KR20140026892A

KR20140026892A - ＧｒｏＥＬ 또는 ｈｎＲＮＰ-Ａ2/Ｂ1를 포함하는 베체트병 진단용 키트

Info

Publication number: KR20140026892A
Application number: KR1020120092626A
Authority: KR
Inventors: 조성빈; 방동식
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2012-08-23
Filing date: 2012-08-23
Publication date: 2014-03-06
Also published as: KR101568457B1

Abstract

본 발명은 GroEL 또는 hnRNP-A2/B1 항원단백질을 포함하는 베체트병 진단용 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 베체트병의 항원 단백질 GroEL 또는 hnRNAP A2/B1 항원단백질를 이용하여 베체트병을 특이적으로 조기 진단할 수 있는 키트를 제조할 수 있고, 나아가 베체트병 예방용 백신 및 치료용 조성물을 제공할 수 있어 유용하다.

Description

ＧｒｏＥＬ 또는 ｈｎＲＮＰ-Ａ2/Ｂ1를 포함하는 베체트병 진단용 키트 {Diagnostic kit for Behcet's disease comprising GroEL and hnRNP-A2/B1}

본 발명은 GroEL 또는 hnRNP-A2/B1 항원단백질을 포함하는 베체트병 진단용 키트에 관한 것이다.

일반적으로, 베체트병은 일본, 한국 및 중국을 포함하는 아시아와 지중해 주위의 국가에서 가장 위협적인 질병 중의 하나로, 눈을 비롯한 여러 장기에 영향을 미치는 염증성의 질병이다. 베체트병의 정확한 발병 원인은 아직 밝혀지지 않았지만, 혈관, 특히 혈관내피세포가 베체트병의 첫번째 타겟인 것으로 알려져 있다. 또한, 스트렙토코커스 상귀스(Streptococcus sanguis (S. sanguis)와 단순헤르페스바이러스(herpes simplex virus)가 베체트병의 발생에 중요한 역할을 하는 것이 밝혀져 있고, α-에놀라제(α-enolase), 글리세르알데히드-3-인산디히드로게나아제(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), 가설단백질(hypothetical protein) 및 산성인산가수분해효소(acid phosphatase)를 포함하는 스트렙토코커스 단백질은 베체트병 환자에서 혈청 IgM과 반응하는 것으로 알려져 있다. S. sanguis 는 베체트병의 증상이 나타나는 구강, 결장 및 음부의 점막에 존재하고 베체트병 환자에서 IgA-protease를 분비하는 S. sanguis 의 감염은 상기 미생물 또는 IgA- protease 항원에 대한 IgA 타이터값을 증가시키는 것으로 알려져 있다.

한편, 베체트병 환자의 치료는 여러 가지 방법으로 진행되었다. 이런 치료에는 국부적, 전신적 또는 내과적 치료방법 등이 있으나, 이들은 만족스러운 결과를 얻지 못하였다. 여러 실험을 통하여, 베체트병의 발병기작 등에 있어서, 면역적 변화가 중요한 역할을 한다는 것이 알려졌다. 베체트병에서 나타나는 면역적 변화는 T 세포 활성 및 백혈구의 비정상적 기능을 포함한다. 면역학적 면에서, 점막의 병변(lesion)에는 먼저, CD4, CD8세포, 탐식세포 및 수지상 세포가 침투하고, 다음에 호중구(neutrophil)가 침투한다. 면역학적 과정이 베체트병의 발병의 일련의 경과에 관여하는 것 때문에, 면역반응을 조절하는 여러 약제들이 베체트병의 치료에 사용되어왔다. 이들 약제는 코르티코스테로이드, 콜키친, 세포 독성 약제 및 사이클로스포린과 같은 이무노필린(immunophilin) 리간드 등이 포함된다. 그러나 이런 약제는 오랜 기간 동안 사용하면, 심한 부작용을 일으킬 수 있는 위험성이 있었다.

본 발명자들은 종전 연구를 통하여 베체트병 환자에서 항-내피세포 IgA 항체의 항원단백질로 hnRNP A2/B1을 밝혀냈고, 재조합 인간 hnRNP A2/B1에 대한 혈청IgA 반응성은 베체트병의 주요 병인으로 추정되고 있는 재조합 streptococcal Hsp-65에 대한 IgA의 반응성과 매우 연관되어 있음을 확인하였다(Cho SB et al., J Invest Dermatol 2012; 132:601-8).

