KR20140130592A - 태반 유래 중간엽 줄기 세포, 또는 태반 유래 줄기세포로부터 유도된 신경 전구세포, 이를 포함하는 약학적 조성물, 질환 치료용 키트, 및 이를 이용하는 질환 치료방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 태반 유래 중간엽 줄기 세포, 또는 태반 유래 줄기세포로부터 유도된 신경 전구세포, 이를 포함하는 약학적 조성물, 질환 치료용 키트, 및 이를 이용하는 질환 치료방법에 대한 것이다. 구체적으로 본 발명의 줄기세포를 이용할 경우 효과적으로 알츠하이머병, 파킨슨병, HIV 치매, 간질과 같은 신경질환, 암, 망막증과 같은 혈관신생 관련 질환에 효과적으로 이용될 수 있어, 산업적 활용도가 높다.

Description

태반 유래 중간엽 줄기 세포, 또는 태반 유래 줄기세포로부터 유도된 신경 전구세포, 이를 포함하는 약학적 조성물, 질환 치료용 키트, 및 이를 이용하는 질환 치료방법 {Placenta derived mesenchymal stem cell or neural progenitor induced from placenta derived stem cell and pharmaceutical composition, treatment kit and treatment method comprising the same}

태반 유래 중간엽 줄기 세포, 또는 태반 유래 줄기세포로부터 유도된 신경 전구세포, 이를 포함하는 약학적 조성물, 질환 치료용 키트, 및 이를 이용하는 질환 치료방법에 관한 것이다.

태반은 최근까지 출산 후 폐기되는 일시적인 기관으로 인식되어 왔다. 그러나, 최근 들어 태반의 부위별로 중간엽 세포, 탈락막(decidua) 세포, 양막(amnion), 상피 세포(endothelial cells) 등의 다양한 세포들이 존재하는 것이 밝혀지고 있다.

태반(placenta)은 임신한 포유류 동물의 자궁에 생기는 기관이다. 태반은 출산시 자궁으로부터 배출되며, 태반이 배출되는 것을 후출산이라 한다. 태반에는 필수 아미노산, 멜라토닌, RNA 및 DNA 등의 핵산 성분, 항산화 효소인 SOD(super oxide dismutase), 히알루론산(hyaluronic acid), 항산화제, 사이토카인, 인슐린유사성장촉인자(insulin-like-growth factor), 표피성장촉진인자(EGF, epidermal growth factor) 및 노쇠세포활성인자(SCAF, senescent cell activating factor)가 존재하는 것으로 알려져 있다.

최근 평균수명이 증가하고 사회의 고령화가 진행되면서 노화에 대한 관심 및 노화와 관련된 질병 특히, 뇌졸증, 치매, 알츠하이머병(Alzheimer's Disease; AD),　파킨슨병(Parkinson's Disease;PD) 등의 뇌신경질환과 같이 뇌신경세포 손상과 관련된 퇴행성　신경질환　등에 대한 관심이 증대되고 있다.

상기 뇌신경계 질환들은 특정 뇌세포의 사멸 또는 퇴화가 일시적 또는 오랜 기간에 걸쳐 진행하는 것이 특징이다. 한번 죽은 뇌세포는 재생이 되지 않기 때문에 결국 치명적인 뇌기능의 손실로 이어진다. 특히, 인지기능, 감각기능, 운동기능, 전신기능의 진행성 저하를 수반하는 뇌기능 부전은 결국 성격과 행동의 변화를 가져오고, 환자들이 스스로 자신을 돌볼 수 없는 지경에 이르게 한다. 이러한 뇌세포 사멸의 주요 경로로는 산화적 스트레스에 의한 산화적 독성, 흥분적 독성, 아폽토시스(apoptosis) 등이 제시되고 있으며, 각각은 특이한 신호전달과정을 통하여 세포사멸을 유발하게 된다.

구체적으로, 뇌졸증, 뇌손상, 알츠하이머병, 파킨슨 병 환자에서 뇌세포 사멸의 주원인으로 활성 산소종(Reactive Oxygen Species; ROS)의 축적 후 tau 단백질, 핵산, 지질의 산화적인 손상이 제시되었다. 특히 자유 라디칼(free radicals)에 의한 산화적 스트레스는 체 내의 각 조직에서 일어나는 세포 사멸의 주원인으로 보고되고 있다.

특히, 대표적인 뇌신경계 질환으로서 알츠하이머병은 퇴행성 신경계 질환이다. 알츠하이머병은 80세 이상 노인의 50% 정도가 고통을 받고 있는 병이다. 알츠하이머병은 암, 심장질환 및 뇌졸증에 이어 노인 사망의 네 번째 원인이 되고 있다.

이러한 알츠하이머병의 특징은 환자의 사후 뇌의 세포 조직병리학 검사로 확인되는 신경섬유 엉킴(neurofibrillary tangles)과 아밀로이드 플라크(amyloid plaques)을 형성하는 것이다. 이는 tau 단백질의 과다한 인산화와 아밀로이드 베타 펩타이드(amyloid β peptide, 이하 'Aβ'라 함)의 축적으로 각각 일어난다고 알려져 있다.

알츠하이머병에서 뇌신경세포 괴사의 원인은 산소 유리 라디칼(oxygen free radical)의 생성, 반응성 산소종과 같은 산화적인 손상이 뇌신경세포 파괴 및 병인론(pathogenesis)과 관련되어 있을 것으로 추정된다.

알츠하이머병의 증상으로는 기억력, 인지능력 및 학습능력의 상실이 서서히 진행되어 나타난다. 이어서 감정 장애와 이상행동을 가져온다. 따라서, 알츠하이머병의 치료는 주로 환자의 증상을 가볍게 하고, 병의 진행속도를 지연시키는데 주안을 두는 간접적인 치료가 유일한 치료법이 되어 왔다.

혈관신생(angiogenesis)은 조직이나 장기에 신규의 혈관을 제공하는 생물학적 과정이다. 구체적으로는 기존의 미세혈관으로부터 새로운 모세혈관이 생성되는 것을 의미하며 성장 후 체내에서 혈관이 생성되는 근본적인 과정이다. 인체에서 정상적으로 관찰되는 생리적 혈관신생은 배아 및 태아의 발달, 자궁의 성숙, 태반의 증식, 황체의 형성 및 상처의 치유와 같은 매우 제한된 상황에서만 일어난다. 이 시기에도 매우 엄격히 조절되어 필요한 기능이 달성되면 혈관신생은 중단된다. 신규한 혈관신생은 신생혈관생성 조절인자에 의해 엄격하게 조절된다. 신생혈관생성의 표현형은 신생혈관생성 자극인자의 상향조절(up-regulation) 및 신생혈관생성 억제인자의 하향조절(down-regulation) 사이의 전체적인 균형에 의하여 바뀐다고 보고되어 왔다.

병적인 상태에서 나타나는 혈관신생과 관련이 있는 질환을 크게 분류해 보면 관절염과 같은 염증성 질환, 당뇨병성　망막증과 같은 안과 질환, 건선(psoriasis)과 같은 피부과 질환 및 가장 대표적인 질환인 암으로 나눌 수 있다.

특히, 원발성 종양과 전이성 종양은 그들의 성장을 위하여 신생혈관의 생성을 필요로 한다. 이중에서 특히 혈관신생과 관련이 있는 질환 중 가장 심각한 경우는 고형암이다. 혈관신생은 종양에서 두 가지 중요한 역할을 하는데, 첫째는 종양의 성장과 증식에 필요한 영양과 산소를 공급하는 것이다. 둘째는 종양까지 침투한 신생 모세혈관들이 전이되는 암세포가 혈액순환계로 들어갈 수 있는 기회를 제공하여 암세포의 전이(metastasis)를 촉진하는 것이다. 전이는 암환자 사망의 주원인이므로, 암의 완치율 및 생존율을 획기적으로 개선하기 위해서는 암을 완전히 없애거나 사멸하는 것뿐만 아니라, 외과 수술 후 암의 전이를 미연에 방지하거나 이미 미세전이가 이루어진 경우에도 전이된 암세포가 더 이상 자라지 못하고 국소 부위에 남아 있도록 하는 것이 중요하다.　

혈관신생에 의한 안과 질환으로는 노인성 퇴화반(macular degeneration), 당뇨병의 합병증으로 망막에 있는 모세혈관이 초자체를 침습하여 결국 눈이 멀게 되는 당뇨성　망막증(diabetic retinopathy), 조숙아의　망막증, 신생혈관 녹내장과 같은 질병 등이 있다.

이외에, 관절염은 자가면역 이상이 원인으로 작용하나 병이 진행하는 과정에서 활액강에 생긴 만성염증이 혈관신생을 유도한다고 알려져 있으며, 새로운 모세혈관이 관절을 침습하여 연골이 파괴되어 생기는 질병이다. 아울러, 건선도 피부에 생기는 만성의 증식성 질환인데, 빠른 증식을 하기 위해서는 많은 혈액이 공급되어야 하므로 혈관신생이 활발히 일어날 수밖에 없다.

따라서, 혈관신생과 관련된 질환은 혈관신생을 억제하는 것이 근원적인 치료방법이 될 것이다.

일 양상은 태반 유래 중간엽 줄기 세포를 제공하는 것이다.

다른 양상은 태반 유래 중간엽 줄기 세포을 포함하는 신경 질환 또는 혈관 신생 관련 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

다른 양상은 상기 조성물을 포함하는 신경 질환 또는 혈관 신생 관련 질환 치료용 키트를 제공하는 것이다.

다른 양상은 상기 조성물을 개체에 투여하여 신경 질환 또는 혈관 신생 관련 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하는 것이다.

다른 양상은 태반 유래 줄기세포로부터 유도된 신경 전구 세포를 제공하는 것이다.

다른 양상은 태반 유래 줄기세포로부터 유도된 신경 전구 세포를 포함하는 신경 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

다른 양상은 상기 조성물을 포함하는 신경 질환 치료용 키트를 제공하는 것이다.

다른 양상은 상기 조성물을 개체에 투여하여 신경 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하는 것이다.

일 양상은 CD 9⁺, CD13⁺ 및 CD 90⁺인 태반 유래 중간엽 줄기 세포를 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "태반(placenta)"은 임신한 포유류 동물의 자궁에 생기는 기관이다. 상기 태반은 양막, 융모막, 탈락막 및 탯줄 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 바람직하게는 양막유래 중간엽 줄기세포일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)"는 뼈, 연골, 지방, 근육세포를 포함한 여러 가지 중배엽성 세포 또는 신경세포와 같은 외배엽성 세포로도 분화하는 능력을 가진 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)이다.

상기 태반 유래 중간엽 줄기 세포는 CD 9⁺, CD13⁺ 및 CD 90⁺이다. 또한, SSEA4^-, TRA-1-60^-, TRA-1-81^- 및 CD34^- 일 수 있다. 또한 CD200⁺ 일 수 있다.

다른 양상은 상기 태반 유래 중간엽 줄기 세포를 포함하는 신경질환 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 신경질환은 예를 들면, 알츠하이머병, 파킨슨병, HIV 치매, 간질, 정신분열증, 우울증, 조울증, 신경 발생장애, 자폐증, 뇌졸중, 루게릭, 헌팅턴병, 다발성경화증, 뇌손상, 뇌성 마비 또는 척수 손상일 수 있다.

다른 양상은 상기 태반 유래 중간엽 줄기 세포를 포함하는 혈관신생 관련 질환 예방 또는 치료용 약학적　조성물을 제공한다.

상기 혈관 신생 관련 질환은 예를 들면 암, 당뇨병성　망막증, 미숙아　망막증, 각막 이식 거부, 신생혈관 녹내장, 홍색증, 증식성　망막증, 건선, 혈우병성 관절, 아테롬성 동맥경화 플라크 내에서의 모세혈관 증식, 켈로이드, 상처 과립화, 혈관 접착, 류마티스 관절염, 골관절염, 자가면역 질환, 크론씨병, 재발협착증, 아테롬성 동맥경화, 장관 접착, 캣 스크래치 질환, 궤양, 간경병증, 사구체신염, 당뇨병성 신장병증, 악성 신경화증, 혈전성 미소혈관증, 기관 이식 거부, 신사구체병증 또는 당뇨병 일 수 있다.

상기의 태반 유래 중간엽 줄기 세포를 포함하는 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 유효성분 외에 약학적으로 허용되는 첨가제를 추가로 포함할 수 있으며, 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위 투여형의 제제로 제형화시킬 수 있다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서 주사제 또는 국소 투여용 제제 등이 포함된다. 예를 들면, 필요에 따라서 물 혹은 그 이외의 약제학적으로 허용할 수 있는 용매를 사용한 무균성 용액 또는 현탁액제의 주사제의 형태로 비경구적으로 사용할 수 있다. 예를 들면, 약제학적으로 허용되는 담체 혹은 매체, 예를 들어 멸균수, 생리식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 부형체, 비히클(vehicle), 방부제, 결합제 등과 적당히 조합하여, 일반적으로 인정되는 단위 용량 형태로 혼화하는 것에 의해 제제화할 수 있다.

상기 제제는 통상의 방법에 따라 비경구적으로 투여될 수 있다. 상기 비경구 투여는 국부적 또는 전신적 투여를 포함한다. 상기 국부적 투여는, 직접적으로 병변 또는 그 주변에 투여하는 것, 예를 들면 병변인 뇌 또는 척수, 그 주변 또는 그 반대쪽 부위에 직접 투여하는 것일 수 있다. 상기 전신적 투여는 척수액, 정맥 또는 동맥에 투여하는 것을 포함한다. 상기 척수액은 뇌척수액을 포함한다. 상기 동맥은 병변에 혈액을 공급하는 부위일 수 있다.

상기 조성물의 1일 투여량은 체중에 따라 1x10⁴ 내지 1x10⁷ 세포/kg, 예를 들면 5x10⁵ 내지 5x10⁶ 세포/kg 일 수 있다. 투여회수는 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 상기 조성물의 실제 투여량은 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여 경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자를 고려하여 증감이 가능하다.

다른 양상은 상기 조성물을 포함하는 신경 질환 또는 혈관 신생 관련 질환 치료용 키트를 제공하는 것이다. 상기 키트는 태반 유래 중간엽 줄기세포의 배양을 위하여 필요한 성분들을 추가로 더 포함할 수 있다. 상기 조성물 및 상기 신경 질환 또는 혈관 신생 관련 질환에 대해서는 전술 한 바와 같다.

다른 양상은 상기 조성물을 개체에 투여하여 신경 질환 또는 혈관 신생 관련 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 방법은 태반 유래 중간엽 줄기 세포를 폴리오르니틴 및 피브로넥틴으로 코팅된 디쉬에 배양하는 단계; 및 상기 배양된 세포를 FGF4 및 헤파린을 포함하는 배지에, 1% 내지 7%의 CO₂ 조건에서 인큐베이션 하는 단계를 더 포함할 수 있다.

또한, 상기 CO₂ 조건에서 2% 내지 5% 일 수 있으며, 3% 일 수 있다.

상기 투여는 국부 또는 전신 투여일 수 있다. 예를 들면, 경구, 직장, 정맥, 비강, 복강, 피하 또는 국소 투여일 수 있으며, 국소 투여는 예를 들면 병변에 직접, 또는 병변 주위에 투여 일 수 있다. 상기 투여는 상기 질환을 예방 또는 치료하기 위한 유효량을 투여하는 것일 수 있다. 이러한 유효한 양은 선택되는 질환의 조건에 따라 당업자가 용이하게 선택할 수 있다.

상기 조성물에 대하여는 전술한 바와 같다. 상기 방법에 있어서, 태반 유래 중간엽 줄기세포는 환자 본인으로부터 채취된 것뿐 아니라 타인 또는 다른 의료용 동물 유래의 세포를 이용하는 것도 가능하다. 세포는 냉동 보존한 것이어도 된다. 본 발명의 치료방법은 반드시 사람에게만 한정되지 않는다. 통상, 사람 이외의 포유동물에 있어서도 중간엽 줄기세포를 이용하여, 본 발명의 방법을 실시하는 것이 가능하다.

다른 양상은 태반 유래 줄기세포로부터 유도된 CD 9⁺, CD13⁺, 및 CD 90⁺인 신경 전구 세포를 제공하는 것이다.

용어 "신경 전구 세포(neuronal progenitor cell 또는 neuronal precursor cell)"는 여러 형태의 신경 세포로 분화할 수 있는 세포를 의미한다. 상기 신경 전구 세포는 신경 줄기 세포(neural stem cell 또는 Neural progenitor cell 또는 Neural precursor cell)와 혼용되어 사용될 수 있다. 또한, 상기 신경 전구 세포는 신경 줄기 세포로부터 유래된 세포를 의미할 수 있다. 상기 신경 전구 세포는 CD 9⁺, CD13⁺, 및 CD 90⁺이다. 또한, 상기 신경전구 세포는 SSEA-4^-, TRA-1-60^-, TRA-1-81^-, SSEA-1^-, CD34^- 및 CD44⁺일 수 있다. 상기 신경 전구 세포는 태반 유래 줄기세포를 FGF4 존재하에 고밀도 배양으로 유도한 것일 수 있다.

상기 태반 유래 줄기세포는 상피 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포인 것인 신경 전구 세포일 수 있다.

다른 양상은 상기 신경 전구 세포를 포함하는 신경질환 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 신경 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, HIV 치매, 간질, 정신분열증, 우울증, 조울증, 신경 발생장애, 자폐증, 뇌졸중, 루게릭, 헌팅턴병, 다발성경화증, 뇌손상, 뇌성 마비 또는 척수 손상일 수 있다.

다른 양상은 상기 약학적 조성물을 포함하는 신경질환 치료용 키트를 제공하는 것이다.

다른 양상은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 신경 질환 또는 혈관 신생 관련 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하는 것이다.

일 양상에 따른 태반 유래 중간엽 줄기 세포, 이를 포함하는 약학적 조성물, 이를 포함하는 질환 치료용 키트, 및 이를 이용하는 질환 치료 방법에 따르면 신경질환 및 혈관신생 관련 질환을 효과적으로 치료 및 예방 할 수 있다.

다른 양상에 따른 태반 유래 줄기세포로부터 유도된 신경 전구 세포, 이를 포함하는 약학적 조성물, 이를 포함하는 질환 치료용 키트, 및 이를 이용하는 질환 치료 방법에 따르면, 신경질환을 효과적으로 치료 및 예방 할 수 있다.

