KR20140039449A - Antibiotic peptide analogues with high antibacterial activities against mutidrug resistant bacteria designed from protaetiamycine and their uses - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 흰점박이 꽃무지유충으로부터 분리된 프로태티아마이신 항균펩타이드 유도체 및 그의 다제내성균에 대한 항균제로서의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a protothyramycin antimicrobial peptide derivative isolated from a white spotted flower larva and its use as an antimicrobial agent against multidrug-resistant bacteria.
페니실린 이후 수많은 종류의 항생제가 개발되어 생체에 외부침입의 세균을 퇴치를 위하여 사용되어 왔다. 그러나 최근에 들어서 이들 항생제에 내성을 가지는 균주들이 등장하여 큰 문제로 여겨진다. 생명에 위협을 가할 수 있는 엔테로코쿠스 패칼리스 (Enterococcus faecalis), 마이코박테리움 투버쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis) 및 슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa) 등의 세균 종들은 지금까지 알려진 여러 종류의 항생제에 대한 저항력을 키워왔다 (Stuart B. Levy, Scientific American, 46-53, 1998). Since penicillin, a number of antibiotics have been developed and used to combat bacterial infiltration into the body. Recently, however, strains resistant to these antibiotics have emerged and are regarded as a big problem. Bacterial species such as Enterococcus faecalis, Mycobacterium tuberculosis and Pseudomonas aeruginosa, which can pose a life threatening effect, are known to be effective against various antibiotics known so far (Stuart B. Levy, Scientific American, 46-53, 1998).
페니실린, 세파로스포린등과 같은 종래의 화학항생제는 미생물의 세포벽 또는 단백질의 합성저해에 의하여 항생작용을 나타낸다. 이들 내성균주를 퇴치할 수 있는 새로운 작용 메카니즘을 가지는 항생제의 개발이 시급한 실정이며 종래의 화학 항생제와 상이한 항생기전을 나타내는 항생펩타이드들은 새로운 개념의 차세대 항생제로서 주목을 받고 있다 (Zasloff M. Curr Opin Immunol 1992 4, 3-7; Boman, H. G., Cell, 65:205, 1991; Boman, H. G. J Intern Med. 2003, 254(3), 197-215; Hancock, R. E., & Scott, M. G., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2000, 97, 8856-8861, Zasloff, M., Nature 2002, 415, 389-395). Conventional chemical antibiotics, such as penicillin, cephalosporin, etc., exhibit antibiotic action by inhibition of cell wall or protein synthesis of microorganisms. It is urgent to develop antibiotics having a new action mechanism capable of exterminating these resistant strains. Antibiotic peptides exhibiting different antibiotic mechanisms from conventional chemical antibiotics are attracting attention as a new concept of next generation antibiotics (Zasloff M. Curr Opin Immunol 1992 4, 3-7; Boman, HG, Cell, 65: 205, 1991, Boman, HG J Intern Med 2003, 254 (3), 197-215; Hancock, RE, & Scott, MG, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000, 97, 8856-8861, Zasloff, M., Nature 2002, 415, 389-395).
최근 다제내성균 중에 P. aeruginosa와 A.baumannii는 내인성으로 획득내성 또한 가장 빈번하게 일어나는 균종에 속해서 항균제 내성 문제가 심각한 균종으로 알려져 있다. P. aeruginosa, A.baumannii에서 다제내성은 아미노글리코사이드, 플로로퀴놀론, 카바페넴등 3가지 계열의 약제에 모두 내성인 균주를 의미하며, 이런 다제내성 균종은 카바페넴이 거의 유일하게 유효한 항균제였는데, 10여 년간 카바페넴에도 내성인 균주가 증가하면서 항균제 치료에 큰 제한이 생겼다는 공통점을 보인다. Recently, P. aeruginosa and A.baumannii are known to be endogenous resistant bacteria, and most of them are resistant to antimicrobial resistance. In P. aeruginosa and A.baumannii, multidrug resistance refers to a strain resistant to all three classes of drugs, including aminoglycosides, fluroquinolones, and carbapenems, and carbapenem was almost the only effective antimicrobial agent , And increased resistance to carbapenem for over a decade, suggesting a major limitation in the treatment of antimicrobial agents.
녹농균 또는 슈도모나스 에루지노사 (Pseudomonas aeruginosa)는 그람 음성균이며, 흔한 감염성 병원균으로서, 항생제에 대한 감수성이 낮아 자연적으로 쉽게 항균제 내성을 획득할 수 있다고 알려져 있다. 다제내성녹농균 (MRSA) 감염증은 카바페넴계, 아미노글리코사이드계, 플로로퀴놀론계 항생제에 모두 내성인 다제내성녹농균 (Multidrug-Resistant Pseudomonas aeruginosa)에 의한 감염 질환으로서 병원에 입원한 많은 환자에게 정착되며 자연적으로 많은 항균제에 내성을 가지나 aminoglycoside, 광범위 페니실린과 cephalosporin에 감수성이 있다. 이러한 다제내성을 가진 균은 현재 치료가 어려우며, 진행성의 질환을 가진 경우 사망률이 높다. 이러한 다제내성 녹농균을 치료하기 위하여 광범위 항균제의 사용은 다제내성 장내세균과 Pseudomonas의 증가를 초래한다. 수술을 위한 예방적 항균제 사용은 가능한 한 좁은 범위의 항균제를 투여하고, 최대 24시간으로 제한한다. 3가지 계열 이상의 항생제에 내성을 갖는 다제내성녹농균은 전세계적으로 증가하는 추세이고 미국의 중환자실감시에서 1993년 4%에서 2002년 14%로 증가하였고 (4개계열중 3개 이상에 내성), 유럽의 EARSS 보고에서는 2007년 17.2%로 나타내었다 (5개계열중 3개 이상에 내성). 국내의 중소병원에서 대제내성률이 23.1% (2006)로 보고되고 있으며 종합병원급에서의 카바페넴 내성률은 29% (2006)로 보고된 이래 증가 추세이다. 다제내성 녹농균에 의하여 피부감염, 욕창, 각막염, 중이염, 심내막염, 폐렴, 균혈증, 패혈증, 수막염과 뇌종양 등을 유발하고 주요 병원감염 원인으로 흔히 요로감염과 인공호흡기관련 폐렴 등이 발생되고 있다. 인공호흡기를 사용하는 호흡기계 감염, 화상 감염, 낭포성 섬유증 환자의 폐렴, 요로 감염을 유발하며, 인공환기기, 흡인카테터, 고여 있는 오염된 물 등의 감염소에 존재하다가 환자에게 직, 간접적으로 전파되어 정착하게 되는데 진행성의 질환을 가진 환자의 경우에는 치료가 어려워 높은 사망률을 보이는 것으로 알려져 있다. Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative bacterium that is a common infectious pathogen and has low sensitivity to antibiotics. Therefore, it is known that Pseudomonas aeruginosa can easily acquire antimicrobial resistance naturally. MRSA infections are multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa resistant to carbapenem, aminoglycoside, and fluoroquinolone antibiotics, and are established in many hospitalized patients. It is naturally resistant to many antimicrobial agents but susceptible to aminoglycosides, broad penicillins and cephalosporins. These multidrug-resistant bacteria are currently difficult to treat and have a high mortality rate with progressive disease. The use of broad-spectrum antimicrobial agents to treat such multidrug-resistant P. aeruginosa results in an increase in multidrug resistance intestinal bacteria and Pseudomonas. The use of prophylactic antimicrobial agents for surgery should be limited to a maximum of 24 hours, with as little of the antimicrobial agent as possible. Resistant P. aeruginosa strains resistant to three or more classes of antibiotics are increasing worldwide and have increased from 4% in 1993 to 14% in 2002 (more than 3 out of 4) In the European EARSS report, it was 17.2% in 2007 (resistant to more than 3 out of 5 lines). The prevalence rate of high-dose immunosuppression was 23.1% (2006) in small hospitals in Korea, and the rate of carbapenem resistance in general hospitals was 29% (2006). Pneumonia, septicemia, sepsis, meningitis, and brain tumor caused by pseudomonas aeruginosa, pneumonia, keratitis, otitis media, endocarditis, pneumonia, meningitis and brain tumor. It causes respiratory infections using respirators, burn infections, pneumonia in patients with cystic fibrosis, and urinary tract infections. It is present in infected areas such as artificial ring devices, aspiration catheters, and contaminated water, It is known that patients with progressive disease have high mortality due to difficulty in treatment.