이에 본 발명자들은 베체트병을 유발하는 항원 단백질을 찾아내고자 노력한 결과, GroEL 단백질이 베체트병의 항원 단백질임을 확인하였고 특히 베체트병 환자의 혈청 IgA와의 특이적 반응성이 우수한, hnRNAP A2/B1 단백질과의 상동성을 가지는 에피토프를 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 GroEL 또는 hnRNP-A2/B1 항원 단백질을 포함하는 베체트병 진단용 키트를 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1에서 57-70번의 아미노산 서열인 베체트병 검출용 항원성 에피토프, 서열번호 1에서 347-358번의 아미노산 서열인 베체트병 검출용 항원성 에피토프, 서열번호 2에서 33-46번의 아미노산 서열인 베체트병 검출용 항원성 에피토프 및 서열번호 2에서 177-188번의 아미노산 서열인 베체트병 검출용 항원성 에피토프를 제공한다.

또한, 서열번호 1로 표시되는 베체트병을 유발하는 항원 단백질을 제공한다.

본 발명은 다른 구체예에서, 상기 에피토프를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 상기 항원 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본 발명은 또 다른 구체예에서, GroEL 또는 hnRNP-A2/B1 항원 단백질 또는 상기 항원 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 베체트병 진단용 키트를 제공하고, 이 때 GroEL의 57-70 또는 347-358번의 아미노산 또는 hnRNP-A2/B1의 33-46 또는 177-188번의 아미노산을 포함하는 베체트병 진단용 키트일 수 있다.

이전 연구로부터, 항체에 특이적으로 반응하는 단백질 유사체를 이용하여 자가면역질환의 치료 효과를 얻을 수 있음을 알 수 있다(Zacharie B et al., J Med Chem. 2010 Feb 11;53(3):1138-45; Meyer O et al., Onkologie. 2011;34(1-2):10-3). 마찬가지로, 베체트병 항원 단백질 GroEL 또는 hnRNP-A2/B1은 베체트병의 백신 조성물로 활용 가능하고, 이에 대하여 특이적으로 반응하는 항체를 이용하여 베체트병 치료용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명은 또 다른 구체예에서, GroEL 또는 hnRNP-A2/B1 항원 단백질을 포함하는 베체트병 예방용 백신을 제공한다. 이 때, GroEL의 57-70 또는 347-358번의 아미노산 또는 hnRNP-A2/B1의 33-46 또는 177-188번의 아미노산을 포함하는 베체트병 예방용 백신일 수 있다.

또한, 본 발명은 또 다른 구체예에서, GroEL 또는 hnRNP-A2/B1에 특이적으로 반응하는 항체를 포함하는 베체트병 치료용 조성물을 제공하고, 이 때 GroEL의 57-70 또는 347-358번의 아미노산 또는 hnRNP-A2/B1의 33-46 또는 177-188번의 아미노산에 특이적으로 반응하는 항체를 포함하는 베체트병 치료용 조성물일 수 있다.

본 발명에 있어서, 서열번호 1은 GroEL 단백질이고 서열번호 2는 hnRNP-A2/B1 단백질 서열이다.

본 발명에서 "벡터 (vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물 일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 것이 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백개의 플라스미드벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있도록 하는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation) 할 수 있다.

본 발명의 "형질전환(transformation)"은 DNA를 숙주세포로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다. 일반적으로 형질전환방법에는 전기천공법(electroporaton), 인산칼슘(CaPO₄) 침전, 염화칼슘(CaCl₂) 침전, 미세주입법(microinjection), 초산 리튬-DMSO법 등이 있고, 형질전환된 재조합 미생물은 DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주세포가 통상 사용되며, 원핵 및 진핵 세포를 포함하는 모든 미생물로서, 박테리아, 효모, 곰팡이 등이 이용가능하다.

본 발명의 베체트병 진단용 키트는, 기본적으로 면역분석(immunoassay)에 적용되어 베체트병을 진단한다. 이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 면역분석(immunoassay) 또는 면역염색(immunostaining) 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 또는 면역염색 포맷은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다. 상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석함으로써, 베체트병을 진단할 수 있다.

본 발명에 따르면 베체트병의 항원 단백질 GroEL 또는 hnRNAP A2/B1 항원단백질를 이용하여 베체트병을 특이적으로 조기 진단할 수 있는 키트를 제조할 수 있고, 나아가 베체트병 예방용 백신 및 치료용 조성물을 제공할 수 있어 유용하다.

