KR20140101974A

KR20140101974A - Composition comprising rhaponticin for preventing or treating of vascular disease

Info

Publication number: KR20140101974A
Application number: KR1020130015262A
Authority: KR
Inventors: 유승우; 오세은
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2013-02-13
Filing date: 2013-02-13
Publication date: 2014-08-21

Abstract

The present invention relates to a novel use of a rhaponticin composition and, more specifically, to a composition comprising rhaponticin as an active ingredient for preventing or treating vascular diseases. The rhaponticin composition according to the present invention increases generation of nitric oxide through an effect of inhibiting arginase activity, suppresses generation of free radicals at the same time, and resolves dysfunction of vascular endothelial cells, thereby a composition comprising the same as an active ingredient can be usefully used as a drug or a functional health food for preventing and treating vascular diseases.

Description

[0001] The present invention relates to a composition for preventing or treating vascular diseases,

본 발명은 라폰티신 화합물의 신규한 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 라폰티신 화합물을 유효성분으로 포함하는 혈관 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. More particularly, the present invention relates to a composition for the prevention or treatment of vascular diseases, which comprises a lapontisin compound as an active ingredient.

생체 내에서 혈액은 복잡하고 정교한 조절 시스템에 의해 항상 평형을 이루고 있어 정상적인 상태에서는 출혈이나 혈전 등에 의해 흐름이 방해받지 않는다. 그러나 여러 가지 요인으로 이러한 평형상태가 깨지면 혈관의 흐름이 원활하지 못하여 혈관 질환들이 발생하게 된다. 혈관질환 중 가장 대표적인 경우가 동맥경화증인데, 심장이나 뇌 등 중요장기에 허혈성 상태를 초래하여 심근경색이나 뇌경색을 일으키는 매우 위험한 질환 중 하나이다.In vivo, the blood is always balanced by a complex and elaborate regulatory system, so that the flow is not interrupted by bleeding or thrombosis under normal conditions. However, when the equilibrium state is broken due to various factors, the flow of blood vessels is not smooth and blood vessel diseases occur. The most common type of vascular disease is arteriosclerosis, which is one of the most dangerous diseases that cause myocardial infarction or cerebral infarction by causing ischemic conditions in important organs such as the heart and brain.

한편, 심장과 혈관은 전신에 산소와 영양소를 공급하는 기관으로 인간이 생명을 유지하는데 없어서는 안 되는 핵심기관이라 할 수 있다. 따라서 여러 가지 원인으로 심혈관계에 이상이 생겨 각 조직 및 기관으로의 혈액과 산소공급이 원활하지 못할 경우 국소부위 조직괴사는 물론 심한 경우 생명에 위협을 주는 위험한 질환을 야기하게 된다. 심혈관 질환은 특히 나이가 들어감에 따라 인체의 노화 현상으로 더욱 빈번해진다. 이러한 이유로 심혈관질환의 예방과 치료가 매우 중요해지고 있다.On the other hand, the heart and blood vessels supply oxygen and nutrients to the whole body, which is an essential part of human life. Therefore, if blood and oxygen supply to each tissue or organ is not smooth due to various causes of cardiovascular diseases, it may cause dangerous disease which threatens to life as well as local necrosis of tissue. Cardiovascular disease is becoming more frequent as a result of aging of the human body, especially as it gets older. For this reason, prevention and treatment of cardiovascular diseases is becoming very important.

현재까지 심혈관 질환의 치료제로 질산(Nitrate)계 제제인 슈와즈(Schwarz)사의 ISMO 등이 소개되어 있으나, 이 제제는 효과는 뛰어나나 체위성저혈압, 심계항진 등의 부작용이 있어, 저혈압, 녹내장 등의 환자에게는 신중히 사용해야 하며, beta-차단제로 아스트라(Astra)사의 베타록(BETALOC)등이 소개되어 있는데, 이 제제 역시 효과는 확실하나 급격한 심장억제 등으로 울혈성심부전환자 등은 신중히 사용해야 한다.To date, the ISMO of Schwarz has been introduced as a treatment for cardiovascular disease. However, this formulation has excellent effects and has side effects such as hypotension and palpitations. Therefore, hypotension, glaucoma, etc. (BETALOC) as a beta-blocker. This formulation is also effective, but patients with congestive heart failure should be used with caution due to rapid cardiac suppression.

한편, 내피 산화질소의 정상적인 생성은 혈관 기능의 유지를 위해 중요하다. 내피세포의 산화질소 방출이 증가하면 평활근(smooth muscle) 세포의 신축성 감소 및 저하된 혈관 저항(vascular resistance)을 초래한다. 그러나 고혈압 및 고지혈증의 상태 하에서 내피의 기능이상은 산화질소 방출의 현저한 감소를 발생시키며, 그 결과로 혈관수축 및 혈관경련이 증가되며, 단핵세포 및 LDL 침윤의 확대되고, 혈관 평활근 세포가 증식하며, 산화적 스트레스의 증가 및 혈소판 응집의 증가를 초래한다. 따라서 내피의 기능 및 산화질소 대사를 회복시키는 물질은 심장동맥 질환 및 심장 기능 장애가 포함하는 혈관 질환의 치료에 있어서 효과적이라 할 수 있다.On the other hand, normal production of endothelial nitric oxide is important for maintenance of vascular function. Increased release of nitric oxide in endothelial cells leads to decreased elasticity of smooth muscle cells and decreased vascular resistance. However, endothelial dysfunction under hypertensive and hyperlipidemic conditions causes a marked reduction in nitric oxide release, resulting in increased vasoconstriction and vasospasm, increased mononuclear cell and LDL infiltration, proliferation of vascular smooth muscle cells, Leading to increased oxidative stress and increased platelet aggregation. Therefore, endothelial function and substances restoring nitric oxide metabolism are effective in the treatment of vascular diseases including cardiac artery disease and cardiac dysfunction.

산화질소를 합성하는 대부분의 세포들은 아르기나아제(arginase)라는 효소도 갖고 있는데, 아르기나아제는 L-아르기닌(arginine)의 가수분해를 촉매하여 L-오르니틴(ornithine)과 요소(urea)를 생성하는 효소 그룹이다. 아르기나아제 I 은 세포내에서 일정하게(constitutively) 발현되며, 아르기나아제 II는 내독소(endotoxin)에 의해 유도되는 것으로 알려져 있다. 또한 상기 효소들은 염증(inflammatory) 조건에서 산화질소의 생산 변경에 매우 중요한 역할을 하지만, 산화질소의 일정한 합성에도 중요한 역할을 한다.Most of the cells that synthesize nitric oxide also have an enzyme called arginase, which catalyzes the hydrolysis of L-arginine to produce L-ornithine and urea It is an enzyme group to generate. Arginase I is constitutively expressed in cells and arginase II is known to be induced by endotoxin. These enzymes play an important role in the production of nitric oxide under inflammatory conditions, but also play an important role in the synthesis of nitric oxide.

