74L/D81N일 수 있다.The lysine enzyme variant according to an embodiment of the present invention may be D81N, D81N / I177L / E193D / I204F, D81N / R112L / I177L / E193D / I204F, Q74L / D81N, Q74L / D81N / K94R or I66V / Q74L / D81N have.

또한, 본 발명은 상기 리신 효소 변이체를 병원성 세균에 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 병원성 세균의 방제 방법을 제공한다.Also, the present invention provides a method for controlling pathogenic bacteria, which comprises treating the pathogenic bacteria with the lysine enzyme mutant.

본 발명의 리신 효소 변이체를 병원성 세균에 처리하는 방법은 리신 효소 변이체를 직접적으로 유해 세균에 처리하거나, 리신 효소 변이체를 표면에 발현하는 대장균을 유해 세균에 처리하는 방법일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The method of treating the pathogenic bacteria with the lysine enzyme mutant of the present invention may be a method of directly treating the lysine enzyme mutant directly to harmful bacteria or treating Escherichia coli expressing the lysine enzyme mutant on the surface with harmful bacteria .

또한, 본 발명은 상기 리신 효소 변이체를 유효성분으로 포함하는, 병원성 세균 방제용 조성물을 제공한다. 본 발명의 상기 조성물은 유효성분으로 D81N, D81N/I177L/E193D/I204F, D81N/R112L/I177L/E193D/I204F, Q74L/D81N, Q74L/D81N/K94R 또는 I66V/Q74L/D81N 변이체를 함유하며, 상기 리신 효소 변이체를 병원성 세균에 처리함으로써 병원성 세균을 방제할 수 있는 것이다.In addition, the present invention provides a composition for controlling pathogenic bacteria, comprising the lysine enzyme mutant as an active ingredient. The composition of the present invention contains D81N, D81N / I177L / E193D / I204F, D81N / R112L / I177L / E193D / I204F, Q74L / D81N, Q74L / D81N / K94R or I66V / Q74L / By treating pathogenic bacteria with lysine enzyme mutants, pathogenic bacteria can be controlled.

또한, 본 발명을 통하여 발굴된 각 변이 아미노산 잔기의 각각 또는 조합을 통하여 더 나은 역가를 갖는 변이체를 개발하는 것도 가능하다.It is also possible to develop mutants having better titer through each of the mutation amino acid residues discovered through the present invention or each combination thereof.

또한, 본 발명은 상기 리신 효소 변이체를 유효성분으로 포함하는 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis) 또는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 의해 유발되는 질환의 치료용 약학적 조성물을 제공한다.In addition, the present invention is Bacillus anthraquinone system (Bacillus including the lysine enzyme variant as an active ingredient anthracis or Bacillus cereus . The present invention also provides a pharmaceutical composition for the treatment of diseases caused by anthracis or Bacillus cereus .

본 발명의 약학적 조성물에 포함되는, 본 발명의 리신 효소 변이체는 전술한 바와 같이 바실러스 안트라시스 및 바실러스 세레우스를 특이적으로 사멸시키므로, 바실러스 안트라시스 또는 바실러스 세레우스에 의해 유발되는 질환의 치료에 효과를 나타낸다. 따라서 본 발명의 약학적 조성물은 바실러스 안트라시스에 의해 유발되는 대표 질환인 탄저병에 대한 치료에 이용될 수 있으며, 바실러스 세레우스에 의한 식중독의 치료에도 이용될 수 있다.The lysine enzyme mutant of the present invention, which is included in the pharmaceutical composition of the present invention specifically kills Bacillus anthracis and Bacillus cereus as described above, and thus is useful for the treatment of diseases caused by Bacillus anthracis or Bacillus cereus Effect. Accordingly, the pharmaceutical composition of the present invention can be used for the treatment of anthrax, a representative disease caused by bacillus anthracis, and can also be used for the treatment of food poisoning by Bacillus cereus.

본 명세서에서 사용된 '치료'라는 용어는 (i) 바실러스 안트라시스 또는 바실러스 세레우스에 의해 유발된 질환의 억제; 및 (ii) 바실러스 안트라시스 또는 바실러스 세레우스에 의해 유발된 질환의 경감을 의미한다.The term " treatment ", as used herein, refers to (i) inhibition of diseases caused by bacillus anthracis or bacillus cereus; And (ii) relieving the disease caused by Bacillus anthracis or Bacillus cereus.

본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.The pharmaceutically acceptable carriers to be contained in the pharmaceutical composition of the present invention are those conventionally used in the formulation and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, But are not limited to, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrups, methylcellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil. It is not. The pharmaceutical composition of the present invention may further contain a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, etc. in addition to the above components.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여를 통해 투여할 수 있으며, 비경구 투여의 경우 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수도 있다. The pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally. In the case of parenteral administration, the composition may be administered by intravenous administration, intraperitoneal administration, intramuscular administration, subcutaneous administration or local administration.

또한, 본 발명은 상기 리신 효소 변이체를 유효성분으로 포함하는 항생제를 제공한다. In addition, the present invention provides an antibiotic comprising the lysine enzyme mutant as an active ingredient.

본 명세서에 있어서, 용어 '항생제'는 항균제, 살균제 및 방부제를 총칭한다.As used herein, the term " antibiotic " is generically referred to as an antimicrobial agent, a bactericide, and an antiseptic agent.