도 1은 S. sanguis을 이용한 면역침전을 수행에 따라 네 가지 단백질 밴드가 관측된 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 서열 비교를 통하여 GroEL 및 hnRNAP A2/B1 간의 상동성 있는 에피토프 영역을 나타낸 것이다.
도 3은 재조합 상동 에피토프 단백질을 이용한 ELISA 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

샘플의 준비

본 발명은 베체트병의 임상적 진단 기준을 만족하는 100명의 베체트병 환자를 기초로 이루어졌다. 환자의 인구통계학적 특징은 표 1에 나타내었다. 모든 베체트병 환자는 적어도 2가지 주요 항목을 만족하는 양성 질환을 가지고 있었다. 70개의 건강 공여주로부터 구입한 혈청(Innovative Research Inc., Novi, MI, USA)은 대조군으로 사용되었고 모든 혈청 샘플은 영하 70℃에서 보관되었다. 베체트병의 임상적 특징, 요검사 결과 및 다른 실험실 시험 결과를 조사하기 위하여 환자들의 진료기록을 검토하였다. 실험실 시험은 완전 혈구 측정, 글루코즈 레벨, 신장 및 간 기능 검사, 적혈구 침강 속도(ESR; normal range, = 20 mm/hour), C 반응성 단백 시험(CRP; normal range; = 0.8 mg/dl), ASO 검사 anti-streptolysin O)(normal range, = 200 IU/ml), 류마티스인자, 항핵항체검사, 성병 및 HLAB51 유전자형 검사를 포함하고 있다.

	Number of BD patients
연령^*	40.6 ±11.4
성별
남성	30
여성	70
구강 궤양	100
생식기 궤양	88
피부 병변	96
안구 병변	35
관절 침범	41
GI 침범	14
혈관 침범	6
중추신경계 침범	6
Epididymitis	1
양성 이상과민 검사	13
양성 HLA-B51	32
ASO (IU/ml)^**	67 (37.5-113.5)
ESR (mm/hour)^**	38 (19.0-60.5)
CRP (mg/dL)^**	4.18 (2.4-13.3)

S. sanguis 항원 및 LC - MALDI - TOF / TOF 분석법을 이용한 면역침강법

S. sanguis(American Type Culture Collection (ATCC) 42927)은 TSB 배지(tryptic soy broth: Sigma, St. Louis, MO, USA)에서 배양하고 RIPA 버퍼로 용해되었다. 전체 세포 추출물(500μg)은 혼합 혈청과 함께 16 시간 동안 배양하였다. G-세파로오스(G-Sepharose) 단백질은 goat anti-human IgA 5 μg으로 전배양한 다음, PBS 버퍼로 세척한 G-세파로오스 단백질 비즈를 추가하고 4℃에서 하룻밤 동안 혼합하였다. 침전된 단백질(immunoprecipitate)을 100mM 디티오트레이톨 및 4M 요소를 포함하는 샘플 버퍼로 서스펜션하고 10% SDS-PAGE를 시행하였다. 그 후, 제거된 겔 조각으로 LC-MALDI-TOF/TOF 분석을 수행하였다. 서치 데이터 스크리닝을 위하여, Mascot score가 30 이상인 단백질들만 광범위한 상동성을 갖는 것으로 채택하였다.

발현 벡터의 구조 및 발현

S. sanguis GroEL의 단백질 코딩 영역을 XhoI 제한효소 자리를 갖는 5' 올리고뉴클레오티드 프라이머(CGAGCCTCGAGATGGCAAAAGATATTAAATT), EcoRI 제한효소 자리를 갖는 3' 올리고뉴클레오티드 프라이머(CGGAATTCCTACATCATACCGCCCATCATGC)를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 인간 hnRNP A2/B1의 단백질 코딩 영역을 XhoI 제한효소 자리를 갖는 5' 올리고뉴클레오티드 프라이머 (CGAGCCTCGAGATGGAGAAAACTTTAGAAACTG), EcoRI 제한효소 자리를 갖는 3' 올리고뉴클레오티드 프라이머(CGGAATTCTCAGTATCGGCTCCTCCCACCATAACCCCCAC)를 이용하여 PCR로 증폭하였다. PCR 증폭산물을 정제한 후 제한 효소를 이용하여 절단하고, pRSET 발현벡터(Invitrogen)에 클로닝하였고, 모든 구조체는 DNA 시퀀싱을 통해 확인하였다. S. sanguis GroEL 및 인간 hnRNP A2/B1는 대장균 BL21에서 과발현되었고, 생산된 재조합 단백질은 Ni-NTA 레진을 이용하여 제조사의 설명에 따라 정제하였다. 단백질 샘플은 영하 30℃에서 보관하였다.

