KR20140062440A - Method for robust expansion of umbilical cord blood derived-pluripotent stem cell expressing znf281 - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 제대혈로부터 분리된 단핵세포를 피브로넥틴이 포함된 배양 용기내에서 배양한 후 배양물로부터 줄기세포를 회수하는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리방법, 본 발명에 의해 분리된 제대혈 유래 줄기세포, 상기 줄기세포 또는 이로부터 분화된 세포를 포함하는 세포치료제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 신규한 줄기세포 배양용 배지, 이 배지에서 줄기세포를 배양하여 증식시키는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 배양방법 및 줄기세포를 구 배양(sphere culture) 또는 삼차원 배양하는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 줄기성(stemness) 증가방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for isolating stem cells, which comprises culturing mononuclear cells isolated from umbilical cord blood in a culture container containing fibronectin and then recovering stem cells from the culture, a stem cell derived from cord blood derived from the present invention, And a cell therapy agent comprising the stem cell or the cell differentiated therefrom. The present invention also relates to a novel stem cell culture medium, a method for culturing stem cells in which the stem cells are cultured and grown, and a method for culturing stem cells in a sphere culture or a three-dimensional culture And to a method for increasing stemness of stem cells.
줄기 세포들은 자기 재생(self-renewing), 분화, 영구성(immortal) 등의 특징을 가지고 있으며, 이러한 독특한 성질을 이용하여 재생의학의 관점에서 다양한 퇴행성 질병의 치료를 위한 해결방법으로 제시될 뿐만 아니라 세포들의 biology에 대한 깊은 통찰을 할 수 있다. 다양한 조직으로부터 얻을 수 있는 성체 줄기 세포는 일반적으로 배아 줄기 세포에 비해 무제한적인 소스와 연구자들이 직면할 수 있는 윤리적 문제를 피할 수 있기 때문에 훨씬 더 매력적이다. 더욱이, 제대혈로부터 분리한 줄기세포는 골수나 지방조직과 달리 기증자가 추가적인 해를 입을 염려가 없기 때문에 다른 성체 줄기세포들보다 더 큰 장점을 가지고 있다.Stem cells have characteristics such as self-renewing, differentiation and immortal. Using these unique properties, stem cells are presented as a solution for the treatment of various degenerative diseases from the viewpoint of regenerative medicine, You can have a deep insight into the biology of Adult stem cells, which can be obtained from various tissues, are generally more attractive than embryonic stem cells because they can avoid unlimited sources and ethical problems faced by researchers. Furthermore, stem cells isolated from umbilical cord blood have greater advantages than other adult stem cells because, unlike bone marrow or adipose tissue, donors are not likely to suffer additional harm.
시험관내(in vitro)에서 제대혈유래 중간엽줄기세포는 성공적으로 신경세포, 간세포, 골세포와 같은 다양한 종류의 세포에 성공적으로 도입되었다(Sun, W. et al., Stem cells, 23:931, 2005; Hong SH. et al ., Biochem. Biophys. Res. Commun., 30:1153, 2005; Hutson EL. et al ., Tissue Engineering, 11:1407, 2005). 또한, 생체내(in vivo)에서, 제대혈 중간엽줄기세포를 이용한 상처, 당뇨병, 심장 경색(heart infraction) 등에 성공적인 이식이 여러 논문들을 통해 보고되어 왔다(Nonome, K. et al ., Am, J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 289:1091, 2005; Yoshida, S. et al ., Stem cells, 23:1409, 2005; Kim Bo. et al., Circulation, 112:96, 2005). 전염병의 전달 위험이 적고, 이식 대 숙주 병(graft-versus-host disease)에 걸릴 위험이 낮아, 제대혈 중간엽줄기세포 이식은 소아, 성인 환자 모두에게 급속히 시술되고 있다(Claudio G. B. et al ., Annual Review of Medicine, 57:403, 2006). 제대혈 이식이 몇몇 질병, 특히 조혈모 결함(hematopoietic defection)과 관련된 병들에 시술할 수 있는 접근으로써 받아들여졌다 할지라도(Grewal, SS. et al ., Blood, 103:1147, 2004; Knutsen, AP. et al., Journal pediatrics, 142:519, 2003; Ooi, J. et al ., Blood, 103:489, 2004; Sanz GF. et al ., Blood, 103:489, 2004), 제대혈유래 중간엽줄기세포의 임상적 적용에 관한 연구는 여전히 제한되어 있다. 예를 들어, 척수 손상된 여성 및 버거병(buerger's disease) 환자에서 완전한 회복은 아니지만, 부분적으로 성공한 보고들이 있다 (Kim, SW. et al ., Stem Cells, 2006; Kang, KS. et al ., Cytotherapy, 7:368, 2005). 그러나, 이러한 세포들의 발달 메커니즘 뿐만 아니라, 이 세포들을 어떻게 잘 배양하고 증식하는지에 대해서는 여전히 잘 알려져 있지 않다.In vitro , umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells have been successfully introduced into various cell types such as neurons, hepatocytes, and bone cells (Sun, W. et al., Stem cells, 23: 931, 2005; Hong SH et al ., Biochem. Biophys. Res. Commun., 30: 1153, 2005; Hutson EL. meat al ., Tissue Engineering, 11: 1407, 2005). In addition, in vivo ( in In vivo , successful transplantation using cord blood mesenchymal stem cells for wound, diabetes, heart infraction has been reported in several papers (Nonome, K. et al ., Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 289: 1091, 2005; Yoshida, S. et al ., Stem cells, 23: 1409, 2005; Kim Bo. et al., Circulation, 112: 96, 2005). Cord Blood Mesenchymal Stem Cell Transplantation has been rapidly performed in both pediatric and adult patients due to the low risk of transmission of infectious diseases and the low risk of graft-versus-host disease (Claudio GB et al. al ., Annual Review of Medicine, 57: 403, 2006). Although umbilical cord blood transplantation has been accepted as a viable approach to some diseases, particularly those associated with hematopoietic defection (Grewal, SS et . al ., Blood, 103: 1147, 2004; Knutsen, AP. et al., Journal Pediatrics, 142: 519, 2003; Ooi, J. et al ., Blood, 103: 489, 2004; Sanz GF. meat al ., Blood, 103: 489, 2004), studies on the clinical application of umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells are still limited. For example, there are partial, but not complete, reports of recovery in spinal cord injured women and buerger's disease patients (Kim, SW et . al ., Stem Cells, 2006; Kang, KS. meat al ., Cytotherapy, 7: 368, 2005). However, as well as the developmental mechanism of these cells, how to culture and proliferate these cells is still not well known.
제대혈에서 중간엽줄기세포를 분리하는 방법은 골수 유래 중간엽줄기세포의 분리 방법을 적용하였을 때 세포의 분리율이 20% 내외이며, 5시간 이내의 신선한 혈액을 사용하였을 때는 50%이지만, 그 이후가 되면 20% 이하로 떨어지고 분리 후에도 세포의 증식이 잘 되지 않는 한계를 보였다.The method of isolating mesenchymal stem cells from cord blood is that when the bone marrow-derived mesenchymal stem cells are separated, the cell separation rate is about 20%, and when fresh blood is used within 5 hours, it is 50% Of the cells were dropped below 20%, and cell proliferation did not progress well even after separation.
이에 본 발명자들은, 인간 제대혈 유래 혈액에서 분리한 단핵 세포를 피브로넥틴이 포함된 배양 용기에서 배양하여, 선형태(spindle-shape)의 세포가 대량으로 증식되며, 집락을 이루는 것을 발견하고 이를 지속적으로 배양하였을 때, 세포의 특성이 일정정도 유지되는 것을 확인하였다. 그래서 기존의 방법에서 문제시 되는 제대혈 유래 비조혈계 만능줄기세포 및 중간엽줄기세포의 효율적 분리 및 대량증식이 가능한 배양 방법으로서 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors have found that mononuclear cells isolated from blood derived from human cord blood are cultured in a culture vessel containing fibronectin to proliferate and colonize spindle-shaped cells in a large amount, and cultured continuously , It was confirmed that the characteristics of the cells were maintained at a certain level. Thus, the present invention has been accomplished as a culture method capable of efficient isolation and mass proliferation of umbilical cord blood-derived non-hematopoietic stem cells and mesenchymal stem cells, which are problematic in the conventional methods.
본 발명의 한 목적은 제대혈로부터 분리된 단핵세포를 피브로넥틴이 포함된 배양 용기내에서 배양한 후 배양물로부터 줄기세포를 회수하는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리방법을 제공하는데 있다.It is an object of the present invention to provide a method for separating stem cells, which comprises culturing monocytes isolated from cord blood in a culture vessel containing fibronectin, and recovering stem cells from the culture.
본 발명의 다른 목적은 상기 분리방법에 의해 분리된 제대혈 유래 줄기세포를 제공하는데 있다.Another object of the present invention is to provide cord blood derived stem cells isolated by the above separation method.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 제대혈 유래 줄기세포 또는 이로부터 분화된 세포를 함유하는 세포치료제를 제공하는데 있다.It is still another object of the present invention to provide a cell therapy agent containing the umbilical cord blood-derived stem cells or the cells differentiated therefrom.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 신규한 줄기세포 배양용 배지를 제공하는데 있다.It is still another object of the present invention to provide a novel culture medium for stem cell culture according to the present invention.
본 발명의 또 다른 목적은 줄기세포를 상기 배지에서 배양하여 증식시키는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 배양방법을 제공하는데 있다.It is still another object of the present invention to provide a method for culturing stem cells, wherein the stem cells are cultured in the medium to proliferate.
본 발명의 또 다른 목적은 줄기세포를 구 배양 또는 삼차원 배양하는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 줄기성을 증가방법을 제공하는데 있다.It is another object of the present invention to provide a method for increasing the stem cell stem cell, which comprises culturing stem cells in a spherical culture or a three-dimensional culture.
본 발명의 한 관점은 제대혈로부터 분리된 단핵세포를 피브로넥틴이 포함된 배양 용기내에서 배양한 후 배양물로부터 줄기세포를 회수하는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리방법에 관한 것이다.One aspect of the present invention relates to a method for separating stem cells, characterized in that monocytes isolated from cord blood are cultured in a culture vessel containing fibronectin, and then stem cells are recovered from the culture.
먼저, 제대혈로부터 단핵세포의 분리는 당업계에 알려진 통상의 방법을 이용하여 실시할 수 있다. 본 발명의 한 양태에서는 제대혈과 Hetasep을 혼합하여 적혈구를 제거한 후 피콜상(Ficoll-plaque)을 이용하여 단핵세포를 분리함으로써 얻을 수 있다. 여기서, 제대혈과 Hetasep의 혼합비는 제대혈 5ml 당 0.5~2ml로 하는 것이 바람직하다.First, the separation of mononuclear cells from cord blood can be carried out using conventional methods known in the art. In one embodiment of the present invention, cord blood and Hetasep are mixed to remove erythrocytes, and then monocytes are separated using Ficoll-plaque. Here, the mixing ratio of cord blood and Hetasep is preferably 0.5 to 2 ml per 5 ml of cord blood.