다제내성 아시네토박터바우마니균(MRAB) 감염증은 카바페넴계, 아미노글리코사이드계, 플로로퀴놀론계 3개 계열 항생제 내성 다제내성아시네토박터바우마니균 (Multidrug-Resistant Acinetobacter baumannii)에 의한 감염 질환으로서, 전세계적으로 증가하는 추세이고, 영국 중환자실 혈류감염균의 카바페넴 내성률은 1998년 0%에서 2006년 55%로 증가하였고 2006~2007년 미국 중환자실 병원감염감시 결과 카바페넴 내성률은 29.2%였으며, 국내의 종합병원에서 분리되는 Acinetobacter baumannii의 내성률은 해마나 증가하는 경향이 있으며, 2009년 imipenem 내성률은 51%였고, amikacin, ciprofloxacin과 ceftazidime 내성률은 각각 47%, 71%, 70%이었다. 2008년6월부터 2009년 7월 동안 국내 중환자실 병원감염감시 결과 카바페넴 내성률은 68.9%였다. 다제내성아시네토박터바우마니균 감염증은 건강인은 감염위험이 매우 적으나 면역저하자, 만성폐질환자, 당뇨환자는 감염에 보다 취약하며 입원환자 특히 인공호흡기구 착용자, 장기간 입원환자는 감염 위험성이 높다고 알려져 있다. 폐렴, 혈류감염, 창상감염을 유발하여 감염에 따라 다양한 증상을 나타내는 것으로 알려졌다. (MRAB) infectious disease is an infectious disease caused by a multidrug-resistant multidrug-resistant Acinetobacter baumannii, which is a carbapenem, aminoglycoside, and fluoroquinolone-based three antibiotic resistant strains. . The rate of resistance to carbapenems in the UK ICU infections was increased from 0% in 1998 to 55% in 2006, and the resistance rate of carbapenem was 29.2% The resistance rate of Acinetobacter baumannii isolated from domestic hospitals tended to increase in hippocampus. In 2009, imipenem resistance rate was 51%, amikacin, ciprofloxacin and ceftazidime resistance rate were 47%, 71% and 70%, respectively. During the period from June 2008 to July 2009, the infection rate of cabapenem was 68.9%. As a result, the risk of infectious diseases is higher in hospitalized patients, especially in patients with respiratory organs, and those in long-term hospitalized patients. It is known to be high. Pneumonia, bloodstream infection, and wound infection.
소위 슈퍼박테리아 출현으로 이어질 수 있는 다제내성균 의료감염 신고현황을 보면, 2011년에 다제내성녹농균 (MRPA) 감염증은 4,433건, 다제내성 아시네토박터바우마니균 (MRAB) 감염증은 1만 3,606건이 신고되었으며, 올해 상반기에만 다제내성 녹농균 (MRPA) 감염증은 3,253건, 다제내성아시토박터바우마니균 (MRAB) 감염증은 11,423건이 신고된 것으로 나타났다. 이와 같은 내성균 증가는 높은 항생제 소비량 (OECD국가 중 1위)과 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있으며, 이러한 항생제 내성을 지난 감염균의 증가는 국민 건강에 심각한 위협이며, 항생제의 사용을 줄이고 적절한 사용을 유도하기 위한 보다 적극적인 대책을 마련하여야 할 것이다.In 2011, there were 4,433 cases of multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa (MRPA) infection, and 13,606 cases of multidrug-resistant Acinetobacterbaumani (MRAB) infections. In the first half of this year, 3,253 cases of multi-drug-resistant Pseudomonas aeruginosa (MRPA) infections were reported, and 11,423 cases of multi-drug-resistant Actobacter Baumani infection (MRAB) were reported. It is known that this increased resistance is closely related to high antibiotic consumption (the first among OECD countries), and the increase in the number of infectious bacilli after these antibiotic resistance is a serious threat to public health. It is necessary to prepare more aggressive countermeasures.
오래전부터 반묘, 백강잠, 궁벵이, 거미, 전갈 등의 곤충이 질병치료에 이용되어져 왔는데 그중에 반묘는 가려운 곳을 치료하는 곤충이라고 동의보감에도 기록되어 있다. 곤충은 현재도 여러 분야에서 연구와 응용이 이뤄지고 있는데, 호르몬이나 페로몬은 신경학과 내분비학의 연구에서 응용되고 있으며 기생이나 공생의 구조는 항균제나 해충방제에 응용되고 있다. 최근 들어 곤충으로부터 항생 펩타이드와 항암물질 등을 이용한 새로운 신약 후보 물질에 관심이 늘어나고 있으며, 고지혈증, 당뇨, 비만, 염증치료, 항암에 탁월한 효능을 보이는 활성물질의 탐색이 활발히 진행되어 탁월한 효능을 보이는 활성물질이 많이 밝혀지고 있고, 특히 항생 펩타이드는 기존 항생제에 내성을 가진 균주에 대해서도 활성을 유지하는 것으로 보여진다. 그러므로 곤충으로부터 유래한 항생 펩타이드는 내성 균주의 출연으로 위협받고 있는 기존의 항생제를 대체할 새로운 개념의 항생제 탐색에 중요한 생물자원으로 각광받고 있다.Insects such as semi-crypts, bamboo flies, spider mites, spiders and scorpions have long been used in the treatment of diseases. Insects are still being studied and applied in many fields. Hormones and pheromones are applied in the study of neurology and endocrinology. The parasitic or symbiotic structure is applied to antimicrobial agents and pest control. Recently, interest in new drug candidates using antibiotic peptides and anticancer substances from insects has been increasing, and research has been actively conducted on active substances showing excellent efficacy in hyperlipidemia, diabetes, obesity, inflammation treatment and anti-cancer, Many antibiotic peptides are found to be active against strains resistant to conventional antibiotics. Therefore, antimicrobial peptides derived from insects are emerging as important biomass resources for the search for a new concept of antibiotics to replace existing antibiotics threatened by the appearance of resistant strains.
