KR20140034004A - Labeling agent for aflatoxin b1 detection and the kit for detecting aflatoxin b1 comprising thereof - Google Patents

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KR20140034004A
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Abstract

The present invention relates to a labeling agent for Aflatoxin B1 detection and a kit for Aflatoxin B1 detection comprising the same, and more specifically, to a labeling agent for detecting Aflatoxin B1 of a nanoparticle - Aflatoxin B1 - carrier protein polymer and a kit for Aflatoxin B1 detection comprising the same and consisting of a single detection line. The labeling agent for detecting a nanoparticle - Aflatoxin B1 - carrier protein polymer and the kit for Aflatoxin B1 detection comprising the same induce a competitive binding reaction with antibodies immobilized on the detection line to minimize the deformation of antibodies, thereby maximizing the activating efficiency of antibodies, and are useful for the quantitative and qualitative detection of Aflatoxin B1.

Description

아플라톡신 Ｂ1 검출용 표지물질 및 이를 포함한 아플라톡신 Ｂ1 검출용 키트{Labeling agent for aflatoxin B1 detection and the kit for detecting aflatoxin B1 comprising thereof}A labeling agent for aflatoxin B1 detection and a kit for detecting aflatoxin B1 containing the labeling agent for aflatoxin B1 detection and a kit for detecting aflatoxin B1

본 발명은 신규한 아플라톡신 B1 검출용 표지물질 및 이를 포함한 아플라톡신 B1 검출용 키트에 관한 것으로, 더 자세하게는 나노입자-아플라톡신 B1-담체단백질 중합체의 아플라톡신 B1 검출용 표지물질 및 이를 포함한 단일 검출선으로 구성된 아플라톡신 B1 검출 키트에 관한 것이다.
The present invention relates to a novel labeling substance for detecting aflatoxin B1 and a kit for detecting aflatoxin B1 containing the same, and more particularly to a labeling substance for detecting aflatoxin B1 of a nanoparticle-aflatoxin B1-carrier protein polymer and a single detection line And an aflatoxin B1 detection kit.

아플라톡신 B1(Aflatoxin B1, AFB1)은 곰팡이독소(Aspergillus flavus) 및 Aspergillus parasiticus로부터 생성되는 세계에서 가장 유독한 독소물질 중 하나로, 수많은 농산물이 저장되는 동안 생성될 수 있으며, 땅콩, 옥수수 및 동물 사료와 같은 농산물에서 자연적으로 생성되는 것으로 알려져 있다.
Aflatoxin B1 (AFB1) is one of the world's most toxic toxins produced from fungal toxins (Aspergillus flavus) and Aspergillus parasiticus. It can be produced during the storage of numerous agricultural products and can be produced in the form of peanuts, corn and animal feed It is known to be produced naturally in agricultural products.

또한, 아플라톡신 B1은 사람 및 동물에게 유독하고, 높은 간암 발병 위험을 유발하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 국제암연구소(IARC)는 아플라톡신 B1을 class 1의 발암물질로 분류하고 있으며, 유럽연합은 땅콩 및 건조과일에 대한 최대 아플라톡신 B1 허용 정도(MRLs)를 2 ㎍/kg로 한정하고 있다. 또한, 곡류에 대해서는 4 ㎍/kg으로 제한하고 있다. 반면, 한국의 경우 식품 및 동물사료에 대한 아플라톡신 B1 허용 정도를 각각 10 ㎍/kg 및 50 ㎍/kg으로 제한하고 있다. 특히, 아플라톡신 B1은 열에 안정하여 초기 오염 정도는 최종 생산물까지 지속된다.
In addition, aflatoxin B1 is toxic to humans and animals and is known to cause a high risk of liver cancer. Thus, the International Agency for Research on Cancer (IARC) classifies aflatoxin B1 as a class 1 carcinogen and the European Union limits the maximum aflatoxin B1 tolerance (MRLs) to peanut and dry fruit to 2 μg / kg. Also, it is limited to 4 ㎍ / kg for cereals. On the other hand, in Korea, the tolerance of aflatoxin B1 to food and animal feed is limited to 10 ㎍ / kg and 50 ㎍ / kg, respectively. In particular, aflatoxin B1 is thermally stable and the initial contamination level persists to the final product.

아플라톡신 B1을 검출하기 위하여 박층크로마토그래피(Thin-layer chromatography, TLC), 고속 액체 크로마토그래피(HPLC), 이상고압층 크로마토그래피(OPLC) 및 효소결합 면역흡착검사(ELISA) 등이 사용되고 있으며, 이는 아플라톡신 B1의 time-delay assay를 기반으로 수행된다. 상기와 같은 분석기는 분석을 위한 공간(실험실)이 필요하며, 1 ng/ℓ 내지 6 ng/ℓ 검출 제한 범위가 있음에도 불구하고 검출시간이 1시간 내지 몇 시간이 소요된다. 따라서, 아플라톡신 B1을 신속하고 편리하게 검출할 수 있는 기술이 필요하다.
Thin-layer chromatography (TLC), high performance liquid chromatography (HPLC), abnormal high pressure layer chromatography (OPLC) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) are used to detect aflatoxin B1, Based on the time-delay assay of B1. The above analyzer requires a space for analysis (laboratory), and it takes a detection time of 1 hour to several hours even though it has a detection limit range of 1 ng / ℓ to 6 ng / ℓ. Therefore, there is a need for a technique for quickly and conveniently detecting aflatoxin B1.

