KR20140025663A - Silver nanocluster probe, method for detecting target polynucleotide using the same, and method for designing silver nanocluster probe - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 실버나노클러스터 프로브 및 이의 설계방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 실버나노입자들의 결합 영역과 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 특이적 염기서열 영역을 포함하고 실버나노입자들의 결합 영역에 실버나노입자들이 결합하여 실버나노클러스터를 형성할 때 검출가능한 광을 발생시키지만 특이적 염기서열 영역에 표적 폴리뉴클레오티드가 결합할 때 광 발생이 감소 내지는 소멸되는 실버나노클러스터 프로브 및 이의 설계 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a silver nanocluster probe and a method of designing the silver nanocluster probe. More particularly, the present invention relates to a silver nanocluster probe and a method of designing the silver nanocluster probe. The silver nanocluster probe includes a binding region of silver nanoparticles and a specific base sequence region specifically binding to a target polynucleotide, Silver nanoparticle probes that generate detectable light when silver nanoparticles are combined to form silver nanoclusters, but light generation is reduced or eliminated when a target polynucleotide binds to a specific base sequence region, and a method of designing the same. .
또한, 본 발명은 검출가능한 광을 발생하는 실버나노클러스터 프로브의 특이적 염기서열 영역에 표적 폴리뉴클레오티드가 결합할 때 광 발생이 감소 내지는 소멸되는 것을 확인함으로써 시료 내에 표적 폴리뉴클레오티드의 존재여부 또는 변이여부를 검출하는 방법에 관한 것이다.In addition, the present invention confirms the reduction or extinguishment of light generation when a target polynucleotide binds to a specific nucleotide sequence region of a silver nanocluster probe that generates detectable light, thereby detecting presence or absence of a target polynucleotide in the sample The method comprising the steps of:
또한, 본 발명은 전술한 실버나노클러스터 프로브를 이용하여 시료 내에 표적 폴리뉴클레오티드의 존재여부 또는 변이여부를 신속하고 편리하게 검출하면서도 특이도와 민감도를 모두 만족시키는 새로운 표적 폴리뉴클레오티드 검출방법에 관한 것이다. The present invention also relates to a new method for detecting a target polynucleotide that satisfies both specificity and sensitivity while rapidly or conveniently detecting the presence or absence of a target polynucleotide in a sample using the silver nanocluster probe described above.
추가로, 본 발명은 다양한 파장의 광을 발생하는 다양한 종류의 실버나노클러스터 프로브를 제공하고 이를 다양한 표적 폴리뉴클레오티드에 대응시켜 센서로서 제공함으로써 해당 파장의 발광 감소 내지는 소멸에 따라 이에 대응되는 표적 폴리뉴클레오티드의 존재여부 또는 변이여부를 검출할 수 있는 방법에 관한 것이다.In addition, the present invention provides various types of silver nanocluster probes that generate light of various wavelengths and provide them as sensors corresponding to various target polynucleotides, so that the corresponding target polynucleotides And detecting the presence or absence of the mutation.
바이오 센서는 유전자 정보 및 단백질 정보를 대량으로 그리고 자동화하여 분석할 수 있거나, 생리활성물질의 존재여부 및 기능을 비교적 간단하고 신속하게 분석할 수 있는 장치이다. 따라서, 바이오 센서는 유전자 및 단백질 연구분야, 의약분야, 농업, 식품, 환경 및 화학산업 등 다양한 분야에서 응용이 활발하게 이루어지고 있다. The biosensor is a device capable of analyzing genetic information and protein information in a large amount and automation, or analyzing the existence and function of the bioactive substance relatively easily and quickly. Therefore, biosensors are actively applied in various fields such as gene and protein research, medicine, agriculture, food, environment and chemical industry.
예를 들어, 바이오 센서 중 하나인 마이크로어레이 칩은 표적 폴리뉴클레오티드에 대해 특이적인 프로브를 사전에 제작하여 유리 슬라이드에 마이크로어레이 장비를 이용하여 집적한 칩으로서, 표적 폴리뉴클레오티드를 형광물질이 표지된 특이적 프라이머를 이용하여 증폭한 후 증폭 산물을 마이크로어레이 칩에 혼성화시키고 스캐너로 형광신호를 분석하여 시료 내의 표적 폴리뉴클레오티드의 존재여부 및 서열변이 등을 분석하는데 사용된다. For example, a microarray chip, which is one of the biosensors, is a chip in which a probe specific to a target polynucleotide is preliminarily manufactured and integrated using a microarray device on a glass slide, and a target polynucleotide is labeled with a fluorescence- Amplification using a primer, hybridization of the amplified product to a microarray chip, and analysis of the fluorescence signal with a scanner to analyze the presence or the sequence variation of the target polynucleotide in the sample.
또 다른 바이오 센서의 하나인 마이크로플루이딕스 칩은 미량의 분석대상물질(DNA, RNA, 펩타이드, 단백질 등)을 칩 내의 챔버로 흘려보내면서 칩 내에서 분석대상물질의 반응 여부를 분석하는 칩이다. 이러한 마이크로플루이딕스 칩은 전술한 마이크로어레이 칩에 비해 전기적 신호의 검출에 의해 비교적 간단하고 빠르게 분석대상물질의 반응여부를 확인할 수 있기 때문에 의료진단분야에서 활용도가 높다. 특히, 마이크로플루이딕스 칩은 형광이 아닌 전기적 신호를 이용하여 분석대상물질의 반응 여부를 검출할 수 있어 장치의 소형화와 검출 편의성의 관점에서 유리하다.Microfluidics chip, one of the other biosensors, is a chip for analyzing the reaction of analytes in a chip by flowing a small amount of analyte (DNA, RNA, peptide, protein, etc.) into the chamber. Such a microfluidic chip can be relatively easily and quickly detected by the detection of an electrical signal as compared with the above-described microarray chip, so that the microfluidics chip can be used in a medical diagnosis field. In particular, the microfluidic chip can detect the reaction of the analyte using an electrical signal, not fluorescence, which is advantageous from the viewpoint of miniaturization of the device and convenience of detection.
그러나, 이러한 마이크로플루이딕스 칩 역시 반응 챔버에 수용되는 완충용액에 의한 검출 재현성 문제가 있으며, 주파수 대역별로 교류를 인가하는 스위핑(sweeping) 과정이 요구되어 임피던스값의 측정 불편과 이에 따른 결과 분석의 어려움이라는 문제가 있다.However, such a microfluidic chip also has a problem of detection reproducibility due to the buffer solution contained in the reaction chamber, and a sweeping process of applying alternating current for each frequency band is required, so that it is difficult to measure the impedance value, .
따라서, 바이오 센서 분야에서는 분석대상물질을 신속하고 편리하게 검출하면서도 특이도와 민감도를 모두 만족시키는 새로운 센싱 기반 기술과 이를 이용한 새로운 바이오 센서의 제공에 대한 요구가 여전히 존재한다.Therefore, in the field of biosensors, there is still a need for a new sensing-based technology that satisfies both singularities and sensitivities while quickly and conveniently detecting analytes, and a new biosensor using the same.
한편, 최근에는 나노기술의 발달에 따라 골드 나노입자 또는 실버 나노입자를 이용한 기술들이 개발되고 있다. 예를 들어, 대한민국 등록특허공보 제10-0981987호에서는 종래의 형광 기반 검출방법에 의해서는 분석하기가 어려웠던 나노크기의 어레이를 주사터널링현미경(scanning tunneling microscope: STM)을 이용하여 분석할 때 실버 나노입자의 염색을 통하여 시그널을 증폭함으로써 민감도를 극대화하는 기술을 개시하고 있다. Recently, with the development of nanotechnology, technologies using gold nanoparticles or silver nanoparticles have been developed. For example, in Korean Patent Registration No. 10-0981987, when a nano-sized array which was difficult to analyze by a conventional fluorescence-based detection method is analyzed using a scanning tunneling microscope (STM) Disclose techniques for maximizing sensitivity by amplifying signals through dyeing of particles.
또한, 전술한 바와 같은 마이크로어레이 칩에서 사용되는 Cy3 또는 Cy5와 같은 형광물질은 올리고뉴클레오티드 프라이머에 사전에 표지해야 하는 번거로움이 있고, 광 안정성의 결여 및 불충분한 발광 세기와 같은 문제점이 있다. 이를 개선하기 위해 올리고뉴클레오티드로 안정화된 실버나노입자들의 클러스터를 이용한 형광물질이 제안된 바가 있다(Chris I. Richards et al., Oligonucleotide-Stabilized Ag Nanocluster Fluorophores, J. AM. CHEM. SOC. 2008, 130, 5038-5039). In addition, fluorescent materials such as Cy3 or Cy5 used in the above-described microarray chip have a problem that they have to be labeled beforehand with oligonucleotide primers, and there are problems such as lack of light stability and inadequate luminescence intensity. To improve this, fluorescent materials using clusters of silver nanoparticles stabilized with oligonucleotides have been proposed (Chris I. Richards et al., Oligonucleotide-Stabilized Ag Nanocluster Fluorophores, J. Am. Chem. SOC. 2008, 130 , 5038-5039).
그리고, 실버나노입자들의 클러스터를 TAIEA (target-assisted isothermal exponential amplification)에서 생성되는 리포터 올리고뉴클레오티드의 표지에 사용하는 기술도 공개된 바가 있다(Yu-Qiang Liu et al., Attomolar Ultrasensitive MicroRNA Detection by DNA-Scaffolded Silver-Nanocluster Probe Based on Isothermal Amplification, Anal. Chem., May 29, 2012, A-E). 이 종래기술은 TAIEA 수행시 표적 miRNA가 존재하면 이를 어닐링하면서 증폭하되 이때 표적 miRNA에 상보적인 올리고뉴클레오티드 외에 표적 miRNA의 증폭과 존재를 알리는 리포터 올리고뉴클레오티드를 생성하고, 표지된 리포터 올리고뉴클레오티드의 검출에 의해 표적 miRNA를 검출하는 기술에 관한 것으로서, 기존의 Cy5 형광물질로 리포터 올리고뉴클레오티드를 표지할 경우 발생하는 증폭반응 저해 문제, 비특이적 증폭 유도 및 검출 민감도 문제 등을 해결하기 위해 실버나노입자들의 클러스터를 이용하여 리포터 올리고뉴클레오티드를 표지하는 방법을 개시하고 있다. There has also been disclosed a technique of using a cluster of silver nanoparticles as a marker of a reporter oligonucleotide generated in target-assisted isothermal exponential amplification (TAIEA) (Yu-Qiang Liu et al., Attomolar Ultrasensitive MicroRNA Detection by DNA- Scaffolded Silver-Nanocluster Probe Based on Isothermal Amplification, Anal. Chem., May 29, 2012, AE). In this prior art, when the target miRNA is present in the TAIEA, the target miRNA is amplified while annealing to generate a reporter oligonucleotide which notifies the amplification and the presence of the target miRNA in addition to the oligonucleotide complementary to the target miRNA. By detecting the labeled oligonucleotide The present invention relates to a technique for detecting a target miRNA, and a cluster of silver nanoparticles is used to solve problems of inhibition of amplification reaction, nonspecific amplification induction, and detection sensitivity that occur when a reporter oligonucleotide is labeled with a conventional Cy5 fluorescent material Discloses a method of labeling a reporter oligonucleotide.