본 발명에서는 제대혈로부터 단핵세포의 분리 수율을 높이기 위해, 분만 직후 회수한 제대혈, 분만 직후 회수하여 실온에서 12~48시간 동안 보관한 제대혈 또는 3~5℃에서 6~72시간 동안 보관한 제대혈을 사용하는 것이 바람직하다.In the present invention, cord blood collected immediately after delivery, cord blood recovered immediately after delivery, cord blood stored at room temperature for 12 to 48 hours, or cord blood stored at 3 ~ 5 ° C for 6 to 72 hours is used to increase the isolation yield of mononuclear cells from cord blood .
본 발명은 제대혈에서 분리된 단핵세포로부터 줄기세포를 분리하는 방법에 있어서, 피브로넥틴을 이용하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에서 용어 '피브로넥틴을 포함하는 배양 용기'란, 단핵세포와 피브로넥틴이 접촉할 수 있는 상태를 의미한다. 예를 들면, 피브로넥틴은 배양 용기에 코팅되거나, 입자 형태 또는 3차원 구조물 형태로 배지에 포함될 수 있다. 한 양태로서, 피브로넥틴이 배양 용기에 코팅된 경우, 피브로넥틴은 0.1∼1mg/ml의 농도로 포함될 수 있다.The present invention is characterized in that fibronectin is used in a method for separating stem cells from mononuclear cells isolated from cord blood. The term "culture vessel containing fibronectin" in the present invention means a state in which mononuclear cells and fibronectin can contact each other. For example, fibronectin can be coated on a culture vessel, or contained in a medium in the form of a particle or a three-dimensional structure. In one embodiment, when fibronectin is coated in a culture vessel, fibronectin may be included at a concentration of 0.1 to 1 mg / ml.
본 발명에서 피브로넥틴은 특별한 제한 없이 동물로부터 유래된 것을 사용할 수 있으나, 사람으로부터 유래된 것이 바람직하다. 상기 피브로넥틴은 인공 합성 (예, 화학적 합성법, 단백질 합성 장치를 이용한 합성 등) 또는 생합성 (예, 재조합 DNA 기술, 섬유아세포 배양 등)을 통해 제조하거나, 사람을 포함한 동물의 혈장 또는 세포외기질로부터 분리함으로써 입수할 수도 있다. 상기 피브로넥틴은 피브로넥틴의 단편(fragment) 또는 펩타이드이거나, 이를 포함할 수 있다.In the present invention, fibronectin can be derived from an animal without particular limitation, but is preferably derived from a human. The fibronectin may be produced by artificial synthesis (for example, chemical synthesis, synthesis using a protein synthesis apparatus, etc.) or biosynthesis (for example, recombinant DNA technology, fibroblast culture, etc.) or isolation from plasma or extracellular matrix . The fibronectin may be, or may comprise, a fragment or peptide of fibronectin.
단핵세포를 피브로넥틴이 포함된 배양 용기내에서 배양할 때, 이용 가능한 배지는 특별히 제한되지 않으나, 기본 배지로는 SNU-1 또는 EGM-2를 이용하는 것이 바람직하다.When the mononuclear cells are cultured in a culture vessel containing fibronectin, the usable medium is not particularly limited, but SNU-1 or EGM-2 is preferably used as a basic medium.
'SNU-1 배지'의 조성은 아래와 같다.The composition of 'SNU-1 medium' is as follows.
본 발명에서는 상기 기본 배지에 FGF-B(Fibroblast Growth Factor), 아스코르브산(Ascorbic acid), EGF(Epodermal Growth Factor), 하이드로코르티손(hydrocortisone), IGF-1(Insulin-like Growth Factor-1) 또는 VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor), 헤파린(heparin)을 첨가하고, 필요에 따라 GA-1000(Gentamycin Sulfate, Amphotericin-B)을 추가로 첨가하는 것이 바람직하다.In the present invention, FGF-B (Fibroblast Growth Factor), Ascorbic acid, Epodermal Growth Factor (EGF), Hydrocortisone, Insulin-like Growth Factor-1 (IGF- (Gentamycin Sulfate, Amphotericin-B) may be further added as needed, if necessary, by adding a vascular endothelial growth factor (VEGF) or heparin.
보다 바람직하게는, 상기 기본 배지에, 우태아혈청(FBS) 20%, bFGF(Fibroblast Growth Factor) 1~40ng/ml, 아스코르브산 0.1~5.0㎍/ml, EGF(Epidermal Growth Factor) 1~40ng/ml, 하이드로코르티손 0.1~1㎍/ml, IGF-I(Insulin-like Growth Factor-1) 1~40ng/ml 또는 VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor) 1~5ng/ml 및 헤파린 20~25㎍/ml를 첨가하고, 필요에 따라 GA-1000(Gentamycin Sulfate, Amphotericin-B)을 추가로 첨가하는 것이다.More preferably, the basic medium is supplemented with 20% fetal bovine serum (FBS), 1 to 40 ng / ml of bFGF (fibrlast growth factor), 0.1 to 5.0 μg / ml of ascorbic acid, 1 to 40 ng / ml of EGF (Epidermal Growth Factor) 1 to 40 ng / ml of IGF-I, 1 to 5 ng / ml of VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) and 20 to 25 μg / ml of heparin, (Gentamycin Sulfate, Amphotericin-B) is added as needed.
한편, 단핵세포를 배양하고 3일 후, 부착되지 못한 단핵세포는 제거하고 부착된 단핵세포만을 계속 배양한다. 이로써, 부착된 단핵세포 중 줄기세포만 선택적으로 증식하게 되며, 분리 후 12~20일 사이에 빠르게 증식하는 줄기세포를 관찰할 수 있다. 여기서, 배지는 2~3일 간격으로 교체하는 것이 바람직하다.On the other hand, after 3 days from the cultivation of the mononuclear cells, the unattached mononuclear cells are removed and only the attached mononuclear cells are continuously cultured. As a result, only the stem cells of the adhered mononuclear cells are selectively proliferated, and stem cells that proliferate rapidly between 12 and 20 days after the isolation can be observed. Here, the medium is preferably replaced every two to three days.
배양물로부터 제대혈유래 만능줄기세포를 수득하는 방법으로는 소팅 기능을 가진 플로우 사이토미터를 사용한 FACS 법(Int . Immunol ., 10(3):275, 1998), 자기 비즈를 사용하는 방법, 중간엽줄기세포를 특이적으로 인식하는 항체를 사용한 패닝법(J. Immunol ., 141(8):2797, 1998) 등이 있다. 또한, 대량의 배양물 등으로부터 다분화능 줄기세포를 수득하는 방법으로는, 세포의 표면에 발현되어 분자(이하, 표면 항원이라 칭함)를 특이적으로 인식하는 항체를 단독 또는 조합하여 이를 칼럼으로서 사용하는 방법이 있다.Methods for obtaining umbilical cord blood-derived pluripotent stem cells from cultured cells include FACS ( Int . Immunol . , 10 (3): 275, 1998) using a flow cytometer having a sorting function, Panning method using an antibody specifically recognizing stem cells ( J. Immunol . , 141 (8): 2797, 1998). As a method for obtaining multipotential stem cells from a large amount of culture or the like, antibodies that specifically express the molecules (hereinafter referred to as surface antigens) expressed on the surface of cells are used singly or in combination and used as a column There is a way.
플로우 사이토미터 소팅 방식으로는, 수적하전 방식, 셀캡쳐 방식 등을 예시할 수 있다. 어떠한 방법도 세포의 표면항원을 특이적으로 인식하는 항체를 형광으로 표지하고, 표지된 항체와 항원의 결합체에 대한 형광을 측정하여 형광 강도를 전기 신호로 변환함으로서 세포의 항원 발현량을 정량할 수 있다. 또한, 사용하는 형광물질의 종류를 조합함으로써, 복수의 표면 항원을 발현하고 있는 세포를 분리하는 것도 가능하다. 여기에 사용가능한 형광물질로는, FITC(fluorescein isothiocyanate), PE(phycoerythrin), APC(allo-phycocyanin), TR(TexasRed), Cy3, CyChrome, Red613, Red670, TRI-Color, QuantumRed 등이 있다.The flow cytometer sorting method can be exemplified by a numerical charging method, a cell capturing method, and the like. In any method, the antibody that specifically recognizes the surface antigen of a cell is labeled with fluorescence, and the fluorescence of the labeled antibody / antigen complex is measured. The fluorescence intensity is converted into an electrical signal, have. It is also possible to separate cells expressing a plurality of surface antigens by combining the kinds of fluorescent substances to be used. Examples of fluorescent materials usable herein include fluorescein isothiocyanate (FITC), phycoerythrin (PE), allo-phycocyanin (APC), TR (TexasRed), Cy3, CyChrome, Red613, Red670, TRI-Color and QuantumRed.
플로우 사이토미터를 사용한 FACS 법으로는, 상기에서 수득한 줄기세포용액을 수집하고, 원심분리 등의 방법으로 세포를 분리한 후, 직접 항체로 염색하는 방법과 한번 적당한 배지 중에서 배양, 증식을 실시한 후에 항체를 염색하는 방법을 이용할 수 있다. 세포의 염색은 우선, 표면 항원을 인식하는 일차항체와 목적 세포샘플을 혼합하고, 얼음 위에서 30분 내지 1시간 인큐베이션한다. 일차 항체가 형광으로 표지되어 있는 경우에는 세정 후 플로우 사이토미터로 분리를 실시한다. 일차 항체가 형광 표지되어 있지 않는 경우에는 세정 후 일차 항체에 대해서 결합 활성을 갖는 형광 표지된 이차 항체와 일차 항체가 반응한 세포를 혼합하고, 다시 얼음에서 30분 내지 1시간 인큐베이션한다. 세정 후, 일차 항체와 이차 항체에서 염색된 세포를 플로우 사이토미터로 분리를 실시한다.
In the FACS method using a flow cytometer, the stem cell solution obtained above is collected, the cells are separated by a method such as centrifugation, and the resultant is directly stained with an antibody. After culturing and propagating in a suitable medium A method of staining an antibody can be used. Cell staining is performed by first mixing the target cell sample with the primary antibody recognizing the surface antigen, and incubating on ice for 30 minutes to 1 hour. If the primary antibody is labeled with fluorescence, wash off and separate with a flow cytometer. If the primary antibody is not fluorescently labeled, the fluorescently labeled secondary antibody having binding activity against the primary antibody after washing is mixed with the primary antibody-reacted cells, followed by further incubation on ice for 30 minutes to 1 hour. After washing, cells stained with primary antibody and secondary antibody are separated by flow cytometer.
본 발명에 의해 분리된, 제대혈 유래 줄기세포는 하기 특성 중 적어도 한 특성을 가지고 있다:The cord blood derived stem cells isolated by the present invention have at least one of the following characteristics:
(a) 전사조절인자인 c-myc, ZNF281에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타낸다.(a) exhibits positive immunological properties for the transcription factor c-myc, ZNF281.