도 1은 태반 줄기세포을 나타낸 도면이다. (A) 패시지 4에서 수득한 AMSC (Amniotic Mesenchymal stem cell)의 형태(morphology)이다. (B)AMSC 의 면역표현형 표면 프로파일의 FACS 분석이다.
도 2는 Aβ_25-35로 자극된 미세 교세포에의 AMSC의 효과를 나타낸 도면이다.
(A) Aβ_25-35 활성화된 미세 교세포는 강하게 뭉쳐진 세포 덩어리를 나타내는 반면, AMSC와 공배양시에는 거대한 덩어리를 나타내지 않았다. (B) 전염증 사이토카인인, 종양괴사인자 (Tumor Necrosis factor; TNF-α 및 인터류킨1(Interleukin 1;IL-1)가 AMSC와 공배양한 미세교세포에서 유의적으로 감소하였다. Scale bar, 100 ㎛. 각각의 비교에서 **, P < 0.01. 데이터는 평균 ±S.E.M. 값으로 나타냈다.
도 3은 수중 미로 실험에서의 공간기억능력에 대한 AMSC의 효과를 나타낸 도면이다. (A)는 출발점이 다른군 간의 탈출 잠재기가 차이가 없음을 나타낸다. (B) 3 시도 블록 이후 AMSC-주사군이 PBS 주사군보다 평균 탈출 잠재기가 유의적으로 감소함을 나타낸다. (C) 5 시도 블록에서의 수영경로를 나타낸다. (D) 시도 실험에서, PBS-주사군보다 AMSC-주사군이 표적지역(target)에서 보내는 시간이 유의적으로 증가하였음을 나타낸다. 각각의 비교에서 **, P < 0.01; *, P < 0.05; #, P < 0.06. 데이터는 평균 ± S.E.M. 값으로 나타낸다.
도 4는 WMT에서의 수영활동에의 AMSC의 투여가 미치는 영향을 나타낸다. (A)는 총 수영 거리, (B)는 수영속도를 나타낸다. *P < 0.05. #p < 0.08. 데이터는 평균 ± S.E.M. 값으로 나타낸다
도 5은 불안-유사 행동 및 로코모터 활성을 나타낸 도면이다. (A) 고가식 십자 미로실험(B) 명/암 왕래 실험(C) 오픈 필드 실험(C) 로코모터 실험 결과를 나타낸다.
도 6은 뇌의 Aβ 플라크 분포에 대한 AMSC 투여의 효과를 나타내는 도면이다. (A) 뇌의 해마 및 피질 부위의 조직. 마우스 뇌의 피질 및 해마의 동결 절편(저배율(x40, B 및 C), 고배율(x100, D, E, F 및 G))이 티오플라빈 S(초록색)으로 염색되었다. (H) AMSC 또는 PBS가 주입된 APPswe (Tg2576) 마우스에서의 Aβ 에 대한 정량 분석 결과이다. Scale bar, 100 ㎛. 각각의 비교에서 **, P < 0.01; *, P < 0.05. 데이터는 평균 ± S.E.M. 값으로 나타낸다.
도 7은 WMT에서의 탈출 잠재기와 아밀로이드 플라크의 수간의 상관관계를 나타내는 도면이다.
도 8은 미세 교세포의 조절에 대한 AMSC 투여의 효과를 나타낸 도면이다. (A) 미세 교세포를 표지하기 위하여 일차 항체(Iba-1)을 이용하여 면역형광염색 하였다. AMSC 또는 PBS가 주입된 APPswe 마우스에서의 뇌 피질 부위의 미세교세포의 패턴을 나타낸다. (B) 이식 후 1주 및 12주에서의 mm² 당 미세 교세포의 평균 개수에 대한 정량적 영상 분석결과이다. (C) 이식 후 1주 및 12주에서의 Iba-1 양성 세포 비율을 나타낸다. Scale bar, 20 ㎛. 각각의 비교에서 *, P < 0.05. 데이터는 평균 ± S.E.M. 값으로 나타낸다.
도 9는 미세 교세포의 식균작용에 대한 AMSC 투여의 효과를 나타낸 도면이다. Iba-1 양성 미세 교세포(초록색) 내의 ED-1(CD68)의 면역반응성의 발현(빨간색). 상주 미세교세포에는 ED-1이 발현되지 않는 반면(A), Aβ 플라크 부변의 활성화된 미세 교세포의 세포 기질에서는 ED-1이 발현한다(B). (C) 이식 후 1주 및 12주에서의 Iba-1 양성 미세 교세포 내의 ED1 발현 비율에 대한 정량적 영상 분석 결과이다. Scale bar, 각각의 비교에서 10 ㎛. *, P < 0.05. 데이터는 평균 ± S.E.M. 값으로 나타낸다.
도 10은 미세 교세포의 ED-1 면역반응성을 나타내는 도면이다. (A 및 C) 상주 미세 교세포에는 ED-1의 활성이 검출되지 않았다. Aβ 플라크에 아주 근접한 활성화된 미세 교세포(Iba-1)에서는 ED-1 면역반응성을 나타낸다(B 및 D). Scale bar, 20 ㎛.
도 11은 뇌와 비장에의 AMSC 검출의 타임 코스(time course)를 나타낸 도면이다. (A) 주사 후 1일 및 1주 후 뇌 조직에서 HuNu가 검출되지 않는 반면, 비장에서는 1 일 및 1주 후에서는 검출되며, 12 주에서는 검출되지 않는다. (B) 주사 후 1일 및 1주 후에 비장에서의 HuNu 양성 세포가 DAB 염색으로 재확인 된 것이다. Scale bar 20 ㎛(A); 100 ㎛(B).
도 12는 염증성 사이토카인 및 단백질 가수분해 효소 분비에 대한 AMSC 투여의 효과를 나타낸 도면이다. PBS 또는 PBS가 주입된 APPswe 마우스에서의 염증성 사이토카인 및 단백질 가수분해 효소의 mRNA 발현 수준을 정량한 결과이다. (A) 는 주입 후 1주 뒤의 IL-1, TNF-α 형질전환성장인자(Transforming Growth Factor-beta; TGF-β, 및 인터류킨10(Interleukin 10;IL-10)의 mRNA 발현정도(B)는 주입 후 12 주 뒤의 IL-1, TNF, TNF-α, TGF-β 및 IL-10의 mRNA 발현정도, (C)는 주입 후 1 주 후에 Matrix metallopeptidase 9 (MMP9) 및 Insulin-degrading enzyme (IDE)의 mRNA 발현 정도를 나타낸다. 각각의 비교에서 **, P < 0.01; *, P < 0.05; #, P < 0.06; ##, P < 0.08. 데이터는 평균 ± S.E.M. 값으로 나타낸다
도 13은 염증 자극에 대한 AMSC의 인 비트로 반응을 나타낸 도면이다. (A) TNF-α 및 인터페론 감마 (Interferon gamma; IFN-γ로 자극된 경우와 비 자극된 AMSC의 TGF-β, MMP9, 및 IDE의 mRNA 발현의 비교이다. (B) ELISA를 이용한 TNF-α 및 IFN-γ로 자극된 경우와 비 자극된 AMSC의 TGF-β 및 MMP9의 단백질 발현의 비교이다. 각각의 비교에서 ***, P<0.001; **, P<0.01; *, P<0.05. 데이터는 평균 ± S.E.M. 값으로 나타낸다
도 14는 알츠하이머 마우스에서 조절 T 세포(regulatory T cell; Treg)의 조절에 대한 AMSC 투여의 효과를 나타낸 도면이다. 비장 단핵 세포(spleen mononuclear cell, SMNC) 내의 조절 T 세포(Treg)의 분포이다. (A) 염 또는 AMSC 주사된 알츠하이머 마우스에서, 주사 후 1일 및 1주일 후의 Treg CD4+ CD25^high 세포를 나타낸다. (B) 염이 주사된 마우스와 비교한 각 시점에서의 Treg(%)의 빈도를 나타낸다. 각각의 비교에서 ***, P < 0.001; **, P < 0.01; ##, P < 0.08. 데이터는 평균 ± S.E.M. 값으로 나타낸다
도 15는 태반 줄기 세포를 나타낸 도면이다. (A)는 패시지 6에서 수득한 AMSC의 형태(좌측 패널), 및 DiI 염색된 AMSC(우측 패널)를 나타낸다. (B)는 human Bone marrow -MSC (hBM-MSC), hAMSC 및 human Adipocyte-MSC (hAdipo-MSC) 에서의 Angiopoietin-1 (Ang-1) 및 Pigment epithelium -derived factor (PEDF)의 비교를 나타낸다.
도 16은 AMSC의 특징을 나타낸 도면이다. (A) AMSC의 면역표현형 프로파일의 FACS 분석 결과를 나타낸 도면이다. AMSC는 SSEA4, TRA-1-81, TRA-1-60(ES 마커) 및 CD34(조혈세포 및 내피세포 마커)에 음성적이고, CD9(비영양막 마커) 및 CD13, CD90(MSC 마커)에 양성적이다. (B) AMSC, hBM-MSC 및 hAdipo-MSC에서의 TGF-β 발현의 비교이다.
도 17은 OIR 유도된 마우스의 망막에서의 염증 사이토카인의 프로파일을 나타내는 도면이다. 정상군에 비교하여 OIR군의 망막에서 염증 사이토카인이 증가하였다. IFN-γ 및 TNF-α 수준이 유의적으로 증가하였다. 각각의 비교에서 ***, p<0.001; *, p<0.05. 데이터는 평균 ±S.E.M.으로 나타낸다.
도 18은 인 비트로 병리적 조건에서의 AMSC의 반응을 나타낸 도면이다. (A) IFN-γ 및 TNF-α로의 자극 후 항-신생혈관 인자의 인 비트로 mRNA 발현을 실시간 PCR로 결정하였다. (B) 자극 후 TGF-β 수준이 유의적으로 증가 한 반면, 다른 인자들은 변화가 없었다. AMSC의 배양 상청액 내의 TGF-β 단백질 수준을 ELISA로 결정하였다. 자극된 AMSC의 배양 상청액 내의 TGF-β 수준이 정상 세포와 비교하여 현저하게 증가하였다. 각각의 비교에서 ***, p<0.001. 데이터는 대조군 세포(-)내의 mRNA의 수준(=1.0)으로 정규화하였으며 평균 ± S.E.M.으로 나타낸다.
도 19는 HUVEC (Human Umbililcal Vein Endothelial Cells) 증식에 대한 AMSC의 억제 효과를 나타내는 도면이다. (A) AMSC와 공배양된 HUVEC는 HUVEC가 단독배양된 경우와 비교하여 감소된 증식을 나타냈다. IFN-γ 및 TNF-α로 선처리된 AMSC는 일반 AMSC에 비하여 HUVEC에 대한 더 강한 억제 효과를 나타냈다. (B) TGF-β siRNA의 형질감염은 IFN-γ 및 TNF-α 처리된 AMSC의 억제효과를 방해하였으나, 처리되지 않은 일반 AMSC의 억제 효과는 TGF-β siRNA의 형질감염에 의해 영향을 받지 않았다. 각각의 비교에서 ***, p<0.001; *, p<0.05. 데이터는 평균 ±S.E.M.으로 나타낸다.
도 20은 AMSCs 에서의 TGF-β 특이적 siRNA의 효과를 나타낸 도면이다. RNA를 TGF-β siRNA 형질감염된 AMSC 또는 정상AMSC에서 추출하였으며, TGF-β의 mRNA 발현을 분석하였다. TGF-β 발현 수준은 TGF-β siRNA 형질감염된 AMSC에서 유의적으로 감소하였다. 각각의 비교에서 ***, p<0.001. 데이터는 평균 ± S.E.M.으로 나타낸다.
도 21은 TGF-β siRNA 형질감염 후 PEDF 및 Ang-1의 발현을 나타낸 도면이다. PEDF및 Ang-1의 발현수준은 TGF-β siRNA 형질 감염 후 변화하지 않는다.
도 22는 인 비보 항-신생혈관 인자 발현에 대한 AMSC의 영향을 나타낸 도면이다. (A) 표시된 항-신행혈관 인자의 망막 mRNA 발현 수준을 정량적 실시간 PCR로 결정하였다. AMSC 가 처리된 마우스에서 TGF-β 망막에서 유의적으로 증가하였다. (B) 마우스 망막에서의 TGF-β의 단백질 수준을 ELISA로 결정하였다. AMSC 처리된 마우스의 망막에서의 TGF-β 수준은 PBS 처리된 마우스에 비하여 유의적으로 증가하였다. 각각의 비교에서 ***, p<0.001; **, p<0.01. 데이터는 대조군 마우스(PBS-처리된)내의 mRNA 수준(=1.0)으로 정규화하였으며 평균 ± S.E.M.으로 나타낸다.
도 23은 망막 혈관신생에 대한 AMSC의 효과를 나타낸 도면이다. P17에서의 대표적인 망막 평면 봉입(flat mount)를 제조하였다. 망막 신생혈관 다발 형성 부위(배율×200, A) 및 혈관 폐색(vaso-obliteration) 부위(배율×40, C)를 컴퓨터-지원형 영상분석으로 결정하였다. 정량된 부위는 회색으로 나타내었다(삽화). 분석된 데이터는 망막에서 혈관 폐색 부위(B) 및 신생혈관 다발 형성 부위(D)의 비율을 나타낸다. 혈관 폐색 및 신생혈관 다말 형상은 대조군에 비하여 AMSC 처리군에서 감소하였다. TGF-β siRNA 처리된 AMSC는 비 형질감염된 AMSC에 비하여 신생혈관형성을 감소시키지 못하였으나, 혈관 폐색의 경우 TGF-β siRNA 처리된 AMSC로 처리된 마우스의 망막에서 대조군에 비해 조금 감소되었다. 각각의 비교에서 ***, p < 0.001; **, p < 0.01; *, p < 0.05; #, p < 0.06. 데이터는 평균 ±S.E.M.으로 나타낸다.
도 24는 인 비보 망막에서의 AMSC의 추적을 나타낸 도면이다. 이동한 AMSC를 주입후 5일 뒤에 망막에서 검출하였다. 좌측 패널은 DIC(회색) 및 DiI 표지된AMSC의 병합된 영상을 나타낸다. 중간 패널은 DAPI(파란색) 및 DiI 표지된 AMSC(red)의 병합된 영상을 나타낸다. 우측 패널은 GS-랙틴염색된 혈관(초록색) 및 DiI 표지된 AMSC(빨간색)의 병합된 영상을 나타낸다. Scale bar = 20 ㎛.
도 25는 패시지 1에서의 양막 줄기세포(amniotic stem cell, hASC) 의 특징을 나타낸 도면이다. (A)는 hASC의 핵형분석을(B) hASC의 형태(morphology)를(C) hASC의 성장곡선을, (D) hASCs 집단 배가수(Population of doubling level, PDL)를, (E)는 hASC의 면역표현형 표면 프로마일에 대한 FACS를 각각 나타낸다. hASC는 CD34(조혈모세포 및 내피 세포 마커)에 음성이고, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81(ES 마커), CD9 및 CD44, CD13, CD90(MSC 마커)에 양성이다. (F-H) OCT4, NANOG, KLF4 및 SOX2와 같은 줄기세포 마커의 mRNA 수준과 단백질 수준을 역전사-PCR, 면역형광 염색, 면역블롯팅으로 분석한 결과이다. (I)는 알칼리성 인산가수분해효소(Alkaline phosphatase, AP) 어세이 결과이다. Scale bar = 100um.
도 26은 hASC 의 분화 잠재력을 나타내는 도면이다. (A) hASC의 분화 잠재력을 나타낸다. 지방세포성(osteogenic) 분화에 Oli Red O 염색, 골원성(osteogenic) 분화에 Von Kossa 염색, 연골성(chondrogenic) 분화에 Alcian blue가 사용되었다. scale bar = 5 mm. (B) hASC를 표시된 성장인자(10 ng/ml bFGF, 10 ng/ml EGF, 25 ng/ml FGF4))로 3일간 처리하였다. 25 ng/mL FGF4 조건에서의 Nestin 및 Musashi의 mRNA 발현을 역전사-PCR을 이용하여 검출하였다.
도 27은 FGF4 가 직접적으로 hASC를 신경 전구세포로 유도하는 것을 나타내는 도면이다. 인지된 농도의 FGF4를 3일 동안 hASC에 처리하였다. Nestin의 mRNA를(A) RT-PCR를 통해 분석되고, Nestin의 단백질 수준은(B) 면역블롯분석 및(C) 면역형광염색으로 분석하였다. Nestin mRNA의 발현 및 단백질 수준은 25 ng/mL FGF 4에서 유의적으로 증가하였다. Scale bar = 100 um. 각각의 비교에서 ***, P < 0.0001. 데이터는 평균 ± S.E.M로 나타낸다.(E) FGF4-매개 ERK1/2 및 JNK의 발현과 활성은 hASC에의 FGF4처리 후 짧은 기간동안 적합한 항체를 이용한 면역블롯을 통하여 분석하였다(F 내지 I). hASC를 U0126 및 SP600125와 함께 FGF4 존재 조건에서 3일간 배양되었다. 그 다음 세포를 항체에 대한 면역블롯 및 면역형광염색으로 분석하였다. Nestin 단백질은 U0126 및 SP600125 내에서 감소하였다. Ki-67의 비율이 JNK 억제에서 감소하였다. 스케일바는 100 um. 각각의 비교에서 ***, P < 0.0001. 데이터는 평균 ±S.E.M.로 나타낸다.
도 28은 FGF4(-) 또는 FGF4(25ng)에서의 hASC의 면역표현형 표면 프로파일에 대한 FACS 분석 결과이다. hASC는 CD34(조혈 세포 및 내피 세포 마커)에 대하여 음성적이고, CD9 및 CD44, CD13, CD90(MSC 마커)에 양성이다. SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81(ES 마커)의 발현은 FGF4의 존재하에서 감소한다.
도 29는 High-Density(HD) 배양 시스템에서 FGF4를 포함하는 유도 배지에서 배양된 hASC를 나타낸다. 현미경을 이용한 타임 랩스(time-lapse) 디지털 영상으로 정상 배양 조건 및 HD 배양 시스템에서의 hASC를 영상화 하였다.
도 30은 세포-새포 접촉은 고-밀도 배양 시스템 내의 신경 세포를 높은 수준으로 유도하는 것을 나타낸 도면이다. (A) 표시된 시간 동안의 HD 배양 시스템내의 hASC의 형태를 나타낸다. (B, C) 12시간, 1일 및 3일 동안, FGF4를 포함하는 유도배지에서의 HD 배양 시스템 또는 정상 조건에서의 hASC의 Nestin, Ki-67, 및 Tuj1에 대한 항체를 이용한 면역형광 염색을 나타낸 결과이다. 표시된 세포 밀도: 1,000cells/cm²(1x) 및 10,000 cells/ cm²(10x). 스케일 바는 100um. (D 내지 E) Nestin, Musashi, 및 Tuj1의 mRNA 수준을 분석한 결과이다. (F, G) Nestin,(F, H) Musashi, 및(F, I) Tuj1의 발현은 HD 배양 및 정상 조건의 높은 밀도에서 증가하였다. PCNA의 발현은 HD 배양하에서 미세하게 감소하였다(F, J). 각각의 비교에서 ***, P < 0.0001. 데이터는 평균 ±S.E.M.로 나타낸다.
도 31은 세포-세포 접촉은 NPC에서 DLL 1발현 증가를 통해 신경 세포를 높은 수준으로 유도하는 것을 나타낸 도면이다. (A)는 HD 배양 또는 정상 조건에서 배양된 hASC의 델타-유사 1(Delta-like 1) 및 노치(notch) 수용기 관련 유전자 발현의 수준을 나타낸 도면이다. (B)는 HD 배양 시스템에서의 DLL-1 및 HES1 유전자 수준을 나타낸다. (C, E) DAPT 존재하에서 DLL-1, Nestin, 및 Tuj1의 mRNA 수준을 나타낸 도면이다. (D, F) DLL-FLAG 및 DLL-Fc으로 DLL-1 과발현된 hASC에서의 Nestin 및 Tuj1의 mRNA 수준을 나타낸 도면이다(G-H). hASC-, 인간 골수-, 및 지방 MSC(양성 대조군: 인간 태아 NPC)에서의 FGF4의 효과를 나타낸 도면이다. 다른 성체 줄기세포와 비교하여 hASC 내에 Nestin 양성 세포가 높은 비율로 존재한다. (I) DLL-1의 mRNA는 HD 배양 시스템 하의 hASC에서만 발현하였다. Scale bar = 100um. 각각의 비교에서 ***, P < 0.0001. 데이터는 평균 ± S.E.M.으로 나타낸다.
도 32는 3일간 FGF4(-) 또는 FGF4(+)조건 하에서 및 2D 구(sphere) 배양 시스템에서 hASC를 배양한 결과이다. 면역형광 염색으로, 세포에서 Nestin, Tuj1 및 다른 계통 분화(linege differention) 단백질 Brachyury, Desmin, GATA4를 검출하였다. scale bar = 100 um.
도 33은 파킨슨 렛트 모델 내의 이식된 세포의 특징을 나타낸 도면이다. 이식 부위 및 이동 부위에서의(A) 전분화능(pluripotent) 줄기세포의 마커인, Sox-2,(B) 신경 전구세포 마커인, Nestin,(C) 이동(migration) 마커인, DCX,(E) 신경 마커인, TH.
도 34는 hASC가 이식된 6-OHDA 렛트에서의 운동 행동 실험(motor behavior task)에 의해 측정된 기능적 회복 및 PET 영상 분석을 나타낸 도면이다. (A) 90분 동안의 회전 실험을 이용한 행동 실험: 암페타민(5mg/kg, i.p.)-유도 회전 점수(score)를 나타낸다. (B) Cylinder Task에서의 사이클링 비대칭 점수를 나타낸다. (C) 이식 후 3주 및 6주에서의 로타로드 실험을 이용한 운동 학습 실험을 나타낸다. 단기 운동 기억 실험을 위해서, 제1회(session)에서 수행된 3번의 시도가 분석되었다. 장기 운동 기억 실험을 위해서, 이식 후 21-24일 및 42일 뒤의 연속하는 3일 동안 로드 위에서 소요하는 시간이 분석되었다(D) PET 영상: 태반 유래 줄기세포의 투여(infusion)후, BP가 증가하였다. 도파민적 손상 모델(위대조군), 줄기 세포-유도 신경전구세포(hASC-NPC) 및 정상대조군(이식되지 않음)의 관상 및 횡측상(transaxial) ¹⁸F FP-CIT PET 영상 슬라이스.
도 35는 테라토마 형성의 분석결과이다. (A-B) 안정성 검사, 10 ㎕ 내의 5×10⁵ cells hASC-NPC가 BALB/c-nu Sic 수컷 마우스에 주사되었다(Central Lab. Animal Inc, Korea). 세포주입 후 6 주 및 36주에 결과를 측정하였으며, 테라토마는 형성되지 않았다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