그러나, 전술한 종래기술들은 실버나노입자를 전자현미경용 염색물질로 사용하여 전자현미경 관찰용 신호를 증폭하거나 기존의 형광물질인 Cy3 또는 Cy5의 표지 대신에 실버나노입자들의 클러스터를 이용한 표지방식을 이용하는 수준에 머물고 있을 뿐 시료 내에 표적 폴리뉴클레오티드의 존재여부 또는 변이여부를 신속하고 편리하게 검출하면서도 특이도와 민감도를 모두 만족시키는 새로운 기반기술의 제공과는 거리가 먼 것이었다. However, in the above-described conventional techniques, silver nanoparticles are used as a dye material for an electron microscope to amplify a signal for observing an electron microscope, or a labeling method using clusters of silver nanoparticles instead of Cy3 or Cy5 But it is far from providing a new base technology that satisfies both singularity and sensitivity while quickly and conveniently detecting presence or variation of a target polynucleotide in a sample.
이에 본 발명자는 전술한 바와 같은 종래기술들의 문제점을 해결하고 시료 내에 표적 폴리뉴클레오티드의 존재여부 또는 변이여부를 신속하고 편리하게 검출하면서도 특이도와 민감도를 모두 만족시키는 새로운 검출기반 기술을 개발하기 위해 예의 연구를 거듭한 결과, 실버나노입자들의 결합 영역과 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 특이적 염기서열 영역으로 구성된 실버나노클러스터 프로브의 경우 실버나노입자들의 결합 영역에 실버나노입자들이 결합하면 종래의 실버나노입자들의 클러스터 보다 강한 발광 강도를 얻을 수 있을 뿐만아니라 특이적 염기서열 영역에 표적 폴리뉴클레오티드가 결합하게 되면 광 발생이 감소 내지는 소멸되는 것을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.Accordingly, the present inventors have made extensive and intensive studies to solve the problems of the prior art as described above and to develop a novel detection-based technology that can quickly and conveniently detect the presence or absence of a target polynucleotide in a sample and satisfy both specificity and sensitivity. As a result, it has been found that, in the case of a silver nanocluster probe composed of a binding region of silver nanoparticles and a specific base sequence region specifically binding to a target polynucleotide, when silver nanoparticles are bonded to the binding region of silver nanoparticles, It is possible to obtain a stronger luminescence intensity than a cluster of nanoparticles, and it is confirmed that when the target polynucleotide binds to the specific nucleotide sequence region, the light generation is reduced or eliminated, and the present invention has been accomplished.
본 발명의 목적은 실버나노입자들의 결합 영역과 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 특이적 염기서열 영역을 포함하고 실버나노입자들의 결합 영역에 실버나노입자들이 결합하여 실버나노클러스터를 형성할 때 검출가능한 광을 발생시키지만 특이적 염기서열 영역에 표적 폴리뉴클레오티드가 결합할 때 광 발생이 감소 내지는 소멸되는 실버나노클러스터 프로브 및 이의 설계 방법을 제공하는 것이다. It is an object of the present invention to provide a silver nanoparticle having a binding region of a silver nanoparticle and a specific base sequence region specifically binding to a target polynucleotide and detecting silver nanoparticles The present invention provides a silver nanocluster probe that generates light as much as possible, but reduces or eliminates light generation when a target polynucleotide binds to a specific base sequence region, and a method of designing the probe.
또한, 본 발명의 목적은 검출가능한 광을 발생하는 실버나노클러스터 프로브의 특이적 염기서열 영역에 표적 폴리뉴클레오티드가 결합할 때 광 발생이 감소 내지는 소멸되는 것을 확인함으로써 시료 내에 표적 폴리뉴클레오티드의 존재여부 또는 변이여부를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.It is also an object of the present invention to identify the presence or absence of a target polynucleotide in a sample by confirming that light generation is reduced or eliminated when a target polynucleotide binds to a specific base sequence region of a silver nanocluster probe that generates detectable light, And to provide a method for detecting the presence or absence of mutation.
추가로, 본 발명의 목적은 다양한 파장의 광을 발생하는 다양한 종류의 실버나노클러스터 프로브를 제공하고 이를 다양한 표적 폴리뉴클레오티드에 대응시켜 센서로서 제공함으로써 해당 파장의 발광 감소 내지는 소멸에 따라 이에 대응되는 표적 폴리뉴클레오티드의 존재여부 또는 변이여부를 검출할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.Furthermore, it is an object of the present invention to provide various kinds of silver nanocluster probes which generate light of various wavelengths and to provide them as sensors corresponding to various target polynucleotides, The present invention provides a method for detecting the presence or absence of a polynucleotide.
따라서, 본 발명의 목적은 전술한 실버나노클러스터 프로브를 이용하여 시료 내에 표적 폴리뉴클레오티드의 존재여부 또는 변이여부를 신속하고 편리하게 검출하면서도 특이도와 민감도를 모두 만족시키는 새로운 기반기술의 표적 폴리뉴클레오티드 검출방법을 제공하는데 있다. Accordingly, an object of the present invention is to provide a novel polynucleotide detection method of a base technology which can quickly and conveniently detect the presence or absence of a target polynucleotide in a sample using the above-mentioned silver nanocluster probe, while satisfying both specificity and sensitivity .
상기한 기술적 과제를 해결하고 상기한 발명의 목적에 부합되도록, 본 발명은 실버나노입자들의 결합 영역과 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 특이적 염기서열 영역을 포함하고 실버나노입자들의 결합 영역에 실버나노입자들이 결합하여 실버나노클러스터를 형성할 때 검출가능한 광을 발생시키지만 특이적 염기서열 영역에 표적 폴리뉴클레오티드가 결합할 때 광 발생이 감소 내지는 소멸되는 실버나노클러스터 프로브를 제공한다.In order to solve the above technical problems and to meet the object of the present invention, the present invention provides a silver nanoparticle comprising a binding region of silver nanoparticles and a specific nucleotide sequence region specifically binding to a target polynucleotide, Silver nanoparticle probes in which silver nanoparticles combine to form detectable light when silver nanoclusters are formed, but light generation is reduced or eliminated when a target polynucleotide binds to a specific base sequence region.
우선, 본 발명의 명세서에서 사용되는 용어를 설명하면 다음과 같다.First, terms used in the specification of the present invention will be described as follows.
본 발명의 명세서에서 사용되는 "표적 폴리뉴클레오티드"란 시료 내에서 검출하고자 하는 단일 사슬 또는 이중 사슬의 DNA 또는 RNA를 의미한다. 예를 들어, 단일염기다형성 또는 유전자형 분석에 사용되는 특이적인 염기서열 부분을 갖는 폴리뉴클레오티드, 특정 질환의 진단에 사용되는 마커 폴리뉴클레오티드, 유전학적으로 의미가 있는 돌연변이를 갖는 폴리뉴클레오티드, miRNA, mRNA 및 non-coding RNA를 포함할 수 있다."Target polynucleotide" as used in the specification of the present invention means DNA or RNA of single chain or double chain to be detected in a sample. For example, a polynucleotide having a specific base sequence portion used for single base polymorphism or genotyping analysis, a marker polynucleotide used for the diagnosis of a specific disease, a polynucleotide having a genetically meaningful mutation, miRNA, mRNA and non-coding RNA.
한편, 본 발명의 실시예에서는 실버나노클러스터 프로브가 miRNA를 검출하는데 사용되었으나 miRNA는 표적 폴리뉴클레오티드의 예시로서 이해되어야 하며, 본 발명의 실버나노클러스터 프로브 및 이의 설계방법과, 이러한 실버나노클러스터 프로브를 이용한 표적 폴리뉴클레오티드 검출방법은 다양한 표적 폴리뉴클레오티드의 존재 여부 또는 변이여부를 검출할 수 있는 기반기술로서 이해되어야 할 것이다. Meanwhile, in the embodiment of the present invention, silver nanocluster probes were used to detect miRNAs, but miRNAs should be understood as an example of target polynucleotides, and silver nanocluster probes of the present invention and a design method thereof, and silver nanocluster probes The target polynucleotide detection method used should be understood as an underlying technology capable of detecting the presence or the mutation of various target polynucleotides.
본 발명은 하기 구조식 1을 갖고 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 실버나노클러스터 프로브를 제공한다:The present invention provides a silver nanocluster probe having the following
구조식 1
X는 실버나노입자들의 결합 영역으로서 실버나노입자들이 결합하여 상기 구조식 1의 프로브가 실버나노클러스터를 형성하도록 하고, X is a binding region of silver nanoparticles, and silver nanoparticles are bonded to form silver nanoclusters of the probe of Formula 1,
Y는 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 특이적 염기서열 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드로서, 5'말단 또는 3'말단이 X에 연결되어 있으며,Y is an oligonucleotide comprising a specific base sequence region that specifically binds to a target polynucleotide, wherein the 5 'terminal or the 3' terminal is linked to X,
상기 실버나노입자들의 결합 영역인 X에 실버나노입자들이 결합하여 실버나노클러스터를 형성할 때에는 검출가능한 광을 발생시키지만 상기 특이적 염기서열 영역인 Y에 표적 폴리뉴클레오티드가 결합할 때에는 광 발생이 감소 내지는 소멸되는 것을 특징으로 한다. When the silver nanoparticles bind to the binding region X of the silver nanoparticles to form silver nanoclusters, a detectable light is generated. However, when the target polynucleotide binds to the specific nucleotide sequence region Y, light generation is reduced And disappears.
본 발명의 일실시예의 실버나노클러스터 프로브에 있어서, X는 핵산(예: DNA, RNA 등), 단백질, 폴리머, 덴드리머(dendrimer), 유기 화합물 및 무기 매트릭스(inorganic matrix)로 구성된 군으로부터 선택된 스캐폴드일 수 있다. 예를 들어, X가 DNA일 때 X는 서열번호 1 내지 서열번호 5로 구성된 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드일 수 있다. In a silver nanocluster probe of an embodiment of the present invention, X is a scaffold selected from the group consisting of a nucleic acid (e.g. DNA, RNA, etc.), a protein, a polymer, a dendrimer, an organic compound and an inorganic matrix Lt; / RTI > For example, when X is DNA, X may be an oligonucleotide selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 5.
