KR20140080084A - Gas forming drug carrier for drug delivery and preparation method thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 약물전달을 위한 기체생성 약물전달체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a gas-generating drug delivery vehicle for drug delivery and a method for producing the same.
약물전달시스템(Drug Delivery System, DDS)이란, 약물 방출 속도를 조절하거나 약물을 목표 부위에 효율적으로 전달하는 방법으로서, 필요한 양의 약물을 효율적으로 전달할 수 있도록 설계한 제형을 선택하여, 의약품의 부작용을 최소화하고 투여한 약물의 효능과 치료 효과를 극대화하는 기술과 시스템을 말하며, 약물방출 시스템은 목적에 따라 지속성 약물방출시스템, 제어형 방출시스템, 및 표적지향형 약물전달시스템으로 등으로 나누어 진다.Drug Delivery System (DDS) is a method of controlling drug release rate or delivering drugs efficiently to a target site. By selecting a dosage form designed to efficiently deliver the required amount of drug, And to maximize the efficacy and therapeutic effect of the administered drug. The drug release system is divided into a sustained drug release system, a controlled release system, and a target-oriented drug delivery system depending on the purpose.
약물 전달과 치료의 효과를 향상시키기 위해, 크기가 작으면서도 효과가 뛰어난 약물전달체 개발에 힘을 쏟고 있으며. 현재 약물은 구강복용, 정맥주사, 피부를 통한 가시적 전달경로 등으로 투약되는데, 만약 나노입자를 이용하면 필요한 약물을 정확한 지점으로 전달할 수 있어 약물의 효과를 극대화할 수 있게 된다.In order to improve the effectiveness of drug delivery and treatment, we are working on developing small but effective drug delivery systems. Currently, drugs are administered by oral administration, intravenous injection, and visible delivery through the skin. If nanoparticles are used, the necessary drugs can be delivered to the correct site, maximizing the effectiveness of the drug.
중합체성 미셀(micelle)은 1984년 바더 등(Bader, H. et al. Angew. Makromol. Chem. 123/124(1984) 457-485)에 의해 약물 담체로서 처음으로 제안되었다. 중합체성 미셀은 내부 코어 중에 약물을 용해시킬 수 있고 표면에 흡착시킬 수도 있는, 일반적으로 작은 크기 및 약물 방출 속도를 조절하거나 약물을 목표 부위에 효율적으로 전달하는 기능을 가질 수 있어, 수용성 환경에서 낮은 용해도를 갖는 약물에 대한 잠재적인 담체로서 출현하였다.Polymeric micelles were first proposed as drug carriers by Bader, H. et al., Angew. Makromol. Chem. 123/124 (1984) 457-485, 1984. Polymeric micelles are generally small in size and capable of dissolving the drug in the inner core and adsorbing to the surface, and may have the function of controlling the drug release rate or delivering the drug efficiently to the target site, Appeared as a potential carrier for drugs with solubility.
미셀은 종종 천연 담체, 예를 들어 바이러스 또는 지단백질(liprotein)에 비견된다. 이들 담체들은 모두 표적 세포로 운반 도중 그의 내용물(그것이 바이러스의 경우 DNA이든지 혹은 지단백질 및 미셀의 경우 수 불용성 약물이든지 간에)을 보호하는 유사한 코어-쉘 구조를 나타낸다.Micelles are often compared to natural carriers, such as viruses or liproteins. These carriers all exhibit a similar core-shell structure that protects its contents during delivery to the target cell (whether it is DNA in the case of virus or water insoluble drug in the case of lipoprotein and micelle).
지단백질은 종양이 저 밀도 지단백질에 대해 상승된 요구를 나타내기 때문에 암 세포에 대한 항종양 화합물의 표적화를 위한 비히클(vehicle)로서 제안되었다. 그러나 담체로서 지단백질의 효능은 주로 약물 혼입된 지단백질이 건강한 세포에 의해서도 인식되고 종양 상의 수용체 부위에 대해서 천연 지단백질과 경쟁하기 때문에 문제가 되었다.Lipoprotein has been proposed as a vehicle for the targeting of antitumor compounds to cancer cells because the tumors exhibit an elevated demand for low density lipoproteins. However, the efficacy of lipoprotein as a carrier has been problematic, mainly because the drug-incorporated lipoprotein is also recognized by healthy cells and competes with natural lipoproteins for the tumor receptor sites.
중합체성 미셀은 코어(Core)-쉘(Shell) 구조를 특징으로 한다. 중합체성 미셀에 대한 약학적 연구는 각각 친수성 쉘 잔기인 A와 소수성 코어 중합체인 B를 갖는 A-B 이중블록 구조를 갖는 공중합체에 초점을 두었다. 생분해성 중합체로 이루어진 소수성 코어는 불용성 약물에 대한 수용조로서 작용하여 상기 약물을 수성 환경과 접촉하는 것으로부터 보호한다. Polymeric micelles are characterized by a core-shell structure. Pharmaceutical studies on polymeric micelles have focused on copolymers with A-B double-block structures with hydrophilic shell residues A and hydrophobic core polymers B, respectively. A hydrophobic core of a biodegradable polymer acts as a reservoir for insoluble drugs to protect the drug from contact with the aqueous environment.
임상적으로 적절한 약물 담체로서 간주되기 위해서 무독성이어야 하며 신장 경로를 통해 배출될 정도로 충분히 낮은 분자량을 가져야 한다. Must be non-toxic to be considered as clinically appropriate drug carriers and should have a sufficiently low molecular weight to be released through the renal pathway.
쉘은 미셀 안정화 및 원형질 단백질 및 세포막과의 상호작용에 기여한다. 상기는 대개 친수성, 비-생분해성, 생체 적합성 중합체로 이루어진다. 상기 담체의 생체 분포는 주로 상기 친수성 쉘의 성질에 의해 지시된다.Shells contribute to micelle stabilization and interaction with plasma proteins and cell membranes. These are usually composed of hydrophilic, non-biodegradable, biocompatible polymers. The biodistribution of the carrier is indicated primarily by the nature of the hydrophilic shell.
다른 중합체들, 예를 들어 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(PNIPA) 및 폴리알킬아크릴산은 미셀에 대해 온도 또는 pH 감수성을 부여하며, 결국 생체 접착성을 부여하는데 사용될 수 있다. 표적화 잔기와의 결합을 위해 표면에 작용기들이 존재하는 미셀이 또한 공지되어 있다. 예를 들어 문헌[Scholz, C. et al., Macromolecules 28(1995) 7295-7297]을 참조하시오.Other polymers, such as poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPA) and polyalkyl acrylic acid, impart temperature or pH sensitivity to micelles and may ultimately be used to confer bioadhesive properties. Micelles in which functional groups are present on the surface for binding with the targeting moiety are also known. See, for example, Scholz, C. et al., Macromolecules 28 (1995) 7295-7297.
초음파(ultrasound)는 종양검사, 태아진단 등 일상적 임상에서 초음파 검사에 사용되며 널리 쓰이고 있다. 초음파 검사는 초음파가 뼈, 근육, 지방 등 조직의 경계면과 같은 서로 다른 매질의 경계를 만나게 되면 굴절, 반사, 산란 등이 일어나는 것을 이용한다. 이러한 굴절, 반사, 산란의 빛을 대비 영상(contrast image)으로 이미지화하여 진단이 이루어진다. Ultrasound is widely used for ultrasonography in routine clinical tests such as tumor screening and fetal diagnosis. Ultrasonography uses refraction, reflection, and scattering when ultrasound meets the boundaries of different media such as bones, muscles, and fats at the tissue interface. These images of refraction, reflection, and scattering are imaged as a contrast image and diagnosed.