최근에는 아플라톡신 B1을 현장 검출하기 위한 분석 방법 중 하나로 측방 유동 분석(lateral flow assay)이 연구되고 있다. 측방 유동 스트립 분석(lateral flow strip assay) 타입의 키트는 시료가 적용되는 샘플패드, 탐지용 항체가 코팅되어 있는 방출패드, 시료가 이동하여 분리되고 항체 항원 반응이 일어나는 전개용 멤브레인 또는 스트립 및 시료가 계속하여 이동하기 위한 흡수패드로 되어 있다. 이 분석은 액체 시료 속에 들어 있는 분석물이 전개용 멤브레인의 표준선 및 검출선을 통과하는 동안 정체 및 시각적 색 표지 항체 검출을 기반으로 수행된다.
Recently, lateral flow assay has been studied as one of the analytical methods for on-site detection of aflatoxin B1. Lateral flow strip assay kits include a sample pad to which a sample is applied, a release pad coated with a detection antibody, a developing membrane or strip in which a sample is separated and an antibody antigen reaction occurs, and a sample And is an absorbing pad for continuously moving. This assay is based on the detection of stained and visual color label antibodies while the analyte in the liquid sample passes through the standard line and detection line of the developing membrane.

이와 같은, 측방 유동 분석법은 암진단, 혈액 감염 진단, 도핑 또는 임신 진단용 의료분야 및 미생물탐지 등 다양한 분야에서 널리 사용되고 있으나, 색을 띠는 입자와 항체 결합물을 표지물질로 이용하고 있어 항체가 변형되어 활성이 떨어지는 단점이 있다.
Such lateral flow analysis is widely used in a variety of fields such as cancer diagnosis, blood infection diagnosis, doping or pregnancy diagnosis medical field, and microbiological detection, but the use of colored particles and antibody conjugate is used as a labeling substance, So that the activity is reduced.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 종래의 측방 유동 스트립 분석 한계를 극복하는 아플라톡신 B1 검출용 표지물질 및 이를 이용한 아플라톡신 B1 검출용 키트를 개발하였으며, 상기 아플라톡신 B1 검출용 표지물질 및 이를 이용한 아플라톡신 B1 검출용 키트를 시료에 적용하여 효과적인 검출 특성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
Under these circumstances, the present inventors have developed a labeling material for detecting aflatoxin B1 and a kit for detecting aflatoxin B1 using the labeling material for detecting aflatoxin B1, which overcomes the limit of the conventional analysis of lateral flow strips. The labeling material for detecting aflatoxin B1 and the kit for detecting aflatoxin B1 Was applied to a sample to confirm effective detection characteristics, thereby completing the present invention.

본 발명의 목적은 신속하게 정량적 및 정성적으로 아플라톡신 B1을 검출할 수 있는 나노입자-아플라톡신 B1-담체단백질 중합체의 아플라톡신 B1 검출용 표지물질을 제공하는 것이다. An object of the present invention is to provide a labeling substance for the detection of aflatoxin B1 of nanoparticle-aflatoxin B1-carrier protein polymer capable of rapidly quantitatively and qualitatively detecting aflatoxin B1.

본 발명의 다른 목적은 상기 나노입자-아플라톡신 B1 -담체단백질 중합체의 아플라톡신 B1 검출용 표지물질을 이용한 아플라톡신 B1 검출용 키트를 제공하는 것이다.
Another object of the present invention is to provide a kit for detecting aflatoxin B1 using the labeling substance for detecting aflatoxin B1 of the nanoparticle-aflatoxin B1-carrier protein polymer.

상기의 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 아플라톡신 B1, 담체단백질 및 나노입자의 복합체를 포함하는 아플라톡신 B1 검출용 표지물질을 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides a labeling material for detecting aflatoxin B1 comprising a complex of aflatoxin B1, carrier protein and nanoparticles.

본 발명의 아플라톡신 B1 검출용 표지물질은 아플라톡신 B1-담체담백질 및 나노입자를 1.0 ㎍:100 ㎕ 비율로 혼합하는 것이 바람직하다.
The labeling substance for detecting aflatoxin B1 of the present invention is preferably mixed at a ratio of 1.0 쨉 g: 100 쨉 l of aflatoxin B1-carrier carrier protein and nanoparticles.

상기 담체단백질은 소혈청 알부민(Bovine Serum Albumin, BSA)인 것이 바람직하다.
Preferably, the carrier protein is bovine serum albumin (BSA).

상기 나노입자는 콜로이드성 금 입자인 것이 바람직하며, 40 nm의 입자 크기인 것이 바람직하다.
The nanoparticles are preferably colloidal gold particles, and preferably have a particle size of 40 nm.