Ｉ. 알츠하이머병에 대한 AMSC의 효과

실시예 1. 실험동물의 특성 및 처리

AMSC(aminotic membrane-derived MSC)의 이식 효과를 평가하기 위하여, 알츠하이머병(Alzheimer's desease, AD)에 대한 형질전환 마우스 모델을 사용하였다. APPswe(Tg2576) 마우스를 Taconic Laboratory(Germantown, NY, USA)로부터 수득하였다. 이식 후 12 주 후의, 성체 암컷 APPswe 마우스(15-16 월령; 20 g; 8마리는 AMSC를 주입하고, 6마리는 PBS를 주입)을 행동 실험 및 병리학적 분석을 위하여 사용하였다. 또한 성체 수컷 APPswe 마우스(12-13 월령; 20 g; 8마리는 AMSC를 주입하고, 6마리는 PBS를 주입)을 이식 후 1주 후에 추가적인 병리학적 분석을 위하여 이용하였다. 야생형 한배새끼(littermate) 마우스(정상군, n = 10)을 APPswe 군과 비교하였다. AD 병리에 대한 AMSC의 면역 조절을 평가하기 위하여, Jackson Laboratory(Bar Harbor, ME, USA)로부터 구매한 3xTg-AD 마우스(6-7 월령; 각 시점의 3마리의 암컷 마우스)를 번식기의 절약을 위하여 사용하였다. 모든 실험 동물을 특정 무균상태에서 사육하고 CHA대학교의 동물실험윤리위원회(IACUC)에 승인된 동물 프로토콜 하에서 다루었다.

실시예 2. 인간 태반 세포의 제조 및 주입

내과, 산과 또는 외과 합병증의 증상을 보이지 않는 정상 인간 태반(=37 주 임신)를 제왕절계술 이후 수득하였다. 공여자 모두로부터 동의를 받았다. 샘플의 수집 및 실험 목적으로의 사용은 차종합병원의 기관감사위원회로부터 승인받았다. 각각의 태반을 조심스럽게 절개하고 PBS로 수차례 세척한 다음, 기계적으로 분쇄하고, 37 ℃에서 30분간 0.5 % 콜라게나제 IV(Sigma, St. Louis MO, USA) 로 분해(digest)하였다. 회수된 세포를 10 % 소태아혈청(Gibco, Grand Island. NY, USA) 및 각각 100 ㎍/ml의 페니실린 및 스트렙토마이신, 25 ng/ml의 FGF4(R&D system, Minneapolis, MN, USA), 및 1 ㎍/ml 헤파린(Sigma)을 보충한 알파-MEM을 포함하는 T 25 플라스크(Nunc, Rochester, NY, USA)에 배양한다.

세포를 밀도 1×10⁴ cells/cm²에서 g/ml 폴리오르니틴(Sigma) 및 4 ㎍/ml 피브로넥틴(Sigma)으로 코팅된 디쉬에서 배양하였다. 25 ng/ml FGF4 및 1 ㎍/ml 헤파린을 포함하는 완전배지를 그 뒤 추가하고, 세포를 3% CO₂의 조건에서 37 ℃에서 6일간 인큐베이션한다.

정맥 주사를 위하여 200 ㎕의 세포 현탁액(약 2×10⁶ cells)을 꼬리 혈관에 주입하였다(AMSC-주사군). 대조군에서는 200 ㎕의 PBS를 꼬리 혈관에 주입하였다(PBS-주사군).

실시예 3. 미세교세포에 대한 아밀로이드 펩티드의 처리

인큐베이터 내에서, BV2 마우스 미세교세포주를 37 ℃에서 5 %의 CO₂ 하에서, 10% 소태아혈청(Gibco), 2 mM 글루타민, 및 페니실린-스트렙토마이신(Gibco)로 보충된 Dulbecco;s modified Eagle's medium에서 유지시켰다. 합성 Aβ_25-35(Sigma)를 1 mM의 농도의 멸균된 증류수에서 용해하고, 접합(aggregation)을 위하여 72 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션하였다. BV2 세포에의 Aβ_25-35 처리를 3중으로 수행하였다. 이 목적을 위하여, BV 2 세포를 트렌스웰(transwell) 시스템에서 배양하였다. 막 기공크기가 0.4 ㎛ 인 트렌스웰(BD, Lincoln Park, NY, USA) 6-웰 디쉬를 사용하였다. hpMSC(2X10⁵ cells/well)를 트렌스웰 내에 시딩(seeding) 하고, BV2 세포(2X10⁵ cells/well)가 6-웰 디쉬에 도말(plate)하였으며, 밤새 부착되도록 하였다. 플레이트를 Aβ_25-35 처리 전 24시간 동안 인큐베이션하였고, BV2 세포를 24시간 동안 50 ㎛ 아밀로이드 펩티드로 처리하였다.

실시예 4. 미세교세포에서의 NO 생산 평가를 위한 아질산염의 정량

Aβ_25-35 처리 후 BV2 세포에서의 NO 생산을 평가하기 위하여 배양 상청액 내의 NO₂-를 측정하였다. 50 ㎕의 샘플 부분 표본을 50 ㎕의 그리스 시약(Promega, Madison, WI, USA)과 96-웰 플레이트에서 혼합하고 10분간 25 ℃에서 인큐베이션하였다. 550 nM에서의 흡광도를 마이크로플레이트 리더로 측정하였다. NaNO₂를 NO₂- 농도 계산을 위한 표준으로 사용하였다.

실시예 5. 동물실험모델의 행동 평가 및 기록

고가식 십자미로 실험(elevated plus-maze), 명/암 왕래 실험(light/dark transition test) 및 운동능력(locomotor) 및 오픈 필드 실험과 같은 탐구-기반 과제(Exploration-based task)를, 어느 정도의 변형를 부가하여(하기 참고), 기본적 운동능력 및 불안-유사 행동(anxiety-like behaviors)을 평가하기 위하여 이용하였다. 최종적으로, 인지적 변화(cognitive change)를 수중미로실험(water maze test, WMT)을 이용하여 측정하였다. 모든 행동 실험을 AMSC 이식 후 6 주 후에 수행하였다.

WMT: 플랫폼(직경이 10 cm)를 포함하는 탱크(직경이 1.1 m)를 이 실험에서 사용하였다. 연이은 5일 동안에 36 차례 시도하였다. 시도 블록, 1, 2, 3, 4가 8차례의 시도를 포함하고, 5번째의 블록이 4차례의 시도를 포함하였다. 6일째에, 단일 시도 검사(probe trial)을 시도 블록에 포함하였다. 7일째에, 모든 마우스에게 6개 단서의(six cued) 학습 실험(learning test)가 수행시켰고, 이는 각각의 마우스에 대하여 감각운동 지수(sensorimotor index)로 제공되었다.

운동능력 실험: 40 cm 정사각형에서 수행하였다. 두 구역을 오픈 필드에 의해서 구분하였다: 주변구역 및 중앙구역. 마우스는 오픈 필드의 중앙에 위치시키고 60분간 자유롭게 움직이도록 하였으며 자동 추적 시스템으로 추적하였다.

오픈 필드 실험: 10 cm 직경의 내부 원형의 플랫폼을 갖는 검정색 바탕으로 된 40 cm의 정사각형에서 수행하였으며, 램프로 조명하였다. 마우스를 오픈 필드 경기장(arena)에 위치시키고 60 분간 자유롭게 움직이게 하였으며, 비디오 레코딩 시스템을 이용하여 추적하였다.

명/암 왕래 실험: 우리(21 X 42 X 25 cm)를 문을 포함하는 파티션을 이용하여 동일한 크기로 분리하였다. 방 하나는 백색 다이오드(390 lux)에 의해 밝게 비춘 반면 나머지 방은 어둡게 하였다(2 lux). 마우스을 5분 동안 두 방간을 자유롭게 움직이게 하였다. 총 이동 횟수, 각 방에서 보낸 시간, 밝은 방으로 들어가는 잠재기(lactency)를 기록하였다.

고가식 십자 미로실험: 미로는 십자를 형성하는 4개의 팔(arm)(45 cm(길이)x10 cm(너비))을 포함했다: 두 팔은 열린 팔이고 두 팔(동일한 크기)는 지붕 및 벽으로 닫힌 것이다. 미로를 50 cm이 넘는 바닥의 검사실에 설치하였다. 각각의 시도에서, 마우스를 열린 팔과 마주하는 중앙 플랫폼에 위치시키고 5분간 자유롭게 움직이게 하였다. 총 이동 횟수, 각 방에서 보내는 시간, 밝은 방으로 들어가기 위한 잠재기를 기록했다.

비디오 모니터링: WNT, 운동능력 실험, 오픈 필드 실험 및 고가식 십자 미로 실험을 평가하고, 비디오 모니터와 컴퓨터로 연결된 전하결합소자(charge-coupled device, CCD) 카메라를 이용하여 기록하였다. 실험은 비디오-추적 시스템(Ethovision, Noldus, Wageningen, NL)을 이용하여 수행하였다.

실시예 6. 세포 이식된 마우스로부터의 조직의 분리 및 처리와 이의 면역조직학적 분석

조직의 준비 및 티오플라빈(thioflavin) S 염색: 마우스를 이식 후 1주 뒤(PBS-주사군 n = 7; AMSC-주사군, n = 7) 및 12주 뒤(PBS-주사군 n = 7; AMSC-주사군, n = 8)에 희생시켰다. 마우스를 마취한 직후 PBS를 심장에 관류시켰다. 관류 후, 뇌를 분리하여, 분석을 위하여 좌우 반구로 나누었다. 좌측 반구를 4 ℃에서 4 %의 포르말린으로 고정시켰으며, 30 % 수크로스에서 인큐베이션한 뒤, 저온유지 장치(cryostat)(Leica, Germany)에서 동결하고 절단하였다. 20 ㎛ 간격의 일련의 관상 절편(coronal section)를 대표적으로 문측 전교련(rostral anterior commisure)으로부터 미측 해마(caudal hippocampus)까지 수집하였다. 300 ㎛ 간격으로 각각 분리한, 마우스 당 6개의 뇌 절편이 정량을 위하여 사용하였다. 뇌 절편을 50 % 에탄올에 용해된 0.5 %의 티오플라빈 S(Sigma)에서 5분간 인큐베이션시켰으며, 5분간 50 %의 에탄올로 2회, 수돗물로 5분간 1회 세척하였고, 봉입제(mounting medium)으로 봉입하였다. 우측 반구는 RNA 분석을 위하여 - 80℃에서 보관하였다.

면역형광 분석: 활성화된 미세교세포의 형태학적 분석을 위하여, Aβ 플라크-부재 뇌 부위를 선택하였으며, 이는 Aβ 플라크 주변의 미세교세포의 광범위한 침윤(massive infiltration)이 단일 미세교세포의 형태의 평가를 불가능하게 하기 때문이다. 미세교세포(Iba-1) 및 CD68(ED1)에 대한 면역형광염색은 절편을 Iba-1(1:500; Wako, Osaka, Japan) 및 ED1(1:500; Serotec, Washington, DC, USA)에 대한 항체와 함께 밤새 인큐베이션하고, Alexa Fluor 488-, 또는 594- 접합된 이차항체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션 하는 것으로 수행하였다. 미세교세포, CD68 및 성상세포(astrocyte)의 이중 면역형광 염색은 인간 핵(HuNu)(1:100; Millipore, Billerica, MA, USA)의 항체를 이용하여 수행하였다. 정상 염소 혈청(isotype control), 또는 PBS(0.1 M, pH 7.4)를 음성대조군으로 일차 항체를 대신하여 사용하였다. 인간 핵(HuNu) 염색을 HRP-DAB 방법으로 수행하였다. 영상은 디지털 카메라 시스템(Nikon, Japan) 및 공초점 현미경(Zeiss, Oberkochen, Germany)을 갖춘 현미경을 이용하여 수득하였고, Adobe Photoshop CS5 소프트웨어를 이용한 정량 분석을 위하여 윈도우 PC로 전송하였다.

Aβ 플라크를 크기별로 분류하고 계수하였다. 대형(직경> 100 ㎛), 중형(직경 50-100 ㎛) 및 소형(직경 < 50 ㎛) 플라크를 검출하고, 공초점 현미경을 이용하여 피질 및 해마를 계수하였다.

실시예 7. IFN-γ 및 TNF-α 자극 후의 mRNA 및 사이토카인 수준의 인 비보 분석 및 인 비트로 분석

AMSC의 인비트로 자극: AMSC를 1 ml DMEM 배지(2 X 10⁵ cells/ml)내의 24-웰 플레이트에서 배양하였고, TNF-α 10 ng/ml; R&D systems) 및 IFN-γ 100 ng/ml; Peprotech)로 6시간 동안 자극하였다. 사이토카인 농도와 반응 시간을 주의깊게 최적화시켰다. 세포는 24시간 후에 회수하고, 상청액은 TGF-β R&D systems)에 대한 상업적 효소-연결 면역 분석법을 이용하여 분석하였다.

사이토카인의 측정: TGF-β 및 MMP-9(R&D systems)에 대한 샌드위치 ELISA를 제조사의 지시에 따라 이용하여, AMSC 또는 배양 상청액 내의 사이토카인의 농도을 자극 후 24시간 뒤에 측정하였다. 사이토카인 농도를 공지된 표준과의 비교를 통하여 계산하였다. 모든 측정은 3회씩 수행되었고 결과는 평균 ± S.E.M으로 나타냈다.

실시예 8. 동물모델 우측 반구로부터 RNA의 분리 및 정량적 실시간 PCR

TRIzol 제제(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 제조사의 지시에 따라 이용하여, 총 RNA를 세포(AMSC 및 BV2 세포)와 우측 반구로부터 추출하였다. SuperScript^TMIII(Invitrogen)를 이용하여 1㎍의 정제된 총 RNA를 cDNA로 변경하였고, 모든 cDNA 샘플을 -80 ℃에서 보관하였다. LightCycler(Roche, Indianapolis, IN, USA)에서, SYBR-Green 반응 키트(Roche)를 제조사의 지시에 따라 이용하여 실시간 PCR를 수행하였으며, 하우스키핑 유전자(GAPDH)와 TGF-β IL-10, TNF-α, IFN-γ, IL-1, IDE, 및 MMP9의 유전자의 상태적 발현을 결정하였다. 실시간 PCR에서 이용된 프라이머는 표 1에 나타낸다. 표적 유전자 발현 값은 GAPDH에 대응하여 정규화하였다. 대조군의 발현값을 데이터 세트에 표준으로 부여하고 모든 다른 샘플의 상대적 발현 수준을 계산하였다.

Primer Sequence Used for Real-Time PCR

Gene name	Accession No.	5'-forward primer sequence-3'	3'-Reverse primer sequence-5'
mIL-1	NM_008361.3	CCCAAGCAATACCCAAAGAA (서열번호 1)	GCTTGTGCTCTGCTTGTGAG (서열번호 2)
mTNF-α	NM_013693.2	GCTCCAGTGAATTCGGAAAG (서열번호 3)	GATTATGGCTCAGGGTCCAA (서열번호 4)
mIL-10	NM_010548.2	CAGGGATCTTAGCTAACGGAAA (서열번호 5)	GCTCAGTGAATAAATAGAATGGGAAC (서열번호 6)
mTGF-β	NM_011577.1	CAAGGGCTACCATGCCAAC (서열번호 7)	AGGGCCAGGACCTTGCTG (서열번호 8)
mMMP-9	NM_013599.2	TGCCGTCGAAGGGATACC (서열번호 9)	GACCCGAAGCGGACATTGT (서열번호 10)
mIDE	NM_031156.2	GAAGACAAACGGGAATACCGTG (서열번호 11)	CCGCTGAGGACTTGTCTGTG (서열번호 12)
mGAPDH	NM_008084.2	GTGAGGGAGATGCTCAGTGTT (서열번호 13)	GGCTGGCATTGCTCT (서열번호 14)
hTGF-β	NM_000660.4	AAATTGAGGGCTTTCGCCTTAGCG (서열번호 15)	TCTTCTCCGTGGAGCTGAAGCAAT (서열번호 16)
hMMP-9	NM_004994.2	TTGACAGCGACAAGAAGTGG (서열번호 17)	GCCATTCACGTCGTCCTTAT (서열번호 18)
hIDE	NM_004969.3	CTCGGAACCTTGCTTCAACAC (서열번호 19)	GGCCCGCTGAAGACGATA (서열번호 20)
hGAPDH	NM_002046.3	AGGGCTGCTTTTAACTCTGGT (서열번호 21)	CCCCACTTGATTTTGGAGGGA (서열번호 22)

실시예 9. AMSC 및 마우스모델 림프구의 면역표현형 검사

AMSC의 면역표현형(Immunophenotyping) 검사: 표현형 분석을 위하여, 적합한 농도의 하기의 항체와 4 ℃에서 20분간 FACS 버퍼 내에서 염색하였다: FITC-표지된 항- SSEA4, TRA-1-81, CD34 및 PE-표지된 항- TRA-1-60, CD90, CD9, CD13(BD Pharmingen, San Diego, CA, USA); PE-표지된 CD200(R&D system). 세포의 세척 후, Cell Quest 소프트웨어를 이용하여 FACS Caliber(BD, San Jose, CA, USA)로 분석하였다.

림프구의 분리 및 면역표현형 검사: 마우스 림프구를 비장에서 분리하였다. 파괴(disruption)를 통해 비장의 단일세포의 현탁액을 수득하고, 죽은 세포 및 적혈구를 제거하기 위하여 Ficoll-Conray 밀도 구배 원심법(density gradient centrifugation)을 수행하였다. 마우스 림프구를 FACS 버퍼에서, FITC-표지된 항-CD4 및 PE-표지된 항- CD25과 함께 30분 동안 4 ℃에서 염색하였다. 세포의 상대적 면역형광은 FACSCalibur^TM 유세포 분석기(flow cytometer)(BD)를 이용하여 분석하였다.