항생 펩타이드는 구조에 따라 세 개의 그룹으로 나눌 수 있다. 첫 번째는 시스테인이 풍부한 (cysteine-rich) β-쉬트(sheet) 펩타이드이고, 두 번째는 α-나선형 (helical)의 양친매성 펩타이드 분자이며, 세 번째는 프롤린이나 트립토판등의 특정 아미노산이 풍부한 (proline-rich, Trp-rich) 펩타이드이다 (Mayasaki et al., Int. J. Antimicrob. Agents, 9, 269-280, 1998; Andreu, D.; Rivas, L. Biopolymers 1998, 47, 415-433). 이들 항균 펩타이드들은 숙주 방어 및 선천적 면역계에 있어서 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다.Antibiotic peptides can be divided into three groups according to their structure. The first is a cysteine-rich β-sheet peptide, the second is an α-helical amphipathic peptide molecule, and the third is a proline or tryptophan-specific proline -rich, Trp-rich) peptides (Mayasaki et al., Int. J. Antimicrob. Agents, 9, 269-280, 1998; Andreu, D .; Rivas, L. Biopolymers 1998, 47, 415-433). These antimicrobial peptides are known to play an important role in host defense and the innate immune system.
또한, 상기 항균 펩타이드들은 아미노산 서열에 따라 다양한 구조를 갖는데, 이들 구조 중 가장 흔한 것은 곤충에서 발견된 항균 펩타이드인 멜리틴 (melittin)이나 세크로핀 (cecropin)과 같이 시스테인 (cysteine) 잔기가 없고 양친화성 α-나선형을 형성하는 구조이다.In addition, the above-mentioned antimicrobial peptides have various structures depending on the amino acid sequence. Among these structures, the most common ones are those having no cysteine residue such as melittin or cecropin, which are antimicrobial peptides found in insects, It is a structure that forms a harmonic α-helical.
현재까지 밝혀진 곤충유래 항균 단백질로서는 쉬파리과(Sarcophaga peregrina)에서 발견된 sacotoxin Ⅲ(Baba et al, 1987), 노랑초파리(Drosophila melanogaster)에서 발견된 diptericin(Wicker et al 1990), 참검정풍뎅이(Holotrichia diomphalia)에서 발견된 holotricin 3(Lee et al., Biol. Pharm. Bull., 18:1049-1052, 1995), 갈색거저리(Tenebrio molitor)에서 발견된 tenecin 3(Lee et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 218:6-11, 1996), 장수풍뎅이(Allomirina dichotoma)에서 발견된 Defensin, Coleoptericin A and B, 담배나방아과의 Heliothis virescens에서 발견된 heliomicin(Lamberty et al., J. Biol. Chem. 274:9320-9326, 1999), 남방장수풍뎅이(Oryctes rhinoceros)에서 발견된 Rhinocerosin, Scarabaecin, 매미아과의 Cicada flammata에서 발견된 cicadin(Wang and Ng, Peptides, 23:7-11, 2002), 큰우단하늘소(Acalolepta luxuriosa)로부터 발견된 Cecropin, 담배거세미나방(Spodoptera litura)으로부터 발견된 Moricin analogue 등이다. The antimicrobial proteins derived from insects have been identified as sacotoxin III (Baba et al, 1987), diptericin (Wicker et al 1990) and Holotrichia diomphalia (Drosophila melanogaster) found in Sarcophaga peregrina. (Lee et al., Biol. Pharm. Bull., 18: 1049-1052, 1995) found in Tenebrio molitor, Lee et al., Biochem. Commun. 218: 6-11, 1996), defensin, Coleoptericin A and B found in the allomirina dichotoma, heliomicin found in Heliothis virescens of tobacco and bacillus (Lamberty et al., J. Biol. Chem. : 9320-9326, 1999), cicadin (Wang and Ng, Peptides, 23: 7-11, 2002) found in Rhinocerosin, Scarabaecin, Cicada flammata found in Oryctes rhinoceros, Cecropin, found from Acalolepta luxuriosa, from foot of Spodoptera litura, The Moricin the analogue or the like.
본 발명자들은 프로태티아마이신 항균펩타이드 helix영역의 아미노산 서열에 기반하여 높은 항생활성을 가진 9Pbw3의 잔기서열을 특허 등록 (등록번호: 10-1062975) 하였다. 9Pbw3는 항균 활성 농도보다 높은 농도인 16 μM에서 인간의 적혈구 세포에 대하여도 용혈 활성을 전혀 나타내지 않았다. 또한, 9Pbw3의 항생 펩타이드는 염증 유도물질 나이트라이트 옥사이드를 효과적으로 저해하고 동시에 염증유도와 관련된 사이토카인인 mTNF-α와 mMIP-2의 생성을 억제함으로써 이 항생 펩타이드가 항염활성을 나타내며 항염활성을 나타내는 농도범위에서 마우스 대식 세포에 대한 독성이 없으므로 인체의 안전한 고기능성 염증 치료제로 사용할 수 있음을 특허 출원 (특허출원번호: 10-2010-0113182) 하였다. Based on the amino acid sequence of the helix region of the proteasomycin antimicrobial peptide, the present inventors have patented a residue sequence of 9Pbw3 with high antibiotic activity (Registration No. 10-1062975). 9Pbw3 showed no hemolytic activity against human red blood cells at a concentration higher than the antimicrobial activity concentration of 16 μM. In addition, the antibiotic peptide of 9Pbw3 effectively inhibits the inflammatory inducer nitrite oxide and at the same time inhibits the production of mTNF-α and mMIP-2, cytokines related to induction of inflammation. Thus, the antibiotic peptide exhibits anti-inflammatory activity and exhibits anti- (Patent Application No. 10-2010-0113182) that it can be used as a therapeutic agent for safe high-function inflammation of the human body since there is no toxicity to mouse macrophages in the range.
본 발명에서는 높은 항생활성을 가진 9Pbw3에 대해 마우스 섬유아세포에 대한 독성과 여러 항생제에 대한 최근 인류의 생명에 위협을 주고 있어 치료제 개발이 시급한 다제내성 녹농균과 다제내성 아시네토박터균에 대한 항균활성을 측정하여 높은 항균 활성과 활성 농도에서의 낮은 세포 독성으로 인체의 다제내성균에 대한 항균치료제로 응용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.In the present invention, 9Pbw3 having a high antibiotic activity is toxic to mouse fibroblasts and the antimicrobial activity against multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa and multidrug resistant Asnitobacter bacteria, The present invention has been accomplished by confirming that it can be applied as an antimicrobial treatment agent against multi-drug resistant bacteria in human body with high antimicrobial activity and low cytotoxicity at an active concentration.
본 발명은 항균 펩타이드, 프로태티아마이신의 잔기서열로부터 설계된 1종의 항균펩타이드를 합성하고 8종의 항생제 다제내성균주에 대한 항균 활성을 확인하고 동물 세포에 대한 낮은 독성을 확인하는 것을 목적으로 한다. The object of the present invention is to synthesize one kind of antimicrobial peptide designed from the residue sequence of an antimicrobial peptide and a proteasome, to confirm the antimicrobial activity against eight antimicrobial resistant strains of antibiotics and to confirm low toxicity to animal cells .
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 항생 펩타이드를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides an antibiotic peptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 펩타이드는 포유류 정상세포에 대하여 독성을 가지지 않는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.In one embodiment of the invention, the peptide is preferably, but not necessarily, not toxic to normal mammalian cells.