반면, 아르기나아제(arginase)는 또한 공통 기질인 L-아르기닌(Arginine)의 이용을 통해 경쟁적으로 NOS를 저해하는 작용도 한다(Berkowitz et al., 2003; Holowatz et al., 2006; Morris et al., 1998; Peyton et al., 2009; Simon et al., 2003; Steppan et al., 2006). 마크로파지(macrophages), 간세포(hepatocytes) 및 혈관평활근세포(vascular smooth muscle cells)에서 아르기나아제I의 발현 및 기능은 lipopolysaccharide (LPS), IL-13, 변경된 산소분압 및 관상 동맥(coronary arteries)의 풍선확장술(balloon dilatation)에 의해 자극될 수 있으며(Chicoine et al., 2004; Klasen et al., 2001; Louis et al., 1998; Modolell et al., 1995; Morris et al., 2004; Nelin et al., 2007; Que et al., 1998; Ryoo et al., 2006), 또한 아르기나아제 II의 활성 및 발현은 OxLDL, LPS, TNF-a, IFN-, 8-bromo-cGMP 및 hypoxia 를 포함한 다양한 혈관 인자들에 의해 유도될 수 있다.On the other hand, arginase also competitively inhibits NOS through the use of a common substrate, L-arginine (Berkowitz et al., 2003; Holowatz et al., 2006; Morris et al Peyton et al., 2009; Simon et al., 2003; Steppan et al., 2006). The expression and function of arginase I in macrophages, hepatocytes and vascular smooth muscle cells was assessed by the expression of lipopolysaccharide (LPS), IL-13, altered oxygen partial pressure and coronary arteries (Nelin et al., 2004), which can be stimulated by balloon dilatation (Chicoine et al., 2004; In addition, the activity and expression of arginase II was determined by a variety of methods including OxLDL, LPS, TNF-a, IFN-, 8-bromo-cGMP and hypoxia Can be induced by vascular factors.

한편 최근 보고된 자료에 의하면 아르기나아제의 억제는 산화질소의 생산을 활발히 증대시키며, 정상적인 심장 기능 및 아테롬생성(atherogenesis), 노화, 발기부전 및 겸상 적혈구 빈혈증(sickle cell disease)에서 혈관 기능 장애에 유용한 효과를 가져오는 것으로 밝혀진 바 있다(Berkowitz et al., 2003; Bivalacqua et al.,2001; Bivalacqua et al., 2007; Hsu et al., 2007; Morris et al., 2004; Steppan et al., 2006; White et al., 2006; Xu et al., 2007).Recent reports have shown that inhibition of arginase activity can actively increase the production of nitric oxide and is associated with normal cardiac function and atherogenesis, aging, erectile dysfunction and vascular dysfunction in sickle cell disease 2007; Morris et al., 2004; Steppan et al., 2007), which has been shown to produce beneficial effects (Berkowitz et al., 2003; Bivalacqua et al. 2006; White et al., 2006; Xu et al., 2007).

따라서 아르기나제의 활성을 억제하는 물질의 경우 혈관 기능 장애를 개선 및 치료하는데 유용하게 사용할 수 있을 것으로 예측하고 있으나, 종래 개발된 아르기나제 활성 억제제의 경우, 부작용이 있으며 그 효과도 미비하여 새로운 아르기나제 활성 억제제의 개발이 시급한 실정이다.Therefore, it is predicted that a substance that inhibits the activity of arginase may be useful for improving and treating vascular dysfunction. However, the arginase activity inhibitor conventionally developed has side effects and its effect is insufficient. The development of an arginase activity inhibitor is urgently needed.

한국등록특허 제1156636호Korean Patent No. 1156636 한국공개특허 제2012-0082047호Korea Patent Publication No. 2012-0082047

이에 본 발명자들은 라폰티신 화합물이 혈관내피세포에서 아르기나아제의 활성을 억제하고, 산화질소의 생성은 증가시키며 동시에 ROS의 생산을 억제하는 활성을 통해 혈관 질환을 예방 또는 치료할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.Therefore, the present inventors confirmed that the lapontisin compound inhibits the activity of arginase and agase in vascular endothelial cells, increases the production of nitric oxide, and simultaneously prevents or treats vascular diseases through its activity of inhibiting the production of ROS Thus completing the present invention.

따라서 본 발명의 목적은 라폰티신 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 혈관 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다. It is therefore an object of the present invention to provide a composition for the prevention or treatment of vascular diseases containing as an active ingredient a laponticin compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

또한, 본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 상기 조성물을 유효성분으로 함유하는 혈관 질환의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a health functional food for preventing or ameliorating vascular diseases containing the composition according to the present invention as an active ingredient.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 라폰티신(Rhaponticin) 화합물 및 그의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군 중에서 선택되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 혈관 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. In order to accomplish the above object, the present invention provides a composition for preventing or treating vascular diseases comprising, as an active ingredient, a compound selected from the group consisting of a Rhaponticin compound and a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 라폰티신 화합물은 아르기나제의 활성 억제, 산화질소의 생성 증가 또는 활성산소종(ROS)의 생성 억제 효과를 가질 수 있다. In one embodiment of the present invention, the laponicsin compound may have an effect of inhibiting the activity of arginase, increasing the production of nitric oxide or inhibiting the production of reactive oxygen species (ROS).

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 아르기나제는 아르기나제 I 및 아르기나아제 II일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the arginase may be arginine I and arginase II.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 혈관 질환은 고혈압, 동맥경화증, 심장발작, 뇌졸중, 암, 노화, 발기부전, 겸상 적혈구 빈혈증(sickle cell disease), 당뇨병, 협심증, 심근경색, 관절염, 당뇨병성 망막증, 건선, 신생혈관 녹내장, 혈관종 및 허혈성 질환으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the vascular disease is selected from the group consisting of hypertension, arteriosclerosis, heart attack, stroke, cancer, aging, erectile dysfunction, sickle cell disease, diabetes, angina, myocardial infarction, arthritis, Retinopathy, psoriasis, neovascular glaucoma, angioma, and ischemic diseases.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 라폰티신 화합물은 조성물 총 부피에 대하여 0.1 ~ 150 uM의 농도로 포함될 수 있다. In one embodiment of the present invention, the laponisin compound may be contained at a concentration of 0.1 to 150 uM based on the total volume of the composition.

또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 혈관 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 유효성분으로 함유하는 혈관 질환의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품을 제공한다. The present invention also provides a health functional food for preventing or ameliorating a vascular disease comprising the composition for preventing or treating vascular diseases according to the present invention as an active ingredient.