재조합 S. sanguis GroEL 및 인간 hnRNP A2/B1를 이용한 웨스턴 블롯팅

정제된 재조합 S. sanguis GroEL(1μg) 및 인간 hnRNP A2/B1(1μg)를 샘플 버퍼에서 서스펜션하였다. 샘플은 12% 폴리아크릴아미드겔에 로딩하여 100V에서 전기영동을 수행하였다. 멤브레인은 대조군 또는 베체트병 환자의 혈청 샘플(일차 항체 희석버퍼(1% non-fat skim milk, 10 mM Tris pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.1% Tween 20)로 1:500으로 희석)과 함께 가끔 저어주면서 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 멤브레인을 PBST로 여섯 번 세척하고 블록킹 버퍼(blocking buffer: 1% non-fat dry milk, 10 mM Tris pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.1% Tween 20)로 1:10,000으로 희석되고 퍼옥시다제-컨쥬게이트된 goat anti-human IgA 항체와 함께 상온에서 1 시간 동안 배양하였다. 그 다음, 화학발광으로 관측하였다.

ELISA

IgA ELISA는 재조합 타겟 에피토프 단백질을 이용하여 수행하였다. 96-웰 마이크로티터 플레이트(Immuno2, HB, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) 를 300ng 타겟 에피토프 단백질로 하룻 밤 동안 코팅하였다. 그 후, 10 명의 베체트병 환자와 10명의 정상 대조군의 혈청 100μL(1% 소혈청 알부민(Sigma, St Louis, MO, USA)을 포함하는 PBST에서 1:20으로 희석)를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 37℃에서 2 시간 동안 배양하였다. 항체 바인딩은 각 웰에 기질(tetramethylbenzidine, Sigma)을 첨가하여 비색법적으로 정량하였다. 플레이트의 광학밀도는 ELISA 리더(Dynatech, Alexandria, VA, USA) 450nm에서 분광광도계로 측정하였다.

통계 분석

베체트병 환자와 정상 대조군의 재조합 S. sanguis GroEL 및 인간 hnRNP A2/B1에 대한 혈청 반응성의 차이를 분석하기 위하여 chi-square test (Fisher's exact test)를 이용하였다. 항-재조합 S. sanguis GroEL IgA 항체 실험 및 항-재조합 인간 hnRNP A2/B1 IgA 항체 실험의 결과 간의 연관성을 판단하기 위하여 McNemar's test를 이용하였다. 혈청 항-재조합 S. sanguis GroEL IgA 항체 및/또는 항-재조합 인간 hnRNP A2/B1 IgA 항체를 가지고 있는 베체트병 환자들의 임상적 특징 및 실험실적 특징과 재조합 S. sanguis GroEL 및/또는 인간 hnRNP A2/B1 테스트 값이 활성화되지 않은 환자들의 특징 간의 연관성의 차이와 강도를 조사하기 위하여 Student's t-test, Mann-Whitney U test, chi-square test(Fisher's exact test), 로지스틱 회귀분석 및 직선회귀 분석법을 이용하였다. 모든 분석은 SAS software version 9.1.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)을 이용하여 수행되었다. P-value<0.05 인 경우에 유의적으로 의미있는 것으로 하였다.

면역침전법 및 프로테오믹스 분석

다섯 명의 베체트병 환자로부터 수득한 혈청 샘플 내 IgA 항체와 반응하는 S. sanguis 추출물을 면역침전시켰다(도 1). 면역침전에 의해 얻어진 4 개의 단백질 밴드를 폴리아크릴아미드 겔로부터 잘라내어 트립신으로 절단하고, 잘라진 단백질 단편을 LC-MALDI-TOF/TOF로 분석하여 펩타이드 지문(peptide fingerprint)을 수득하였다. 면역글로불린을 포함하고 가긍정적 판단(false positives)은 배제된 NCBI 데이터를 이용하여 네 가지 단백질 밴드에 상응하는 DNA 시퀀스를 찾아냈다. 특히, 다음의 단백질은 Mascot score 값이 30 이상을 나타내는 것이 확인되었다: foldase protein PrsA, von Willebrand factor type A, ATPase involved in DNA repair, C1q B-chain precursor, 50S ribosomal protein L1, flagellar FliF M-ring protein, flavoprotein NrdI, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, and chaperonin GroEL(표 2). 이들 단백질 가운데 streptococcal chaperonin GroEL(estimated molecular weight (M _r )/pI, 57093/4.73; NCBI accession number, gi│315316118; Swiss-Prot accession number, EFU64148; Mascot score, 755; sequence coverage, 42%)은 60-kDa chaperonin 또는 Hsp-65로 알려져 있어, 본 발명에 있어서 추가적인 분석을 수행하였다.