본 발명의 일실시예의 실버나노클러스터 프로브에 있어서, 상기 표적 폴리뉴클레오티드는 miRNA 160이고 Y는 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 참고로, miRNA 160은 애기장대(Arabidopsis)에서 식물성장호르몬인 옥신(auxin)의 시그널링에 중요한 옥신 반응 인자(Auxin Response Factor)의 전사를 타겟팅하는 miRNA이다.In a silver nanocluster probe of an embodiment of the present invention, the target polynucleotide may be
본 발명의 일실시예의 실버나노클러스터 프로브에 있어서, Y가 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드일 때, 상기 구조식 1의 프로브는 서열번호 7 내지 서열번호 11로 구성된 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드일 수 있다.In the silver nanocluster probe of one embodiment of the present invention, when Y is an oligonucleotide of SEQ ID NO: 6, the probe of the
본 발명의 실버나노클러스터 프로브를 이용한 표적 폴리뉴클레오티드 검출방법은,The method of detecting a target polynucleotide using the silver nanocluster probe of the present invention comprises:
(a) 하기 구조식 1을 갖고 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 실버나노클러스터 프로브를 준비하는 단계와, (a) preparing a silver nanocluster probe having the following
구조식 1
(b) 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 특이적 염기서열 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드로서 5'말단 또는 3'말단이 상기 구조식 1의 X에 연결되어 있는 Y에 표적 폴리뉴클레오티드가 상보적으로 결합되도록 하는 단계와,(b) an oligonucleotide comprising a specific base sequence region that specifically binds to a target polynucleotide, wherein the 5 'terminal or the 3' terminal is linked to X in the
(c) 실버나노입자들의 결합 영역인 상기 구조식 1의 X에 실버나노입자들을 결합시켜 실버나노클러스터를 형성하는 단계와,(c) binding silver nanoparticles to X of
(d) 상기 구조식 1의 X에 실버나노입자들을 결합시켜 형성된 실버나노클러스터로부터 발생되는 광의 강도가, 상기 구조식 1의 Y에 대한 표적 폴리뉴클레오티드의 결합에 따라 감소 내지는 소멸되는지 여부를 확인하는 단계를 포함한다.(d) confirming whether the intensity of light generated from the silver nanoclusters formed by binding the silver nanoparticles to X of the
본 발명의 일실시예의 표적 폴리뉴클레오티드 검출방법은, 표적 폴리뉴클레오티드가 존재하지 않는 경우에 상기 구조식 1의 X에 실버나노입자들을 결합시켜 형성된 실버나노클러스터로부터 발생되는 광의 강도를 I0으로 하고 상기 (d) 단계에서 감소 내지는 소멸된 것으로 확인된 광의 강도를 I로 한 후, I0/I의 값으로부터 발광 강도의 감소 정도를 정량화하고 표적 폴리뉴클레오티드를 정량화하는 단계를 더 포함할 수 있다.A method for detecting a target polynucleotide in an embodiment of the present invention comprises detecting the intensity of light generated from a silver nanocluster formed by binding silver nanoparticles to X of the
본 발명의 일실시예의 표적 폴리뉴클레오티드 검출방법은, 상기 광의 강도가 감소 내지는 소멸되는지 여부를 확인함으로써 분석대상 시료 내에 표적 폴리뉴클레오티드의 존재여부 또는 변이여부를 검출하는 단계를 더 포함한다.The method of detecting a target polynucleotide of an embodiment of the present invention further includes the step of detecting presence or absence of a target polynucleotide in a sample to be analyzed by checking whether the intensity of the light is reduced or extinguished.
본 발명의 일실시예의 표적 폴리뉴클레오티드 검출방법에 있어서, 상기 X는 핵산(예: DNA, RNA 등), 단백질, 폴리머, 덴드리머(dendrimer), 유기 화합물 및 무기 매트릭스(inorganic matrix)로 구성된 군으로부터 선택된 스캐폴드일 수 있다. 예를 들어, 상기 X가 DNA일 때 X는 서열번호 1 내지 서열번호 5로 구성된 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드일 수 있다. In a method of detecting a target polynucleotide of an embodiment of the present invention, X is selected from the group consisting of a nucleic acid (e.g. DNA, RNA, etc.), a protein, a polymer, a dendrimer, an organic compound and an inorganic matrix Scaffold. For example, when X is DNA, X may be an oligonucleotide selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 5.
본 발명의 일실시예의 표적 폴리뉴클레오티드 검출방법에 있어서, 상기 (c) 단계는 AgNO3 첨가 및 NaBH4 환원에 의해 수행될 수 있다.In the method for detecting a target polynucleotide of an embodiment of the present invention, the step (c) may be performed by addition of AgNO 3 and reduction of NaBH 4 .
본 발명의 일실시예의 표적 폴리뉴클레오티드 검출방법에 있어서, 상기 표적 폴리뉴클레오티드는 miRNA 160이고 Y는 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드일 수 있다. In a method of detecting a target polynucleotide of an embodiment of the present invention, the target polynucleotide may be
본 발명의 일실시예의 표적 폴리뉴클레오티드 검출방법에 있어서, Y가 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드일 때, 상기 구조식 1의 프로브는 서열번호 7 내지 서열번호 11로 구성된 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드일 수 있다.In the target polynucleotide detection method of an embodiment of the present invention, when Y is the oligonucleotide of SEQ ID NO: 6, the probe of the
본 발명의 하기 구조식 1을 갖고 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 실버나노클러스터 프로브의 설계방법은,A method of designing a silver nanocluster probe having the following
구조식 1
실버나노입자들이 결합하여 상기 구조식 1의 프로브가 실버나노클러스터를 형성하도록 하는 X를 구성하는 단계와,Constructing X such that the silver nanoparticles combine to form the silver nanoclusters of the probe of
표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 특이적 염기서열 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드인 Y의 5'말단 또는 3'말단이 X에 연결되도록 Y를 구성하는 단계를 포함하되, Constructing Y such that the 5 ' end or the 3 ' end of Y, an oligonucleotide comprising a specific base sequence region that specifically binds to a target polynucleotide, is linked to X,
상기 실버나노입자들의 결합 영역인 X에 실버나노입자들이 결합하여 실버나노클러스터를 형성할 때에는 검출가능한 광을 발생시키지만 상기 특이적 염기서열 영역인 Y에 표적 폴리뉴클레오티드가 결합할 때에는 광 발생이 감소 내지는 소멸되도록 X와 Y를 구성하는 것을 특징으로 한다.When the silver nanoparticles bind to the binding region X of the silver nanoparticles to form silver nanoclusters, a detectable light is generated. However, when the target polynucleotide binds to the specific nucleotide sequence region Y, light generation is reduced And X and Y are configured to be eliminated.
본 발명의 일실시예의 실버나노클러스터 프로브의 설계방법에 있어서, X는 핵산(예: DNA, RNA 등), 단백질, 폴리머, 덴드리머(dendrimer), 유기 화합물 및 무기 매트릭스(inorganic matrix)로 구성된 군으로부터 선택된 스캐폴드일 수 있다. 예를 들어, X가 DNA일 때 X는 서열번호 1 내지 서열번호 5로 구성된 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드일 수 있다. In a method of designing a silver nanocluster probe according to an embodiment of the present invention, X is selected from the group consisting of a nucleic acid (e.g. DNA, RNA, etc.), a protein, a polymer, a dendrimer, an organic compound and an inorganic matrix It may be the selected scaffold. For example, when X is DNA, X may be an oligonucleotide selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 5.
본 발명의 일실시예의 실버나노클러스터 프로브의 설계방법에 있어서, 상기 표적 폴리뉴클레오티드는 miRNA 160이고 Y는 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드일 수 있다. In a silver nanocluster probe design method of an embodiment of the present invention, the target polynucleotide may be
본 발명의 일실시예의 실버나노클러스터 프로브의 설계방법에 있어서, Y가 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드일 때, 상기 구조식 1의 프로브는 서열번호 7 내지 서열번호 11로 구성된 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드일 수 있다. In a method of designing a silver nanocluster probe according to an embodiment of the present invention, when Y is an oligonucleotide of SEQ ID NO: 6, the probe of the
한편, 본 발명에 있어서, 상기 발생 광의 파장 영역은 적색 영역 내지 적외선 영역인 것이 바람직하고, 구체적으로 600nm-750nm인 것이 더욱 바람직하다.On the other hand, in the present invention, the wavelength region of the generated light is preferably a red region or an infrared region, and more preferably 600 nm-750 nm.
본 발명에 따른 실버나노클러스터 프로브는 실버나노입자들의 결합 영역과 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 특이적 염기서열 영역을 포함하고 실버나노입자들의 결합 영역에 실버나노입자들이 결합하여 실버나노클러스터를 형성할 때 검출가능한 광을 발생시키지만 특이적 염기서열 영역에 표적 폴리뉴클레오티드가 결합할 때 광 발생이 감소 내지는 소멸되는 기능을 나타낸다.The silver nanocluster probe according to the present invention comprises a binding region of silver nanoparticles and a specific nucleotide sequence region specifically binding to a target polynucleotide, wherein silver nanoparticles bind to the binding region of silver nanoparticles to form silver nanoclusters But also exhibits a function of reducing or eliminating light generation when a target polynucleotide binds to a specific base sequence region.
또한, 본 발명에 따르면 검출가능한 광을 발생하는 실버나노클러스터 프로브의 특이적 염기서열 영역에 표적 폴리뉴클레오티드가 결합할 때 광 발생이 감소 내지는 소멸되는 것을 확인함으로써 신속하고 편리하게 시료 내에 표적 폴리뉴클레오티드의 존재여부 또는 변이여부를 검출할 수 있다. 즉, 본 발명에 따르면 전술한 실버나노클러스터 프로브를 이용함으로써 시료 내에 표적 폴리뉴클레오티드의 존재여부 또는 변이여부를 별도의 표지과정 없이 1시간 이내에 신속하고 편리하게 검출하면서도 특이도와 민감도를 모두 만족시킬 수 있다. In addition, according to the present invention, when the target polynucleotide binds to the specific nucleotide sequence region of the silver nanocluster probe that generates detectable light, it is confirmed that the light generation is reduced or eliminated, thereby quickly and conveniently introducing the target polynucleotide Presence or absence of mutation can be detected. That is, by using the silver nanocluster probe according to the present invention, the presence or absence of the target polynucleotide in the sample can be quickly and conveniently detected within one hour without any labeling process, and both specificity and sensitivity can be satisfied .
뿐만아니라, 본 발명은 다양한 파장의 광을 발생하는 다양한 종류의 실버나노클러스터 프로브를 제공하고 이를 다양한 표적 폴리뉴클레오티드에 대응시켜 센서로서 제공함으로써 해당 파장의 발광 감소 내지는 소멸에 따라 이에 대응되는 표적 폴리뉴클레오티드의 존재여부 또는 변이여부를 검출할 수 있는 바이오 센서를 제공할 수 있다.In addition, the present invention provides various types of silver nanocluster probes for generating light of various wavelengths and provides them as sensors corresponding to various target polynucleotides, so that the corresponding target polynucleotides A biosensor capable of detecting presence or absence of a biosensor can be provided.
도 1은 본 발명의 실버나노클러스터 프로브에서 실버나노입자들의 결합 영역에 실버나노입자들이 결합하여 실버나노클러스터를 형성할 때에는 검출가능한 광을 발생시키지만 특이적 염기서열 영역에 표적 폴리뉴클레오티드가 결합할 때에는 광 발생이 감소 내지는 소멸되는 것을 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명의 일실시예의 실버나노클러스터 프로브(DNA-12nt-RED-160 프로브)의 염기서열 구성과, 이러한 실버나노클러스터 프로브에 실버나노입자들이 결합할 때 시간의 경과에 따른 발광 강도 변화를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일실시예의 실버나노클러스터 프로브(DNA-12nt-RED-160 프로브)에 대해 AgNO3 첨가 및 NaBH4 환원 후 1시간 경과 시점에서 300 nm ~ 640 nm의 여기 파장 범위에 대한 함수로서 측정된 전체 발광 스펙트럼이다.
도 4는 본 발명의 일실시예의 실버나노클러스터 프로브(DNA-12nt-RED-160 프로브)에 대한 AgNO3 첨가 및 NaBH4 환원 후 1시간, 2시간 및 3시간이 경과하여도 발광 강도의 변화가 크지 않고 안정적인 발광 특성을 나타내는 발광 스펙트럼이다.
도 5는 종래의 DNA-12nt-RED 서열에 대해 AgNO3 첨가 및 NaBH4 환원 후 1시간 경과된 시점에서 540 nm ~ 600 nm의 여기 파장에 대한 함수로서 측정된 전체 발광 스펙트럼이다.
