KR20140012681A - Proteins for biocontrol of plant pathogenic fungi - Google Patents
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Abstract
푸사리움종, 스클레로티니아종, 리족토니아종, 피시움종 등으로 예시되는 식물 병원성 진균에 의해 야기되는 질병 증상을 방제하기 위한 조성물이다. 조성물에는 서열 4, 서열 5, 서열 6, 또는 서열 7과 80 % 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 분자가 제공된다. 조성물은 종자 처리, 식물 처리 또는 토양 처리 중 하나일 수 있다. 형질전환된 식물 세포는 서열 4, 서열 5, 서열 6, 또는 서열 7과 80 % 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 분자를 발현하며 이로써 상기 식물 세포는 식물 병원성 진균에 의한 감염에 내성이다. 형질전환된 미생물 세포는 서열 4, 서열 5, 서열 6, 또는 서열 7과 80 % 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 분자를 발현한다.A composition for controlling disease symptoms caused by phytopathogenic fungi exemplified by Fusarium species, Sclerotinia species, Lizatonia species, Pisium species and the like. The composition is provided with a polypeptide molecule comprising an amino acid sequence having at least 80% sequence homology with SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 7. The composition can be one of seed treatment, plant treatment or soil treatment. The transformed plant cell expresses a polypeptide molecule comprising an amino acid sequence having at least 80% sequence homology with SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 7 such that the plant cell is resistant to infection by plant pathogenic fungi to be. The transformed microbial cell expresses a polypeptide molecule comprising an amino acid sequence having at least 80% sequence homology with SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 7.
Description
본 발명은 신규의 생물학적 방제제, 진균성 식물 병원균을 방제하기에 효과적인 관련 조성물 및 그 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 식물 병원성 진균에 정진균 및/또는 살진균 효과를 갖는 신규의 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 또한 단백질을 포함하는 생물학적 방제제 및 그것을 수반하는 용도, 방법, 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to novel biological control agents, related compositions effective for controlling fungal plant pathogens and the use thereof. In particular, the present invention relates to novel proteins having a fungal and / or fungicidal effect on plant pathogenic fungi. The present invention also relates to biological control agents comprising proteins and uses, methods and compositions accompanying them.
푸사리움(Fusarium)은 식물 및 토양에 널리 분포되어 있는 섬유상 진균이다. 특정 푸사리움종은 식물 병원균이다. 예를 들어, 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum)은 100 종이 넘는 식물에서 푸사리움 시들음병을 야기한다. 이는 차단 및 붕괴를 일으킬 수 있는 식물 목관부 콜로니화에 의해서 일어난다. 이것이 발생할 때 잎의 시들음 및 황화와 같은 증상이 식물에서 나타나고 궁극적으로 식물의 죽음에 이른다. 이러한 상태가 전세계 시장으로부터 그로스 미셸(Gros Michel) 바나나 품종이 감소하고 사라지는 주요 원인이었다. 최근 새로운 균주가 우세한 카벤디쉬(Cavendish) 품종의 식물을 공격하기 시작하여, 해결책이 없는 경우 이 품종 역시 세계 시장에서 사라질 것이라는 우려를 낳고 있다.Fusarium (Fusarium) is a fibrous fungi that are widely distributed in plants and soil. Certain Fusarium species are plant pathogens. For example, Fusarium oxysporum causes Fusarium wilting disease in more than 100 plants. This is caused by plant wood colonization, which can cause blockage and collapse. When this occurs, symptoms such as withering and yellowing of the leaves appear in the plant and ultimately lead to plant death. This was the main reason for the decline and disappearance of Gros Michel banana varieties from global markets. Recently, new strains have started to attack plants of the predominant Cavendish variety, raising concerns that if there is no solution, it will disappear from the world market.
푸사리움 뿌리썩음병이 임업 묘포에서 묘목의 죽음의 주요 원인이며 또한 첫 번째 생장 시기 동안 아웃플랜팅한 후의 생존 감소를 야기한다. 이 질병은 몇몇의 푸사리움종에 의해 야기되며 세계의 많은 지역에서 흔하다. 이 질병은 서부 캐나다 및 미국에서, 그리고 북부 중앙 및 남부 주에서도 특별한 문제이다. 또한, -진균 푸사리움 설시내튬(Fusarium circinatum)에 의해 야기되는- 소나무 가지마름병이 심각한 소나무의 질병이며 특히 미국과 뉴질랜드에서 산림 산업에 위협이 된다. 라디에이터(Radiata) 또는 몬테레이(Monterey) 소나무가 이 질병에 매우 민감하며 캘리포니아 일부 지역에서 성목(mature tree)에서의 고사율이 80 %에 달한다.Fusarium root rot is a leading cause of seedling death in forest nursery and also leads to reduced survival after outplanting during the first growing season. This disease is caused by several Fusarium species and is common in many parts of the world. The disease is a particular problem in western Canada and the United States, and in northern central and southern states. In addition, pine blight-caused by the fungus Fusarium circinatum- is a serious pine disease and is a threat to the forest industry, especially in the United States and New Zealand. Radiata or Monterey pines are very susceptible to the disease, with 80% mortality in the nature tree in some parts of California.
'이삭 마름병(ear blight)' 또는 '붉은곰팡이병(scab)'으로도 알려져 있는 푸사리움 상부 마름병(Fusarium Head Blight (FHB))은 푸사리움에 의해 야기되는 밀, 보리, 귀리 및 다른 작은 곡물 질병이다. 옥수수(corn)와 옥수수(maize)는 '이삭 썩음병(ear rot)'으로 알려진 유사 상태에 의해 발병할 수 있다. 전술한 상태는 작물의 수확량 및 등급을 낮출 수 있고 잠재적으로는 진균독소(mycotoxin)로 곡물을 오염시킬 수 있다. FHB가 곡물 산업에 매년 거의 50억 달러의 비용이 들게 하는 것으로 추정된다. 최근 서부 캐나다에서 상업적으로 중요한 밀과 보리 작물에 FHB가 커져가는 의미있는 문제로 드러났다. 과거, 일부 발병한 곳에서의 수확량이 30 % 이상만큼 감소한 캐나다에서 푸사리움 옥시스포럼 및 푸사리움 아베나시움(Fusarium avenaceum)이 FHB와 주로 연관된 두 가지 종으로 확인되었다. FHB와 이삭 썩음병 수확 곡물은 종종 거식증(feed refusal), 일반적인 소화 장애, 설사 및 출혈과 관련된 데옥시니발레놀(deoxinivalenol(DON)) 트리코테센(trichothecenes)과 같은 진균독소로 오염된다. 북미에서의 독성의 3-아세틸데옥시니발레놀 (3-ADON) 푸사리움 그라미네아룸 (Fusarium graminearum) 군 출현은 꽤 최근의 현상이다. 이것이 15-ADON 화학형을 대체하고 있다. 게다가, - 실험실 및 포장(field) 조건 모두에서 푸사리움 그라미네아룸에 유사한 - 푸사리움 쿨모룸(F. culmorum)의 진균독소 프로파일이 전세계적으로 옥수수(corn), 옥수수(maize) 및 밀 생산에 대한 또 다른 위협을 나타낸다. 현재 FHB 및 관련 진균독소에 대한 효과적인 방제 수단이 없다. 또한, 옥수수, 밀, 보리, 귀리, 또는 다른 작은 곡물의 내성 품종 역시 없다. 살진균제(fungicide)가 효과적일 수 있으나 이들은 질병을 일시적으로 억제할 뿐이다.Fusarium Head Blight (FHB), also known as `` ear blight '' or `` scab, '' is a wheat, barley, oat and other small grain disease caused by Fusarium. to be. Corn and maize can be caused by a similar condition known as 'ear rot'. The aforementioned conditions can lower the yield and grade of the crop and potentially contaminate the grains with mycotoxins. The FHB is estimated to cost the grain industry nearly $ 5 billion annually. In recent years, FHB has become a significant problem for growing commercially important wheat and barley crops in western Canada. In the past, the Fusarium Oxysis Forum and Fusarium avenaceum have been identified as two species primarily associated with FHB in Canada, where yields in some affected areas have decreased by more than 30%. FHB and ear rot harvest grains are often contaminated with fungal toxins such as deoxinivalenol (DON) trichothecenes, which are associated with feed refusal, general digestive disorders, diarrhea and bleeding. Toxic 3-acetyldeoxynivalenol (3-ADON) Fusarium Graminearum ( Fusarium) graminearum ) military appearance is a fairly recent phenomenon. This replaces the 15-ADON chemical type. In addition, the mycotoxin profile of F. culmorum -similar to the Fusarium Graminea Room in both laboratory and field conditions-has been used in corn, maize and wheat production worldwide. Represents another threat. There is currently no effective control of FHB and related mycotoxins. Also, there are no resistant varieties of corn, wheat, barley, oats, or other small grains. Fungicides can be effective, but they only temporarily suppress the disease.
흔한 식물 병원균일 뿐만 아니라 푸사리움종은 기회감염성으로 동물을 감염시킬 수 있으며 인간에서의 가벼운 및/또는 전신적 감염의 원인 인자일 수 있다. 푸사리움은 푸사리움 감염을 치료하기 어렵게 하는, 가장 약물저항성인 진균 중 하나이다. 침습성 감염은 치명상이 될 수 있다.Fusarium species, as well as common plant pathogens, can infect animals opportunistically and can be a causative agent of mild and / or systemic infection in humans. Fusarium is one of the most drug resistant fungi that makes it difficult to treat a Fusarium infection. Invasive infections can be fatal.
스클레로티니아(Sclerotinia) 줄기 썩음병은 병원균 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum)에 의해 야기된다. 스클레로티니아 스클레로티오룸은 넓은 숙주 범위를 가지며 수많은 종의 식물을 감염시키는 것으로 알려져 있다 (캐놀라, 해바라기, 대두, 아마 등). 질병의 발병은 특히 윤작하지 않는 조건하 또는 회전이 몇몇의 민감한 식물종을 포함하는 경우 심각할 수 있다. 감염이 개화기 초기에 발생하는 경우 수확량 감소는 20 %에 달할 수 있다. 널리 퍼진 다른 진균성 식물 병원균은 농작물에서 "모잘록병(damping off)" 또는 "와이어-스템(wire-stem)" 질병 증상을 야기하는 리족토니아(Rhizoctonia)이다. 감염은 생장 시기 동안 언제든 발생할 수 있으나 유묘기가 가장 민감하다. 모든 생장 단계에서의 질병의 발생 정도 및 심각성은 날씨, 토양 조건 및 접종물 레벨에 영향을 받는다. 유묘감염은 저온의 날씨에 잘 일어난다. 또한, 와이어스템 질병의 발생 정도는 토양이 습윤하고 저온인 봄과 가을에 가장 심각하다. 뿌리 썩음병은 일반적으로 따뜻하고 습윤한 날씨 동안 발생하며 임의의 발달 단계에서 식물을 발병시킬 수 있다. 모잘록병이 발병한 묘는 생기지 못하며 만일 그렇다 할지라도 빠르게 줄어들고, 넘어지고, 죽는다. 더 늙은 묘에서는 아래쪽 잎들이 자주색이 되고 아래쪽 줄기가 수축되며 토양 표면 근처에서 짙은 갈색이 된다. 다른 증상은 종자 부패, 뿌리 썩음 및 아래쪽 잎자루에서의 동고병(canker)을 포함할 수 있다. 피시움 울티멈(Pythium ultimum)은 전세계에 걸쳐 널리 분포된, 어디에나 있는 토양운반의 병원균이며 이는 식물에 모잘록병 및 뿌리 썩음병을 야기한다. 피시움 울티멈은 많은 중요한 작물학적 농작물 및 잔디풀을 포함하여 넓은 범위의 숙주를 가진다. Sclerotinia stem rot is caused by the pathogen Sclerotinia sclerotiorum . Sclerotinia sclerothiorum has a wide host range and is known to infect numerous species of plants (canola, sunflower, soybean, flax, etc.). The onset of the disease can be severe, especially under conditions that are not rotatable or when rotation involves some sensitive plant species. If the infection occurs early in the flowering period, yield reduction can reach 20%. Another widespread fungal plant pathogen is Rhizoctonia , which causes "damping off" or "wire-stem" disease symptoms in crops. Infection can occur at any time during the growing season, but seedlings are most sensitive. The incidence and severity of disease at all stages of growth is affected by weather, soil conditions and inoculum levels. Seedling infections occur well in cold weather. In addition, the incidence of wirestem disease is most severe in spring and autumn when the soil is wet and cold. Root rot generally occurs during warm, wet weather and can develop plants at any stage of development. Seedlings of the disease are not formed, and if so, they quickly shrink, fall, and die. In older tombs, the lower leaves become purple, the lower stem contracts, and dark brown near the soil surface. Other symptoms may include seed rot, root rot and canker in the lower petioles. Pythium ultimum is a widely distributed pathogen for soil transport throughout the world, which causes plant seedlings and root rot. Pisium Ultimum has a wide range of hosts, including many important agronomic crops and turfgrass.
본 발명은 진균성 병원균 및/또는 푸사리움종, 스클레로티니아종, 리족토니아종, 피시움종 등으로 예시되는 식물 병원성 진균에 의해 야기되는 질병 증상을 방제하는 신규의 단백질에 관한 것이다. 또한, 이러한 신규의 단백질은 푸사리움종, 스클레로티니아종, 리족토니아종, 피시움종 등으로 예시되는 식물 병원성 진균에 의해 생산되는 독소에 대해 항진균독소 효과 역시 가진다.The present invention relates to novel proteins that control fungal pathogens and / or disease symptoms caused by plant pathogenic fungi exemplified by Fusarium spp., Sclerotinia spp., Lizartonia spp., Psium spp. In addition, these novel proteins also have antifungal toxin effects on toxins produced by plant pathogenic fungi exemplified by Fusarium species, Sclerotinia species, Lizatonia species, Pisium species and the like.
본 발명의 일부 예시적인 실시태양은 식물 병원성 진균포자의 발아 방제 및/또는 예방, 및/또는 식물 병원성 진균 균사체의 증식 방제, 및/또는 식물 병원성 진균이 식물 세포를 감염시키는 것의 예방 또는 임의의 그 조합에 유용한 스페로데스 마이코파라시티카(Sphaerodes mycoparasitica)에 의해 생산되는 신규의 세포내 단백질에 관한 것이다.Some exemplary embodiments of the invention provide germination control and / or prevention of plant pathogenic fungal spores, and / or control of proliferation of plant pathogenic fungal mycelium, and / or prevention of, or any infection thereof, of plant pathogenic fungi. A novel intracellular protein produced by Sphaerodes mycoparasitica useful for combination.
본 발명의 일부 예시적인 실시태양은 식물 병원성 진균 포자의 발아 방제 및/또는 예방, 및/또는 식물 병원성 진균 균사체의 증식 방제, 및/또는 식물 병원성 진균이 식물 세포를 감염시키는 것의 예방 또는 임의의 그 조합에 유용한 스페로데스 마이코파라시티카에 의해 생산되는 신규의 세포외 단백질에 관한 것이다.Some exemplary embodiments of the invention provide germination control and / or prevention of plant pathogenic fungal spores, and / or control of proliferation of plant pathogenic fungal mycelium, and / or prevention of, or any infection thereof, by plant pathogenic fungi. A novel extracellular protein produced by Spherodes mycoparasiticas useful in combination.
본 발명의 한 측면은 서열 4를 포함하며 약 79 kDa의 분자량을 갖는 스페로데스 마이코파라시티카에 의해 생산되는 신규의 세포외 단백질에 관한 것이다.One aspect of the invention relates to a novel extracellular protein comprising SEQ ID NO: 4 and produced by Spherodes mycoparasitika having a molecular weight of about 79 kDa.