실시예 10. 통계적 분석

통계적 분석은 Statistical Analysis System(SAS; SAS Korea, Inc., Seoul, Korea), 버전 Enterprise 4.0을 이용한 차대학교의 메인프레임 컴퓨터에서 수행하였다. 기초 운동기능 분석, 영상 강도(image intensity) 데이터, 실시간 PCR 데이터는 T-test 또는 이원분산 분석(two-way variance analysis)을 이용하여 분석하였고, 그 뒤 LSD(Fisher's least significant difference) 사후 검증(post-hoc test)을 수행하였다. 모든 측정은 마우스의 랜덤 영향을 고려하여 믹스 모델(mixed model) 분석(SAS, PROC MIXED)을 사용하여 분석하였다. WMT와 플라크 개수 사이의 상관을 피어슨 상관 분석(Pearson correlation coefficient)을 사용하여 분석을 하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 나타내고 p 값< 0.05을 유의적이라고 보았다.

실시예 11. 인 비트로 및 인비보에서의 AMSC의 영향의 확인

11.1. 태반 줄기 세포의 특성

도 1은 패시지(passage) 4에서 회수된 AMSC의 형태(morphology)를 나타낸다. AMSC의 면역표현형 표면 프로파일의 유동 계수 분석은 CD34(조혈세포 및 내피세포의 마커), SSEA4, TRA-1-60, 및 TRA-1-81(배아줄기세포 마커)에 대하여 음성이고, CD9(비영양막(non-trophoblast) 마커), 및 CD13 및 CD90(MSC 마커)에 양성임을 나타냈다. 더욱이, AMSC는 세포 표면 항원 CD200에 대하여 양성적이었다(도 1B). 최근 인식된 막관통 글리코프로테인(transmembrane glycoprotein)인 CD200은 면역조절, 그의 수용체 CD200R을 통한 내성(tolerance)에 중요한 역할을 수행하는 것이 알려졌다.

11.2. Aβ _25-35 에 의해 유도된 미세교세포에 대한 AMSC의 억제 활성

AMSC에서 발현되는 CD200가 아밀로이드-활성화된 미세교세포에서 면역조절효과를 갖는지를 조사하기 위하여, 불사화된(immortalized) 쥐의 미세교세포주인 BV2 세포를 50 μM의 총장 Aβ_25-35 펩티드의 신경독 도메인(neurotoxic domain), Aβ_25-35 펩티드로 자극한 뒤, AMSC와 공배양하였다. 24시간 동안 Aβ_25-35로 자극한 후, 활성화된 미세교세포는 밀집하게 뭉친 세포 덩어리(cell clump)를 보이는 반면, AMSC와 공배양한 미세교세포는 세포덩어리를 보이지 않았다(도 2A). 또한, AMSC는 미세교세포에서의 Aβ_25-35 매개 NO 생산에도 영향을 미쳤다. 정상 미세교세포는 매우 적은 양의 아질산염(2.7±0.1 μM)을 생산한다. 24시간 동안 Aβ_25-35 로 자극한 후, NO 생산은 유의적으로 증가(21.4±1.2 μM; p<0.001)한 반면, AMCS와의 공배양에서는 아질산성 질소축적(nitrite accumulation)이 유의적으로 감소하였다(13.4±2.2 μM)(도 2B). 다음, AMSC의 활성화된 미세교세포에서의 TNF-α 및 IL-1의 mRNA 활성에 대한 영향을 조사하였다. 도 2c에서 나타난 바와 같이, LPS(100 ng/ml)는 미세교세포에서의 TNF-α 및 IL-1의 뚜렷한 상향조절을 일으켰다. 비히클-처리된 미세교세포와 비교하였을 때, AMSC와의 공배양물은 LPS-유도된 TNF-α 및 IL-1β 과생산을 유의적으로 억제하였다.

11.3. AMSC의 이식에 의한 기억 기능 개선 효과 검증

수중 미로 실험(water maze test, WMT)을 이식 후 6주 뒤에 수행하였으며, 각각의 출발점(동쪽 E, 북쪽 N, 북서쪽 NW 및 남동쪽 SE: 도 3A)로부터 숨겨진 플랫폼으로 도달하기까지 필요한 평균 탈출 잠재기(escape latency)를 측정하였다. 서로 다른 출발점의 군간에는 통계학적으로 유의적인 상호 영향은 없었다(F_6,66 = 0.50 : F₆는 집단간 자유도, 출발점 (n:7)-1=값(6), F₆₆은 전체 자유도, 전체 샘플 수, p = 0.80). 그러나, 시도 블록과 실험군간에는 유의적인 상호 영향이 있었다(F_8,88 = 2.73, F₈는 집단간 자유도, 출발점 (n:7)-1=값(6), F88은 전체 자유도, 전체 샘플 수. p = 0.009; 도 3B). 시도 블록 1에서는, 정상 대조군이 PBS- 및 AMSC-주사군보다 더 빨리 숨겨진 플랫폼을 찾는 경향이 있는 반면(p = 0.06; 도 3B), 시도 블록 2에서는, 3개 군의 평균 탈출 잠재기에는 유의적인 차이가 없었다(도 3B). 시도블록 3에서의 정상 대조군의 잠재기는 PBS-주사 및 AMSC-주사군보다 유의적으로 빨랐다(각각, p < 0.0001 및 p < 0.0002; 도 3B).

흥미롭게도, 시도블록 3부터 시도블록 5까지, AMSC-주사군이 평균 탈출 잠재기에 유의적인 변화를 나타내며, 이는 손상된 기억 기능이 줄기세포 주입에 의해 변화하였음을 의미한다. 더욱이, 시도 블록 4 및 5에서 AMSC-주사군과 정상대조군 간에 통계학적으로 유의적인 차이가 없는 반면, AMSC-주사군과 PBS-주사군간에는 유의적인 차이가 존재한다(시도 블록 4에서 p < 0.06 및 시도 블록 5에서 p < 0.002; 도 3B). 시도 블록 4 및 5에서, 정상 대조군의 결과도 PBS-주입군의 결과와 유의적으로 달랐다(각각, p < 0.002 및 p < 0.0003; 도 3B). 시도 블록 5에서의 각 실험군의 대표적인 수영 경로에서, AMSC-주사군이 PBS-주사군에 비하여 공간 학습 습득(spatial learning acquisition)이 증가하는 것을 나타냈다(도 3C).

뒤이어, 5일째, 마지막 훈련 시도 후 24시간 뒤, 검사 실험(probe test)를 수행하였다. 시도 검사는 플랫폼을 재거하고, 각각의 마우스가 종전 플랫폼으로 채워졌던 구역에서 보내는 60초 이상의 시간의 길이를 기록하였다. 결과는 정상 대조군은 2.41 ± 0.35 초, PBS-주사군은 0.92 ± 0.31 초이고, AMSC-주사군은 2.61±0.75 초이다(F_2,21 = 4.32, p = 0.03; 도 3D). 구역에서 보낸 시간은 정상 대조군(p < 0.008) 및 AMSC-주사군(p < 0.02)에 비하여 PBS-주사군에서 현저하게 짧았다. 총 수영거리에 대해서는, 시도 블록과 실험군간에 유의적인 상호영향이 존재하였다(F_8,88 = 2.68, p < 0.01; 도 4A). 1 내지 4 시도 블록 동안에는 정상대조군과 AMSC-주사군 간에는 수영속도(velocity)에 대한 차이가 존재하지 않았으나(시도블록 및 실험군간의 상호영향; F_8,88 = 2.40, p < 0.02), 정상대조군과 PBS-주사군간에는 유의적인 차이가 있었다(p < 0.05; 도 4B).

운동능력실험, 고가식 십자미로 실험, 명/암 왕래실험 또는 오픈 필드 실험에서는, 야생형 마우스(정상대조군), PBS 가 주사된 APPswe 마우스(PBS-주사군) 또는 AMSC가 주사된 APPswe 마우스(AMSC-주사군)간에 유의적인 차이가 없었다(도 5).

11.4. AMSC 처리에 의한 APPswe 마우스 뇌 내에서의 Aβ 플라크 개선 효과 검증

12 주간 AMSC를 처리한 마우스로부터 제거된 뇌조직의 모든 6개의 절편이 크레실 바이오렛(cresyl violet)(도 6 A) 및 티오플라빈 S(thioflavin S)(도 6 B 내지 G)로 염색하였다. 피질 및 해마, 두 뇌 부위의 Aβ 플라크의 수는 PBS-주사군(19.84 ± 3.45) 보다 AMSC-주사군(8.72 ± 1.22)에서 훨씬 적었다(도 6H; p < 0.02). 플라크를 개별 Aβ 플라크의 크기에 기초하여 하위 범주에 따라 분석하였다. 결과는 소형(지름이 < 50 ㎛), 중형(지름이 50-100 ㎛) 플라크의 수는 PBS-주사군에 비하여 AMSC-주사군에서 유의적으로 적은 반면(도 6 H; 각각 p < 0.01 및 p < 0.03), 대형 플라크(지름이 > 100 ㎛)의 수는 그룹간에 차이가 없었음을(도 6 H; p < 0.1)를 나타낸다. 이것은 AMSC 주사 후 1 주 뒤의 경우에는 그렇지 않았다(데이터 미기재).

AMSC-주사군은 WMT에서의 평균 탈출 잠재기와 아밀로이드 플라크간의 양의 상관관계(positive correlation)(rho = 0.85, p < 0.06)를 나타내는 경향을 보이는 반면, PBS-주사군에서는 그와 같은 상관관계가 나타나지 않았다(p = 0.83; 도 7).

11.5. AMSC 이식에 의한 미세교세포의 리크루팅 조절 검증, 및 AMSC 이식에 의한 대체-활성화된, 식균 미세교세포의 비율 증가 경향 검증

AMSC-주사군에서 감소하는 Aβ 플라크의 메커니즘을 조사하기 위하여, 상재(resident) 미세 교세포의 수를 계수하였다. 주사 후 1 주 뒤에, PBS-주사군에 비하여(58.36 cells/mm², p < 0.02;도 8A, B), AMSC-주사군에서(67.58 cells/mm²) Iba-1-양성 미세교세포의 수가 유의적으로 증가한 반면, 주사 후 12 주 후에는, 각 군간의 Iba-1-양성 미세교세포 수는 차이가 없었다(p = 0.95; 도 8A, B). 추가의 정량 영상 분석은, 주입 후 1주 뒤에, PBS-주사군보다 AMSC-주사군에서의 Iba-1-양성 미세교세포의 밀도가 더 높지만(p < 0.04; 도 8C), 주사 후 12 주 뒤에는 더 낮다는 것이 나타났다(p < 0.05; 도 8C). 이것은 주입된 AMSC가, AD 마우스 모델로의 이식 후의 초기급성 단계(initial acute stage)에서 미세 교세포를 리크루팅(Recruitment) 하는 것이 가능하지만, 전-염증(proinflammatory)환경에도 불구하고, 낮은 수의 상재 미세 교세포를 유지한다는 것을 암시한다. 이는 MSC의 면역억제역할을 뒷받침한다.

ED1 또한 양성인, Iba-1-양성군의 활성화된 미세 교세포의 밀도를 분석하였다. 도 9A는 ED1 음성인 휴지(resting) 미세 교세포를 나타내고, 도 9B는 AMSC-주사군 내의 ED1-양성 미세 교세포가 Aβ 플라크 주변에 산재하는 것을 나타내고, Aβ 플라크가 존재하지 않는 뇌 영역은 발견되지 않았다(도 10). 뒤이어, 유사한 크기의, Aβ 플라크와 미세교세포의 주변 부위를 더 정밀한 분석을 위하여 선택하였다. AMSC-주사군의 Iba-1-양성 미세 교세포의 대부분은 ED-1 양성인 반면, PBS-주사군내의 Iba-1-양성 미세교세포의 아주 적은 수가 ED1과 공염색됨을 나타내다(도 9B). 이 결과와 일치하게, Iba-1 발현에 대한 ED1 발현 비율은 주사 후 1주 뒤 및 2 주 뒤 모두에서, AMSC-주사군에서가 PBS-주사군보다 유의적으로 높았다(각각 p < 0.02 및 p < 0.05; 도 9C). 이러한 발견은 이식된 AMSC가 미세 교세포의 식균 활성을 조절한다는 것을 암시한다.

최종적으로, 이식된 AMSC의 좌위를 확인하기 위하여 HuNu 면역염색이 더 수행하였다. 이식 후 1주일 뒤에 AMSC-주사 마우스의 뇌에는 인간 세포가 발견되지 않았으나, 적어도 주사 후 1주 뒤까지 HuNu-양성 세포가 비장에서는 확인되었다(도 11).

11.6. AMSC에 의한 IL-1, TNF-α IL-10, 및 TGF-β 발현 조절, 및 Aβ 분해 효소 분비 검증

전염증 사이토카인, IL-1 및 TNF-α를 코딩하는 mRNA의 수준은 주사 후 1 주 뒤에, AMSC-주사군에서가 정상 대조군보다 더 낮았다(각각, p < 0.01 및 p < 0.06). 그러나 항-염증 사이토카인, IL-10을 코딩하는 mRNA의 수준은 정상 대조군에 비하여 AMSC-주사군에서 더 높았다(p < 0.04). TGF-β mRNA 수준은 두 군간에 유의적인 차이가 없었다(p < 0.08; 도 12A).

주사 후 12 주까지, IL-10 및 TGF-β mRNA 수준은, AMSC-주사군이 정상대조군에 비하여 유의적으로 높았으나(각각, p < 0.0003 및 p < 0.01), IL-1 및 TNF-α mRNA의 발현에는 유의적인 차이가 없었다(도 12B).

인슐린-분해 효소(insulin-degrading enzyme, IDE) 및 MMP-9를 포함하는, Aβ 분해 효소의 수준은 주입 후 1주 뒤에, AMSC-주사군에서 정상대조군에 비해 높았다(각각, p < 0.005 및 p < 0.06; 도 12C).

11.7. 전염증 사이토카인, IFN-γ 및 TNF-α 자극 후, AMSC는 TGF-β 및 MMP-9의 발현 수준 검증

외인성(exogenous) IFN-γ 및 TNF-α 병용 투여(co-administration)는 인 비트로에서 AMSC를 자극하였다. 정량적 실시간 PCR은 IFN-γ 및 TNF-α 병용 투여 후 TGF-β 유의적인 증가를 확인하였다(p < 0.001; 도 13A). MMP-9 및 IDE mRNA 수준은 전염증 사이토카인과 함께 배양된 AMSC에서가 상기 사이토카인이 없이 배양된 것에 비하여 유의적으로 높았다(각각, p < 0.0009 및 p < 0.05; 도 13A). TGF-β 수준은 전염증 사이토카인과 함께 배양된 AMSC의 세포 용해물(236.70 pg/ml) 및 상청액(155.14 pg/ml)에서가 사이토카인 없이 배양된 AMSC의 세포 용해물(126.73 pg/ml) 및 상청액(117.63 pg/ml) 보다 유의적으로 높았으며(각각, p < 0.03 및 p < 0.000006; 도 13B), MMP-9의 수준은 사이토카인과 함께 배양된 세포의 세포 용해물(452.09 pg/ml) 및 상청액(261.06 pg/ml) 이 사이토카인 없이 배양된 세포의 세포 용해물(235.59 pg/ml) 및 상청액(95.51 pg/ml)보다 유의적으로 높았다(각각, p < 0.002 및 p < 0.04). 이러한 발견은 AMSC가 AD 뇌에서 면역 조절 역할을 수행한다는 인 비보 모델에서와 동일한 결과이다.

11.8. AMSC에 의한 면역 조절 기능(immune regulatory function) 검증

AMSC가 면역 반응에서의 내성을 조절하는 능력이 있는, CD4⁺CD25^high T 세포인, 조절 T 세포의 유도를 촉진하는지 여부를 확인하였다. AD 마우스로의 AMSC의 주입후 1일째 및 7일째에, 각 시점에서의 비장세포로부터 CD4⁺CD25^high 세포의 유세포계수 분석을 수행하였다(도 14A). AMSC가 주입된 AD 마우스로부터 분리된 림프구 내의 CD4⁺CD25^high T세포의 비율이 PBS가 주입된 AD마우스에 비하여 현저하게 증가(3배 보다 높게) 증가하였다(도 14B).

Ⅱ. 망막증에 대한 AMSC의 효과

실시예1. AMSC의 배양 및 처리

이 발명에서의 모든 절차는 차 종합병원의 기관감사위원회(Institutional Review Board, IRB)에 의하여 검토 및 승인되었다. 인간 태반을 차 종합병원에서 수집한 직후 배송하였다. 각각 공지된 동의서 양식을 샘플의 사용 전에 제공하였다. 태반을 받자 마자, 각각의 조직(기저탈락막(deciduas basalis))을 조심스럽게 절개하고 PBS로 세척하였다. 회수한 조직의 조각을 작은 조각으로 절단하고, 교반기 인큐베이터(shaker incubator) 내에서 30 분간 37 ℃에서 0.5 %의 콜라게나제 IV(Sigma, St. Louis MO, USA)로 분해(digest)시켰다. 회수된 세포는 T 25 플라스크(2 X 10⁵ cells/mm3, Nunc)내의, 10 % 우태아혈청(Gibco, Grand Island. NY, USA), 각각 100 ㎍/ml의 페니실린 및 스트렙토마이신(Gibco), 25 ng/ml FGF4(R&D system, Minneapolis, MN, USA), 및 1 ㎍/ml 헤파린(Sigma)으로 보충된 알파 MEM에서 배양하였다. 모든 배양물은 5 % CO²조건으로 37 ℃에서 인큐베이터 내에 유지시켰으며, 배양 배지를 매일 갈아주었다. 각각의 실험에서, 세포는 약 80 % 밀도이며, 페시지 5(P5) 초과의 세포는 실험에서 사용하기 않았다. 주사된 세포의 추적을 위하여, AMSC는 30 분간 37 ℃에서 친유성 막-결합 형광염료인 2 mM 의 CM-DiI(1,1'-dioctadecyl 3,3,3',3'-tetramethy lindocarbocyanine pechlorate)(Molecular Probes, Eugene, OR)와 함께 인큐베이션하였다(도 15).

실시예 2. AMSC의 면역표현형 분석

유세포계수 분석이 P5의 AMSC에 수행되었다. 2 X 10⁵ 세포가 30분간 SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81, CD34, CD13, 및 CD90, CD9(BD, Becton Dickinson, San Jose, CA) 항체와 접합한 FITC(fuorescein isothiocyanate) 또는 PE(phycoerythrin)과 함께 인큐베이션된다. FACS Calibur Flow Cytometer(BD, Hialeah, FL)에서 항체당 만 번의 반응이 일어났다. 뒤이어 결과는 CellQuest Pro 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.

실시예 3. AMSC의 인비트로 자극 및 분석

AMSC를 2 X 10⁵ cells/ml로 시딩(seeding)하고, 1ml 부피로 밤새 배양한 뒤, 전-염증 사이토카인인 TNF-α 10 ng/ml; R&D systems) 및 IFN-γ 100 ng/ml; Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA)로 6시간 동안 자극시켰다. 농도와 시간은 적정 후 선택하였다(데이터 미기재). 상청액을 수집하고 ELISA(enzyme-linked immunoassay)를 이용하여 분석하였다.