(b) 세포외기질이 코팅된 바닥에 부착되어 부착 후 5 내지 30일 사이에 선 형태 또는 구 형태의 세포 집락을 이루면서 증식한다.(b) adheres to the bottom of the extracellular matrix and proliferates in a linear or spherical cell population between 5 and 30 days after attachment.
(c) 30 내지 45의 CPDL(cumulative population doubling level)을 보인다.(c) a cumulative population doubling level (CPDL) of 30 to 45.
(d) CD14, CD31, CD34, CD45 및 HLA-DR에 대하여 음성의 면역학적 특성을 나타낸다.(d) show immunological properties of negative for CD14, CD31, CD34, CD45 and HLA-DR.
(e) 중배엽, 내배엽 및 외배엽의 세포로 분화 가능하다.(e) Differentiation into mesodermal, endodermal, and ectodermal cells.
(f) TIMP-2, TGF-β, RANTES CINC-3, EOTAXIN, GM-CSF, IFN-γ, IL-1b, IL-3, IL-6, IL-8, IL-10, IL12p40, IL13, IL-16, IP-10, Leptin, MCP-2, MIG, MIP-3a, b-NGFm, sTNFRI, PFGF-bb로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 사이토카인 또는 케모카인을 분비한다.
IL-6, IL-8, IL-10, IL12p40, IL13, IL-10, At least one cytokine or chemokine selected from the group consisting of IL-16, IP-10, Leptin, MCP-2, MIG, MIP-3a, b-NGFm, sTNFRI and PFGF-bb is secreted.
본 발명의 제대혈유래 줄기세포가 Oct-4, Sox-2, Rex-1, c-myc, ZNF281을 발현한다는 것은 미분화 상태가 유지되고 있음을 의미한다.The expression of Oct-4, Sox-2, Rex-1, c-myc and ZNF281 in cord blood-derived stem cells of the present invention means that undifferentiated state is maintained.
또한, 본 발명의 줄기세포는 30~45의 CPDL(cumulative population doubling level)을 보여, 증식력이 우수함을 알 수 있다. 핵형 분석에 의해, 본 발명의 세포는 빠르게 증식하지만, 정상 염색체의 구조를 가지고 있음이 확증되었다.In addition, the stem cells of the present invention show a CPDL (cumulative population doubling level) of 30 to 45, indicating that the stem cells have excellent proliferative power. By karyotyping, the cells of the present invention proliferated rapidly but were confirmed to have a normal chromosomal structure.
본 발명의 제대혈 유래 줄기세포는 조혈모 줄기세포 마커 또는 면역거부반응 관련 마커로 알려진 CD14, CD31, CD34, CD45 및 HLA-DR에 대하여 음성의 면역학적 특성을 나타낸다. 이와 같이 본 발명의 제대혈 유래 줄기세포는 조혈 및 면역거부반응 관련 마커가 결여되어 이식시 혈관형성과 거부반응을 최소화할 수 있어 동종간 이식(allogenic transplantation)에 유용한 세포로 사용할 수 있다.The umbilical cord blood-derived stem cells of the present invention show the immunological characteristics of negative for CD14, CD31, CD34, CD45 and HLA-DR, which are known as hematopoietic stem cell markers or immune rejection-related markers. As described above, the umbilical cord blood-derived stem cells of the present invention lack hematopoietic and immune rejection-related markers and can minimize angiogenesis and rejection upon transplantation, and thus can be used as cells useful for allogenic transplantation.
본 발명의 제대혈 유래 줄기세포는 중배엽의 골형성세포, 연골세포, 지방세포로의 분화뿐만 아니라 내배엽의 간세포 및 외배엽의 신경세포와 망막관련세포로도 분화할 수 있다. 따라서, 본 발명의 줄기세포는 다양한 질병을 치료하는데 이용될 수 있다.The umbilical cord blood-derived stem cells of the present invention can differentiate not only into osteogenic cells of chondrogenic osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes but also to endodermic hepatocytes and ectodermal neurons and retinal-associated cells. Therefore, the stem cells of the present invention can be used for treating various diseases.
본 발명의 제대혈 유래 줄기세포는 TIMP-2, TGF-β, RANTES CINC-3, EOTAXIN, GM-CSF, IFN-γ, IL-1b, IL-3, IL-6, IL-8, IL-10, IL12p40, IL13, IL-16, IP-10, Leptin, MCP-2, MIG, MIP-3a, b-NGFm, sTNFRI, PFGF-bb 등 다양한 사이토카인 또는 케모카인을 분비한다. 이러한 사이토카인 또는 케모카인을 분비함으로써 본 발명의 제대혈 유래 줄기세포는 다양한 질병을 치료하는데 이용될 수 있다.The umbilical cord blood-derived stem cells of the present invention can be used for the treatment of various diseases such as TIMP-2, TGF-β, RANTES CINC-3, EOTAXIN, GM-CSF, IFN-γ, IL-1b, IL-3, IL- , IL12p40, IL13, IL-16, IP-10, Leptin, MCP-2, MIG, MIP-3a, b-NGFm, sTNFRI and PFGF-bb. By secreting these cytokines or chemokines, the umbilical cord blood-derived stem cells of the present invention can be used for treating various diseases.
이러한 특징을 갖는 줄기세포는 신규한 것으로서, 본 발명은 상기와 같은 특징을 갖는 제대혈 유래 줄기세포를 제공한다.
The stem cells having such characteristics are novel, and the present invention provides cord blood derived stem cells having the above characteristics.
본 발명의 줄기세포는 골형성세포, 연골세포, 지방세포, 간세포, 신경세포를 비롯한 다양한 유형의 세포로 분화할 수 있어 그에 대응되게 다양한 질병 치료에 이용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 줄기세포 또는 이로부터 분화된 세포를 함유하는 세포 치료제를 제공한다. 본 발명의 세포 치료제는 예를 들면, 신경질환(예, 퇴행성 신경질환), 골관절염(예, 퇴행성 관절염, 류마티스 관절염), 골결실(예, 골다공증), 간질환(예, 간경화), 심혈관계 질환을 포함한 다양한 질병을 치료하는데 이용될 수 있다.The stem cells of the present invention can differentiate into various types of cells including osteogenic cells, cartilage cells, adipocytes, hepatocytes, nerve cells, and the like, and thus can be used for various diseases. Accordingly, the present invention provides a cell therapy agent containing stem cells of the present invention or cells differentiated therefrom. The cell therapy agent of the present invention can be used in the treatment of diseases such as neurodegenerative diseases such as degenerative neurological diseases, osteoarthritis (e.g. degenerative arthritis, rheumatoid arthritis), bone defects (e.g. osteoporosis), liver diseases , ≪ / RTI > and the like.
본 발명의 세포 치료제는 세포를 보호 및 유지하는 하나 이상의 희석제를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 희석제는 생리식염수, PBS(Phosphate Buffered Saline), HBSS(Hank's balanced salt solution) 등의 완충용액, 혈장 또는 혈액성분 등이 있을 수 있다.
The cell treatment agent of the present invention preferably comprises at least one diluent which protects and maintains the cells. The diluent may be a buffer solution such as physiological saline, PBS (Phosphate Buffered Saline) or HBSS (Hank's balanced salt solution), plasma or blood components.
한편, 본 발명은 신규한 줄기세포 배양용 배지에 관한 것이다. 상기 배지는, 우태아혈청(FBS) 20%, bFGF(Fibroblast Growth Factor) 1~40ng/ml, 아스코르브산 0.1~5.0㎍/ml, EGF(Epidermal Growth Factor) 1~40ng/ml, 하이드로코르티손 0.1~1㎍/ml, IGF-I(Insulin-like Growth Factor-1) 1~40ng/ml 또는 VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor) 1~5ng/ml 및 헤파린 20~25㎍/ml가 첨가되고, 필요에 따라 GA-1000(Gentamycin Sulfate, Amphotericin-B)이 추가로 첨가된 EGM-2 또는 SNU-1 배지를 포함한다.On the other hand, the present invention relates to a novel culture medium for stem cell culture. The medium contained 20% of fetal bovine serum (FBS), 1 to 40 ng / ml of bFGF (bibulast growth factor), 0.1 to 5.0 μg / ml of ascorbic acid, 1 to 40 ng / ml of EGF (epidermal growth factor) 1 to 40 ng / ml of IGF-I, 1 to 5 ng / ml of VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) and 20 to 25 μg / ml of heparin, , Or EGM-2 or SNU-1 medium supplemented with GA-1000 (Gentamycin Sulfate, Amphotericin-B).
상기 줄기세포 배양용 배지는 신규한 것으로서, 상술된 바와 같이 본 발명에 따른 제대혈 유래 줄기세포의 분리방법에서도 이용되었다. 본 발명의 배지는 제대혈 유래 줄기세포를 비롯한 모든 성체 줄기세포의 증식에 유용하므로 성체 줄기세포를 배양하는데 이용할 수 있다.
The culture medium for stem cell culture was novel and was also used in the method of isolating cord blood-derived stem cells according to the present invention as described above. Since the medium of the present invention is useful for the proliferation of all adult stem cells including cord blood-derived stem cells, it can be used for culturing adult stem cells.
또한, 본 발명은 줄기세포를 본 발명의 배지에서 배양하여 증식시키는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 배양방법에 관한 것이다. 상기 줄기세포는 바람직하게는 성체 줄기세포일 수 있다.The present invention also relates to a method for culturing stem cells, wherein the stem cells are cultured in the medium of the present invention and proliferated. The stem cells may preferably be adult stem cells.
한 양태로서, 본 발명의 줄기세포 배양용 배지는 본 발명의 제대혈 유래 줄기세포 배양에 이용될 수 있다. 본 발명의 제대혈 유래 줄기세포를 본 발명의 배지에서 배양하면서 선 형태(spindle-shape) 세포의 집락이 확인된 지 3~5일 후에 계대 배양하는 것이 바람직하다. 배양은 5% CO2 조건에서 실시하는 것이 적합하고, 배양은 5~30일 동안 지속할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
In one embodiment, the culture medium for stem cell culture of the present invention can be used for culturing cord blood-derived stem cells of the present invention. It is preferable to subculture the umbilical cord blood-derived stem cells of the present invention in a culture medium of the
또한, 본 발명은 줄기세포를 구 배양(sphere culture) 또는 삼차원 배양함으로써 줄기세포의 줄기성(stemness)을 증가시키는 방법에 관한 것이다(실시예 11 참조). 상기 줄기세포는 바람직하게는 성체 줄기세포일 수 있다. 상기 삼차원 배양시에는 MEF(Mouse embryonic fibroblast cell)를 이용하는 것이 바람직하다.The present invention also relates to a method for increasing the stemness of stem cells by sphere culture or three-dimensional culture of stem cells (see Example 11). The stem cells may preferably be adult stem cells. MEF (mouse embryonic fibroblast cell) is preferably used for the above three-dimensional culture.