대부분의 초음파 검사는 피부에 초음파 장치를 대고 초음파의 투과력을 이용해 복부 속 장기를 관찰한다. 그러나 피부로부터 거리가 먼 장기 같은 조직은 초음파의 투과력으로는 관찰하기 어렵다. Most ultrasound tests are performed by placing an ultrasound device on the skin and observing the abdominal organs using ultrasound permeability. However, tissues such as organs distant from the skin are difficult to observe with the penetration power of ultrasonic waves.
따라서 초음파가 임상에 응용된 이래 좀 더 깊은 장기까지 볼 수 있고, 정확한 진단을 위해 반사상의 대비를 극대화시키는 문제가 대두되었다. 이를 위한 노력의 일환으로 초음파 조영제(ultrasound contrast agent)의 개발이 다각도로 이루어지고 있다.Therefore, since ultrasound has been used in clinical applications, it is possible to see deeper organs, and the problem of maximizing the contrast of the reflection image has been raised for accurate diagnosis. Ultrasound contrast agents have been developed in various ways as part of their efforts.
한편, 고분자 미셀(micelle)은 혈류 내에서 희석되어 붕괴되는 문제점이 있으며, 또한 기존의 쉘 가교 고분자 미셀은 구조를 안정하게 유지할 수 없는 문제가 있으며, 소수성 고분자인 PLGA(poly D,L-lactide-co-glycolide) ) 또는 PLLA(poly L-lactic acid)로 구성된 양친성 고분자를 이용한 약물전달체의 경우, 생체적합성 고분자로서 약물전달시스템에 주로 이용되고 있다. 또한 pH, 온도와 같은 물리화학적 자극에 반응할 수 있는 또 다른 양친성 고분자와 물리적 또는 화학적으로 혼합하여 약물방출량을 증진하는 방법이 사용되기 하지만, PLLA 또는 PLGA의 약물전달체로서의 문제점들이 제시되고 있다. In addition, there is a problem that polymeric micelles are diluted and collapsed in the bloodstream, and the conventional shell-crosslinked polymeric micelles can not stably maintain the structure. The hydrophobic polymer PLGA (poly D, L-lactide- co-glycolide) or PLLA (poly L-lactic acid) is used as a biocompatible polymer in a drug delivery system. In addition, a method of physically or chemically mixing with another amphipathic polymer capable of responding to physicochemical stimulation such as pH and temperature to increase the drug release amount is used, but problems as drug carriers of PLLA or PLGA have been suggested.
PLGA 또는 PLLA의 느린 생분해성과 그에 따른 약물의 방출 효율이 낮아 질병치료에 있어 문제점이 있다. 약물 방출 속도가 느리거나 방출 효율이 낮은 경우, 질병의 치료가 불가능 또는 지연되거나 후천성 다중약물내성이 발생할 가능성을 높여 복용량을 늘려도 치료 효과가 떨어지며, 세포독성의 위험이 있으므로, 효과적으로 약물을 전달하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.The slow biodegradation of PLGA or PLLA and the resulting release efficiency of the drug are low, which is problematic in the treatment of diseases. If the drug release rate is slow or the release efficiency is low, the treatment is not effective even if the treatment is impossible or delayed or the possibility of acquiring acquired multidrug resistance is increased, increasing the dose, and there is a risk of cytotoxicity, .
또한 조영제로 사용되는 경우 기존의 조영제의 경우 마이크로버블의 지속시간이 3~4분에 불과하며, 건강한 조직과 질병이 걸린 조직간에 대조가 명확하지 않으며, 또한 cm단위만 관측이 가능하며, 또한 방사선 피폭이나 요오드계 조영제는 신체에 위험할 수 있다. In contrast, when used as a contrast agent, the duration of microbubbles is only 3 to 4 minutes in contrast to conventional contrast agents, and the contrast between healthy and diseased tissues is not clear, Exposure or iodine-based contrast agents can be dangerous to the body.
또한, 의료업계에서는 약물의 효율적 전달을 위해 고분자 미셀에 대한 약학적, 제제화 응용에 대한 연구가 진행되고 있으며, 고분자 미셀(micelle)은 양친성 블록 공중합체에 의해 형성되며 소수성부분(코어) 및 친수성부분(쉘)의 구조를 가진다. 이러한 양친성 고분자에 의해 형성된 미셀은 난용성 약물의 가용화 문제를 개선하기 위하여 약물전달체로서 많이 응용되고 있지만 현재까지 개발된 약물전달체의 경우 목적하는 효과를 도출하지 못하고 있어 보다 개량된 기술개발이 필요한 실정이다. In the medical industry, pharmaceutical and pharmaceutical applications of polymeric micelles are being studied for efficient drug delivery. Polymeric micelles are formed by amphiphilic block copolymers and have hydrophobic moieties (core) and hydrophilic Part (shell) structure. Micelles formed by such an amphipathic polymer have been widely applied as drug carriers to improve the solubilization problem of insoluble drugs. However, since the drug carriers developed until now can not obtain the desired effects, to be.
이에 본 발명에서는 생체고분자 PLLA와 mPEG(methoxy-polyethylene-glycol) 를 이용하여 개발한 약물의 방출 및 기체를 생성하는 미셀로서, PLLA의 생분해성 문제를 개선하고 약물의 방출속도를 증진시키기 위하여 기체를 생성시키는 카보네이트 결합을 부여한 것으로, 상기 카보네이트 결합의 가수분해에 의해 생성되는 이산화탄소 기체와 이에 따른 입자붕괴를 이용하여 봉입된 약물의 방출속도를 높일 수 있는 기체 생성 약물전달체 및 이의 제조 기술을 제공함에 특징이 있다. Accordingly, the present invention provides a micelle capable of releasing a drug and generating a gas, which has been developed using biopolymers PLLA and mPEG (methoxy-polyethylene-glycol), as a micelle. In order to improve the biodegradability of PLLA, The present invention provides a gas-generating drug delivery system capable of increasing the rate of release of a drug encapsulated using carbon dioxide gas produced by hydrolysis of the carbonate bond and particle collapse thereby, and a process for producing the same. .
그러므로 본 발명의 목적은 mPEG(methoxy-polyethylene-glycol)-b-PLLA(Poly L-lactic acid) 이중블록 공중합체 고분자에 BC(benzyl chloroformate)이 결합된 접합체를 유효성분으로 포함하는 기체 생성 약물전달체 조성물을 제공하는 것이다.SUMMARY OF THE INVENTION It is, therefore, an object of the present invention to provide a gas-generating drug delivery system comprising a conjugate in which BC (benzyl chloroformate) is conjugated to mPEG (methoxy-polyethylene glycol) -b-PLLA (poly L-lactic acid) To provide a composition.
또한 본 발명의 다른 목적은 mPEG(methoxy-polyethylene-glycol)-b-PLLA(Poly L-lactic acid) 이중블록 공중합체 고분자에 BC(benzyl chloroformate)이 결합된 기체 생성 약물전달을 위한 접합체의 제조방법을 제공한다. Another object of the present invention is to provide a method for producing a conjugate for gas-generating drug delivery in which BC (benzyl chloroformate) is bonded to mPEG (methoxy-polyethylene-glycol) -b-PLLA (poly L-lactic acid) .
이에 본 발명은 mPEG(methoxy-polyethylene-glycol)-b-PLLA(Poly L-lactic acid) 이중블록 공중합체 고분자에 BC(benzyl chloroformate)이 결합된 접합체를 유효성분으로 포함하는 기체 생성 약물전달체 조성물을 제공한다.Accordingly, the present invention provides a gas-generating drug delivery composition comprising, as an active ingredient, a conjugate in which BC (benzyl chloroformate) is conjugated to a methoxy-polyethylene-glycol-b-PLLA (poly L-lactic acid) to provide.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 접합체는 하기 화학식 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 기체 생성 약물전달체 조성물일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the conjugate is represented by the following formula (1).