도 6은 DNA-160 서열 단독에 대해 AgNO3 첨가 및 NaBH4 환원 후 1시간 경과된 시점에서 540 nm ~ 600 nm의 여기 파장에 대한 함수로서 측정된 전체 발광 스펙트럼이다.
도 7은 본 발명의 일실시예의 실버나노클러스터 프로브(DNA-12nt-RED-160 프로브)와 0μM 내지 1.5μM의 농도 범위의 miR160의 혼합물에 대해 AgNO3 첨가 및 NaBH4 환원 후 측정된 발광 스펙트럼과, 이를 정량화한 Stern-Volmer 플롯팅 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일실시예의 실버나노클러스터 프로브(1.5μM의 DNA-12nt-RED-160 프로브)에 대해 AgNO3와 NaBH4를 먼저 추가하고 1시간 경과한 시점에서 측정한 발광 스펙트럼(검정색 곡선)과, 이후 표적 폴리뉴클레오티드인 miR160을 추가한 후 20분이 경과한 시점에서 측정된 새로운 발광 스펙트럼(적색 곡선)이다.
도 9는 표적 폴리뉴클레오티드 miR160과 이에 대한 대조군인 RNA(RNA-miR163, RNA-miR166, RNA-miR172, RNA-RY-1)의 염기서열을 도시하고, 상기 표적 폴리뉴클레오티드 miR160의 존재로 인해 본 발명의 일실시예의 실버나노클러스터 프로브(DNA-12nt-RED-160 프로브)의 발광 강도의 급격한 감소를 나타내는 발광 스펙트럼과 I0/I 값에 대한 그래프를 도시한다.
도 10은 야생형 애기장대(WT)와 돌연변이형 애기장대(hyl1-2)에서 U6 snRNA 및 miR160에 대한 노던 블롯팅 결과를 나타내는 전기영동사진이다.
도 11은 야생형 애기장대(WT)와 돌연변이형 애기장대(hyl1-2)의 전체 RNA에 대해 본 발명의 일실시예의 실버나노클러스터 프로브(DNA-12nt-RED-160 프로브)를 반응시킨 후 실버나노입자들의 클러스터 형성에 의한 발광을 측정한 발광 강도 스펙트럼과 I0/I 값에 대한 그래프이다.
도 12는 야생형 애기장대(WT)와 돌연변이형 애기장대(hyl1-2)의 전체 RNA에 대해 본 발명의 일실시예의 실버나노클러스터 프로브(DNA-12nt-RED-160 프로브)를 첨가하지 않고 실버나노입자들의 클러스터 형성에 의한 발광을 측정한 발광 강도 스펙트럼이다.FIG. 1 shows that silver nanocluster probes of the present invention generate detectable light when silver nanoparticles bind to silver nanoparticles in a binding region of silver nanoparticles to form silver nanoclusters, but when a target polynucleotide binds to a specific base sequence region And the generation of light is reduced or disappears.
FIG. 2 is a graph showing the nucleotide sequence structure of a silver nanocluster probe (DNA-12nt-RED-160 probe) according to an embodiment of the present invention and the change in luminescence intensity with time when silver nano- .
FIG. 3 is a graph showing the relationship between a function for an excitation wavelength range of 300 nm to 640 nm at a time point of 1 hour after addition of AgNO 3 and reduction of NaBH 4 to a silver nanocluster probe (DNA-12nt-RED-160 probe) Lt; / RTI >
4 is a graph showing changes in luminescence intensity even after 1 hour, 2 hours and 3 hours after addition of AgNO 3 and NaBH 4 reduction to a silver nanocluster probe (DNA-12nt-RED-160 probe) according to an embodiment of the present invention And is a luminescence spectrum showing a stable light emission characteristic.
FIG. 5 is a total luminescence spectrum measured as a function of excitation wavelength from 540 nm to 600 nm at 1 hour after addition of AgNO 3 and reduction of NaBH 4 with respect to the conventional DNA-12nt-RED sequence.
FIG. 6 is a total luminescence spectrum measured as a function of excitation wavelength from 540 nm to 600 nm at 1 hour after addition of AgNO 3 and reduction of NaBH 4 for DNA-160 sequence alone.
7 is a graph showing the relationship between the luminescence spectrum measured after addition of AgNO 3 and NaBH 4 reduction to a mixture of a silver nanocluster probe (DNA-12nt-RED-160 probe) according to an embodiment of the present invention and miR160 in a concentration range of 0 μM to 1.5 μM , And a Stern-Volmer plotting graph that quantifies this.
FIG. 8 is a graph showing the emission spectra (black curves) measured at 1 hour after addition of AgNO 3 and NaBH 4 to silver nanocluster probes (1.5 μM DNA-12nt-RED-160 probe) ) And a new luminescence spectrum (red curve) measured 20 minutes after the addition of the target polynucleotide miR160.
Figure 9 shows the nucleotide sequences of the target polynucleotide miR160 and the control RNAs (RNA-miR163, RNA-miR166, RNA-miR172 and RNA-RY-1), and due to the presence of the target polynucleotide miR160, And I 0 / I value showing a sharp decrease in the luminescence intensity of the silver nanocluster probe (DNA-12nt-RED-160 probe) of Example 1 of the present invention.
10 is an electrophoresis image showing Northern blotting results for U6 snRNA and miR160 in wild-type Arabidopsis thaliana (WT) and mutant Arabidopsis thaliana (hyl1-2).
FIG. 11 shows the results obtained by reacting the silver nanocluster probe (DNA-12nt-RED-160 probe) of one embodiment of the present invention with the total RNA of the wild-type Arabidopsis thaliana (WT) and the mutant Arabidopsis thaliana (hyl1-2) measuring the light emission by the cluster formation of particle emission intensity spectrum and a graph of the I 0 / I value.
12 is a graph showing the results obtained by adding silver nano cluster probes (DNA-12nt-RED-160 probe) of one embodiment of the present invention to total RNA of wild-type Arabidopsis thaliana WT and mutant Arabidopsis thaliana And the luminescence intensity spectrum obtained by measuring the luminescence by cluster formation of particles.
이하, 본 발명을 실시예에 기초하여 보다 상세히 기술한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌들은 본 발명에 참고로서 통합된다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on examples. It should be understood that the following embodiments of the present invention are only for embodying the present invention and do not limit or limit the scope of the present invention. It will be understood by those of ordinary skill in the art that various changes in form and details may be made therein without departing from the spirit and scope of the invention as defined by the appended claims. The references cited in the present invention are incorporated herein by reference.
실시예Example
실시예 1: 실버나노클러스터 프로브의 제작 및 발광 확인Example 1: Preparation of silver nanocluster probe and confirmation of luminescence
실버나노입자들의 결합 영역(X 영역)의 올리고뉴클레오티드(서열번호 1)(이하, "DNA-12nt-RED"로 약칭됨)의 3'말단에, miRNA 160(이하, "miR160"으로 약칭됨)(서열번호 12)에 대해 상보적인 염기서열(서열번호 6)(이하, "DNA-160"으로 약칭됨)을 추가하여 본 발명의 일실시예의 실버나노클러스터 프로브(서열번호 7)(이하, "DNA-12nt-RED-160 프로브"로 약칭됨)를 제작하였다(도 2의 (A) 참조). 본 실시예에서는 실버나노입자들이 X 영역에 결합할 때 적색 발광을 하는 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드와, 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 특이적 염기서열 영역(Y 영역)을 결합시켰으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니고 다양한 파장의 광을 발생시킬 수 있는 X 영역의 올리고뉴클레오티드들이 사용될 수 있다. 예시로서 X 영역의 올리고뉴클레오티드는 다음의 서열번호 1 내지 서열번호 5 중 어느 하나일 수 있고, Y 영역의 올리고뉴클레오티드는 서열번호 6의 염기서열을 포함할 수 있다.
MiRNA 160 (hereinafter abbreviated as "miR160") at the 3 'end of an oligonucleotide (SEQ ID NO: 1) (hereinafter abbreviated as "DNA-12nt-RED") of a binding region (X region) (SEQ ID NO: 7) (hereinafter referred to as "DNA-160") of the present invention by adding a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence (SEQ ID NO: DNA-12nt-RED-160 probe ") (see Fig. 2 (A)). In this embodiment, the oligonucleotide of SEQ ID NO: 1 which emits red light when the silver nanoparticles are bonded to the X region is combined with the specific base sequence region (Y region) which specifically binds to the target polynucleotide, Is not limited thereto, and oligonucleotides of the X region capable of generating light of various wavelengths can be used. For example, the oligonucleotide of the X region may be any one of SEQ ID NOS: 1 to 5 below, and the oligonucleotide of the Y region may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6.
X 영역의 올리고뉴클레오티드의 예Examples of oligonucleotides in the X region
적색발광: 5'-CCTCCTTCCTCC-3' (서열번호 1)Red emission: 5'-CCTCCTTCCTCC-3 '(SEQ ID NO: 1)
청색발광: 5'-CCCTTTAACCCC-3' (서열번호 2)Blue emission: 5'-CCCTTTAACCCC-3 '(SEQ ID NO: 2)
녹색발광: 5'-CCCTCTTAACCC-3' (서열번호 3)Green emission: 5'-CCCTCTTAACCC-3 '(SEQ ID NO: 3)
황색발광: 5'-CCCTTAATCCCC-3' (서열번호 4)Yellow light emission: 5'-CCCTTAATCCCC-3 '(SEQ ID NO: 4)
근적외선: 5'-CCCTAACTCCCC-3' (서열번호 5)
Near-infrared: 5'-CCCTAACTCCCC-3 '(SEQ ID NO: 5)
Y 영역의 올리고뉴클레오티드Oligonucleotides of the Y region
5'-TGGCATACAGGGAGCCAGGCA-3' (서열번호 6)
5'-TGGCATACAGGGAGCCAGGCA-3 '(SEQ ID NO: 6)
X 영역 및 Y 영역으로 구성된 실버나노클러스터 프로브의 예Example of silver nanocluster probe composed of X region and Y region
5'-CCTCCTTCCTCCTGGCATACAGGGAGCCAGGCA-3' (서열번호 7)5'-CCTCCTTCCTCCTGGCATACAGGGAGCCAGGCA-3 '(SEQ ID NO: 7)
5'-CCCTTTAACCCCTGGCATACAGGGAGCCAGGCA-3' (서열번호 8)5'-CCCTTTAACCCCTGGCATACAGGGAGCCAGGCA-3 '(SEQ ID NO: 8)
5'-CCCTCTTAACCCTGGCATACAGGGAGCCAGGCA-3' (서열번호 9)5'-CCCTCTTAACCCTGGCATACAGGGAGCCAGGCA-3 '(SEQ ID NO: 9)
5'-CCCTTAATCCCCTGGCATACAGGGAGCCAGGCA-3' (서열번호 10)5'-CCCTTAATCCCCTGGCATACAGGGAGCCAGGCA-3 '(SEQ ID NO: 10)
5'-CCCTAACTCCCCTGGCATACAGGGAGCCAGGCA-3' (서열번호 11)
5'-CCCTAACTCCCCTGGCATACAGGGAGCCAGGCA-3 '(SEQ ID NO: 11)
본 실시예에서 표적 폴리뉴클레오티드인 miRNA 160는 애기장대(Arabidopsis)에서 식물성장호르몬인 옥신(auxin)의 시그널링에 중요한 옥신 반응 인자(Auxin Response Factor)의 전사를 타겟팅하는 것으로 알려져 있다.