본 발명의 한 측면은 서열 5를 포함하며 약 50 kDa의 분자량을 갖는 스페로데스 마이코파라시티카에 의해 생산되는 신규의 세포외 단백질에 관한 것이다.One aspect of the invention relates to a novel extracellular protein comprising SEQ ID NO: 5 and produced by Spherodes mycoparasitika having a molecular weight of about 50 kDa.
본 발명의 한 측면은 서열 6을 포함하며 약 36 kDa의 분자량을 갖는 스페로데스 마이코파라시티카에 의해 생산되는 신규의 세포외 단백질에 관한 것이다.One aspect of the invention relates to a novel extracellular protein comprising SEQ ID NO: 6 and produced by Spherodes mycoparasitika having a molecular weight of about 36 kDa.
본 발명의 한 측면은 서열 7을 포함하며 약 13 kDa의 분자량을 갖는 스페로데스 마이코파라시티카에 의해 생산되는 신규의 세포외 단백질에 관한 것이다.One aspect of the invention relates to a novel extracellular protein produced by Spherodes mycoparasitika comprising SEQ ID NO: 7 and having a molecular weight of about 13 kDa.
본 발명의 일부 예시적인 실시태양은 하나 이상의 신규의 세포외 단백질을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 조성물은 종자 처리 조성물일 수 있고 또는 이들은 식물 처리 조성물일 수 있고 또는 이들은 토양 처리 조성물일 수 있다.Some exemplary embodiments of the invention relate to compositions comprising one or more novel extracellular proteins. The composition may be a seed treatment composition or they may be plant treatment compositions or they may be soil treatment compositions.
본 발명의 일부 예시적인 실시태양은 하나 이상의 신규의 세포내 단백질 및 신규의 세포외 단백질을 생산하도록 형질전환된 미생물 세포에 관한 것이다. 형질전환된 미생물 세포는 푸사리움종, 스클레로티니아종, 리족토니아종, 피시움종 등으로 예시되는 식물 병원성 진균에 의해 야기되는 질병 증상을 방제하기 위해 사용될 수 있다. 형질전환된 미생물 세포는 종자 처리 및/또는 식물 처리 및/또는 토양 처리 또는 임의의 그 조합으로서 사용될 수 있다. 다르게는, 형질전환된 미생물 세포가 신규의 단백질을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 단백질은 본 발명의 조성물을 제조하기 위해 수확되고 사용될 수 있다.Some exemplary embodiments of the invention relate to microbial cells transformed to produce one or more new intracellular proteins and new extracellular proteins. Transformed microbial cells can be used to control disease symptoms caused by plant pathogenic fungi exemplified by Fusarium species, Sclerotinia species, Lizatonia species, Pisium species and the like. Transformed microbial cells can be used as seed treatment and / or plant treatment and / or soil treatment or any combination thereof. Alternatively, transformed microbial cells can be used to produce new proteins. Proteins can be harvested and used to make the compositions of the present invention.
본 발명의 일부 예시적인 실시태양은 하나 이상의 신규의 단백질을 과발현하는 형질전환된 식물 세포에 관한 것이다. 이러한 형질전환된 식물 세포는 종자, 체세포배, 기관형성 조직 등으로 예시되는, 온전한 식물로 배양될 수 있는 식물 번식체에 포함될 수 있다. 형질전환된 식물 세포를 포함하는 온전한 식물은 푸사리움종, 스클레로티니아종, 리족토니아종, 피시움종 등으로 예시되는 식물 병원성 진균에 의해 야기되는 질병 증상에 내성이거나 적어도 잘 견딘다.Some exemplary embodiments of the invention relate to transformed plant cells that overexpress one or more novel proteins. Such transformed plant cells can be included in plant propagules that can be cultured into intact plants, exemplified by seeds, somatic embryos, organogenic tissues, and the like. Intact plants, including transformed plant cells, are resistant or at least well resistant to disease symptoms caused by plant pathogenic fungi exemplified by Fusarium species, Sclerotinia species, Lizatonia species, Pisium species and the like.
본 발명의 예시적인 실시태양이 다음의 도면을 참고로 하여 함께 기술되며, 여기서:
도 1(a)A 및 1(a)B는 본 발명의 예시적인 단백질의 푸사리움 옥시스포럼 (1(a)A) 및 푸사리움 그라미네아룸 (1(a)B)의 균사 생장에 대한 억제 효과를 보여주는 디스크 확산 분석법의 현미경사진이며, 도 1(b)는 생장 3일과 4일 후 예시적인 단백질에 의한 푸사리움 옥시스포럼 (A) 및 푸사리움 그라미네아룸 (B)의 균사 생장의 % 억제를 보여주는 차트이고;
도 2는 스페로데스 마이코파라시티카에 의해 생산되는 세포내 단백질의 두 밴드로 분리되는 10 % 천연-PAGE (native-PAGE)의 현미경사진이고;
도 3은 도 2에 보여진 10 % 천연-PAGE 겔에 나타난 상부 밴드 및 하부 밴드로부터 용리된 스페로데스 마이코파라시티카 세포내 단백질의 12 % SDS-PAGE 분리의 현미경사진이고;
도 4는 스페로데스 마이코파라시티카에 의해 생산되는 세포외 단백질의 네 밴드로 분리되는 10 % 천연-PAGE의 현미경사진이고;
도 5는 도 4에 보여진 10 % 천연-PAGE 겔의 네 밴드로부터 용리된 스페로데스 마이코파라시티카 세포외 단백질의 12 % SDS-PAGE 분리의 현미경사진이고;
도 6은 스페로데스 마이코파라시티카에 의해 생산되는 세포외 단백질의 네 밴드의 FLPC 분리를 보여주는 크로마토그램이고;
도 7(a)는 대조군 처리에서 푸사리움 옥시스포럼의 균사 생장의 현미경사진이고; 7(b)는 대조군 처리 플러스 완충액에서 푸사리움 옥시스포럼의 균사 생장의 현미경사진이고; 7(c)는 50 kDa 세포내 단백질의 푸사리움 옥시스포럼의 균사 생장에 대한 억제 효과의 현미경사진이며; 그리고 7(d)는 79 kDa 세포내 단백질의 푸사리움 옥시스포럼의 균사 생장에 대한 억제 효과의 현미경사진이고;
도 8(a)는 대조군 처리에서 푸사리움 그라미네아룸의 균사 생장의 현미경사진이고; 8(b)는 대조군 처리 플러스 완충액에서 푸사리움 그라미네아룸의 균사 생장의 현미경사진이고; 8(c)는 50 kDa 세포내 단백질의 푸사리움 그라미네아룸의 균사 생장에 대한 억제 효과의 현미경사진이며; 그리고 8(d)는 79 kDa 세포내 단백질의 푸사리움 그라미네아룸의 균사 생장에 대한 억제 효과의 현미경사진이고;
도 9(a)는 79 kDa 세포외 단백질 (EC1)에 의한 푸사리움 옥시스포럼의 균사 과성장의 억제를 대조군 처리 (c)에 비교하여 보여주는 현미경사진이고, 9(b)는 50 kDa 세포외 단백질 (EC2) 및 36 kDa 세포외 단백질 (EC3)에 의한 푸사리움 옥시스포럼의 균사 과성장의 억제를 보여주는 현미경사진이고;
도 10(a)는 79 kDa 세포외 단백질 (EC1)에 의한 푸사리움 그라미네아룸의 균사 과성장의 억제를 대조군 처리 (c)에 비교하여 보여주는 현미경사진이고, 10(b)는 50 kDa 세포외 단백질 (EC2) 및 36 kDa 세포외 단백질 (EC3)에 의한 푸사리움 그라미네아룸의 균사 과성장의 억제를 보여주는 현미경사진이고;
도 11(a)는 13 kDa 세포외 단백질 (EC4)에 의한 푸사리움 그라미네아룸의 균사 과성장의 억제를 대조군 처리 (c)에 비교하여 보여주는 현미경사진이고, 11(b)는 13 kDa 세포외 단백질 (EC4)에 의한 푸사리움 옥시스포럼의 균사 과성장의 억제를 대조군 처리 (c)에 비교하여 보여주는 현미경사진이고;
도 12(a) 및 12(b)는 스페로데스 마이코파라시티카 세포외 단백질 분획 EC1, EC2, EC3 및 EC4의 푸사리움 옥시스포럼 포자 12(a) 및 푸사리움 그라미네아룸 포자 12(b)의 발아에 대한 효과를 보여주는 차트이고;
도 13은 스페로데스 마이코파라시티카 세포외 단백질 분획 EC1, EC2, EC3 및 EC4의 푸사리움 옥시스포럼 및 푸사리움 그라미네아룸의 콜로니 생장 및 발달 억제에 대한 효과를 보여주는 차트이고;
도 14A(c), 14A(a), 14A(b)는 대조군 푸사리움 옥시스포럼 포자의 발아 (c), 푸사리움 옥시스포럼 포자의 발아에 대한 50 kDa 단백질의 억제 효과 (a), 및 13 kDa 단백질의 억제 효과를 보여주는 현미경사진이고, 도 14B(c), 14B(a), 14B(b)는 대조군 푸사리움 그라미네아룸 포자의 발아 (c), 푸사리움 그라미네아룸 포자의 발아에 대한 50 kDa 단백질의 억제 효과 (a), 및 13 kDa 단백질의 억제 효과를 보여주는 현미경사진이고;
도 15(a) 및 15(b)는 대조군 (15(a))와 비교하여 결정 형성 세포외 단백질 EC1 및 EC3의 푸사리움 아베나시움의 균사 생장에 대한 효과 (15(b))를 보여주는 현미경사진이고;
도 16(a) 및 16(c)는 대조군 (16(a))과 비교하여 결정 형성 세포외 단백질 EC1 및 EC3의 발아 밀 종자의 콜로니화 및 푸사리움 그라미네아룸의 균사 생장에 대한 효과 (16(b))를 보여주는 현미경사진이며, 16 (c)는 세포외 단백질로 처리된 밀 묘의 표면으로부터 분해된 수많은 푸사리움 그라미네아룸 균사 성분 (화살표 참조)을 보여주는 공초점 레이져 주사 현미경 현미경사진이다. "K+"는 배지가 EC1 및 EC3 세포외 단백질을 함유하였음을 가리킨다. "K-"는 EC1 및 EC3 세포외 단백질이 배지에 없었던 것을 나타낸다. "K-결정"은 세포외 단백질 분자(들)의 위치를 확인해주고;
도 17(a) 및 17(b)는 대조군 (17(a))과 비교하여 결정 형성 세포외 단백질 EC1 및 EC3의 푸사리움 그라미네아룸의 균사 생장에 대한 효과 (17(b))를 보여주는 현미경사진이고;
도 18(a)는 도 17(b)로부터의 결정 단백질 처리된 푸사리움 그라미네아룸으로부터의 분해된 진균 균사 및 단백질 결정의 존재를 보여주는 주사 전자 현미경 현미경사진이고, 18(b)는 도 17(b)로부터의 결정 단백질 처리된 푸사리움 그라미네아룸의 균사 중 단백질 결정의 존재를 보여주는 공초점 레이져 주사 현미경 현미경사진이고, 18(c)는 도 17(b)로부터의 결정 단백질 처리된 푸사리움 그라미네아룸으로부터의 단백질 결정 및 수많은 파괴된 균사 성분 및 세포사멸 분해된 세포 (화살표)의 존재를 보여주는 화학력 현미경 현미경사진이다. "K 결정: 세포외 단백질 분자(들)의 위치를 확인해준다";
도 19는 79 kDa EC1 단백질을 포함하는 아미노산의 말디 토프 질량분석(MALDI-TOF-MS) 분리를 보여주는 차트이고;
도 20은 50 kDa EC2 단백질을 포함하는 아미노산의 말디 토프 질량분석 분리를 보여주는 차트이고;
도 21은 36 kDa EC3 단백질을 포함하는 아미노산의 말디 토프 질량분석 분리를 보여주는 차트이고;
도 22는 13 kDa EC3 단백질을 포함하는 아미노산의 말디 토프 질량분석 분리를 보여주는 차트이고;
도 23(a)-23(f)는 다음의 현미경사진이다: (23(a)) PDA상 스클레로티니아 스클레로티오룸의 대조군 무처리 배양물, (23(b)) 세포외 단백질 EC1 플러스 EC3로 수정한 PDA상에서 배양한 스클레로티니아 스클레로티오룸 배양물, (23(c)) 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)의 대조군 무처리 배양물, (23(d)) 세포외 단백질 EC1 플러스 EC3로 수정한 PDA상에서 배양한 리족토니아 솔라니 배양물, (23(e)) 피시움 울티멈의 대조군 무처리 배양물, 및 (23(f)) 세포외 단백질 EC1 플러스 EC3로 수정한 PDA상에서 배양한 피시움 울티멈 배양물; 그리고
도 24는 결정 형성 세포외 단백질 EC1 및 EC3의 스클레로티니아 스클레로티오룸, 리족토니아 솔라니 및 피시움 울티멈의 균사 생장에 대한 억제 효과를 보여주는 차트이다.Exemplary embodiments of the invention are described together with reference to the following figures, wherein:
1 (a) A and 1 (a) B show the mycelial growth of the Fusarium oxysporum (1 (a) A) and Fusarium Graminearum (1 (a) B) of exemplary proteins of the invention. A micrograph of a disk diffusion assay showing the inhibitory effect, FIG. 1 (b) shows the mycelial growth of Fusarium oxysporum (A) and Fusarium gramrealum (B) with exemplary proteins three and four days after growth. A chart showing% inhibition;
FIG. 2 is a micrograph of 10% native-PAGE (native-PAGE) separated into two bands of intracellular proteins produced by Spherodes mycoparasiticas;
FIG. 3 is a micrograph of 12% SDS-PAGE isolation of Spherodes mycoparasitica intracellular protein eluted from the upper and lower bands shown in the 10% natural-PAGE gel shown in FIG. 2;
FIG. 4 is a micrograph of 10% native-PAGE separated into four bands of extracellular protein produced by Spherodes mycoparasiticas;
FIG. 5 is a micrograph of 12% SDS-PAGE isolation of Spherodes mycoparasitica extracellular protein eluted from four bands of the 10% natural-PAGE gel shown in FIG. 4;
FIG. 6 is a chromatogram showing FLPC separation of four bands of extracellular protein produced by Spherodes mycoparasiticas;
Figure 7 (a) is a micrograph of mycelial growth of the Fusarium oxysporum in the control treatment; 7 (b) is a micrograph of the mycelial growth of the Fusarium oxysporum in control treatment plus buffer; 7 (c) is a micrograph of the inhibitory effect of 50 kDa intracellular protein on mycelial growth of the Fusarium oxysporum; And 7 (d) is a micrograph of the inhibitory effect of mycelial growth of the Fusarium oxysporum of 79 kDa intracellular protein;
FIG. 8 (a) is a micrograph of the mycelial growth of Fusarium Graminearum in control treatment; 8 (b) is a micrograph of the mycelial growth of Fusarium Graminearum in control treatment plus buffer; 8 (c) is a micrograph of the inhibitory effect of 50 kDa intracellular protein on mycelial growth of Fusarium gramrearum; And 8 (d) is a micrograph of the inhibitory effect on the mycelial growth of Fusarium gramrearum of 79 kDa intracellular protein;
FIG. 9 (a) is a micrograph showing the inhibition of mycelial overgrowth of Fusarium oxysporum by 79 kDa extracellular protein (EC1) compared to control treatment (c), 9 (b) showing 50 kDa extracellular protein (EC2) and 36 kDa extracellular protein (EC3) are micrographs showing the inhibition of mycelial overgrowth of Fusarium oxysporum;
FIG. 10 (a) is a micrograph showing the inhibition of mycelial overgrowth of Fusarium Graminearum by 79 kDa extracellular protein (EC1) compared to control treatment (c), 10 (b) showing 50 kDa extracellular protein (EC2) and 36 kDa extracellular protein (EC3) are micrographs showing the inhibition of mycelial overgrowth of Fusarium Graminearum;
FIG. 11 (a) is a micrograph showing the inhibition of mycelial overgrowth of Fusarium Graminearum by 13 kDa extracellular protein (EC4) compared to control treatment (c), and 11 (b) is 13 kDa extracellular protein Micrograph showing inhibition of mycelial overgrowth of Fusarium oxis forum by (EC4) compared to control treatment (c);
12 (a) and 12 (b) show Fusarium oxysporum spores 12 (a) and Fusarium gramrearum spores 12 (b) of the spherodes mycoparasitica extracellular protein fractions EC1, EC2, EC3 and EC4. A chart showing the effect on germination;
FIG. 13 is a chart showing the effects on colony growth and developmental inhibition of Fusarium oxysForum and Fusarium gramrearum of Spherodes mycoparasitika extracellular protein fractions EC1, EC2, EC3 and EC4;
14A (c), 14A (a), 14A (b) show germination of control Fusarium oxyspores spores (c), inhibitory effect of 50 kDa protein on germination of Fusarium oxyspores spores, and It is a micrograph showing the inhibitory effect of 13 kDa protein, Figure 14B (c), 14B (a), 14B (b) is the germination of the control Fusarium Graminea spores (c), the germination of Fusarium Graminea spores Micrograph showing the inhibitory effect of 50 kDa protein on (a), and the inhibitory effect of 13 kDa protein;
15 (a) and 15 (b) are microscopes showing the effect (15 (b)) on the mycelial growth of Fusarium avenassium of crystal forming extracellular proteins EC1 and EC3 compared to control (15 (a)). Photo;
16 (a) and 16 (c) show the effect on colonization of germinated wheat seeds of the crystal forming extracellular proteins EC1 and EC3 and mycelial growth of Fusarium gramrealum compared to the control (16 (a)). (b)) is a micrograph showing 16 (c) is a confocal laser scanning micrograph showing the number of Fusarium Graminearum mycelium components (see arrow) degraded from the surface of wheat seedlings treated with extracellular proteins. "K +" indicates that the medium contained EC1 and EC3 extracellular proteins. "K-" indicates that the EC1 and EC3 extracellular proteins were not in the medium. "K-crystal" identifies the location of extracellular protein molecule (s);
17 (a) and 17 (b) are microscopes showing the effect (17 (b)) on the mycelial growth of the Fusarium Graminearum of the crystal forming extracellular proteins EC1 and EC3 compared to the control (17 (a)). Photo;
FIG. 18 (a) is a scanning electron micrograph showing the presence of degraded fungal hyphae and protein crystals from crystalline protein treated Fusarium Graminearum from FIG. 17 (b), FIG. 18 (b) shows FIG. Confocal laser scanning microscopy micrograph showing the presence of protein crystals in the mycelium of crystalline protein treated Fusarium gramrealum from b), 18 (c) is crystalline protein treated Fusarium gras from FIG. 17 (b) Chemistry microscopy micrograph showing protein crystals from Minnearum and the presence of numerous disrupted mycelial components and apoptosis lysed cells (arrows). "K determination: confirms the location of extracellular protein molecule (s)";
19 is a chart showing Malditope mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) separation of amino acids comprising 79 kDa EC1 protein;
20 is a chart showing Malditope mass spectrometry separation of amino acids comprising 50 kDa EC2 protein;
FIG. 21 is a chart showing Malditope mass spectrometry separation of amino acids comprising 36 kDa EC3 protein; FIG.