<화학식 1>≪ Formula 1 >
상기 식에서 n는 정수 50~250이고, m은 정수 12~85이다.In the above formula, n is an integer of 50 to 250, and m is an integer of 12 to 85.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 기체는 이산화탄소일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the gas may be carbon dioxide.
또한, 본 발명은, Further, according to the present invention,
a)mPEG(methoxy-polyethylene-glycol)-b-PLLA(Poly L-lactic acid)를 디클로로메탄에 용해시킨 후, BC(benzyl chloroformate)를 첨가하는 단계; 및 b) 디에틸 에테르(diethyl ether)를 첨가하여 반응시켜 침전물을 형성하는 단계를 포함하는, PLLA(Poly L-lactic acid)-mPEG(methoxy-polyethylene-glycol)에 BC(benzyl chloroformate)이 결합된 기체 생성 약물전달을 위한 접합체의 제조방법을 제공한다.a) dissolving mPEG (methoxy-polyethylene-glycol) -b-PLLA (Poly L-lactic acid) in dichloromethane, and then adding benzyl chloroformate (BC); And b) adding diethyl ether to form a precipitate, wherein PLLA (methoxy-polyethylene-glycol) is combined with benzyl chloroformate (BC) A method for preparing a conjugate for gas-mediated drug delivery is provided.
본 발명의 일실시예에 있어서, 촉매로서 Triethylamine(TEA)를 사용할 수 있다. In one embodiment of the present invention, Triethylamine (TEA) can be used as the catalyst.
또한 본 발명은 상기 본 발명에 따른 PLLA(Poly L-lactic acid)-mPEG(methoxy-polyethylene-glycol)에 BC(benzyl chloroformate)이 결합된 접합체를 유효성분으로 포함하는 초음파 진단용 조영제를 제공한다. The present invention also provides a contrast agent for ultrasound diagnosis comprising a conjugate wherein benzyl chloroformate (BCLA) is conjugated to poly-L-lactic acid (PLLA) -mPEG (methoxy-polyethylene glycol) according to the present invention.
본 발명에서 제조된 기체생성 미셀은 PLLA-PEG에 기체생성 카보네이트 결합을 부여하기 위해 BC(benzyl chloroformate)를 화학적으로 결합시켜 개발하였다. 본 기체생성 미셀은 시간의 경과에 따라 가수분해되는 경우 이산화탄소 기체를 생성하며 이에 따른 입자붕괴에 의해 내부에 봉입된 난용성 약물이 방출 속도를 증진시킬 수 있다. 기존 PLLA를 포함하는 약물전달체가 갖고 있는 분해성 문제를 보완할 수 있고, 기본 초음파 조영제로 사용되는 기체생성 고분자와 달리 간단한 방법으로 개발할 수 있다.The gas-generating micelles prepared in the present invention were chemically coupled with benzyl chloroformate (BC) to provide a gaseous carbonate bond to PLLA-PEG. The gas generating micelles generate carbon dioxide gas when hydrolyzed over time, and the insoluble drug encapsulated therein by particle collapse can increase the release rate. It can solve the degradation problem of drug carriers including conventional PLLA, and can be developed in a simple way, unlike gas generating polymers used as basic ultrasound contrast agents.
또한 본원 발명에 따른 기체생성 미셀은 BC와 PLLA의 하이드록실잔기 (hydroxyl)를 트리에틸아민(Triethylamine : TEA)을 촉매로 사용하여 간단한 방법을 통해 화학적으로 반응시켜 제조할 수 있다. 이와 같은 방법으로 합성하였을 경우, 기체생성 카보네이트 결합(carbonate linkage )을 부여할 수 있고 이에 따른 가수분해 시 미셀 내부에서 발생되는 이산화탄소 기체와 그에 따른 입자붕괴가 가능하다.Also, the gas generating micelles according to the present invention can be prepared by chemically reacting the hydroxyl moiety of BC and PLLA with triethylamine (TEA) as a catalyst through a simple method. When synthesized in this manner, it is possible to provide a gas-forming carbonate linkage, and thus the carbon dioxide gas generated in the micelles upon hydrolysis and thus the collapse of the particles is possible.
미셀의 입자붕괴는 시간에 따른 붕괴양상을 보이며 48시간 이내에 입자가 붕괴되고 그에 따른 미셀의 약물방출 효과를 보인다. 이러한 미셀의 입자붕괴에 따른 봉입된 난용성 약물의 방출 속도 증진과 암세포를 비롯한 질환세포 치료 등의 치료효과가 가능하다. The particle collapse of micelles shows collapsing pattern over time and collapses within 48 hours and the effect of micelles is released. It is possible to increase the release rate of the insoluble drug encapsulated by the particle collapse of micelles and to treat the disease cells including cancer cells.
또한 가수분해로부터 발생하는 CO2 가스를 초음파 탐지용 조형제(Ultrasonic contrast agent)로 이용할 수 있다. 이하 문헌을 참조할 수 있다.[J.R.Eisenbrey, et.al. Development and optimization of a doxorubicin loaded poly(lactic acid) contrast agent for ultrasound directed drug delivery, J Control Release, 143, 2010, 38-44.]In addition, CO 2 gas generated from hydrolysis can be used as an ultrasonic contrast agent. [JREisenbrey, et al. Development and optimization of a doxorubicin loaded poly (lactic acid) contrast agent for ultrasound directed drug delivery, J Control Release, 143, 2010, 38-44.
도 1은 mPEG-b-PLLA 을 포함하는 미셀은 분해가 진행되어도 PH의 변화가 없으나, mPEG-b-PLLA-BC 을 포함하는 미셀의 경우는 CO2 의 발생으로 인해 시간이 경과하면 PH가 낮아지며, 이를 도시한 것이다.
도 2는 mPEG-b-PLLA 와 mPEG-b-PLLA-BC 를 동일한 조건에서 측정했을 때 mPEG-b-PLLA-BC 로 이루어진 미셀의 경우, 많은 CO2 기포가 발생하는 것을 시각적으로 관찰할 수 있으며, 이를 촬영한 디지털 이미지 이다.
도 3은 0시간에서 50시간을 항온 방치한 결과로서 모델 약물인 항암제 DOX(doxorubicin)를 포함하는 mPEG-b-PLLA로 이루어진 미셀 과 mPEG-b-PLLA-BC로 이루어진 미셀 의 분해정도(%)를 비교한 것이다. 이 때 (a)는 37 °C 이며 (b)는 50 °C 인 경우를 도시한 것이다.
도 4는 DOX의 투여 방법에 따른 KB 세포의 생존성(viability)을 비교한 것으로서, DOX를 전달약물로 하여 순수하게 DOX만 투여한 것과, mPEG-b-PLLA로 이루어진 미셀에 포함하여 투여한 것 및 mPEG-b-PLLA-BC로 이루어진 미셀에 포함하여 투여한 KB 세포의 생존성을 비교한 것으로서 항온방치시간(Incubation Time)은 48시간이며, 농도는 각각 1, 5, 10 mg/mL으로 변화 시키며 측정한 것을 도시한 것이다.
도 5는 미셀의 크기를 측정하기 위해서, PBS(phosphate buffered saline) 용액 150 mM, pH 7.4, 37 °C 에서 micelle 샘플(0.1 mg/mL)를 항온방치한 후 Zetasizer 3000 instrument (Malvern Instruments, USA)을 이용하여 각각 0, 6, 24, 48 시간 후에 미셀의 크기를 측정한 것으로서, 633nm 파장 및 고정 산란각(fixed scattering angle) 90° 로 하여 He-Ne 레이져 빔(Laser beam)을 조사하여 측정한 것으로서 (a)는 mPEG-b-PLLA 미셀 (b)는 mPEG-b-PLLA-BC 미셀을 도시한 것으로 양자 모두 구형의 미셀구조를 나타낸다.