본 발명의 항생제는 일차적으로 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis) 또는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 의해 유발되는 질병에 대한 예방 및 치료제로 활용될 수 있다. 또한 기본 항생제에 대한 내성을 획득한 다재 내성 바실러스 안트라시스 또는 바실러스 세레우스에 의한 질환 치료에도 활용될 수 있다.Antibiotics of the present invention is primarily Bacillus anthraquinone system (Bacillus anthracis , or Bacillus cereus . < / RTI > It can also be used for the treatment of diseases caused by the highly resistant Bacillus anthracis or Bacillus cereus that have acquired resistance to basic antibiotics.

본 발명의 리신 변이체는 기존 항생제에 비하여 바실러스 안트라시스 또는 바실러스 세레우스에 대한 특이성이 매우 높다는 장점을 가지고 있다. 이는 유용한 다른 균은 죽이지 않고 병원균인 바실러스 안트라시스 또는 바실러스 세레우스만을 선택적으로 죽일 수 있으므로 부작용이 상당히 감소된 항생제로서 매우 가치가 있다고 할 수 있다. 또한 본 발명의 리신 변이체를 항생 물질로 이용하게 되면 기존의 항생제를 이용하는 것과는 달리 병원균의 내성 내지 저항성(resistance)을 유도하지 않는 장점을 갖기 때문에 기존의 항생 물질에 비해 제품수명주기(life cycling)가 긴 신규 항생제로서 이용될 수 있다. 다시 말해, 대부분의 항생 물질들은 내성 증가에 직면함에 따라 갈수록 사용범위가 줄어들 수밖에 없는데 반해, 본 발명의 리신 효소 변이체를 유효성분으로 포함하는 항생제는 내성 문제를 근본적으로 해결할 수 있기에 그만큼 항생제로서의 제품수명 주기가 길어질 것으로 기대된다. 따라서 병원성 세균인 바실러스 안트라시스를 특이적으로 사멸시키는 본 발명의 리신 효소 변이체를 유효성분으로 포함하는 항생제는 항균 효과, 살균 효과 및 방부 효과가 뛰어난 항생제로 유용하게 사용될 수 있다.The lysine mutant of the present invention has an advantage that the specificity for Bacillus anthracis or Bacillus cereus is very high as compared with the existing antibiotic. This can be said to be a valuable antibiotic with considerably reduced side effects because it can selectively kill pathogenic bacillus anthracis or bacillus cereus without killing other useful bacteria. In addition, when the lysine mutant of the present invention is used as an antibiotic, unlike conventional antibiotics, it has the advantage that it does not induce resistance or resistance of a pathogen. Therefore, the life cycle of the product is higher than that of conventional antibiotics Can be used as a long new antibiotic. In other words, the antibiotics containing the lysine enzyme mutant of the present invention as an active ingredient can fundamentally solve the resistance problem, while the antibiotic resistance of most of the antibiotics increases as the resistance to the increase increases. Therefore, The cycle is expected to be longer. Therefore, antibiotics containing the lysine enzyme mutant of the present invention, which specifically kills the pathogenic bacterium Bacillus anthracis, as an active ingredient, can be effectively used as antibiotics excellent in antimicrobial effect, sterilizing effect and preservative effect.

또한, 본 발명은 상기 리신 효소 변이체를 유효성분으로 포함하는 소독제를 제공한다. 상기 리신 효소 변이체를 유효성분으로 포함하는 소독제는 병원 2차 감염 예방, 식품위생, 및 축산업 분야에서의 소독제로 그 활용가치가 높다. 이 소독제는 식품산업에서 소독제 및 식품첨가제로 활용될 수 있으며, 조리 장소 및 조리 설비의 소독제로도 유용하게 사용될 수 있다. 특히 상기 리신 단백질은 병원 2차 감염 예방에 효과적이다. 즉, 병원 2차 감염의 예방이나 병원 2차 감염에 대한 치료 목적에 활용될 수 있다. 현재 병원 2차 감염은 매우 심각한 상황이며 병원 2차 감염 때문에 발생하는 미국의 일 년간 치료비용이 약 300억불에 달한다고 한다. 이는 병원 2차 감염의 심각성을 보여 준다 할 수 있다.The present invention also provides a disinfectant comprising the lysine enzyme mutant as an active ingredient. The disinfectant containing the lysine enzyme mutant as an active ingredient is highly effective as a disinfectant in the fields of prevention of secondary infection of the hospital, food hygiene, and animal husbandry. This disinfectant can be used as a disinfectant and food additive in the food industry, and also as a disinfectant for cooking places and cooking facilities. In particular, the lysine protein is effective for preventing secondary infection of a hospital. That is, it can be used for the purpose of prevention of secondary infection of a hospital or secondary infection of a hospital. Currently, the second infections in the hospital are very serious and cost about $ 30 billion a year in the US due to the second infection of the hospital. This can indicate the severity of the second infection in the hospital.

본 발명은 PlyPH3 유전자를 변이시킨 유전자 라이브러리를 대장균 표면에 발현하여 개량된 변이효소의 역가를 대상 병원체인 바실러스 세레우스(Bacillus cereus, ATCC 4342) 세포가 도말된 플레이트에서 그 투명환을 비교함으로써 손쉽게 선별하는 기술을 제공한다. 그리하여 각 실시예에 예시되는 바와 같이 다양한 아미노산 잔기가 변이된 변이체를 제공한다. 예를 들면, 서열번호 1의 아미노산 서열 중 81번째 아미노산인 아스파르트산(D, Aspartic acid)이 다른 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 병원성 세균에 대한 용균 또는 항균 능력이 개선된 리신 효소 변이체를 포함하여 각 실시예에 포함되는 각종 변이 아미노산 잔기를 제공한다. 여기서 발굴된 각 변이 아미노산 잔기들은 각각 또는 조합으로 리신 역가를 개선할 수 있는 정보를 제공한다.
The present invention relates to a method for screening a transformed enzyme by expressing a gene library in which a PlyPH3 gene has been mutated on the surface of Escherichia coli and comparing the activity of the modified mutant enzyme with a transparent circle in a plate on which Bacillus cereus (ATCC 4342) Technology. Thus providing variants in which the various amino acid residues are mutated as exemplified in each Example. For example, a lytic enzyme or a lysine enzyme mutant having improved antibacterial activity against pathogenic bacteria, wherein the aspartic acid (D, Aspartic acid), which is the 81st amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, The various variant amino acid residues included in each example are provided. Each mutated amino acid residue found here provides information that can improve lysine titer, either individually or in combination.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples. However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.