실시예 4. siRNA-표적(targeting) TGF-β1 의 처리

GenBank 로부터 수득한 인간의 TGF-β1 mRNA 핵산서열(GI:260655621)의 사용 및 siRNA의 설계된 전략으로, TGF-β1 mRNA 을 표적하는 두 쌍의 21-bp의 역 반복 서열이 Bioneer(Seoul, Korea)를 이용하여 설계되고 합성되었다. TGF-β1이 코딩된 서열의 정방향: 5`-CAGAGUACACACAGCAUAU-3`(1243-1261)(서열번호 31); 역방향, 5`-AUAUGCUGUGUGUACUCUG-3`(1261-1243)(서열번호 32)을 siRNA가 표적하였다. siRNA(최종 농도가 100 pmol)가 Lipofectamine2000(Invitrogen, Gaithersburg, MD)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 세포로 감염시켰다. TGF-β1 유전자 침묵(gene silencing)의 효과는 정량적 실시간 RCR과 웨스턴 블롯팅에 의하여 평가되었다.

실시예 5. AMSC와 인간제대혈관내피세포와의 공배양

인간제대혈관내피세포(Human umbilical vein endothelial cell. HUVEC)를 차의과학대학교의 Dr. Hyung-Min Chung(Seoul, Korea)로부터 제공받았다. 세포는 플레이트의 EGM-MV Bullet Kit(5% FBS 및 12 ㎍/ml BBE, 1 ?/ml 히드로코르티손(hydrocortisone), 및 1 ?/ml GA-1000를 포함하는 EBM 배지; Clonetics, San Diego, CA)에서 성장하였다. 70 % 융합(confluency)의 HUVEC(페시지 6)가 대부분의 실험에서 사용되었다.

0.4 ㎛의 막 기공 크기를 갖는 Transwell(BD) 6-웰 디쉬가 사용되었다. AMSC(2 X 10⁵ cells/well) 가 트렌스웰(transwell) 내부에 시딩(seeding)되고, HUVEC(2 X 10⁵ cells/well)가 6-웰 디쉬에 도말(plate)되고 밤새 부착되도록 하였다. 각각의 처리를 위하여, AMSC가 전-염증 사이토카인 또는 siRNA로 처리되거나 처리되지 않았다. siRNA 처리는 전-염증 사이토카인으로의 자극 전에 수행하였다. 플레이트는 증식도 측정(proliferation assay) 의 24시간 전 동안 인큐베이션하였다.

실시예 6. HUVEC 증식의 억제

HUVEC(human umbilical vein endothelial cell를 성장 배지를 포함하는 6-웰 플레이트(2 X 10⁵ cells/well)에 시딩하였다. 16시간의 기아기(starvation phase)(1% FCS) 후, 세포를 VEGF165(20 ng/ml; R&D) 로 자극하고 BrdU(5'-bromodeoxyuridine)용액과 함께 0.01 mM의 최종농도로 24시간 동안 인큐베이션하였다. 세포증식은 BrdU-기반 증식도 측정으로 평가하였다. 포함된 BrdU는 특이적 항-BrdU(Abcam, Cambridge, MA) 형광 항체로 염색하였다. 흡광도는 마이크로플레이트 리더 가변 VersaMax(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 확인하였다.

실시예 7. 산소-유도된 망막증(oxygen-induced retinopathy, OIR) 모델의 유도

모든 실험은 차종합병원의 "실험동물 사용과 관리에 대한 가이드라인"에 따라서 수행되었으며, 모든 실험 절차는 차종합병원의 실험동물관리위원회(CHA General Hospital Research Institute Animal Care and Use Committee)에 의하여 승인받았다. OIR(산소-유도된 망막증, oxygen-induced retinopathy) 은 C57BL/6J 마우스에서 유도하였다. P7의 새끼 및 그들의 모체를 실내 공기에서 75 % 산소로 이동시켜 5일을 유지 한 후 실내공기로 다시 돌아오게 하였다. 과산소 환경은 Jeung Do B&P(Seoul, Korea)의 챔버를 이용하여 제조되고 유지되었다. 체중은 P12 및 P17에서 기록하였다(표 2).

Day after birth	Body weights
	PBS treated mice	AMSCs treated mice
P12	4.23±0.15	4.54±0.19
P17	4.85±0.17	4.56±0.08

실시예 8. AMSC의 복강내 이식

P12에서 실내 공기로 돌아온 직후, 체중으로 짝지어진 새끼에게 50 ? 의 PBS로 희석된 1 X 10⁶ 세포(hMSC군, n=8)또는 50 ㎕의 PBS(비교군(con group), n=8)를 임의로 복강내(intraperitoneal, i.p)이식하였다. 이식은 복부의 사분면에서의 오른쪽 하부에, 역류를 통한 손실을 방지하게 위하여 조심스럽게 처리하였다. 수여 마우스의 망막을 P17에서 실험하였다.

실시예 9. 맥관구조(vasculature)의 면역조직화학 및 가시화

맥관 구조, 주사되거나 내생의 세포의 부위, 및 특징의 영상화를 위하여 P17의 망막을 수확하였다. 혈관 폐색(vascular obliteration) 및 전망막 신생혈관 다발(preretinal neovascular tuft)의 정량을 P17에서 수행하였다. 혈관을 염색하기 위한 면역조직학적 분석이 종래에 기술된 바와 같이 수행되었다. 요약하면, 망막을 4 %의 파라포름알데히드(paraformaldehyde, PFA)내에 1시간 동안 고정시키고, 1시간동안 10 %의 정상염소혈청(normal goat serum, NGS)에서 블로킹(blocking) 된 후, 혈관을 확인하기 위해 형광 표지와 접합된 Griffonia simplicifolia lectin(GS-lectin)(Vector. Lab., oratories Inc, CA)와 함께 밤새 인큐베이션시켰다.

세척 후, 망막은 세포 핵을 가시화 하기 위하여DAPI로 대비염색 되었다. 전체 봉입 시료(whole-mount preparation)를 얻기 위하여 망막을 방사-이완(radial-relaxing) 절개로 평평하게 놓았다. 일부의 경우, 주사된 세포의 추적을 위하여, 형광 간섭(fluorescence interference)을 방지하기 위하여, 혈관 염색 없이 블로킹만을 수행하였다. 영상은 디지털 카메라 시스템(Nikon, Tokyo, Japan)을 갖추고 Adobe Photoshop CS5소프트웨어를 이용한 정량적 분석을 위하여 윈도우 PC로 연결된 현미경을 이용하여 수행하였다.

실시예 10. 동물모델의 망막으로부터 RNA의 분리 및 역전사효소-PCR의 수행

RNA를 세포 및 망막 조직으로부터 TRIzol 제제(Invitrogen)를 제조사의 지시에 따라 이용하여 분리하였다. 망막 RNA를 9 한배 새끼(litter)의 하나의 눈의 망막으로부터 추출하였다. 샘플의 총 정제된 RNA로부터 100 ng를 SuperScript^TM III(Invitrogen)를 이용하여 cDNA로 변환하고, 모든 cDNA 샘플을 -80 ℃에서 보관하였다. 페시지 5의 인간 골수 MSC(hBM-MSC)의 RNA 및 인간 지방질 MSC(hAdipo-MSC)의 RNA를 Porf. Hyung-Min Chung(CHA University, Korea)부터 수여받았다. 역전사효소-PCR은 AccuPower PCR PreMix(Bioneer)의 20 ㎕ 반응 용량(reaction volume)으로 수행되었다

실시예 11. 정량적 실시간 PCR

실시간 PCR은 LightCycler(Roche) 내에서 SYBR-Green 반응 키트(Roche, Lewes, UK)를 제조사의 지시에 따라 수행하였으며, 하우스키핑 유전자와, VEGF, TGF-β PEDF, 및 Ang-1의 유전자의 상대적 발현을 결정하였다. 프라이머 서열은 표 3에서 나타낸다. 상대적 유전자 발현 데이터의 분석은 CT(comparative threshold cycle method)로 계산하였다. 표적 유전자 발현값은 하우스키핑 유전자의 발현 수준과 대비하여 정규화하였다. 데이터 세트 내의 대조군 발현 값을 표준으로 정하고 다른 샘플의 상대적인 발현 수준을 계산하였다.

Primer Sequences Used for Real-Time RT-PCR

Gene name	Accession No.	5'-forward primer sequence-3'	3'-Reverse primer sequence-5'
mTGF-β	NM_011577.1	CAAGGGCTACCATGCCAAC (서열번호 7)	AGGGCCAGGACCTTGCTG (서열번호 8)
mPEDF	NM_011340.3	GCCCAGATGAAAGGGAAGATT (서열번호 23)	TGAGGGCACTGGGCATT (서열번호 24)
mAng-1	NM_009640.3	CCTCTGGTGAATATTGGCTTGGGA (서열번호 25)	AGCATGTACTGCCTCTGACTGGTT (서열번호 26)
mGAPDH	NM_008084.2	GTGAGGGAGATGCTCAGTGTT (서열번호 13)	GGCTGGCATTGCTCT (서열번호 14)
hTGF-β	NM_000660.4	AAATTGAGGGCTTTCGCCTTAGCG (서열번호 15)	TCTTCTCCGTGGAGCTGAAGCAAT (서열번호 16)
hPEDF	NM_002615.5	TATCACCTTAACCAGCCTTTCATC (서열번호 27)	GGGTCCAGAATCTTGCCAATG (서열번호 28)
hAng-1	NM_001146.3	CCGTGAATCTGGAGCCGTTTG (서열번호 29)	AAGCCCGACAGTCAGTGGAG (서열번호 30)
hGAPDH	NM_002046.3	AGGGCTGCTTTTAACTCTGGT (서열번호 21)	CCCCACTTGATTTTGGAGGGA (서열번호 22)

실시예 12. 동물모델로부터 절개된 망막 단백질에 대한 ELISA 수행

절개한 망막, 냉각된 스냅(snap frozen)이 프로티나제 억제 칵테일(Sigma-Aldrich)를 포함하는 RIPA 버퍼 내에서 얼음에서 균질화(homogenize) 되었다. 1개의 샘플을 위하여 3마리의 새끼 마우스의 망막 총 단백질이 수집되었기 때문에, 각 군당 9 한배새끼로부터 총 3개의 샘플을 얻었다. 샘플은 10분간 8,000 g으로 4 ℃에서 원심분리하였다. 망막 샘플 및 배양 상청액에서 나타난 TGF-β1을 Human TGF-β1 Quantikine kits(R&D)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 분석하였다. TGF-β1의 농도는 표준 샘플과의 비교로 계산하였다. 각 군의 TGF-β1 평균을 3개의 실험으로 나타내었다.

실시예 13. 통계적 분석

통계적 분석은 차 대학 메인프레임 컴퓨터로 the Statistical Analysis System(SAS; SAS Korea, Inc., Seoul, Korea), 버전 Enterprise 4.0을 사용하였다.

데이터는 평균 ± SEM 으로 나타내었다. 모든 통계는 독립 티 검정(티 테스트)를 사용하여 계산하였다. 실시간 PCR 데이터는 로우데이터를 사용하여 분석하였다. p 값은 0.05이하를 유의적인 것으로 고려하였다.

실시예 14. AMSC의 망막증에 대한 효과 확인

14.1. AMSC의 특징의 확인

AMSC의 면역표현형 표면 프로파일에 대한 유세포계수 분석은 AMSC가 SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81(배아줄기세포 마커), 및 CD34(조혈 및 내피세포 마커)에 대하여 음성이고, CD13, CD90(MSC 마커), 및 CD9(비-영양막(non-trophoblast) 마커)에 대해서는 양성임을 나타냈다(도 16A). 이러한 발현 프로파일은 다분화능(multipotent) MSC의 일반적인 기준으로 확인되었다.

AMSC에서의 항-신생혈관 인자(anti-neovascular factor)(신생혈관 안정화(neovessel stabilization) 촉진하는 인자를 포함)의 발현 수준을 hBM-MSC 및 hAdipo-MSC과 비교하였다. PEDF 및 ANG-1 발현에 대해서는 차이점이 발견되지 않았지만(도 15B), TGF-β 발현은 hBM-MSC 및 hAdipo-MSC에 비하여 AMSC에서 훨씬 강력하였다(도 16B).

14.2. 인 비트로의 병리적 조건(pathologic condition)에서의 AMSC의 반응

전-염증 사이토카인이 존재하는 병리적 조건하에서 AMSC가 그의 항-신생혈관 특성을 유지하는지 여부를 조사하기 위하여, OIR-유도된 망막내의 사이토카인 발현을 분석하였다. 다중 염증 사이토카인, 특히 TNF-α 및 IFN-γ 상향조절(upregulated)되었다(보충 도 17). 이 결과를 바탕으로, IFN-γ 및 TNF-α의 AMSC에의 효과를 인 비트로에서 실험하였다. IFN-γ 및 TNF-α 처리 후 0시간 및 24시간 후에 AMSC로부터 mRNA 및 단백질을 추출하였다. RT-PCR 분석은 IFN-γ 및 TNF-α 노출된 AMSC가 PEDF의 mRNA 수준에 대해서는 유의적인 차이를 나타내지 않았으며, ANG-1 발현은 조금 감소하였음을 나타내었다(도 18A). 반대로, AMSC에서의 TGF-β 발현은 유의적으로 상향조절되었다(p < 0.001; 도 18A). 이와 일치하게, TGF-β 단백질의 증가된 분비가 ELISA를 통하여 확인되었다(271.82 ± 6.35 pg/ml 대 70.45 ± 2.36 pg/ml, p < 0.001; 도 18B). 이러한 데이터는 AMSC가 TGF-β 의 분비 향상을 통하여 환경적 변화에 반응함을 암시한다.

14.3. HUVEC 증식에 대한 AMSC의 억제 효과의 확인

AMSC에 의한 TGF-β의 유도가 혈관신생(neovascularization)의 억제에 중요하게 작용하는지 여부에 대하여 조사하기 위하여, HUVEC를 정상 또는 IFN-γ 및 TNF-α가 처리된 AMSC와 공배양하였다. 공배양 1일 전에 AMSC에 대한 IFN-γ 및 TNF-α 처리(AMSC 자극)를 수행하였다. 증식에 대한 억제영향은 BrdU-기반 증식 분석에 의하여 측정하였고, 결과는 HUVEC 증식에 대한 AMSC-매개 억제를 증명하였다. 도 19에서 나타난 바와 같이, HUVEC 단독 배양에 비하여, 정상 AMSC와 공배양된 HUVEC에서 증식에 대한 미세한 억제효과를 관찰할 수 있었다. 더욱 중요하게, IFN-γ 및 TNF-α 처리된 AMSC가 정상 AMSC에 비하여 HUVEC의 증식에 더욱 큰 억제 효과를 나타냈다(도 19A). 이것은 망막증-유사 조건에 노출된 AMSC가 일반적인 조건하의 AMSC보다 더 효과적으로 HUVEC의 증식을 억제한다는 것을 암시한다.

뒤이어, AMSC의 억제효과의 메커니즘을 실험하였다. TGF-β 역할을 평가하기 위하여, TGF-β 발현을 siRNA 형질감염(transfection)에 의해서 침묵화(silence)시켰다. AMSC 배양물에서의 TGF-β siRNA의 형질감염효과는 정량적 실시간 PCR를 통하여 확인하였으며, 이것은 대조군 AMSC와 비교하여 TGF-β siRNA 가 TGF-β 발현의 80~90 %를 감소시키고(도 20), PEDF 및 Ang-1의 발현은 변화하지 않음(도 21)을 나타냈다. 도 19B에서 나타난 바와 같이, TGF-β siRNA 형질감염은 AMSC의 HUVEC증식에 대한 억제효과를 방해하였다. 중요하게 TGF-β siRNA가 형질 감염된 정상 AMSC는 비-형질전환된 정상 AMSC에 비하여 억제 능력에 유의적인 차이를 나타내지 않았다(p = 0.77). 대조적으로, IFN-γ 및 TNF-α 처리된, TGF-β 수준이 감소된 AMSC의 HUVEC 증식에의 억제효과는 유의적으로 제거되었다(p = 0.007).

종합하여 보면, 이러한 결과는 AMSC가 망막증 조건하에서 HUVEC 증식에 억제적인 역할을 수행하며, 이는 TGF-β 발현의 상향-조절을 통할 수 있음을 나타낸다.

14.4. 인 비보 망막증 조건하에서의 AMSC에 의한 사이토카인의 조절의 확인

인 비보에서 AMSC의 가능한 영향을 평가하기 위하여, AMSC의 처리 후, OIR 모델 마우스의 망막에서의 사이토카인 발현을 분석하였다. AMSC를 P12의 각 마우스의 복강 내로 주사하였고, P17에서 망막 조직을 분석하였다. 망막에서의 항-신생혈관 인자 발현이 그 뒤 실시간 PCR에 의해 평가되었다. 인 비트로 데이터와 동일하게, AMSC-처리된 마우스의 망막에서, TGF-β 발현이 유의적으로 증가하였다(도 22A). AMSC-처리군에서의 PEDF 발현은 대조군과 차이가 없었으며, 망막조직에서 Ang-1 발현은 검출되지 않았다. ELISA 를 이용한 망막 조직 용해물 내의 TGF-β 발현의 정량적 분석은, AMSC-처리군에서 TGF-β 수준이 65.23 ± 11.16 pg/ml에 도달한 반면, 대조군에서의 TGF-β 평균 수준은 27.73 ± 3.57 pg/ml임을 나타냈다(p < 0.01; 도 22B). 따라서, TGF-β mRNA 및 단백질 수준의 분석은TGF-β 인 비보의 망막증 조건에서 AMSC에 의해 분비된다는 것을 나타낸다.

14.5. 망막 혈관신생에 대한 AMSC의 영향

뒤이어, 병리적 혈관형성(pathologic angiogenesis)을 감소시키는 AMSC의 잠재력이 인 비보에서 실험되었다. 도 23A에서 나타난 바와 같이, AMSC의 투여는 대조군에 비하여 OIR 에 의해 유도된 병리적 혈관신생의 정도를 현저히 변화시켰다. 대조군 마우스의 중앙 및 중간주변부(midperipheral) 망막에 풍부한 신생 혈관 다발(neovascular tuft)이 AMSC-처리군에서는 미비하게 나타났다(도 23A, 왼쪽 및 중간 패널). 신생혈관다발 부위는 회색으로 나타난다(도 23A, 삽화). 정량적 분석은 대조군에 비하여 AMSC-처리군에서 망막내에 신생혈관다발 부위의 억제가 4.73% 이상임을 확인하였다.

일관되게, AMSC-처리군의 망막 맥관 구조는 중앙 망막 주변의 희박한 무혈관(sparse avascular) 부위를 제외한, 중간주변부 및 주변부에서 일반적인 형태(morphology) 및 분지(branching)를 나타낸다(도 23C). 혈관 폐색(vascular obliteration) 부분은 회색으로 나타난다(도 23C 삽화). AMSC 처리된 마우스의 망막은 PBS 처리된 마우스의 망막에 비하여, 약 10.93 %의 비혈관 부분을 나타낸다(p < 0.001; 도 23D). 이 결과는 AMSCs가 신행혈관다발형성을 억제하고 증식적 망막증에서의 정상적인 혈관화 부분(normal vascularized area)을 증가시킨다는 것을 나타낸다.