상기 아플라톡신 B1 검출용 표지물질은, 아플라톡신 B1-담체단백질 중합체를 완충용액으로 2.0 ㎎/㎖ 수준으로 희석하는 단계(단계 1); 상기 희석된 아플라톡신 B1-담체단백질 용액에 나노입자 현탁액을 1.0 ㎍:100 ㎕ 비율로 혼합하는 단계(단계 2); 및 상기 혼합액을 상온에서 400 rpm 내지 600 rpm으로 회전 배양하는 단계(단계 3)로 결합되는 것이 바람직하다.
The labeling substance for detecting aflatoxin B1 is prepared by diluting aflatoxin B1-carrier protein polymer with a buffer solution to a level of 2.0 mg / ml (step 1); Mixing the diluted aflatoxin B1-carrier protein solution with the suspension of the nanoparticles in a ratio of 1.0 mu g / 100 mu l (step 2); And a step (step 3) of rotating the mixed solution at 400 rpm to 600 rpm at room temperature.

상기 단계 1은, 아플라톡신 B1-담체단백질 중합체를 완충용액을 사용하여 희석하는 단계로, 상기 완충용액은 인산완충식염수를 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
Step 1 is a step of diluting the aflatoxin B1-carrier protein polymer with a buffer solution. The buffer solution may be phosphate buffered saline, but is not limited thereto.

상기 단계 2는, 상기 단계 1의 아플라톡신 B1-담체단백질 중합체 희석액에 나노입자 현탁액을 혼합하는 단계이다. 상기 나노입자 현탁액은 완충용액을 사용하여 pH 7.3으로 제조한 것을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
Step 2 is a step of mixing the suspension of the nanoparticles into the diluted solution of the aflatoxin B1-carrier protein polymer of step 1 above. The nanoparticle suspension may be prepared using a buffer solution at pH 7.3, but is not limited thereto.

또한, 상기 단계 3은, 상기의 나노입자-아플라톡신 B1-담체단백질 중합체를 얻기위해 상기 나노입자-아플라톡신 B1-담체단백질 중합체 용액을 상온에서 배양하는 단계이다. 상기 배양시간은 20분 내지 40분인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.Step 3 is a step of culturing the nanoparticle-aflatoxin B1-carrier protein polymer solution at room temperature to obtain the nanoparticle-aflatoxin B1-carrier protein polymer. The incubation time is preferably 20 minutes to 40 minutes, but is not limited thereto.

또한, 본 발명은 상기의 아플라톡신 B1 검출용 표지물질을 포함하는 아플라톡신 B1 검출용 키트를 제공한다.
The present invention also provides a kit for detecting aflatoxin B1 comprising the above-described labeling substance for detecting aflatoxin B1.

상기 아플라톡신 B1 검출용 키트는, 시료의 유동 순서에 따라 시료가 주입되는 시료패드(1); 상기 아플라톡신 B1 검출용 표지물질이 코팅된 결합패드(2); 아플라톡신 B1 다클론 항체가 고정된 니트로셀룰로스 멤브레인 검출패드(3); 및 흡수패드(4)를 포함하는 것이 바람직하다.
The aflatoxin B1 detecting kit comprises a sample pad 1 to which a sample is injected according to a flow sequence of the sample; A binding pad 2 coated with a labeling substance for detecting aflatoxin B1; A nitrocellulose membrane detection pad 3 to which aflatoxin B1 polyclonal antibody is immobilized; And an absorbent pad (4).

상기 시료패드(1)는, 민감도 향상을 위하여 borate 완충용액을 사용하여 전처리하는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
The sample pad 1 is preferably pretreated with a borate buffer solution in order to improve sensitivity, but the present invention is not limited thereto.

상기 아플라톡신 B1 검출용 표지물질이 코팅된 결합패드(2)는, 민감도 향상을 위하여 borate 완충용액으로 전처리하는 것이 바람직하나, 이제 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 결합패드(2)는 일정 함량의 나노입자-아플라톡신 B1-담체단백질 중합체를 함유하는 것이 바람직하다.
The binding pad 2 coated with the labeling material for detecting aflatoxin B1 is preferably pretreated with a borate buffer solution for the purpose of improving sensitivity, but the present invention is not limited thereto. It is also preferred that the binding pad 2 contain a certain amount of nanoparticle-aflatoxin B1-carrier protein polymer.

상기 니트로셀룰로스 멤브레인 검출패드(3)는, 민감도 향상을 위하여 인산완충식염수에 침지시켜 전처리하는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 검출패드(3)는 아플라톡신 B1-다클론 항체로 코팅된 단일 검출선을 포함하는 것이 바람직하다.
The nitrocellulose membrane detection pad 3 is preferably pretreated by immersion in phosphate-buffered saline to improve sensitivity, but is not limited thereto. In addition, the detection pad 3 preferably includes a single detection line coated with an aflatoxin B1-polyclonal antibody.