실시예Example 1.  One. 바실러스Bacillus 안트라시스Anthracis ( ( BacillusBacillus anthracisanthracis ) 유래) Origin 리신 (Lee Sin ( PlyPH3PlyPH3 )의 빙핵활성단백질 ) ≪ / RTI > INPINP ( ( iceice -- nucleationnucleation proteinprotein )에 의한 대장균 표면 발현) On E. coli surface expression

1. 표면 발현 벡터의 제작1. Fabrication of Surface Expression Vector

미생물 표면에 효소를 발현시키면, 미생물 세포를 파쇄하지 않고 세포 표면에 발현된 효소의 역가를 확인할 수 있다. 특히 세포벽 분해 효소처럼 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis) 전세포나 세포벽 복합 폴리머 물질에 대하여 그 역가를 측정해야 할 경우에는 세포 표면에 있는 효소 역가를 직접 측정하는 것이 특별한 장점을 갖는다. 본 발명에서는 이를 위하여 빙핵활성단백질 INP (ice nucleation protein)에 리신 단백질을 융합 (fusion)하여(도 2) 발현시킴으로써 리신 효소를 대장균 세포 표면에 발현되도록 하였다 (US Patent App. 10/185,990, 2002).When the enzyme is expressed on the surface of the microorganism, the activity of the enzyme expressed on the cell surface can be confirmed without destroying the microbial cells. In particular, as the cell wall degrading enzyme of Bacillus anthraquinone system (Bacillus anthracis ) When measuring the activity against whole cell or cell wall composite polymer material, it is of special advantage to directly measure the enzyme activity on the cell surface. In the present invention, the lysine protein is expressed on the surface of E. coli cells by fusing lysine protein (FIG. 2) to the ice nucleation protein INP (US Patent App. 10 / 185,990, 2002) .

리신 (PlyPH3) 유전자 합성 후 합성 유전자 PlyPH3 (synthetic PlyPH3)을 주형으로 사용하여 Xma PlyPH3-F 프라이머(5'-GGTTCCCGGGATGGGTTATATTGTAGATATT-3'; 서열번호 2) 및 Nhe PlyPH3-R 프라이머(5'-GTCGCTAGCTTATTTAACTTCATACCACCA-3'; 서열번호 3)을 이용하여 PCR을 수행하였다. 제한 효소 NheI 및 XmaI을 처리한 pGF101 벡터와 pGFPlyPH3을 라이게이션 (ligation)하여 대장균 JM109에 형질전환하였다.
(5'-GGTTCCCGGGATGGGTTATATTGTAGATATT-3 '; SEQ ID NO: 2) and Nhe PlyPH3-R primer (5'-GTCGCTAGCTTATTTAACTTCATACCACCA-3) using synthetic gene PlyPH3 (synthetic PlyPH3) as a template after lysine (PlyPH3) '; SEQ ID NO: 3). The pGF101 vector treated with restriction enzymes Nhe I and Xma I and pGF PlyPH3 were ligated to obtain E. coli JM109.

2. 2. 리신의Lysine 발현 및  Expression and 투명환Transparent ring ( ( halohalo ) 확인) Confirm

리신 발현 및 투명환 (halo)을 확인하기 위해, 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus) ATCC 4342 세포 및 세포벽이 함유된 플레이트를 만들었다. 역가를 측정하기 위해서는 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis) 세균의 세포 또는 세포벽을 함유한 플레이트를 제조하여 투명환 역가를 확인하여야 한다. 그러나 탄저병의 원인균인 바실러스 안트라시스는 고위험 병원균으로 3등급의 생물학실험실에서만 다룰 수 있는 병원균이다. 그러므로 용균 효소 (리신) 개량을 위한 균주로 다른 병원균 (surrogate host)을 사용할 수밖에 없다. 본 발명에서는 일반적으로 바실러스 안트라시스를 대체하여 실험할 수 있다고 알려진 균주인 바실러스 세레우스 ATCC 4342를 사용하였다 (Yoong et al ., 2006, Journal of Bacteriology 188:2711-2714.)To confirm lysine expression and clear halo, Bacillus cereus ATCC 4342 cells and plates containing cell walls were made. To measure the potency of Bacillus anthraquinone system (Bacillus anthracis bacteria cells or cell walls should be prepared to determine the transparency value of the cells. However, Bacillus anthracis, a causative organism of anthrax, is a high-risk pathogen and can only be treated by a third-level biological laboratory. Therefore, it is inevitable to use other pathogens (surrogate host) as a strain for the improvement of lytic enzyme (lysine). In the present invention, Bacillus cereus ATCC 4342, a strain known to be able to be tested in place of Bacillus anthracis, was used (Yoong et al . , 2006, Journal of Bacteriology 188: 2711-2714.)