도 6은 미셀 샘플의 형상을 FE-SEM(field emission scanning electron microscopy , Hitachi s-4800, Japan)를 이용하여 각각 6, 24, 48 시간 후에 측정한 것으로 (c)는 mPEG-b-PLLA 미셀 (d)는 mPEG-b-PLLA-BC 미셀을 도시한 것이다.
도 7은 미셀 블록을 Bruker Advance III(400 MHz)라는 핵자기공명분석장치 (Nuclear Magnetic Resonance : NMR)를 이용하여, H-NMR 피크(Peak)를 측정한 것이며, 기준용액으로는 TMS(tetra methyl silane)를 사용하였으며, NMR solvent 로는 DMSO-d6 (dimethyl sulfoxide) 를 사용하였다. 측정결과 BC블럭에서 CH는 δ7.52 ppm 이며, BC블럭에서 CH2는 δ5.45 ppm 인 것을 도시한 것이다.
도 8은 미셀 블록의 가수분해 전의 mPEG-b-PLLA-BC 과 가수분해 후의 mPEG-b-PLLA을 Bruker Advance III(400 MHz) 핵자기공명분석장치(Nuclear Magnetic Resonance : NMR)를 사용하여, H-NMR 피크(Peak)를 측정한 것으로서, PBS(150mM,pH7.4) 용액에서 37°C , 48시간 후 측정한 것이다. 기준용액으로는 TMS(tetra methyl silane)를 이용하였으며, NMR solvent 로는 DMSO-d6 를 사용하였으며, 측정결과 48시간 후에는 BC블럭에서 CH인 δ7.52 ppm 값 과, BC블럭에서 CH2인 δ5.45 ppm 값이 측정되지 않은 것을 도시한 것이다.
도 9는 미셀 내부에 약물이 결합된 형태의 모식도로서 가수분해 되면서 CO2 가 발생하면서 미셀이 분해되는 것을 나타낸다. 또한 탄소결합(Carbonate linkage)이 가수분해되면서 미세기포 구멍(nanobubble holes)이 발생하면서 DOX를 효율적으로 분비하는 것을 도시한 것이다. 1 shows that the micelles containing mPEG-b-PLLA have no change in pH even when degradation proceeds, whereas in the case of micelles containing mPEG-b-PLLA-BC, PH is lowered over time due to the generation of CO 2 , Respectively.
FIG. 2 is a graph showing that a large number of CO 2 bubbles are visually observed in the case of micelles composed of mPEG-b-PLLA-BC when mPEG-b-PLLA and mPEG-b-PLLA-BC are measured under the same conditions , And a digital image of the captured image.
FIG. 3 shows the degree of degradation (%) of micelles composed of mPEG-b-PLLA and mPEG-b-PLLA-BC comprising mPEG-b-PLLA containing the drug drug DOX (doxorubicin) as a result of incubation for 0 to 50 hours. . In this case, (a) shows a case of 37 ° C and (b) shows a case of 50 ° C.
FIG. 4 is a graph comparing the viability of KB cells according to the dosing method of DOX. It is a result of DOX-only administration using DOX as a delivery drug and in the case of using micelles composed of mPEG-b-PLLA And mPEG-b-PLLA-BC. The incubation time was 48 hours, and the concentrations were changed to 1, 5, and 10 mg / mL, respectively. As shown in Fig.
FIG. 5 shows the results of measurement of micelle size using a Zetasizer 3000 instrument (Malvern Instruments, USA) after a micelle sample (0.1 mg / mL) was incubated at 150 mM phosphate buffered saline (PBS) , And measuring the size of the micelles after 0, 6, 24, and 48 hours, respectively, using a He-Ne laser beam at a wavelength of 633 nm and a fixed scattering angle of 90 ° (A) shows mPEG-b-PLLA-BC micelles (b) show mPEG-b-PLLA-BC micelles and both show spherical micellar structures.
Fig. 6 shows the morphology of the micelles after 6, 24 and 48 hours, respectively, using FE-SEM (Hitachi s-4800, Japan) d) shows mPEG-b-PLLA-BC micelles.
7 shows the results of measurement of the H-NMR peak of a micelle block using a nuclear magnetic resonance (NMR) apparatus (Bruker Advance III, 400 MHz), and TMS silane), and DMSO-d 6 (dimethyl sulfoxide) was used as the NMR solvent. As a result of measurement, the CH in the BC block is 隆 7.52 ppm, and the CH 2 in the BC block is 隆 5.45 ppm.
8 is a graph showing the relationship between mPEG-b-PLLA-BC before hydrolysis of a micelle block and mPEG-b-PLLA after hydrolysis using a Bruker Advance III (400 MHz) Nuclear Magnetic Resonance -NMR peak, measured at 37 ° C for 48 hours in PBS (150 mM, pH 7.4) solution. TMS (tetramethyl silane) was used as the reference solution, and DMSO-d6 was used as the NMR solvent. After 48 hours, the δ5.5 ppm value of CH in the BC block and δ5.5 ppm of CH 2 in the BC block were measured. 45 ppm < / RTI > value was not measured.
Figure 9 is a schematic view as hydrolysis of the drug has been bonded to form the inner micelle CO 2 And the decomposition of the micelle occurs. In addition, it shows that the carbon bond is hydrolyzed and nanobubble holes are generated to efficiently secrete DOX.
이하, 본원 발명을 상세하게 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
mPEG-b-PLLA-BC 를 이용한 약물을 포함하는 치료제Drug-containing drugs using mPEG-b-PLLA-BC
본 발명에서 “약물을 포함한다”는 내용은 미셀 내부에 물리화학적으로 결합 또는 포괄 등이 되거나 표면에 흡착 등의 방법으로 결합이 되는 것을 의미하는 것이다. In the present invention, the term " containing a drug " means that the substance is physically or chemically bound to the inside of the micelle or is bound to the surface by adsorption or the like.
본원 발명에 의해 미셀 내부에 포함될 수 있는 약물의 대상 질병은 염증성 질환, 심혈관계질환, 폐질환, 신경계질환, 당뇨병, 안구질환, 악성종양 등 뿐만 아니라 HIV, SAS 등과 같은 바이러스 감염증에도 사용될 수 있다. 따라서 전달될 수 있는 약물 역시 소염제, 진통제, 항암제, 항생제, 백신, 등 실시예에 한정되지 않는다. 또한 약물의 투여 방법은 주사제, 경구투여제, 경피투여제, 경점막투여제 등 다양하게 사용될 수 있다. According to the present invention, the target disease of the drug which can be contained in the micelle can be used not only for inflammatory diseases, cardiovascular diseases, pulmonary diseases, neurological diseases, diabetes, eye diseases, malignant tumors but also viral infections such as HIV and SAS. Therefore, the drugs that can be delivered are not limited to anti-inflammatory agents, analgesics, anticancer agents, antibiotics, vaccines, and the like. In addition, the method of administering the drug can be variously used, such as an injection, an oral administration, a transdermal administration, and a transmucosal administration.
여기에 사용되는, “약물을 포함하는” 의 의미는 "약물-로딩된(drug-loaded)" 또는 "캡슐화된 (encapsulated)" 및 그 파생어들과 상호 교환되어 사용된다. 본 발명에 따라. 소정의 예에 있어서, 약물 또는 치료제는 코어 외부의 친수성 쉘(shell) 부분에 위치할 수 있다. 이 경우 역시 약물을 포함하는 것으로 볼 수 있다. As used herein, the term "comprising a drug" is used interchangeably with "drug-loaded" or "encapsulated" and its derivatives. According to the invention. In some examples, the drug or therapeutic agent may be located in a hydrophilic shell portion outside the core. In this case, it can also be considered to include drugs.