FIG. 22 is a chart showing Malditope mass spectrometry separation of amino acids comprising 13 kDa EC3 protein; FIG.
23 (a) -23 (f) are the following micrographs: (23 (a)) control untreated culture of sclerotenia sclerotirum on PDA, (23 (b)) extracellular protein Sclerotinia sclerothiolum cultures cultured on PDA modified with EC1 plus EC3, (23 (c)) control untreated culture of Rhizoctonia solani , (23 (d)) cells Lithuanian Solani cultures cultured on PDA modified with exogenous protein EC1 plus EC3, (23 (e)) control untreated culture of Pisium Ultimum, and (23 (f)) extracellular protein EC1 plus EC3 Fish cultures cultured on modified PDA; And
FIG. 24 is a chart showing the inhibitory effect of the crystal forming extracellular proteins EC1 and EC3 on the mycelial growth of sclerotinia sclerothiorum, lizartonia solani and fishium Ultimum.
스페로데스 마이코파라시티카 (자낭균류, 멜라노스포랄레스(Melanosporales))는 밀 또는 아스파라거스 밭에서 유래하는 푸사리움 아베나시움, 푸사리움 그라미네아룸 및 푸사리움 옥시스포럼의 분리물로부터 분리되어 온 균기생균이다. 이 종은 자낭포자 크기, 모양 (방추상 및 세모) 및 벽 무늬 (망상 및 매끈함)의 독특한 조합을 특징으로 한다. 또한, 자실체 자낭벽의 표면상, 균사를 둘러싸는 자실체상, 그리고 균사로부터 발생하는 불규칙하게 분지된 분생자 자루상의 단순 피아리드(phialide)로부터 분생자가 생산된다. 스페로데스 마이코파라시티카는 피아리드 무성생식을 가지며 자실체 자낭벽의 표면상 또는 균사를 둘러싸는 자실체상으로 불규칙하게 분산되어 있는, 그리고 분생자 자루 상에 단순 피아리드를 생산한다. 스페로데스 마이코파라시티카는 푸사리움의 살아있는 균사에 기생하는 갈고리 유사 구조를 형성한다.Spherodes Mycoparasitika (Saculobacterium, Melanosporales) has been isolated from isolates of Fusarium Avenacium, Fusarium Graminearum and Fusarium Oxysis Forum from wheat or asparagus fields. It is a fungus. This species is characterized by a unique combination of follicle size, shape (like fusiform and triangular) and wall pattern (reticulated and smooth). In addition, conidia are produced from simple pyaridides on the surface of the fruiting body wall of the fruiting fruit, on the fruiting body surrounding the hyphae, and on irregularly branched conidia stalks resulting from the hyphae. Spherodes mycoparasiticas have a piad asexual reproduction and produce simple piads on the surface of the fruiting fruit pericardium wall or irregularly distributed on the fruiting body surrounding the mycelia. Spherodes mycoparasitica forms a hook-like structure that parasitic to the living mycelium of Fusarium.
스페로데스 마이코파라시티카의 샘플 배양물을 기탁 번호 IDAC301008-01로 캐나다 국제 기탁기관 (R3E 3R2 캐나다 위니펙 알링턴 스트리트 1015)에 기탁하였다. 푸사리움 아베나시움 (완전세대형: 지베렐라 아베나시아(Giberella avenacea))에 기생영양적으로 기생하는 스페로데스 마이코파라시티카의 샘플 배양물을 기탁번호 IDAC301008-02로 캐나다 국제 기탁기관에 기탁하였고 본원에서 "SM-Bst"라고 언급한다. 푸사리움 그라미네아룸 (완전세대형: 지베렐라 제아(Giberella zeae))에 기생영양적으로 기생하는 스페로데스 마이코파라시티카의 샘플 배양물을 기탁번호 IDAC301008-03으로 캐나다 국제 기탁기관에 기탁하였으며 본원에서 "SM-Gst"라고 언급한다.Sample cultures of Spherodes mycoparasitica were deposited with the Canadian International Depository (R3E 3R2 Winnipeg Arlington Street 1015, Canada) under Accession No. IDAC301008-01. Fusarium Avenacium (Full Generation: Giberella Avenasia) A sample culture of S. ferodes mycoparasitias parasiticly parasitic to avenacea )) was deposited with the Canadian International Depositary under accession number IDAC301008-02 and is referred to herein as "SM-Bst". Fusarium Graminea Room (Full Generation: Giberella A sample culture of S. ferodes mycoparasitica parasitually parasitic to zeae )) was deposited with the Canadian International Depositary under accession number IDAC301008-03 and is referred to herein as "SM-Gst".
스페로데스 마이코파라시티카의 대형 서브유닛 리보솜 RNA 유전자 (LSU)로부터의 1266 bp DNA 서열이 서열 1에 주어진다.The 1266 bp DNA sequence from the large subunit ribosomal RNA gene (LSU) of Spherodes mycoparasitika is given in SEQ ID NO: 1.
스페로데스 마이코파라시티카의 소형 서브유닛 리보솜 RNA 유전자 (SSU)로부터의 1233 bp DNA 서열이 서열 2에 주어진다.The 1233 bp DNA sequence from the small subunit ribosomal RNA gene (SSU) of Spherodes mycoparasitika is given in SEQ ID NO: 2.
본원에 개시된 스페로데스 마이코파라시티카에 의해 생산되는 신규의 단백질은 항진균제로서 유용하다. 이러한 신규의 단백질은 푸사리움 진균의 감염을 치료, 완화 또는 다르게는 방제하기 위해 사용될 수 있다. 스페로데스 마이코파라시티카에 의해 생산되는 이러한 신규의 단백질은 특히 푸사리움 아베나시움, 푸사리움 그라미네아룸, 및/또는 푸사리움 옥시스포럼의 감염을 치료, 완화 또는 다르게는 방제하고 식물 건강 또는 생장을 개선하는 데 유용하다.The novel proteins produced by the spherodes mycoparasitica disclosed herein are useful as antifungal agents. Such novel proteins can be used to treat, alleviate or otherwise control infection of Fusarium fungi. These novel proteins produced by Spherodes Mycoparasitika particularly treat, alleviate or otherwise control infections of Fusarium avenasis, Fusarium gramrealum, and / or Fusarium oxysis forums and It is useful for improving growth.
본원에 개시된 신규의 스페로데스 마이코파라시티카 단백질은 진균 감염, 특히 푸사리움 감염이 발생하는 가능성을 낮추는 예방제로서 사용될 수 있다.The novel Spherodes mycoparasitica protein disclosed herein can be used as a preventive agent to lower the likelihood of developing fungal infections, in particular Fusarium infections.
본원에 개시된 신규의 스페로데스 마이코파라시티카 단백질은 푸사리움 시들음병 또는 푸사리움 상부 마름병이 발병한 식물을 치료하는 데 사용될 수 있다. 이들 단백질은 이러한 상태가 확산되는 것을 막거나 다르게는 이러한 상태가 발생하는 위험성을 줄이는 예방 수단으로서 사용될 수 있다.The novel Spherodes mycoparasitica protein disclosed herein can be used to treat plants that have developed Fusarium wilting or Fusarium upper blight. These proteins can be used as a preventive measure to prevent the spread of these conditions or otherwise reduce the risk of developing them.
본원에 개시된 신규의 스페로데스 마이코파라시티카 단백질은 푸사리움 진균의 감염을 치료, 완화 또는 다르게는 방제하기 위해 사용될 수 있다. 단백질은 치료가 필요한 유기체에 임의의 적절한 방식으로 적용될 수 있다. 예를 들어, 단백질은 직접 사용될 수 있고 또는 다르게는 이들이 토양 시스템 또는 흙을 사용하지 않는 생장 시스템에 적용 (예를 들어, 알갱이 조성물, 토탄계 조성물), 종자에 적용 (예를 들어, 분말 조성물, 알갱이 조성물, 토탄계 조성물, 액상 조성물) 또는 생장하는 식물에 적용 (예를 들어, 분말 조성물, 액상계 조성물)을 위한 접종제로 추가 가공될 수 있다.The novel spherodes mycoparasitica proteins disclosed herein can be used to treat, alleviate or otherwise control infections of Fusarium fungi. The protein can be applied in any suitable way to the organism in need of treatment. For example, proteins can be used directly or alternatively they are applied to soil systems or to growth systems that do not use soil (eg, granulated compositions, peat-based compositions), to seeds (eg, powder compositions, Granule compositions, peat-based compositions, liquid compositions) or inoculum for application to growing plants (eg, powder compositions, liquid compositions).
본원에 개시된 제제는 (i) 하나 이상의 신규의 단백질을 포함하는 하나 이상의 유효 성분, (ii) 하나 이상의 캐리어 - 종종 빽빽하게 들어있는 유효 성분을 지탱하고 표적으로 전달하기 위해 사용되는 불활성 물질, 및 경우에 따라 (iii) 하나 이상의 아쥬반트 - 자외선으로부터의 보호에 의해 유효 성분의 기능을 촉진하고 유지하고 표적상 내우성을 보장하고 수분을 보유하거나 건조로부터 보호하며 그리고/또는 문헌[Hynes and Boyetchko (2006, Research initiatives in the art and science of biopesticide formulations. Soil Biol. & Biochem. 38: 845-49)]에 의해 개시된 것과 같은 표준 농업 장비를 이용하여 유기물 살충제의 확산 및 분산을 촉진하는 화합물을 포함한다.The formulations disclosed herein comprise (i) at least one active ingredient comprising at least one novel protein, (ii) at least one carrier—an inert material used to support and deliver to the target ingredient which is often densely packed, and According to (iii) at least one adjuvant—promoting and maintaining the function of the active ingredient by ensuring protection from ultraviolet rays, ensuring targeted rain resistance, retaining moisture or protecting it from drying and / or described in Hynes and Boyetchko (2006, Research initiatives in the art and science of biopesticide formulations . Soil Biol. & Biochem. 38: 845-49) using the standard agricultural equipment such as that disclosed by the include compounds to promote the diffusion and dispersion of the organic insecticide.
스페로데스 마이코파라시티카로부터의 내부 전사 스페이서 리보솜 DNA를 서열분석하였다. ITS 영역으로부터의 560 bp DNA 서열이 서열 3에 주어진다.Internal transcription spacer ribosomal DNA from Spherodes mycoparasitika was sequenced. The 560 bp DNA sequence from the ITS region is given in SEQ ID NO: 3.
스페로데스 마이코파라시티카로부터의 총 세포내 단백질 추출물 및 세포외 단백질 추출물은 푸사리움종, 스클레로티니아종, 리족토니아종, 및 피시움종의 진균 포자 발아의 유의미한 억제를 입증한다. 약 79 kDa의 분자량을 갖고 서열 4를 포함하는 것, 약 50 kDa의 분자량을 갖고 서열 5를 포함하는 다른 것, 약 36 kDa의 분자량을 갖고 서열 6을 포함하는 다른 것, 그리고 네 번째가 약 13 kDa의 분자량을 갖고 서열 7을 포함하는, 살진균 효과를 갖는 신규의 네 단백질이 총 단백질 추출물로부터 단리되었다. 본 발명은 하나 이상의 이들 단백질을 포함하는 항진균제를 제공한다.Total intracellular protein extracts and extracellular protein extracts from Spherodes mycoparasitica demonstrate significant inhibition of fungal spore germination of Fusarium species, Sclerotinia species, Lizatonia species, and Pisium species. Having a molecular weight of about 79 kDa and comprising SEQ ID NO: 4, another having a molecular weight of about 50 kDa and comprising SEQ ID NO: 5, another having a molecular weight of about 36 kDa and comprising SEQ ID NO: 6, and the fourth is about 13 Four novel proteins with fungicidal effect, having a molecular weight of kDa and comprising SEQ ID NO: 7, were isolated from total protein extracts. The present invention provides antifungal agents comprising one or more of these proteins.
종래의 분자 생물학적 기술이 각각의 신규의 네 단백질을 단리, 특성화 및 생산하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 단백질에 대한 유전자(들)을 확인하기 위해 스페로데스 마이코파라시티카는 표준 노던 블럿에 의해 단리된 상향조절된 mRNA 및 푸사리움 옥시스포럼 여액을 투여할 수 있다. 역전사효소 PCR (RT-PCR)에 의해 mRNA로부터 cDNA가 생산될 수 있다. cDNA는 증폭되고, 정제되고 적합한 벡터로 삽입될 수 있다. 이 벡터는 적합한 숙주 세포로 삽입될 수 있다.Conventional molecular biological techniques can be used to isolate, characterize and produce each of the four new proteins. For example, to identify the gene (s) for the present protein, Spherodes mycoparasiticas can be administered upregulated mRNA and Fusarium oxisforum filtrate isolated by standard Northern blots. CDNA can be produced from mRNA by reverse transcriptase PCR (RT-PCR). cDNA can be amplified, purified and inserted into a suitable vector. This vector can be inserted into a suitable host cell.