따라서, 본 발명의 나노입자-아플라톡신 B1-담체단백질 중합체의 아플라톡신 B1 검출용 표지물질 및 이를 포함한 아플라톡신 B1 검출용 키트는 효과적인 곰팡이독소 검출 키트에 적용될 수 있다.
Accordingly, the labeling substance for detecting aflatoxin B1 of the nanoparticle-aflatoxin B1-carrier protein polymer of the present invention and the kit for detecting aflatoxin B1 containing the same can be applied to an effective mycotoxin detection kit.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 아플라톡신 B1 검출용 표지물질은 나노입자-아플라톡신 B1-담체단백질 중합체를 검출용 표지물질로 이용하여 검출선에 고정된 항체와의 경쟁적 결합 반응을 유도함으로써 항체의 변형을 최소화 함으로써 항체의 활성 효율을 극대화하는 효과가 있다.
As described above, the labeling substance for the detection of aflatoxin B1 according to the present invention uses a nanoparticle-aflatoxin B1-carrier protein polymer as a detection labeling substance to induce a competitive binding reaction with an antibody immobilized on the detection line, By minimizing the deformation, there is an effect of maximizing the activity efficiency of the antibody.

또한, 본 발명의 아플라톡신 B1 검출용 키트는 나노입자-아플라톡신 B1-담체단백질 중합체를 검출용 표지물질로 사용함과 동시에 표준선이 없는 단일 검출선으로 일원화하여 신속하게 정량적 및 정성적으로 아플라톡신 B1을 검출할 수 있는 효과가 있다.
In addition, the kit for detecting aflatoxin B1 of the present invention uses nanoparticle-aflatoxin B1-carrier protein polymer as a detection substance for detection, and is unified with a single detection line having no standard line to quickly detect quantitatively and qualitatively aflatoxin B1 There is an effect that can be done.

도 1은, 본 발명의 일 실시예에 따른 콜로이드성 금 나노입자-아플라톡신 B1-소혈청 알부민 중합체의 표지물질을 함유한 아플라톡신 B1 검출용 one-dot strip 키트의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는, 본 발명의 일 실시예에 따른 (a) pH에 따른 흡광도 변화 및 (b) pH에 따른 콜로이드성 금 나노입자의 색 변화를 나타낸 것이다.
도 3은, 본 발명의 일 실시예에 따른 아플라톡신 B1-소혈청 알부민(AFB1-BSA) 농도에 따른 (a) 흡광도 변화 및 (b) 색변화를 나타낸 것이다.
도 4는, 본 발명의 일 실시예에 따른 아플라톡신 B1 검출용 one-dot strip 키트의 아플라톡신 B1 검출 성능을 나타낸 것이다.
도 5는, 본 발명의 일 실시예에 따른 아플라톡신 B1 검출용 one-dot strip 키트의 오크라톡신(OTA)에 대한 교차반응성을 나타낸 것이다. FIG. 1 shows the structure of a one-dot strip kit for detecting aflatoxin B1 containing colloidal gold nanoparticle-aflatoxin B1-bovine serum albumin polymer labeling substance according to an embodiment of the present invention.
FIG. 2 shows changes in absorbance of the colloidal gold nanoparticles according to pH (a) and (b) according to an embodiment of the present invention.
FIG. 3 shows (a) the absorbance change and (b) the color change according to aflatoxin B1-bovine serum albumin (AFB1-BSA) concentration according to an embodiment of the present invention.
4 shows aflatoxin B1 detection performance of a one-dot strip kit for detecting aflatoxin B1 according to an embodiment of the present invention.
FIG. 5 shows the cross-reactivity of oatatoxin (OTA) of a one-dot strip kit for detection of aflatoxin B1 according to an embodiment of the present invention.

이하, 하기 제조예 및 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 제조예 및 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following Production Examples and Examples. However, the following Preparation Examples and Examples are for illustrating the present invention, but the scope of the present invention is not limited thereto.

실시예Example 1:  One: 콜로이드성 금Colloidal gold 나노입자- Nanoparticles- 아플라톡신Aflatoxin B1- B1- 소혈청Bovine serum 알부민 중합체의 제조 Preparation of albumin polymer

콜로이드성 금 나노입자-아플라톡신 B1-소혈청 알부민 중합체를 제조하기 위하여, 아플라톡신 B1-소혈청 알부민은 시그마(Sigma ST. Louis, MO, USA)로부터 구입하였으며, 콜로이드성 금 나노입자는 BioAssay Works(Ijamsville, MD, USA)로부터 구입하였다. To produce colloidal gold nanoparticles-aflatoxin B1-bovine serum albumin polymer, aflatoxin B1-bovine serum albumin was purchased from Sigma ST. Louis, MO, USA and colloidal gold nanoparticles were purchased from BioAssay Works , MD, USA).