본 발명에 따른 라폰티신 화합물은 아르기나아제의 활성을 억제하는 작용을 통해 산화질소(NO)의 생성은 증가시키고 동시에 활성산소의 생성은 억제함으로써 혈관내피세포의 기능장애를 개선시킬 수 있으므로 이를 유효성분으로 함유하는 조성물은 혈관 질환의 예방 및 치료를 위한 의약품 또는 건강기능식품으로 유용하게 사용할 수 있다. The laponticin compound according to the present invention can improve the production of nitrogen oxides (NO) through the action of inhibiting arginase activity and at the same time, by inhibiting the production of active oxygen, thereby improving the vascular endothelial dysfunction The composition containing the active ingredient can be usefully used as a medicine or a health functional food for the prevention and treatment of vascular diseases.

도 1은 각기 다른 농도의 라폰티신 화합물을 처리한 후 아르기나제 I 및 아르기나아제 II의 활성 억제 정도를 마우스의 신장 조직 및 간 조직을 대상으로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 마우스 대동맥을 대상으로 본 발명에 따른 라폰티신 화합물을 처리한 후, NO 생성정도를 대조군과 비교하여 나타낸 것이고(A), 활성산소(ROS) 억제 정도를 대조군과 비교하여 그래프로 나타낸 것이다(B).Fig. 1 shows the results of measurement of the inhibitory activity of arginine I and arginase II on kidney tissues and liver tissues of mice after treatment with different concentrations of lapontisin compounds.
FIG. 2 is a graph showing the degree of NO production after treatment with a raffoxin compound according to the present invention in a mouse aorta compared with a control (A), and the degree of inhibition of reactive oxygen species (ROS) (B).

본 발명은 라폰티신(Rhaponticin) 화합물의 신규한 약학적 용도를 규명한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 라폰티신 화합물 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 혈관 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.The present invention discloses a novel pharmaceutical use of a rhaponticin compound. More specifically, the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising at least one compound selected from the group consisting of a laponisin compound and a pharmaceutically acceptable salt thereof, The present invention provides a composition for preventing or treating vascular diseases.

본 발명의 라폰티신 화합물은 3',5-dihydroxy-4'-methoxystilbene 3- O-beta-D-glucopyranoside으로 명명되며, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물이다. The laportisin compound of the present invention is named 3 ', 5-dihydroxy-4'-methoxystilbene 3-O-beta-D-glucopyranoside and is a compound represented by the following formula (1).

또한, 본 발명에 따른 라폰티신 화합물은 염, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하며, 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.In addition, the laponisin compound according to the present invention can be used in the form of a salt, preferably a pharmaceutically acceptable salt. The salt is preferably an acid addition salt formed by a pharmaceutically acceptable free acid, and the free acid may be an organic acid or an inorganic acid. The organic acids include, but are not limited to, citric, acetic, lactic, tartaric, maleic, fumaric, formic, propionic, oxalic, trifluroacetic, benzoic, gluconic, methosulfonic, glycolic, succinic, Glutamic acid and aspartic acid. The inorganic acid includes, but is not limited to, hydrochloric acid, bromic acid, sulfuric acid, and phosphoric acid.

본 발명에 따른 라폰티신 화합물은 천연으로부터 분리되거나 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조할 수 있으며, 보다 바람직하게는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 알려진 추출 및 정제 방법을 이용하여 대황으로부터 추출 및 분리할 수 있다. The laportisin compound according to the present invention can be isolated from nature or can be prepared by chemical synthesis methods known in the art and more preferably extracted from rhubarb using extraction and purification methods known to those skilled in the art And can be separated.

본 발명의 일실시예에서는 대황(大黃, Rheum palmatum)으로부터 분리 및 정제된 라폰티신 화합물을 가톨릭 대학교로부터 수득하여 실험에 사용하였는데, 대황은 성질이 몹시 차며 맛은 쓰고 독이 없는 것으로 알려져 있으며, 어혈과 월경이 나오지 않는 것에 효과가 있고 대소변을 잘 통하게 하고 열을 식혀주며, 월경이상, 혈뇨, 급성복막염, 적취, 토혈, 수종, 식적비만, 세균성 하리,퇴행성 관절염, 열병, 열이 있으면서 헛소리하는 증상, 각기, 종창, 화상 등에 사용하는 것으로 알려져 있다. 또한, 한방에서는 기원전부터 소염성의 하제(下劑)로 쓰고 있으며 여러 가지 처방에 배합하여 사용하고 있다.In one embodiment of the present invention, the lapontisin compound isolated and purified from Daumhang (Rheum palmatum) was obtained from the Catholic University of Korea and used in the experiment. It is known that rhubarb is very cold in properties, It is effective in preventing ejaculation and menstruation. It has good effect on feces, coolness and heat, and it can cramp with hemorrhoids, hematuria, acute peritonitis, fever, hematemesis, species, obesity, bacterial hari, degenerative arthritis, fever and fever It is known to be used for symptoms, each phase, swelling, burns and the like. In addition, it has been used as an anti-inflammatory agent since BC and has been used in various prescriptions.

상기 대황으로부터 본 발명에 따른 화합물을 함유하는 추출물을 수득하기 위한 적절한 용매로는 물 또는 유기용매를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol), 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있으며, 추출방법은 열수추출, 환류냉각 추출, 냉침 추출법 등 당업계에서 사용되는 방법이라면 모두 사용가능하다.As an appropriate solvent for obtaining the extract containing the compound according to the present invention from the rhubarb, water or an organic solvent may be used. Preferably, the extract may be purified water, methanol, ethanol, propanol, isopropanol butanol, isopropanol, butanol, acetone, ether, benzene, chloroform, ethyl acetate, methylene chloride, hexane and cyclohexane. cyclohexane, etc., can be used alone or in combination. The extraction method can be used in any of the methods used in the art such as hot water extraction, reflux cooling extraction, and cold extraction.

또한, 대황으로부터 본 발명의 라폰티신 화합물의 분리 및 정제는 실리카겔(silica gel)이나 활성 알루미나(alumina)등의 각종 합성수지를 충진한 컬럼 크로마토그라피(column chromatography) 및 고속액체크로마토그라피(HPLC) 등을 단독으로 혹은 병행하여 사용할 수 있다. 그러나 유효성분의 추출 및 분리정제 방법은 반드시 상기한 방법에 한정되는 것은 아니다.Separation and purification of the laportisin compound of the present invention from rhubarb can be carried out by column chromatography and high performance liquid chromatography (HPLC), which pack various synthetic resins such as silica gel and activated alumina Can be used alone or in parallel. However, the method of extracting and separating and purifying the active ingredient is not necessarily limited to the above-mentioned method.