상기에서, '줄기성 증가'란, 배아 줄기세포양 집락(Embryonic Stem Cell-like colony)을 형성하거나, Oct4, Sox2 등과 같은 전사조절인자를 더 강하게 발현하는 것을 의미한다.In the above, 'increase in steminess' means formation of embryonic stem cell-like colony or stronger expression of transcription factors such as Oct4 and Sox2.
이상 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명에 따른 만능줄기세포는 인간 제대혈 유래로, 피브로넥틴을 포함하는 배양 용기내에서 배양하면, 기존의 성체 줄기세포에 비해 미분화 단계에서 오랜 기간 동안 왕성한 세포 성장을 하며, 불치병 치료에 유용하게 사용될 수 있고, 연골세포, 골형성세포 및 지방세포 등 여러 종류의 세포로 분화하는 능력을 가지고 있어, 신경계 질환, 심혈관계, 골격계 질환 등의 치료에 효과적이다.As described above, when the pluripotent stem cells of the present invention are cultured in a culture vessel containing fibronectin from human cord blood, the pluripotent stem cells grow vigorously for a long period of time in the undifferentiated stage, It is useful for the treatment of incurable diseases and has the ability to differentiate into various kinds of cells such as chondrocytes, osteogenic cells and adipocytes, and is effective for the treatment of neurological diseases, cardiovascular diseases, skeletal diseases and the like.
도 1은 인간 제대혈 유래 세포를 분리한 후, 각각 14일째, 15일째, 16일째, 17일째, 18일째 세포 성장 형태를 나타낸 사진(A, B, C, D 및 E) 및 새로운 용기에 옮긴 후 Passage 3에서 세포 성장을 나타낸 사진이다(F).
도 2는 제대혈유래 만능줄기세포의 시간에 따른 세포 증식을 누적으로 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 제대혈유래 만능줄기세포를 장기간 배양한 후 핵형분석을 실시한 결과이다.
도 4는 본 발명에 따른 제대혈유래 만능줄기세포에 여러 가지 마커를 부착시켜 유세포분석을 한 결과이다.
도 5a는 본 발명에 따른 제대혈유래 만능줄기세포가 미분화상태 줄기 세포 마커의 발현을 유세포분석기와 세포면역염색을 통하여 분석한 결과이다(A: Oct4 유세포 분석 결과 그래프, B: 면역염색에서 Oct4 발현 사진 C: Oct4 발현 사진의 핵염색 사진, D: Oct4 발현사진과 핵염색 사진의 합성).
도 5b는 terra-1, hUCB-MSC, AD-MSC 및 AM에서 ZNF281의 발현을 확인한 결과(상)와 3 내지 9회 계대 배양된 hUCB-MSC에서 ZNF281의 발현을 FACS 분석으로 확인한 결과(하)이다.
도 6은 본 발명에 따른 인간 제대혈유래 만능줄기세포가 ZNF281, Oct4, Sox2, c-myc 및 Rex-1과 같은 미분화상태를 유지하는데 있어 중요한 유전자를 발현하고 있음을 RT-PCR을 통하여 확인한 결과이다.
도 7은 인간 제대혈유래 만능줄기세포가 각각 골형성세포, 지방 세포, 연골세포 및 신경세포로 분화되었음을 나타내는 사진이다(A: 골형성 세포로 분화 유도하지 않은 대조군을 Alizarin Red S로 염색한 사진, B: 골형성 세포로 분화를 유도한 세포의 Alizarin Red S 염색 사진, C: 지방 세포로 분화를 유도하지 않은 대조군의 Oil Red O 염색 사진, D: 지방 세포로 분화를 유도한 세포의 Oil Red O 염색 사진, E: 연골세포로 분화 유도한 세포의 Toluidine Blue 염색 사진, F: 연골세포로 분화 유도 후 촬영한 세포 pellet의 사진, G: 신경세포로 분화 유도 후 신경세포의 마커인 Tuj-1 및 MAP2로 면역형광염색한 사진).
도 8은 인간 제대혈유래 만능줄기세포를 골형성 세포 및 지방 세포로 분화를 유도한 후, RNA를 추출한 후 RT-PCR을 통하여 확인한 결과이다( PPAR-γ와 FABP-4는 지방 세포 분화의 마커이고, Collagen Type 1은 골형성세포 분화의 마커이다. PPAR-γ: Peroxisome Proliferator-Activated Receptor gamma, FABP-4: Fatty Acid Binding Protein-4, GAPDH: Glyceraldehydeglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase).
도 9는 본 발명에 따른 제대혈유래 만능줄기세포의 망막 관련 단백질의 발현 양상을 나타낸 것이다.
도 10은 인간 제대혈유래 만능줄기세포를 배양한 배양액을 수집하여 세포가 분비한 여러 사이토카인을 antibody array를 이용하여 분석한 사진이다(A: hUCB-MSC1, B: hUCB-MSC2, C: hUCB-MSC3, D: 배열된 항체의 순서 POS: Positive control, NEG: Negative control, GCSF: Granulocyte-Colony Stimulating Factor, GM-CSF: Granulocyte Monocyte-Colony Stimulating Factor, ICAM-1: Intra-Cellular Adhesion Molecule, IFN-γ: Interferon-γ, IL: Interleukin, MCP: Monocyte Chemoattractant Protein, M-CSF: Monocyte-Golony Stimulating Factor, MIG: Monokine induced by Interferon Gamma, MIP: Macrophage Inflammatory Protein, RANTES: Regulated upon Activation, Normal T-cell Expressed and Secreted, TGF-β: Transforming Growth Factor-β, TNF: Tumour Necrosis Factor, sTNFR: soluble Tumour Necrosis Factor Receptor, PDGF-BB: Platelet-Derived Growth Factor-BB, TIMP2: Tissue Inhibitor of Metalloproteinases-2).
도 11은 본 발명에 의해 분리한 제대혈유래 만능줄기세포를 구배양(sphere culture) 및 mouse fibroblast cell인 STO cell을 이용하여 삼차원적으로 배양한 사진 및 전사조절인자인 Oct4, Sox2 유전자의 발현 양상을 RT-PCR을 통해 확인한 결과이다(도 11a : 구배양을 통한 제대혈유래 만능줄기세포의 삼차원배양, 도 11b: STO 세포를 이용한 제대혈유래 만능줄기세포의 삼차원배양).Fig. 1 shows photographs (A, B, C, D and E) showing cell growth morphologies on the 14th day, 15th day, 16th day, 17th day and 18th day after separation of human umbilical cord blood- This is a photograph showing cell growth in Passage 3 (F).
2 is a graph showing accumulation of cell proliferation with time in cord blood-derived pluripotent stem cells.
FIG. 3 is a result of karyotype analysis after long-term culture of umbilical cord blood-derived pluripotent stem cells according to the present invention.
FIG. 4 is a result of flow cytometry analysis by attaching various markers to cord blood-derived pluripotent stem cells according to the present invention.
FIG. 5a is a graph showing the results of analysis of the expression of undifferentiated stem cell markers by umbilical cord blood-derived pluripotent stem cell according to the present invention through flow cytometry and immunohistochemistry (A: Oct4 flow cytometry analysis, B: C: Oct4 expression, D: Oct4 expression and nuclear staining).
FIG. 5B shows the result of (1) the expression of ZNF281 in terra-1, hUCB-MSC, AD-MSC and AM, and the expression of ZNF281 in hUCB- to be.
FIG. 6 shows the result of RT-PCR of the human umbilical cord blood-derived pluripotent stem cells according to the present invention expressing genes important for maintaining undifferentiated states such as ZNF281, Oct4, Sox2, c-myc and Rex-1 .
FIG. 7 is a photograph showing that human umbilical cord blood-derived pluripotent stem cells were differentiated into osteogenic cells, adipocytes, chondrocytes and neurons, respectively (A: a control group not inducing differentiation into osteogenic cells was stained with Alizarin Red S, B: Alizarin Red S staining of cells that induced differentiation into osteogenic cells, C: Oil Red O staining of the control group that did not induce differentiation into adipocytes, D: Oil Red O T: Toluidine blue staining of cells induced to differentiate into cartilage cells, F: Photographs of cell pellets taken after induction of differentiation into chondrocytes, G: Tuj-1, a marker of neuronal cells after induction of differentiation into neurons, Immunofluorescent staining with MAP2).
FIG. 8 shows the results of RT-PCR after extracting RNA after inducing differentiation of human umbilical cord blood-derived pluripotent stem cells into osteogenic cells and adipocytes (PPAR-γ and FABP-4 are markers of adipocyte differentiation ,
FIG. 9 shows the expression patterns of retinal-associated proteins in cord blood-derived pluripotent stem cells according to the present invention.
FIG. 10 is a photograph (A: hUCB-MSC1, B: hUCB-MSC2, C: hUCB-MSC1) of various cytokines secreted from cells by collecting the culture solution in which human umbilical cord blood derived pluripotent stem cells were cultured. ICC-1: Intra-Cellular Adhesion Molecule, IFN-γ, TNF-α, TNF-α, TNF- γ: Interferon-γ, IL: Interleukin, MCP: Monocyte Chemoattractant Protein, M-CSF: Monocyte-Golony Stimulating Factor, MIG: Monokine induced by Interferon Gamma, MIP: Macrophage Inflammatory Protein, RANTES: Regulated Upon Activation, Expressed and Secreted, TGF-β: Transforming Growth Factor-β, TNF: Tumor Necrosis Factor, sTNFR: soluble Tumor Necrosis Factor Receptor, PDGF-BB: Platelet-Derived Growth Factor-BB, TIMP2: Tissue Inhibitor of Metalloproteinases-2.
Fig. 11 shows the results of three-dimensional culture of umbilical cord blood-derived pluripotent stem cells isolated by the present invention using sphere culture and mouse fibroblast cell STO cells, and expression patterns of Oct4 and Sox2 genes as transcription regulators (Fig. 11a: Three-dimensional culture of cord blood-derived pluripotent stem cells through spherical cultures, and Fig. 11b: Three-dimensional culture of pluripotent pluripotent stem cells derived from STO cells).
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
It will be apparent to those skilled in the art that various modifications and variations can be made in the present invention without departing from the spirit or scope of the invention as defined by the appended claims. It will be obvious to you.