Spot number	Identified protein	Swiss-Prot accession number	NCBI accession number	Mr (kDa)/pI	Mascot score
1	Foldase protein PrsA	ZP_06199103	gi│270292892	34349/5.08	143
2	von Willebrand factor, type A	ZP_01748840	gi│126733085	36066/3.72	31
3	ATPase involved in DNA repair	ZP_01201100	gi│89889589	188466/5.14	31
4	C1q B-chain precursor	CAA26880	gi│573114	24154/8.85	57
5	50S ribosomal protein L1	NP_345142	gi│15900538	24480/9.22	83
6	Flagellar FliF M-ring protein	YP_002514037	gi│220935138	60117/5.40	37
7	Flavoprotein NrdI	NP_357750	gi│15902200	22950/6.90	54
8	Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase	BAD37146	gi│51534656	35929/5.39	67
9	Chaperonin GroEL	EFU64148	gi│315316118	57093/4.73	733

재조합 S. sanguis GroEL 및 재조합 인간 hnRNP A2/B1과 베체트병 환자의 혈청 간의 반응성 확인

S. sanguis GroEL을 E. coli BL21에서 과발현 시킨 후, Ni-NTA 레진을 이용하여 재조합 단백질을 정제하였다. 100명의 베체트병 환자와 70명의 건강한 대조군의 혈청을 이용하여 혈청 반응성을 평가하기 위하여 재조합 S. sanguis GroEL 및 재조합 인간 hnRNP A2/B1의 웨스턴블롯팅 분석을 수행하였다. 재조합 S. sanguis GroEL에 대한 혈청 IgA 반응성은 100명의 베체트병 환자 중 77명에서 관측되었고(77%), 재조합 인간 hnRNP A2/B1에 대한 반응성은 100명의 베체트병 환자 중 79명에서 관측되었다(79%). McNemar's test 결과는 항-재조합 S. sanguis GroEL IgA 항체 실험 및 항-재조합 인간 hnRNP A2/B1 IgA 항체 실험 결과 간에 차이가 없음을 나타내었다(P = 0.845). 그러나, 재조합 S. sanguis GroEL 및 재조합 인간 hnRNP A2/B1에 대한 IgA 반응성은 건강한 대조군 70명에서 각각 21명(30%), 8명(11.4%)로 관측되었다. McNemar's test 결과는 건강한 대조군에서의 항-재조합 S. sanguis GroEL IgA 항체 실험 및 항-재조합 인간 hnRNP A2/B1 IgA 항체 실험 결과 간에는 의미있는 차이가 있음을 나타내었다(P = 0.004).

재조합 S. sanguis GroEL((P < 0.0001)) 및 재조합 인간 hnRNP A2/B1(P < 0.0001) 모두에 대한 혈청 IgA 반응성은 정상 대조군보다 베체트병 환자에서 훨씬 높게 나타났다. 100명의 베체트병 환자 가운데 65명은 두 가지 재조합 단백질에 대하여 혈청 반응성을 나타내었고(65%), 91명의 환자는 두 가지 단백질 중 적어도 하나에 대한 혈청 반응성(91%)을 나타내었다. 한편, 정상 대조군 가운데 5명의 혈청은 두 가지 재조합 단백질 모두에 반응하였고(7.1%), 24명의 혈청은 적어도 하나에 대한 반응성(34.3%)을 나타내었다.

베체트병 환자에서 항- S. sanguis GroEL 및/또는 hnRNP A2/B1 IgA 항체에 의한 임상적 특징 확인

100명의 베체트병 환자 가운데 77명(남성 23명, 여성 54명, 평균 연령 40.5±11.1세)은 재조합 S. sanguis GroEL에 대해 양성 반응성을 나타낸 반면, 23명의 환자(남성 7명, 여성 16명, 평균 연령 40.9±12.6세)에서는 음성 반응성을 나타내었다. 재조합 S. sanguis GroEL에 대한 양성 반응성을 나타낸 베체트병 환자들에서는 다음과 같은 증상이 관측되었다: 반복적인 구강 궤양(oral ulcers) 77명(100%), 피부 병변(skin lesions) 75명(97.4%), 생식기 궤양(genital ulcers) 65명(84.4%), 관절 침범(articular involvement) 29명(37.7%), 안구 침범(ocular involvement) 29명(37.7%), 위장 병변(gastrointestinal lesions) 12명(15.6%), 혈관 침범(vascular involvement) 5명(6.5%), 중추신경계 침범(central nervous system involvement) 5명(6.5%). 항-S. sanguis GroEL IgA 항체에 대하여, HLA-B51 test는 77명의 베체트병 환자 중 23명(29.9%)에서 양성 반응성이 나타났고, 이상과민 반응검사(pathergy test)에서는 11명(14.3%)에서 양성 반응성이 나타났다.