아플라톡신 B1-소혈청 알부민 중합체는 최상의 조건을 확인하기 위하여, 다양한 pH 및 아플라톡신 B1-소혈청 알부민 농도 조건 하에서 콜로이드성 금 나노입자와 중합화 하였다. 아플라톡신 B1-소혈청 알부민 중합체는 0.5 mM 인산완충식염수(pH 7.2)를 첨가하여 2.0 ㎎/㎖로 희석하였다. 희석된 아플라톡신 B1-소혈청 알부민 중합체 용액 1.0 ㎕는 96-well microplate에서 다른 완충 용액으로 pH 5.4 내지 pH 10.1로 적정된 콜로이드성 금 나노입자 100 ㎕와 다양한 pH로 혼합하였다. 혼합된 용액은 3초 동안 흔들어 준 후 상온에서 30분 동안 배양하였으며, 배양된 용액은 콜로이드성 금 나노입자 잔여 표면의 차단을 위해 Blocker 소혈청 알부민 용액 10 ㎕를 첨가하여 콜로이드성 금 나노입자-아플라톡신 B1-소혈청 알부민 중합체 용액을 수득하였다.
Aflatoxin B1-bovine serum albumin polymers were polymerized with colloidal gold nanoparticles under various pH and aflatoxin B1-bovine serum albumin concentration conditions to ascertain the best conditions. Aflatoxin B1-bovine serum albumin polymer was diluted to 2.0 mg / ml with 0.5 mM phosphate buffered saline (pH 7.2). 1.0 [mu] l of diluted aflatoxin B1-bovine serum albumin polymer solution was mixed with 100 [mu] l of colloidal gold nanoparticles titrated from pH 5.4 to pH 10.1 with different buffer in 96-well microplates at various pH. The mixed solution was shaken for 3 seconds and then cultured at room temperature for 30 minutes. To the blocked solution, 10 μl of Blocker bovine serum albumin solution was added to block the remaining surface of the colloidal gold nanoparticles to prepare colloidal gold nanoparticles-aflatoxin B1-bovine serum albumin polymer solution.

실시예Example 2:  2: 아플라톡신Aflatoxin B1 검출용  B1 detection oneone -- dotdot stripstrip 키트Kit

본 발명의 콜로이드성 금 나노입자-아플라톡신 B1-소혈청 알부민 중합체를 표지물질로 함유한 아플라톡신 B1 검출용 one-dot strip 키트를 이루는 각 구성요소들은 필요에 따라 일체형으로 제조되거나 각각 분리되어 제조될 수 있다. 또한, 사용 형태에 따라 일부 구성요소를 생략하여 사용이 가능하다.
The components constituting the one-dot strip kit for detecting aflatoxin B1 containing the colloidal gold nanoparticle-aflatoxin B1-bovine serum albumin polymer of the present invention as a labeling substance can be manufactured integrally or individually have. In addition, some components may be omitted depending on the usage pattern.

이하, 첨부된 도 1을 참조하여 본 발명의 일 실시예에 따른 콜로이드성 금 나노입자-아플라톡신 B1-소혈청 알부민 중합체를 함유한 아플로톡신 B1 검출용 one-dot strip 키트를 상세히 설명하기로 한다.
Hereinafter, a one-dot strip kit for detecting the presence of the colloidal gold nanoparticle-aflatoxin B1-bovine serum albumin polymer according to an embodiment of the present invention will be described in detail with reference to FIG. 1 .

콜로이드성 금 나노입자-아플라톡신 B1-소혈청 알부민 중합체를 함유한 아플라톡신 B1 검출용 one-dot strip 키트는 시료의 유동 순서에 따라 시료가 주입되는 시료패드(1), 콜로이드성 금 나노입자-아플라톡신 B1-소혈청 알부민 중합체의 아플라톡신 B1 검출용 표지물질이 코팅된 결합패드(2), 아플라톡신 B1 다클론 항체가 고정된 니트로셀룰로스 멤브레인 검출패드(3) 및 흡수패드로 구성된다.
Colloidal gold nanoparticles - Aflatoxin B1 - A one-dot strip kit for detection of aflatoxin B1 containing aflatoxin B1-bovine serum albumin polymer comprises a sample pad (1) to which a sample is injected in accordance with the flow sequence of the sample, colloidal gold nanoparticles - aflatoxin B1 - a binding pad (2) coated with a labeling substance for detecting aflatoxin B1 of bovine serum albumin polymer, a nitrocellulose membrane detection pad (3) fixed with aflatoxin B1 polyclonal antibody, and an absorbent pad.

시료패드(1)는, 민감성의 향상을 위하여 1% 소혈청 알부민 및 0.05% Tween-20을 함유하는 pH 7.4의 50 nM borate 완충 용액으로 처리한 후 37℃에서 하룻밤 동안 건조하였다.
The sample pad (1) was treated with a 50 nM borate buffer solution of pH 7.4 containing 1% bovine serum albumin and 0.05% Tween-20 to improve sensitivity, and then dried overnight at 37 ° C.

결합패드(2)는 전처리 용액으로 처리 한 후 37℃에서 하룻밤 동안 건조하였다. 그 후, 상기 실시예 1에서 제조된 콜로이드성 금 나노입자-아플라톡신 B1-소혈청 알부민 중합체 용액 1.0 ㎕를 주입한 후 37℃에서 3시간 동안 완벽하게 건조하였다. 결합패드(2)의 전처리 용액은 10% 자당(sucrose), 0.05% Tween-20을 pH 7.4의 50 nM borate 완충용액에 혼합한 후 100℃ 이상의 고온에서 15분간 가열하여 자당과 Tween-20이 완전하게 용해되도록 한 후, 2% 소혈청 알부민(단백질 용액으로 열에 매우 민감)이 응고되지 않도록 상온으로 식힌 완충용액에 혼합하여 제조하였다.
The binding pad 2 was treated with pretreatment solution and then dried overnight at 37 ° C. Thereafter, 1.0 μl of the colloidal gold nanoparticle-aflatoxin B1-bovine serum albumin polymer solution prepared in Example 1 was injected and dried at 37 ° C for 3 hours. The pretreatment solution of the binding pad (2) was mixed with 10% sucrose, 0.05% Tween-20 in 50 nM borate buffer solution at pH 7.4, and then heated at a temperature of 100 ° C or higher for 15 minutes so that sucrose and Tween- , And mixed with a buffer solution cooled to room temperature so that 2% bovine serum albumin (very sensitive to heat as protein solution) would not coagulate.