클로닝과 발현은 확인된 단백질에 대한 프라이머를 고안함으로써 이러한 신규의 항균 단백질을 코딩하는 유전자의 단리에 초점을 맞출 수 있다. 단리된 유전자는 관련된 단백질의 대규모 생산을 위한 산업적 균주를 발생시키기 위해 적절한/효과적인 프로모터로 적절한 발현 백터 (효모 또는 박테리아)에서 클로닝될 수 있다. 이러한 벡터는 프로메가(Promega), 인비트로겐(Invitrogen), 클론테크(Clontech) 또는 다른 회사로부터 구입할 수 있다. 클로닝된 유전자를 그 단백질 발현에 대하여 시험할 수 있고 발현된 단백질을 (His-태그 또는 다른 컬럼을 이용하여) 정제할 것이다. 정제 단백질은 문헌[Drummond et al. (2000, The development of microbiological methods for phytochemical screening. Rec. Res. Dev. Phytochem. 4:143-152)]에 의해 개시된 마이크로타이터 플레이트 분석 방법 및/또는 디스크 플레이트 분석법으로 예시되는 방법을 이용하여 식물 병원성 진균에 대한 그 항진균 활성에 대해 시험할 수 있다. 그 후, 단백질의 생산을 증가시키기 위해 유전자 돌연변이 또는 인핸서, 인트론 또는 단백질 특이적 프로모터 (GA 유도성)의 첨가 또는 첨가 결실을 포함하는 rDNA 기술을 사용할 수 있다.Cloning and expression can focus on the isolation of genes encoding these novel antimicrobial proteins by designing primers for the identified proteins. Isolated genes can be cloned in appropriate expression vectors (yeast or bacteria) with suitable / effective promoters to generate industrial strains for large scale production of related proteins. Such vectors can be purchased from Promega, Invitrogen, Clontech or other companies. The cloned gene can be tested for its protein expression and the expressed protein will be purified (using His-tag or other column). Purified proteins are described in Drummond et al. (2000, The development of microbiological methods for phytochemical screening . Rec. Res. Dev. Phytochem. 4: 143 - 152) using a microtiter plate assay and / or methods which are illustrated in the disc plate assay disclosed by may be tested for its antifungal activity against phytopathogenic fungi. Thereafter, rDNA techniques can be used that include the addition or deletion of gene mutations or enhancers, introns or protein specific promoters (GA inducible) to increase protein production.
하나 이상 또는 모든 신규의 단백질, 즉, 13 kDa 단백질, 36 kDa 단백질, 50 kDa 단백질, 및 79 kDa 단백질을 코딩하는 선택된 유전자는 문헌[Sanghyun et.al. (2008, Transgenic wheat expressing a barley class II chitinase gene has enhanced resistance against Fusarium graminearum . J. Expt. Botany, 59, 2371-2378)] 및 문헌[Tobias et. al. (2007, Co - bombardment , integration and expression of rice chitinase and thaumatin - like protein genes in barley ( Hordeum vulgare cv . Conlon ). Plant Cell Reports 26: 631-639)]으로 예시되는 것과 같은 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 기술을 사용하여 병원성 진균에 대해 항진균 활성을 가진 형질전환주를 생성하기 위해 선택된 식물 게놈으로 형질전환될 수 있다. 이러한 신규의 단백질로의 형질전환에 적절한 농작물은 다른 것들 중 지방종자 작물, 곡물 작물, 두류 작물, 침엽수종 및 낙엽수종으로 예시된다. 예시적인 지방종자 작물은 다른 것들 중 캐놀라, 겨자, 평지씨, 대두, 아마, 해바라기, 홍화, 아주까리 및 카멜리나를 포함한다. 예시적인 곡물 작물은 다른 것들 중 밀, 보리, 귀리, 라이밀, 호밀, 쌀, 옥수수, 수수 및 퀴노아를 포함한다. 예시적인 두류 작물은 다른 것들 중 콩류, 완두콩, 병아리콩, 렌틸(lentil), 및 루핀(lupin)을 포함한다. 예시적인 침염수종은 다른 것들 중 소나무, 가문비나무, 전나무, 및 솔송나무를 포함한다. 예시적인 낙엽수종은 다른 것들 중 포플러, 사시나무, 단풍나무, 참나무, 견과 생산 나무, 과일 나무, 아카시아 및 유칼립투스를 포함한다.Selected genes encoding one or more or all new proteins, namely 13 kDa protein, 36 kDa protein, 50 kDa protein, and 79 kDa protein, are described in Sanghyun et.al. (2008, Transgenic wheat expressing a barley class II chitinase gene has enhanced resistance against Fusarium graminearum . J. Expt. Botany, 59, 2371 - 2378) ] and the method disclosed in [Tobias et. al. (2007, Co - bombardment , integration and expression of rice chitinase and thaumatin - like protein genes in barley ( Hordeum vulgare cv . Conlon ) . Plant Cell Reports 26: 631 - using known techniques to those skilled in the art, such as that illustrated by 639) for the pathogenic fungus transformed with the plant genome selected to produce a transformed cell with the antifungal activity Can be switched. Crops suitable for transformation with these novel proteins are exemplified by oilseed crops, grain crops, legume crops, coniferous species and deciduous species, among others. Exemplary oilseed crops include canola, mustard, rapeseed, soybean, flax, sunflower, safflower, castor and camellias, among others. Exemplary grain crops include wheat, barley, oats, rye wheat, rye, rice, corn, sorghum and quinoa, among others. Exemplary legume crops include legumes, peas, chickpeas, lentils, and lupins, among others. Exemplary salivary species include pine, spruce, fir, and cypress among others. Exemplary deciduous species include poplars, aspens, maples, oaks, nut producing trees, fruit trees, acacia and eucalyptus, among others.
본 발명은 스페로데스 마이코파라시티카에 의해 생산되는 하나 이상 또는 모든 79 kDa 단백질 (서열 4 포함), 50 kDa 단백질 (서열 5 포함), 36 kDa 단백질 (서열 6 포함), 및 13 kDa 단백질 (서열 7 포함)을 포함하는 항진균 조성물을 제공한다. 다르게는, 하나 이상 또는 모든 13 kDa 단백질, 36 kDa 단백질, 50 kDa 단백질, 및 79 kDa 단백질이 하나 이상 또는 모든 13 kDa 단백질, 36 kDa 단백질, 50 kDa 단백질, 및 79 kDa 단백질을 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자가 제공되는 형질전환된 미생물에 의해 생산될 수 있다. 본 발명은 식물의 진균성 질병의 방제 방법, 진균독소 해독 방법을 또한 제공하며 이 방법은 이후 본원에서 총칭하여 '항진균제'로 언급하는, 하나 이상 또는 모든 13 kDa 단백질, 36 kDa 단백질, 50 kDa 단백질, 및 79 kDa 단백질을 식물의 부위에 적용하는 것을 포함한다.One or more or all of the 79 kDa proteins (including SEQ ID NO: 4), 50 kDa protein (including SEQ ID NO: 5), 36 kDa protein (including SEQ ID NO: 6), and 13 kDa protein (SEQ ID NO: 6) produced by Spherodes Mycoparasitica It provides an antifungal composition comprising 7). Alternatively, one or more nucleic acids encoding one or more or all 13 kDa proteins, 36 kDa proteins, 50 kDa proteins, and 79 kDa proteins encoding one or more or all 13 kDa proteins, 36 kDa proteins, 50 kDa proteins, and 79 kDa proteins Molecules can be produced by the transformed microorganisms provided. The present invention also provides a method for controlling fungal diseases of plants, a method for detoxifying mycotoxins, which method is one or more or all 13 kDa proteins, 36 kDa proteins, 50 kDa proteins, hereafter collectively referred to herein as 'antifungal agents'. , And applying the 79 kDa protein to the site of the plant.
본 발명의 조성물은 예를 들어 식물의 종자 및/또는 식물을 생장시키는 데 사용되는 생장 배지 (예를 들어 토양 또는 물) 및/또는 식물의 뿌리 및/또는 식물의 잎, 또는 임의의 그 조합에 적용할 수 있다. 본 조성물로 처리할 수 있는 예시적인 농작물은 종자 작물, 곡물 작물, 두류 작물, 원예 작물, 임업 작물, 및 잔디풀과 같은 농작물을 포함한다.The compositions of the present invention may be used, for example, in seed and / or growth medium (eg, soil or water) and / or roots and / or leaves of plants, or any combination thereof, used to grow plants. Applicable Exemplary crops that can be treated with the present compositions include crops such as seed crops, grain crops, legume crops, horticultural crops, forestry crops, and turfgrass.
본 발명은 항진균제 및 하나 이상의 농업적으로 허용가능한 캐리어 및/또는 희석제를 포함하는 조성물을 제공하며 이것이 최종 산물의 안정성 및/또는 성능을 보증할 것이다. 적절한 캐리어는 다른 것들 중 카올리나이트, 벤토나이트 및 몬모리놀라이트(montmorinollite)로 예시되는 점토 분진, 토탄 알갱이, 토탄 분말, 탄소 가루, 셀룰로스 알갱이 및 톱밥, 질석, 펄라이트(perlite), 포미스(pomice), 메틸셀룰로스, 탈크로 예시되는 분진으로 예시된다. 적절한 희석제는 물로 그리고 알긴산염, 카라게닌, 아가, 카르복시메틸셀룰로스 등으로 예시되는 비점성 겔로 예시된다. 캐리어 또는 희석제는 유효 성분과 병용 가능, 농업적으로 허용가능해야 하고 양호한 흡수 능력을 가지며 적절한 부피 밀도를 가져 입자 분산 및 부착이 쉽게 해야한다.The present invention provides a composition comprising an antifungal agent and one or more agriculturally acceptable carriers and / or diluents which will ensure the stability and / or performance of the final product. Suitable carriers include clay dust, peat grains, peat powder, carbon powder, cellulose grains and sawdust, vermiculite, perlite, pomice, among others exemplified by kaolinite, bentonite and montmorinollite Methylcellulose, dust exemplified by talc. Suitable diluents are exemplified by water and by inviscid gels exemplified by alginate, carrageenan, agar, carboxymethylcellulose and the like. The carrier or diluent must be compatible with the active ingredient, agriculturally acceptable, have good absorption capacity and have an appropriate bulk density to facilitate particle dispersion and adhesion.
본원의 조성물은 당해 분야의 관습에 따라 수성 스프레이, 알갱이 및 가루 제제로 적용할 수 있다. 수성 스프레이는 대개 본 발명의 화합물의 유화성 농축물 제제 또는 수화 분말을 비교적 많은 양의 물과 혼합하여 분산체를 형성함으로써 제조된다.The compositions herein can be applied as aqueous sprays, granules and powder formulations according to customs in the art. Aqueous sprays are usually prepared by mixing an emulsifiable concentrate formulation or hydrating powder of a compound of the present invention with a relatively large amount of water to form a dispersion.
수화 분말은 항진균제, 고체 캐리어 및 표면 활성제의 미분 혼합물을 포함할 수 있다. 고체 캐리어는 대개 애터펄자이트(attapulgite) 점토, 카올린 점토, 몬모릴로나이트 점토, 규조토, 미분 실리카, 정제 실리케이트, 또는 그 조합으로부터 선택된다. 본원에서 유용할 수 있는 계면 활성제는 습윤, 투과 및/또는 분산 능력을 갖는다. 이들은 통상적으로 약 0.5 중량% 내지 약 10 중량%의 양으로 존재한다. 본원의 계면 활성제는 예를 들어, 알킬벤젠술포네이트, 알킬 술페이트, 나프탈렌술포네이트 및 응축된 나프탈렌술포네이트, 술폰화 리그닌 및 비이온성 계면 활성제로부터 선택될 수 있다.Hydrating powder may comprise a fine mixture of antifungal agents, solid carriers and surface active agents. The solid carrier is usually selected from attapulgite clays, kaolin clays, montmorillonite clays, diatomaceous earth, finely divided silica, purified silicates, or combinations thereof. Surfactants that may be useful herein have wetting, permeating and / or dispersing capabilities. They are typically present in amounts of about 0.5% to about 10% by weight. Surfactants herein can be selected from, for example, alkylbenzenesulfonates, alkyl sulfates, naphthalenesulfonates and condensed naphthalenesulfonates, sulfonated lignin and nonionic surfactants.
유화성 농축물은 액체 캐리어 내 본 발명의 항진균제를 포함할 수 있으며 캐리어는 수불혼화성 용매와 계면 활성제의 혼합물이다. 본원에서 유용할 수 있는 용매는 크실렌, 알킬나프탈렌과 같은 방향족 탄화수소 용매, 석유 증류물, 테르펜 용매, 에테르-알콜, 유기 에스테르 용매 또는 그 적절한 조합을 포함한다.Emulsifiable concentrates may comprise the antifungal agent of the invention in a liquid carrier and the carrier is a mixture of a water immiscible solvent and a surfactant. Solvents that may be useful herein include aromatic hydrocarbon solvents such as xylene, alkylnaphthalene, petroleum distillates, terpene solvents, ether-alcohols, organic ester solvents, or suitable combinations thereof.
본 발명의 조성물이 접종제 분산 및 오염원을 방제하기 위해 식물 부스러기 또는 쓰레기에, 또는 토양에 적용될 때 발아 전 보호에 관하여 알갱이 제제 또는 가루가 때때로 스프레이보다 더 편리하다.With respect to pre-germination protection, granule formulations or powders are sometimes more convenient than sprays when the compositions of the present invention are applied to plant debris or trash or to soil to control inoculant dispersion and contaminants.
한 실시태양에서 본원에 개시된 항진균제가 알긴산염 펠렛으로 캡슐화된다. 펠렛은 임의의 적절한 방식으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 유용한 한 가지 방법이 문헌[Harveson et. al. (2002, Novel Use of a Pyrenomycetous Mycoparasite for Management of Fusarium Wilt of Watermelon. Plant Disease 86(9): 1025-1030)]에 기술된다.In one embodiment the antifungal agent disclosed herein is encapsulated in alginate pellets. The pellet can be prepared in any suitable manner. For example, one useful method is Harveson et. al. (2002, Novel Use of a Pyrenomycetous Mycoparasite for Management of Fusarium Wilt of Watermelon . Plant Disease 86 (9): 1025 - 1030 are described).
본 조성물은 항진균제에 유용한 다른 활성 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원의 조성물은 트리코데르마(Trichoderma), 황, 님 오일, 로즈마리 오일, 호호바 오일, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 알릴아민 (예를 들어, 테르비나핀), 대사길항물질 (예를 들어, 플루시토신), 아졸 (예를 들어, 케토코나졸, 이트라코나졸), 에치노칸딘 (예를 들어, 카스포펀진), 폴리엔 (예를 들어, 암포테리신 B), 전신제 (예를 들어, 그리세오풀빈), 또는 그 조합과 같은 다른 항진균제를 포함할 수 있다.The composition may comprise other active substances useful for antifungal agents. For example, the composition of the present application may be Trichoderma , sulfur, nim oil, rosemary oil, jojoba oil, Bacillus subtilis ( Bacillus) subtilis ), allylamine (eg terbinafine), antimetabolites (eg flucitocin), azoles (eg ketoconazole, itraconazole), echinocandine (eg caspofungin) And other antifungal agents, such as polyenes (eg, amphotericin B), systemic agents (eg, griseofulvin), or combinations thereof.