먼저 바실러스 세레우스를 LB 고체 배지에서 37℃ 조건으로 밤새 배양한 후, 단일 콜로니 (colony)를 선발하여 LB 액체 배지에 접종하였다. 접종한 콜로니는 37℃ 및 200 rpm 조건으로 밤새 배양한 후, 1%의 배양액을 LB 액체 배지에 다시 접종하고 37℃ 및 200 rpm 조건으로 하룻밤 더 배양하였다. 배양액은 원심분리하여 상등액을 제거하고, 바실러스 세레우스 세포 침전물만 모아 새로운 LB 액체 배지가 들어있는 1 L 삼각 플라스크에 현탁하였다. 바실러스 세레우스가 포함된 LB 액체 배지에 1.5% 아가 (Agar powder)를 첨가하여 고온 (121℃) 살균하였다. 마지막으로 IPTG (isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside) 및 앰피실린 (ampicillin)을 첨가한 후 잘 혼합하여 사각 플레이트에 분주했다.First, Bacillus cereus was cultured in LB solid medium overnight at 37 ° C, and a single colony was selected and inoculated into LB liquid medium. The inoculated colonies were incubated at 37 ° C and 200 rpm overnight, then 1% of the culture was inoculated again in LB liquid medium and incubated overnight at 37 ° C and 200 rpm. The culture was centrifuged to remove the supernatant, and the Bacillus cereus cell sediment was collected and suspended in a 1 L Erlenmeyer flask containing fresh LB liquid medium. 1.5% agar powder was added to LB liquid medium containing Bacillus cereus to sterilize at high temperature (121 캜). Finally, IPTG (isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside) and ampicillin were added, mixed well and dispensed into a square plate.

형질전환한 대장균 JM109-pGFPlyPH3을 바실러스 세레우스 세포 및 세포벽이 함유된 플레이트에 도말하여 발현을 확인하고 투명환으로 역가를 확인하였다(도 3).
The transformed Escherichia coli JM109-pGF PlyPH3 was transformed into Bacillus The cells were plated on a plate containing ceria cells and cell walls, and the expression was confirmed, and the activity was confirmed by a transparent ring (Fig. 3).

실시예Example 2.  2. PlyPH3PlyPH3 유전자의 변이-유발 ( Mutation-inducing ( errorerror -- proneprone ) ) PCRPCR 및 변이 확인 And mutation confirmation

리신 유전자의 변이를 유발하기 위해, PCR 무작위 돌연변이 키트 (Clontech, 미국)로 변이-유발 (Error-prone) PCR을 수행하였다. pGF-PlyPH3 플라스미드를 추출한 후, EPpGF102-F 프라이머 (5'-CAGAACGGGTGAGAACGGTGTTGA-3'; 서열번호 4) 및 EppGF102-R 프라이머 (5'-CCGCTTCTGCGTTCTGATTTAATCTGT-3'; 서열번호 5)를 이용하여 변이-유발 PCR을 수행하였다. 변이-유발 PCR 라이브러리 DNA 100 ng을 대장균 JM109에 형질전환하여 도말한 후 37℃에서 밤새 배양하였다. 형성된 콜로니를 모아 플라스미드 정제 키트를 이용하여 플라스미드를 추출하였다. 그 중 일부 플라스미드 20개를 모아서 염기서열을 결정하고 라이브러리 수율을 계산하였다. 그리고 일부 콜로니는 스탁 (stock)으로 만들어 -70℃ 냉동고에 보관하였다.
To induce mutation of the lysine gene, error-prone PCR was performed with a PCR random mutagenesis kit (Clontech, USA). PCR was carried out using EPpGF102-F primer (5'-CAGAACGGGTGAGAACGGTGTTGA-3 '; SEQ ID NO: 4) and EppGF102-R primer (5'-CCGCTTCTGCGTTCTGATTTAATCTGT-3'; SEQ ID NO: 5) after extracting pGF- PlyPH3 plasmid Respectively. 100 ng of mutation-induced PCR library DNA was transformed into E. coli JM109, plated and incubated overnight at 37 ° C. The formed colonies were collected and the plasmid was extracted using a plasmid purification kit. Some of these plasmids were collected and their nucleotide sequences were determined and library yields were calculated. Some colonies were made into stock and stored in a -70 ° C freezer.

실시예Example 3.  3. 변이체Mutant 선발 Selection

변이-유발 PCR을 통해 확보된 형질전환체 대장균 JM109-pGFPlyPH3을 바실러스 세레우스 세포 및 세포벽이 함유된 플레이트에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 투명환 (halo)이 형성된 클론은 변이전의 대조 클론과 함께 사각 플레이트에 접종하였다.
Transformant Escherichia coli JM109-pGF PlyPH3 , obtained through mutation-inducible PCR, Cereus cells and plate containing cell walls were cultured overnight at 37 < 0 > C. The clone in which the halo was formed was inoculated onto the square plate with the control clone before the peritoneum.

1. 1차 선발1. First Selection

변이-유발 라이브러리들로부터 제조된 형질전환체에 의해 형성된 투명환의 크기를 비교하여, 리신 (lysin) 변이체 스크리닝을 수행하였다. 변이 라이브러리 DNA를 형질전환하여 확보한 약 60,000개의 클론 중 40~50%의 클론에서 투명환을 확인하였고, PlyPH3 대조구와 투명환을 비교하였다. 변이-유발 PCR(도 4)을 통해 확보한 리신 변이체 중에서 투명환 비교 및 활성 실험을 통해 변이체 6개를 선발하였고 (도 1 및 표 1), 그 중 역가가 가장 높은 클론으로 PlyPH3 38 (D81N)을 선발하였다.Lysine mutant screening was performed by comparing the sizes of the transparent rings formed by the transformants prepared from the mutation-inducing libraries. Transparent circles were identified in 40-50% clones of approximately 60,000 clones obtained by transformation of the mutated library DNA, and the PlyPH3 control and transparent rings were compared. Among the lysine mutants obtained through the mutation-induced PCR (FIG. 4), six mutants were selected through the comparison of the transparent circle and the activity test (FIG. 1 and Table 1). Among them, PlyPH3 38 (D81N) Were selected.