치료제를 미셀에 포함시키는 것은 예비 성형된 미셀을 함유하는 용액에 화합물을 수중 유적형 과정 또는 투석법에 의해 용해시켜 수행할 수 있으며, 치료제는 중합체성 미셀 내에 포착시키고 치료에 유효량을 투여할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따라 사용되는 치료제는 미셀 내에 효율적으로 포함시키기 위해서는 소수성이 유리하다. 그러나, 이온성 미셀과 반대로 하전된 친수성 화합물, 예를 들어 올리고뉴클레오티드간에 안정한 복합체를 형성시키는 것도 가능할 수 있다. 보다 적합한 약물로는 소수성(수불용성)인 항종양 화합물 (예를 들어 독소루비신(DOX), 불충분하게 가용성인 대사길항 물질(예: 마이토마이신) 및 알킬화제(예: 카르무스틴)가 있다. Incorporating therapeutic agents into micelles may be accomplished by dissolving the compounds in a solution containing preformed micelles by an oil-in-water process or by dialysis, wherein the therapeutic agent is entrapped within the polymeric micelles and an effective amount can be administered to the treatment . Preferably, the therapeutic agent used in accordance with the present invention is advantageously hydrophobic for efficient inclusion in micelles. However, it may also be possible to form a stable complex between an ionic micelle and an oppositely charged hydrophilic compound, such as an oligonucleotide. More suitable drugs include antineoplastic compounds that are hydrophobic (water insoluble) (e.g., doxorubicin (DOX), insufficiently soluble metabolite antagonists (such as mitomycin) and alkylating agents (e.g., carmustine).
더욱이, 약물을 화학적 결합에 의해 또는 투석, 유화 기법, 수성 매질 중에서의 약물과 미셀의 단순한 평형 또는 물에 대한 약물중합체 고체 분산액의 용해를 통한 물리적 포착에 의해 본 발명의 중합체성 미셀 조성물에 혼입시킬 수 있다.Moreover, the drug may be incorporated into the polymeric micelle composition of the present invention by chemical coupling or by dialysis, emulsification techniques, simple equilibrium of the drug and micelle in aqueous medium, or physical capture through dissolution of the drug polymer solid dispersion in water .
약물을 포함하는 미셀은 일명 용매 증발 기법에 의해 제조할 수 있다. 문헌(Liggins, R. T. and Burt, H., Paclitaxel loaded poly(L-lactic acid) microspheres: Properties of microspheres made with low molecular weight polymers, Int. J. Pharm. 2001, 222(1), 19-33; Liggins, R. T., et. al., Paclitaxel loaded poly(L-lactic acid) microspheres for the prevention of intraperitoneal carcinomatosis after a surgical repair and tumor cell spill, Biomaterials, 2000, 21(19), 1959-1969)을 참조할 수 있다. 또한, 문헌 (Burt, H. M., et. al., Controlled delivery of Taxol from microspheres composed of a blend of ethylene-vinyl acetate copolymer and poly(d,l lactic acid), Cancer Lett. 1995, 88(1), 73-79))을 참조할 수 있다. 또한, 마이크로구는 일명 용매 추출 기법에 의해 제조할 수 있다. 예를 들면, 문헌(Feng, S. and Huang, G., Effects of emulsifiers on the controlled release of paclitaxel(Taxol) from nanospheres of biodegradable polymers, J. Control. Release 2001, 71(1), 53-59; Shiga, K. et. al., Preparation of poly(d,l-lactide) and copoly(lactide-glycolide) microspheres of uniform size, J. Pharm. Pharmacol. 1996, 48(9), 891-5)을 참조할 수 있으며, 이들 양 문헌은 그 전체 내용이 본 명세서에 참고 인용되어 있다. 또한, 문헌(Schaefer, M. J. and Singh, J., Effcts ofadditives on stability of etoposide in PLGA microspheres, Drug Dev. Ind. Pharm. 2001, 27(4), 345-350)을 참조할 수 있다.The micelles containing the drug can be prepared by a so-called solvent evaporation technique. Lactic acid microspheres: Properties of microspheres made with low molecular weight polymers, Int. J. Pharm. 2001, 222 (1), 19-33; Liggins, RT and Burt, , RT, et. Al., Paclitaxel loaded poly (L-lactic acid) microspheres for the prevention of intraperitoneal carcinomatosis after a surgical repair and tumor cell spill, Biomaterials, 2000, 21 (19), 1959-1969 have. (D, l lactic acid), Cancer Lett. 1995, 88 (1), 73 (1977), which is incorporated by reference herein in its entirety, -79) can be referred to. In addition, microspheres can be prepared by a so-called solvent extraction technique. For example, Feng, S. and Huang, G., Effects of emulsifiers on the controlled release of paclitaxel (Taxol) from nanospheres of biodegradable polymers, J. Control. Release 2001, 71 (1), 53-59; See, for example, Shiga, K. et al., Preparation of poly (d, l-lactide) and copoly (lactide-glycolide) microspheres of uniform size, J. Pharm. Pharmacol. 1996, 48 (9), 891-5 , Both of which are incorporated herein by reference in their entirety. See also Schaefer, M. J. and Singh, J., Effcts of Additives on Stability of Etoposide in PLGA Microspheres, Drug Dev. Ind. Pharm., 2001, 27 (4), 345-350).
약물의 물리적인 포착은 일반적으로 투석 또는 수중 유적형 유화 과정에 의해 수행된다. 투석법은 약물 및 공중합체 모두 용해되는 용매, 예를 들어 에탄올 등을 사용할 수 있으며. 선택성 용매로 대체함에 따라 상기 과정 중에 상기 중합체의 소수성 부분이 회합되어 상기 불용성 약물이 혼입된 미셀 코어를 형성한다. 유기 용매의 완전한 제거는 상기 투석을 수 일에 걸쳐 연장시킴으로써 수행될 수 있다. 수중 유적형 유화 방법에서, 수 불용성 휘발성 용매, 예를 들어 클로로포름 중의 약물의 용액을 상기 공중합체의 수용액에 가하여 수중 유적형 유화액을 제조한다.Physical capture of the drug is generally performed by dialysis or by an oil-in-water emulsification process. The dialysis method can use a solvent in which both the drug and the copolymer are dissolved, for example, ethanol. Upon substitution with a selective solvent, the hydrophobic moieties of the polymer are associated during the process to form a micellar core incorporating the insoluble drug. Complete removal of the organic solvent can be accomplished by extending the dialysis over several days. In an oil-in-water emulsion method, a water-insoluble volatile solvent, for example, a solution of a drug in chloroform is added to an aqueous solution of the copolymer to prepare an oil-in-water emulsion.
용매가 증발됨에 따라 미셀-약물 결합물이 형성된다. 후자의 방법에 대한 투석 과정의 주요 이점은 잠재적으로 독성인 용매의 사용을 피할 수 있다는 것이다. As the solvent evaporates, the micelle-drug conjugate is formed. The main advantage of the dialysis process over the latter method is that it avoids the use of potentially toxic solvents.
내부 코어와 약물 사이의 반데르발스(Van der Waals) 상호작용은 미셀의 안정성을 증가시킨다고 알려져 있다.