본원의 조성물은 약 0.1 중량% 내지 약 95 중량%의 항진균제 및 약 0.1 중량% 내지 약 95 중량%의 캐리어 및/또는 계면 활성제를 함유할 수 있다. 심기 전에 식물 종자에 직접 적용하는 것이 일부 예에서 본 발명의 분말화된 고체 화합물 또는 가루 제제와 종자를 혼합함으로써 이루어져 매우 얇고 종자의 중량에 기초하여 단지 1 또는 2 중량 백분율 이하를 나타내는 실질적으로 균일한 코팅을 얻을 수 있다. 그러나 일부 예에서, 메탄올과 같은 식물 독성이 아닌 용매는 종자 표면에 본 발명의 화합물의 균일한 분포를 촉진하기 위해 캐리어로 편리하게 이용된다.The compositions herein may contain about 0.1% to about 95% by weight antifungal agent and about 0.1% to about 95% by weight carrier and / or surfactant. Direct application to plant seeds prior to planting is in some instances made by mixing the seeds with the powdered solid compounds or powder formulations of the invention, which is very thin and substantially uniform, representing only 1 or 2 weight percent or less based on the weight of the seed. A coating can be obtained. However, in some instances, non-phytotoxic solvents such as methanol are conveniently used as carriers to promote uniform distribution of the compounds of the present invention on the seed surface.
본원의 조성물은 식물 내 진균 감염의 치료에 유용할 수 있다. 결과적으로 본원의 조성물은 하나 이상 또는 모든 본원에 개시된 79 kDa 단백질 (서열 4 포함), 50 kDa 단백질 (서열 5 포함), 36 kDa 단백질 (서열 6 포함), 및 13 kDa 단백질 (서열 7 포함) 및 그에 대해 허용가능한 캐리어를 포함할 수 있다.The compositions herein may be useful for the treatment of fungal infections in plants. As a result, one or more or all of the disclosed herein 79 kDa protein (including SEQ ID NO: 4), 50 kDa protein (including SEQ ID NO: 5), 36 kDa protein (including SEQ ID NO: 6), and 13 kDa protein (including SEQ ID NO: 7), and May include an acceptable carrier therefor.
본 발명은 하나 이상 또는 모든 스페로데스 마이코파라시티카 13 kDa 단백질, 36 kDa 단백질, 50 kDa 단백질 및 79 kDa 단백질을 포함하는 항진균 조성물을 생산하는 예시적인 방법에 관한 것이다. 본 방법은 다음을 포함한다:The present invention is directed to an exemplary method for producing an antifungal composition comprising one or more or all of the Spherodes mycoparasitika 13 kDa protein, 36 kDa protein, 50 kDa protein and 79 kDa protein. The method includes:
(a) 스페로데스 마이코파라시티카 포자의 포자 형성 유도;(a) induction of spore formation of the spherodes mycoparasitica spores;
(b) 스페로데스 마이코파라시티카 배양;(b) spherodes mycoparasitica culture;
(c) 스페로데스 마이코파라시티카 배양물로부터 단백질 회수;(c) protein recovery from Spherodes mycoparasitica culture;
(d) 회수한 스페로데스 마이코파라시티카 단백질로부터 하나 이상 또는 모든 13 kDa 단백질, 36 kDa 단백질, 50 kDa 단백질 및 79 kDa 단백질 분리 및 회수; 및(d) isolating and recovering one or more or all 13 kDa protein, 36 kDa protein, 50 kDa protein and 79 kDa protein from the recovered Spherodes mycoparasitica protein; And
(e) 스페로데스 마이코파라시티카 단백질로부터 회수한 하나 이상 또는 모든 13 kDa 단백질, 36 kDa 단백질, 50 kDa 단백질 및 79 kDa 단백질을 포함하는 조성물 제조.(e) Preparation of a composition comprising at least one or all 13 kDa protein, 36 kDa protein, 50 kDa protein and 79 kDa protein recovered from Spherodes mycoparasitica protein.
79 kDa 단백질 (서열 4 포함), 50 kDa 단백질 (서열 5 포함), 36 kDa 단백질 (서열 6 포함) 및 13 kDa 단백질 (서열 7 포함)이 회수된 스페로데스 마이코파라시티카 단백질로부터 함께 분리되고 회수될 수 있다. 다르게는, 13 kDa 단백질 및/또는 36 kDa 단백질 및/또는 50 kDa 단백질 및/또는 79 kDa 단백질 또는 임의의 그 조합이 회수된 스페로데스 마이코파라시티카 단백질로부터 각각 회수될 수 있다.79 kDa protein (including SEQ ID NO: 4), 50 kDa protein (including SEQ ID NO: 5), 36 kDa protein (including SEQ ID NO: 6) and 13 kDa protein (including SEQ ID NO: 7) were separated and recovered together from the recovered spherodes mycoparasitika protein. Can be. Alternatively, 13 kDa protein and / or 36 kDa protein and / or 50 kDa protein and / or 79 kDa protein or any combination thereof may be recovered from the recovered spherodes mycoparasitika protein, respectively.
본 발명은 하나 이상 또는 모든 스페로데스 마이코파라시티카 79 kDa 단백질 (서열 4 포함), 50 kDa 단백질 (서열 5 포함), 36 kDa 단백질 (서열 6 포함) 및 13 kDa 단백질 (서열 7 포함)을 포함하는 항진균 조성물을 생산하는 다른 예시적인 방법에 관한 것이다. 본 방법은 다음을 포함한다:The present invention includes one or more or all of the spherodes mycoparasiticas including 79 kDa protein (including SEQ ID NO: 4), 50 kDa protein (including SEQ ID NO: 5), 36 kDa protein (including SEQ ID NO: 6) and 13 kDa protein (including SEQ ID NO: 7). It relates to another exemplary method for producing an antifungal composition. The method includes:
(f) 스페로데스 마이코파라시티카에 의해 생산되는 하나 이상 또는 모든 13 kDa 단백질, 36 kDa 단백질, 50 kDa 단백질, 및 79 kDa 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자로 선택된 미생물 배양물 형질전환;(f) microbial culture transformation selected with one or more genes encoding one or more or all 13 kDa protein, 36 kDa protein, 50 kDa protein, and 79 kDa protein produced by Spherodes mycoparasiticas;
(g) 형질전환된 미생물 배양물 배양;(g) culture of transformed microbial culture;
(h) 형질전환된 배양물로부터 단백질 회수;(h) protein recovery from the transformed culture;
(i) 회수된 단백질로부터 13 kDa 단백질 및/또는 36 kDa 단백질 및/또는 50 kDa 단백질 및/또는 79 kDa 단백질 분리 및 회수;(i) isolation and recovery of 13 kDa protein and / or 36 kDa protein and / or 50 kDa protein and / or 79 kDa protein from the recovered protein;
(j) 하나 이상 또는 모든 13 kDa 단백질, 36 kDa 단백질, 50 kDa 단백질 및 79 kDa 단백질을 포함하는 조성물 제조.(j) Preparation of a composition comprising at least one or all 13 kDa protein, 36 kDa protein, 50 kDa protein and 79 kDa protein.
13 kDa 단백질 및/또는 36 kDa 단백질 및/또는 50 kDa 단백질 및/또는 79 kDa 단백질이 회수된 단백질로부터 함께 분리되고 회수될 수 있다. 다르게는, 13 kDa 단백질 및/또는 36 kDa 단백질 및/또는 50 kDa 단백질 및/또는 79 kDa 단백질이 회수된 단백질로부터 각각 회수될 수 있다. 스페로데스 마이코파라시티카에 의해 생산되는 하나 이상 또는 모든 13 kDa 단백질, 36 kDa 단백질, 50 kDa 단백질 및 79 kDa 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자로 형질전환될 수 있는 적절한 미생물 배양물은 에쉐리히아 콜라이(Escherichia coli), 슈도모나스종(Pseudomonas spp.), 바실러스종(Bacillus spp.) 등과 같은 박테리아 배양물, 자이고사카로마이세스종(Zygosaccharomyces spp), 사카로마이세스종(Saccharomyces spp), 피키아종(Pichia spp.), 클루베로마이세스종(Kluveromyces spp.) 등과 같은 효모 배양물, 및 페니실리움종(Penicillium spp.) 등으로 예시된다.13 kDa protein and / or 36 kDa protein and / or 50 kDa protein and / or 79 kDa protein can be separated and recovered together from the recovered protein. Alternatively, 13 kDa protein and / or 36 kDa protein and / or 50 kDa protein and / or 79 kDa protein may be recovered from the recovered protein, respectively. Suitable microbial cultures capable of being transformed with one or more genes encoding one or more or all 13 kDa protein, 36 kDa protein, 50 kDa protein and 79 kDa protein produced by Spherodes Mycoparasitika are Escherichia coli ( Escherichia coli ), Pseudomonas spp.), Bacillus spp . Bacterial cultures, such as Zygosaccharomyces spp), Saccharomyces spp), Pichia species spp . ), Kluveromyces yeast cultures such as spp.), and Penicillium spp. spp.) and the like.
실시예Example
실시예Example 1: One: 스페로데스Spherodes 마이코파라시티카로부터의From mycopara city car 세포내Intracellular 및 And 세포외Extracellular 단백질 생산 및 추출 Protein Production and Extraction
스페로데스 마이코파라시티카 균주 IDAC 301008-02 및/또는 IDAC 301008-03이 본원에 개시된 모든 연구에서 사용되었으며 전체에 걸쳐 각각 "SM-Bst" 및 "SMGst"로 칭한다. SM-Bst와 SM-Gst의 원배양물을 제조하였고 감자 덱스트로스 브로스 (PDB) 배양 배지에서 21 ℃로 유지하였다. 원배양물의 각각의 유형으로부터 세포내 및 세포외 단백질을 제조하기 위하여 PDB 배양물로부터 50 ml PDB 생장 배지를 함유하는 250-ml 에를렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크로 약 3 ml를 옮겼다. 플라스크를 실온으로 회전식 진탕기 (150 rpm) 상에서 7일 동안 인큐베이션하였다. 어린 균사를 왓맨(Whatman)® No.1 여과지를 통해 여과하였다 (왓맨은 영국 켄트의 왓맨 인터내셔널 리미티드(Whatman International Ltd.)의 등록상표이다). 왓맨® No.1 여과지 상에 수집된 균사를 세포내 단백질의 추출에 사용한 반면, 여과된 배양 배지는 그로부터의 세포외 단백질의 회수에 사용하였다.Spherodes mycoparasitica strains IDAC 301008-02 and / or IDAC 301008-03 have been used in all studies disclosed herein and are referred to collectively as "SM-Bst" and "SMGst", respectively. Raw cultures of SM-Bst and SM-Gst were prepared and maintained at 21 ° C. in potato dextrose broth (PDB) culture medium. About 3 ml were transferred from PDB culture to a 250-ml Erlenmeyer flask containing 50 ml PDB growth medium to prepare intracellular and extracellular proteins from each type of original culture. The flask was incubated for 7 days on a rotary shaker (150 rpm) at room temperature. The young mycelium was filtered through watmaen (Whatman) ® No.1 filter paper (watmaen is a registered trademark of watmaen International Limited (Whatman International Ltd.) of England, Kent). In contrast with the mycelia collected on watmaen ® No.1 filter paper for extraction of the protein in the cell, the filtered culture medium was used for the recovery of the protein outside of the cell therefrom.
실시예Example 2: 2: 스페로데스Spherodes 마이코파라시티카로부터의From mycopara city car 세포내Intracellular 단백질 및 Protein and 세포외Extracellular 단백질의 Protein 분획화Fractionation , 분리 및 정제, Separation and purification
세포내 단백질 추출 : 세포내 단백질을 문헌[Chen et al. (2004, Heat shock proteins of thermophilic and thermotolerant fungi from Taiwan. Bot. Bull. Acad. Sin. 45: 247-257)]에 개시된 방법에 따라 추출하였다. 각 샘플로부터 총 200 mg의 진균 균사를 막자를 이용하여 멸균 자기 유발에서 액상 질소 내 분말화하였고 1.5 ml 냉각한 추출 완충액과 혼합하였다. 균사 (~200 mg)를 50 mM 트리스-HCl (pH 8.5); 2 % 나트륨 도데실 술페이트 (SDS); 2 % β-메르캅토에탄올; 1 mM 페닐메틸술포닐 플루오리드 (95 % 알코올 내 PMSF)로 이루어진 완충액 1 mL를 함유하는 분쇄 튜브에서 초음파처리에 의해 분쇄하였다. 균질액을 10분 동안 28 ℃에서 12,000 rpm으로 원심분리하였고 상청액을 수집하였다. 냉 아세톤 (-20 ℃)의 4 부피를 가하였고 샘플을 밤새 -20 ℃에서 동결하였다. 침전물 (단백질)을 아세톤에 저장하였고 5분 동안 28 ℃에서 12000 rpm으로 원심분리하였으며 최종적으로 샘플 완충액 (62.5 mM 트리스-HCl (pH 6.8); 3 % SDS; 10 % 글리세롤; 5 % β-메르캅토에탄올)의 50-100 ㎕에 용해하였다. 단백질 샘플을 새로운 1.5 ml 에펜도르프 튜브에 옮겼고 추가 연구를 위해 사용할 때까지 - 80 ℃에서 저장하였다. Intracellular Protein Extraction : Intracellular proteins are described in Chen et al. (2004, Heat shock proteins of thermophilic and thermotolerant fungi from Taiwan . Bot. Bull. Acad. Sin. 45: 247-257). A total of 200 mg fungal mycelium from each sample was powdered in liquid nitrogen in sterile magnetophoresis using a pestle and mixed with 1.5 ml cooled extraction buffer. Mycelium (~ 200 mg) was added to 50 mM Tris-HCl (pH 8.5); 2% sodium dodecyl sulfate (SDS); 2% β-mercaptoethanol; Grinding by sonication in a grinding tube containing 1 mL of buffer consisting of 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF in 95% alcohol). The homogenate was centrifuged at 12,000 rpm at 28 ° C. for 10 minutes and the supernatant was collected. Four volumes of cold acetone (-20 ° C.) were added and samples were frozen overnight at −20 ° C. The precipitate (protein) was stored in acetone and centrifuged for 5 minutes at 12000 rpm at 28 ° C. and finally sample buffer (62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8); 3% SDS; 10% glycerol; 5% β-mercapto Ethanol) in 50-100 μl. Protein samples were transferred to new 1.5 ml Eppendorf tubes and stored at −80 ° C. until used for further study.