또 본 발명은 상기 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 제공한다.The present invention also provides a pharmaceutical composition comprising the peptide of the present invention as an active ingredient.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 포유류 정상세포에 대하여 독성을 가지지 않는 것이 바람직하고, 상기 조성물은 0에서 50μM의 펩타이드 농도에서 독성을 가지지 않는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.In one embodiment of the present invention, it is preferred that the composition does not have toxicity to mammalian normal cells, and it is more preferable that the composition does not have toxicity at a peptide concentration of 0 to 50 μM, but is not limited thereto.
또 본 발명은 상기 본 발명의 펩타이드를 유효 성분으로 포함하는 미생물에 대한 항균용 조성물을 제공한다.The present invention also provides an antimicrobial composition for a microorganism comprising the peptide of the present invention as an active ingredient.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 다제내성 녹농균과 다제내성 아시네토박터균에 대한 항균 활성을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.In one embodiment of the present invention, the composition preferably has antimicrobial activity against multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa and multidrug-resistant Acinetobacter bacteria, but is not limited thereto.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 다제내성 녹농균은 카바페넴계, 아미노글리코사이드계, 플로로퀴놀론계 항생제에 모두 내성인 다제내성녹농균이고, 상기 다제내성 아시네토박터바우마니균은 카바페넴계, 아미노글리코사이드계 및 플로로퀴놀론계의 3종의 항생제에 대하여 내성을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.In another embodiment of the present invention, the multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa is a multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa that is resistant to both carbapenem-based, aminoglycoside-based, and phloroquinolone-based antibiotics, and the multidrug-resistant acinetobacterbaumani is carbapenem-based It is preferred to have resistance to three antibiotics, aminoglycoside-based and fluoroquinolone-based, but is not limited thereto.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 다제내성 녹농균은 다제내성녹농균 MRPA (2002, 2003, 2095, 2163)이고, 상기 다제내성 아시토박터바우마니균은 아시토박터바우마니균 MRAB (12005, 12035, 12036, 12037)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.In one embodiment of the present invention, the multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa is a multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa MRPA (2002, 2003, 2095, 2163), and the multidrug-resistant acitobacterbaumani bacteria is acitobacterbaumani MRAB (12005, 12035). , 12036, 12037), but is not limited thereto.
또 본 발명은 상기 본 발명의 펩타이드를 유효 성분으로 포함하는 사료용 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for feed comprising the peptide of the present invention as an active ingredient.
이하 본 발명을 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described.
본 발명은 인체에 항생제로서 유용하게 사용될 수 있는 딱정벌레목에 속하는 흰점박이꽃무지(Protaetia brevitarsis)유충으로부터 분리된 프로태티아마이신의 helix영역의 잔기서열을 기반으로 하여 설계된 유도체의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 펩타이드는 기존의 항생 펩타이드에 비해 길이가 짧으며 최근 감염에 대한 치료제 개발이 시급하다고 알려져 있는 다제내성녹농균과 다제내성아시네토박터균인 두 종류의 다제내성균주에 우수한 항균활성을 보인다. 또한 본 발명의 펩타이드는 다제내성균주에 대하여 항균 활성을 보이는 농도에서 세포독성을 전혀 보이지 않으므로 본 발명에 의한 항균펩타이드는 인체에 대한 항균치료제로 유용하게 쓰일 수 있다. The present invention relates to the use of derivatives designed on the basis of the residue sequence of the helix region of the proteasomicin isolated from the white spotted bollworm (Protaetia brevitarsis) larva belonging to the beetle family which can be usefully used as antibiotics in the human body. The peptides of the present invention show excellent antimicrobial activity against two types of multidrug resistant bacteria, which are shorter in length than conventional antibiotic peptides and known to be urgently required for the development of therapeutic agents for recent infections, such as multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa and multidrug-resistant Acinetobacter. In addition, since the peptide of the present invention does not show any cytotoxicity at a concentration showing antimicrobial activity against a multidrug-resistant bacterial strain, the antimicrobial peptide according to the present invention can be effectively used as an antimicrobial therapeutic agent for the human body.
본 발명에서는 흰점박이꽃무지의 유충으로부터 분리된 항균 펩타이드, 프로태티아마이신의 잔기서열로부터 설계된 고항균 유도체를 합성하여 항생제에 대한 다제내성녹농균과 다제내성아시네토박터바우마니균에 대한 항균 활성을 나타냄을 밝히는 것이다. In the present invention, the antimicrobial peptide isolated from the larva of white spotted flower ignorance, the anti-bacterial derivative designed from the residue sequence of proteathiamycin was synthesized and the antimicrobial activity against the multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa and the multidrug-resistant Acinetobacterbaumani bacteria against antibiotics It is revealed.
이하 본 발명을 단계에 따라 보다 구체적으로 설명하고자 한다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the steps.
본 발명에서는 프로태티아마이신 항균펩타이드 helix영역의 아미노산 서열에 기반하여 높은 항생활성을 가졌던 9Pbw3를 합성하였다. 이에 대해 다제내성균에 대한 활성을 측정하여 항균치료제로 응용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.In the present invention, 9Pbw3 having high antibiotic activity was synthesized based on the amino acid sequence of the helix region of the proteasomycin antimicrobial peptide. The present inventors have completed the present invention by confirming that the antimicrobial treatment agent can be used as an antimicrobial therapeutic agent by measuring the activity against multidrug-resistant bacteria.
표 1은 본 발명의 9Pbw3의 잔기서열이다. Table 1 is the residue sequence of 9Pbw3 of the present invention.
이들 1종의 항생펩타이드를 합성하여 다제내성균에 대한 항생활성을 검정하였다. 그 결과 본 발명에 의한 항균 펩타이드를 처리 시 공시한 8종의 다제내성균들의 생장이 억제되었다. 한편 항균펩타이드에 대해 세포 독성을 나타내는지를 확인하기 위하여 마우스의 섬유아세포에 대한 독성을 조사한 결과, 양성 대조군으로 사용한 melittin에 비해 서열번호 1의 항생 펩타이드가 현저히 낮은 세포독성을 보였다. 이는 9Pbw3는 다제내성균에 대한 항생 활성과 마우스의 섬유아세포에 대한 낮은 세포 독성을 보이는 항생 펩타이드로서 인체에 대한 항생제 후보물질로 가능함을 보인다. These antibiotic peptides were synthesized and tested for antibiotic activity against multidrug - resistant bacteria. As a result, the growth of the 8 kinds of resistant microbes in the treatment of the antimicrobial peptides according to the present invention was inhibited. On the other hand, in order to confirm whether the antimicrobial peptide exhibits cytotoxicity, the antibiotic peptide of SEQ ID NO: 1 showed significantly lower cytotoxicity than the melittin used as a positive control group. This shows that 9Pbw3 is an antibiotic peptide showing antibiotic activity against multidrug-resistant bacteria and low cytotoxicity against mouse fibroblasts as an antibiotic candidate substance for human body.