본 발명에서는 대황으로부터 유래된 라폰티신 화합물이 아르기나제의 활성을 억제함을 통해 산화질소의 생성을 증가시키고 활성산소종(ROS)의 생성을 억제하여 혈관질환을 예방 또는 치료할 수 있는 효과가 있음을 처음으로 규명하였다. In the present invention, the raffitisic compound derived from rhubarb inhibits the activity of arginase, thereby increasing the production of nitrogen oxides and inhibiting the production of reactive oxygen species (ROS), thereby preventing or treating vascular diseases For the first time.

심혈관계 질환이 발병되는 주요 인자로서는 유전적 요인, 생활습관, 당뇨의 합병증 등 매우 다양하게 알려져 있으나, 현대의학적 관점에서는 활성산소종 (Reactive Oxygen Species, ROS)과 혈관내 산화성 스트레스의 증가 및 내피 세포형 산화질소 합성효소(endothelial type Nitric Oxide Synthase, eNOS)의 활성감소로 인한 산화질소의 감소에 의한 것으로 알려져 있다.The main factors that cause cardiovascular diseases are genetic factors, lifestyle, and diabetic complications. However, in modern medical terms, reactive oxygen species (ROS) and increased endothelial cell stress (ENOS) activity of endothelial-type Nitric Oxide Synthase (eNOS).

특히, 내피 세포형 산화질소 합성효소에 의해 생성되는 산화질소는 강력한 혈관이완 인자인 동시에 혈소판응집, 혈관근육세포 증식, 단핵구 세포의 혈관침착, 동맥경화 관련 단백질 발현을 저해하여 전체적인 심혈관계의 항상성 조절에 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며(Forstermann et al., Circulation, 113:1708-1714, 2006), 또한 활성 산소종은 접착 분자 발현의 조절, 혈관평활근세포 (VSMC, vascular smooth muscle cells)의 증식과 이동 자극 및 산화력이 있는 지단백질(lipoprotein) 조절 등을 야기하여 심혈관계 질환을 발생시키는 것으로 알려져 있다.In particular, nitric oxide produced by endothelial nitric oxide synthase is a potent vasodilator and inhibits platelet aggregation, vascular myocyte proliferation, vascular deposition of mononuclear cells, and atherosclerosis-related protein expression, (Forstermann et al., Circulation, 113: 1708-1714, 2006). In addition, reactive oxygen species play a role in the regulation of adhesion molecule expression, the proliferation of vascular smooth muscle cells And lipoprotein regulation with mobility and oxidative potential, leading to cardiovascular disease.

한편, 본 발명에서는 라폰티신 화합물이 아르기나제의 활성을 억제하는 활성이 있다는 사실을 처음으로 규명하였다는 특징이 있는데, 상기 아르기나제의 활성 억제는 최근 보고된 자료에 의하면 산화질소의 생산을 증가시켜 혈관 기능 장애에 유용한 효과가 있는 것으로 밝혀진 바 있다. In the present invention, it is firstly characterized that the lapontisin compound has an activity of inhibiting the activity of arginase. The inhibition of the activity of arginase according to the recently reported data shows that production of nitric oxide Which is useful for vascular dysfunction.

따라서 본 발명자들은 본 발명에 따른 라폰티신 화합물이 아르기나제의 활성 억제를 통해 혈관 질환을 예방 및 치료할 수 있다는 사실을 예상할 수 있었다. Therefore, the inventors of the present invention have been able to anticipate that the laportisine compound according to the present invention can prevent and treat vascular diseases through inhibition of arginase activity.

보다 구체적으로, 본 발명의 일실시예에 따르면 라폰티신 화합물의 아르기나제 활성 억제 작용을 확인하기 위해, 마우스의 간 및 신장으로부터 각 조직을 분리한 후, 조직 용해물에 처리하기 전에 아르기나아제 I 및 아르기나아제 II의 항체를 이용하여 아르기나아제의 이성질체의 존재 여부를 확인하였으며, 본 발명에 따른 라폰티신 화합물을 농도별로 처리한 후 아르기나제의 활성을 측정한 결과, 본 발명의 라폰티신 화합물은 마우스의 간 및 신장 조직에서 아르기나제 I 및 아르기나아제 II에 대하여 모두 농도 의존적으로 효소 활성을 억제하는 것으로 나타났다(도 1 참조).More specifically, according to one embodiment of the present invention, in order to confirm the arginase activity inhibiting action of the laponicsin compound, each tissue is separated from mouse liver and kidney, The presence of arginine or its isomer was confirmed using an antibody of agase I and arginase II. After the treatment of the concentration of the laponticin compound according to the present invention, the activity of arginase was measured. As a result, In the liver and kidney tissues of mice showed that both arginase I and arginase II inhibited enzyme activity in a concentration-dependent manner (see FIG. 1).

다른 일실시예에 따르면 라폰티신 화합물을 처리한 대동맥의 내피 세포에서 O₂ ^-- 민감성 시료인 DHE를 사용하여 O₂ ^-발생을 측정한 결과, DHE 형광세기는 처리한 라폰티신 화합물의 처리에 의하여 감소하는 것으로 나타났으며, DHE 신호는 MnTBAP 처리 시 완전히 억제되는 것으로 나타났다. 또한, 산화질소(NO)는 라폰티신 화합물 처리에 의해 증가되는 것을 확인하여 아르기나아제가 NOS의 조절을 위한 일반적인 기작으로 L-아르기닌 기질을 제한함으로써 NOS에 의한 NO 생성을 조절할 수 있다는 새로운 개념과 부합함을 알 수 있었다(도 2 참조).-Sensitive sample, using the DHE O ₂ ^- ^- As a result of measuring the occurrence, DHE fluorescence intensity is treated in a process called Ponti new compounds O ₂ la, according to another embodiment example, in endothelial cells treated with Ponti new compound aorta , And the DHE signal was completely inhibited by MnTBAP treatment. In addition, it has been confirmed that nitric oxide (NO) is increased by treatment with laportisin compound, and thus arginase inhibits the production of NO by NOS by limiting the L-arginine substrate as a general mechanism for the regulation of NOS (See FIG. 2).

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명은 본 발명에 따른 라폰티신 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 혈관 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있으며, 상기 화합물은 아르기나제의 활성억제, 산화질소의 생성 증가 또는 활성산소종(ROS)의 생성 억제효과를 통해 혈관 질환을 예방 및 치료할 수 있다.Accordingly, the present invention provides a composition for preventing or treating vascular disease, which comprises the compound of the present invention or a salt thereof as an active ingredient, wherein the compound inhibits the activity of arginase, Vascular diseases can be prevented and treated by increasing nitrogen production or inhibiting the production of reactive oxygen species (ROS).