Van der Waals interaction between the inner core and the drug is known to increase micellar stability.
mPEGmPEG -b--b- PLLAPLLA -- BCBC 를 포함하는 초음파 조영제(Lt; RTI ID = 0.0 > ( UltrasonicUltrasonic ContrastContrast AgentAgent ))
본원 발명은 기존의 초음파 조영제들과는 달리 방사선이나 유해한 요오드계 조영제가 아닌 탄소결합이 가수분해되면서 발생하는 CO2가 마이크로 또는 나노 미세기포를 형성하는 것을 이용하는 것이므로, 친환경적이고 신체에 무해하며 생체적합성(biocompatible)이 높으면서도 경제적이다. 또한 기존 조영제들과 달리 마이크로 또는 나노 버블은 오랜 지속시간을 갖으며, 질병에 걸린 세포가 흡수하는 경우, 건강한 조직과 질병에 걸린 조직 사이의 대조가 명확하게 나타나 병변의 위치와 크기까지 정확하게 확인할 수 있으며, 검출 능력이 cm단위에서 mm단위까지 강화될 수 있다. Unlike conventional ultrasound contrast agents, the present invention utilizes the fact that CO 2 generated by hydrolysis of carbon bonds, which is not a radiation or harmful iodine contrast agent, forms micro or nano-sized air bubbles. Therefore, it is environmentally friendly, biocompatible ) Is high and economical. In contrast to conventional contrast agents, micro- or nano-bubbles have a long duration, and when diseased cells are absorbed, the contrast between healthy tissue and diseased tissue is clearly visible, , And the detection capability can be enhanced from cm to mm.
기존의 초음파용 조영제의 경우 기체발생이 가능한 전구체를 내부에 봉입하여 사용한 반면, 본원 발명에서는 고분자 말단에 기체발생이 가능한 화학결합(카보네이트 결합)을 부여하였으며, 이 같은 화학결합 부여에 의한 기체발생 방법은, 나노입자 내부에 약물과 전구체와 같은 2가지 이상의 약물을 봉입해야하는 문제를 개선해서, 이미 화학적으로 개조된 나노입자 내부에 단지 약물만 봉입함으로써 쉽게 약물방출용 나노입자를 제조할 수 있다는 장점이 있다.
In the present invention, a chemical bond (carbonate bond) capable of generating gas is given to the end of a polymer, and a gas generating method by such a chemical bond-imparting method Has the advantage of solving the problem of encapsulating two or more drugs such as drugs and precursors in nanoparticles so that nanoparticles for drug release can be easily produced by simply enclosing only the drug inside the chemically modified nanoparticles have.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples. However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited by the following examples.
<< 실시예Example 1> 1>
mPEGmPEG -b--b- PLLAPLLA -- BCBC ( ( methoxy메틸oxy - - polyethylenepolyethylene -- glycolglycol - -
b-b- polypoly -L--L- lacticlactic acidacid - - benzylbenzyl chloroformatechloroformate )의 크기 및 구조 분석) Size and structure analysis
본 발명자들은 하기 화학식 Ⅰ로 표시되는 구조를 갖는 접합체를 제조하위해, poly(L-lactic acid : PLLA)와 poly (ethylene glycol : PEG)의 화학적 결합에 의해 형성된 양친성 블록 공중합체인 PLLA-PEG에 기체 생성 카보네이트 결합을 부여하기 위해 PLLA의 하이드록실잔기와 benzyl chloroformte(BC)의 접합시킨 접합체로 이루어진 기체 생성 미셀(micelle)을 제조하였다. The inventors of the present invention prepared a conjugate having a structure represented by the following formula (I): PLLA-PEG, which is an amphiphilic block copolymer formed by chemical bonding of poly (L-lactic acid: PLLA) and poly Gas generating micelles consisting of a conjugate of benzyl chloroformate (BC) and a hydroxyl moiety of PLLA were prepared to give a gaseous carbonate bond.
미셀(micelle)은 일반적으로 양친성(兩親性), 예컨대 친수성기와 소수성기를 동시에 갖는 저분자량의 물질들이 이루는 열역학적으로 안정하고 균일한 구형의 구조를 지칭하는 것이다. 또한 미셀구조는 구형을 이루며, 미셀의 내부를 코어(Core)라 하며 미셀의 겉껍질 부분을 쉘(Shell) 이라고도 한다. 상기 미셀 구조를 갖는 화합물에 약물을 녹여 투입하는 경우 약물은 미셀 내부 또는 표면에 존재하게 되며, 이러한 미셀은 체내에서 환경 변화에 반응하여 약물을 방출을 할 수 있으므로, 약물전달용 캐리어로서 이용된다. 본 실시예에 따라 제조된 미셀은 PLLA-PEG 양친성 고분자를 통해 제조된 것으로, 가수분해 시에 이산화탄소를 발생시킬 수 있다. 특히 입자 내부에 난용성 약물이 봉입되어있을 때 이산화탄소 기체에 의해 붕괴되어진 입자내부를 통해 난용성 약물의 방출 속도를 증진시킬 수 있는 특징이 있다. 미셀 블록을 Bruker Advance III(400 MHz)라는 핵자기공명분석장치 (Nuclear Magnetic Resonance : NMR)를 이용하여, H-NMR 피크(Peak)를 측정한 것이며, 기준용액으로는 TMS(tetra methyl silane)를 사용하였으며, NMR solvent 로는 DMSO-d6 (dimethyl sulfoxide) 를 사용한 결과 BC블럭에서 CH는 δ7.52 ppm 이며, BC블럭에서 CH2는 δ5.45 ppm 이다. Micelles generally refer to a thermodynamically stable and homogeneous spherical structure formed by low molecular weight materials that have both affinity, for example, hydrophilic and hydrophobic groups at the same time. In addition, the micelle structure has a spherical shape. The inside of the micelle is called a core, and the shell portion of the micelle is also called a shell. When a drug is dissolved in a compound having the above-mentioned micelle structure, the drug is present inside or on the surface of the micelle. Such micelle is used as a carrier for drug delivery because it can release the drug in response to environmental changes in the body. The micelles prepared according to this embodiment are prepared through the PLLA-PEG amphipathic polymer and can generate carbon dioxide during hydrolysis. Particularly, when the insoluble drug is encapsulated in the particles, the release rate of the insoluble drug can be enhanced through the particles collapsed by the carbon dioxide gas. The micelle block was measured for H-NMR peak using Bruker Advance III (400 MHz) Nuclear Magnetic Resonance (NMR). TMS (tetramethyl silane) was used as the reference solution. As a result of using DMSO-d 6 (dimethyl sulfoxide) as the NMR solvent, the CH in the BC block was 隆 7.52 ppm, and the CH 2 in the BC block was 隆 5.45 ppm.
또한, 미셀 블록의 가수분해 전의 mPEG-b-PLLA-BC 과 가수분해 후의 mPEG-b-PLLA을 Bruker Advance III(400 MHz) 핵자기공명분석장치(Nuclear Magnetic Resonance : NMR)를 사용하여, PBS(150mM,pH7.4) 용액에서 37°C , 48시간 후 측정한 결과 BC블럭에서 CH인 δ7.52 ppm 값 과, BC블럭에서 CH2인 δ5.45 ppm 값이 측정되지 않았으므로 48시간이 경과하면 대부분의 mPEG-b-PLLA-BC 이 분해된다는 것을 알 수 있었다.In addition, mPEG-b-PLLA-BC before hydrolysis of the micelle block and mPEG-b-PLLA after hydrolysis were analyzed by using Bruker Advance III (400 MHz) Nuclear Magnetic Resonance (NMR) 150 mM, pH 7.4) at 37 ° C for 48 hours. As a result, the δ7.52 ppm value of CH in the BC block and the δ 5.45 ppm value of CH 2 in the BC block were not measured. , Most of mPEG-b-PLLA-BC was degraded.
<화학식 I>(I)
상기 식에서 n는 정수 50~250이고, m은 정수 12~85이다.
In the above formula, n is an integer of 50 to 250, and m is an integer of 12 to 85.