이하 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하는 것으로, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 제한되지 않는 다는 것은 당업계에서 통상적인 지식을 가진 자들에게 있어서 자명할 것이다. 또한 비록 구체적인 실시예로 제시되지는 않았지만, 항균 작용이 있는 본 발명에 의한 항균 펩타이드 유도체를 유효성분으로 함유하는 항균제용 약학적 조성물이 가능함이 당업자에게 당연할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described more specifically by way of examples. It should be apparent to those skilled in the art that these embodiments are illustrative only of the present invention and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments. It will be apparent to those skilled in the art that a pharmaceutical composition for an antimicrobial agent containing an antimicrobial peptide derivative of the present invention having an antibacterial activity as an active ingredient is possible although it is not shown in a specific example.
우선, 본 발명의 항균 펩타이드가 상기 용도로 사용될 수 있는지 확인하기 위하여 본 발명자들은 본 발명에서 합성한 항균 펩타이드및 대조군 펩타이드에 대하여 8종의 다제내성균에 대하여 항균 활성을 측정하였다. 항균 활성은 균체가 분열되지 않는 펩타이드의 최소성장 억제농도 (minimal inhibitory concentration: MIC), 이하 “MIC”라 약칭함)를 측정하여 관찰하였다. 다제내성균은 다제내성녹농균인 MRPA (CCARM2002, CCARM2003, CCARM2095, CCARM2163)와 다제내성아시네토박터바우마니균인 MRAB (CCARM12005, CCARM12035, CCARM12036, CCARM12037)를 그 대상으로 하였다. First, in order to confirm whether the antimicrobial peptide of the present invention can be used for the above-mentioned purpose, the present inventors measured the antimicrobial activity against the eight antimicrobial resistant bacteria against the antimicrobial peptide and the control peptide synthesized in the present invention. The antimicrobial activity was observed by measuring the minimal inhibitory concentration (MIC) of peptides in which the cells were not cleaved (hereinafter abbreviated as " MIC "). MRABA (CCARM2002, CCARM2003, CCARM2095, CCARM2163) and MRAB (CCARM12005, CCARM12036, CCARM12037) which are multidrug resistant resistant strains of Aspergillus lactis were studied.
서열번호 1의 항생펩타이드들은 다제내성녹농균인 MRPA에 대하여 대조군인 melittin보다 다소 우수한 항생활성을 나타내었으며 다제내성아시네토박터바우마니균인 MRAB에 대하여는 melittin보다는 조금 낮은 항생활성을 나타내었다. (표 2 참조). The antibiotic peptides of SEQ ID NO: 1 showed slightly better antibiotic activity than the control melittin for MRPA, which is a multidrug-resistant P. aeruginosa, and a slightly lower antibiotic activity for MRAB, a multidrug-resistant Acinetobacter baumanni, than melittin. (See Table 2).
본 발명의 항균 펩타이드 서열번호 1의 마우스의 섬유아세포 (NIH3T3)에 대한 독성을 조사한 결과 대조군인 melittin은 MIC농도의 낮은 농도에서도 독성이 높았다. 서열번호 1의 항생펩타이드인 9Pbw3는 모두 MIC보다 훨씬 높은 농도인 50 uM에서 100%의 생존률을 보이며 전혀 세포독성을 보이지 않았으며 100 uM에서는 7%의 생존률을 보였다. 따라서 항생펩타이드인 9Pbw3는 높은 세포 선택성을 가짐을 알 수 있었다 (도 1 참조). As a result of the toxicity of the antimicrobial peptide of the present invention to the fibroblast (NIH3T3) of the mouse of SEQ ID NO: 1, the control melittin was highly toxic even at a low MIC concentration. The antibiotic peptide of SEQ ID NO: 1, 9Pbw3, showed 100% survival rate at 50 uM, which is much higher than MIC, and showed no cytotoxicity at all, and 7% survival rate at 100 uM. Thus, the antibiotic peptide 9Pbw3 has high cell selectivity (see FIG. 1).
상기 서열번호 1로 기재되는 펩타이드는 임상투여시에 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.The peptide of SEQ ID NO: 1 can be administered parenterally at the time of clinical administration and can be used in the form of a general pharmaceutical preparation.
즉, 본원 발명의 펩타이드는 실제로 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용 될 수 있다.That is, the peptide of the present invention can be administered in various forms of parenteral administration. In the case of formulation, the peptide is prepared using a diluent or excipient such as a filler, an extender, a binder, a wetting agent, a disintegrant or a surfactant. Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories. Propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used as the non-aqueous solvent and suspension agent. As a suppository base, witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
또한, 상기 펩타이드는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브 산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이팅 물질(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.In addition, the peptide may be used in combination with various carriers permitted as medicaments such as physiological saline or an organic solvent. In order to increase the stability or absorbability, carbohydrates such as glucose, sucrose or dextran, ascorbic acid antioxidants such as ascorbic acid or glutathione, chelating agents, low molecular weight proteins or other stabilizers can be used as pharmaceuticals.
상기 펩타이드의 유효용량은 1 내지 2 ㎎/㎏이고, 바람직하기에는 0.5 내지 1 ㎎/㎏ 이며, 하루 1 내지 3회 투여될 수 있다.The effective dose of the peptide is 1 to 2 mg / kg, preferably 0.5 to 1 mg / kg, and can be administered 1 to 3 times a day.
본 발명의 약학적 조성물에서 서열번호 1로 기재되는 펩타이드의 총 유효량은 거환(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 확산(infusion) 등에 의해 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기 펩타이드의 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량이 결정되는 것이므로 이러한 점을 고려할 때, 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 펩타이드의 약학적 조성물로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다.The total effective amount of the peptide of SEQ ID NO: 1 in the pharmaceutical composition of the present invention may be administered to a patient in a single dose by bolus form or by infusion for a relatively short period of time, Multiple doses may be administered by a fractionated treatment protocol administered over a prolonged period of time. The concentration of the peptide is determined in consideration of various factors such as the route of administration and the number of treatments as well as the age and health condition of the patient. Therefore, in view of this point, The appropriate effective dose depending on the particular use of the peptide as a pharmaceutical composition may be determined.
또한 본 발명은 적합한 담체 또는 사료 보충물의 형태에 혼합된 상기 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 하는 수의 또는 축산 용도의 조성물에 관한 것이다.The present invention also relates to a composition for use in water or for livestock use comprising the peptide of the present invention as an active ingredient in a form suitable carrier or feed supplement.
상기 언급된 조성물은 항생제의 결점과 부작용의 유발 없이, 동물 특히 가축 예를 들어 돼지(swine), 소(bovine), 양(ovine), 닭, 또는 말(equine) 등에 유용하게 사용될 수 있다.The above-mentioned compositions can be usefully used in animals, especially in livestock such as swine, bovine, ovine, chicken, or equine, without the drawbacks and side effects of antibiotics.
복용량은 동물의 종(species), 크기(size), 무게(weight), 나이(age)와 같은 다수의 요인들에 좌우될 것이다.Dosage will depend on a number of factors such as the species, size, weight, age of the animal.
원칙적으로, 전형적인 복용량은 동물/일 당 0.001 - 10 g의 펩타이드 범위일 것이다.In principle, a typical dose will range from 0.001 to 10 g of peptide per animal / day.