선발된 PlyPH3 변이체들의 서열정보Sequence information of selected PlyPH3 variants 촉매 도메인 (1-190)The catalytic domain (1-190) 결합 도메인 (191-268)The binding domain (191-268) PlyPH3-6PlyPH3-6 Q46P/ V122VQ46P / V122V Q198L/T215AQ198L / T215A PlyPH3-7PlyPH3-7 L40V/ N134DL40V / N134D Q196LQ196L PlyPH3-38PlyPH3-38 D81ND81N PlyPH3-40PlyPH3-40 I14V/ Q46R/K71E/D97G/I100VI14V / Q46R / K71E / D97G / I100V K201EK201E PlyPH3-43PlyPH3-43 F55V/ I100L/N134D/K136R/E187AF55V / I100L / N134D / K136R / E187A Q198R/S235P/T249SQ198R / S235P / T249S PlyPH3-45PlyPH3-45 N52D/I107LN52D / I107L K255EK255E

2. 2차 선발2. Second selection

리신 변이체 PlyPH3 38 (D81N)을 주형으로 이용하여 변이-유발 PCR을 수행하여 2차 라이브러리를 제작한 후 대장균 JM109에 형질전환하였다. 2차 형질전환체를 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus)가 함유된 플레이트에 접종하여 추가로 리신 변이체 효소를 선발하였다. 라이브러리 콜로니 (library colony) 중 바실러스 세레우스 세포 및 세포벽이 함유된 플레이트에서 더 큰 투명환을 형성하는 클론을 선별하였다. 즉, PlyPH3 원효소와 PlyPH3 변이체를 다시 접종하여 형성된 투명환을 비교하였다. 2차 변이-유발 PCR을 통한 리신 라이브러리 선별 및 활성 실험을 수행한 결과, 변이체 PlyPH3 D81N/I177L/E193D/I204F, plyPH Q74L/D81N을 선발할 수 있었다.
Mutation-induced PCR was performed using the lysine mutant PlyPH3 38 (D81N) as a template to construct a secondary library and then transformed into E. coli JM109. 2 the primary transformant Bacillus cereus (Bacillus cereus ) was further inoculated to select lysine mutant enzymes. Among the library colony, Clones that form larger transparent rings were selected on plates containing Cereus cells and cell walls. That is, the transparent rings formed by inoculation of the PlyPH 3 enzyme and the PlyPH 3 mutant were compared. Selection of lysine library by secondary mutation-inducible PCR and experiments were carried out. As a result, mutants PlyPH3 D81N / I177L / E193D / I204F and plyPH Q74L / D81N were selected.

3. 3차 선발3. Tertiary selection

2차 선발에서 얻은 변이체 PlyPH3 D81N/I177L/E193D/I204F, PlyPH3 Q74L/D81N를 주형 (template)으로 하여 3차 변이-유발 PCR 라이브러리를 제작하였다. 3차 라이브러리 형질전환체도 바실러스 세레우스 세포 및 세포벽이 함유된 플레이트에 도말하여 투명환(halo)을 형성하는 콜로니를 선발하였다. PlyPH3 원효소와 선발한 PlyPH3 변이체를 함께 접종하여 투명환을 비교했으며, 투명환을 형성하는 약 100,000개 콜로니의 10~15%를 선발하였다. 최종적으로 선발한 36개의 변이체에 대해 염기서열을 분석한 결과, 서로 다른 3개의 변이체를 찾을 수 있었다.
A third mutation-inducing PCR library was constructed using the mutant PlyPH3 D81N / I177L / E193D / I204F and PlyPH3 Q74L / D81N obtained in the second selection as a template. The tertiary library transformed bacillus Cereus cells and colonies that formed a transparent halo by plating on a plate containing cell walls were selected. The PlyPH3 enzyme and the selected PlyPH3 variants were inoculated together to compare the transparent rings, and 10 to 15% of about 100,000 colonies forming transparent rings were selected. As a result of analyzing the nucleotide sequences of 36 variants finally selected, three mutants were found.

실시예Example 4.  4. 변이체의Mutant 염기서열 및 아미노산  Base sequence and amino acid 잔기Residue

변이-유발 PCR을 통해 선발한 리신 변이체들의 변이 아미노산 잔기를 정리하면 표 2와 같다.The mutation amino acid residues of lysine mutants selected through mutation-induced PCR are summarized in Table 2.

PlyPH3 변이체의 변이 아미노산 잔기 정보Mutation of PlyPH3 mutant amino acid residue information 명칭designation 아미노산 변이 위치Amino acid mutation position PD84PD84 vectorvector controlcontrol PlyPH3 WTPlyPH3 WT PlyPH3 1차 선발PlyPH3 1st round selection D81ND81N PlyPH3 2차 선발PlyPH3 2nd round selection D81N/I177L/E193D/I204FD81N / I177L / E193D / I204F Q74L/D81NQ74L / D81N PlyPH3 3차 선발PlyPH3 3rd round selection D81N/R112L/I177L/E193D/I204FD81N / R112L / I177L / E193D / I204F Q74L/D81N/K94RQ74L / D81N / K94R I66V/Q74L/D81NI66V / Q74L / D81N