<< 실시예Example 2> 2>
mPEGmPEG -b--b- PLLAPLLA -- BC 의BC's 크기 및 형상 변화 분석 Size and shape change analysis
미셀의 크기를 측정하기 위해서, PBS(phosphate buffered saline) 용액 150 mM, pH 7.4, 항온방치시간(incubation time)37 °C 에서 micelle 샘플(0.1 mg/mL)를 Zetasizer 3000 instrument (Malvern Instruments, USA)을 이용하여 633nm 파장 및 고정 산란각(fixed scattering angle) 90° 로 하여 He-Ne 레이져 빔(Laser beam)을 조사하여 측정하였다. Micelle samples (0.1 mg / mL) were added to a Zetasizer 3000 instrument (Malvern Instruments, USA) at 150 mM phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4, and incubation time of 37 ° C. And a He-Ne laser beam was irradiated with a wavelength of 633 nm and a fixed scattering angle of 90 °.
mPEG-b-PLLA-BC 미셀의 평균크기는 대략 286 nm 로 측정되었다. 또한 미셀 입자의 크기 변화는 도5에 나타내고 있으며, 형상의 변화는 도6에 나타내고 있다. 또한 평균크기는 입자의 평균적인 직경을 의미하는 것으로서 특정 입자의 직경이 아닌 샘플 입자들의 통계적인 평균 직경을 의미하는 것이다. 도 5에 따르면 mPEG-b-PLLA로 이루어진 미셀의 크기변화는 시간경과에 불구하고 일정하나, mPEG-b-PLLA-BC로 이루어진 미셀의 경우 48시간 경과 후에 갑자기 크기가 커짐을 알 수 있다. 또한 도 6에 따르면 mPEG-b-PLLA 미셀 의 경우 형태가 원형을 지속적으로 유지하나, mPEG-b-PLLA-BC 미셀의 경우 24시간 경과 후의 형태와 48시간 경과 후 형태가 크게 변함을 알 수 있다. 따라서 mPEG-b-PLLA-BC 미셀을 약물전달체로 사용하는 경우가 크기 및 형태의 변화가 현저하여 빠르고 효율적인 약물전달체임을 알 수 있다.The average size of mPEG-b-PLLA-BC micelles was measured to be approximately 286 nm. The change in the size of the micelle particles is shown in Fig. 5, and the change in shape is shown in Fig. The average size means the average diameter of the particles, which means the statistical average diameter of the sample particles, not the diameter of the specific particles. According to FIG. 5, the size change of micelles composed of mPEG-b-PLLA is constant regardless of the lapse of time, but the micelles composed of mPEG-b-PLLA-BC suddenly increase in size after 48 hours. According to FIG. 6, the mPEG-b-PLLA-BC micelle maintains its original shape, while the mPEG-b-PLLA-BC micelle exhibits greatly changed morphology after 24 hours and after 48 hours . Therefore, the use of mPEG-b-PLLA-BC micelle as a drug delivery vehicle is remarkably fast and efficient in terms of size and shape.
<< 실시예Example 3> 3>
mPEGmPEG -b--b- PLLAPLLA -- BC 의BC's 제조방법 Manufacturing method
제조에 사용되는 재료인 Triethylamine (TEA), benzyl chloroformate (BC), dichloromethane (DCM), diethyl ether, doxorubicin -HCl (DOX -HCl), benzne, L-glutamine, and dimethyl sulfoxide (DMSO) 은 Sigma-Aldrich (USA)로부터 구매하였다. mPEG-b-PLLA-BC 중합체의 합성은 하기 반응식 Ⅰ에 나타낸 것과 같다. 즉, 하기 화학식 Ⅱ에 나타난 PLLA 와 하기 화학식 Ⅲ에 나타난 BC의 하이드록실잔기를 트리에틸아민(TEA)을 촉매로 사용하여 화학적 반응시켰다. 이와 같은 방법으로 합성하였을 경우, 기체생성 카보네이트 결합을 부여할 수 있으며, mPEG-b-PLLA 의 하이드록시말단(terminal hydroxyl (-OH))은 BC(benzyl chloroformate : C6H5CH2OOCl) 와 결합된다. 보다 구체적으로, 먼저 mPEG를 톨루엔에 완전히 녹인 후, 2:1 비율로 PLLA와 촉매제로 스태너스 옥테이트(Stannous octate) 첨가하여 하기 화학식 Ⅱ에 나타난 PLLA-mPEG 을 합성하고, 이후 상기 혼합물을 120℃에서 10시간 교반시킨 후 반응된 용액은 에틸 에테르를 사용하여 침전물을 형성시켰다. 이후 상기 침전 물을 진공건조 시킨 후 다이메틸설프옥시드용액(DMS)에 용해한 다음, 상기 용액을 투석막 (Spectra/Por: 2,000 MW)으로 옮겨 1차 증류수에서 합성되지 않은 mPEG와 PLLA를 투석을 이용하여 제거시켰다. 이후 투석시킨 용액은 1일 동안 동결건조 하여 분말을 얻었고, 상기 합성된 mPEG-b-PLLA(0.2mM)는 디클로로메탄에 완전히 녹인 후, BC(1mM)를 첨가하고 트리에틸아민(1mM)를 첨가하여 반응시켰다. 이후 디에틸 에테르를 첨가하여 침전물을 형성하게 한 후, 여과시켜 접합체를 수득하였다. 또한, 상기 반응에서 촉매로서 TEA(Triethylamine) 1mM 을 추가하여 반응시켰다. (TEA), benzyl chloroformate (BC), dichloromethane (DCM), diethyl ether, doxorubicin-HCl (DOX-HCl), benzene, L-glutamine, and dimethyl sulfoxide (DMSO) were purchased from Sigma-Aldrich (USA). The synthesis of mPEG-b-PLLA-BC polymer is as shown in Scheme I below. That is, the PLLA shown in the following formula (II) and the hydroxyl moiety of BC shown in the following formula (III) were chemically reacted with triethylamine (TEA) as a catalyst. When synthesized in this manner, it is possible to give a gas-forming carbonate bond, and the terminal hydroxyl (-OH) of mPEG-b-PLLA is converted into BC (benzyl chloroformate: C 6 H 5 CH 2 OOCl) . More specifically, mPEG was completely dissolved in toluene, PLLA-mPEG represented by the following formula (II) was synthesized by adding PLLA and a stannous octate as a catalyst at a ratio of 2: 1, For 10 hours, and then the reacted solution was precipitated with ethyl ether. Thereafter, the precipitate was vacuum-dried and then dissolved in dimethylsulfoxide solution (DMS). Then, the solution was transferred to a dialysis membrane (Spectra / Por: 2,000 MW) and mPEG and PLLA, which were not synthesized in the primary distilled water, . Then, the dialyzed solution was lyophilized for 1 day to obtain a powder. The synthesized mPEG-b-PLLA (0.2 mM) was completely dissolved in dichloromethane, BC (1 mM) was added and triethylamine Lt; / RTI > Diethyl ether was then added to form a precipitate, which was then filtered to obtain a conjugate. In addition, 1 mM TEA (Triethylamine) was added as a catalyst in the reaction.
<화학식 Ⅱ>≪ Formula (II)
상기 식에서 n는 정수 50~250이고, m은 정수 12~85이다.
In the above formula, n is an integer of 50 to 250, and m is an integer of 12 to 85.
<화학식 Ⅲ> ≪ Formula (III)
<반응식 Ⅰ><Reaction Scheme I>
상기 식에서 n는 정수 50~250이고, m은 정수 12~85이다.
In the above formula, n is an integer of 50 to 250, and m is an integer of 12 to 85.
<< 실험예Experimental Example 1> 1>
mm PEGPEG -b--b- PLLAPLLA 와 Wow mPEGmPEG -b--b- PLLAPLLA -- BC 의BC's 분해에 따른 Due to decomposition pHpH 변화 비교Change comparison
도 1에 나타난 것과 같이 37 °C에서 항온방치(incubation)하면서, 0~50 시간을 측정한 결과, mPEG-b-PLLA로 이루어진 미셀은 분해 시간이 경과해도 PH의 변화가 없으나, mPEG-b-PLLA-BC로 이루어진 미셀의 경우는 CO2의 발생으로 인해 시간이 경과할수록 용액이 산성이 되어 PH가 낮아지는 것으로 나타났다.