본 발명의 수의 또는 축산용 사료 조성물은 본 발명의 성분이 아닌 다른 성분을 함유할 수 있다. 적합하게는 첨가제는 성장 촉진제, 향료, 흡수 지지체 및/또는 다른 사료 성분 뿐만 아니라, 0.1 내지 100중량%, 바람직하게는 0.2 내지 90중량%의 성분을 함유한다. 바람직하게는, 성장 촉진제, 향료, 흡수 지지체 및/또는 다른 사료 성분의 총 양은 첨가제의 10 내지 75중량%이다. 임의의 성분이 식물 물질인 경우, 이들은 첨가제 중의 임의의 다른 성분과 혼합되기 전에 적합하게 건조되고, 미립자 또는 분말로 분쇄된다.The feed composition for animal or veterinary use of the present invention may contain components other than the components of the present invention. Suitably the additive comprises 0.1 to 100% by weight, preferably 0.2 to 90% by weight, of components, as well as growth promoters, fragrances, absorbent supports and / or other feed ingredients. Preferably, the total amount of growth promoting agent, fragrance, absorbent support and / or other feed ingredients is from 10 to 75% by weight of the additive. If the optional ingredients are plant materials, they are suitably dried and mixed with fine particles or powder before mixing with any other ingredients in the additive.
적합한 성장 촉진 첨가제 및 향료의 예는 크레졸, 아네톨, 데카락톤, 운데카락톤 및/또는 도데카락톤, 이오논(ionone), 아이론(irone), 진저롤, 피페리딘, 프로필리덴 프탈라이드, 부틸리덴 프탈라이드, 캡사이신 및/또는 타닌산이다. 지지체는 예를 들면 40 내지 50중량%의 목재 섬유, 8 내지 10중량%의 스테아린, 4 내지 5중량%의 강황 분말, 4 내지 5중량%의 로즈마리 분말, 22 내지 28중량%의 석회석, 1 내지 3중량%의 고무, 예를 들면 아라비아 고무, 5 내지 50중량%의 당 및/또는 전분 및 5 내지 15중량%의 물을 함유할 수 있다. 다른 사료 성분은 적합하게는 비타민, 효소, 무기 염, 분쇄된 곡물, 단백질함유 성분, 탄수화물-함유 성분, 거친 밀가루 및/또는 밀기울로 구성된 군에서 선택된다. 첨가제는 적합하게는 사료가 0.4ppm 내지 80중량%의 성분을 함유하게 하는 양으로 본 발명에 따른 사료 조성물에 첨가된다. Examples of suitable growth promoting additives and flavoring agents include, but are not limited to, cresol, anethole, decaractone, undecalactone and / or dodecaractone, ionone, irone, gingerol, piperidine, propylidenephthalide, Tylidene phthalide, capsaicin and / or tannic acid. The support may comprise, for example, from 40 to 50% by weight of wood fibers, from 8 to 10% by weight of stearin, from 4 to 5% by weight of turmeric powder, from 4 to 5% by weight of rosemary powder, from 22 to 28% 3% by weight of a rubber such as gum arabic, 5 to 50% by weight of sugar and / or starch and 5 to 15% by weight of water. Other feed ingredients are suitably selected from the group consisting of vitamins, enzymes, inorganic salts, ground grains, protein containing ingredients, carbohydrate-containing ingredients, coarse wheat flour and / or wheat bran. The additive is suitably added to the feed composition according to the invention in an amount such that the feed contains from 0.4 ppm to 80% by weight of the ingredients.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 흰점박이꽃무지 유충으로부터 분리된 펩타이드의 α-helix 영역의 잔기서열을 기반으로 설계된 서열번호 1로 기재되는 항생펩타이드의 용도에 관한 것이다. 이들은 카바페넴계, 아미노글리코사이드계, 플로로퀴놀론계 항생제에 모두 내성인 다제내성녹농균 (Multidrug-Resistant Pseudomonas aeruginosa)에 대하여 비교 펩타이드인 melittin과 비교하였을 때 우수한 항균활성을 나타내었으며, 카바페넴계, 아미노글리코사이드계, 플로로퀴놀론계의 3종의 항생제에 대하여 내성을 가지는 다제내성아시네토박터바우마니균 (Multidrug-Resistant Acinetobacter baumannii)에 대하여 비교 펩타이드인 melittin과 비교하였을 때 melittin보다는 약간 낮은 항균 활성을 나타내었다. 거의 모든 다제내성균에서 탁월한 항균작용을 나타내고, 항균활성이 탁월함과 동시에 항균 활성 농도인 16 μM에서 인간의 적혈구 세포에 대하여도 용혈 활성을 전혀 나타내지 않았으며 마우스 섬유아세포에 대하여 독성을 전혀 가지지 않는 박테리아 선택성이 탁월하며 길이가 짧아 저 분자량인 항생 펩타이드으로서 서열번호 1의 항생 펩타이드는 인체의 안전한 항생제로 유용하게 사용할 수 있을 것이다. 따라서 본 발명에 의해 제공되는 항생 펩타이드는 다제내성균에 대한 뛰어난 항균활성과 세포독성을 나타내지 않으므로 인체에 안전한 항생제로 유용하게 사용될 수 있다.
As described above, the present invention relates to the use of the antibiotic peptide described in SEQ ID NO: 1, which is designed based on the residue sequence of the? -Helix domain of the peptide isolated from the white spotted flower larva. They showed excellent antimicrobial activity against multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa, which is resistant to carbapenem-based, aminoglycoside-based, and phloroquinolone-based antibiotics, compared to the comparative peptide melittin. Antimicrobial activity was slightly lower than that of melittin compared to the comparative peptide against Multidrug-Resistant Acinetobacter baumannii, which is resistant to three antibiotics, aminoglycoside and fluoroquinolone. Indicated. The antimicrobial activity was excellent in almost all of the multidrug-resistant bacteria, and the antimicrobial activity of 16 μM did not exhibit any hemolytic activity against human red blood cells, and no bacterial selectivity for mouse fibroblasts As an excellent antibiotic peptide having a short length and a low molecular weight, the antibiotic peptide of SEQ ID NO: 1 can be used as a safe antibiotic for human body. Therefore, the antibiotic peptide provided by the present invention does not exhibit excellent antimicrobial activity and cytotoxicity against multidrug-resistant bacteria, and thus can be effectively used as a safe antibiotic in the human body.
도 1은 9Pbw3를 마우스의 섬유아세포 (NIH3T3)에 대해 처리하여 펩타이드 농도에 따른 펩타이드 독성을 측정하여 % survival rate로 나타낸 것이고, 여기서는 대조군으로 항균 펩타이드인 melittin을 사용하였다. Figure 1 shows the% survival rate of 9Pbw3 treated with mouse fibroblast (NIH3T3) by measuring the peptide toxicity according to the peptide concentration. Here, the antimicrobial peptide melittin was used as a control.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 상세하게 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다. However, the following examples are illustrative of the present invention, and the scope of the present invention is not limited by the following examples.