실시예Example 1: 본 발명에 따른 1: According to the present invention 제대혈유래Derived cord blood 만능줄기세포의 배양, Cultivation of pluripotent stem cells, 증식능Proliferative ability 조사 및 핵형 분석 Investigation and karyotype analysis
Full term UCB 샘플(n=20)은 산모 동의하에 수집하였다. 우선 Full term UCB를 HetaSep (Stem cells Technologies INC, Vancouver, BC)을 이용하여 적혈구를 우선적으로 분리를 하였다. 그 다음은 기존의 방법과 마찬가지로 피콜상(ficoll gradient)에서 분리하였다. 분리한 단핵세포를 20% FBS를 함유한 EGM-2 SingleQuots을 첨가한 SNU-1 배지 또는 EGM-2 (Lonza)를 이용하여 피브로넥틴을 0.1mg/ml - 1 mg/ml의 농도로 코팅한 6 well plate에 1 x 105~8 세포로 배양하였다. EGM-2 SingQouts의 구성은 heparin, Ascorbic acid, rhEGF, hydrocortisone, VEGF, rhFGF-B, R3-IGF-1, GA-1000으로 구성되어 있다. 세포를 배양한지 3일 후 부착되지 못한 단핵세포를 제거하고 배지는 2 내지 3일 간격으로 교체해주었다.Full-term UCB samples (n = 20) were collected under maternal consent. First, the full-term UCB was preferentially separated from the red blood cells using HetaSep (Stem cells Technologies INC, Vancouver, BC). Then, it was separated from the ficoll gradient as in the conventional method. Separated mononuclear cells were cultured in SNU-1 medium supplemented with EGM-2 SingleQuots containing 20% FBS or EGM-2 (Lonza) in 6 wells coated with 0.1 mg / ml - 1 mg / ml of fibronectin well plates were incubated with 1 x 10 5 to 8 cells. The composition of EGM-2 SingQouts consists of heparin, ascorbic acid, rhEGF, hydrocortisone, VEGF, rhFGF-B, R 3 -IGF-1 and GA-1000. Three days after the cells were cultured, the unattached mononuclear cells were removed and the medium was replaced every 2 to 3 days.
상기 분리 후, CO2 5% 조건에서 배양한 지 5~30일째에, 일정한 선형태의 세포들이 집락을 이루는 것을 확인하였다(도 1A). 생성된 집락은 빠른 속도로 증식을 하였고, 집락이 관찰된 지 3일에서 7일 후, 0.125% Trypsin-EDTA로 부유시킨 후, 새로운 용기로 이동시켜, 세포를 계속 유지하였다(도 1B, 도 1C, 도 1D, 도 1E 및 도 1F). 도 1은 이와 같은 과정을 보여주는 사진으로 시간이 경과함에 따라 세포 집락의 크기가 증가하는 것을 볼 수 있으며, 또한 계대배양 후에도 세포의 형상이 일정하게 유지되는 것을 관찰할 수 있다(도 1. 본 실시예에 의해서 분리한 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 형성과 증식 과정을 보여주는 사진. A: 단핵 세포 배양 14일 후 초기 집락의 형태, B: 15일, C: 16일, D: 17일, E: 18일, F: 계대배양 후 passage 3에서 관찰한 세포의 사진).
After the above separation, it was confirmed that the cells in a constant line form colonize on
지속적으로 세포를 배양하면서, 분리한 중간엽 줄기세포의 증식력이 어느 정도 되는지 조사하기 위하여 CPDL(cumulative population doubling level)을 측정하였다(Cristofalo et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 95, 1998). 세포는 이분법을 이용하여 증식을 한다. 따라서 세포의 성장속도는 한 개의 세포가 두 개의 세포로 되는 시간이 어느 정도인지에 따라 결정된다. 이것을 Doubling time이라 하며 세포의 증식력을 평가할 수 있는 척도로 사용될 수 있다. 만약 CDPL값이 10이라면 하나의 세포가 10번의 분열을 함을 의미하며 이를 수치상으로 계산하면 하나의 세포가 약 1000개의 세포까지 증식함을 의미한다. 기존의 제대혈 유래 줄기세포의 가장 큰 문제점은 지방 조직이나 골수 유래의 중간엽 줄기세포에 비하여 현저히 떨어지는 증식력이었고 세포의 대량 증식인 임상적용 측면에서도 증식력이 중요하다고 볼 수 있다. 측정방법은 다음과 같이 진행하였다. 우선 다른 제대혈 샘플에서 분리한 세 종류의 제대혈유래 만능 줄기세포를 100디쉬에 2x105개씩 배양을 하고, 3일 또는 4일 간격으로 계대를 하며 세포계산기를 이용하여 세포 수를 측정하였다. 세포의 증식이 멈출 때까지 계속적으로 세포를 배양하며 세포 수를 측정하였다. 이렇게 구한 세포 수를 다음과 같은 수학식을 이용하여 CPDL값을 구한다.The cumulative population doubling level (CPDL) was measured to determine the proliferative potential of isolated mesenchymal stem cells while culturing cells continuously (Cristofalo et al., Proc. Natl. Acad Sci., USA 95, 1998). Cells proliferate using dichotomous methods. Thus, the growth rate of a cell is determined by how long it takes for one cell to become two cells. This is called doubling time and can be used as a measure of cell proliferation. If the CDPL value is 10, it means that one cell divides 10 times and by numerical calculation it means that one cell will proliferate to about 1000 cells. The most prominent problem of existing cord blood derived stem cells is proliferative power which is significantly lower than that of adipose tissue or bone marrow derived mesenchymal stem cells, and proliferation is also important in terms of clinical application, which is a proliferation of cells. The measurement method was as follows. Three types of umbilical cord blood - derived pluripotent stem cells isolated from other cord blood samples were cultured in a 100 - dish at 2 × 10 5 cells. Cells were counted using a cell analyzer at 3 or 4 days intervals. Cells were continuously cultured until cell proliferation ceased and cell number was measured. The CPDL value is obtained by using the following equation for the number of cells thus obtained.
NH/NI = 2X or [log(NH) - log(NI)]/log(2) = X N H / N I = 2 X or [log (N H) - log (N I)] / log (2) = X
여기서 NI는 최초 배양을 시작할 때의 세포 수, NH는 계대를 할 당시 포화상태에서의 세포 수를 의미한다.Where N I is The number of cells at the start of the initial culture and N H means the number of cells in the saturated state at the time of passage.
이와 같은 방법으로 지속적으로 세포를 유지하며 값을 구하였다. 대조군으로는 역시 제대혈에서 유래한 내피전구세포(hUCB-EPC; human Umbilical cord blood derived endothelial progenitor cells)를 이용하였다. 그 결과는 도 2의 그래프와 같이 제대혈 유래 내피전구세포가 두 달 정도의 배양 시간 동안 약 20 CPDL을 보인 반면, 제대혈유래 만능줄기세포의 경우 세 가지 다른 샘플 모두 40~45 CPDL을 보였다. 이러한 수치는 이론상으로 하나의 세포집락에서 1012까지 증식할 수 있음을 의미한다.
In this way, the cells were continuously maintained and their values were obtained. As a control group, human umbilical cord blood derived endothelial progenitor cells (hUCB-EPC) were also used. As shown in the graph of FIG. 2, cord blood-derived endothelial progenitor cells showed about 20 CPDL during the incubation time of about two months, whereas cord blood-derived pluripotent stem cells showed 40 to 45 CPDL in all three different samples. This means that theoretically, it can grow up to 10 12 in one cell population.
일반적으로, 이러한 왕성한 증식력을 보이는 세포는 암세포화되어 빠르게 폭발적으로 증가하는 경우가 있을 수 있다. 암세포화된 세포는 인체 내에서 여러 조절 신호들을 무시하고 크게 증식하는 경향이 있기 때문에, 세포치료제로 이용할 수 없으며 연구의 목적도 없다고 볼 수 있다. 따라서 본 발명에 의해 분리한 제대혈 유래 만능줄기세포가 정상적인 염색체를 가진 세포인지 확인을 반드시 해야 하며, 그 방법으로서 핵형분석을 통하여 세포의 염색체 이상을 확인해 보았다. 도 3에서 보는 바와 같이, passage 10의 세포에서도 정상 염색체의 구조를 가지고 있는 것이 확인되었다.
In general, cells showing such vigorous proliferative capacity may become cancer cells and rapidly explode. Cancer cells can not be used as a cell therapy agent because of their tendency to proliferate with neglecting various regulatory signals in the human body. Therefore, it is necessary to confirm whether the umbilical cord blood-derived pluripotent stem cells isolated by the present invention are cells having a normal chromosome, and the chromosomal abnormality of the cells was confirmed by the karyotyping method. As shown in FIG. 3, it was confirmed that the
실시예Example 2: 본 발명에 따른 2: According to the invention 제대혈유래Derived cord blood 만능줄기세포의 표면 항원 분석 Surface antigen analysis of pluripotent stem cells
배지내에 현탁한 세포들을 특성을 분석하는 flow cytometry 실험을 하였다. 세포 표면 항원 phenotyping을 위해, 3-4 계대 세포들을 수득하여 fluorescein isothiocyanate(FITC) 또는 phycoerythrin(PE)가 결합된 항체로 염색하고, FACS Aria (Becton Dickinson, NY)으로 분석하였다.Flow cytometry experiments were performed to characterize suspended cells in the medium. For cell surface antigen phenotyping, 3-4 passaged cells were obtained and stained with fluorescein isothiocyanate (FITC) or phycoerythrin (PE) conjugated antibodies and analyzed by FACS Aria (Becton Dickinson, NY).
본 발명에 의해 분리한 제대혈유래 만능줄기세포(partially pluripotent stem cell)의 특성을 분석하기 위해 표지 항원으로는 CD10(T세포 마커), CD14(단핵세포 마커), CD24(상피 세포 마커), CD29(단핵 세포 마커), CD31(내피 세포 마커), CD34 (조혈모 줄기세포 마커), CD44 (중간엽 줄기 세포 마커), CD45 (비조혈모 줄기세포 마커), CD51/61 (파골 세포 마커), CD73 (중간엽 줄기 세포 마커), CD90 (중간엽 줄기 세포 마커), CD105 (중간엽 줄기 세포 마커), CD133 (조혈모 줄기세포 마커), HLA-DR(면역거부반응 관련 마커)를 사용하였고, 이를 Flow cytometer를 이용하여 분석하였다. 실시 결과는 표 1과 같다. 도 4는 아래의 결과를 그래프로 표시한 것이다.
CD10 (T cell marker), CD14 (mononuclear cell marker), CD24 (epithelial cell marker), CD29 (monocyte marker), and the like were used as marker antigens in order to analyze the characteristics of the partially pluripotent stem cells isolated by the present invention. (Osteoclast markers), CD31 (osteoclast markers), CD31 (osteoclast markers), CD34 (hematopoietic stem cell markers), CD34 (Hematopoietic stem cell marker), CD90 (mesenchymal stem cell marker), CD90 (mesenchymal stem cell marker), CD105 (mesenchymal stem cell marker) cytometer. The results are shown in Table 1. Figure 4 is a graphical representation of the results below.