광을 발생시키는 본 발명의 실버나노클러스터 프로브를 제조하기 위해, 서열번호 7의 올리고뉴클레오티드 (15μM)를 25℃에서 10분간 방치한 후 250μM의 AgNO3 및 250μM의 NaBH4를 1:17:17의 비율(올리고뉴클레오티드:AgNO3:NaBH4)로 첨가하여 최종 부피가 50㎕가 되도록 하였다(도 1 참조). AgNO3(99.9999%)과 NaBH4(99.99%)는 Sigma Aldrich로부터 구입하여 사용하였다.To prepare the silver nanocluster probe of the present invention for generating light, an oligonucleotide (15 μM) of SEQ ID NO: 7 was left at 25 ° C. for 10 minutes, and 250 μM of AgNO 3 and 250 μM of NaBH 4 were added thereto at a ratio of 1:17:17 (Oligonucleotide: AgNO 3 : NaBH 4 ) to a final volume of 50 μl (see FIG. 1). AgNO 3 (99.9999%) and NaBH 4 (99.99%) were purchased from Sigma Aldrich.
그리고 나서 위의 과정을 통해 수득된 1.5μM의 실버나노클러스터 프로브(DNA-12nt-RED-160 프로브)에 대해 발광 스펙트럼을 측정하였다. 발광 측정은 1 mm 석영 큐벳 (quartz cuvette)에서 형광측정기(fluorimeter) (Horiba Jobin Yvon, Fluoromax-4)에 의해 측정 기록되었다. 그 결과, 본 발명의 일실시예의 실버나노클러스터 프로브(DNA-12nt-RED-160 프로브)는 실버나노입자들이 클러스터를 형성할 때 강한 적색 발광을 나타내었다(도 2의 (B) 참조). Then, the luminescence spectrum was measured on a 1.5 μM silver nanocluster probe (DNA-12nt-RED-160 probe) obtained through the above procedure. Luminescence measurements were recorded and recorded by a fluorimeter (Horiba Jobin Yvon, Fluoromax-4) in a 1 mm quartz cuvette. As a result, a silver nanocluster probe (DNA-12nt-RED-160 probe) of one embodiment of the present invention showed strong red luminescence when silver nanoparticles clustered (see FIG.
도 2의 (B)는 본 발명의 일실시예의 1.5μM의 DNA-12nt-RED-160 프로브에 대해 AgNO3 첨가 및 NaBH4 환원 후 560 nm에서 여기시킨 다음, 620nm에서 발광을 측정하여 얻은 발광 스펙트럼으로서, 시간의 경과(15분, 30분, 60분)에 따른 발광 강도 변화를 나타내고 있다. 또한, 본 발명의 일실시예의 1.5μM의 DNA-12nt-RED-160 프로브에 대해 AgNO3 첨가 및 NaBH4 환원 후 1시간 경과 시점에서 300 nm ~ 640 nm의 여기 파장 범위에 대한 함수로서 전체 발광 스펙트럼을 측정하였다(도 3).FIG. 2 (B) is a graph showing the relationship between the luminescence spectrum obtained by measuring the luminescence at 620 nm after excitation at 560 nm after addition of AgNO 3 and NaBH 4 reduction to a 1.5 μM DNA-12nt-RED-160 probe of an embodiment of the present invention (15 minutes, 30 minutes, and 60 minutes) as time elapses. As a function of the excitation wavelength range of 300 nm to 640 nm at a time point of 1 hour after the addition of AgNO 3 and NaBH 4 reduction, the total luminescence spectrum of the 1.5 μM DNA-12nt-RED-160 probe of the present invention (Fig. 3).
도 2의 (B)의 결과를 분석하면, 본 발명의 일실시예의 DNA-12nt-RED-160 프로브는 DNA-12nt-RED 서열만을 단독으로 사용한 경우 보다 발광이 빠르게, 즉 1 시간 이내에 나타날 뿐만아니라 1시간 경과 후 발광 강도가 100배로 나타났다. 또한, 본 발명의 일실시예의 DNA-12nt-RED-160 프로브는 AgNO3 첨가 및 NaBH4 환원 후 1시간, 2시간 및 3시간이 경과하여도 발광 강도의 변화가 크지 않고 일정하여 안정적인 발광 특성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다(도 4 참조). Analysis of the results of FIG. 2B reveals that the DNA-12nt-RED-160 probe of one embodiment of the present invention exhibits luminescence more rapidly than DNA-12nt-RED alone, ie, within 1 hour After 1 hour, the emission intensity was 100 times. In addition, the DNA-12nt-RED-160 probe of one embodiment of the present invention exhibits stable luminescence characteristics with constant change of luminescence intensity even after 1 hour, 2 hours and 3 hours after addition of AgNO 3 and NaBH 4 reduction (See Fig. 4).
반면에, 종래의 1.5μM의 DNA-12nt-RED 서열 또는 1.5μM의 DNA-160 서열 단독에 대해 AgNO3 첨가 및 NaBH4 환원 후 1시간 경과된 시점에서 540 nm ~ 600 nm의 여기 파장에 대한 함수로서 전체 발광 스펙트럼을 측정하면, 본 발명의 일실시예의 실버나노클러스터 프로브(DNA-12nt-RED-160 프로브)에 비해 발광 강도가 낮았고 적색 발광이 나타나는데 몇시간이 소요되었다(도 5 및 도 6 참조). On the other hand, for the conventional 1.5 μM DNA-12nt-RED sequence or 1.5 μM DNA-160 sequence alone, the function for the excitation wavelength of 540 nm to 600 nm at an elapsed time of 1 hour after AgNO 3 addition and NaBH 4 reduction The emission intensity was lower than that of the silver nanocluster probe (DNA-12nt-RED-160 probe) of the embodiment of the present invention, and it took several hours to emit red light (see FIGS. 5 and 6) ).
또한, 본 발명의 일실시예의 DNA-12nt-RED-160 프로브, 종래의 DNA-12nt-RED 서열 및 miR160에 특이적인 DNA-160 서열 각각에 대해 AgNO3 첨가 및 NaBH4 환원 후 560 nm에서 여기시킨 다음, 적색 발광이 나타나는데 소요되는 시간 및 620 nm에서의 발광 강도를 측정 비교하여 정리하면 하기 표 1과 같다. 50㎕ 내의 150μM 및 15μM의 DNA-12nt-RED 서열에 대해 실버나노입자들의 클러스터를 형성하기 위해 1:6:6 (DNA-12nt-RED 서열:AgNO3:NaBH4) 비율로 AgNO3 및 NaBH4를 50㎕의 최종 부피가 되도록 첨가하였고, 50㎕ 내의 15μM의 DNA-160 서열에 대해 실버나노입자들의 클러스터를 형성하기 위해 1:17:17 (DNA-160 서열:AgNO3:NaBH4) 비율로 AgNO3 및 NaBH4를 50㎕의 최종 부피가 되도록 첨가하였으며, 발광 강도를 측정하기 전에 부피를 50㎕로부터 500㎕로 증가시켰다. 한편, DNA:AgNO3:NaBH4의 비율이 상이한 것은 실버나노입자들이 결합하는 DNA의 길이가 다르기 때문이며 본 실시예에서는 2개의 뉴클레오티드 당 1개의 Ag+의 비율이 얻어지도록 DNA:AgNO3:NaBH4의 비율을 결정하였다.
The DNA-12nt-RED-160 probe of the present invention, the conventional DNA-12nt-RED sequence, and the DNA-160 sequence specific to miR160 were respectively excited by AgNO 3 addition and NaBH 4 reduction at 560 nm Next, the time required for the red luminescence to appear and the luminescence intensity at 620 nm are measured and compared and summarized in Table 1 below. 6:: 6 (DNA-12nt -
표 1: DNA-12nt-RED-160 프로브, DNA-12nt-RED 서열 및 DNA-160 서열의 발광 강도 및 적색 발광 소요 시간 비교Table 1: Comparison of luminescence intensity of DNA-12nt-RED-160 probe, DNA-12nt-RED sequence and DNA-160 sequence and time required for red emission
위와 같은 실험결과들을 살펴보면, 실버나노입자들의 결합 영역과 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 특이적 염기서열 영역을 포함하는 경우 실버나노입자들의 결합 영역 단독으로 구성된 서열(종래의 DNA-12nt-RED 서열)이나 특이적 염기서열 단독으로 구성된 서열(DNA-160 서열) 보다 발광이 빠르게 나타날 뿐만아니라(1시간 내) 발광 후 시간이 경과하여도 안정적인 발광 특성을 나타내었으며, 특히 발광 강도가 100배가 되는 예상치 못한 효과를 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 실버나노입자들의 결합 영역과 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 특이적 염기서열 영역을 포함하는 실버나노클러스터 프로브는 신속한 검출에 적합하고 검출의 민감도와 정확도를 높일 수 있음을 확인할 수 있었다.
As a result of the above experiment, when the binding region of the silver nanoparticles and the specific nucleotide sequence region specifically binding to the target polynucleotide are included, the binding region of the silver nanoparticles alone (the conventional DNA-12nt-RED (DNA-160 sequence) composed of only a single nucleotide sequence or a single nucleotide sequence (DNA-160 sequence), and stable luminescence characteristics even after a lapse of time after luminescence (within 1 hour) I could see the unexpected effect. Therefore, the silver nanocluster probe comprising the binding region of the silver nanoparticles of the present invention and the specific base sequence region specifically binding to the target polynucleotide is suitable for rapid detection, and it is confirmed that the sensitivity and accuracy of detection can be enhanced I could.
실시예 2: 본 발명의 실버나노클러스터 프로브의 표적 폴리뉴클레오티드에 대한 특이적 결합에 의한 검출 능력 확인Example 2: Confirmation of detection ability of silver nanocluster probe of the present invention by specific binding to target polynucleotide
실시예 1에서 준비된 본 발명의 실버나노클러스터 프로브(1.5μM)(DNA-12nt-RED-160 프로브)와 0μM 내지 1.5μM의 농도 범위의 miR160(표적 폴리뉴클레오티드)(서열번호 12)의 혼합물(최종 부피 50㎕)을 25℃에서 15분간 인큐베이션하였다. 이와 같이 인큐베이션된 혼합물에 대해 실시예 1과 동일한 방식으로 AgNO3 및 NaBH4 첨가 후 25℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였고 450㎕의 증류수를 첨가하여 1 mm 석영 큐벳(quartz cuvette)에서 형광측정기(fluorimeter) (Horiba Jobin Yvon, Fluoromax-4)를 이용하여 560 nm에서 여기시킨 다음, 620nm에서 발광을 측정하여 발광 스펙트럼을 얻었다(도 7의 (A) 참조). A mixture of the silver nanocluster probe (1.5 μM) (DNA-12nt-RED-160 probe) of the present invention prepared in Example 1 and miR160 (target polynucleotide) (SEQ ID NO: 12) in a concentration range of 0 μM to 1.5 μM Volume 50 [mu] l) was incubated at 25 [deg.] C for 15 minutes. AgNO 3 and NaBH 4 were added to the thus incubated mixture in the same manner as in Example 1, followed by incubation at 25 ° C for 1 hour. Then, 450 μl of distilled water was added thereto, and the mixture was analyzed with a fluorimeter in a 1 mm quartz cuvette. (Horiba Jobin Yvon, Fluoromax-4) at 560 nm, and the emission was measured at 620 nm to obtain an emission spectrum (see FIG. 7 (A)).