실시 예 1: Example 1: 펩타이드들의Peptides 합성 및 분리정제 Synthesis and separation purification
서열번호 1로 기재되는 항균 펩타이드들은 Fmoc (9-fluorenyl -methoxycarbonyl)-chemistry를 이용한 고상 펩타이드 합성법(solid phase peptide synthesis) (Merrifield, R. B. Science 232: 341-347)에 의하여 제조하였다. 각 Fmoc-아미노산 및 Fmoc-Nlys(Boc)-OH의 coupling에 의한 펩타이드 chain의 연장은 Coupling시약인 N-hydroxybenzotriazole(HOBt) 및 dicyclohexycarbodiimide (DCC)를 사용하였다. 각 펩타이드의 아미노 말단의 Fmoc-아미노산인 Fmoc-Val-OH을 coupling 시킨 후, 20% piperidine/N-methyl pyrolidone (NMP)용액으로 Fmoc기를 제거하고 NMP 및 dichoromethane (DCM)으로 여러 번 씻어준 다음 질소 가스로 건조시켰다. 여기에 TFA (trifluoroacetic acid)-phenol-thioanisole-ethanedithiol-H2O (82.5: 5: 5: 2.5: 5, vol./vol.) 용액을 가하고 실온에서 2시간 반응시켜 보호기의 제거 및 수지(resin)으로 부터 펩타이드를 분리시킨 다음, diethylether로 펩타이드를 침전화 시켰다. 이렇게 하여 얻은 crude 펩타이드는 정제형 역상 칼럼 (Vydac C18, 300Å, 15μm, 2.2 cm × 25 cm)이 부착된 0.05% TFA가 포함된 CH3CN (acetonitrile) gradient로 하는 크로마토그래피(HPLC)로 정제하였다. 정제를 완료한 순수한 펩타이드는 MALDI 질량 분석법(Hill, et al. Rapid Commun. Mass Spectrometry, 5, 395, 1991)을 이용하여 얻은 분자량이 아미노산 서열로부터 계산하여 얻은 분자량과 일치하므로 정확한 아미노산 서열을 가지는 펩타이드가 합성되었음을 확인하였다. The antimicrobial peptides of SEQ ID NO: 1 were prepared by solid phase peptide synthesis (Merrifield, R. B. Science 232: 341-347) using Fmoc (9-fluorenyl-methoxycarbonyl) -chemistry. Coupling reagents N-hydroxybenzotriazole (HOBt) and dicyclohexycarbodiimide (DCC) were used to extend the peptide chain by coupling each Fmoc-amino acid and Fmoc-Nlys (Boc) -OH. Fmoc-Val-OH, which is the Fmoc-amino acid of the amino terminal of each peptide, was coupled and then the Fmoc group was removed by 20% piperidine / N-methyl pyrolidone (NMP) solution, washed several times with NMP and dichoromethane (DCM) And dried with a gas. The solution was added with TFA (trifluoroacetic acid) -phenol-thioanisole-ethanedithiol-H2O (82.5: 5: 5: 2.5: 5, vol./vol.) Solution and reacted at room temperature for 2 hours. The peptides were separated from each other and dialyzed with diethylether. The crude peptide thus obtained was purified by chromatography (HPLC) using a CH3CN (acetonitrile) gradient containing 0.05% TFA with a purified reverse phase column (Vydac C18, 300 Å, 15 μm, 2.2 cm × 25 cm). The pure peptide that has been purified is consistent with the molecular weight obtained from the amino acid sequence calculated by MALDI mass spectrometry (Hill, et al. Rapid Commun. Mass Spectrometry, 5, 395, 1991) Were synthesized.
실시예2Example 2 : 항균활성의 측정 : Measurement of antimicrobial activity
서열번호 1로 표기되는 펩타이드의 항균활성을 측정하기 위하여 다음과 같이 실시하였다. 항생제 다제내성균으로서는 항생제 내성균주은행 (Culture collection of antimicrobial resistant microbe)으로부터 분양받은 다제내성녹농균인 MRPA (CCARM2002, CCARM2003, CCARM2095, CCARM2163)와 다제내성아시네토박터바우마니균인 MRAB (CCARM12005, CCARM12035, CCARM12036, CCARM12037)를 대상으로 하였다. 세균수가 ml 당 2×106 colony-forming units (CFUs)가 되도록 1% peptone으로 희석하고 50 ㎕씩 96-웰 마이크로적정 플레이트(microtiter plate)에 분주한 후, 1% peptone으로 희석한 펩타이드 용액 (2:1 단계적으로 희석된 용액)을 각 웰에 50 ㎕씩 첨가한다. 플레이트를 37℃에서 18시간 동안 배양 한 후 ELISA판독기 (Bio-Tek Instruments)로 620nm에서 각 웰의 흡광도를 측정하여 펩타이드의 최소성장억제농도 (MIC: minimal inhibitory concentration)를 결정한다. 대조군의 펩타이드로서 항균 펩타이드 melittin을 사용하였다. In order to measure the antimicrobial activity of the peptide represented by SEQ ID NO: 1, the following procedure was carried out. The antimicrobial resistant bacteria MRPA (CCARM2002, CCARM2003, CCARM2095, CCARM2163) and MRAB (CCARM12005, CCARM12035 and CCARM12036), which are multidrug resistant resistant strains of Aspergillus lactis, were purchased from the culture collection of antimicrobial resistant microbe , CCARM12037) were selected. The cells were diluted with 1% peptone to a concentration of 2 x 106 colony-forming units (CFUs) per ml and dispensed in 50 μl aliquots into a 96-well microtiter plate. The solution was then diluted with 1% peptone : 1 step diluted solution) is added to each well in an amount of 50 占 퐇. Plates are incubated at 37 ° C for 18 hours and the absorbance of each well is measured at 620 nm with an ELISA reader (Bio-Tek Instruments) to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of the peptide. The antimicrobial peptide melittin was used as the control peptide.
그 결과 다제내성녹농균인 MRPA에 대하여 항생 펩타이드의 활성은 대조군인 melittin과 비교하였을 때 다소 높은 활성을 나타내었으며, 다제내성아시네토박터바우마니균인 MRAB에 대하여는 항생 펩타이드이 9Pbw3보다 다소 낮은 활성을 나타내어 다제내성균에 대한 성공적인 활성을 보임을 알 수 있었다. As a result, the activity of antibiotic peptide against MRPA, which is a multidrug resistant P. aeruginosa, was slightly higher than that of control, melittin, and antibiotic peptide was slightly lower than that of 9Pbw3 for MRAB, a multidrug resistant resistant strain of Acinetobacter baumannii. And showed successful activity against resistant bacteria.
melittinComparative peptides:
melittin
표 2는 항생제 다제내성균에 대한 항생 펩타이드의 항균 활성을 나타낸 표이다.Table 2 shows antimicrobial activity of antibiotic peptides against the antibiotic-resistant multidrug-resistant bacteria.