상기에서 본 발명의 화합물이 그 활성을 억제할 수 있는 아르기나제는 아르기나제 I 및 아르기나제 II일 수 있다. In the above, the arginase in which the compound of the present invention can inhibit its activity may be arginine I and arginine II.

본 발명에서 상기 혈관 질환은 이에 제한되지는 않으나, 고혈압, 동맥경화증, 심장발작, 뇌졸중, 암, 노화, 발기부전, 겸상 적혈구 빈혈증(sickle cell disease), 당뇨병, 협심증, 심근경색, 관절염, 당뇨병성 망막증, 건선, 신생혈관 녹내장, 혈관종 및 허혈성 질환으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.In the present invention, the vascular diseases include, but are not limited to, hypertension, arteriosclerosis, heart attack, stroke, cancer, aging, erectile dysfunction, sickle cell disease, diabetes, angina, myocardial infarction, arthritis, Retinopathy, psoriasis, neovascular glaucoma, angioma, and ischemic disease.

따라서 본 발명에 따른 혈관 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 혈관 질환을 치료할 수 있는 약학적 조성물로 사용될 수 있다. Therefore, the composition for preventing or treating vascular diseases according to the present invention can be used as a pharmaceutical composition for treating vascular diseases.

또한, 본 발명에서 상기 라폰티신 화합물은 조성물 총 부피에 대하여 0.1~150 uM의 농도로 포함될 수 있다. In the present invention, the lapontisin compound may be contained at a concentration of 0.1 to 150 uM based on the total volume of the composition.

본 발명에 따른 상기 혈관 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 라폰티신 화합물을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 유효한 양"이란 혈관질환을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다. 본 발명에 따른 라폰티신 화합물의 약학적으로 유효한 양은 0.5 ~ 100 mg/day/체중kg, 바람직하게는 0.5 ~ 5 mg/day/체중kg이다.The composition for the prevention or treatment of vascular diseases according to the present invention may contain a pharmaceutically effective amount of a laponicin compound alone or may include one or more pharmaceutically acceptable carriers, excipients or diluents. The term "pharmaceutically effective amount" as used herein refers to an amount sufficient to prevent, ameliorate, and treat a vascular disease. The pharmaceutically effective amount of the laponticin compound according to the present invention is 0.5 to 100 mg / day / kg body weight, preferably 0.5 to 5 mg / day / kg body weight.

그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 혈관질환의 증상 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.However, the pharmaceutically effective amount may be appropriately changed depending on the symptom of the vascular disease, the age, body weight, health condition, sex, administration route and treatment period of the patient.

상기 본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르 브산과 같은 항산화제가있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995). The pharmaceutical composition according to the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier. The term "pharmaceutically acceptable" as used herein refers to a composition that is physiologically acceptable and does not normally cause an allergic reaction such as gastrointestinal disorder, dizziness, or the like when administered to humans. Pharmaceutically acceptable carriers include, for example, carriers for oral administration such as lactose, starch, cellulose derivatives, magnesium stearate, stearic acid and the like, water for parenteral administration such as water, suitable oils, saline, aqueous glucose and glycols And may further contain stabilizers and preservatives. Suitable stabilizers include antioxidants such as sodium hydrogen sulfite, sodium sulfite or ascorbic acid. Suitable preservatives include benzalkonium chloride, methyl- or propyl-paraben and chlorobutanol. Other pharmaceutically acceptable carriers can be found in Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1995).

본 발명에 따른 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는, 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있다.The pharmaceutical composition according to the present invention, together with a pharmaceutically acceptable carrier as described above, may be formulated into a suitable form according to a method known in the art. That is, the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared in various parenteral or oral administration forms according to known methods, and isotonic aqueous solutions or suspensions are preferred for injection formulations typical of parenteral administration formulations. The injectable formulations may be prepared according to techniques known in the art using suitable dispersing or wetting agents and suspending agents. For example, each component may be formulated for injection by dissolving in saline or buffer. In addition, formulations for oral administration include, but are not limited to, powders, granules, tablets, pills, and capsules.

상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 상기에서 '유효량' 이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. The pharmaceutical composition formulated as described above may be administered in an effective amount through various routes including oral, transdermal, subcutaneous, intravenous, or muscular. The term " effective amount " as used herein refers to an amount that shows a preventive or therapeutic effect when administered to a patient.

본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 연령, 성별 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 바람직하게는 1~10000mg/체중kg/day, 더욱 바람직하게는 10~1000mg/체중kg/day의 유효용량으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 혈관질환의 예방 또는 치료용 조성물은 혈관질환을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수도 있다.The dosage of the pharmaceutical composition according to the present invention can be appropriately selected depending on the route of administration, subject to be administered, age, gender, individual difference, and disease state. Preferably, the pharmaceutical composition of the present invention may contain the active ingredient in an amount of 1 to 10000 mg / kg body weight / day, more preferably 10 to 1000 mg / kg body weight / day May be repeatedly administered several times a day at an effective dose of < RTI ID = 0.0 > In addition, the composition for preventing or treating vascular diseases according to the present invention may be administered in combination with a known compound having an effect of preventing, improving or treating vascular diseases.

따라서 본 발명은 본 발명의 라폰티신 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 조성물을 포함하는 혈관질환의 예방 및 치료용 약제를 제공할 수 있다.Accordingly, the present invention can provide a medicament for the prevention and treatment of vascular diseases, which comprises a composition containing the lapontisin compound of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.

나아가 본 발명에 따른 혈관질환의 예방 또는 치료용 조성물은 천연으로부터 분리 및 정제된 라폰티신 화합물을 함유하고 있어 약물에 대한 독성 및 부작용이 없고 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있기 때문에 상기 본 발명의 조성물은 체내에 대해 매우 안정한 특징이 있다.Furthermore, since the composition for preventing or treating vascular diseases according to the present invention contains the lapontisin compound isolated and purified from natural materials, it has no toxicity and side effects to drugs and can be safely used for long-term use. Therefore, The composition is very stable in the body.

따라서 본 발명의 혈관 질환 예방 또는 치료용 조성물은 혈관질환 증상의 예방 및 개선을 목적으로 하는 식품에 첨가할 수 있으므로, 상기 본 발명의 조성물을 혈관질환 증상의 예방 및 개선을 위한 식품용 조성물로 사용할 수 있다.Therefore, the composition for preventing or treating vascular diseases according to the present invention can be added to foods for the purpose of preventing or improving the symptoms of vascular diseases. Therefore, the composition of the present invention can be used as a food composition for prevention and improvement of vascular disease symptoms .