인 비보에서 TGF-β siRNA의 AMSC의 이로운 효과를 무력화시키는 능력을 또한 실험하였다. 이 실험을 위하여, 기능적 분석을 TGF-β siRNA로 처리된 AMSC사용으로 수행하였다(도 23A, C, 우측 패널). 예상한 바와 같이, TGF-β siRNA 처리된 AMSC는 비-침묵화 AMSC와 비교하여 신형혈관다발 형성을 억제하는데에 실패하였다(p < 0.001; 도 23B); 그러나, 비처리된 AMSC와 TGF-β siRNA 처리된 AMSC간의 정상적인 혈관화 부분의 차이가 유의적이지 않음에도 불구하고(p > 0.27; 도 23D), 정상적인 혈관화 부분은 대조군에 비하여 TGF-β siRNA 처리군에서 미비하게 증가하였다(p < 0.06; 도 23D). 이러한 결과는 AMSC 처리가 TGF-β 발현을 통하여 망막 신생혈관화(neovascularization)를 효과적으로 억제하는 반면, 혈관 폐색에 대한 효과는 TGF-β 무관함을 나타낸다.

14.6. 복강 내 주사 후 AMSC의 이동

망막 신생혈관화에 대한 가능한 AMSC-매개 억제효과를 조사하기 위하여, 복강내 투여된 AMSC를 CM-DiI로 표지하고 추적하였다(도 15A). 순환 AMSC의 망막 혈관 누출 가능성의 배제를 위하여, AMSC가 정맥으로 투여되지 않음이 매우 중요하다. 주사 후 5일 뒤에, 이동한 AMSC가 망막에서 검출되었다(도 24, 좌 및 중간 패널). AMSC는 망막 신생혈관화 부위에 위치하고, 혈관 그물(vascular network)에 흡수되지 않았으며(도 24, 우측 패널), 이는 AMSC가 내피세포 또는 주위세포(pericyte)로 분화되지 않음을 나타낸다. 이러한 결과는 AMSC가 사이토카인 분비를 통하여 비정상적 혈관신생을 조절하는 근거리 분비(paracrine) 메카니즘을 뒷받침한다.

Ⅲ. 태반 유래 줄기세포의 특징 및 이로부터 신경전구세포의 유도

실시예 1. 인간만삭태반으로부터 hASC의 분리 및 처리

내과, 산과 또는 외과적 합병증이 없는 정상의, 인간만삭태반(human term placenta)(임신 주수 = 37)를 제왕절계술로 수득하고, 이 발명에 사용하였다. 모든 공여자는 기재되고, 공지된 동의서를 제공하였다. 샘플의 수집 및 그들의 연구목적으로의 사용은 차 종합병원(Seoul, Korea)의 기관감사위원회(Institutional Review Board, IRB)의 승인을 받았다. 각 태반은 조심스럽게 절개되었다. 회수된 조직의 조각을 PBS로 수회 세척한 뒤, 기계적으로 분쇄한 뒤, 30분간 37 ℃에서, 2 mg/ml의 트립신(Sigma), 20 ug/ml DNase I(Sigma), 1.2 U/ml Dispase(Gibco) 및 1 mg/ml 콜라게나제 IV(Sigma)를 포함하는 Hank? Balanced Salt solution(HBSS, Gibco)로 분해(digest)하였다. 회수한 세포를 10% 우태아혈성(FBS, Gibco) 및 페니실린/스트렙토마이신(Gibco), 25ng/mL FGF4(R&D Systems), 및 1 ㎍/mL 헤파린(Sigma)을 포함하는 Alpha-MEM 배지(Gibco, New York, USA)를 포함하는 T 25 플라스크(2 X 10⁵ cells/mm³, Nunc)내에서 배양하였다. 3일째에, hASC(human amniotic stem cell)을 트립신화되고(trypsinized) 혈구 계수기(hemacytometer)를 이용하여 계수하였다.

실시예 2. 인간 ESC, 인간 BM-MSC, 인간 AD-MSC, 인간 태아 NPC의 배양

인간 골수 중간엽 줄기세포(human Bone marrow mesenchymal stem cells, hBM-MSCs, Lonza)를 10 % FBS 및 페니실린/스트렙토마이신 및 100 mM L-글루타민로 보충한 Alpha-MEM 배지에서 37 ℃에서 5 %의 CO²환경에서 배양하였다. 인간 지방 중간엽 줄기세포(Human Adipose mesenchymal stem cells, hAD-MSCs)는 10% FBS 및 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 Alpha-MEM 배지에서 37 ℃에서 5% CO² 환경에서 배양하였다. 밀집도(confluence) 80 %에 도달하면, 세포를 트립신화시키고 새로운 배양 디쉬로 옮겼다.

인간 유래 신경 전구세포(neural precursor cell)를 15 ㎍/ml 폴리오르니틴(polyornithine) 및 4 ㎍/m 피프로넥틴이 선-코팅된 배양 디쉬에 30,000 cells/cm²의 밀도로 도말(plate)하였다. 세포는 1ug/ml 토코페롤 및 1ug 토코페롤 아세트산 및 20 ng/ml의 인간 상피 성장 인자(human epidermal growth factor, EGF), 20 ng/ml 인간 섬유아세포 성장인자(human fibroblast growth factor-2, FGF-2; 종전 기본 섬유아세포 성장인자) 및 2 % B-27 마이너스-AO 보충물로 보충된 DMEM/F12(Gibco)에서 배양하였다. 배양물은 37 ℃에서, 5% CO₂, 92% N₂ 및 3% O₂ 조건의 다습환경에 위치시켰다. 배양물을 Accutase 및 동일한 조건하에 세포의 재도말(replating)로 매 10-14일을 패스(pass)하였다.

실시예 3. 유세포 계수 분석, 정량적 PCR 및 면역블롯팅 분석을 이용한 hASC의 특징

유세포 계수 분석(Flow cytometry analysis): 표현형 분석을 위하여, 세포를 FACS 버퍼내에서 20분간 4 ℃에서 적적한 농도의 하기 항체와 함께 염색하였다: FITC-표지된 항- SSEA4, TRA-1-81, CD90, CD34 및 PE-표지된 항- TRA-1-60, CD9, CD44, CD13(BD Pharmingen). 세포의 세척 후, Cell Quest 소프트웨어를 이용한 FACS Calibur(Becton Dickinson)으로 분석하였다.

정량적 역전사 PCR: TRIzol(Invitrogen)를 이용하여 총 RNA를 세포로부터 분리시켰다. 1 ㎍ 의 총 RNA로부터 Superscript II 역전사효소, Oligo-d(T) 12-18 프라이머, DTT, 및 dNTPs를 제조사의 프로토콜에 따라 이용하여, cDNA를 합성하였다. RT-PCR를 Pre-Mix 키트(Bioneer)를 판매사의 안내서에 따라 이용하여 수행하였다. 사용된 프라이머는 표 1에 나타냈다. PCR 생산물을 RedGel(Biotium,Inc) 를 이용한 2 %의 아가로스겔 전기영동하였고 UV- 트랜스일루미네이터(transilluminator)로 가시화 하였다.

면역블롯팅(Immunoblotting) 분석: 세포를 저온의 PBS로 세척하고, 프로테아제 억제 칵테일(Pierce)을 포함하는 용해 버퍼로 용해시켰다. 총 세포 용해물이 Bradford 제제(Bio-Rad)에 의해 정규화되었고, 30~50 ㎍의 용해물을 8 ~ 12 % SDS-PAGE에 적용하고 PVDF 막(Milipore)로 이동시켰다. 막은 5% 탈지유(Becton Dickinson)를 포함하는 TBS-T(50mM Tris-HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20)내에 블록(block)하였고, 각 항체로 조사하였다. 면역반응은 ECL Western Blotting system(Milipore, Amersham)를 이용하여 수행하였다.

실시예 4. hASC의 NPC에 대한 배양 시스템

hASC를 10% FBS(Gibco), 각각 100 ㎍/mL의 페니실린 및 스트렙토마이신(Gibco), 25ng/mL FGF4(R&D Systems), 및 1 ㎍/mL 헤파린(Sigma)이 보충된 알파-MEM에 배양하였다. 신경 유도를 위하여, 고밀도 세포 배양방법(high cell density culture method)가 세포간의 상호작용을 증가시키기 위하여 사용되었다. 세포는 15 ug/mL 폴리오르니틴(Sigma) 및 4 ㎍/mL 피브로넥틴(Sigma)로 코팅된 디쉬에 10,000 cells/cm² 밀도로, 플레이트의 중앙에, 총 플레이드 공간의 약 1/3으로 시작하는 세포 스포팅(spotting)으로, 도말하였고, 뒤이어 세포를 25ng/mL FGF4 및 1 ㎍/mL 헤파린을 포함하는 완전 배지에서 6일간 37 ℃에서 5 % CO₂환경에서 인큐베이션하였다.

실시예 5. 인간 AMSC의 분화 잠재력의 분석

지방세포성 분화(Adipogenic differentiation): 세포를 6-웰 배양 디쉬에 of 1.5 X 10⁴ cells/ cm²의 밀도로 시딩하고 100 % 밀집도에 도달하기 까지 10 % FBS(Gibco)가 보충된 고 글루코스 DMEM(Gibco)에 배양하였다. 뒤이어 세포에 대하여 지방세포성 유도 배지(1 mM 덱사메타손(Sigma), 0.5 mM 3-이소부틸-1-메틸-잔틴(Sigma), 10 ng/mL 재조합 인간 인슐린(Sigma), 100mM 인도메타신(Sigma), 10% FBS로 보충된 고-글루코스 DMEM) 및 지방세포 유지 배지(10 ng/mL 재조합 인간 인슐린 및 10% FCS가 보충된 고-글루코스 DMEM)를 이용하여 각각 7일간 연속적으로 3 사이클의 유도/유지를 수행하였다. 분화 후, 세포를 10 % 포르말린으로 고정하고, 세포질 내의 유적(oil droplet)의 생산을 확인하기 위하여, 실온에서 5분간 2%(wt/vol) Oil Red O 제제(Sigma)로 염색하였다.

골원성 분화(Osteogenic differentiation): 세포를 3 X 10³ cells/cm² 밀도로 시딩하고, 10% FBS(Gibco)가 보충된 고 글루코스 DMEM(Gibco)에 70-80 % 밀집도에 도달할 때 까지 배양되며, 뒤이어 2.5 주 동안 주 당 2회씩 골원성 유도 배지(100nM 덱사메타손(Sigma), 10mM β-글리세로포스파트(Sigma), 0.2mM 아스코르브산염(Sigma), 및 10% FBS을 보충한 IMDM 기본 배지(GIBCO)를 공급하였다. 골원성 분화는 실온에서 15분동안 10 % 포르말린으로 세포를 고정하고, 하이드록시에퍼타이트 메트릭스(hydroxyapatite matrix)의 축적(deposition)을 증명하는 von Kossa 염색으로 염색하는 것을 이용하여 검출하였다.

연골성 분화(Chondrogenic differentiation): 연골성 분화를 유도하기 위하여, 처음 세포(3 x 10³ cells/cm²)를 시팅하고, 15-mL 폴리프로필렌 튜브에 이동시키고, 각 튜브의 바닥에 펠렛 마이크로매스(pelleted micromass)를 형성하기 위해, 5분간 1000 rpm에서 원심분리하였으며, 최종적으로 연골성 배지(0.1 M 덱사메타손(Sigma), 50g/mL AsA(Sigma), 100g/mL 소듐 피루빈산염(Sigma), 40g/mL 프롤린(Sigma), 10 ng/mL TGF-1(Peprotech), 6.25 g/mL 인슐린(Sigma), 6.25 g/mL 트랜스페린(Sigma), 6.25 ng/mL 아셀렌산(Sigma), 1.25 mg/mL BSA(Sigma), 및 5.35mg/mL 리놀레산(Sigma)이 고충된 고-글루코스 DMEM)을 처리하였다. 배지를 주마다 2회 갈았으며, 연골형성을 주마다 분석하였다. 배양 후 2-4 주 후, 세포를 PBS로 2회 세척하고, 4% PFA에 고정하고 Alcian Blue로 염색하였다.

실시예 6. FGF4의 후속반응의 억제

FGF4 후속 반응(downstream) 억제를 위하여, hASC를 디메틸 설폭사이드(DMSO) 중 5 μM ERK 억제 U0126 또는 10 μM JNK 억제 SP600125(Calbiochem)로 선처리하거나 선처리하지 않은 10% FBS를 포함하는 알파-MEM 배지에 1시간 동안 배양한 뒤, 25ng/mL FGF4으로 3일 동안 자극하였다. Notch 신호의 억제를 분석하기 위하여, ASC가 50 μM Notch 억제 DAPT(N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-1-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester, Sigma)로 선처리하거나 선처리 하지 않은 10% FBS를 포함하는 알파-MEM 배지 내에 1시간 동안 배양하고, 25 ng/mL FGF4로 3일간 자극하였다.

실시예 7. 세포의 면역세포화학적 분석

세포를 처음 실온에서 15분간 4 %의 PFA로 고정하고, 20분 동안 0.1% Triton X-100로 투과성화(permeabilize)하였으며, 그 뒤 10 % 정상 염소 혈청(normal goat serum, NGS)으로 블로킹(blocking)하였다. 하기의 일차 항체를 사용하였다: 항-뉴론 classIII β-튜블린(Tuj1), -Nestin(Covance), -Ki-67(Novocastra), -SOX2, -NANOG, KLF4, Brachyury/Bry(모두 Abcam), OCT3/4, GATA4(모두 Santa Cruz). 세포를 Alexa Fluor 488 또는 594-접합된 항체(Molecular Probes)와 함께 1시간동안 실온에서 인큐베이션 시키고, 세포 핵을 확인하기 위하여 4', 6-diamino-2-phenylindole(DAPI, PBS 내 2mg/mL)로 염색시켰다. 커버-슬립(cover-slip)를 유리 슬라이드 위에 봉입하였다. 세포를 형광 현미경 또는 공초점 형광 현미경(LSM 510 confocal microscope, Zeiss)을 이용하여 기사화하였다.

실시예 8. 동물 실험

8.1. 실험동물 모델의 준비 및 처리

본 발명에서는 암컷 성체 Sprague-Dawley 렛트(220-250 g)를 사용하였다. 그들을 실온(22-23 ℃) 표준 12시간 명/암 사이클(오전 7시에 밝힘)로 사육하였으며, 음식과 물에 대한 비제한적인 접근이 가능하도록 하였다. 실험 절차는 실험동물관리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 동물관리 가이드라인에 따라서 수행하였다.

8.2. 6-히드록시도파민 병변 및 이식

렛트를 rumpun(1.5 mg/kg)을 포함하는 케타민(ketamine)(4.5 mg/kg, i.p.)을 이용하여 마취시켰다. 렛트의 우측 내측전뇌속(medial forebrain bundle, MFB)에 9 ㎍ 6-OHDA 및 0.2 mg/mL L-아스코르브산을 양쪽 정위 주사(bilateral stereotaxic injection)로 26-게이지 Hamilton 주사기를 이용하여 투여하였다: 문측-후측(anterior-posterior, AP) -4.4, 내측-외측(medial-lateral, ML) -1.2, 등측-배측(dorsal-ventral, DV) -7.8, -2.3 에서 tooth bar set 및 AP -4.0, ML -0.8, DV -8.0, 3.4에서 tooth bar set; 모든 브레그마(bregma)에서 밀리미터 적응(adjustment)으로 나타낸다(Paxinos et al., 1997, Espino et al., 1995, Kim et al., 1998). 삽입한 바늘을 5분 뒤에 각 부위에서 철수시켰다. 6-OHDA 주사후 4 주 뒤에, 렛트의 암페타민-유도된 회전 비대칭(rotational asymmetry)을 실험하였다. 회전 수치는 자동화된 로터미터(rotameter) 장치(Med Associates Inc., St. Albans, VT, USA)를 이용하여 90 분간 모니터하였다.

줄기세포 이식을 위하여, 병변의 동측으로 6 회전/분의 렛트를 줄기세포 이식을 위하여 하기의 4 개 중 하나로 배속시켰다: 위대조군(n=11), hASCs(n=9), hASCs-NPC(n=8), 및 hES-NPC(n=4).주사일에, 세포를 트립신화하고, PBS로 세척한 후 계수하였고, 3 ㎕의 세포 상청액(PBS 내의 1.5 x 10⁵ cells/㎕)를 22-게이지 바늘로, KDS310 나노 펌프(KD Scientific Inc., Holliston, MA, USA)를 이용하여 동측 선조체(ipsilateral striatum)에 5분 이상 주입하였다. 케타민(4.5 mg/kg) 및 rompun(1.5 mg/kg)으로 유도한 마취 하에서, 세포 또는 염을 두 부위(브레크마 및 경막(dura)에 대하여 AP, ML 및 DV로(1) 0.07, -0.30, -0.55;(2) -0.10, -0.40, -0.50)에 위치시켰다. 각 주입의 완료 후 10분 후 각 부위에서 바늘을 제거하였다. 위대조군을 포함하는 모든 동물에게 면역억제제인 염으로 희석된 사이클로스포린 A(10mg/kg, Chongkundang Pharmaceutical Corp.)를 이식 한 다음날부터 시작하여 이식 후 2주까지 복강내(i.p.)로 투여하였다. 투여량은 실험에 끝날 때까지 5 mg/kg 감소시켰다.

8.3. 동물모델 뇌 조직의 처리, 면역조직화학 및 면역형광

동물을 세포 이식 또는 염의 주사 후 1, 6 또는 12 주에 펜토바르비탈(pentobarbital)(3 mL/kg)에 의한 마취로 안락사시킨 뒤, 0.05 M 인산염 버퍼 중 4% PFA를 경심관류(transcardially)로 관류시켰다. 뇌를 제거하구, 후-고정하며, 동결보존(cryoprotect)하였다. 면역조직화학을 종래 기술된 바에 따라, 뇌 전체를 포함하는 자유-유동적 동결절편기-절편(free-floating cryomicrotome-cut section)(40 ㎛ 두께)에서 수행하였다. 0.05M PBS 내에서 3 % H₂O₂ 에서 인큐베이션 후, 0.1 M PBS내의 0.3 % Triton X-100 및 3 % BSA에 인큐베이션하고, 절편은 도파민작동성 뉴런(1:200 TH from Abcam)을 인식하기 위한 일차 항체와 함께 4 ℃에서 밤새 염색하였다. The Vectastain Elite ABC 키트(Vector Laboratories., Burlingame, CA, USA)를 이차 항체로 사용하였다. 조직은 형광 현미경 또는 공초점 형광 현미경(LSM 510 confocal microscope, Zeiss)으로 가시화하였다.

대안적으로, 상기와 같이 수득한 자유-유동적 40-㎛ 절편을 하기의 일차 항체와 함께 4 ℃에서 밤새 염색하였다: SOX2(1:200; Chemicon), Nestin(1:200; Chemicon) 및 DCX(1:200; Cell-Signaling Technology). 조직을 PBS로 3 회 세척하고, 2시간 동안 이차 형광-접합 염소 항-마우스 또는 항-토끼 항체(DAKO, Denmark, Cy3, FITC, both diluted 1:1,000)과 2시간 동안 인큐베이션시켰으며, 최종적으로 세척하고 Vectorshield 내로 봉입하였다. 모든 조직 샘플은 추가적으로 DAPI로 대비 염색하였다. 조직은 형광 현미경 또는 공초점 형광 현미경(LSM 510 confocal microscope, Zeiss)으로 가시화하였다.

8.4. 행동 분석

6-OHDA 파킨슨모델에서 대조군(n=11), hES-NPC(n=4), hASC(n=9) 및 hASCs-NPC(n=8)의 4개의 군에 대하여 하기의 행동 실험을 수행하였다.

회전 실험: 5 mg/kg 암페타민(Sigma) 의 복강내 주사 후에, 회전 행동을 자동 로타미터 시스템(rotameter system)(Med Associates Inc.)을 이용하여 90분간 측정하였다. 동측(ipsilateral) 회전의 수를 세포 이식 전 7일 전에 및 이식 후 3, 7 및 9주 후에 계산하였다.