실시예Example 3: 본 발명에 따른 3: According to the present invention 제대혈유래Derived cord blood 만능줄기세포의 Of pluripotent stem cells ZNF281ZNF281 발현 및 Expression and CoreCore transcription transcription factorfactor 발현 양상 분석 Expression pattern analysis
ZNF281(Zinc finger protein 281)은 ESC에서 핵심 전사 인자 중 하나이다(Wang J et al. (2006) Nature 444, 364-368). 초기에 ZBP-99로 명명된, ZNF281은 ZBP-89와 91% 아미노산 서열 유사성 및 79% 서열 동일성을 공유하는 4개의 Krㆌppel형 징크 핑거를 보유하고 있다. 또한, 두 유전자의 카르복시 말단 절편에는 잘 보존된 아미노산 서열이 존재한다. ZNF281 cDNA의 예상되는 오픈 리딩 프레임은 99kDa 단백질을 암호화한다. EMSA(Electrophoretic mobility shift assay)결과로는 GASTRIN 및 ORNITHINE DECARBOXYLASE 유전자의 GC-리치(rich) 프로모터 부위에 특이적으로 결합한다는 것을 보여준다(Law DJ et al. (1999) Biochem Biophys Res Commun 262, 113-120; Lisowsky T et al. (1999) FEBS Lett 453, 369-374). ZNF281은 mass spectral multidimensional protein identification technology와 조합된 탠덤 친화도 정제(tandem affinity purification)에 의해 c-MYC 연관 단백질 중 하나로 동정되었다(Koch HB et al. (2007) Cell Cycle 6, 205-217.).Zinc Finger protein 281 (ZNF281) is one of the key transcription factors in ESC (Wang J et al. (2006) Nature 444, 364-368). ZNF281, initially named ZBP-99, has four Kr ㆌ ppel type zinc fingers sharing 91% amino acid sequence similarity and 79% sequence identity with ZBP-89. In addition, well conserved amino acid sequences are present in the carboxy terminal fragments of both genes. The expected open reading frame of ZNF281 cDNA encodes a 99 kDa protein. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) results show that it specifically binds to the GC-rich promoter region of the GASTRIN and ORNITHINE DECARBOXYLASE genes (Law DJ et al. (1999) Biochem Biophys Res Commun 262, 113-120 Lisowsky T et al. (1999) FEBS Lett 453, 369-374). ZNF281 was identified as one of the c-MYC-related proteins by tandem affinity purification combined with mass spectral multidimensional protein identification technology (Koch HB et al. (2007)
POU family transcription factors와 같은 Oct3/4 유전자들은 분화된 조직에서는 존재하지 않고, 높은 증식능을 함유하는 미분화된 줄기 세포들에서 특별히 발현되는 것으로 알려져 있다 (Tai M-H. et al ., Carcinogenesis 26:495, 2005; Tondreau T. et al ., Stem cells, 23:1105, 2005). 일반적으로 배아 줄기세포의 마커로서 쓰이지만, 위와 같은 특성으로 미분화상태를 의미하는 마커로서 쓰이기도 한다. 그리하여 stemness의 마커로서 Oct4를 사용하여 세포 콜로니를 염색한 결과, 많은 세포들이 핵 부위에 Oct4가 염색되는 것을 확인할 수 있었으며, Flow cytometry를 통한 분석에 있어서도 많은 세포에서 발현하는 것을 확인할 수 있었다.Oct3 / 4 genes, such as the POU family transcription factors, are not present in the differentiated tissues and are known to be specifically expressed in undifferentiated stem cells containing high proliferation (Tai MH et al ., & lt ; / RTI & gt ; Carcinogenesis 26: 495, 2005; Tondreau T. meat al ., Stem cells, 23: 1105, 2005). It is generally used as a marker of embryonic stem cells, but it is also used as a marker for undifferentiated state with the above characteristics. Therefore, we used Oct4 as a marker of stemness to stain cell colonies. As a result, it was confirmed that many cells were stained with Oct4 in the nucleus, and the expression was confirmed in many cells by flow cytometry.
세포내 단백질(intracellular proteins)의 염색을 위해, 세포들은 4℃에서 4% 포름알데히드로 하룻밤동안 고정하고, 0.1% Triton X-100(Sigma-Aldrich)으로 10분 동안 permeabilize하였다. 슬라이드와 접시는 인간 Oct4(1:200)에 대한 마우스 1차 항체로 1시간동안 인큐베이션한 다음, PBS(phosphate buffered saline; Gibco)로 세척하고, 적색형광염료인 Alexa594가 결합된 goat 항마우스 IgG 2차 항체(Invitrogen)로 1시간동안 인큐베이션 하여 면역염색을 실시하고, 대조염색으로 DAPI를 이용하여 핵을 염색하였다.For staining of intracellular proteins, cells were fixed overnight at 4 ° C with 4% formaldehyde and permeabilized with 0.1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) for 10 min. Slides and dishes were incubated with mouse primary antibody against human Oct4 (1: 200) for 1 hour and then washed with PBS (phosphate buffered saline; Gibco) and labeled with goat
도 5에 나타난 바와 같이, Oct4 염색 결과, 많은 제대혈유래 만능줄기세포에서 Oct4를 발현하는 것으로 나타났다(도 5A: Oct4 유세포 분석 결과 그래프, B: 면역염색에서 Oct4 발현 사진 C: Oct4 발현 사진의 핵염색 사진, D: Oct4 발현사진과 핵염색 사진의 합성 사진).As shown in Fig. 5, Oct4 staining revealed that the cells were expressed in many umbilical cord blood-derived pluripotent stem cells (Fig. 5A: Oct4 flow cytometry analysis, B: Oct4 expression in immunohistochemistry C: Photograph, D: Oct4 expression photograph and nuclear dyed photograph).
이러한 Oct4와 같은 유전자는 줄기세포의 stemness와 매우 밀접하게 관련되어 있으며, 실제로 Oct4, Sox2등과 같은 유전자를 과발현시켜 성체줄기세포에서 배아줄기세포와 유사한 구조의 전능성을 지닌 세포를 유도하는 기술 또한 최근에 연구되었다(Takahashi et al, Cell, 131(5), 861-872, 2007). 따라서 줄기세포에서 이러한 유전자의 발현은 줄기세포의 stemness를 잃지 않으면서 미분화상태를 유지하는데 있어 매우 중요하다 할 수 있다. 따라서 본 발명에 의해 분리한 제대혈유래 만능줄기세포에서 기존의 논문에 의해 알려진 ZNF281, Oct-4, Sox2와 같은 유전자의 발현이 어떻게 나타나는지 역전사중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 통하여 확인해 보기로 하였다.
These genes, such as Oct4, are closely related to the stemness of stem cells. In fact, overexpression of genes such as Oct4, Sox2 and the like has led to the development of cells with embryonic stem cell- (Takahashi et al, Cell, 131 (5), 861-872, 2007). Therefore, the expression of these genes in stem cells can be very important for maintaining the undifferentiated state without losing the stemness of the stem cells. Therefore, we confirmed the expression of genes such as ZNF281, Oct-4, and Sox2 known from the existing papers in cord blood-derived pluripotent stem cells isolated by the present invention through reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) .
본 실시예를 위해 작제된 프라이머는 다음 표 2와 같다.
The primers prepared for this Example are shown in Table 2 below.
도 6에서 실험 결과를 보면, Oct-4, Sox2, c-myc, ZNF281, REX-1등의 유전자가 발현하는 것을 확인할 수 있다. 이것은 본 발명에 따른 제대혈 유래 줄기세포의 만능줄기세포로서의 능력을 보여주는 것이라 할 수 있을 것이다.
6, it can be seen that genes such as Oct-4, Sox2, c-myc, ZNF281 and REX-1 are expressed. This can be said to be the ability of the umbilical cord blood-derived stem cells according to the present invention as pluripotent stem cells.
실시예Example 4: 본 발명에 따른 4: According to the present invention 제대혈유래Derived cord blood 만능줄기세포의 Of pluripotent stem cells 골형성Osteogenesis 세포로의 분화 Differentiation into cells
골형성 세포로 분화를 유도하기 위하여 세포를 부착시키고, 세포가 부착되고 나서 약 70-80% confluency가 될 때까지 배양하였다. 70-80% confluency에 도달했을 경우 골분화 유도 배지로 교환하였다. 골분화 유도 배지는 DMEM low glucose에 10% FBS를 첨가하고, 10 mM beta-glycerophosphate (Sigma-Aldrich), 0.1 μM Dexamethasone (Sigma-Aldrich), 50 μM ascorbate (Sigma-Aldrich)를 첨가하여 제조하였다. 배지는 3일마다 교환해주고, 분화유도는 약 2주간 실시하였다.To induce differentiation into osteogenic cells, the cells were adhered and cultured until the cells became adherent to about 70-80% confluency. When 70-80% confluency was reached, the cells were replaced with bone differentiation induction medium. The differentiation induction medium was prepared by adding 10% FBS to DMEM low glucose and adding 10 mM beta-glycerophosphate (Sigma-Aldrich), 0.1 μM Dexamethasone (Sigma-Aldrich) and 50 μM ascorbate (Sigma-Aldrich). The medium was changed every 3 days, and induction of differentiation was performed for about 2 weeks.
2주후 골분화로 인한 calcium mineralization을 확인하기 위해 Alizarin red s staining을 실시하였다. 염색방법은 다음과 같다. 배지를 제거한 다음 증류수를 이용해 2번 세척 후, 차가운 70% EtOH를 사용하여 4℃에서 1시간 고정하였다. 다시 증류수로 2회 세척 후 40mM Alizarin red s를 사용하여 상온에서 10분간 염색하였다. 그리고 나서 증류수를 이용하여 5회 세척하였다. After 2 weeks, Alizarin red staining was performed to confirm calcium mineralization due to bone differentiation. The dyeing method is as follows. After the medium was removed, the cells were washed twice with distilled water and fixed with cold 70% EtOH at 4 ° C for 1 hour. After washing twice with distilled water, the cells were stained with 40 mM Alizarin red s for 10 minutes at room temperature. Then, it was washed five times with distilled water.
염색을 실시한 결과, 도 7A, 도 7B에 나타난 바와 같이 분화를 유도하지 않은 도 7A는 Alizarin red s에 염색된 칼슘이 거의 보이지 않지만, 분화를 유도한 도 7B에서는 적색으로 염색이 되는 것을 관찰할 수 있다. 이것은 제대혈유래 만능 줄기세포가 골형성세포로 분화하며 칼슘을 분비함을 의미한다고 볼 수 있다.
As a result of the staining, as shown in Fig. 7A and Fig. 7B, in Fig. 7A in which no differentiation was induced, almost no calcium stained in Alizarin red s was observed, but in Fig. 7B that induced differentiation, have. This suggests that umbilical cord blood-derived pluripotent stem cells differentiate into osteogenic cells and secrete calcium.