100명의 베체트병 환자 가운데 79명(남성 23명, 여성 56명, 평균 연령 40.8±11.5세)은 재조합 인간 hnRNP A2/B1에 대해 양성 반응성을 나타낸 반면, 21명(남성 7명, 여성 14명, 평균 연령 40.0±11.3세)은 음성 반응성을 나타내었다. 재조합 인간 hnRNP A2/B1에 대한 양성 반응성을 나타낸 베체트병 환자들에서는 다음과 같은 증상이 관측되었다: 반복적인 구강 궤양(oral ulcers) 79명(100%), 피부 병변(skin lesions) 75명(94.9%), 생식기 궤양(genital ulcers) 68명(86.1%), 관절 침범(articular involvement) 32명(40.5%), 안구 침범(ocular involvement) 28명(35.4%), 위장 병변(gastrointestinal lesions) 12명(15.2%), 혈관 침범(vascular involvement) 4명(5.1%), 중추신경계 침범(central nervous system involvement) 6명(7.6%). 항-인간 hnRNP A2/B1 IgA 항체에 대하여, HLA-B51 test는 79명의 베체트병 환자 중 24명(30.4%)에서 양성 반응성이 나타났고, 이상과민 반응검사(pathergy test)에서는 12명(15.2%)에서 양성 반응성이 나타났다.

베체트병 환자에서 혈청 IgA 항체와 반응하는 상동 에피토프 영역의 확인

streptococcal GroEL과 인간 hnRNP A2/B1 간의 상동 시퀀스를 확인하기 위하여 T-Coffee의 얼라이먼트 알고리즘을 사용하였다(Notredame C et al., J Mol Biol 2000; 302:205-17). 상당한 상동성을 나타내는 8가지 구별되는 에피토프가 관측되었고, 각 후보 에피토프를 합성하고 정제하였다(Peptron Inc., 대한민국). streptococcal GroEL과 인간 hnRNP A2/B1 모두에 대하여 혈청 iGa 반응성을 나타내는 10명의 베체트병 환자의 혈청과 재조합 후보 에피토프를 이용하여 ELISA를 수행하였다.