세포외 단백질 추출 : 여과된 배양 배지를 세포외 단백질의 공급원으로 사용하였으며 3000-달톤 컷오프 멤브레인으로 아미콘(Amicon)® 한외여과 원심분리 튜브로 4 ℃에서 4000 rpm으로 원심분리함으로써 농축하였다 (아미콘은 미국 메사추세츠주 빌레리카 밀리포어 코포레이션(Millipore Corp.)의 등록 상표이다). 디스크 확산 분석법을 이용하여 총 세포외 단백질을 진균 병원균, 푸사리움 옥시스포럼 및 푸사리움 그라미네아룸에 대한 항진균 활성에 대하여 시험하였다. 총 세포외 단백질의 항진균 활성을 문헌[Roberts and Selitrennikoff (1986, Isolation and partial characterization of two antifungal proteins from barley. Biochim. Biophys. Acta, 880: 161-170)]에 의해 기술된 바를 일부 변형하여 래디얼 디스크 플레이트 확산 분석법(radial disc plate diffusion assay)에 의한 멸균 조건 하에서 시험하였다. 푸사리움 옥시스포럼 및 푸사리움 그라미네아룸에 대한 항진균 활성에 대하여 총 세포외 단백질 시험을 감자 덱스트로스 아가를 함유하는 페트리 접시에서 수행하였다. 활발히 생장하는 진균 플레이트로부터의 균사 플러그를 페트리 접시 중앙에 위치하였고 멸균 여과지 디스크 (5 mm 직경의 왓맨® 여과지 no.1)를 균사 콜로니의 가장자리로부터 0.5 cm 거리의 아가 표면에 위치하였다. 2.5 ㎍의 세포외 단백질을 함유하는 분액 (60 ㎕)을 디스크에 첨가하였다 (테스트 스팟을 도 1(a)A 및 1(a)B에서 "T"로 나타낸다). 멸균 증류수 및 완충액을 대조군으로 사용하였다 (대조군 스팟을 도 1(a)A 및 1(a)B에서 "C"로 나타낸다). 이후 플레이트를 4일 동안 실온에서 인큐베이션하였고 균사 과성장 억제에 대해 조사하였다. 균사 콜로니의 영역을 측정하였으며 대조군에 비해 균사 콜로니 과성장 영역의 감소 백분율을 산출함으로써 진균 생장 억제를 결정하였다. SMCD 배양물로부터 회수한 총 세포외 단백질은 푸사리움 옥시스포럼 및 푸사리움 그라미네아룸 모두에서 균사 과성장을 억제하였다 (도 1(a)A 및 1(a)B). 발아 개시 3일 후 푸사리움 옥시스포럼의 균사 신장에서 약 22 % 억제, 그리고 푸사리움 그라미네아룸의 균사 신장에서 30 % 억제가 관찰되었다 (도 1(b)). 1일 후, 푸사리움 옥시스포럼의 균사 신장 억제가 약 30 %까지 증가한 한편, 푸사리움 그라미네아룸의 균사 신장 억제가 약 35 %까지 증가하였다 (도 1b). Extracellular Protein extraction : The filtered culture medium was used as a source of extracellular protein and Amicon as a 3000-Dalton cutoff membrane.® Concentrated by centrifugation at 4000 rpm at 4 ° C. in an ultrafiltration centrifuge tube (Amicon is a registered trademark of Billyrica Millipore Corp., Mass., USA). Total extracellular proteins were tested for antifungal activity against fungal pathogens, Fusarium oxysporum and Fusarium gramrearum using a disk diffusion assay. Antifungal activity of total extracellular proteins is described by Roberts and Selitrennikoff (1986,Isolation and partial characterization of two antifungal proteins from barley. Biochim. Biophys. Acta, 880: 161-170) were modified under sterile conditions by a radial disc plate diffusion assay with some modifications. Total extracellular protein tests for antifungal activity against the Fusarium oxime forum and the Fusarium gramrearum were performed in a Petri dish containing potato dextrose agar. Mycelial plugs from actively growing fungal plates were placed in the center of the Petri dish and sterile filter paper discs (5 mm diameter Whatman)® Filter paper no. 1) was placed on the agar surface at a distance of 0.5 cm from the edge of the mycelia colonies. Aliquots (60 μl) containing 2.5 μg extracellular protein were added to the discs (test spots are indicated as “T” in FIGS. 1 (a) A and 1 (a) B). Sterile distilled water and buffer were used as controls (control spots are indicated as "C" in Figures 1 (a) A and 1 (a) B). Plates were then incubated for 4 days at room temperature and examined for mycelial overgrowth inhibition. The area of mycelial colonies was measured and fungal growth inhibition was determined by calculating the percentage of reduction of the mycelial colony overgrowth area compared to the control. Total extracellular protein recovered from the SMCD culture inhibited mycelial overgrowth in both Fusarium oxysporum and Fusarium gramrearum (FIGS. 1 (a) A and 1 (a) B). About 22% inhibition in mycelial kidney of Fusarium oxime forum and 30% inhibition in mycelial kidney of Fusarium gramrealum was observed 3 days after germination (FIG. 1 (b)). After 1 day, the mycelial suppression of Fusarium oxime forum increased by about 30%, while the mycelial suppression of Fusarium Graminearum increased by about 35% (FIG. 1B).
천연 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (천연- PAGE ): 단백질 (세포내 및 세포외)을 문헌[Laemmli (1970, Cleavage of structural protein during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685)]에 주어진 방법을 사용하여 불연속 완충 시스템에서 10 % 천연 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (천연-PAGE)에 의해 분리하였다. 축적 겔 (3.75 % 아크릴아미드/비스-아크릴아미드 30:0.8 v/v)은 완충액으로서 125 mM 트리스-HCl, pH 6.8을 포함하였으며 분리 겔 (7.5 % 아크릴아미드/비스-아크릴아미드 30:0.8 v/v)은 완충액으로서 375 mM 트리스-HCl, pH 8.8을 포함하였다. 겔을 4 ℃에서 밤새 120 V로 25 mM 트리스 및 192 mM 글리신, pH 8.3을 함유하는 트리스-글리신 전극 완충액으로 작동하였다. 전기영동 후, 은 염색법 (바이오-래드(Bio-Rad)® 키트법)에 따라 겔을 염색하였다. Natural polyacrylamide gel electrophoresis (natural- PAGE ): proteins (intracellular and extracellular) were described in Laemmli (1970, Cleavage). of structural protein during the assembly of the head of bacteriophage T4 . Nature 227 : 680-685) was isolated by 10% natural polyacrylamide gel electrophoresis (natural-PAGE) in a discrete buffer system. Accumulation gel (3.75% acrylamide / bis-acrylamide 30: 0.8 v / v) contained 125 mM Tris-HCl, pH 6.8 as buffer and separation gel (7.5% acrylamide / bis-acrylamide 30: 0.8 v / v). v) included 375 mM Tris-HCl, pH 8.8 as buffer. The gel was operated with Tris-glycine electrode buffer containing 25 mM Tris and 192 mM Glycine, pH 8.3 at 120 V overnight at 4 ° C. After electrophoresis, the gels were stained according to the silver staining method (Bio-Rad ® kit method).
나트륨 도데실 술페이트 - 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 ( SDS - PAGE ): 천연-PAGE로부터 용리된 단백질 및 총 단백질의 SDS-PAGE를 문헌[Laemmli (1970)]에 주어진 방법에 따라 12 % 폴리아크릴아미드 겔 상에서 수행하였다. 단백질을 트리스-글리신 완충액 (pH 8.3)에서 5 % 축적 겔 (pH 6.8) 및 12 % 분리 아크릴아미드 겔 (pH 8.8) 및 적절한 마커를 이용하여 분석하였다. SDS-전기영동에 앞서 단백질을 5 % β-메르캅토에탄올을 함유하는 동일 부피의 샘플 완충액 (60 mM 트리스-HCl 완충액, 4 % SDS, pH 6.8)과 혼합하였다. 바이오-래드® 래버러토리 캐나다 리미티드 (Bio-Rad® Laboratories Canada Ltd.) (캐나다 PQ 몬트리올; 바이오-래드는 미국 CA 허큐리스 바이오-래드 래버러토리 인크.의 등록상표이다)로부터 얻은 표준 마커 단백질의 혼합물을 사용하였다. 모든 샘플은 95 ℃에서 5분 동안 가열하였고 실온으로 냉각하였다. 단백질을 은 염색법 (바이오-래드® 키트법)에 의해 시각화하였다. 단백질 분자 질량을 표준 분자 질량 마커의 이동도와 비교하여 추정하였다. Sodium dodecyl Sulfate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis ( SDS - PAGE ): SDS-PAGE of protein eluted from natural-PAGE and total protein was performed on a 12% polyacrylamide gel according to the method given in Laemmli (1970) It was. Proteins were analyzed using 5% accumulation gel (pH 6.8) and 12% isolated acrylamide gel (pH 8.8) and appropriate markers in Tris-glycine buffer (pH 8.3). Prior to SDS-electrophoresis, the proteins were mixed with an equal volume of sample buffer containing 60% β-mercaptoethanol (60 mM Tris-HCl buffer, 4% SDS, pH 6.8). Bio-Rad Laboratories ® Tori Canada Limited (Bio-Rad ® Laboratories Canada Ltd. ) ( Montreal, PQ, Canada; Bio-Rad US heokyu CA Leasing Bio-Rad Laboratories is a registered trademark of Torrey Inc.) standard protein markers obtained from A mixture of was used. All samples were heated at 95 ° C. for 5 minutes and cooled to room temperature. Proteins were visualized by silver staining (Bio-Rad ® Kit Method). Protein molecular mass was estimated by comparing the mobility of standard molecular mass markers.
세포외 단백질의 고속 단백질 액체 크로마토그래피 ( FPLC ): 제조사의 지시에 따라 FPLC AKTA® 정제기 시스템 (AKTA는 스웨덴 웁살라 GE 헬스케어 바이오-사이언스 AB 리미티드(GE Healthcare Bio-Sciences AB Ltd.)의 등록상표이다)을 이용하여 수퍼덱스(Superdex)® 75 GL 10/30 컬럼 (수퍼덱스는 스웨덴 웁살라 GE 헬스케어 바이오-사이언스 AB 리미티드의 등록상표이다)을 통해 단백질을 분획화하였다. 이전에 컬럼을 멸균수 및 0.15 M NaCl을 함유하는 50 mM 인산나트륨 완충액, pH 7.0으로 평형화하였고 이후 단백질을 주입하였으며 (약 500 ㎕) 단백질을 1.0 ml/분의 유속으로 동일 완충액으로 용리하였다. 단백질을 0.15 M NaCl을 함유하는 50 mM 인산나트륨 완충액, pH 7.0을 이용하여 겔 여과를 통해 정제하였다. 수퍼덱스 75 상 겔 여과시 단백질을 별개 피크로 분석하였다. 0.8-ml 분획을 수집하였으며 그 순도를 SDS-PAGE로 체크하였다. Fast Protein Liquid Chromatography of Extracellular Proteins ( FPLC ): FPLC AKTA ® Purifier System (AKTA is a registered trademark of GE Healthcare Bio-Sciences AB Ltd., Uppsala, Sweden, as directed by the manufacturer. ) were super dex (Superdex) ® 75
나트륨 도데실 술페이트 - 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 ( SDS - PAGE ): FPLC 분획으로부터 회수된 단백질의 SDS-PAGE (12 %)를 문헌[Laemmli (1970)]에 주어진 방법에 따라 수행하였다. FPLC 분획을 나타내는 모든 피크를 모았고 냉각한 아세톤 1:4 부피에서 침전에 의해 회수하였으며 밤새 -20 ℃로 유지하였다. 10분 동안 12,000 g 에서 원심분리한 후 침전된 단백질 (펠렛)을 최소양 (30 ㎕)의 분석 완충액에 용해하였다. 단백질을 트리스-글리신 완충액 (pH 8.3)에서 5 % 축적 겔 (pH 6.8) 및 12 % 분리 아크릴아미드 겔 (pH 8.8) 및 적절한 마커를 갖는 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. SDS-전기영동에 앞서, 단백질을 5 % β-메르캅토에탄올을 함유하는 동일 부피의 샘플 완충액 (60 mM 트리스-HCl 완충액, 4 % SDS, pH 6.8)과 혼합하였다. 표준 마커 단백질의 혼합물 (바이오-래드® 단백질 마커, 바이오-래드 래버러토리 캐나다 인크.)을 사용하였다. 모든 샘플을 95 ℃에서 5분 동안 가열하였고 겔에 로딩하기 전 실온으로 냉각하였다. 단백질을 은 염색법 (바이오-래드® 은 염색 키트, 바이오-래드 래버러토리 캐나다 인크.)에 의해 시각화하였다. 단백질 분자 질량을 표준 분자 질량 마커의 이동도와 비교하여 추정하였다. FPLC로부터 수득된 분획화된 단백질의 분자 질량을 SDS-PAGE (12 % 및 16 %)에 의해 결정하였다. 천연-PAGE 방법에 의해 분리되는 큰 중량의 단백질 밴드를 포함하는 세포외 단백질을 분리하기 위해 5 % SDS-PAGE를 수행하였다. Sodium dodecyl Sulfate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis ( SDS - PAGE ): SDS-PAGE (12%) of the protein recovered from the FPLC fraction was performed according to the method given in Laemmli (1970). All peaks representing the FPLC fractions were collected and recovered by precipitation in cold acetone 1: 4 volume and kept at -20 ° C overnight. After centrifugation at 12,000 g for 10 minutes, the precipitated protein (pellets) was dissolved in a minimal amount (30 μl) of assay buffer. Proteins were analyzed by SDS-PAGE with 5% accumulation gel (pH 6.8) and 12% isolated acrylamide gel (pH 8.8) and appropriate markers in Tris-glycine buffer (pH 8.3). Prior to SDS-electrophoresis, the protein was mixed with an equal volume of sample buffer (60 mM Tris-HCl buffer, 4% SDS, pH 6.8) containing 5% β-mercaptoethanol. A mixture of standard marker proteins (Bio-Rad ® Protein Marker, Bio-Rad Laboratories Canada Inc.) was used. All samples were heated at 95 ° C. for 5 minutes and cooled to room temperature before loading into the gel. Proteins were visualized by silver staining (Bio-Rad ® Silver Staining Kit, Bio-Rad Laboratories Canada Inc.). Protein molecular mass was estimated by comparing the mobility of standard molecular mass markers. The molecular mass of the fractionated protein obtained from FPLC was determined by SDS-PAGE (12% and 16%). 5% SDS-PAGE was performed to separate extracellular proteins comprising large weight protein bands separated by the natural-PAGE method.
SM-Bst 및 SMGst로부터 추출되는 세포내 단백질의 10 % 천연 폴리아크릴아미드 겔을 이용한 천연-PAGE 전기영동은 상부 밴드 및 하부 밴드로 지정되는 단백질의 두 밴드를 분리하였다 (도 2). 천연-PAGE의 각 단백질 밴드를 500-750 ㎕의 샘플 완충액 (62.5 mM 트리스-HCl, pH 6.8; 1 % PMSF, 1 % EDTA)에 침지하였고 4 ℃에서 밤새 두었다. 10분 동안 12,000 g으로 원심분리하여 단백질을 회수하였다. 천연-PAGE로부터 용리되는 분리 단백질의 분자량을 결정하기 위해 12 % 겔을 이용하여 세포내 단백질의 SDS-PAGE 분리를 하였다. 세포내 샘플의 하부 및 상부 밴드로부터 용리된 단백질은 대략 50 및 79 kDa의 별개의 두 밴드 존재를 나타냈다 (도 3).Natural-PAGE electrophoresis using 10% natural polyacrylamide gels of intracellular proteins extracted from SM-Bst and SMGst separated two bands of protein designated as upper and lower bands (FIG. 2). Each protein band of native-PAGE was immersed in 500-750 μl of sample buffer (62.5 mM Tris-HCl, pH 6.8; 1% PMSF, 1% EDTA) and left overnight at 4 ° C. The protein was recovered by centrifugation at 12,000 g for 10 minutes. SDS-PAGE separation of intracellular proteins was performed using a 12% gel to determine the molecular weight of the isolated protein eluting from native-PAGE. Proteins eluted from the lower and upper bands of the intracellular sample showed the presence of two separate bands of approximately 50 and 79 kDa (FIG. 3).
SM-Bst 및 SMGst로부터 추출되는 세포외 단백질의 10 % 천연 폴리아크릴아미드 겔을 이용한 천연-PAGE 전기영동은 EC1, EC2, EC3, 및 EC4로 지정되는 단백질의 네 밴드를 분리하였다 (도 4). 천연-PAGE의 각 단백질 밴드를 500-750 ㎕의 샘플 완충액 (62.5 mM 트리스-HCl, pH 6.8; 1 % PMSF, 1 % EDTA)에 침지하였고 4 ℃에서 밤새 두었다. 10분 동안 12,000 g으로 원심분리하여 단백질을 회수하였다. 천연-PAGE로부터 용리된 분리 단백질의 분자량을 결정하기 위해 12 % 겔을 이용하여 세포외 단백질의 SDS-PAGE 분리를 하였다. 네 밴드로부터의 용리된 단백질은 약 다음의 분자량을 갖는 분리 및 정제 단백질의 존재를 나타내었다: (i) 79 kDa (EC1), (ii) 50 kDa (EC2), (iii) 36 kDa (EC3), 및 13 kDa (EC4) (도 5).Natural-PAGE electrophoresis using 10% natural polyacrylamide gels of extracellular proteins extracted from SM-Bst and SMGst separated four bands of proteins designated EC1, EC2, EC3, and EC4 (FIG. 4). Each protein band of native-PAGE was immersed in 500-750 μl of sample buffer (62.5 mM Tris-HCl, pH 6.8; 1% PMSF, 1% EDTA) and left overnight at 4 ° C. The protein was recovered by centrifugation at 12,000 g for 10 minutes. SDS-PAGE separation of extracellular protein was performed using a 12% gel to determine the molecular weight of the isolated protein eluted from native-PAGE. Eluted proteins from the four bands showed the presence of isolated and purified proteins having the following molecular weights: (i) 79 kDa (EC1), (ii) 50 kDa (EC2), (iii) 36 kDa (EC3) , And 13 kDa (EC4) (FIG. 5).