검출패드(3)는, 인산완충식염수에 침지시킨 후 37℃에서 하룻밤 동안 건조하였다. 그 후 검출선을 형성시키기 위하여, 인산완충식염수로 2.0 ㎎/㎖로 희석된 아플라톡신 B1-다클론 항체(AFB1-PAb) 1.0 ㎕를 미세 피펫을 이용하여 원형의 형태로 주입한 후 37℃에서 3시간 동안 건조하였다. 실험에 사용된 아플라톡신 B1-다클론 항체(AFB1-PAb)는 시그마(Sigma ST. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다.
The detection pad 3 was immersed in phosphate buffered saline and then dried overnight at 37 占 폚. Then, 1.0 μl of aflatoxin B1-polyclonal antibody (AFB1-PAb) diluted with phosphate buffered saline (2.0 mg / ml) was injected into a round shape using a micropipette, Lt; / RTI > The aflatoxin B1-polyclonal antibody (AFB1-PAb) used in the experiments was purchased from Sigma (St. Louis, MO, USA).

상기와 같이 처리된, 시료패드(1), 결합패드(2), 검출패드(3) 및 흡수패드는 도 1에 나타난 바와 같이 측방유동분석 strip 형태로 조립하였다.
The sample pad 1, the bonding pad 2, the detection pad 3 and the absorbent pad, which were processed as described above, were assembled in the form of a lateral flow analysis strip as shown in FIG.

실험예Experimental Example 1: 적정  1: titration pHpH 분석 analysis

콜로이드성 금 나노입자 와 아플라톡신 B1-소혈청 알부민 중합체 간의 최상의 결합 이루기 위한 최적의 pH 농도를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1에서 제조된 콜로이드성 금 나노입자-아플라톡신 B1-소혈청 알부민 중합체 용액에 1.0 M 염화나트륨 용액 100 ㎕를 첨가하여 혼합하고 상온에서 10분 동안 둔 후 색변화를 관찰하였다. 이는, 높은 농도의 염이 금 나노입자 결합을 유도하여 불충분한 양의 항원이 나노입자의 표면에 흡착되는 것을 이용한 것으로, 금 나노입자의 결합은 붉은색에서 파랑-회색으로 변화된 것을 통해 확인할 수 있다. 따라서, 최적 pH는 용액의 색 변화 및 520 nm 흡광도를 통해 확인하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타난 바와 같이, 520 nm에서 pH의 변화의 최고 수치는 pH 5.4에서 나타났으며, pH 7.3에서 pH 8.2까지는 특별한 변화를 보이지 않았다. 반면에, pH 8.2 이상에서는, 붉은색에서 레드퍼플(red-purple)로 색변화를 나타내었다. 퍼플색은 나노입자가 결합된 것으로 볼 수 있다. 따라서, 다른 완충용액 및 blocking 용액의 pH가 7.4인 것을 감안하여, 금 나노입자와 아플라톡신 B1-소혈청 알부민의 중합 효율을 위한 중합 반응은 pH 7.3이 적절한 것을 확인할 수 있었다.
To confirm the optimum pH concentration for achieving the best bond between the colloidal gold nanoparticles and the aflatoxin B1-bovine serum albumin polymer, the colloidal gold nanoparticle-aflatoxin B1-bovine serum albumin polymer solution prepared in Example 1 was added with 1.0 100 μl of sodium chloride solution was added, mixed and left at room temperature for 10 minutes, and color change was observed. This is due to the fact that a high concentration of salt induces gold nanoparticle binding and an insufficient amount of the antigen is adsorbed on the surface of the nanoparticles. The binding of gold nanoparticles can be confirmed by changing from red to blue-gray . Therefore, the optimum pH was confirmed by the color change of the solution and the absorbance at 520 nm, and the results are shown in FIG. As shown in Fig. 2, the maximum value of pH change at 520 nm was found at pH 5.4, and no change was observed from pH 7.3 to pH 8.2. On the other hand, at pH 8.2 or higher, the color change from red to red-purple was observed. Purple color can be seen as a combination of nanoparticles. Therefore, it was confirmed that the polymerization reaction for the polymerization efficiency of gold nanoparticles and aflatoxin B1-bovine serum albumin was appropriate at pH 7.3, considering that the pH of other buffer solution and blocking solution was 7.4.