도 7의 (A)의 결과를 살펴보면, 본 발명의 일실시예의 실버나노클러스터 프로브(DNA-12nt-RED-160 프로브)는 표적 폴리뉴클레오티드 miR160에 대해 농도의존적으로 적색 발광 신호의 강도를 감소시키는 것으로 확인되었다. 즉, 본 발명의 일실시예의 DNA-12nt-RED-160 프로브는 표적 폴리뉴클레오티드인 miR160 농도 증가에 따라 miR160와 특이적으로 결합하는 프로브의 양이 증가함으로써 적색 발광 신호의 강도가 점차 감소 내지는 소멸되는 것으로 확인되었다. 따라서, 본 발명의 실버나노클러스터 프로브는 표적 폴리뉴클레오티드의 존재에 따른 적색 발광 신호의 감소 정도를 정량화하면 표적 폴리뉴클레오티드의 존재 여부 또는 변이 여부를 검출할 수 있는 프로브와 이를 포함하는 센서로서 적용가능하다.7A, the silver nanocluster probe (DNA-12nt-RED-160 probe) of one embodiment of the present invention reduces the intensity of the red emission signal in a concentration-dependent manner with respect to the target polynucleotide miR160 . That is, the DNA-12nt-RED-160 probe of one embodiment of the present invention increases the amount of the probe specifically binding to miR160 according to the increase of miR160 concentration, which is the target polynucleotide, so that the intensity of the red light emission signal gradually decreases or disappears Respectively. Therefore, the silver nanocluster probe of the present invention can be applied as a probe capable of detecting the presence or absence of a target polynucleotide by quantifying the degree of reduction of a red light emission signal according to the presence of a target polynucleotide, and a sensor including the probe .
전술한 바와 같은 표적 폴리뉴클레오티드의 존재에 따른 적색 발광 신호의 감소 정도를 정량화하는 것은 도 7의 (B)에 도시된 바와 같은 Stern-Volmer 플롯팅에 의해 가능하다. 예를 들어, 표적 폴리뉴클레오티드인 miR160가 존재하지 않는 경우의 대조군의 발광 강도를 I0으로 할 때 I0을 miR160의 농도에 따른 발광강도 I로 나눈 값인 I0/I는 도 7의 (B)에서 확인되는 바와 같이 miR160의 농도에 대해 선형 관계(linear dependence)를 갖고 그 기울기는 대략 13임을 알 수 있다. 이러한 I0/I 값과 표적 폴리뉴클레오티드 농도의 선형 관계를 이용하면, 발광 강도의 상대적 감소에 따른 표적 폴리뉴클레오티드의 농도를 환산할 수 있다. The quantification of the degree of reduction of the red emission signal according to the presence of the target polynucleotide as described above is possible by the Stern-Volmer plotting as shown in Fig. 7 (B). For example, the target polynucleotide of miR160 is when the control light emission intensity of the case does not exist, the I 0 is calculated by dividing I 0 to the light-emitting intensity I in accordance with the concentration of miR160 I 0 / I of Fig. 7 (B) It can be seen that the gradient has a linear dependence on the concentration of miR160 and its slope is approximately 13. [ Using the linear relationship of the I 0 / I value and the target polynucleotide concentration, it is possible to convert the concentration of the target polynucleotide with a relative decrease in luminescence intensity.
특히, 본 발명의 실버나노클러스터 프로브는 발광 강도 50% 감소시 표적 폴리뉴클레오티드인 miR160의 Kd -1값이 76nM로서 500μL의 부피에서 38pmol의 표적 폴리뉴클레오티드인 miR160을 검출할 수 있어, 피코 몰 단위의 표적 폴리뉴클레오티드의 검출이 가능하고 이로부터 본 발명의 실버나노클러스터 프로브는 표적 폴리뉴클레오티드의 검출 민감도가 매우 우수하다고 할 수 있다.In particular, the silver nanocluster probe of the present invention is capable of detecting miR160, which is a target polynucleotide of 38 pmol in a volume of 500 mu L, at a Kd < -1 & gt; value of the target polynucleotide miR160 of 76 nM, It is possible to detect the target polynucleotide of the silver nanocluster probe of the present invention. Thus, the silver nanocluster probe of the present invention has excellent detection sensitivity of the target polynucleotide.
한편, 본 발명의 실버나노클러스터 프로브와 표적 폴리뉴클레오티드인 miR160을 먼저 섞어 반응시킨 후 AgNO3와 NaBH4를 차례로 처리한 다음 1시간 경과 시점에서 발광 강도를 측정한 경우 적색 발광 강도의 감소를 명확하게 확인할 수 있었다. 반면에 본 발명의 실버나노클러스터 프로브에 대해 AgNO3와 NaBH4를 먼저 섞고 표적 폴리뉴클레오티드인 miR160을 추가한 후 발광 강도를 측정하면 발광 강도 감소가 적었다(도 8 참조).
On the other hand, when the silver nanocluster probe of the present invention and the target polynucleotide miR160 were first mixed and reacted and AgNO 3 and NaBH 4 were sequentially treated, and the luminescence intensity was measured at an elapsed time of 1 hour, I could confirm. On the other hand, when the silver nanocluster probe of the present invention was firstly mixed with AgNO 3 and NaBH 4 and the target polynucleotide miR160 was added to measure the luminescence intensity, the decrease in luminescence intensity was small (see FIG. 8).
실시예 3: 본 발명의 실버나노클러스터 프로브의 특이도 검증Example 3: Specificity test of silver nanocluster probe of the present invention
실시예 1에 따라 준비된 본 발명의 일실시예의 1.5μM의 실버나노클러스터 프로브(DNA-12nt-RED-160 프로브)(서열번호 7)에 대해 다양한 농도(0.2μM 내지 15μM)의 miR160(표적 폴리뉴클레오티드)(서열번호 12)가 첨가된 용액, 또는 본 발명의 일실시예의 실버나노클러스터 프로브(DNA-12nt-RED-160 프로브)의 miR160에 대한 특이도 시험을 위한 대조군으로서 0.5μM의 RNA-miR163 (서열번호 13), 0.5μM의 RNA-miR166 (서열번호 14), 0.5μM의 RNA-miR172 (서열번호 15) 또는 0.5μM의 RNA-RY-1 (서열번호 16)이 1.5μM의 실버나노클러스터 프로브(DNA-12nt-RED-160 프로브)에 첨가된 용액을 준비하였다. MiR160 (target polynucleotide) of various concentrations (0.2 μM to 15 μM) against a 1.5 μM silver nanocluster probe (DNA-12nt-RED-160 probe) (SEQ ID NO: 7) of an embodiment of the present invention prepared according to Example 1 As a control for the specificity test for the miR160 of the silver nanocluster probe (DNA-12nt-RED-160 probe) of Example 1 of the present invention or the solution containing the RNA-miR163 (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 13), 0.5 μM of RNA-miR166 (SEQ ID NO: 14), 0.5 μM of RNA-miR172 (SEQ ID NO: 15) or 0.5 μM of RNA-RY- (DNA-12nt-RED-160 probe) was prepared.
표적 폴리뉴클레오티드인 miR160과 이에 대한 대조군인 RNA들의 염기서열은 본 발명의 실버나노클러스터 프로브의 특이도 시험을 위해 다음과 같은 서열로 구성된다(도 9의 (A) 참조). The nucleotide sequence of the target polynucleotide miR160 and the control RNA is composed of the following sequence for the specificity test of the silver nanocluster probe of the present invention (see FIG. 9 (A)).
RNA-miR160: 5'-UGCCUGGCUCCCUGUAUGCCA-3' (서열번호 12)RNA-miR160: 5'-UGCCUGGCUCCCUGUAUGCCA-3 '(SEQ ID NO: 12)
RNA-miR163: 5'-UUGAAGAGGACUUGGAACUUCGAU-3' (서열번호 13)RNA-miR163: 5'-UUGAAGAGGACUUGGAACUUCGAU-3 '(SEQ ID NO: 13)
RNA-miR166: 5'-UCGGACCAGGCUUCAUUCCCC-3' (서열번호 14)RNA-miR166: 5'-UCGGACCAGGCUUCAUUCCCC-3 '(SEQ ID NO: 14)
RNA-miR172: 5'-AGAAUCUUGAUGAUGCUGCAU-3' (서열번호 15)RNA-miR172: 5'-AGAAUCUUGAUGAUGCUGCAU-3 '(SEQ ID NO: 15)
RNA-RY-1: 5'-GCCAGCGCUCGGUUUUUUUUUUU-3' (서열번호 16)
RNA-RY-1: 5'-GCCAGCGCUCGGUUUUUUUUUUUU-3 '(SEQ ID NO: 16)
상기 과정에서 수득된 혼합용액을 25℃에서 15분간 인큐베이션한 후, AgNO3와 NaBH4를 첨가하여 최종 부피가 50㎕가 되도록 하였다. 그리고 나서, 상기 혼합 용액에 대해 실시예 1과 동일한 방식으로 AgNO3 및 NaBH4 첨가 후 25℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였고 450㎕의 증류수를 첨가하여 1 mm 석영 큐벳 (quartz cuvette)에서 형광측정기(fluorimeter) (Horiba Jobin Yvon, Fluoromax-4)를 이용하여 560 nm에서 여기시킨 다음, 620nm에서 발광을 측정하여 발광 스펙트럼을 얻었다(도 9의 (B) 참조). miR160과 이에 대한 대조군인 RNA(RNA-miR163, RNA-miR166, RNA-miR172, RNA-RY-1)의 존재로 인해 본 발명의 일실시예의 실버나노클러스터 프로브(DNA-12nt-RED-160 프로브)의 실버나노클러스터 형성 후에 측정된 발광 강도의 감소가 관찰되었는데, 특히 표적 폴리뉴클레오티드인 miR160에 의한 발광 강도의 감소가 매우 컸고 나머지 RNA는 그 영향이 미미하였다. 각 RNA에 대한 I0/I 값을 그래프로 나타내어 비교한 결과(도 9의 (C)), miR160의 경우 가장 높은 6배의 발광 강도의 감소가 확인되어 본 발명의 실버나노클러스터 프로브는 표적 폴리뉴클레오티드 검출시 특이도 높은 프로브로 제작될 수 있으며, 이를 이용한 바이오 센서로의 응용을 가능케 한다.
The mixed solution obtained in the above procedure was incubated at 25 ° C for 15 minutes, and AgNO 3 and NaBH 4 were added to make a final volume of 50 μl. Then, AgNO 3 and NaBH 4 were added to the mixed solution in the same manner as in Example 1, incubation was carried out at 25 ° C for 1 hour, and 450 μl of distilled water was added thereto. The mixture was diluted with a 1 mm quartz cuvette using a fluorimeter ) (Horiba Jobin Yvon, Fluoromax-4) at 560 nm and then measured for luminescence at 620 nm to obtain a luminescence spectrum (see Fig. 9 (B)). (DNA-12nt-RED-160 probe) of one embodiment of the present invention due to the presence of miR160 and the control RNA (RNA-miR163, RNA-miR166, RNA- miR172, The reduction of the luminescence intensity of the target polynucleotide miR160 was remarkably large and the effect of the remaining RNA was small. ((C) in Fig. 9), in the case of a miR160 the highest six-fold decrease in the emission intensity of the check silver nanoclusters probe of the present invention I 0 / results of the I value comparison represented by the graphs for each of the RNA target poly When the nucleotide is detected, it can be produced as a probe with high specificity, and it is possible to use the probe as a biosensor.