실시예Example 5.  5. 바실러스Bacillus 서브틸리스Subtilis ( ( BacillusBacillus subtilissubtilis )에서 발현된 리신 ), ≪ / RTI > 변이체의Mutant 역가Potency 비교 compare

바실러스 발현 시스템에서 자가유도 발현 (autoinduction expression)으로 리신 변이체를 발현시킨 후 개량 역가를 확인하기 위하여 pGF101-PlyPH3을 주형으로 하여 PCR을 수행하였다. pD84 벡터와 pGF101-PlyPH3에 제한 효소 BamHI 및 BsiWI을 처리하여 대장균 DH5α에 형질전환한 후 37℃에서 밤새 배양하였다. 형성된 콜로니에서 플라스미드를 분리하여 바실러스 서브틸리스 DB 104에 형질전환하였다. 클로람페니콜 (chloramphenicol)이 포함된 바실러스 서브틸리스 포자 형성 배지 (sporulation media) 3 ㎖에 변이체 콜로니 6개를 각각 접종하여 37℃ 및 200 rpm 조건에서 16시간 동안 배양하였다. 이어서 클로람페니콜이 포함된 DSM 액체 배지 300 ㎖에 1%의 배양액을 재접종하여 37℃ 및 200 rpm 조건으로 24시간 동안 더 배양하였다. 배양액을 5,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 세포 침전물을 제외한 배지 상등액을 회수하였다. 회수한 상등액을 50배 아세톤 (acetone)으로 농축한 후, 바실러스 세레우스가 함유된 DSM 플레이트에 동일한 양으로 각각 접종하였다. 37℃에서 16시간 동안 배양한 후 투명환의 크기를 비교한 결과, 변이체들의 투명환이 더 크게 나타나는 것을 확인할 수 있었다 (도 5).
PCR was performed using pGF101- PlyPH3 as a template to express the lysine mutant by autoinduction expression in the Bacillus expression system and to confirm the improved activity. pD84 vector and pGF101- PlyPH3 were treated with restriction enzymes BamHI and BsiWI to transform E. coli DH5α and cultured overnight at 37 ° C. Plasmids were isolated from the colonies formed and transformed into Bacillus subtilis DB 104. Six mutant colonies were inoculated in 3 ml of Bacillus subtilis sporulation medium containing chloramphenicol and cultured at 37 ° C and 200 rpm for 16 hours. Subsequently, 1% of the culture solution was re-inoculated into 300 ml of the DSM liquid medium containing chloramphenicol, and further cultured at 37 DEG C and 200 rpm for 24 hours. The culture was centrifuged at 5,000 rpm for 15 minutes to recover the supernatant of the medium except the cell precipitate. The recovered supernatant was concentrated to 50-fold in acetone, and then inoculated in the same amount to a DSM plate containing Bacillus cereus. As a result of comparing the sizes of the transparent rings after incubation at 37 ° C for 16 hours, it was confirmed that the transparent rings of mutants appeared larger (FIG. 5).