실험예Experimental Example 2: 적정  2: titration 아플라톡신Aflatoxin B1- B1- 소혈청Bovine serum 알부민 농도 분석 Albumin concentration analysis

콜로이드성 금 나노입자의 표면 코팅을 위해 필요한 담체단백질의 최적 양을 측정하기 위하여 콜로이드성 금 나노입자와 다양한 부피의 아플라톡신 B1-소혈청 알부민을 중합하였다. 콜로이드성 금 나노입자는 상기의 실험예 1에서 확인한 결과에 따라 pH 7.3의 콜로이드성 금 나노입자 현탁액 100 ㎕를 사용하였다. 0, 0.5, 1.0, 1.5 및 2.0 ㎕의 2.0 ㎎/㎖ 아플라톡신 B1-소혈청 알부민 중합 용액을 상기 콜로이드성 금 나노입자 현탁액이 처리된 96-well microplate에 각각 첨가하여 혼합한 후 상온에서 30분 동안 두었다. 그 후 10% 염화나트륨 100 ㎕를 각 well에 첨가하고 상온에서 10분 동안 두었다. 520 nm 흡광도 및 색변화를 통해 아플라톡신 B1-소혈청 알부민의 적정 농도를 확인하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타난 바와 같이, 0.5 ㎕ 내지 2.0 ㎕ 아플라톡신 B1-소혈청 알부민이 콜로이드성 금 나노입자 100 ㎕에서 안정화되는 결과를 보였다.
Colloidal gold nanoparticles and various volumes of aflatoxin B1-bovine serum albumin were polymerized to determine the optimum amount of carrier protein required for surface coating of colloidal gold nanoparticles. As the colloidal gold nanoparticles, 100 μl of a colloidal gold nanoparticle suspension having a pH of 7.3 was used according to the results of Experimental Example 1 described above. 0, 0.5, 1.0, 1.5 and 2.0 μl of a 2.0 mg / ml aflatoxin B1-bovine serum albumin polymerization solution was added to a 96-well microplate treated with the colloidal gold nanoparticle suspension, and the mixture was incubated at room temperature for 30 minutes I have. Then 100 μl of 10% sodium chloride was added to each well and left at room temperature for 10 minutes. The optimum concentration of aflatoxin B1-bovine serum albumin was determined through absorbance and color change at 520 nm, and the results are shown in Fig. As shown in FIG. 3, 0.5 μl to 2.0 μl aflatoxin B1-bovine serum albumin was stabilized in 100 μl of colloidal gold nanoparticles.

실험예Experimental Example 3:  3: 아플라톡신Aflatoxin 검출용  For detection oneone -- dotdot stripstrip 키트의Of kit 검출 한계 분석 Detection limit analysis

상기 실시예 2에서 제조된 콜로이드성 금 나노입자-아플라톡신 B1-소혈청 알부민 중합체의 아플라톡신 B1 표지물질을 함유한 아플라톡신 B1 검출용 one-dot strip 키트의 검출 성능을 확인하기 위하여, 10% 메탄올을 함유한 인산완충식염수을 이용하여 0 ppb 내지 1000 ppb의 아플라톡신 B1(AFB1) 시료액을 준비하였다. 각 아플라톡신 B1(AFB1) 시료에 대한 분석은 대부분 10분 내에 완료되었으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타난 바와 같이, 아플라톡신 B1(AFB1)이 없는 경우(오직 인산완충식염수) 음성반응(붉은색의 점이 검출선에 나타나는 것)을 확인하였다. 반면, 10 ppb 내지 1000 ppb의 아플라톡신 B1(AFB1) 시료액에서는 양성반응을 보이는 것을 확인하였다. 따라서, 상기 실시예 2에서 제조된 아플라톡신 B1 검출용 one-dot strip kit의 아플라톡신 B1(AFB1) 검출한계는 10 ppb인 것을 확인할 수 있었다.
To confirm the detection performance of the one-dot strip kit for detecting aflatoxin B1 containing the colloidal gold nanoparticle-aflatoxin B1-bovine serum albumin polymer produced in Example 2 with the aflatoxin B1 labeling substance, 10% methanol From 0 ppb to 1000 ppb of aflatoxin B1 (AFB1) sample solution was prepared using a phosphate-buffered saline solution. Analysis of each aflatoxin B1 (AFB1) sample was completed within 10 minutes, and the results are shown in FIG. As shown in Fig. 4, negative reaction (appearance of a red dot on the detection line) was confirmed in the absence of aflatoxin B1 (AFB1) (phosphate buffered saline only). On the other hand, a positive reaction was observed in aflatoxin B1 (AFB1) sample solution of 10 ppb to 1000 ppb. Therefore, it was confirmed that the detection limit of aflatoxin B1 (AFB1) of the one-dot strip kit for detecting aflatoxin B1 prepared in Example 2 was 10 ppb.