실시예 4: 본 발명의 실버나노클러스터 프로브를 이용하여 전체 식물 RNA에 대한 야생형 및 돌연변이형 검출Example 4: Detection of wild type and mutant type of whole plant RNA using silver nanocluster probe of the present invention
본 실시예에서는 분석대상이 되는 전체 식물 RNA에 대해 본 발명의 실버나노클러스터 프로브를 이용한 검출을 수행하여 특정 miRNA의 대사경로에 결함이 있는 돌연변이형을 분석 확인하였다. 이를 위해 표적 폴리뉴클레오티드인 miR160을 포함하는 모든 RNA가 존재하는 야생형(WT) 애기장대(Arabidopsis thaliana)와 miR160의 프로세싱 경로에 결함이 있는 돌연변이형(hyl1-2) 애기장대를 사용하였다. 실험결과, 본 발명의 실버나노클러스터 프로브는 전체 RNA를 포함하는 분석 대상 시료에서 특정 표적 폴리뉴클레오티드가 존재하는지 여부 뿐만아니라 존재하는 경우에 변이가 존재하는지 여부, 즉 야생형인지 돌연변이형인지를 확인할 수 있었다.In the present embodiment, the detection of the mutant type defective in the metabolic pathway of a specific miRNA was performed by performing detection using the silver nanocluster probe of the present invention for the entire plant RNA to be analyzed. To do this, we used a wild type (WT) Arabidopsis thaliana in which all the RNA containing the target polynucleotide miR160 was present and a mutant type (hyl1-2) Arabidopsis thaliana deficient in the processing pathway of miR160. As a result, the silver nanocluster probe of the present invention can confirm whether or not a specific target polynucleotide is present in a sample to be analyzed including total RNA, and whether or not a mutation exists, that is, a wild type or a mutant type .
우선, 야생형 애기장대(WT)와 돌연변이형 애기장대(hyl1-2)의 RNA 정제 및 노던 블롯팅 분석은 당업계에 알려진 공지기술에 따라 수행하였다(Yang, S. W.; Chen, H. Y.; Yang, J.; Machida, S.; Chua, N. H.; Yuan, Y. A. Structure 2010, 18, 594-605). 도 10에 도시된 바와 같이, miR160의 프로세싱 경로와 관련이 없는 U6 snRNA (U6 small nuclear RNA)는 야생형과 돌연변이형 모두에서 밴드가 확인되었으나, miR160은 돌연변이형(hyl1-2)에서 야생형에 비해 현저하게 감소된 수준을 나타내어 매우 약한 밴드만을 확인할 수 있었다.First, RNA purification and Northern blotting analysis of wild-type Arabidopsis thaliana (WT) and mutant Arabidopsis thaliana (hyl1-2) were performed according to known techniques known in the art (Yang, SW; Chen, HY; ; Machida, S .; Chua, NH; Yuan, YA Structure 2010, 18, 594-605). As shown in Fig. 10, U6 small nuclear RNA (U6 snRNA), which is not related to the processing pathway of miR160, was found to have bands in both wild type and mutant type, while miR160 was found to be more abundant in the mutant type (hyl1-2) And only very weak bands were identified.
그리고, 이러한 노던 블롯팅 분석 결과와 본 발명의 실버나노클러스터 프로브를 이용한 분석결과가 일치하는지를 다음과 같이 확인하였다. 정제된 전체 RNA를 50% 포름아마이드(50% formamide) 대신에 RNAse가 없는 증류수에 재용해시키고 얻은 20μg의 RNA를 본 발명의 일실시예의 15μM의 실버나노클러스터 프로브(DNA-12nt-RED-160 프로브)와 25℃에서 15분간 인큐베이션하고 실시예 1 내지 실시예 3에서 기술한 바와 같은 방식으로 실버나노클러스터 형성과정(AgNO3 및 NaBH4 첨가)을 수행하였다. The results of the Northern blotting analysis and the analysis using the silver nanocluster probe of the present invention were confirmed as follows. The purified total RNA was redissolved in distilled water without RNAse in place of 50% formamide and 20 μg of the obtained RNA was added to a 15 μM silver nanocluster probe of the present invention (DNA-12nt-RED-160 probe ) and incubated for 15 minutes at 25 ℃ and examples 1 to exemplary manner with a silver nanoclusters to form the process as described in example 3 (
그리고 나서, 실시예 1 내지 실시예 3에서 설명한 바와 같은 발광 측정 방법에 따라, 야생형 애기장대(WT)와 돌연변이형 애기장대(hyl1-2)의 20μg의 전체 RNA에 대한 발광을 측정하였고 I0/I 값을 구하였다(도 11 참조). 한편, 비교를 위해 본 발명의 일실시예의 실버나노클러스터 프로브(DNA-12nt-RED-160 프로브)를 첨가하지 않고 야생형 애기장대(WT)와 돌연변이형 애기장대(hyl1-2)의 20μg의 전체 RNA에 대한 발광을 측정하였다(도 12 참조).Then, Examples 1 to embodiments in accordance with the light emission measuring method as described in Example 3, the luminescence was measured for a total of 20μg RNA of wild-type Arabidopsis (WT) and mutant-type Arabidopsis thaliana (hyl1-2) I 0 / I value (see Fig. 11). For comparison, 20 μg of total RNA of wild-type Arabidopsis thaliana (WT) and mutant Arabidopsis thaliana (hyl1-2) without adding the silver nanocluster probe (DNA-12nt-RED-160 probe) of one embodiment of the present invention (See Fig. 12).
그 결과, 도 11에 도시된 바와 같이, 야생형 애기장대의 전체 RNA에 대해 본 발명의 일실시예의 실버나노클러스터 프로브(DNA-12nt-RED-160 프로브)를 반응시킨 경우에는 현저한 발광 감소(검정색 곡선)가 관찰된 반면에, 돌연변이형 애기장대(hyl1-2)의 전체 RNA에 대해 본 발명의 일실시예의 실버나노클러스터 프로브(DNA-12nt-RED-160 프로브)를 반응시킨 경우에는 발광 감소가 미미하여 야생형에 비해 대략 4배 정도의 발광 강도를 나타내었다(적색 곡선). 이는 본 발명의 실버나노클러스터 프로브(DNA-12nt-RED-160 프로브)가 돌연변이형 miR160에 대해서는 특이적으로 결합하지 않아 발광 감소가 미미한 것을 의미하며, 앞서 수행한 노던 블롯팅 결과와 일치하는 것이었다.As a result, when the silver nanocluster probe (DNA-12nt-RED-160 probe) of the embodiment of the present invention was reacted with the total RNA of wild type Arabidopsis as shown in Fig. 11, remarkable luminescence reduction ), Whereas when the silver nanocluster probe (DNA-12nt-RED-160 probe) of the present invention was reacted with the total RNA of the mutant type Arabidopsis thaliana (hyl1-2) The emission intensity was about 4 times that of the wild type (red curve). This means that the silver nanocluster probe (DNA-12nt-RED-160 probe) of the present invention does not specifically bind to the mutant miR160, resulting in a slight decrease in luminescence, which is consistent with the result of Northern blotting performed earlier.
즉, 본 실시예에서는 분석대상이 되는 전체 식물 RNA에 대해 본 발명의 실버나노클러스터 프로브를 이용하여 특정 miRNA의 대사경로에 결함이 있는 돌연변이형을 확인할 수 있었다. 이는 본 발명의 실버나노클러스터 프로브가 전체 RNA를 포함하는 분석 대상 시료에서 특정 표적 폴리뉴클레오티드가 존재하는지 여부 뿐만아니라 존재하는 경우에 변이가 존재하는지 여부, 즉 야생형인지 돌연변이형인지를 확인할 수 있는 것을 의미한다.That is, in the present embodiment, the mutant type defective in the metabolic pathway of a specific miRNA can be identified using the silver nanocluster probe of the present invention for the entire plant RNA to be analyzed. This means that the silver nanocluster probe of the present invention can confirm whether or not a specific target polynucleotide is present in a sample to be analyzed including total RNA, and whether or not a mutation exists, that is, a wild type or a mutant type do.
결국, 본 발명의 실버나노클러스터 프로브를 이용한 실험결과(도 11)는 노던 블롯팅 분석 결과(도 10)와 일치하여 본 발명의 실버나노클러스터 프로브는 전체 RNA를 포함하는 분석 대상 시료에서 특정 표적 폴리뉴클레오티드가 존재하는지 여부를 확인함에 있어 비특이적인 전체 RNA의 배경값에 대해서도 명확한 검출신호를 생성함으로써 특정 표적 폴리뉴클레오티드를 유효하게 검출할 수 있었고, 또한 변이가 존재하는지 여부, 즉 야생형인지 돌연변이형인지를 확인할 수 있어 새로운 바이오 센서를 위한 기반기술로서 다양하게 적용가능한 것이라고 하겠다.11) of the silver nanocluster probe of the present invention is consistent with the results of the northern blotting analysis (FIG. 10), the silver nanocluster probe of the present invention has a specific target poly It was possible to effectively detect a specific target polynucleotide by generating a clear detection signal with respect to background values of nonspecific total RNA in confirming whether nucleotides were present and whether a mutation was present or not, And it can be applied variously as a base technology for a new biosensor.
이상 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.Although the present invention has been described with reference to the above embodiments, the present invention is not limited thereto. It will be understood by those skilled in the art that modifications and variations may be made without departing from the spirit and scope of the invention, and that such modifications and variations are also contemplated by the present invention.