실린더 실험: 자발적 움직임(spontaneous movement)은 동물을 투명한 실린더(높이, 40 cm; 직경, 20 cm)에 위치시키는 것으로 측정하였다. 자발적활동을 5분간 비디오로 기록하였다. 총 6개 패턴의 움직임(왼쪽 앞다리 접촉, 오른쪽 앞다리 접촉, 양 앞다리의 최초 왼쪽 접촉, 양 앞다리의 최초 오른쪽 접촉, 양 앞다리 접촉, 몸만을 일으킴)을 렛트의 자발적 움직임의 관찰로 평가하였다. 앞다리 스텝의 수를 측정하였다. 처리군에 대하여 무지한 두 실험자가 비디오 기록을 관찰하고 느린 동작으로 평가하였다.

로타로드 실험: 가속 로타로드 실험을 렛트의 ACCELER 로타로드 쳇바퀴를 이용하여 수행하였다. 3분간 고정된 속도(4 rpm)에 적응 후, 로드의 회전 속도가 5분간 4 rpm의 최초 속도에서 50 rpm으로 선형 증가하는 수평의 플라스틱 로드에 위치시켰다. 각 쥐가 로드 위에서 걷기 균형을 유시할 수 있는 시간을 측정하였다. 로드 회전 시간을 세포 이식 후 21, 22, 23, 및 42 일에 계산하였다.

실시예 9. 동물 모델의 선조체에 대한 웨스턴 블롯

단백질 추출물을 수득하기 위하여, 렛트를 이식 또는 염 주입 후 6주째에 경추 파열법(cervical dislocation)으로 희생시키고, 빠르게 선조체(striatum, ST) 및 흑질(subtantia nigra, SN)를 절개하였다. 샘플을 400 ㎕의 빙온의 용해 버퍼(50 mM Tris-HCl [pH 7.5], 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.5% 소듐 데옥시콜산, 0.1% SDS 및 0.02% 소듐 아지드)내에서 방사선처리(sonicate) 하였다. 용해물의 단백질 농도를 Bradford 제제(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 결정하였다.

웨스턴 블롯 분석을 위하여, 샘플(10-20 ? 단백질)을 12 % 도데실황산나트륨(sodium dodecyl sulfate)-폴리아크릴아미드(polyacrylamide) 전기영동 겔에 로딩(loading) 시켰다. 분리 후, 단백질을 나이트로 셀룰로스(nitrocellulose) 막에 블롯팅하고 1시간동안 0.1% Tween-20, 5% 탈지유 및 0.2% BSA를 포함하는 TBS(Tris-buffered saline) 내에서 실온에서 교반(shaking)하였다. 교반 후, 막을 0.1% Tween-20를 포함하는 TBS 내에서 일차 항체(토끼 모노클로날 항 -TH; Biotechnologies Santa Cruz, CA. USA; 1:1000)와 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이션 하였다. 홀스래디쉬 페록시다아제(horseradish peroxidase, HRP)-결합된 이차 항체(항-토끼; 1:1000)를 이용하여 일차 항체를 검출하였고, 결합된 이차 항체는 강화된 화학 발광((Amersham Biosciences, Buckingghamshire, UK)에 의해 가시화되었다.

실시예 10. 테라토마 형성 분석 및 핵형 분석을 통한 안전성 실험

테라토마 형성 어세이: 6 주령의 6 BALB/c-nu Sic 수컷 마우스(Central Lab. Animal Inc, Korea)에 21-게이지 바늘을 이용하여 좌우 양쪽 고환에 10 ㎕ 배양 배지 내의 5 X 10⁵ cell 를 이식하였다. 이식 후 8, 12 또는 48 주에, 마우스를 희생하고 고환을 10 % 포르말린에 고정하였다. 모든 조직을 분석을 위하여 파라핀 블록 내에 넣었다. 블록을 10-15 ㎛로 절단하였고, 결과 슬라이드를 헤마톡시린 및 에오신으로 염색하였다.

핵형 분석: 핵형분석(Karyotyping)을 Cytogenomic Services Facility of Samkwang Medical Laboratories를 이용하여 수행하였다. 핵형의 분석을 위하여, 1-2 시간동안 0.05 ㎍/mL 콜세미드(colcemid)를 이용하여 세포분열을 중기에서 블로킹하였다. 염색체를 G-band염색으로 가시화하고, 100개 이상의 중기 세포를 분석하였으며, 최소한 3개를 핵형 분석하였다.

실시예 11. 통계

모든 분석을 차대학 메인프레임 컴퓨터에서 Statistical Analysis System(SAS; SAS Korea, Inc. Seoul, Korea), 버전 Enterprise 4.0.를 이용하여 수행하였다. TH⁺ 세포의 수를 T-검정(T-test) 또는 이원분산분석(two-way analysis of variance) 과 차후 LSD-사후 검정(post-hoc test)을 이용하여 분석하였다. 행동 어세이를 위해서, 회전 실험, 로타로드 및 실린더 검사의 평균값을 종속 변인(dependent variable)으로 이용하고, "처리"(위대조군, hASCs, hASCs-NPC, 및 hES-NPC이식군)를 독립변인(independent variable)으로 이용하였다. 분산과정(variance procedure)(SAS, PROC MIXED)의 혼합 모델 분석을 렛트의 임의 요인(random effect)를 고려하기 위하여 사용한다.

실시예 12. 인 비트로 및 인 비보 분석을 통한 hASC 특징 및 이로부터 유도된 신경전구세포의 확인

12.1. 인간 만삭 태반의 hASC의 특징 및 유지

태반 양막으로부터 분리한 hASC를 몇몇의 인비트로 어세이를 이용하여 특정하였다. 분리된 세포의 핵형분석으로 그들이 인간 태아 기원인 것(도 25A), 및 중간엽 세포를 강하게 연상시키는, 매우 납작하고 비대칭 방추-모양의(asymmetrical spindle-shaped) 형태의 보유를 확인하였다(도 25B). hASC의 성장곡선은 인 비트로에서 축적된 세포의 양이 세포 페시지가 증가함에 따라 급격하고 일정하게 증가한다는 것을 증명하였고, 이는 세포의 활발한 증식을 나타낸다. hASC의 배가시간은 31시간이고, 집단 배가수(population doubling level, PDL)은 32일까지 지속된다(도 25C, D). 세포계수(Flow cytometry)는 hASC가 MSC-관련 표면 마커 CD44(94.3 ± 3.7 %), CD13(84.1±7.1%) 및 CD90(84.0±7.5%)에 양성적이고, 조혈줄기세포 마커인 CD34에 음성적임을 나타낸다.

일부 줄기세포 표면 마커가 신선하게 분리된 hASC에서 나타난다(도 25E). 세포는 SSEA-4(97.0±1.4 %) 및 TRA-1-60(56.9±19.3%), 및 TRA-1-81(50.5±17.7 %)을 포함하는 배아 줄기세포(Embryonic stem cell, ESC)의 다른 표면 마커를 발현하였고, SSEA-1를 발현하지 않았다. CD9(99.8±0.1%)의 검출은 세포가 영양막(trophoblast)으로부터 유래하지 않았음을 확인하였다(도 25E). 인간 ESC 및 ASC 둘다, OCT-3/4, NANOG, KLF4, 및 SOX2을 포함하는, 다분화(pluripotent) 줄기세포의 특징인 유전자의 mRNA를 발현하였다(도 25G). 그러나, hASC의 면역조직화학 프로파일은 이 세포가 SOX2에만 양성 반응성이고, OCT 4, NANOG, 및 KLF4 단백질은 전혀 없다는 것을 나타냈다(도 25F).

또한, 면역 블롯팅을 이용하여, 신선하게 분리된 hASC에서 OCT4, NANOG, 및 KLF4의 단백질 수준이 검출되지 않은 반면(도 25H), hASCs에서 4개의 유전자, KLF4, OCT-3/4, NANOG 및 SOX2에 대한 mRNA의 발현은 검출되었다(도 25G, H). H9 세포는 알카리성 인산가수분해효소(alkaline phosphatase enzyme) 활성을 나타내었지만, hASC는 아니었다 (도 25I). hASC의 추가적 특정은 지방세포(adipocyte), 조골세포(osteoblast) 및 연골세포(chondrocyte)와 같은 중간엽-계통 세포로 분화할 수 있는 능력을 나타내었다(도 26A).

12.2. FGF4에 처리에 따라 증가된 hASC의 Nestin 양성 세포

신경 유도 잠재력을 조사하기 위하여 bFGF, EGF, 및 FGF4를 포함하는 일부 성장인자를 실험하였다. NPC의 마커인 Nestin 및 Musashi1의 발현 수준이 다른 두 조건하(10 ng/mL EGF 또는 10 ng/mL bFGF로 처리)에 비하여 25 ng/mL FGF4로 처리하였을 때 훨씬 높았다(도 26B). 뒤이어, FGF4가 hASC의 증식 또는 신경으로의 운명에 영향을 미치는지 여부에 대해서 조사하였다. 이에 따라, 각기 다른 용량의 FGF4(10 ng/mL, 25 ng/mL, 및 50 ng/mL)의 3 일간의 처리가 hASC의 NPC의 전형적 마커인, Nestin 발현에 영향을 미치는지를 조사하였다.

25ng/mL FGF4에서 Nestin의 가장 높은 mRNA 발현 수준을 얻었다(도 27A). 면역블롯팅으로 측정한 Nestin 단백질의 발현도 유사하게 증가하였다(도 27B). 분화 3일째에, FGF4(25ng/mL)가 배지에 존재하는지 여부에 따라, Nestin-발현 세포의 수가 유의적으로 상이하였다 (독립적 배양의 7 세트에서 계수된 총 세포, p < 0.0001)(도 27C, D). SSEA-4, TRA-1-60, 및 TRA-1-81의 발현 또한, FGF4가 처리되지 않은 대조군 배양물에서보다 FGF4가 처리된 배양물에서 더 낮은 반면(도 28), CD9, CD90, CD13, 및 CD44는 FGF4 처리 배양물에 유지되었다.

12.3. FGF4 후속적 신호 전달의 확인

FGF4의 후속적으로 hASC의 신경 분화를 활성화 할 수 있는, 미토젠-활성화된 단백질 카이나제(mitogen-activatd protein kinases, MAPK; ERK 및 JNK을 포함)와 같은 세포내 신호활성을 조사하였다. FGF4-처리 또는 미처리된 세포에서, 72시간 동안의 활성화(인산화)형태의 신호분자의 단백질 수준 변화를 측정하였다. pERK(인산화된 ERK) 수준의 즉각적 증가가 12 시간에서 관찰되었고, FGF4 의 처리 후 24시간동안 pERK의 수준이 점진적으로 증가하였다.

또한, 또 다른 FGF4의 주요한 후속 신호 물질인 pJNK의 수준이 FGF4 처리의 12시간 동안 급격하게 증가하였다. 흥미롭게도, FGF4-처리세포에서 12시간의 시점에서, pERK1/2 및 pJNK가 가장 높은 수준이었고, 12시간에 Nestin 발현의 현저한 증가가 검출되었다(도 27E). FGF4에 의한 Nestin 발현의 유도가 FGF4/ERK 신호 전달(signaling) 또는 FGF4/JNK 신호 전달에 따르는 것인지 분석하기 위하여, hASC에 FGF4 투여 1시간 전에 ERK 신호 전달 억제제인 5mM U0216 또는JNK 신호전달 억제제인 20mM SP600125를 투여하였고, ERK인 산화 및 JNK 인산화를 72시간 시점에서 분석하였다. 특이적 억제제인 U0126(ERK 신호전달) 및 SP600125(JNK 신호전달)에 의한 FGF4-MAPK 신호전달의 억제는 Nestin 단백질 수준의 감소를 야기하였다(도 27F, G). 그룹간에 유의적인 차이가 존재하였다(ERK 억제 실험에서 F_(3,23)=11.56, P < 0.0001 for the ERK 및 JNK 억제 실험에서 F_(3,23) = 137.22, P < 0.0001). 5mM U0216의 존재하에 47.61 ± 3.46의 총 세포가 Nestin⁺ 이고, 20mM SP600125 존재하에서 48.47 ± 3.07의 총 세포가 Nestin⁺ 인 반면(DMSO 내 보다, 각각, P < 0.004 및 P < 0.006), DMSO 내에서는 68.19 ± 4.2 였다.

대조적으로 Ki-67⁺ 증식 세포(Ki-67⁺ proliferating cell)의 비율은 5 mM U0216 존재하에서 낮은 반면(총 DAPI+ 세포에서 % Ki-67⁺cells: 5 mM U0216 에서 64.46 ± 2.14, 및 DMSO 내에서 67.3 ± 2.39; P < 0.0001, n = 6), 20 mM SP600125의 존재하에서 보다 유의적으로 감소하였다(총 DAPI+ 세포에서 % Ki-67⁺cells: 20 mM SP600125내에서 37.53 ± 1.89 in 20 mM SP600125(P < 0.0001 DMSO처리군과 비교하여, n=6))(도 27 G, H). 이러한 데이터는 FGF4로 유도된 ERK 신호전달이 신호 유도에 특이적이지만, Ki67⁺ 증식 세포에는 영향을 주지 않는 반면, FGF4-JNK 신호 전달은 Nestin 뿐만 아니라 Ki-67의 발현에 영향을 미치는 것으로 보인다.

12.4. DLL1 발현 증가로 인한, 높은 수준의 NPC로 유도된 세포-세포 접촉

신경세포의 수율 및 순도를 증가시키는 방법을 조사하기 위하여, 신경/뉴런 유도에의 일부 세포-대-세포 접촉(contact)수준의 효과가, 세포-세포 접촉을 향상시키는 상이한 세포 밀도 조건에서 실험되었다. 이에 따라, FGF4를 포함하는 배지에서 배양된 hASC를 "High-Density(HD) 배양 시스템" 으로 명명되는, 형태적으로 구형 응집체(spherical aggregate)를 형성하기 위하여, 플레이트에 스포팅(spotting)되었다. 일반적으로, 세포의 형태적 변화는 세포 이동, 분화 및 다세포 조직의 발달에서 특정 구조의 형성을 동반한다.

HD 배양 시스템 내(10x세포밀도) 또는 정상 배양 조건(10x 세포밀도) 의 FGF4-처리 hASC 를, hASC 세포의 분화과정에서의 형태의 변화를 시각화 할 수 있는, 위상차 현미경(phase contrast microscopy)을 이용하여, 24시간 동안 타임 랩스(time-lapse) 디지털 이미지로 영상화 하였다(도 29, 도 30A). 또한 25ng FGF4를 포함하는 배지에서 정상 및 HD 배양 간의 Nestin/Ki-67 및 Nestin/TUJ1의 3일간의 발현 수준을 비교하였다. 일반적으로 Nestin-면역반응성 세포는 분화기 중에 점진적으로 증가한다(도 30B, C). 도 30B에서 나타난 바와 같이, 12시간에서, Nestin⁺ 세포가 10x 밀도로 HD로 배양된 hASC에서 관찰되었으며; 이것은 상이한 조건의 군 간에 가장 높은 비율이었다.

첫날에, HD로 배양된 1 x 밀도의 hASC가 정상 배양의 세포보다 미세하게 높은 비율로 Nestin⁺ 세포를 나타내었으며, 어떠한 HD도 5 x 밀도를 나타내지 않았다. 반면, 10 x 세포밀도에서, Nestin⁺ 및 TUJ1⁺ 세포 수의 급격한 증가가 관찰되었다. 신경 유도 3일 후, 10 x 밀도의 HD 방법으로 배양된 hASC은 Nestin⁺ 세포의 가장 높은 수준을 증명하였다. 더욱이, 10 x 밀도의 HD 방법으로 배양된 hASC는 신경 유도 3일 후, TUJ-1 가장 높은 발현을 나타냈다.

증식에 관하여, 10 x 밀도에서 배양된 세포는 HD 또는 정상 배양 하의 1 x 밀도로 배양된 세포에 비하여, Ki-67의 증가된 발현을 증명하였다. 첫날에 비하여 3일째에 모든군에서 급격한 증가를 관찰할 수 있었다. 그러나, HD 방법의 10 x 밀도의 세포 성장은 감소하였다(도 30B). 도 30C에서 나타난 바와 같이, 단백질 면역블롯팅은 사용되는 배양 방법에 무관하게, 세포 밀도가 증가함에 따라, Nestin 및 TUJ-1의 상대적 발현도 꾸준히 증가하는 것을 입증한다. 동일한 세포 밀도(1x밀도)에서, Nestin mRNA, Musashi mRNA, 및 TUJ1 mRNA의 수준은 정상 및 HD 분화 조건하에서 일반적으로 증가하였다. HD 조건은, 정상 배양조건하의 발현 수준에 비하여, 3일째에 Nestin mRNA 약간의 수준 증가를 유도하고, 6일째에는 Nestin을 강력하게 증가시키는 반면, 정상 성장 조건에 비하여 HD 조건 하에서 Musashi mRNA 및 TUJ1 mRNA의 수준의 증가가 현저하지 않았다(도 30D). 더욱이, Nestin, Muhashi, 및 TUJ1단백질 수준은 세포 밀도에 비례하여 3일째에 모든 배양 조건하에서 현저하게 증가하였다(도 30E, F_{(1,12 )} = 68.84, P < 0.0001, n=3).

놀랍게도, Nestin 단백질의 수준은, HD 조건하에서 3개의 상이한 세포 농도에서 정상 조건에 비하여 높았으며(정상 조건하에 비하여, 1x에서, P = 0.0001, 5x에서 p = 0.002, 및 10x에서 P = 0.0004) HD 배양 조건에서 10x세포 밀도에서 최대치에 도달한다(도 30F, G). 3개의 상이한 세포 농도에서, TUJ1 단백질 수준의 동일한 패턴이 관찰되었으며(정상 조건하에 비하여, 1x에서, P = 0.0007, 5x에서, p = 0.004, 및 10x 에서 P = 0.01) HD 배양 조건에서 10x 세포 밀도에서 최대치에 도달하였다(도 3F, I). Musashi1 단백질 수준은 세포 밀도 비례적으로 증가하였으며(F_(1,12)=16.15, P < 0.001, n=3), 즉, Musashi1 의 단백질 수준이 1x 내지 10x 정상 배양 조건에서 증가(정상 조건에서 1x 부터 5x 까지 P<0.0001 및 5x 부터 10x 까지 P<0.0001)하고, 5x 내지 10x의 HD 배양 조건에서 Musashi1 의 단백질 수준이 증가하였다(HD 배양 조건에서 5x 부터 10x까지 P < 0.0001)(도 30F, H). 이에 반하여, PCNA 단백질 수준은 HD 배양조건하에서 조금 감소하였다(도 30F, J).

12.5. 세포-세포 상호작용의 신경 유도 메커니즘의 확인

세포-세포 상호작용의 신경 유도 메커니즘을 더 조사하기 위하여, 일부 Notch 수용기 및 리간드(ligand)의 mRNA 발현을 RT-PCR을 이용하여 hASC 및 hASC-NPC에서 측정하였다. 처음에, mRNA 수준을 정상 배양 조건에서 배양된 hASC와 HD 배양조건에서 유도된 hASC-NPC 간에 비교하였다. 모든 배양조건에서, FGF4를 포함하는 동일 배지가 3일 동안 사용되었다. RT-PCR 분석은 hASC가 모든 인간 Notch 수용체인 Notch1, Notch2, Notch3, Notch 4는 모두 발현 하며, Notch 리간드는 DLL1, DLL3및 JAG2를 발현하며, DLL4, JAG1는 발현하지 않는다는 것을 나타냈다(도 31 A). 특히, DLL-1 리간드의 발현 수준은 정상적으로 배양된 세포에 비하여 HD 배양된 hASC-NPC에서 훨씬 강력한 반면, JAG2 리간드 및 Notch 수용기의 발현은 두 배양간에 변화가 없으며, 이는 DLL1가 최적의 신경/뉴론 유도에 중요한 인자임을 나타낸다.