실험예Experimental Example 4: 곰팡이독소와의 교차 반응 분석 4: Cross-reactivity analysis with mycotoxins

상기 실시예 2에서 제조된 콜로이드성 금 나노입자-아플라톡신 B1-소혈청 알부민 중합체의 아플라톡신 B1 표지물질을 함유한 아플라톡신 B1 검출용 one-dot strip 키트에 대한 아플라톡신 B1 이외의 다른 곰팡이독소와의 교차 반응성을 확인하기 위하여, 10, 100 및 1000 ㎍/㎖의 오크라톡신(OTA)를 함유하는 시료를 주입하여 검출분석을 시행하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타난 바와 같이, 오크라톡신에 대한 상기 실시예 2에서 제조된 아플라톡신 B1 검출용 one-dot strip 키트는 모두 음성반응을 나타내었다. 이는, 상기의 아플라톡신 B1 검출용 one-dot strip 키트가 동물사료 또는 식품에 들어있는 아플라톡신 B1의 검출용으로 유용하게 사용될 수 있음을 보여주는 것이라 할 수 있다.
Cross-reactivity of the colloidal gold nanoparticle-aflatoxin B1-bovine serum albumin polymer prepared in Example 2 with other fungal toxins other than aflatoxin B1 on a one-dot strip kit for detection of aflatoxin B1 containing aflatoxin B1 labeling substance , A sample containing 10, 100, and 1000 쨉 g / ml of ocratoxin (OTA) was injected to perform detection analysis. The results are shown in Fig. As shown in FIG. 5, the one-dot strip kit for detecting aflatoxin B1 prepared in Example 2 for ocratoxin showed negative reaction. It can be said that this one-dot strip kit for detecting aflatoxin B1 can be usefully used for the detection of aflatoxin B1 contained in animal feed or food.

1: 시료패드
2: 결합패드
3: 검출패드
4: 흡수패드1: Sample pad
2: Combination pad
3: Detection pad
4: Absorption pad

Claims (7)

아플라톡신 B1, 담체단백질 및 나노입자의 복합체를 포함는 아플라톡신 B1 검출용 표지물질.
A label for detecting aflatoxin B1 comprising a complex of aflatoxin B1, a carrier protein and nanoparticles.
제1항에 있어서, 상기 아플라톡신 B1 검출용 표지물질은 아플라톡신 B1-담체단백질 및 나노입자를 1.0 ㎍:100 ㎕ 비율로 혼합하는 것을 특징으로 하는 아플라톡신 B1 검출용 표지물질.
The labeling material for detecting aflatoxin B1 according to claim 1, wherein the labeling material for detecting aflatoxin B1 is mixed with aflatoxin B1-carrier protein and nanoparticles at a ratio of 1.0 µg: 100 µl.
제1항에 있어서, 상기 담체단백질은 소혈청 알부민(Bovine Serum Albumin, BSA)인 것을 특징으로 하는 아플라톡신 B1 검출용 표지물질.
According to claim 1, wherein the carrier protein is bovine serum albumin (Bovine Serum Albumin, BSA) labeling material for detecting aflatoxin B1, characterized in that.
제1항에 있어서, 상기 나노입자는 콜로이드성 금 입자인 것을 특징으로 하는 아플라톡신 B1 검출용 표지물질.
The labeling material for detecting aflatoxin B1 according to claim 1, wherein the nanoparticles are colloidal gold particles.
제1항에 있어서, 상기 아플라톡신 B1 검출용 표지물질은,
아플라톡신 B1-담체단백질 중합체를 2.0 ㎎/㎖ 수준까지 완충용액으로 희석하는 단계;
상기 희석된 아플라톡신 B1-담체단백질 용액에 나노 입자 현탁액을 1.0 ㎍:100 ㎕ 비율로 혼합하는 단계; 및
상기 혼합액을 20분 내지 40분 동안 상온에서 400 rpm 내지 600 rpm으로 회전 배양하는 단계로 결합되는 것을 특징으로 하는 아플라톡신 B1 검출용 표지물질.
The method according to claim 1, wherein the labeling substance for detecting aflatoxin B1 comprises:
Diluting the aflatoxin B1-carrier polymer with a buffer to a level of 2.0 mg / ml;
Mixing the nanoparticle suspension in the diluted aflatoxin B1-carrier protein solution at a ratio of 1.0 μg: 100 μl; And
And the step of incubating the mixture solution for 20 to 40 minutes at a temperature of 400 rpm to 600 rpm.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 아플라톡신 B1 검출용 표지물질을 포함하는 아플라톡신 B1 검출용 키트.
A kit for detecting aflatoxin B1 comprising the labeling substance for detecting aflatoxin B1 according to any one of claims 1 to 5.
제6항에 있어서, 상기 아플라톡신 B1 검출용 키트는, 시료의 유동 순서에 따라 시료가 주입되는 시료패드;
상이 아플라톡신 B1 검출용 표지물질이 코팅된 결합패드;
아플라톡신 B1 다클론 항체가 고정된 니트로세룰로스 멤브레인 검출패드; 및
흡수패드를 포함하는 것을 특징으로 하는 아플라톡신 B1 검출용 키트.
[7] The apparatus according to claim 6, wherein the aflatoxin B1 detecting kit comprises: a sample pad into which a sample is injected according to a flow order of the sample;
Binding pad coated with a label for detecting aflatoxin B1;
A nitrocellulose membrane detection pad having an aflatoxin B1 polyclonal antibody immobilized thereon; And
Wherein the absorbent pad comprises an absorbent pad.
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