AKTA® 정제기 시스템을 이용하여 FPLC 고속 단백질 액체 크로마토그래피에 의해 결정함으로써 수퍼덱스 75 GL 10/30 컬럼상 세포외 단백질의 네 밴드의 용리 프로파일을 도 5에 나타낸다. ® AKTA purifier FPLC Fast protein shows the elution profile of the four bands of the super dex 75
실시예Example 3: 3: 푸사리움종에In the Fusarium 의한 by 스페로데스Spherodes 마이코파라시티카My Co-Para City Car 배양물로부터 회수된 정제 Purified recovered from culture 세포내Intracellular 단백질 및 정제 Protein and Purification 세포외Extracellular 단백질에 의한 균사 과성장의 억제 Inhibition of mycelial overgrowth by protein
단백질의 항진균 활성을 일부 변형한 문헌[Roberts et al. (1986, Isolation and partial characterization of two antifungal proteins from barley. Biochim. Biophys. Acta, 880: 161-170)]에 주어진 방법에 따라 래디얼 디스크 플레이트 확산 분석법에 의해 멸균 조건 하에서 시험하였다. 감자 덱스트로스 아가를 함유하는 페트리 접시에서 푸사리움 옥시스포럼 및 푸사리움 그라미네아룸에 대한 항진균 활성에 대하여 단리된 단백질의 분석을 수행하였다. 활발히 생장하는 진균 플레이트로부터의 균사 플러그를 페트리 접시 중앙에 위치하였고 멸균 여과지 디스크 (5 mm 직경의 왓맨® 여과지 no.1)를 균사 콜로니의 가장자리로부터 0.5 cm 거리의 아가 표면에 위치하였다. 단리된 단백질 (60 ㎕)을 디스크에 가하였다. 단지 항진균 단백질이 없는 멸균 증류수 및 완충액을 대조군으로 사용하였다. 이후 플레이트를 3-4일 동안 실온에서 인큐베이션하였고 이후 디스크 주변의 억제 존(zone)에 대해, 만일 있는 경우에, 조사하였다. 이러한 방식에서, 시험하는 단백질이 항진균제였다면 초승달 형태 진균 생장의 억제 존이 디스크 주변에서 발생했을 수 있다. 균사 콜로니의 영역을 측정하였으며 대조군 (물 및 완충액 처리된 플레이트)으로 균사 콜로니 영역의 % 감소를 산출함으로써 진균 생장 억제를 결정하였다.Some modifications of the antifungal activity of proteins are described in Roberts et al. (1986, Isolation and partial characterization of two antifungal proteins from barley . Biochim. Biophys. Acta, 880: 161-170) was tested under sterile conditions by radial disc plate diffusion assay. Analysis of isolated proteins was performed for antifungal activity against Fusarium oxysporum and Fusarium graminearum in Petri dishes containing potato dextrose agar. Mycelial plugs from actively growing fungal plates were placed in the center of the Petri dish and a sterile filter paper disc (Watman ® filter paper no. 1 of 5 mm diameter) was placed on the agar surface 0.5 cm from the edge of the mycelia colonies. Isolated protein (60 μl) was added to the disc. Sterile distilled water and buffer without only antifungal protein were used as controls. Plates were then incubated for 3-4 days at room temperature and then examined for inhibition zones, if any, around the disc. In this way, if the protein being tested was an antifungal agent, an inhibitory zone of crescent form fungal growth may have occurred around the disc. The area of mycelial colonies was measured and fungal growth inhibition was determined by calculating the% reduction of the mycelial colony area with a control (water and buffer treated plates).
50 kDa 세포내 단백질 및 79 kDa 세포내 단백질 모두 균사 신장, 즉, 푸사리움 옥시스포럼 (도 7(a)-7(d)) 및 푸사리움 그라미네아룸 (도 8(a)-8(d))의 균사 생장을 억제하였다.Both the 50 kDa intracellular protein and the 79 kDa intracellular protein both mycelial elongation, ie, Fusarium oxysporum (Figs. 7 (a) -7 (d)) and Fusarium Graminearum (Fig. 8 (a) -8 (d) Mycelial growth of)) was inhibited.
79 kDa 단백질 (EC1), 50 kDa 단백질 (EC2), 및 36 kDa 단백질 (EC3)가 푸사리움 옥시스포럼 (도 9(a)-9(b)) 및 푸사리움 그라미네아룸 (도 10(a)-10(b))의 균사 과성장을 억제하였다. 13 kDa 단백질 (EC4)은 푸사리움 그라미네아룸 (도 11(a)) 및 푸사리움 옥시스포럼 (도 11(b))의 균사 과성장을 억제하였다.79 kDa protein (EC1), 50 kDa protein (EC2), and 36 kDa protein (EC3) were found in the Fusarium oxisforum (Figs. 9 (a) -9 (b)) and Fusarium Graminearum (Fig. 10 (a) Mycelial overgrowth of) -10 (b)) was inhibited. 13 kDa protein (EC4) inhibited mycelial overgrowth of Fusarium Graminearum (FIG. 11 (a)) and Fusarium Oxy Forum (FIG. 11 (b)).
실시예Example 4: 4: 푸사리움종에In the Fusarium 의한 포자 발아의 Caused by spore germination 스페로데스Spherodes 마이코파라시티카My Co-Para City Car 배양물로부터 회수된 정제 Purified recovered from culture 세포외Extracellular 단백질에 의한 억제 Inhibition by Protein
네 개의 세포외 스페로데스 마이코파라시티카 단백질 EC1, EC2, EC3 및 EC4에 의한 푸사리움종 포자 발아에 대한 억제 효과를 문헌[Ghosh (2006, Antifungal Properties of Haem Peroxidase from Acorus calamus. Ann. Bot. 98: 1145-1153)] 및 문헌[Yadav et al. (2007, An antifungal protein from Escherichia coli. J. Med. Microbiol. 56: 637-644)]에 개시된 마이크로타이터 플레이트 분석 방법을 이용하여 평가하였다. 분획화된 단백질의 가능한 독성을 진균 푸사리움 옥시스포럼 및 푸사리움 그라미네아룸을 이용하여 백분율 생장 억제 분석법으로 시험하였다. 분획화된 단백질의 시험관내 항진균 활성을 96-웰 마이크로타이터 플레이트에서 결정하였다. 마이크로플레이트 웰에서 10 ㎕의 감자 덱스트로스 브로스 (PDB; 디트로이트의 디프코 래버러토리(Difco Laboratories)를 3 ㎕의 푸사리움 옥시스포럼 및 푸사리움 그라미네아룸의 포자 현탁액과 혼합하였다. 단백질 분획을 함유하는 상이한 피크의 7 ㎕의 분취액을 마이크로타이터 플레이트 내 현탁액에 가하였다 (12-8 웰). 물과 완충액을 음성 대조군으로 사용하였다. 이후 암실에서 마이크로타이터 플레이트를 실온으로 인큐베이션하였다. 도립 및 형광 현미경을 사용하여 24시간 후 무처리 및 처리된 웰 모두에서의 포자 발아 억제에 대해 관찰하였다. 현미경 내 발아된 포자와 발아되지 않은 포자의 수 및 균사에 의해 덮인 영역의 백분율을 생장 억제의 백분율을 결정하기 위해 사용하였다.Inhibitory effect of four extracellular spherodes mycoparasitika proteins EC1, EC2, EC3 and EC4 on Fusarium spore germination [Ghosh (2006, Antifungal) Properties of Haem Peroxidase from Acorus calamus . Ann. Bot. 98: 1145-1153) and Yadav et al . (2007, An antifungal protein from Escherichia coli . J. Med. Microbiol. 56: 637-644). Possible toxicity of the fractionated proteins was tested in percent growth inhibition assays using the fungal Fusarium oxysForum and Fusarium gramrearum. In vitro antifungal activity of fractionated proteins was determined in 96-well microtiter plates. 10 μl of potato dextrose broth (PDB; Difco Laboratories of Detroit) was mixed with 3 μl of spore suspension of Fusarium oxysporum and Fusarium gramrearum in microplate wells. 7 μl aliquots of different peaks containing were added to the suspension in the microtiter plate (12-8 wells) Water and buffer were used as negative controls The microtiter plates were then incubated at room temperature in the dark. Inverted and fluorescence microscopy were used to observe spore germination inhibition in both untreated and treated wells after 24 h.The number of germinated and ungerminated spores in the microscope and the percentage of areas covered by mycelium inhibited growth. It was used to determine the percentage of.
모든 네 개의 세포외 단백질이 푸사리움 옥시스포럼 및 푸사리움 그라미네아룸 (도 12(a) 및 12(b))의 포자 발아를 유의하게 억제하였다. 또한, 모든 네 개의 세포외 단백질이 푸사리움 옥시스포럼 및 푸사리움 그라미네아룸의 균사 생장 억제의 큰 존을 (이들 유기체가 별도로 고체 배지에 평판배양될 때) 형성하였다 (도 13). 도 14A(c)는 대조군 푸사리움 옥시스포럼 포자의 발아를 보여주는 현미경사진이며 도 14A(a)는 50 kDa 단백질의 푸사리움 옥시스포럼 포자의 발아에 대한 억제 효과를 보여주고, 도 14A(b)는 13 kDa 단백질의 푸사리움 옥시스포럼 포자의 발아에 대한 억제 효과를 보여준다. 도 14B(c)는 대조군 푸사리움 그라미네아룸 포자의 발아를 보여주는 현미경사진이며 도 14B(a)는 50 kDa 단백질의 푸사리움 그라미네아룸 포자의 발아에 대한 억제 효과를 보여주고, 도 14(b)는 13 kDa 단백질의 푸사리움 그라미네아룸 포자의 발아에 대한 억제 효과를 보여준다.All four extracellular proteins significantly inhibited the spore germination of the Fusarium oxysporum and the Fusarium Graminearum (FIGS. 12 (a) and 12 (b)). In addition, all four extracellular proteins formed large zones (when these organisms were plated separately in solid medium) in the large zone of mycelial growth inhibition of the Fusarium oxysporum and the Fusarium Graminearum (FIG. 13). 14A (c) is a micrograph showing the germination of control Fusarium oxysporum spores and FIG. 14A (a) shows the inhibitory effect on the germination of Fusarium oxysporum spores of 50 kDa protein and FIG. 14A (b) ) Shows the inhibitory effect of the 13 kDa protein on the germination of the Fusarium oxysporum spores. FIG. 14B (c) is a micrograph showing the germination of control Fusarium Graminear spores and FIG. 14B (a) shows the inhibitory effect on the germination of Fusarium Graminerum spores of 50 kDa protein, FIG. 14 (b) ) Shows the inhibitory effect of the 13 kDa protein on the germination of Fusarium Graminea spores.
실시예Example 5: 5: 스페로데스Spherodes 마이코파라시티카My Co-Para City Car 배양물로부터 회수된 결정 형성 Crystal Formation Recovered from Culture EC1EC1 및 And EC3EC3 단백질의 억제 효과 Inhibitory Effects of Proteins
PDA상 활발히 생장하는 푸사리움 아베나시움 및 푸사리움 그라미네아룸 배양물로 결정 형성 세포외 단백질 EC1 (79 kDa) 및 EC3 (36 kDa)의 진균독성 효과를 평가하였다. 푸사리움 아베나시움을 균사가 플레이트의 표면을 덮을 때까지 PDA 아가 상에서 생장시켰다. 플레이트의 절반을 EC1 및 EC3 결정 단백질의 혼합물로 처리하였고 그 후, 플레이트를 암실에서 5일 동안 23 ℃로 인큐베이션하였다. 플레이트의 무처리 대조군측 (도 15(a))에 비해 EC1/EC3 단백질 혼합물로 처리한 플레이트의 절반 (도 15(B))에서 상당한 균사 손상을 관찰하였다.The fungal toxic effects of the crystal-forming extracellular proteins EC1 (79 kDa) and EC3 (36 kDa) were assessed with the Fusarium avenacium and Fusarium Graminearum cultures actively growing on PDA. Fusarium avenasium was grown on PDA agar until the mycelium covered the surface of the plate. Half of the plate was treated with a mixture of EC1 and EC3 crystalline proteins and the plates were then incubated at 23 ° C. for 5 days in the dark. Significant mycelial damage was observed in half of the plates treated with EC1 / EC3 protein mixture (FIG. 15 (B)) compared to the untreated control side of the plate (FIG. 15 (A)).
PDA 플레이트 표면에 걸쳐 밀 종자를 뿌렸다. 종자가 발아한 후에 푸사리움 그라미네아룸을 플레이트에 접종하였다. 플레이트의 절반을 EC1/EC3 단백질 혼합물로 처리하였고 그 후, 플레이트를 암실에서 5일 동안 23 ℃로 인큐베이션하였다. EC1/EC3 단백질 혼합물이 주어진 플레이트의 절반 상에서는 진균 생장이 없었던 반면 (도 16(b)), 플레이트의 무처리측 상에서는 진균 균사가 증식하였다 (도 16(a)). EC1/EC3 단백질 혼합물이 주어진 아가 표면의 공초점 레이져 주사 현미경으로의 조사는 수많은 분해된 균사 성분을 보여주었다 (도 16(c)의 화살표 참고).Sprinkle wheat seeds across the PDA plate surface. After seed germination, Fusarium Graminearum was inoculated on the plate. Half of the plate was treated with the EC1 / EC3 protein mixture and then the plate was incubated at 23 ° C. for 5 days in the dark. The EC1 / EC3 protein mixture had no fungal growth on half of the given plate (FIG. 16 (b)), while fungal mycelia grew on the untreated side of the plate (FIG. 16 (a)). Confocal laser scanning microscopy of the agar surface given the EC1 / EC3 protein mixture showed a number of degraded mycelial components (see arrow in FIG. 16 (c)).
푸사리움 그라미네아룸을 균사가 플레이트의 표면을 덮을 때까지 PDA 아가 상에서 생장시켰다. 플레이트의 절반을 EC1 및 EC3 결정 단백질의 혼합물로 처리하였고 그 후, 플레이트를 암실에서 5일 동안 21 ℃로 인큐베이션하였다. 플레이트의 무처리 대조군측 (도 17(a))에 비해 EC1/EC3 단백질 혼합물로 처리한 플레이트의 절반 (도 17(B))에서 상당한 균사 손상을 관찰하였다. EC1/EC3 단백질 혼합물이 주어진 아가 표면의 주사 전자 현미경으로의 조사는 수많은 분해된 균사 성분을 보여주었다 (도 18(a)의 화살표 참고). 화학력 현미경으로의 동일 표면 조사는 파괴된 균사 성분 및 세포사멸 분해된 세포를 보여주었다 (도 18 (c)의 화살표 참고).Fusarium Graminearum was grown on PDA agar until the mycelium covered the surface of the plate. Half of the plate was treated with a mixture of EC1 and EC3 crystalline proteins and the plates were then incubated at 21 ° C. for 5 days in the dark. Significant mycelial damage was observed in half of the plates treated with EC1 / EC3 protein mixture (FIG. 17 (B)) compared to the untreated control side of the plate (FIG. 17 (A)). Scanning electron microscopy of the agar surface given the EC1 / EC3 protein mixture showed a number of degraded mycelial components (see arrow in FIG. 18 (a)). Same surface examination with chemical force microscopy showed destroyed mycelial components and apoptosis lysed cells (see arrow in FIG. 18 (c)).