10 명의 베체트병 환자 중 3명에서 에피토프 2(hnRNP A2/B1 펩타이드의 9-28 및 GroEL 펩타이드의 32-51)에 대한 혈청 IgA 반응성이 관측되었고(30%), 7명의 베체트병 환자에서 에피토프 3(hnRNP A2/B1 펩타이드의 33-46 및 GroEL 펩타이드의 57-70)에 대한 혈청 IgA 반응성이 관측되었다(70%). 또한, 7 명의 환자에서 에피토프 6(hnRNP A2/B1 펩타이드의 177-188 및 GroEL 펩타이드의 347-358)에 대한 혈청 IgA 반응성이 관측되었고(70%), 4명의 환자에서 에피토프 7(hnRNP A2/B1 펩타이드의 189-202 및 GroEL 펩타이드의 359-372)에 대한 혈청 IgA 반응성(40%), 4명의 환자에서 에피토프 8(hnRNP A2/B1 펩타이드의 203-212 및 GroEL 펩타이드의 373-382)에 대한 혈청 IgA 반응성(40%)이 관측되었다. 그러나, 10명의 베체트병 환자 모두는 에피토프 1(hnRNP A2/B1 펩타이드의 1-8 및 GroEL 펩타이드의 1-8), 에피토프 4(hnRNP A2/B1 펩타이드의 127-143 및 GroEL 펩타이드의 193-209), 에피토프 5(hnRNP A2/B1 펩타이드의 164-176 및 GroEL 펩타이드의 316-328)에 대하여는 의미있는 반응성을 나타내지 않았다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Diagnostic kit for Behcet's disease comprising GroEL and hnRNP-A2/B1 <130> IPDB46380 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 540 <212> PRT <213> Streptococcus sanguinis <400> 1 Met Ser Lys Glu Ile Lys Phe Ser Ser Asp Ala Arg Ser Ala Met Val 1 5 10 15 Arg Gly Val Asp Ile Leu Ala Asp Thr Val Lys Val Thr Leu Gly Pro 20 25 30 Lys Gly Arg Asn Val Val Leu Glu Lys Ser Phe Gly Ser Pro Leu Ile 35 40 45 Thr Asn Asp Gly Val Thr Ile Ala Lys Glu Ile Glu Leu Glu Asp His 50 55 60 Phe Glu Asn Met Gly Ala Lys Leu Val Ser Glu Val Ala Ser Lys Thr 65 70 75 80 Asn Asp Ile Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Val Leu Thr Gln 85 90 95 Ala Ile Val Arg Glu Gly Ile Lys Asn Val Thr Ala Gly Ala Asn Pro 100 105 110 Ile Gly Ile Arg Arg Gly Ile Glu Ala Ala Val Ala Ala Ala Val Glu 115 120 125 Ala Leu Lys Asn Asn Ala Ile Pro Val Ala Asn Lys Glu Ala Ile Ala 130 135 140 Gln Val Ala Ala Val Ser Ser Arg Ser Glu Lys Val Gly Glu Tyr Ile 145 150 155 160 Ser Glu Ala Met Glu Lys Val Gly Lys Asp Gly Val Ile Thr Ile Glu 165 170 175 Glu Ser Arg Gly Met Glu Thr Glu Leu Glu Val Val Glu Gly Met Gln 180 185 190 Phe Asp Arg Gly Tyr Leu Ser Gln Tyr Met Val Thr Asp Ser Glu Lys 195 200 205 Met Val Ala Asp Leu Glu Asn Pro Tyr Ile Leu Ile Thr Asp Lys Lys 210 215 220 Ile Ser Asn Ile Gln Glu Ile Leu Pro Leu Leu Glu Ser Ile Leu Gln 225 230 235 240 Ser Asn Arg Pro Leu Leu Ile Ile Ala Asp Asp Val Asp Gly Glu Ala 245 250 255 Leu Pro Thr Leu Val Leu Asn Lys Ile Arg Gly Thr Phe Asn Val Val 260 265 270 Ala Val Lys Ala Pro Gly Phe Gly Asp Arg Arg Lys Ala Met Leu Glu 275 280 285 Asp Ile Ala Ile Leu Thr Gly Gly Thr Val Ile Thr Glu Asp Leu Gly 290 295 300 Leu Glu Leu Lys Asp Ala Thr Ile Glu Ala Leu Gly Gln Ala Ala Arg 305 310 315 320 Val Thr Val Asp Lys Asp Ser Thr Val Ile Val Glu Gly Ala Gly Asn 325 330 335 Pro Glu Ala Ile Phe His Arg Val Ala Val Ile Lys Ser Gln Ile Glu 340 345 350 Thr Thr Thr Ser Glu Phe Asp Arg Glu Lys Leu Gln Glu Arg Leu Ala 355 360 365 Lys Leu Ser Gly Gly Val Ala Val Ile Lys Val Gly Ala Ala Thr Glu 370 375 380 Thr Glu Leu Lys Glu Met Lys Leu Arg Ile Glu Asp Ala Leu Asn Ala 385 390 395 400 Thr Arg Ala Ala Val Glu Glu Gly Ile Val Ala Gly Gly Gly Thr Ala 405 410 415 Leu Ala Asn Val Ile Pro Ala Val Ala Asp Leu Glu Leu Thr Gly Asp 420 425 430 Glu Ala Thr Gly Arg Asn Ile Val Leu Arg Ala Leu Glu Glu Pro Val 435 440 445 Arg Gln Ile Ala His Asn Ala Gly Phe Glu Gly Ser Ile Val Ile Asp 450 455 460 Arg Leu Lys Asn Ala Glu Val Gly Thr Gly Phe Asn Ala Ala Thr Gly 465 470 475 480 Glu Trp Val Asn Met Ile Glu Glu Gly Ile Ile Asp Pro Val Lys Val 485 490 495 Ser Arg Ser Ala Leu Gln Asn Ala Ala Ser Val Ala Ser Leu Ile Leu 500 505 510 Thr Thr Glu Ala Val Val Ala Asn Lys Pro Glu Pro Val Ala Pro Ala 515 520 525 Pro Ala Met Asp Pro Ser Met Met Gly Gly Met Met 530 535 540 <210> 2 <211> 353 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 2 Met Glu Lys Thr Leu Glu Thr Val Pro Leu Glu Arg Lys Lys Arg Glu 1 5 10 15 Lys Glu Gln Phe Arg Lys Leu Phe Ile Gly Gly Leu Ser Phe Glu Thr 20 25 30 Thr Glu Glu Ser Leu Arg Asn Tyr Tyr Glu Gln Trp Gly Lys Leu Thr 35 40 45 Asp Cys Val Val Met Arg Asp Pro Ala Ser Lys Arg Ser Arg Gly Phe 50 55 60 Gly Phe Val Thr Phe Ser Ser Met Ala Glu Val Asp Ala Ala Met Ala 65 70 75 80 Ala Arg Pro His Ser Ile Asp Gly Arg Val Val Glu Pro Lys Arg Ala 85 90 95 Val Ala Arg Glu Glu Ser Gly Lys Pro Gly Ala His Val Thr Val Lys 100 105 110 Lys Leu Phe Val Gly Gly Ile Lys Glu Asp Thr Glu Glu His His Leu 115 120 125 Arg Asp Tyr Phe Glu Glu Tyr Gly Lys Ile Asp Thr Ile Glu Ile Ile 130 135 140 Thr Asp Arg Gln Ser Gly Lys Lys Arg Gly Phe Gly Phe Val Thr Phe 145 150 155 160 Asp Asp His Asp Pro Val Asp Lys Ile Val Leu Gln Lys Tyr His Thr 165 170 175 Ile Asn Gly His Asn Ala Glu Val Arg Lys Ala Leu Ser Arg Gln Glu 180 185 190 Met Gln Glu Val Gln Ser Ser Arg Ser Gly Arg Gly Gly Asn Phe Gly 195 200 205 Phe Gly Asp Ser Arg Gly Gly Gly Gly Asn Phe Gly Pro Gly Pro Gly 210 215 220 Ser Asn Phe Arg Gly Gly Ser Asp Gly Tyr Gly Ser Gly Arg Gly Phe 225 230 235 240 Gly Asp Gly Tyr Asn Gly Tyr Gly Gly Gly Pro Gly Gly Gly Asn Phe 245 250 255 Gly Gly Ser Pro Gly Tyr Gly Gly Gly Arg Gly Gly Tyr Gly Gly Gly 260 265 270 Gly Pro Gly Tyr Gly Asn Gln Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Tyr Asp 275 280 285 Asn Tyr Gly Gly Gly Asn Tyr Gly Ser Gly Asn Tyr Asn Asp Phe Gly 290 295 300 Asn Tyr Asn Gln Gln Pro Ser Asn Tyr Gly Pro Met Lys Ser Gly Asn 305 310 315 320 Phe Gly Gly Ser Arg Asn Met Gly Gly Pro Tyr Gly Gly Gly Asn Tyr 325 330 335 Gly Pro Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Tyr Gly Gly Arg Ser Arg 340 345 350 Tyr