실시예Example 5: 본 발명에 따른 5: According to the present invention 제대혈유래Derived cord blood 만능줄기세포의 지방 세포로의 분화 Differentiation of pluripotent stem cells into adipocytes
지방세포 분화를 유도하기 위해서 세포가 부착되고 나서 약 70-80% confluency가 될 때까지 배양하였다. 70-80% confluency에 도달했을 경우 지방분화 유도 배지로 교환하였다. 지방분화 유도 배지는 DMEM low glucose에 10% FBS를 첨가하였다. 1μM Dexamethasone, 10㎍/ml insulin (Sigma-Aldrich), 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine(Sigma-Aldrich), 0.2 mM indomethacin(Sigma-Aldrich)을 첨가하여 분화배지를 제조하였다. 분화유도 배지는 3일마다 교환해주고, 분화유도는 약 2-3주간 실시하였다.To induce adipocyte differentiation, the cells were incubated until adhered to about 70-80% confluency. When 70-80% confluency was reached, the cells were replaced with fat-differentiation induction medium. DMEM low glucose supplemented with 10% FBS. The differentiation medium was prepared by adding 1 μM Dexamethasone, 10 μg / ml insulin (Sigma-Aldrich), 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (Sigma-Aldrich) and 0.2 mM indomethacin (Sigma-Aldrich). Differentiation induction medium was changed every 3 days, and induction of differentiation was carried out for about 2-3 weeks.
2-3 주후 Oil red O 염색을 실시하여 지방분화가 유도된 것을 확인한다. 배지를 제거하고 PBS를 이용하여 세척한 후 10% formalin을 넣고 상온에서 5분간 두었다. 포르말린을 제거하고, 다시 새로운 포르말린을 동량 넣고 상온에서 최소 1시간 이상 고정하였다. 포르말린을 제거한 후에, 60% isopropanol을 이용하여 세척하였다. 완전히 마를 때까지 기다린 후, Oil Red O 염색약을 넣고 상온에서 10분간 염색하였다. 염색약을 제거한 후, 곧바로 증류수를 넣고 세척하였다.After 2-3 weeks, oil red O staining was performed to confirm that the lipidation was induced. The medium was removed, washed with PBS, and 10% formalin was added thereto at room temperature for 5 minutes. Formalin was removed and fresh formalin was added at the same temperature for at least 1 hour. After the formalin was removed, it was washed with 60% isopropanol. After waiting until it was completely dried, Oil Red O dye was added and stained at room temperature for 10 minutes. After the dye was removed, it was immediately washed with distilled water.
지방 줄기세포로의 분화를 거치는 세포들은 oil red O에 의해 염색되었을 때 붉은 색을 나타내는데, oil red O는 지방세포의 lipid droplet을 붉은 색으로 염색하기 때문이다. 도 7C 및 7D에서 보는 바와 같이, 분화를 유도하지 않은 도 7C는 lipid droplet이 많이 보이지 않을 뿐만 아니라 염색도 거의 되지 않지만, 분화를 유도한 도 7D는 lipid droplet이 많이 보이고 붉은 색으로 염색된 것을 관찰할 수 있다.
Cells that undergo differentiation into adipose stem cells are red when stained with oil red O, while oil red O stains red cells with lipid droplets of adipocytes. As shown in FIGS. 7C and 7D, in FIG. 7C, which induces differentiation, lipid droplet is not much visible, and there is little dyeing. However, FIG. 7D which induces differentiation shows that lipid droplet is much visible and reddish can do.
실시예Example 6: 본 발명에 따른 6: According to the present invention 제대혈유래Derived cord blood 만능줄기세포의 연골 세포로의 분화 Differentiation of pluripotent stem cells into chondrocytes
연골 세포로 분화를 유도하기 위해, Lonza에서 나온 rTGF-beta 3을 함유한 연골세포 형성 배지(PT-3003)에 3주 동안 처리하였다. 배지는 일주일에 두 번씩 갈아주고, 연골세포 형성(osteogenesis)은 1주 간격으로 측정하였다.To induce differentiation into chondrocytes, chondrocyte-forming medium (PT-3003) containing rTGF-
연골세포로 분화되었는지 알아보기 위해, toluidine blue staining을 실시하였다. 세포들을 10시간동안 4% 포름알데하이드로 고정하고, 그 후 다시 10시간 동안 picric acid로 고정하였다. 그 후 cryosection 하여 3분동안 toluidine blue staining을 하였고, hematoxilin으로 3초 동안 counterstaining을 하였다.To determine whether the cells were differentiated into chondrocytes, toluidine blue staining was performed. Cells were fixed with 4% formaldehyde for 10 h and then fixed with picric acid for another 10 h. After cryosection, staining was performed for 3 minutes with toluidine blue and counterstaining with hematoxylin for 3 seconds.
연골 세포로의 분화를 거치는 세포들은 pellet이 무너지지 않고 일정한 형태를 유지하며 toluidine blue에 의해 염색되었을 때 푸른 색을 나타내는데, 도 7E 및 도 7F에서 나타난 바와 같이, 푸른 색으로 염색되어 있는 것을 확인할 수 있으며, 형태도 잘 유지하고 있는 것을 확인할 수 있다.
Cells that undergo differentiation into chondrocytes exhibit a blue color when they are stained with toluidine blue, maintaining a constant shape without collapsing the pellet. As shown in FIGS. 7E and 7F, the cells are stained with blue color , And the shape is maintained well.
실시예Example 7: 본 발명에 따른 7: According to the present invention 제대혈유래Derived cord blood 만능줄기세포의 Of pluripotent stem cells 골형성세포Osteogenic cells 및 지방세포로 분화 유도 후 유전자 발현 레벨의 변화 And the level of gene expression after induction of differentiation into adipocytes
줄기세포는 분화 과정을 거치면서 유전자 발현의 양상이 현저하게 변화하는 것을 관찰할 수 있다. 일반적으로 줄기세포가 지방세포로 분화를 하게 되면 PPAR-γ(Peroxisome Proloferator-activated Receptor-γ)나 FABP4(Fatty Acid Binding Protein 4)와 같은 유전자의 발현이 증가하고, 골형성세포로 분화하게 되면 Collagen Type 1등의 유전자 발현이 증가한다.(Mathews et al., J Am Acad Dermatol, 56(3), 472-492, 2007; Cho et al., J. Cell. Biochem., 96, 533-542, 2005). 따라서 분화를 유도한 후 특정 세포에서 발현하는 유전자의 발현 레벨을 봄으로써 간접적으로 분화를 확인할 수 있다. 실험 방법은 다음과 같다.As the stem cells undergo differentiation, we can observe a remarkable change in the expression pattern of the gene. In general, when stem cells differentiate into adipocytes, the expression of genes such as PPAR-γ (Peroxisome Proloferator-activated Receptor-γ) and FABP4 (Fatty Acid Binding Protein 4) increases,
골형성세포와 지방세포를 각각 유도 2-3주 후에 Trizol (Invitrogen)을 이용하여 RNA를 추출하였다. AccuPower RT Premix(Bioneer)를 사용하여 cDNA를 합성하고, Maxime PCRPreMix Kit(Intronbio)를 이용하여 PCR을 수행하였다.
RNA was extracted using Trizol (Invitrogen) after induction of osteogenic cells and adipocytes, respectively. CDNA was synthesized using AccuPower RT Premix (Bioneer) and PCR was performed using Maxime PCRPreMix Kit (Intronbio).
본 실시예에 사용하기 위해 작제한 프라이머는 다음 표 3과 같다.
Table 3 shows the restriction primers for use in this example.
실험을 실시한 결과, 도 8에서 볼 수 있듯이 지방세포 분화 마커인 PPAR-γ와 FABP4는 분화를 유도한 세포에서 발현이 크게 증가하는 것을 볼 수 있으며, 골형성세포의 분화 마커인 Collagen Type 1의 경우도 마찬가지로 분화 유도한 세포에서 크게 증가하는 것을 볼 수 있었다. 한편, loading control인 GAPDH의 경우 분화 유도한 세포와 하지 않은 세포 모두 동일하게 나왔으며, 따라서 실험결과의 정당성을 뒷밤침하였다.
As shown in FIG. 8, PPAR-γ and FABP4, which are adipocyte differentiation markers, show a significant increase in expression in cells inducing differentiation. In the case of
실시예Example 8: 본 발명에 따른 8: According to the present invention 제대혈유래Derived cord blood 만능줄기세포의 신경 세포로의 분화 Differentiation of pluripotent stem cells into neurons
신경 세포로 분화를 유도하기 위해, 일단 5% FBS, 10ng/ml bFGF(basic Fibroblast Growth Factor)를 함유한 DMEM으로 구성된 배지에서 24시간 동안 전처리(preincubation)하였다. 본격적인 신경 분화를 유도하기 위해서 1% DMSO, 100uM BHA, 0.5mM VPA, 10mM KCl, 10ng/ml NGF, B27를 함유한 DMEM으로 구성된 신경세포 형성 배지에 24시간 동안 처리하였다. 신경세포로 분화되었는지 알아보기 위해, 세포를 4% paraformaldehyde에 고정한 후 Tuj-1, MAP-2, GFAP, Neurofilament-160의 신경 세포 마커로 면역염색을 하였을 경우 네 가지 마커를 발현하는 것을 확인할 수 있었다(도 7G).
To induce differentiation into neurons, preincubation was carried out in a medium consisting of DMEM containing 5% FBS and 10 ng / ml bFGF (basic fibroblast growth factor) for 24 hours. In order to induce full-scale neural differentiation, the cells were treated with neuronal cell-forming medium consisting of DMEM containing 1% DMSO, 100 uM BHA, 0.5 mM VPA, 10 mM KCl, 10 ng / ml NGF and B27 for 24 hours. To determine whether the cells were differentiated into neurons, the cells were fixed in 4% paraformaldehyde and immunostaining with neuronal markers of Tuj-1, MAP-2, GFAP and Neurofilament-160 revealed four markers (Fig. 7G).
실시예Example 9: 본 발명에 따른 제대혈 유래 9: Umbilical cord blood origin according to the present invention 중간엽Intermediate lobe 줄기세포의 망막( Stem cell retinas ( retinaretina ) 관련 특성 단백질 발현 분석) Analysis of protein expression
본 실시예는 제대혈유래 만능줄기세포에서 망막(retina) 관련 특성을 알아보기 위해서 면역형광염색법을 이용하여 발현정도 및 패턴에 관해 확인하였다.
In this example, the degree and pattern of expression were determined using immunofluorescence staining to determine the retina-related characteristics in umbilical cord blood-derived pluripotent stem cells.
망막(retina)에서만 특이적으로 발현하는 단백질의 발현 양상을 확인하였다.The expression pattern of the protein specifically expressed in the retina was confirmed.
도 9는 망막에서 특이적으로 발현하는 단백질을 면역형광염색을 통하여 발현 양상을 확인한 사진이다. A)에서는 PAX6 및 Hu protein의 발현양상을 관찰하였다. PAX6는 retina progenitor marker로 알려져 있으며, Hu protein은 망막을 구성하는 세포 중 하나인 ganglion cell 및 amacrine cell에서 특이적으로 발현하는 단백질이다. 일반적인 세포 배양 상태에서는 발현하지 않는 것을 확인하였다.9 is a photograph showing the expression patterns of proteins specifically expressed in the retina through immunofluorescence staining. A), the expression pattern of PAX6 and Hu protein was observed. PAX6 is known as a retina progenitor marker, and Hu protein is a protein specifically expressed in ganglion cells and amacrine cells, which constitute the retina. It was confirmed that the cells did not express in a normal cell culture condition.