그러므로 본 발명의 혈관질환 증상의 예방 및 개선을 위한 식품용 조성물은 혈관질환 증상의 예방 및 개선에 효과가 있는 식품, 예컨대, 식품의 주원료, 부원료, 식품 첨가제, 기능성 식품 또는 음료로 용이하게 활용할 수 있다.Therefore, the composition for food for the prevention and improvement of vascular disease symptoms of the present invention can be easily used as a food which is effective for prevention and improvement of vascular disease symptoms, for example, as a raw material, additives, food additives, have.

본원에서 상기 ‘식품’이란, 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 기능성 식품 및 음료를 모두 포함하는 것을 말한다.The term 'food' as used herein means a natural product or a processed product containing one or more nutrients, preferably a state of being able to be eaten directly through a certain degree of processing, , Food, food additives, functional foods and beverages.

본원발명에 따른 혈관질환 증상의 예방 및 개선용 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본원발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 빵류, 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 캔디류, 쵸코렛류, 껌류, 아이스크림류, 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실 음료, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.Examples of the food to which the composition for preventing and improving vascular disease symptoms according to the present invention can be added include various foods, beverages, gums, tea, vitamin complex, and functional foods. In addition, in the present invention, the food may include special nutritive foods (e.g., crude oil, spirits, baby food, etc.), meat products, fish meat products, tofu, mackerel, noodles (Such as soy sauce, soybean paste, kochujang, mixed potatoes), sauces, confectionery (eg, snacks), candies, chocolate, gums, ice cream, milk products (eg, fermented milk, cheese, But are not limited to, pickled foods (various kinds of kimchi, pickles, etc.), beverages (e.g., fruit drinks, vegetable beverages, beverages, fermented beverages and the like) and natural seasonings (e.g. The food, beverage or food additive may be prepared by a conventional production method.

또한, 상기 ‘기능성 식품’이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 구체적으로는 건강 기능성 식품일 수 있다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.The term "functional food" refers to a food group that is imparted with added value to function and express the function of the food by physical, biochemical, biotechnological techniques, etc., Refers to a food prepared by processing a body so as to sufficiently express the body's control function on the body, such as recovery, and the like. Specifically, it may be a health functional food. The functional food may include a food-acceptable food-aid additive, and may further comprise suitable carriers, excipients and diluents conventionally used in the production of functional foods.

또한, 본원발명에서 상기 ‘음료’란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 기능성 음료를 포함한다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 혈관질환 증상의 예방 및 개선용 조성물을 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.In the present invention, the term " beverage " refers to a generic term for drinking thirst or for enjoying a taste, and includes functional beverages. The beverage contains, as an essential ingredient, a composition for preventing or ameliorating the symptoms of the vascular disease as well as other components, and there is no particular limitation on other ingredients. The beverage contains various flavors or natural carbohydrates as an additional ingredient can do.

나아가 상기 기술한 것 이외에 본원발명의 혈관질환 증상의 예방 및 개선용 조성물을 함유하는 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으며, 상기 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.Further, in addition to the above-mentioned items, the food containing the composition for preventing and improving symptoms of vascular diseases according to the present invention may contain flavors such as various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), synthetic flavors and natural flavors, coloring agents and fillers Cheese, chocolate, etc.), pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloid thickeners, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonating agents used in carbonated drinks, These components can be used independently or in combination.

본원발명의 혈관질환 증상의 예방 및 개선용 조성물을 함유하는 식품에 있어서, 상기 본 발명에 따른 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.001중량% 내지 90중량%로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.1중량% 내지 40중량%로 포함할 수 있고, 음료의 경우, 100ml를 기준으로 0.001g 내지 2g, 바람직하게는 0.01g 내지 0.1g의 비율로 포함할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있으므로 상기 범위에 한정되는 것은 아니다.
The amount of the composition according to the present invention may be 0.001% by weight to 90% by weight, preferably 0.1% by weight, To 40% by weight, and in the case of beverages, it may be contained in a proportion of 0.001 g to 2 g, preferably 0.01 g to 0.1 g, based on 100 ml. However, for the purpose of health and hygiene, May be less than the above range, and since the active ingredient has no problem in terms of safety, it can be used in an amount of more than the above range, so it is not limited to the above range.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are for further illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited to these examples.

<< 실시예Example 1> 1>

하기 본 발명에서 수행한 실시예에서 사용한 실험 재료 및 실험방법들을 설명하면 하기에 기재된 바와 같다.
The experimental materials and experimental methods used in the embodiments of the present invention are described below.

<1-1> <1-1> 실험재료Experimental material

마취된 마우스 C57BL/6의 간 및 신장으로부터 아르기나아제(arginase) 용해물을 준비하였고, MnTBAP(Mn(III) Tetra(4-benzoic acid) porphyrin chloride), L-NAME(-nitro-L-arginine methyl ester)는 Calbiochem사에서 구입한 것을 사용하였다. 이하 다른 모든 시약들은 Sigma사에서 구입한 것을 사용하였으며, 본 발명에 따른 화합물인 Piceatannol-3-O-beta-D-glucopyranoside(PG)는 가톨릭 대학교로부터 수득한 것을 사용하였다.
Arginase lysates were prepared from liver and kidneys of anesthetized mouse C57BL / 6, and MnTBAP (Mn (III) Tetra (4-benzoic acid) porphyrin chloride), L-NAME (-nitro-L-arginine methyl ester) was purchased from Calbiochem. All other reagents were purchased from Sigma, and the compound of the present invention, Piceatannol-3-O-beta-D-glucopyranoside (PG), was obtained from Catholic University.

<1-2> <1-2> 세포배양Cell culture

HUVECs 세포들은 Cascade biologics에서 구입하여 사용하였으며, 공급자의 프로토콜에 따라 5% 이산화탄소 및 37℃의 조건하에서 Medium230 plus low-serum growth supplement(LSGS)가 첨가된 배지를 이용하여 배양 및 보관하였다.
HUVECs cells were purchased from Cascade biologics and cultured and stored in media supplemented with Medium230 plus low-serum growth supplement (LSGS) under conditions of 5% CO 2 and 37 ° C according to supplier protocol.

<1-3> <1-3> 아르기나아제(Arginase ( arginasearginase )활성 측정) Active measurement

아르기나제의 활성 측정을 위해 먼저 세포들을 4℃에서 균일화(homogenization)시킨 다음, 14,000 x g로 20분간 원심분리하고, 용해(lysis) 버퍼(50 mM Tris-HCl, pH7.5, 0.1 mM EDTA 및 프로테아제 억제제(protease inhibitors))로 세포들을 용해시켜 용해물을 준비하였으며, 아르기나아제 활성분석은 용해물의 상층액들을 사용하였다(Ryoo et al., 2006). 또한 상기 활성분석은 공지된 아르기나아제 억제제(ABH, 2(S)-amino-6-boronohexanoic acid, 20 uM)의 존재 하에서 아르기나아제의 활성을 측정함으로써 분석하였다.
To measure the activity of arginase, the cells were first homogenized at 4 ° C and then centrifuged at 14,000 xg for 20 minutes and resuspended in lysis buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.1 mM EDTA, (Protease inhibitors) to prepare lysates, and arginase activity assay used lysates in supernatants (Ryoo et al., 2006). The activity assay was also analyzed by measuring the activity of arginase in the presence of a known arginase inhibitor (ABH, 2 (S) -amino-6-boronohexanoic acid, 20 uM).