DLL1 신경 전달이 어떻게 전사인자를 조절하는지를 검사하기 위하여, 신경계통(neural lineage)의 발달을 조절하고, HES1, HES5, MASH1, NEUROD, 및 NGN2를 포함하는 간세포(progenitor)를 발생시키는, bHLH 단백질의 유전자 발현 패턴을 평가하였다. 반-정량적(Semi-quantitative) RT-PCR은 MASH1 및 NEUROD의 발현 수준이 정상 배양보다 HD 배양에서 증가한다는 것을 나타냈다. HES1의 발현은 정상 및 HD 배양물 모두에서 검출되었다. HD 배양 방법에서, HES1의 발현은 세포 밀도가 증가함에 따라 감소하는 반면, DLL1의 수준은 세포 밀도가 증가함에 따라 증가한다. HES1이 신경발생을 억제하는 음성 bHLH 전사 인자이고, DLL-1가 세포-세포 상호작용을 통해 신경 또는 뉴런 발생에 필수적임을 고려해볼 때, 세포-세포 상호작용의 개선이 신경/뉴런 유도를 증가시길 가능성이 매우 높다(도 31B).

이를 더 확인하기 위하여, Notch 억제제 DAPT(N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-1-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester)의 효과를 이용하여, hASC의 배양 동안 신경/뉴런 유도 조건(FGF4를 포함하는 HD)하에서 DLL1의 결합이 Notch를 블록하는지 여부를 조사하였다(도 31C). 신경 유지에 대한 DAPT 억제제의 효과를 분석하기 위하여, DLL, Nestin, TUJ의 유전자 발현이 DAPT 처리된 세포 및 DMSO 처리된 세포에서 측정되었다.

DAPT 처리된 세포에서 DMSO 처리된 세포에 비하여 DLL1, Nestin, 및 TUJ1가 유의적으로 낮은 수준으로 발현하였다(각각 P=0.009, P=0.003, 및 P=0.02, 각각 n=3). DLL1 신호전달의 상승-조절을 DLL1-FLAG 및 DLL1-Fc를 이용하여 더 측정되었다. hASC 배양에서 FGF4를 수반한 DLL1-FLAG 및 DLL1-Fc의 처리 3일 후, 재조합 DLL1 단백질은 DLL1(DLL1-Flag에서 P=0.0005 및 DLL1-Fc에서 P=0.0002 for DLL1-Fc, 각각 n=3), Nestin(DLL1-Fc 에서 P=0.01, 각각 n=3), 및 TUJ1(DLL1-Flag 에서 P=0.05 및 DLL1-Fc에서 P=0.03, 각각 n=3) 유전자의 mRNA 수준을 상승-조절하였다. 이러한 결과는 세포-세포간 상호작용을 통한 DLL1의 수준이 hASC의 신경/뉴런 분화를 유도하는 중요한 인자임을 나타낸다(도 31D).

FGF4 노출이 다른 계통 세포를 증가시키는지 여부를 시험하기 위하여, 면역조직화학적 어세이를 수행하였다. Brachyury 및 Desmin, 중배엽 마커는 발현하지 않았고, 내배엽 마커인 GATA4는 FGF4 노출여부와 관계 없이 발현하였다(도 32).

12.6. 골수, 지방조직 및 태반으로부터 유도된 MSC의 신경 유도 잠재력의 비교

이 발명을 통한 신규한 신경 유도 방법이 다른 종류의 성체 MSC에 적용가능한지를 더 조사하기 위하여, 성체 인간 골수 MSC(BM-MSCs) 및 지방조직 유래 MSC(AD-MSC)를 3일 동안 정상 조건 또는 HD 조건하에서 25 ng/mL FGF4의 존재 또는 부존재하에서 최초 배양되었다. FGF4를 수반한 정상 또는 HD 배양은 Nestin⁺ 세포를 현저하게 유도(FGF4 부재한 배양 조건과 비교하여 모든 조건 하에서 Ps < 0.0001, 각 실험에서 n = 7)함에도 불구하고, FGF4 포함 FGF4 배지에서의 다른 성체 MSC 에 비하여 hASC에서 Nestin⁺ 세포 비율이 가장 높았으며(F_(3,84)=602.5, P < 0.0001, n=7), 이는 양성 대조군으로 사용한 태아-NPC와 비교할만 하였다. 정상 방법으로 배양된 hASC와 HD 방법으로 배양된 hASC 간에 Nestin⁺수가 가장 큰 차이를 나타냈으며, 이는 hASC로부터 유래되 세포가 FGF4 신경 유도에 매우 민감함을 나타낸다(P < 0.0001, n=7). 태아 NPC의 신경 유도는 FGF4에 거의 영향을 받지 않았다(도 31G, H). 시험된 줄기세포의 반-정량적 RT-PCR 분석은 두 성체 MSC 내에서 DLL1가 mRNA로 거의 또는 전혀 존재하지 않았음을 증명한다; 그러나 hASC 내의 DLL1 수준은 "HD" 배양 조건 하에서만 증가하였고, 태아 NPC는 강력한 DLL1 발현을 나타냈다(도 32I).

12.7. 선조체 이식 부위(striatum graft site)의 이식된 hASC-NPC의 특정

인간-특이적 인간 핵(HN) 마커로의 직접적 면역조직화학 염색을 이용하여 뇌 절편에서 이식 부위를 쉽게 인식하였다. HN-면역반응적 세포는 이식 후 1주일 후에 수직의 바늘 경로(vertical needle tract) 주변에 관찰되었다(도 33A). 이식 후 1 주일 후에서, HN⁺세포의 거의 대부분이 SOX2를 동시발현하였다(도 33B). 이식 후 약 1 및 6주에서 Nestin⁺ 세포는 HN⁺ 세포와 공동-표지(co-labeled) 되었다(도 33C). 이식후 1 주 후 다른 배엽 마커, 예를 들면 BRA(중배엽), Desmin(중배엽), 및 c-KIT(내배엽)은 검출되지 않았다. 이식 후 6주 뒤에, 이동 마커인 DCX에 양성인 세포들은 선조체에 분포되었다. 일부 DCX⁺ 세포는 HN로 공염색되었다(도 33D). 일부 TH⁺ 세포 역시 HN 와 공발현되었으며, 이는 이식된 hASC-NPC가 선조체 부위에서, 신경 및 특히 TH⁺ 뉴런으로 분화함을 나타낸다. 더욱이, 일부 세포는 AADC에 양성이었다(도 33E, F).

12.8. hAMSC-NPC 이식의 기능 손상 개선에의 효과 확인

실험적으로 유도된 파킨슨 증상을 나타내는 hASC, hASC-NPC(HD 조건군), H9-NPC, 및 위대조군의 4 군의 렛트가 행동 어세이에 사용하였다. 운동 손상(motor impairment)의 정도 또는 이식 전 및 이식 후 3, 6, 및 9주 후의 4군의 동물에서의 개선 정도를 평가하기 위하여 암페타민-유도 회전 행동이 측정되었다(도 34A). 그룹간 및 시간간의 현저한 상호영향이 관찰되었다(F_{9, 117} = 1.30, P < 0.04). 이식 후 6 및 9주에서, hASC-NPC군은 위대조군과 유의적으로 상이하였으며(각각 P < 0.03 및 P < 0.003) 동측 회선 행동이, 위 대고군과 비교하여 볼때, hASC 및 hASC-NPC군에서 각각 20 % 및 30 % 감소하였다. hASC-NPC가 이식된 렛트에서, 암페타민-유도 동측 회전은 3주부터 9주까지 계속적으로 감소하였다.

H9-NPC군에서는, 비 대칭적 행동이 6주에서는 약 20 % 낮았지만, 9주에서 약 10 %였다. MFB 의 일방적 병변(unilateral lesion)은 비-손상된 발의 사용이 우선적이다. 비대칭적 행동을 확인하기 위해 사용되는 또 다른 실험인, 실린더 실험이, 투명한 실린더에서의 손상된 앞다리의 사용을 평가하기 위하여 수행되었다(도 34B). 손상된 앞다리 터치 수의 유의적인 효과가 관찰되었다(F_{3, 32} = 2.52, P < 0.05).

hASC-NPC가 이식된 렛트에서는 위대조군에 비하여 손상된 앞발다리의 현저히 증가된 이용을 증명하였다(P < 0.05). 최종적으로, 로타로드 실험을 이용하여 운동 기억을 분석하였다. 가속화된 로드에서 떨어지는 잠재기(lactency)를 측정하였다. 이 실험은 단기기억 및 장기기억 실험으로 분리하여 진행하였다. 단기기억을 측정하기 위하여, 첫날의 3회의 시도가 분석되고, 시도간의 차 경사(slope difference)가 분석되었다. hAMSC-NPC가 이식된 렛트는 잠재기의 점진적 증가를 보였고, 3회의 시도 동안에 로드 위에서 유의적으로 많은 시간을 보냈다(p < 0001, 도 34C).

장기기억 시험에서, 이식 후 21일 및 42일 후부터 시작하는 3일간의 연속일 동안 동물을 동일한 실험을 수행하였다. 기간내의 차 경사(slope difference)가 동물이 어떻게 실험을 수행하는지를 기억하는 시간을 나타낸다. hASC-NPC 군 및 hESC-NPC군의 잠재기는 위대조군 및 hASC군에 비하여, 3일간의 연속일 전반에 걸쳐, 더 길었다(Ps < 0.001). 42일째에, HD 조건하에서 배양된 hASC-NPC가 이식된 군이 다른 군에 비하여 나은 로타로드 수행을 나타낸 반면, 로드 위에서 보내는 시간은 미비하게 감소하였다(Ps < 0.0001, 도 34D).

평형상태에서(equilibrium state)에서, 특이적 결합 위치에서의 좌우 선조체로의 DAT-리간드 결합 및 비특이적 결합 위치에서의 소뇌로의 DAT-리간드 결합을 정량하기 위하여 세포 이식후 9주후PET 분석을 수행하였다. 위대조군은 도파민적 손상 모델(dopaminergic impairment model)의 ¹⁸F FP-CIT PET였다. 도파민적 손상모델의 BP는 6-OHDA 투입 부위(우측 선조체)에서0.06이고, 정상 부위(좌측 선조체)에서 2.70였다. ASI는 1.91였다(도 34E. 좌측). hASC-NPC 세포 이식 후, 증가된 방사성 핵종(radionuclide)의 흡수(uptake)가 선조체 부위에서 검출되었다.

줄기세포 투입 부위(우측 선조체)에서 BP는 1.75이고, 정상 부위에서 2.75였으며, ASI는 0.44였다(도 34E. 중간). 정상 대조군에서, 선조체내의 BP는 2.89(좌측 선조체) 및 2.95(우측 선조체) 이고 ASI는 0.02였다(도 34E. 우측). hASC의 이식 후, 가시적 평가에 따르면, 선조체 부위의 평균수가 유의적으로 높았다. ¹⁸F FP-CIT PET를 이용한 분자 이미징은 6-OHDA가 투입된 부위에서 선조체 병변(striatal lesion)에서 감소된 방사능을 나타냈다. 그러나, 세포 이식 후, BP가 유의적으로 증가하였고, ASI는 유의적으로 감소하였으며, 이는 DAT 터미널 내의 FP-CIT의 회복을 나타낸다. 최종적으로, 세포 이식후, 선조체 및 SN에서의 도파민성 뉴런의 인 비보 생존을 평가하기 위하여 TH 단백질 수준을 측정하였다. 이식 후 6 주 뒤에, TH 단백질은 손상되지 않은 선조체 및 손상되지 않은 SN에서 검출되었으며, hASC -주사군 또는 위-대고군에서의 병변화된 선조체 또는 병변화된SN에서는 검출되지 않았다. 놀랍게도, TH 단백질은 hASC-NPC 주사군에서는 병변화된 선조체 및 SN에서 매주 관찰되었다(도 34F).

hASC-NPC가 테라토마를 형성하는지 여부를 검사하기 위하여, hASC-NPC가 SCID 마우스에 이식되었다. 6주 및 32 주에서 테라토마 형성은 관찰되지 않았다(도 35A, B).

<110> CHA university <120> Placenta derived mesenchymal stem cell or neural progenitor induced from placenta derived stem cell and pharmaceutical composition, treatment kit and treatment method comprising the same <130> PN099681 <160> 32 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer sequence of mIL-1 <400> 1 cccaagcaat acccaaagaa 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence of mIL-1 <400> 2 gcttgtgctc tgcttgtgag 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer sequence of mTNF-a <400> 3 gctccagtga attcggaaag 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence of mTNF-a <400> 4 gattatggct cagggtccaa 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer sequence of mIL-10 <400> 5 cagggatctt agctaacgga aa 22 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence of mIL-10 <400> 6 gctcagtgaa taaatagaat gggaac 26 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer sequence of mTGF-b <400> 7 caagggctac catgccaac 19 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence of mTGF-b <400> 8 agggccagga ccttgctg 18 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer sequence of mMMP-9 <400> 9 tgccgtcgaa gggatacc 18 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence of mMMP-9 <400> 10 gacccgaagc ggacattgt 19 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer sequence of mIDE <400> 11 gaagacaaac gggaataccg tg 22 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence of mIDE <400> 12 ccgctgagga cttgtctgtg 20 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer sequence of mGAPDH <400> 13 gtgagggaga tgctcagtgt t 21 <210> 14 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence of mGAPDH <400> 14 ggctggcatt gctct 15 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer sequence of hTGF-b <400> 15 aaattgaggg ctttcgcctt agcg 24 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence of hTGF-b <400> 16 tcttctccgt ggagctgaag caat 24 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer sequence of hMMP-9 <400> 17 ttgacagcga caagaagtgg 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence of hMMP-9 <400> 18 gccattcacg tcgtccttat 20 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer sequence of hIDE <400> 19 ctcggaacct tgcttcaaca c 21 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence of hIDE <400> 20 ggcccgctga agacgata 18 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer sequence of hGAPDH <400> 21 agggctgctt ttaactctgg t 21 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence of hGAPDH <400> 22 ccccacttga ttttggaggg a 21 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer sequence of mPEDF <400> 23 gcccagatga aagggaagat t 21 <210> 24 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence of mPEDF <400> 24 tgagggcact gggcatt 17 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer sequence of mAng-1 <400> 25 cctctggtga atattggctt ggga 24 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence of mAng-1 <400> 26 agcatgtact gcctctgact ggtt 24 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer sequence of hPEDF <400> 27 tatcacctta accagccttt catc 24 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence of hPEDF <400> 28 gggtccagaa tcttgccaat g 21 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer sequence of hAng-1 <400> 29 ccgtgaatct ggagccgttt g 21 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence of hAng-1 <400> 30 aagcccgaca gtcagtggag 20 <210> 31 <211> 19 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA for TGF-b1 <220> <223> siRNA for TGF-b <400> 31 cagaguacac acagcauau 19 <210> 32 <211> 19 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA for TGF-b1 <220> <223> siRNA for TGF-b1 <400> 32 auaugcugug uguacucug 19

Claims (21)

1. CD 9⁺, CD13⁺ 및 CD 90⁺인 태반 유래 중간엽 줄기 세포.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 세포는 SSEA4^-, TRA-1-60^-, TRA-1-81^-, 및 CD34^-인 것인 태반 유래 중간엽 줄기 세포.
3. 청구항 1에 있어서, 상기 세포는 CD200⁺ 인 것인 태반 유래 중간엽 줄기 세포.
4. 청구항 1에 있어서, 상기 태반은 양막, 융모막, 탈락막 및 탯줄 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 태반 유래 중간엽 줄기 세포.
5. 청구항 1의 태반 유래 중간엽 줄기 세포를 포함하는 신경질환 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
6. 청구항 5에 있어서, 상기 신경질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, HIV 치매, 간질, 정신분열증, 우울증, 조울증, 신경 발생장애, 자폐증, 뇌졸중, 루게릭, 헌팅턴병, 다발성경화증, 뇌손상, 뇌성 마비 또는 척수 손상인 것인 조성물.
7. 청구항 1의 태반 유래 중간엽 줄기 세포를 포함하는 혈관신생 관련 질환 예방 또는 치료용 약학적　조성물.
8. 청구항 7에 있어서, 상기 혈관신생 관련 질환은 암, 당뇨병성　망막증, 미숙아　망막증, 각막 이식 거부, 신생혈관 녹내장, 홍색증, 증식성　망막증, 건선, 혈우병성 관절, 아테롬성 동맥경화 플라크 내에서의 모세혈관 증식, 켈로이드, 상처 과립화, 혈관 접착, 류마티스 관절염, 골관절염, 자가면역 질환, 크론씨병, 재발협착증, 아테롬성 동맥경화, 장관 접착, 캣 스크래치 질환, 궤양, 간경병증, 사구체신염, 당뇨병성 신장병증, 악성 신경화증, 혈전성 미소혈관증, 기관 이식 거부, 신사구체병증, 당뇨병 또는 관절염인 것인 조성물.
9. 청구항 5 또는 청구항 7의 약학적 조성물을 포함하는 신경 질환 또는 혈관 신생 관련 질환 치료용 키트.
10. 청구항 5 또는 청구항 7의 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 신경 질환 또는 혈관 신생 관련 질환의 치료 또는 예방 방법.
11. 청구항 10에 있어서, 상기 투여는 경구, 직장, 정맥, 비강, 복강, 피하 또는 국소 투여인 것인 치료 또는 예방 방법.
12. 청구항 10에 있어서, 개체에 투여 전에 상기 태반 유래 중간엽 줄기 세포를 폴리오르니틴 및 피브로넥틴으로 코팅된 디쉬에 배양하는 단계; 및
    상기 배양된 세포를 FGF4 및 헤파린을 포함하는 배지에, 1% 내지 7%의 CO₂ 조건에서 인큐베이션 하는 단계를 더 포함하는 것인 치료 또는 예방 방법.
13. 태반 유래 줄기세포로부터 분화된 CD 9⁺, CD13⁺, 및 CD 90⁺인 신경 전구 세포.
14. 청구항 13에 있어서, 상기 신경 전구 세포는 SSEA-4^-, TRA-1-60^-, TRA-1-81^-, SSEA-1^-, CD34^- 및 CD44⁺인 것인 신경 전구 세포.
15. 청구항 13에 있어서, 상기 태반은 양막, 융모막, 탈락막 및 탯줄 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 신경 전구 세포.
16. 청구항 13에 있어서, 상기 태반 유래 줄기세포는 상피 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포인 것인 신경 전구 세포.
17. 청구항 13에 있어서, 상기 신경 전구 세포는 태반 유래 줄기세포를 FGF4존재 하에서 고밀도 배양하여 유도한 것인 신경 전구 세포.
18. 청구항 13 내지 17 중 어느 한 항의 신경 전구 세포를 포함하는 신경질환 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
19. 청구항 18에 있어서, 상기 신경질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, HIV 치매, 간질, 정신분열증, 우울증, 조울증, 신경 발생장애, 자폐증, 뇌졸중, 루게릭, 헌팅턴병, 다발성경화증, 뇌손상, 뇌성 마비 또는 척수 손상인 것인 조성물.
20. 청구항 18의 약학적 조성물을 포함하는 신경질환 치료용 키트.
21. 청구항 18의 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 신경 질환 또는 혈관 신생 관련 질환의 치료 또는 예방 방법.

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