B)에서는 Opsin과 Rhodopsin의 발현양상을 확인하였다. Opsin의 경우는 Cone cell에 특이적으로 발현하는 단백질이며, Rhodopsin의 경우는 rod cell에 특이적으로 발현하는 단백질이다. 일반적인 세포 배양 상태에서 Opsin은 발현하지 않았지만 Rhodopsin은 발현하는 것을 확인하였다.B), the expression patterns of Opsin and Rhodopsin were confirmed. In the case of Opsin, it is a protein specifically expressed in a cone cell. In the case of Rhodopsin, it is a protein specifically expressed in a rod cell. Opsin was not expressed in normal cell culture but Rhodopsin was expressed.
C)에서는 CRX 및 Recoverin의 발현양상을 확인하였다. CRX는 pan-photoreceptor marker로 알려져 있으며, Recoverin은 photoreceptor marker로 알려져 있다. 일반적인 세포 배양 상태에서는 발현하지 않는 것을 확인하였다.C), the expression patterns of CRX and Recoverin were confirmed. CRX is known as a pan-photoreceptor marker, and Recoverin is known as a photoreceptor marker. It was confirmed that the cells did not express in a normal cell culture condition.
(배율 400배, scale bar = 50um)
(Magnification 400 times, scale bar = 50um)
실시예Example 10: 본 발명에 따른 10: According to the present invention 제대혈유래Derived cord blood 만능줄기세포에서 분비된 사이토카인 분석 Analysis of cytokines secreted from pluripotent stem cells
줄기세포를 이용한 치료의 가능성은 크게 두 가지로 나뉠 수 있다. 첫 번째는 손상된 세포로의 직접적인 분화를 통한 치료효과이며, 두 번째는 생체내에서 기존의 세포들에게 치료효과를 나타낼 수 있는 긍정적인 변화를 일으킬 여러 사이토카인이나 성장인자를 분비하는 능력이다. 일반적으로 줄기세포는 여러 사이토카인 또는 성장인자를 분비하는 것으로 알려져 있다(Kim et al. Cytokine. 2005). 이러한 효과를 paracrine effect라 부른다. 본 발명에 의하여 분리, 증식한 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 사이토카인 분비 양상이 어떠한지 알아보기 위해, human Cytokine antibody array(RaybioTech. Norcross, USA)를 이용하여 조사해 보았다.The possibility of treatment using stem cells can be largely divided into two. The first is the therapeutic effect through direct differentiation into damaged cells, and the second is the ability to secrete multiple cytokines or growth factors that cause a positive change in vivo to have a therapeutic effect on existing cells. In general, stem cells are known to secrete several cytokines or growth factors (Kim et al. Cytokine. 2005). This effect is called the paracrine effect. To investigate the secretory pattern of cytokine secretion from umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells isolated and proliferated according to the present invention, a human cytokine antibody array (RaybioTech. Norcross, USA) was used.
우선 FBS와 Supplement를 제거한 배양액을 이용하여 세포를 24시간 안정화시킨 후, 2시간 간격으로 배지를 1ml씩 수집하였다. 수집한 배지를 100㎕씩 합쳐 단백질 정량법을 이용하여 정량한 후, array를 실시하였다.First, the cells were stabilized for 24 hours using the culture medium from which FBS and Supplement were removed, and then 1 ml of medium was collected every 2 hours. After collecting 100 μl of each of the collected media, quantification was carried out using protein quantification method, and array was performed.
도 10에서 볼 수 있듯이, 세 개의 다른 샘플로부터 분리한 제대혈 유래 만능줄기세포에서 공통적으로 IL-8, TIMP-2 등이 분비되는 것을 확인할 수 있었으며, 그 외 TGF-β, RANTES, CINC-3, EOTAXIN, GM-CSF, IFN-γ, IL-1b, IL-3, IL-6, IL-10, IL12p40, IL13, IL-16, IP-10, Leptin, MCP-2, MIG, MIP-3a, b-NGFm, sTNFRI, PFGF-bb와 같은 사이토카인들도 분비되는 것을 확인할 수 있었다(도 10A: hUCB-MSC1의 array 분석 사진, 도 10B: hUCB-MSC2, 도 10C: hUCB-MSC3, 도 10D: antibody 배열 순서).
As shown in FIG. 10, it was confirmed that IL-8 and TIMP-2 were secreted from cord blood-derived pluripotent stem cells isolated from three different samples. In addition, TGF-β, RANTES, CINC- 3, IL-6, IL-10, IL12p40, IL13, IL-16, IP-10, Leptin, MCP-2, MIG- (Fig. 10A: array analysis of hUCB-MSC1, Fig. 10B: hUCB-MSC2, Fig. 10C: hUCB-MSC3, Fig. 10D: antibody array order).
실시예Example 11: 본 발명에 따른 11: According to the present invention 제대혈유래Derived cord blood 만능줄기세포의 삼차원 배양 Three-dimensional culture of pluripotent stem cells
성체줄기세포는 일반적으로 culture dish에서 monolayer로 증식한다. 하지만 2D가 아닌 3D상태의 sphere로 증식시키면 더욱 stemness가 높은 세포를 선별하고 증식시킬 수 있음을 실험을 통해 확인하였다. sphere의 형성을 위하여 culture dish를 0.7% agarose로 coating을 시키는데 세포가 dish 바닥으로 침투하지 못하게 coating은 5mm 이상 되도록 한다. 세포를 seeding할 때에, single cell간의 부착을 최소화하기 위해 cm2당 2000개미만의 세포를 뿌렸다. 이렇게 얻어진 sphere는 40㎛ strainer를 이용하여 sphere를 형성하지 못한 single cell과 구분하였다. 그 결과 도 11a에서 보는 바와 같이 sphere culture 시에 세포사하지 않고 sphere를 형성하여 줄기세포의 특징을 유지하는 것을 관찰할 수 있다. 또한 도 11a-D와 같이sphere culture를 통해 배양한 세포는 monolayer에서 배양한 줄기세포에 비해 상대적으로 OCT4, SOX2 등의 embryonic marker의 발현이 높게 나타나는 것을 관찰할 수 있었다.Adult stem cells generally proliferate from culture dish to monolayer. However, it has been confirmed through experimentation that it is possible to select and proliferate more stem cells by proliferating into sphere of non-2D 3D state. For formation of sphere, culture dish is coated with 0.7% agarose so that coating is not less than 5mm so that cells do not penetrate into dish bottom. When seeding the cells, only 2,000 cells per cm 2 were sprinkled to minimize adhesion between single cells. The obtained sphere was separated from a single cell which did not form a sphere using a 40 μm strainer. As a result, as shown in FIG. 11 (a), it is observed that spherical cells are retained in sphere culture by forming sphere without cell death. Also, as shown in FIG. 11A-D, the cells cultured through the sphere culture showed higher expression of embryonic markers such as OCT4 and SOX2 relative to the stem cells cultured in the monolayer.
Embryonic stem cell의 배양은 Mouse embryonic fibroblast cell 상에서 이루어진다. Mouse embryonic fibroblast cell이 내놓는 LIF 등 여러 가지 chemokine이 ES cell의 형태를 유지하고 분화하지 않도록 막는 역할을 해주기 때문이다. 제대혈유래 만능줄기세포를 mouse embryonic fibroblast cell line 상에서 배양한 결과 일반적인 성체줄기세포의 형태처럼 편평한 것이 아니라 삼차원적인 형태로 colony를 이루는 것을 관찰하였다. STO cell은 mitomycin C를 0.1 mg/ml로 처리하여 증식을 억제한 후에 0.1% gelatin이 coating된 dish에 2 x 105 cell/ml로 seeding한 후 24시간 배양한 후 제대혈유래 만능줄기세포를 seedign하였다. 그 결과, 도 11b에서 보는 바와 같이 시간이 지남에 따라 세포가 STO cell위에서 Embryonic stem cell과 유사하게 증식하는 것을 관찰할 수 있다.
Embryonic stem cell culture is performed on mouse embryonic fibroblast cells. This is because many chemokines such as LIF produced by mouse embryonic fibroblast cells prevent ES cells from retaining their shape and differentiation. When umbilical cord blood - derived pluripotent stem cells were cultured on a mouse embryonic fibroblast cell line, they were observed to form a colony in a three - dimensional form rather than a flat form as a typical adult stem cell form. STO cells were treated with mitomycin C at a concentration of 0.1 mg / ml to inhibit proliferation, seeded at a concentration of 2 × 10 5 cells / ml in a dish coated with 0.1% gelatin, cultured for 24 hours, and seeded with umbilical cord blood-derived pluripotent stem cells . As a result, as shown in FIG. 11B, it can be observed that cells proliferate similarly to embryonic stem cells on STO cells over time.
Claims (5)
(a) 전사조절인자인 c-myc에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타냄;
(b) 세포외기질이 코팅된 바닥에 부착되어 부착 후 5 내지 30일 사이에 선 형태 또는 구 형태의 세포 집락을 이루면서 증식함;
(c) 30 내지 45의 CPDL(cumulative population doubling level)을 보임;
(d) CD14, CD31, CD34, CD45 및 HLA-DR에 대하여 음성의 면역학적 특성을 나타냄;
(e) 중배엽, 내배엽 및 외배엽의 세포로 분화 가능함; 및
(f) TIMP-2, TGF-β, RANTES CINC-3, EOTAXIN, GM-CSF, IFN-γ, IL-1b, IL-3, IL-6, IL-8, IL-10, IL12p40, IL13, IL-16, IP-10, Leptin, MCP-2, MIG, MIP-3a, b-NGFm, sTNFRI, PFGF-bb로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 사이토카인 또는 케모카인을 분비함.
Derived umbilical cord blood-derived pluripotent stem cells exhibiting positive immunological properties against ZNF281, a transcription factor.
(a) exhibits positive immunological properties for the transcription factor c-myc;
(b) adheres to a bottom coated with an extracellular matrix and proliferates in a linear or spherical cell population between 5 and 30 days after attachment;
(c) show a cumulative population doubling level of 30 to 45;
(d) show immunological properties of negative for CD14, CD31, CD34, CD45 and HLA-DR;
(e) differentiable into mesoderm, endoderm and ectodermal cells; And
IL-6, IL-8, IL-10, IL12p40, IL13, IL-10, At least one cytokine or chemokine selected from the group consisting of IL-16, IP-10, Leptin, MCP-2, MIG, MIP-3a, b-NGFm, sTNFRI, PFGF-bb.
A stem cell culture medium comprising EGM-2 or SNU-1 medium supplemented with at least one selected from IGF-I or VEGF, fetal bovine serum (FBS), bFGF, ascorbic acid, EGF, hydrocortisone and heparin.
A method for proliferating stem cells, comprising culturing stem cells in a sphere culture or three-dimensional culture to increase stemness.
4. The method according to claim 3, wherein the stem cell is a ZNF281-expressing umbilical cord blood-derived stem cell.
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