<1-4> <1-4> 웨스턴Western 블럿Blot 분석 analysis

C57BL/6 마우스(10주)의 간 또는 신장을 버퍼(50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 1 mM EDTA, 1 ug/ml leupeptin, 1 ug/ml pepstatin, 1 ug/ml aprotinin, 1 mM phenylmethylsulfonylflouride, 1 mM sodium orthovanadate 및 1 mM NaF)에서 균질화시키고, 14,000 x g 로 30분간 원심분리 하였다. 이후, 상층액의 단백질 양은 Bradford 법으로 측정한 다음, 단백질(100 ug)을 10% SDS-PAGE에서 전기영동 시키고, 니트로셀룰로오스막(Bio-Rad)으로 옮겼다. 이후, 상기 막에 모노클로날(monoclonal) anti-arginase I(Santa Cruz), arginase II(Santa Cruz), anti-endothelial nitric oxide synthase(eNOS, BD Bioscience) 또는 anti-beta tubulin(BD bioscience) 항체를 첨가하여 반응시킨 후, 2차 항체(Amersham)와 반응시켰다. 이후 시그널 분석은 화학 발광(chemiluminescence) 검출 시약을 사용하여 X-ray 필름으로 검출하였다.
Liver or kidneys of C57BL / 6 mice (10 weeks) were diluted in buffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 1 mM EDTA, 1 ug / ml leupeptin, 1 ug / ml pepstatin, / ml aprotinin, 1 mM phenylmethylsulfonylflouride, 1 mM sodium orthovanadate and 1 mM NaF) and centrifuged at 14,000 xg for 30 minutes. Then, the amount of protein in the supernatant was measured by Bradford method, and the protein (100 ug) was electrophoresed on 10% SDS-PAGE and transferred to nitrocellulose membrane (Bio-Rad). Then, monoclonal anti-arginase I (Santa Cruz), arginase II (Santa Cruz), anti-endothelial nitric oxide synthase (eNOS, BD Bioscience) or anti-beta tubulin (BD bioscience) And reacted with a secondary antibody (Amersham). The signal analysis was then detected with X-ray film using a chemiluminescence detection reagent.

<1-5> <1-5> 분리된 마우스 대동맥에서 In isolated mouse aorta DAFDAF -- FMFM 또는 or DHEDHE 를 이용한 Using NONO 발생 측정 Measurement of occurrence

마우스 대동맥환(aortic rings)을 분리하고, 본 발명에 따른 picaetannol-3-O-beta-D-glucopyranoside(50 uMol/L) 화합물의 존재 하에 2% FBS 및 항생제(1X)를 첨가한 Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM) 배지에서 37℃ 및 5% 이산화탄소의 조건하에서 밤새도록 배양하였다(White et al., 2006). 이후, 상기 대동맥을 세로 방향으로 자르고, HEPES 버퍼(NaCl 120 mM, KH2PO4 2.6 mM, KCl 4 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 0.6 mM, HEPES 25 mM, glucose 14 mM, pH7.4)로 채워진 실가드 코팅 챔버(silgard coated chamber)(상부에 내피층(endothelial layer))의 바닥에 고정시켰다. 상기 챔버는 37℃에서 30분간 가열기(heating stage)와 균형을 맞추게 하였고, 형광 측정 동안 상기 챔버는 static bath 조건을 유지하였다. 이후 최적화된 여기(excitation) 및 방출(emission) 파장(DAF-FM, 470/525 nm; 또는 DHE, 470/580)을 갖는 Olympus 10x 대물렌즈(objective), intensified camera(Luca 658M-TL)와 custom image acquisition program(Cell software, Olympus)을 사용하여 조직 백그라운드 및 DAF-FM (4-Amino-5-methylamino-2',7'-difluorofluorescein) Diacetate 또는DHE(dihydroethidine)의 형광을 측정하였다. 초기 평형에 따라, 백그라운드 형광을 기록하고 대동맥을 15분간 실온으로 하였다. 그 후 상기 대동맥을 HEPES 버퍼에서 45분간 5 uM DAF-FM 또는 5 uM DHE(molecular Probes)에 로딩한 후, DAF-FM 또는 DHE으로 세척한 다음, 37℃에서 20분 동안 평형상태를 유지하도록 하였다. 형광 강도는 전체 시야(view) 필드로부터 평균화하였고(5 frames, 2x2 binning), acquisition 프로그램으로 기록하였다. L-NAME( mol/L) 또는 MnTBAP( mol/L)을 다시 처리한 후에, 강도의 베이스라인 변화를 설정하기 위해 DAFFM 또는 DHE로 세척한 후, DAF-FM 또는 DHE 형광의 변화들을 기록하였다. 시간에 따른 형광 변화의 기울기는 Origin(version 7.5, OrignLab Corp, Northampton, MA)에서 선형회귀로 측정되었고 통계 비교(statistical comparison)에 사용되었다.
Mouse aortic rings were separated and cultured in Dulbeccos modified Eagles (R) supplemented with 2% FBS and antibiotic (1X) in the presence of picaetannol-3-O-beta-D-glucopyranoside (50 uMol / L) (DMEM) medium at 37 ° C and 5% CO 2 overnight (White et al., 2006). Thereafter, the aorta was cut in the longitudinal direction, and then the aorta was cut in the longitudinal direction and sealed with a seal-guard coating filled with HEPES buffer (NaCl 120 mM, KH 2 PO 4 2.6 mM, KCl 4 mM, CaCl 2 2 mM, MgCl 2 0.6 mM, HEPES 25 mM, glucose 14 mM, And fixed to the bottom of a sililged coated chamber (upper endothelial layer). The chamber was allowed to equilibrate with the heating stage for 30 minutes at 37 DEG C and the chamber maintained the static bath condition during fluorescence measurement. An Olympus 10x objective with an optimized excitation and emission wavelength (DAF-FM, 470/525 nm; or DHE, 470/580), an intensified camera (Luca 658M-TL) Fluorescence of the tissue background and DAF-FM (4-Amino-5-methylamino-2 ', 7'-difluorofluorescein) diacetate or DHE (dihydroethidine) was measured using an image acquisition program (Cell software, Olympus). Following the initial equilibrium, background fluorescence was recorded and the aorta was left at room temperature for 15 minutes. The aorta was then loaded into 5 uM DAF-FM or 5 uM DHE (molecular Probes) for 45 minutes in HEPES buffer, then washed with DAF-FM or DHE and maintained equilibrated at 37 ° C for 20 minutes . Fluorescence intensity was averaged from the entire view field (5 frames, 2x2 binning) and recorded with the acquisition program. After reprocessing L-NAME (mol / L) or MnTBAP (mol / L), changes in DAF-FM or DHE fluorescence were recorded after washing with DAFFM or DHE to establish a baseline change in intensity. The slope of fluorescence change over time was measured by linear regression in Origin (version 7.5, OrignLab Corp., Northampton, Mass.) And used for statistical comparisons.