Claims

서열번호 1에서 57-70번의 아미노산 서열인 베체트병 검출용 항원성 에피토프.
서열번호 1에서 347-358번의 아미노산 서열인 베체트병 검출용 항원성 에피토프.
서열번호 2에서 33-46번의 아미노산 서열인 베체트병 검출용 항원성 에피토프.
서열번호 2에서 177-188번의 아미노산 서열인 베체트병 검출용 항원성 에피토프.
서열번호 1로 표시되는 베체트병을 유발하는 항원 단백질.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 에피토프를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
제 5항의 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
제 6항의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체.
제 7항의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체.
GroEL 또는 hnRNP-A2/B1 항원 단백질 또는 상기 항원 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 베체트병 진단용 키트.
제 10항에 있어서,
상기 GroEL 항원 단백질은 GroEL의 55-70 또는 347-358번의 아미노산을 포함하는 베체트병 진단용 키트.
제 10항에 있어서,
hnRNP-A2/B1 항원 단백질은 hnRNP-A2/B1의 33-46 또는 177-188번의 아미노산을 포함하는 베체트병 진단용 키트.
GroEL 또는 hnRNP-A2/B1 항원 단백질을 포함하는 베체트병 예방용 백신.
제 13항에 있어서,
GroEL의 55-70 또는 347-358번의 아미노산을 포함하는 베체트병 예방용 백신.
제 13항에 있어서,
hnRNP-A2/B1의 33-46 또는 177-188번의 아미노산을 포함하는 베체트병 예방용 백신.
GroEL 또는 hnRNP-A2/B1에 특이적으로 반응하는 항체를 포함하는 베체트병 치료용 조성물.
제 16항에 있어서,
GroEL의 55-70 또는 347-358번의 아미노산에 특이적으로 반응하는 항체를 포함하는 베체트병 치료용 조성물.
제 16항에 있어서,
hnRNP-A2/B1의 33-46 또는 177-188번의 아미노산에 특이적으로 반응하는 항체를 포함하는 베체트병 치료용 조성물.