As shown in FIG. 1, when the incubation was carried out at 37 ° C for 0 to 50 hours, the micelles composed of mPEG-b-PLLA showed no change in PH even after the decomposition time, In the case of micelles composed of PLLA-BC, the solution became acidic with time due to the generation of CO 2 , and PH was lowered.
<< 실험예Experimental Example 2> 2>
mPEGmPEG -b--b- PLLAPLLA 와 Wow mPEGmPEG -b--b- PLLAPLLA -- BC 의BC's 기포발생Bubble generation 정도의 비교 Comparison of degree
mPEG-b-PLLA로 이루어진 미셀과 mPEG-b-PLLA-BC로 이루어진 미셀을 동일한 조건에서 항온방치했을 때 mPEG-b-PLLA-BC로 이루어진 미셀의 경우가 더 많은 기포를 발생시킴을 시각적으로 관찰할 수 있으며, 도 2에 나타난 것과 같이 디지털 이미지로 알 수 있다. PBS (150 mM, pH 7.4) 용액에서 37 °C 였으며 각각 10 mg/mL 씩 측정하였으며 12시간 후의 사진이다.
When the micelles composed of mPEG-b-PLLA and the micelles made of mPEG-b-PLLA-BC were allowed to stand at the same temperature under the same conditions, visual observation that the micelles composed of mPEG-b-PLLA-BC produced more bubbles And can be known as a digital image as shown in FIG. PBS (150 mM, pH 7.4) at 37 ° C and 10 mg / mL, respectively.
<< 실험예Experimental Example 3> 3>
DOXDOX 를 포함하는 Containing mPEGmPEG -b--b- PLLAPLLA 과 and mPEGmPEG -b--b- PLLAPLLA -- BC 의BC's 분해정도Degree of decomposition (%) 비교(%) compare
DOX를 전달약물로 측정한 실험예로서 0에서 50시간을 항온방치한 결과로서 (a)는 37 °C 이며 (b)는 50 °C 이다. 실험결과 mPEG-b-PLLA-BC 를 약물전달체로 사용한 경우가 mPEG-b-PLLA로 이루어진 미셀을 약물전달체로 사용한 경우보다 2배 정도 높은 방출율을 보이는 것을 알 수 있으며, 특히 온도가 상승할수록 약물 방출율이 높아짐을 알 수 있다. 따라서 본원 발명인 mPEG-b-PLLA-BC로 이루어진 미셀이 약물전달체로서 약물방출 속도와 방출량이 우수함을 판단할 수 있다.
As a result of an experiment in which DOX was measured as a delivery drug, (a) was 37 ° C and (b) was 50 ° C as a result of incubation for 0 to 50 hours. As a result, it was found that the use of mPEG-b-PLLA-BC as a drug delivery agent was twice as high as that of using mPEG-b-PLLA as a drug delivery vehicle, As shown in FIG. Therefore, it can be judged that the micelles composed of mPEG-b-PLLA-BC of the present invention are excellent drug release rate and release amount as a drug delivery vehicle.
<< 실험예Experimental Example 4> 4>
DOXDOX 의 투여 방법에 따른 Depending on the method of administration KBKB 세포의 Cell 생존성Survivability (( viabilityviability ) )
DOX를 순수하게 DOX만 투여한 것과, mPEG-b-PLLA로 이루어진 미셀에 결합하여 투여한 것, mPEG-b-PLLA-BC로 이루어진 미셀에 결합하여 투여한 것으로 KB 세포의 생존성을 비교한 것으로서 각각 농도를 1, 5, 10 mg/mL으로 변화시켰으며, 투여 48시간 후 측정하였다. B-PLLA-BC, which was prepared by administering DOX only to DOX alone, conjugated to micelles composed of mPEG-b-PLLA, and administered to micelles composed of mPEG-b-PLLA-BC, The concentrations were changed to 1, 5, and 10 mg / mL, respectively, and measured 48 hours after administration.
KB cells(비인두 표피암 조직에서 유래된 배양세포)을 RPMI-1640 배지에서 2mM의 L-glutamine과 1%의 penicillin-streptomycin, 10%의 FBS, 5%의 CO2 를 대기압 하에서 37°C.에서 항온배양 한다 (5X106cells/mL).KB cells were cultured in RPMI-1640 medium at 37 ° C under atmospheric pressure with 2 mM L-glutamine, 1% penicillin-streptomycin, 10% FBS, and 5% CO 2 . (5X10 < 6 > cells / mL).
플라스크에 단일 세포층을 형성하면 0.25%(w/v) trypsin 과 0.03%(w/v) EDTA 를 이용해서 세포를 회수한 후 RPMI-1640 배지를 포함하는 well plates에 옮기고 24시간 배양된 것을 사용한다.Cells were harvested using 0.25% (w / v) trypsin and 0.03% (w / v) EDTA and transferred to well plates containing RPMI-1640 medium for 24 h .
도 5에서 알 수 있듯이 투여량이 증가할수록 KB세포의 생존성은 낮아지며 모든 투여량 변화 데이터에서 알 수 있듯이 mPEG-b-PLLA-BC 미셀 형태로 약물을 투여한 경우가 mPEG-b-PLLA 미셀 형태로 투여한 경우보다 생존성이 낮다는 것을 알 수 있다. 따라서 mPEG-b-PLLA-BC로 이루어진 미셀이 효율적인 항암제 전달체임을 알 수 있다.
As can be seen from FIG. 5, as the dose increases, the viability of KB cells decreases. As can be seen from the data of all the dosage changes, administration of mPEG-b-PLLA-BC micelle form the drug leads to mPEG-b-PLLA micelle form The survivability is lower than that of the
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에 대한 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.The present invention has been described with reference to the preferred embodiments. It will be understood by those skilled in the art that the present invention may be embodied in various other forms without departing from the spirit or essential characteristics thereof. Therefore, the disclosed embodiments should be considered in an illustrative rather than a restrictive sense. The scope of the present invention is defined by the appended claims rather than by the foregoing description, and all differences within the scope of equivalents thereof should be construed as being included in the present invention.
Claims (6)
상기 접합체는 하기 화학식 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 기체 생성 약물전달체 조성물:
<화학식 1>
상기 식에서 n는 정수 50~250이고, m은 정수 12~85이다.The method according to claim 1,
Wherein the conjugate is represented by the following formula (1): < EMI ID =
≪ Formula 1 >
In the above formula, n is an integer of 50 to 250, and m is an integer of 12 to 85.
상기 기체는 이산화탄소인 것을 특징으로 하는 기체 생성 약물전달체 조성물.The method according to claim 1,
Wherein the gas is carbon dioxide.
b) 디에틸 에테르(diethyl ether)를 첨가하여 반응시켜 침전물을 형성하는 단계를 포함하는,
PLLA(Poly L-lactic acid)-mPEG(methoxy-polyethylene-glycol)에 BC(benzyl chloroformate)이 결합된 기체 생성 약물전달을 위한 접합체의 제조방법.a) dissolving mPEG (methoxy-polyethylene-glycol) -b-PLLA (Poly L-lactic acid) in dichloromethane, and then adding benzyl chloroformate (BC); And
b) reacting by the addition of diethyl ether to form a precipitate.
A method for producing a conjugate for the delivery of a gas-generating drug, wherein BC (benzyl chloroformate) is conjugated to PLLA (meth-L-lactic acid) -mPEG (methoxy-polyethylene glycol).
촉매로서 Triethylamine(TEA)를 사용하는 것을 특징으로 하는 제조방법.5. The method of claim 4,
Wherein triethylamine (TEA) is used as a catalyst.
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