실시예Example 6.  6. PlyPH3PlyPH3 변이 아미노산  Mutant amino acid 잔기의Residue 위치 location

확보된 변이체의 변이 위치 (mutation sites) 및 변이 위치가 단백질 3차 구조상 어디에 위치하는지 확인하기 위해, PlyPH3과 78.0%의 상동성을 갖는 plyB (plyBcat; 2NW0)의 구조를 통해 살펴보았다. 그 결과 G2, F76, N78, D97, M126, N164, I177 및 T243 아미노산 잔기에서 하나 이상의 변이 잔기들이 확인되었다 (도 6 및 7). 또한 이와 유사한 염기서열이 확인된 PlyPH와 AmpD는 각각 2개 또는 1개의 아미노산 서열의 차이가 있는 것으로 확인되어(도 8), 본 발명에서 확인한 역가 개량을 가능하게 하는 변이 아미노산 잔기 도입시, 역가가 개량될 것으로 동 업계에 종사하는 과학기술자라면 충분히 예상할 수 있다.In order to determine where the mutation sites and mutation sites of the mutants were located on the protein tertiary structure, we examined the structure of plyB (plyBcat; 2NWO), which has a homology of 78.0% with PlyPH3. As a result, one or more mutation residues were identified in the amino acid residues G2, F76, N78, D97, M126, N164, I177 and T243 (FIGS. 6 and 7). In addition, it was confirmed that PlyPH and AmpD having similar nucleotide sequences differ from each other by two or one amino acid sequences (FIG. 8). Thus, when a mutant amino acid residue that enables the improvement of the activity as identified in the present invention is introduced, A technologist in the industry who is expected to be improved can be expected.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology GENOFOCUS CO., LTD. <120> Lysin enzyme variant having improved bacteriolytic or antibacterial activity <130> PN13388 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 268 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 1 Met Gly Tyr Ile Val Asp Ile Ser Lys Trp Asn Gly Asn Ile Asn Trp 1 5 10 15 Asp Val Ala Ala Pro Gln Leu Asp Phe Val Ile Ala Arg Val Gln Asp 20 25 30 Gly Ser Asn Tyr Ile Asp Pro Leu Tyr Lys Ser Tyr Val Gln Ala Met 35 40 45 Lys Thr Arg Asn Ile Pro Phe Gly Asn Tyr Ala Phe Cys Arg Phe Ile 50 55 60 Ser Ile Ala Asp Ala Lys Lys Glu Ala Gln Asp Phe Trp Asn Arg Gly 65 70 75 80 Asp Lys Ser Ala Thr Val Trp Val Ala Asp Val Glu Val Lys Thr Met 85 90 95 Asp Asp Met Ile Ala Gly Thr Gln Ala Phe Ile Asp Glu Leu Arg Arg 100 105 110 Leu Gly Ala Lys Lys Val Gly Leu Tyr Val Gly His His Met Tyr Gly 115 120 125 Pro Phe Gly Met Ala Asn Val Lys Ser Asp Phe Val Trp Ile Pro Arg 130 135 140 Tyr Gly Gly Asn Lys Pro Ala Tyr Pro Cys Asp Ile Trp Gln Tyr Thr 145 150 155 160 Glu Thr Gly Asn Val Pro Gly Ile Gly Lys Cys Asp Leu Asn Gln Leu 165 170 175 Ile Gly Asn Lys Pro Leu Ser Trp Phe Thr Glu Ser Val Pro Lys Gln 180 185 190 Glu Asn Ile Gln Ala Gln Val Ser Lys Gln Asn Ile Ile Gln Ser Gly 195 200 205 Ala Phe Ser Pro Tyr Glu Thr Pro Asp Val Met Gly Ala Leu Thr Ser 210 215 220 Leu Lys Met Thr Ala Thr Phe Ile Leu Gln Ser Asp Gly Leu Thr Tyr 225 230 235 240 Phe Val Thr Glu Pro Thr Ser Asp Thr Gln Leu Asn Ala Leu Lys Ser 245 250 255 Trp Leu Asp Arg Lys Gly Trp Trp Tyr Glu Val Lys 260 265 <210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ggttcccggg atgggttata ttgtagatat t 31 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gtcgctagct tatttaactt cataccacca 30 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 cagaacgggt gagaacggtg ttga 24 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ccgcttctgc gttctgattt aatctgt 27 <110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology          GENOFOCUS CO., LTD. <120> Lysin enzyme variant having improved bacteriolytic or          antibacterial activity <130> PN13388 <160> 5 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 268 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 1 Met Gly Tyr Ile Val Asp Ile Ser Lys Trp Asn Gly Asn Ile Asn Trp   1 5 10 15 Asp Val Ala Ala Pro Gln Leu Asp Phe Val Ile Ala Arg Val Gln Asp              20 25 30 Gly Ser Asn Tyr Ile Asp Pro Leu Tyr Lys Ser Tyr Val Gln Ala Met          35 40 45 Lys Thr Arg Asn Ile Pro Phe Gly Asn Tyr Ala Phe Cys Arg Phe Ile      50 55 60 Ser Ile Ala Asp Ala Lys Lys Glu Ala Gln Asp Phe Trp Asn Arg Gly  65 70 75 80 Asp Lys Ser Ala Thr Val Trp Val Ala Asp Val Glu Val Lys Thr Met                  85 90 95 Asp Asp Met Ile Ala Gly Thr Gln Ala Phe Ile Asp Glu Leu Arg Arg             100 105 110 Leu Gly Ala Lys Lys Val Gly Leu Tyr Val Gly His His Met Tyr Gly         115 120 125 Pro Phe Gly Met Ala Asn Val Lys Ser Asp Phe Val Trp Ile Pro Arg     130 135 140 Tyr Gly Gly Asn Lys Pro Ala Tyr Pro Cys Asp Ile Trp Gln Tyr Thr 145 150 155 160 Glu Thr Gly Asn Val Pro Gly Ile Gly Lys Cys Asp Leu Asn Gln Leu                 165 170 175 Ile Gly Asn Lys Pro Leu Ser Trp Phe Thr Glu Ser Val Pro Lys Gln             180 185 190 Glu Asn Ile Gln Ala Gln Val Ser Lys Gln Asn Ile Ile Gln Ser Gly         195 200 205 Ala Phe Ser Pro Tyr Glu Thr Pro Asp Val Met Gly Ala Leu Thr Ser     210 215 220 Leu Lys Met Thr Ala Thr Phe Ile Leu Gln Ser Asp Gly Leu Thr Tyr 225 230 235 240 Phe Val Thr Glu Pro Thr Ser Asp Thr Gln Leu Asn Ala Leu Lys Ser                 245 250 255 Trp Leu Asp Arg Lys Gly Trp Trp Tyr Glu Val Lys             260 265 <210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ggttcccggg atgggttata ttgtagatat t 31 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gtcgctagct tatttaactt cataccacca 30 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 cagaacgggt gagaacggtg ttga 24 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ccgcttctgc gttctgattt aatctgt 27

Claims (18)