실시예Example 6: 6: 스페로데스Spherodes 마이코파라시티카My Co-Para City Car 배양물로부터 회수된 정제 Purified recovered from culture 세포외Extracellular 단백질의 서열 분석 및 추정적 확인 Sequence Analysis and Presumptive Identification of Proteins
세포외 단백질 밴드 EC1 (79 kDa), EC2 (50 kDa), EC3 (36 kDa), 및 EC4 (13 kDa)를 5 %, 12 % 및 16 % SDS-PAGE 겔로부터 절단하였다. 잘라낸 단백질 밴드를 말디 토프 질량분석 장치를 이용한 서열 분석 및 펩티드 특징 규명 및 펩티드 서열의 유니프로트KB/스위스-프로트(UniProtKB/Swiss-Prot) 및 NCBI 데이터베이스와의 비교에 의한 추정적 확인을 위해 맥길(McGill) 대학 및 게놈 퀘벡 이노베이션 센터 (Genome Quebec Innovation Centre)(캐나다 PQ 몬트리올 드라이브 펜필드 애비뉴 740 Rm 704)로 보냈다. Extracellular protein bands EC1 (79 kDa), EC2 (50 kDa), EC3 (36 kDa), and EC4 (13 kDa) were cut from 5%, 12% and 16% SDS-PAGE gels. The cleaved protein bands were subjected to McGill's for sequencing using the Malditops mass spectrometry and for speculative characterization by peptide characterization and comparison of the peptide sequences with UniProtKB / Swiss-Prot and the NCBI database. McGill University and Genome Quebec Innovation Center (Canada PQ Montreal Drive Penfield Avenue 740 Rm 704).
말디 토프 질량분석 분석은 EC1 단백질을 포함하는 아미노산의 분리를 가능하게 하였다 (도 19). EC1 단백질을 포함하는 아미노산의 서열은 다음으로 밝혀졌다:Malditops mass spectrometry allowed the separation of amino acids including EC1 protein (FIG. 19). The sequence of amino acids comprising the EC1 protein was found to be:
YLPGGGGGRDEPPPR (서열 4)YLPGGGGGRDEPPPR (SEQ ID NO: 4)
EC1의 질량은 78,688 Da (79 kDa)로 밝혀졌으며 그 정체성은 RTX 단백질 독소 및 관련 Ca2 +-결합 단백질과 유사한 것으로 예상되었다.The mass of EC1 have been found to 78,688 Da (79 kDa) that identity RTX toxin protein and associated Ca 2 + - was expected to be similar to the binding protein.
EC2 세포외 단백질 밴드의 말디 토프 질량분석 분리는 (도 20) EC2 단백질을 포함하는 아미노산 서열을 결정하는 것을 가능하게 하였다:Malditope mass spectrometry separation of the EC2 extracellular protein band (FIG. 20) made it possible to determine the amino acid sequence comprising the EC2 protein:
LHVQFMSSK (서열 5)LHVQFMSSK (SEQ ID NO: 5)
EC2의 질량은 49,443 Da (50 kDa)으로 결정되었으며 그 정체성은 β-1,4-글루카제 단백질과 유사한 것으로 예상되었다. The mass of EC2 was determined to be 49,443 Da (50 kDa) and its identity was expected to be similar to the β-1,4-glucase protein.
EC3 세포외 단백질 밴드의 말디 토프 질량분석 분리는 (도 21) EC3 단백질을 포함하는 아미노산 서열을 결정하는 것을 가능하게 하였다:Malditope mass spectrometry separation of the EC3 extracellular protein band (FIG. 21) made it possible to determine the amino acid sequence comprising the EC3 protein:
EIAVTELDIAGASSTDYVEVVEACLNQPK (서열 6)EIAVTELDIAGASSTDYVEVVEACLNQPK (SEQ ID NO: 6)
EC3의 질량은 35,578 Da (36 kDa)으로 결정되었으며 그 정체성은 크실라나아제 단백질과 유사한 것으로 예상되었다.The mass of EC3 was determined to be 35,578 Da (36 kDa) and its identity was expected to be similar to the xylanase protein.
EC4 세포외 단백질 밴드의 말디 토프 질량분석 분리는 (도 22) EC3 단백질을 포함하는 아미노산 서열을 결정하는 것을 가능하게 하였다:Malditope mass spectrometry separation of the EC4 extracellular protein band (FIG. 22) made it possible to determine the amino acid sequence comprising the EC3 protein:
TTVSYDTGYDDK (서열 7)TTVSYDTGYDDK (SEQ ID NO: 7)
EC4의 질량은 2,563 Da (SDS-Page 분석은 그 분자량이 13 kDa라고 나타냈기 때문에 이것은 말단이 절단된 단편이다)으로 결정되었으며 그 정체성은 가상의 세라토-플라타닌(Cerato-platanin) 독소로 예상되었다.The mass of EC4 was determined to be 2,563 Da (which is a truncated fragment because the SDS-Page analysis indicated that its molecular weight was 13 kDa) and its identity was expected to be a hypothetical Cerato-platanin toxin. .
실시예Example 6: 6: 스페로데스Spherodes 마이코파라시티카My Co-Para City Car 배양물로부터 회수한 정제 Purified from Culture 세포외Extracellular 단백질의 Protein 스클레로티니아Sclerotinia 스클레로티오룸Sclero Room , , 리족토니아Liqtonia 솔라니Solani , 및 , And 피시움Pisium 울티멈의Ultimum 균사 생장 및 발달에 대한 영향 Influence on Mycelial Growth and Development
스페로데스 마이코파라시티카 배양물로부터 회수한 정제 세포외 단백질 EC1 (79 kDa) 및 EC3 (36 kDa)의 정진균 및 진균독성 효과를 농작물에 상당한 손상을 야기하는 추가적인 3 가지 널리 퍼진 식물 병원균으로 평가하였다. EC1 + EC3 세포외 스페로데스 마이코파라시티카 단백질의 혼합물 (1:1)의 스클레로티니아 스클레로티오룸, 리족토니아 솔라니, 및 피시움 울티멈에 대한 억제 효과를 문헌[Ghosh (2006)] 및 문헌[Yadav et al. (2007)]에 개시된 마이크로타이터 플레이트 분석 방법을 이용하여 평가하였다. 균사를 수집하였고 생장 36 시간 후에 문헌[Strom et al. (2005, Co-cultivation of antifungal Lactobacillus plantarum MiLAB 393 and Aspergillus nidulans , evaluation of effects on fungal growth and protein expression. FEMS Microb Let, 246: 119-124)]에 주어진 방법에 따라 생물량을 칭량하였다. 도 23(a), 23(c), 및 23(e)는 각각 암실에서 4일 동안 26 ℃로 PDA 상에서 생장한 스클레로티니아 스클레로티오룸, 리족토니아 솔라니, 및 피시움 울티멈의 대조군 배양물의 현미경사진이다. 도 23(b), 23(d), 및 23(f)는 각각 스페로데스 마이코파라시티카에 의해 생산된 EC1 (79 kDa) 및 EC3 (36 kDa) 세포외 단백질의 (1:1) 혼합물로 수정한 PDA 상에서 생장한 스클레로티니아 스클레로티오룸, 리족토니아 솔라니, 및 피시움 울티멈의 현미경사진이다. 세포외 단백질 혼합물은 모든 세 식물 병원균 진균 배양물에 상당한 균사 손상을 야기하였다 (도 23(b), 23(d), 23(f)). 도 24의 데이터는 세포외 단백질 혼합물이 다음을 야기하였다는 것을 입증한다: (i) 무처리 대조군과 비교하여 스클레로티니아 스클레로티오룸 생장의 약 80 % 억제, (ii) 무처리 대조군과 비교하여 리족토니아 솔라니 생장의 약 85 % 억제, 및 (iii) 무처리 대조군과 비교하여 피시움 울티멈 생장의 약 95 % 억제. 이러한 데이터는 본원에 개시된 스페로데스 마이코파라시티카 세포외 단백질이 넓은 범위의 토양 및 식물 병원성 진균에 정진균 및 진균독성 효과를 가진다는 것을 입증한다.The fungal and fungal toxic effects of the purified extracellular proteins EC1 (79 kDa) and EC3 (36 kDa) recovered from Spherodes mycoparasitika cultures were evaluated with three additional widespread plant pathogens causing significant damage to crops. . The inhibitory effect of a mixture of EC1 + EC3 extracellular Spherodes mycoparasitica protein (1: 1) on sclerotenia sclerotirum, lizartonia sorani, and fishium Ultimum is described by Ghosh (2006). ) And Yadav et. al . (2007) using the microtiter plate analysis method disclosed. Mycelia were collected and 36 hours after growth in Strom et al. (2005, Co-cultivation of antifungal Lactobacillus plantarum MiLAB 393 and Aspergillus nidulans , evaluation of effects on fungal growth and protein expression . FEMS Microb Let, 246: 119-124). Figures 23 (a), 23 (c), and 23 (e) show sclerotnia sclerothiorum, lisartonia solani, and pisium ultimum grown on PDA at 26 ° C. for 4 days in the dark, respectively. Micrographs of control cultures. Figures 23 (b), 23 (d), and 23 (f) are (1: 1) mixtures of EC1 (79 kDa) and EC3 (36 kDa) extracellular proteins produced by Spherodes mycoparasiticas, respectively. Micrographs of sclerotinia sclerotiorum, lizartonia solani, and fishium Ultimum grown on fertilized PDA. The extracellular protein mixture caused significant mycelial damage to all three plant pathogen fungal cultures (Figures 23 (b), 23 (d), 23 (f)). The data in FIG. 24 demonstrate that the extracellular protein mixture resulted in: (i) about 80% inhibition of sclerotnia sclerothiorum growth compared to the untreated control, (ii) untreated control Inhibition of about 85% of liqtonia solanie growth in comparison with, and (iii) Inhibition of about 95% of pisium Ultimum growth in comparison to the untreated control. These data demonstrate that the spherodes mycoparasitica extracellular protein disclosed herein has a fungal and fungal toxic effect on a wide range of soil and plant pathogenic fungi.
본원에 개시된 연구는 서열 4를 포함하는 79 kDa 단백질, 서열 5를 포함하는 50 kDa 단백질, 서열 6을 포함하는 36 kDa 단백질 및 서열 7을 포함하는 13 kDa 단백질로 확인되는 스페로데스 마이코파라시티카로부터 유래한 세포외 단백질이 푸사리움종, 스클레로티니아종, 리족토니아종, 및 피시움종과 같은 다양한 식물 병원성 진균의 포자 발아를 억제하는 데 유용하다는 것을 명백히 입증한다. 본원에 개시된 연구는 또한 식물 병원성 진균의 균사를 하나 이상의 이러한 세포외 단백질과 접촉하는 것이 균사 생장의 중단을 야기하고 분해에 이른다는 것을 입증한다. 따라서, 서열 4, 서열 5, 서열 6 또는 서열 7과 80 % 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자로 식물 세포를 형질전환하는 것은 식물 세포가 서열 4, 서열 5, 서열 6, 또는 서열 7에 개시된 아미노산 서열과 80 % 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드 분자를 생산하는 것을 가능하게 할 것이다. 따라서, 이러한 형질전환된 세포가 식물 내로 배양될 때, 세포를 포함하는 식물은 세포 내 세포외 단백질의 형성을 야기하는 폴리펩티드를 발현할 것이다. 이러한 식물의 표면 콜로니화 및/또는 식물 감염의 과정 동안, 세포외 단백질에 근접하고/거나 세포외 단백질과 접촉하게 되는 식물 병원성 진균은 억제되고/거나 분해될 것이다.The studies disclosed herein were made from spherodes mycoparasitika identified as 79 kDa protein comprising SEQ ID NO: 4, 50 kDa protein comprising SEQ ID NO: 5, 36 kDa protein comprising SEQ ID NO: 6 and 13 kDa protein comprising SEQ ID NO: 7. The extracellular proteins derived clearly demonstrate that they are useful for inhibiting spore germination of various plant pathogenic fungi such as Fusarium species, Sclerotinia species, Lizatonia species, and Pisium species. The studies disclosed herein also demonstrate that contacting the mycelium of plant pathogenic fungi with one or more such extracellular proteins causes disruption of mycelial growth and leads to degradation. Thus, transforming a plant cell with at least one nucleic acid molecule encoding at least one polypeptide comprising an amino acid sequence having at least 80% sequence homology with SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 7 indicates that the plant cell is SEQ ID NO: 4. It will be possible to produce one or more polypeptide molecules comprising an amino acid sequence having at least 80% sequence homology with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 7. Thus, when such transformed cells are cultured into plants, the plant comprising the cells will express a polypeptide that results in the formation of extracellular proteins in the cells. During the course of surface colonization of these plants and / or plant infections, plant pathogenic fungi which come into contact with and / or come into contact with extracellular proteins will be inhibited and / or degraded.
SEQUENCE LISTING <110> University of Saskatchewan Vujanovic, Vladimir <120> PROTEINS FOR BIOCONTROL OF PLANT PATHOGENIC FUNGI <130> 13764-P39401PC01 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1266 <212> DNA <213> Sphaerodes mycoparasitica <400> 1 atagggagaa gaagcactgc gattgcccta gtaacggcga gtgaagcggc agcagcccag 60 atttggaatc tggtcctttt ggggcccgag ttgtaatctg cagaggaagc gtctggtgcg 120 gtgccggcct agttccctgg aacgggacgc cgtagagggt gacagccccg tacggtcggc 180 caccaaacct gtgtgtcgct ccttcgaaga gtcgcgtagt ttgggaatgc tgcgtaaagt 240 gggaggtatg ctcctcctaa ggctaaatac cggccagaga ccgatagcgc acaagtagag 300 tgatcgaaag atgaaaagca ccttgaaaat ggggttaaaa agtacgtgaa attgccaaag 360 gggaagcgct cgtggccaga ctcgtgcctt atggatcatc cggctatttc gccggtgcac 420 tccattaggc tcgggccagc gtcggtcggc gccggtacta aaagacagcg cgaacgtggc 480 tctcttcggg gagtgttata gcgcgctgtg taatgtgctg gcgccgtccg aggaccgcgc 540 atttatgcaa ggacgctggc gtaatggcca ctagcgaccc gtcttgaaac acggaccaag 600 gagtcgccca gagacgcgag tgtgcgggtg acaaacccct 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tagattaaaa accaatgccc 180 ttcggggctc tttggtgatt catgataact tctcgaatcg cacggccttg cgccggcgat 240 ggttcattca aatttcttcc ctatcaactt tcgatgtttg ggtagtggcc aaacatggtg 300 gcaacgggta acggagggtt agggctcgac cccggagaag gagcctgaga aacggctcct 360 acatccaagg aaggcagcag gcgcgcaaat tacccaatct caactcgagg aggtagtgac 420 aataaatacc gatgcagggc tctttagggt cttgcaattg gaatgagtac aatttaaatc 480 ccttaacgag gaacaattgg agggcaagtc tggtgccagc agccgcggta actccagctc 540 caatagcgta tattaaagtt gttgtggtta aaaagctcgt agttgaacct tgggcctggc 600 cggctggtcc gcctaacagc gtgcactggt gcggccgggt cttcccaccg cggagccgca 660 tgtccttcac tgggcgtgtc ggggaagcgg tacttttact gtgaaaaaat tagagtgctc 720 taagcaggcc tatgctcgaa tacattagca tggaataata gaataggaca gtcgttctat 780 tttgttggtt tctaggacgt ctgtaatgat taacagaaac aatcgggggc gtcagtattg 840 catcgtcaga ggtgaaattc ttagatcgat gcaagactaa ctactgcgaa agcattcgcc 900 aagggtgttt tcattaatca ggaacgaaag ttaggggatc gaagacgatc agataccgtc 960 gtagtcttaa ccataaacta tgccgactag ggatcgggcg gtgtaatttt 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