<110> Seoulin Bio Science Co.,Ltd. <120> Silver nanocluster probe, method for detecting target polynucleotide using the same, and method for designing silver nanocluster probe <130> P12-0286KR <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X region 1 <400> 1 cctccttcct cc 12 <210> 2 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X region 2 <400> 2 ccctttaacc cc 12 <210> 3 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X region 3 <400> 3 ccctcttaac cc 12 <210> 4 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X region 4 <400> 4 cccttaatcc cc 12 <210> 5 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X region 5 <400> 5 ccctaactcc cc 12 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Y region <400> 6 tggcatacag ggagccaggc a 21 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Silver nanocluster probe 1 <400> 7 cctccttcct cctggcatac agggagccag gca 33 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Silver nanocluster probe 2 <400> 8 ccctttaacc cctggcatac agggagccag gca 33 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Silver nanocluster probe 3 <400> 9 ccctcttaac cctggcatac agggagccag gca 33 <210> 10 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Silver nanocluster probe 4 <400> 10 cccttaatcc cctggcatac agggagccag gca 33 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Silver nanocluster probe 5 <400> 11 ccctaactcc cctggcatac agggagccag gca 33 <210> 12 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA-miR160 <400> 12 ugccuggcuc ccuguaugcc a 21 <210> 13 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA-miR163 <400> 13 uugaagagga cuuggaacuu cgau 24 <210> 14 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA-miR166 <400> 14 ucggaccagg cuucauuccc c 21 <210> 15 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA-miR172 <400> 15 agaaucuuga ugaugcugca u 21 <210> 16 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA-RY-1 <400> 16 gccagcgcuc gguuuuuuuu uuu 23 <110> Seoulin Bio Science Co., Ltd. <120> Silver nanocluster probe, method for detecting target polynucleotide using the same, and method for designing silver nanocluster probe <130> P12-0286KR <160> 16 <170> Kopatentin 1.71 <210> 1 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X region 1 <400> 1 cctccttcct cc 12 <210> 2 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X region 2 <400> 2 ccctttaacc cc 12 <210> 3 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X region 3 <400> 3 ccctcttaac cc 12 <210> 4 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X region 4 <400> 4 cccttaatcc cc 12 <210> 5 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> X region 5 <400> 5 ccctaactcc cc 12 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Y region <400> 6 tggcatacag ggagccaggc a 21 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Silver nanocluster probe 1 <400> 7 cctccttcct cctggcatac agggagccag gca 33 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Silver nanocluster probe 2 <400> 8 ccctttaacc cctggcatac agggagccag gca 33 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Silver nanocluster probe 3 <400> 9 ccctcttaac cctggcatac agggagccag gca 33 <210> 10 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Silver nanocluster probe 4 <400> 10 cccttaatcc cctggcatac agggagccag gca 33 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Silver nanocluster probe 5 <400> 11 ccctaactcc cctggcatac agggagccag gca 33 <210> 12 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA-miR160 <400> 12 ugccuggcuc ccuguaugcc a 21 <210> 13 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA-miR163 <400> 13 uugaagagga cuuggaacuu cgau 24 <210> 14 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA-miR166 <400> 14 ucggaccagg cuucauuccc c 21 <210> 15 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA-miR172 <400> 15 agaaucuuga ugaugcugca u 21 <210> 16 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> RNA-RY-1 <400> 16 gccagcgcuc gguuuuuuuu uuu 23
Claims (18)
구조식 1
X는 실버나노입자들의 결합 영역으로서 실버나노입자들이 결합하여 상기 구조식 1의 프로브가 실버나노클러스터를 형성하도록 하고,
Y는 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 특이적 염기서열 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드로서, 5'말단 또는 3'말단이 X에 연결되어 있으며,
상기 실버나노입자들의 결합 영역인 X에 실버나노입자들이 결합하여 실버나노클러스터를 형성할 때에는 검출가능한 광을 발생시키지만 상기 특이적 염기서열 영역인 Y에 표적 폴리뉴클레오티드가 결합할 때에는 광 발생이 감소 내지는 소멸되는 것을 특징으로 실버나노클러스터 프로브.1. A silver nanocluster probe having the following structural formula 1 and specifically binding to a target polynucleotide,
Structure 1
X is a binding region of silver nanoparticles, and silver nanoparticles are bonded to form silver nanoclusters of the probe of Formula 1,
Y is an oligonucleotide comprising a specific base sequence region that specifically binds to a target polynucleotide, wherein the 5 'terminal or the 3' terminal is linked to X,
When the silver nanoparticles bind to the binding region X of the silver nanoparticles to form silver nanoclusters, a detectable light is generated. However, when the target polynucleotide binds to the specific nucleotide sequence region Y, light generation is reduced The silver nanocluster probe is characterized in that it disappears.
X는 핵산, 단백질, 폴리머, 덴드리머(dendrimer), 유기 화합물 및 무기 매트릭스(inorganic matrix)로 구성된 군으로부터 선택된 스캐폴드인 것을 특징으로 하는 실버나노클러스터 프로브.The method of claim 1,
X is a scaffold selected from the group consisting of a nucleic acid, a protein, a polymer, a dendrimer, an organic compound, and an inorganic matrix.
X가 DNA일 때 X는 서열번호 1 내지 서열번호 5로 구성된 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 실버나노클러스터 프로브.3. The method of claim 2,
Wherein when X is DNA, X is an oligonucleotide selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 5.
상기 표적 폴리뉴클레오티드는 miRNA 160이고 Y는 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 실버나노클러스터 프로브.4. The method according to any one of claims 1 to 3,
Wherein the target polynucleotide is miRNA 160 and Y is an oligonucleotide of SEQ ID NO: 6.
Y가 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드일 때, 상기 구조식 1의 프로브는 서열번호 7 내지 서열번호 11로 구성된 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 실버나노클러스터 프로브.5. The method of claim 4,
And Y is an oligonucleotide of SEQ ID NO: 6, wherein the probe of formula 1 is an oligonucleotide selected from the group consisting of SEQ ID NO: 7 to SEQ ID NO: 11.
상기 발생 광의 파장 영역은 적색 영역 내지 적외선 영역인 것을 특징으로 하는 실버나노클러스터 프로브.3. The method according to claim 1 or 2,
Wherein a wavelength region of the generated light is a red region or an infrared region.
상기 발생 광의 파장 영역은 600nm-750nm인 것을 특징으로 하는 실버나노클러스터 프로브.The method according to claim 6,
Wherein the wavelength range of the generated light is from 600 nm to 750 nm.
구조식 1
(b) 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 특이적 염기서열 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드로서 5'말단 또는 3'말단이 상기 구조식 1의 X에 연결되어 있는 Y에 표적 폴리뉴클레오티드가 상보적으로 결합되도록 하는 단계와,
(c) 실버나노입자들의 결합 영역인 상기 구조식 1의 X에 실버나노입자들을 결합시켜 실버나노클러스터를 형성하는 단계와,
(d) 상기 구조식 1의 X에 실버나노입자들을 결합시켜 형성된 실버나노클러스터로부터 발생되는 광의 강도가, 상기 구조식 1의 Y에 대한 표적 폴리뉴클레오티드의 결합에 따라 감소 내지는 소멸되는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 실버나노클러스터 프로브를 이용한 표적 폴리뉴클레오티드 검출방법.(a) preparing a silver nanocluster probe having the following structural formula 1 and specifically binding to a target polynucleotide, and
Structure 1
(b) an oligonucleotide comprising a specific base sequence region that specifically binds to a target polynucleotide, wherein the 5 'terminal or the 3' terminal is linked to X in the above formula 1, the target polynucleotide is complementarily bound , ≪ / RTI >
(c) binding silver nanoparticles to X of Formula 1, which is a binding region of silver nanoparticles, to form silver nanoclusters;
(d) confirming whether the intensity of light generated from the silver nanoclusters formed by binding the silver nanoparticles to X of the formula 1 is reduced or extinguished according to the binding of the target polynucleotide to Y in the formula 1 And detecting the target polynucleotide using the silver nanocluster probe.
표적 폴리뉴클레오티드가 존재하지 않는 경우에 상기 구조식 1의 X에 실버나노입자들을 결합시켜 형성된 실버나노클러스터로부터 발생되는 광의 강도를 I0으로 하고 상기 (d) 단계에서 감소 내지는 소멸된 것으로 확인된 광의 강도를 I로 한 후, I0/I의 값으로부터 발광 강도의 감소 정도를 정량화하고 표적 폴리뉴클레오티드를 정량화하는 단계를 더 포함하는 실버나노클러스터 프로브를 이용한 표적 폴리뉴클레오티드 검출방법.9. The method of claim 8,
When the target polynucleotide is absent, the intensity of light generated from the silver nanoclusters formed by binding the silver nanoparticles to X in the structural formula 1 is I 0 and the intensity of the light determined to decrease or disappear in the step (d) and then to the I, I 0 / I from the value of quantifying the degree of reduction of the light intensity and the target polynucleotide detection method using a silver nano-cluster probe further comprising the step of quantifying the target polynucleotide.
상기 광의 강도가 감소 내지는 소멸되는지 여부를 확인함으로써 분석대상 시료 내에 표적 폴리뉴클레오티드의 존재여부 또는 변이여부를 검출하는 단계를 더 포함하는 실버나노클러스터 프로브를 이용한 표적 폴리뉴클레오티드 검출방법.10. The method according to claim 8 or 9,
Detecting presence or absence of a target polynucleotide in a sample to be analyzed by confirming whether the intensity of the light is reduced or extinguished.
상기 X는 핵산, 단백질, 폴리머, 덴드리머(dendrimer), 유기 화합물 및 무기 매트릭스(inorganic matrix)로 구성된 군으로부터 선택된 스캐폴드인 것을 특징으로 하는 실버나노클러스터 프로브를 이용한 표적 폴리뉴클레오티드 검출방법.10. The method according to claim 8 or 9,
Wherein X is a scaffold selected from the group consisting of nucleic acid, protein, polymer, dendrimer, organic compound and inorganic matrix.
상기 (c) 단계는 AgNO3 첨가 및 NaBH4 환원에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 실버나노클러스터 프로브를 이용한 표적 폴리뉴클레오티드 검출방법.10. The method according to claim 8 or 9,
Wherein the step (c) is carried out by adding AgNO 3 and reducing NaBH 4, and detecting the target polynucleotide using the silver nanocluster probe.
상기 발생 광의 파장 영역은 적색 영역 내지 적외선 영역인 것을 특징으로 하는 실버나노클러스터 프로브를 이용한 표적 폴리뉴클레오티드 검출방법.10. The method according to claim 8 or 9,
Wherein the wavelength region of the generated light is a red region or an infrared region. ≪ RTI ID = 0.0 > 15. < / RTI >
상기 발생 광의 파장 영역은 600nm-750nm인 것을 특징으로 하는 실버나노클러스터 프로브를 이용한 표적 폴리뉴클레오티드 검출방법.14. The method of claim 13,
Wherein the wavelength range of the generated light is 600 nm to 750 nm.
구조식 1
실버나노입자들이 결합하여 상기 구조식 1의 프로브가 실버나노클러스터를 형성하도록 하는 X를 구성하는 단계와,
표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 특이적 염기서열 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드인 Y의 5'말단 또는 3'말단이 X에 연결되도록 Y를 구성하는 단계를 포함하되,
상기 실버나노입자들의 결합 영역인 X에 실버나노입자들이 결합하여 실버나노클러스터를 형성할 때에는 검출가능한 광을 발생시키지만 상기 특이적 염기서열 영역인 Y에 표적 폴리뉴클레오티드가 결합할 때에는 광 발생이 감소 내지는 소멸되도록 X와 Y를 구성하는 것을 특징으로 하는 실버나노클러스터 프로브의 설계방법.A method for designing a silver nanocluster probe having the following structural formula 1 and specifically binding to a target polynucleotide,
Structure 1
Constructing X such that the silver nanoparticles combine to form the silver nanoclusters of the probe of formula 1;
Constructing Y such that the 5 ' end or the 3 ' end of Y, an oligonucleotide comprising a specific base sequence region that specifically binds to a target polynucleotide, is linked to X,
When the silver nanoparticles bind to the binding region X of the silver nanoparticles to form silver nanoclusters, a detectable light is generated. However, when the target polynucleotide binds to the specific nucleotide sequence region Y, light generation is reduced And X and Y are configured to be eliminated.
X는 핵산, 단백질, 폴리머, 덴드리머(dendrimer), 유기 화합물 및 무기 매트릭스(inorganic matrix)로 구성된 군으로부터 선택된 스캐폴드인 것을 특징으로 하는 실버나노클러스터 프로브의 설계방법.16. The method of claim 15,
X is a scaffold selected from the group consisting of a nucleic acid, a protein, a polymer, a dendrimer, an organic compound, and an inorganic matrix.
상기 발생 광의 파장 영역은 적색 영역 내지 적외선 영역인 것을 특징으로 하는 실버나노클러스터 프로브의 설계방법.17. The method according to claim 15 or 16,
Wherein a wavelength region of the generated light is a red region or an infrared region.
상기 발생 광의 파장 영역은 600nm-750nm인 것을 특징으로 하는 실버나노클러스터 프로브의 설계방법.
18. The method of claim 17,
Wherein the wavelength range of the generated light is 600 nm to 750 nm.
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