실시예Example 3: 마우스의 섬유아세포에 대한 독성측정 3: Toxicity of mouse fibroblasts
서열 1로 표기되는 펩타이드들에 대해 포유류 세포주에 대한 독성여부를 판별하기 위하여 다음과 같이 실험을 실시하였다. 마우스의 섬유아세포를 10% 소태아혈청 (FBS: fetal bivine serum)을 포함하는 세포배양 배지인 RPMI1640 배양액으로 37℃의 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 96-웰 마이크로적정 플레이트(microtiter plate)의 각 웰에 2X104 세포수가 되도록 RPMI1640 배양액 100μL씩 분주한 후, 37℃의 5% CO2 배양기에서 하룻밤 (overnight)동안 배양한다. 배지를 제거한 플레이트에 100μM부터 2배의 농도로 희석한 펩타이드를 10% 소태아혈청이 제외된 RPMI1640 배양배지와 함께 배양된 마우스의 섬유아 세포에 처리한다. 이때 음성 대조군으로는 펩타이드를 처리하지 않고 배양액만을 넣은 것으로 비교하였다. 세포가 분주된 플레이트를 37℃의 5% CO2 배양기에서 하룻밤 (overnight)동안 배양한다. MTT [3-(4, 5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide]용액 (MTT를 5mg/ml되게 PBS에 녹인 용액) 20μl씩을 플레이트 각 웰에 분주하고 37℃에서 4시간 동안 배양한다. 생존세포의 미토콘드리아 효소에 의해 생성된 MTT formazan에 100μL의 DMSO(Dimethyl sulfoxide)을 처리한 후, 각 웰의 생존세포율 (% Survival)을 ELISA판독기로 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 펩타이드를 처리한 웰의 흡광도 값을 펩타이드를 처리하지 않는 대조군 세포가 들어 있는 흡광도 값으로 나눈 백분율로 펩타이드의 세포독성을 측정하였다. In order to determine the toxicity of the peptides represented by SEQ ID NO: 1 to mammalian cell lines, the following experiment was conducted. The mouse fibroblasts were cultured in RPMI 1640 medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. 100 μL of the RPMI 1640 culture is dispensed into each well of a 96-well microtiter plate in an amount of 2 × 10 4 cells, and then cultured overnight at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator. Peptides diluted from 100 μM to twice the concentration on the plate from which the medium has been removed are treated with fibroblast cells of the cultured mouse together with RPMI 1640 culture medium in which 10% fetal bovine serum is excluded. At this time, the negative control group was compared with the group in which only the culture solution was added without treating the peptide. Cells are seeded and the plates are incubated overnight at 37 ° C in a 5% CO2 incubator. 20 μl of a solution of MTT [3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide] dissolved in PBS at 5 mg / ml was dispensed into each well of the plate, Lt; / RTI > for 4 hours. MTT formazan produced by the mitochondrial enzyme of surviving cells was treated with 100 μL of DMSO (Dimethyl sulfoxide), and the survival rate (% Survival) of each well was measured at 570 nm using an ELISA reader. The cytotoxicity of the peptides was measured as a percentage of the absorbance value of the wells treated with the peptide divided by the absorbance value of the control cells not treated with the peptide.
도 1에 나타난 바와 같이 서열번호 1의 9Pbw3는 다제내성균에 대한 항균 활성을 가지는 8 μM과 16 μM의 농도에서 100%의 생존률을 보였으며, 50uM의 고농도까지도 포유류 세포인 마우스 섬유아세포에 대하여 독성이 없는 것을 확인하였다. 또한 이전의 연구에서 서열번호 1의 9Pbw3는 인간의 적혈구 세포에 대하여도 낮은 용혈활성을 보임을 확인하였다. 이로써 서열번호 1의 9Pbw3는 다제내성균에 대하여 뛰어난 항균활성은 유지하면서 낮은 용혈활성과 세포독성을 보이는 우수한 항생제 후보 물질로서의 기능을 갖춘 항생 펩타이드라 할 수 있다.As shown in Fig. 1, 9Pbw3 of SEQ ID NO: 1 showed a survival rate of 100% at a concentration of 8 [mu] M and 16 [mu] M with antimicrobial activity against multidrug-resistant bacteria. Even at a high concentration of 50 [mu] M, . In addition, in the previous study, it was confirmed that 9Pbw3 of SEQ ID NO: 1 shows low hemolytic activity also against human red blood cells. As a result, 9Pbw3 of SEQ ID NO: 1 is an antibiotic peptide having an excellent antibiotic candidate substance exhibiting low hemolytic activity and cytotoxicity while maintaining excellent antimicrobial activity against multidrug-resistant bacteria.
<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp. <120> Antibiotic peptide analogues with high antibacterial activities against mutidrug resistant bacteria designed from Protaetiamycine and their uses <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9Pbw3 <400> 1 Arg Leu Trp Leu Ala Ile Trp Arg Arg 1 5 <110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp. <120> Antibiotic peptide analogues with high antibacterial activities against mutidrug resistant bacteria designed from Protaetiamycine and their uses <160> 1 <170> Kopatentin 1.71 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9Pbw3 <400> 1 Arg Leu Trp Leu Ala Ile Trp Arg Arg 1 5
Claims (13)
상기 펩타이드는 포유류 정상세포에 대하여 독성을 가지지 않는 것을 특징으로 하는 항생 펩타이드.The method of claim 1,
The peptide is an antibiotic peptide, characterized in that it does not have toxicity to normal mammalian cells.
상기 조성물은 포유류 정상세포에 대하여 독성을 가지지 않는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.The method of claim 3,
The composition is a pharmaceutical composition, characterized in that it is not toxic to normal mammalian cells.
상기 조성물은 0에서 50μM의 펩타이드 농도에서 독성을 가지지 않는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.The method of claim 3,
The composition is a pharmaceutical composition, characterized in that it is not toxic at a peptide concentration of 0 to 50μM.
상기 조성물은 포유류 정상세포에 대하여 독성을 가지지 않는 것을 특징으로 하는 항균용 조성물.The method according to claim 6,
The composition is antimicrobial composition, characterized in that it does not have toxicity to normal mammalian cells.
상기 조성물은 0에서 50μM의 펩타이드 농도에서 독성을 가지지 않는 것을 특징으로 하는 항균용 조성물.The method according to claim 6,
The composition is antimicrobial composition, characterized in that it does not have toxicity at a peptide concentration of 0 to 50μM.
상기 조성물은 다제내성 녹농균과 다제내성 아시네토박터균에 대한 항균 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 항균용 조성물.The method according to claim 6,
Wherein said composition has antimicrobial activity against multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa and multidrug-resistant Acinetobacter bacteria.
상기 다제내성 녹농균은 카바페넴계, 아미노글리코사이드계, 플로로퀴놀론계 항생제에 모두 내성인 다제내성녹농균인 것을 특징으로 하는 항균용 조성물.10. The method of claim 9,
The multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa is an antimicrobial composition characterized in that it is a multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa resistant to carbapenem-based, aminoglycoside-based, and fluoroquinolone-based antibiotics.
상기 다제내성 아시네토박터바우마니균은 카바페넴계, 아미노글리코사이드계 및 플로로퀴놀론계의 3종의 항생제에 대하여 내성을 가지는 것을 특징으로 하는 항균용 조성물.10. The method of claim 9,
The multi-drug resistant acinetobacterbaumani bacteria have a resistance to three kinds of antibiotics of carbapenem-based, aminoglycoside-based and fluoroquinolone-based antimicrobial composition.
상기 다제내성 녹농균은 다제내성녹농균 MRPA (2002, 2003, 2095, 2163)이고, 상기 다제내성 아시토박터바우마니균은 아시토박터바우마니균 MRAB (12005, 12035, 12036, 12037)인 것을 특징으로 하는 항균용 조성물.10. The method of claim 9,
The multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa is a multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa MRPA (2002, 2003, 2095, 2163), and the multidrug-resistant Pseudomonas aertobacter Baumani is an acetobacterbaumani MRAB (12005, 12035, 12036, 12037). Antimicrobial composition.
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