<1-6> <1-6> 통계처리Statistical processing

모든 데이터들은 적어도 네 번의 독립된 실험들의 평균± S.D.로 나타내었다. 편차의 유의성을 평가하기 위해 두 그룹 간의 unpaired Student's t-test를 사용하였다. P<0.05를 유의성 있는 것으로 받아들였다.
All data were expressed as mean ± SD of at least four independent experiments. The unpaired Student's t-test between the two groups was used to evaluate the significance of the deviation. P <0.05 was considered significant.

<< 실시예Example 2> 2>

라폰티신La Pontijn 화합물의 Compound 아르기나제Arginina 활성분석 Activity analysis

본 발명자들은 라폰티신 화합물에 아르기나제 억제 활성이 있는지를 측정하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 먼저 마우스의 간 및 신장으로부터 상기 실시예 <1-1>의 방법에 따라 각 조직들의 용해물을 수득하였고, 라폰티신 화합물을 상기 용해물에 처리하기 전에 아르기나아제 I 및 아르기나아제 II의 항체를 이용하여 실시예 <1-4>에 기재된 웨스턴 방법을 통해 아르기나아제의 이성질체의 존재여부를 확인하였으며, 본 발명에 따른 라폰티신 화합물을 각 농도별(5, 10, 30, 50 ug/ml)로 처리한 후 실시예 <1-3>의 방법에 따라 아르기나제의 활성을 측정하였다.
The present inventors conducted the following experiment to determine whether araphazine inhibitory activity is present in the laportisine compound. First, a lysate of each tissue was obtained from the liver and kidneys of the mice according to the method of Example < 1-1 >. The laphthosine compound was dissolved in the solution of arginase I and arginase II Antibodies were used to confirm the presence of isomers of arginase through the Western method described in Example < l-4 >. The laponticin compounds according to the present invention were added to each concentration (5, 10, 30, / ml), and the activity of arginase was measured according to the method of Example < 1-3 >.

그 결과, 본 발명의 라폰티신 화합물은 마우스의 간 및 신장 조직에서 아르기나제 I 및 아르기나아제 II에 대하여 모두 농도 의존적으로 효소 활성을 억제하는 것으로 확인되었다(도 1 참조).
As a result, it was confirmed that the lapontisin compound of the present invention inhibited the enzyme activity in a dose-dependent manner for arginase I and arginase II in mouse liver and kidney tissue (see FIG. 1).

<< 실시예Example 3> 3>

라폰티신La Pontijn 화합물의 Compound NONO 생성 증가 및 Increase production and ROSROS 생성 감소 활성 측정 Measurement of production reduction activity

나아가 본 발명자들은 본 발명에 따른 라폰티신 화합물의 처리에 의한 아르기나아제의 활성 억제가 NO의 생성을 증가시키면서 동시에 ROS의 생성을 감소시키는 작용이 있는지를 조사하기 위하여, 라폰티신 화합물을 처리한 대동맥의 내피 세포에서 O₂ ^-- 민감성 시료인 DHE를 사용하여 O₂ ^-발생을 측정하였다.
Further, in order to investigate whether the inhibition of arginase activity by the treatment with the laportisin compound according to the present invention increases the production of NO and simultaneously reduces the production of ROS, In aortic endothelial cells, O ₂ ^- generation was measured using O ₂ ^- - sensitive DHE.

그 결과, DHE 형광세기는 처리한 라폰티신 화합물의 처리에 의하여 감소하는 것으로 나타났으며, DHE 신호는 MnTBAP 처리 시 완전히 억제되는 것으로 나타났다. 또한, 상기 결과는 아르기나아제가 NOS의 조절을 위한 일반적인 기작으로 L-아르기닌 기질을 제한함으로써 NOS에 의한 NO 생성을 조절할 수 있다는 새로운 개념과 부합한다. 따라서 아르기나아제의 억제는 L-아르기닌의 양을 증가시킬 수 있고, 나아가 eNOS가 감소된 내피에서 ROS 생성과 분리되는 것을 억제할 수 있다는 것을 알 수 있었다(도 2 참조).
As a result, DHE fluorescence intensity was decreased by treatment with treated lapontisin compound, and DHE signal was completely inhibited by MnTBAP treatment. In addition, the results are consistent with a new concept that arginase is able to regulate NO production by NOS by limiting L-arginine substrate as a general mechanism for the regulation of NOS. Thus, it has been found that inhibition of arginase can increase the amount of L-arginine and further inhibit the separation of eNOS from ROS production in the reduced endothelium (see FIG. 2).

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.The present invention has been described with reference to the preferred embodiments. It will be understood by those skilled in the art that various changes in form and details may be made therein without departing from the spirit and scope of the invention as defined by the appended claims. Therefore, the disclosed embodiments should be considered in an illustrative rather than a restrictive sense. The scope of the present invention is defined by the appended claims rather than by the foregoing description, and all differences within the scope of equivalents thereof should be construed as being included in the present invention.

Claims

A composition for preventing or treating vascular diseases, comprising a compound selected from the group consisting of Rhaponticin compounds and pharmaceutically acceptable salts thereof as an effective ingredient.

The method according to claim 1,
Wherein the laponisin compound has an effect of inhibiting the activity of arginase, increasing the production of nitric oxide or inhibiting the production of reactive oxygen species (ROS).

3. The method of claim 2,
Wherein the arginase is arginase I and arginase II.

The method according to claim 1,
The vascular disease is selected from the group consisting of hypertension, arteriosclerosis, heart attack, stroke, cancer, aging, erectile dysfunction, sickle cell disease, diabetes, angina pectoris, myocardial infarction, arthritis, diabetic retinopathy, psoriasis, neovascular glaucoma, And ischemic diseases. &Lt; RTI ID = 0.0 > 11. < / RTI >

The method according to claim 1,
Wherein the lapontin compound is contained at a concentration of 0.1 to 150 uM based on the total volume of the composition.

A health functional food for preventing or improving a vascular disease containing the composition of any one of claims 1 to 5 as an active ingredient.