서열번호 1의 아미노산 서열 중 66번째, 74번째, 81번째, 94번째, 112번째, 177번째, 193번째 또는 204번째 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 치환된 것을 특징으로 하는 병원성 세균에 대한 용균 또는 항균 능력이 개선된 리신 효소 변이체.Wherein the amino acid sequence of any one or more of amino acids 66, 74, 81, 94, 112, 177, 193 or 204 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with a lytic or antimicrobial agent for a pathogenic bacterium Improved lysine enzyme variants. 제1항에 있어서, 상기 리신 효소 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 81번째 아미노산인 아스파르트산(D, Aspartic acid)이 아스파라긴(N, Asparagine)으로 치환된 것(D81N)을 특징으로 하는 리신 효소 변이체.[2] The lysine enzyme mutant according to claim 1, wherein the lysine enzyme mutant is a lysine enzyme (D81N) characterized by having asparagine (D, Asparagine) substituted aspartic acid (D, Aspartic acid), which is the 81st amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: Mutant. 제2항에 있어서, 상기 리신 효소 변이체는 추가로 서열번호 1의 아미노산 서열 중 177번째 아미노산인 이소루신(I, Isoleucine)이 루신(L, Lecine)으로, 193번째 아미노산인 글루탐산(E, Glutamic acid)이 아스파르트산으로 및 204번째 아미노산인 이소루신이 페닐알라닌(F, Phenylalanine)으로 치환된 것(D81N/I177L/E193D/I204F)을 특징으로 하는 리신 효소 변이체.[Claim 3] The lysine enzyme mutant according to claim 2, wherein the lysine enzyme mutant further comprises Ilesoleucine (L, Lecine), which is the 177th amino acid of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, glutamic acid ) Wherein the aspartic acid and the 204th amino acid isoleucine are replaced with phenylalanine (F, Phenylalanine) (D81N / I177L / E193D / I204F). 제3항에 있어서, 상기 리신 효소 변이체는 추가로 서열번호 1의 아미노산 서열 중 112번째 아미노산인 아르기닌(R, Arginine)이 루신으로 치환된 것(D81N/R112L/I177L/E193D/I204F)을 특징으로 하는 리신 효소 변이체.The lysine enzyme mutant according to claim 3, wherein the lysine enzyme mutant is further characterized by having arginine (R, Arginine) substituted with leucine (D81N / R112L / I177L / E193D / I204F), which is the 112st amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 Lt; / RTI &gt; 제2항에 있어서, 상기 리신 효소 변이체는 추가로 서열번호 1의 아미노산 서열 중 74번째 아미노산인 글루타민(Q, Glutamine)이 루신으로 치환된 것(Q74L/D81N)을 특징으로 하는 리신 효소 변이체.3. The lysine enzyme mutant according to claim 2, wherein the lysine enzyme mutant is further characterized in that glutamine (Q, Glutamine) which is the 74th amino acid of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with leucine (Q74L / D81N). 제5항에 있어서, 상기 리신 효소 변이체는 추가로 서열번호 1의 아미노산 서열 중 94번째 아미노산인 리신(K, Lysine)이 아르기닌으로 치환된 것(Q74L/D81N/K94R) 또는 66번째 아미노산인 이소루신이 발린(V, Valine)으로 치환된 것(I66V/Q74L/D81N)을 특징으로 하는 리신 효소 변이체.6. The method according to claim 5, wherein the lysine enzyme mutant further comprises (Q74L / D81N / K94R) in which lysine (K, Lysine), which is the 94th amino acid of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, (I66V / Q74L / D81N) substituted with valine (V, Valine). 제1항에 있어서, 상기 병원성 세균은 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis) 또는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)인 것을 특징으로 하는 리신 효소 변이체.The lysine enzyme mutant according to claim 1, wherein the pathogenic bacterium is Bacillus anthracis or Bacillus cereus . 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 리신 효소 변이체를 코딩하는 유전자.8. A gene encoding a lysine enzyme mutant of any one of claims 1 to 7. 제8항의 리신 효소 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터.A recombinant vector comprising the gene encoding the lysine enzyme mutant of claim 8. 제9항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.A host cell transformed with the recombinant vector of claim 9. 제9항의 재조합 벡터를 숙주 세포에 형질전환하여 리신 효소 변이체 코딩 유전자를 발현하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 리신 효소 변이체의 생산 방법.A method for producing a lysine enzyme mutant, comprising the step of transforming the recombinant vector of claim 9 into a host cell to express a lysine enzyme mutant coding gene. 제11항의 방법에 의해 생산된 리신 효소 변이체.12. A lysine enzyme mutant produced by the method of claim 11. 제1항 내지 제7항, 제12항 중 어느 한 항의 리신 효소 변이체를 병원성 세균에 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 병원성 세균의 방제 방법.A method for controlling a pathogenic bacterium, which comprises treating a pathogenic bacterium with a lysine enzyme mutant of any one of claims 1 to 7 and 12. 제1항 내지 제7항, 제12항 중 어느 한 항의 리신 효소 변이체를 유효성분으로 포함하는, 병원성 세균 방제용 조성물.A composition for controlling pathogenic bacterium, comprising the lysine enzyme mutant of any one of claims 1 to 7 as an active ingredient. 제1항 내지 제7항, 제12항 중 어느 한 항의 리신 효소 변이체를 유효성분으로 포함하는, 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis) 또는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 의해 유발되는 질환의 치료용 약학적 조성물.The Bacillus anthraquinone containing a 1 to claim 7, wherein any one of the lysine enzyme variant the active ingredient of claim 12 wherein the sheath (Bacillus Anthracis , or Bacillus cereus . 제15항에 있어서, 상기 바실러스 안트라시스 또는 바실러스 세레우스에 의해 유발되는 질환은 탄저병 또는 식중독인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.16. The pharmaceutical composition according to claim 15, wherein the disease caused by Bacillus anthracis or Bacillus cereus is anthrax or food poisoning. 제1항 내지 제7항, 제12항 중 어느 한 항의 리신 효소 변이체를 유효성분으로 포함하는 항생제.An antibiotic comprising the lysine enzyme mutant of any one of claims 1 to 7 as an active ingredient. 제1항 내지 제7항, 제12항 중 어느 한 항의 리신 효소 변이체를 유효성분으로 포함하는 소독제.A disinfectant comprising the lysine enzyme mutant of any one of claims 1 to 7 as an active ingredient.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8389469B2 (en) 2005-06-06 2013-03-05 The Rockefeller University Bacteriophage lysins for Bacillus anthracis
KR100988771B1 (en) 2008-09-29 2010-10-20 주식회사 인트론바이오테크놀로지 Novel Lysin Protein Having Killing Activity Specific to Enterococcus and Streptococcus

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017061732A1 (en) * 2015-10-06 2017-04-13 주식회사 인트론바이오테크놀로지 Novel antibacterial protein bps13 having lytic capability specific to bacillus strains

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