KR20140010898A - Method for sarch storage, hydrogen poduction and ethanol poduction by the low carbon dioxide mediated induction with sulfur-deprivation in microalgae - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to a method for starch storage, hydrogen production, and ethanol production by culturing microalgae under autotrophic conditions through low carbon dioxide-mediated induction with sulfur deprivation, and more particularly, to a method for starch storage in Chlamydomonas through sulfur deprivation and a CO_2 concentrating mechanism (CCM) induced low concentration of CO_2 and for high hydrogen production and ethanol production at high yield by using the stored starch. The improvement in starch storage capacity of microalgae through the sulfur deprivation and the CCM can lead to increases in the production of hydrogen and ethanol, an improvement in green gas reduction capacity, and an increase in productivity of various metabolites through the use of the stored starch. Therefore, the present invention is useful in all industries.

Description

황결핍과 낮은 이산화탄소 매개유발과정의 결합에 의한 자가영양조건에서 미세조류 배양에 의한 전분축적, 수소 및 에탄올 생산 방법{Method for Sarch Storage, Hydrogen Poduction and Ethanol Poduction by The Low Carbon Dioxide Mediated Induction with Sulfur－Deprivation in Microalgae}Method for producing starch, hydrogen and ethanol by microalgal culture under autotrophic conditions by combination of sulfur deficiency and low carbon dioxide mediated process Deprivation in Microalgae}

본 발명은 황결핍과 낮은 이산화탄소 매개유발과정의 결합에 의한 자가영양조건에서 미세조류 배양에 의한 전분축적, 수소 및 에탄올 생산 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 황결핍 및 낮은 CO2 농도에서 유발되는 CO2 농축메커니즘(CCM, CO2 concentrating mechanism)을 통한 클라미도모나스(Chlamydomonas)에서 전분축적 및 축적된 전분을 이용하여 고수율로 수소 및 에탄올을 생산하는 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a method of starch accumulation, hydrogen and ethanol production by microalgae culture under autotrophic conditions by the combination of sulfur deficiency and low carbon dioxide mediated process, more specifically sulfur deficiency and low CO 2 CO 2 from concentration The present invention relates to a method for producing hydrogen and ethanol at high yield using starch accumulation and accumulated starch in Chlamydomonas through a concentration mechanism (CCM, CO 2 concentrating mechanism).

화석연료의 고갈우려와 가격폭등 및 이들의 연소로 인하여 발생하는 온실가스(CO2)의 축적은 각종 지구온난화문제들을 발생시키기 때문에, 현재 지속가능한 청정에너지원의 개발이 요구되고 있다. 그 중 수소는 연소시 순수한 물이 나오는 청정에너지로서 기존의 화석연료를 대체할 수 있는 지속가능한 미래에너지원으로서 여겨지고 있으나 기존의 대용량 수소생산방법들은 대부분 수소생산중 이산화탄소를 동시에 배출하기 때문에 환경친화적이지 못하다는 단점이 있었다.The depletion of fossil fuels, price surges, and the accumulation of greenhouse gases (CO 2 ) caused by their combustion create various global warming problems, and therefore, development of sustainable clean energy sources is required. Hydrogen is regarded as a sustainable future energy source that can replace the existing fossil fuel as clean energy that pure water comes out during combustion, but the existing large-capacity hydrogen production methods emit carbon dioxide during hydrogen production at the same time. There was a downside.

미세조류는 CO2를 포집하여 성장하며, 강한 빛과 더불어 강력한 혐기조건의 조성 시 하이드로게나아제(hydrogenase)를 발현하여 수소를 생산하는 대사체계가 갖추어져 있기 때문에 미세조류를 활용하면 환경친화적인 수소생산시스템의 구축이 가능하다 (Gyeong Taek Gong et al., Korean J. Biotechnol. Bioeng., 18(1):51, 2003; Mi-Sun Kim et. al., Korean J. Biotechnol. Bioeng., 20(6):393, 2005; H. Gaffron, and J. Rubin, J. Gen. Physiol ., 26:219, 1942). 그러나 미세조류를 기반으로 하는 광전환수소생산시스템(MHPS, Microalgae-mediated hydrogen photo-production system)의 생산성은 제한적이기 때문에 현재까지 최적화와 관련하여 많은 연구들이 수행되어왔으며, 앞으로도 지속적인 개발이 필요한 실정이다 (M. L. Ghirardi et al ., Trends Biotechnol ., 18:506, 2000: U. Miura, Process Biochem., 30:1, 1995).Microalgae grows by capturing CO 2 , and have a metabolic system that produces hydrogen by expressing hydrogen through the formation of strong anaerobic conditions and strong anaerobic conditions. (Gyeong Taek Gong et al., Korean J. Biotechnol. Bioeng., 18 (1): 51, 2003; Mi-Sun Kim et. Al., Korean J. Biotechnol. Bioeng., 20 (6) ): 393, 2005; H. Gaffron, and J. Rubin, J. Gen. Physiol ., 26: 219, 1942). However, since the productivity of microalgae-mediated hydrogen photo-production system (MHPS) based on microalgae is limited, many studies on optimization have been conducted until now, and continuous development is needed. (ML Ghirardi et al ., Trends Biotechnol ., 18: 506, 2000: U. Miura, Process Biochem., 30: 1, 1995).

광합성미생물인 클라미도모나스와 같은 미세조류세포는 일반적으로 영양소가 풍부한 배지 내에서 지수생장하다 영양소가 결핍된 상태가 되면(주로 황이나 질소성분의 결핍), 전분이나 지질과 같은 저장성 대사물질들을 세포 내 축적하려는 경향이 있는데, 이때 대체로 클라미도모나스가 생리적 특성상 자가영양조건에서 영양소결핍을 통한 전분을 축적할 수 있는 기간은 24시간 이내로 한정되어 있으며, 이 중 전분은 혐기적 조건에서 발효를 통하여 수소, 에탄올 및 아세테이트와 같은 대사산물들로 전환되며 특히, 광에 의한 발효 시 다른 대사산물들에 비해서 수소로 과반량 전환하여 방출하는 것으로 알려져 있으며, 암발효시 수소보다는 에탄올을 비롯한 다른 유기물로 과반량 전환하여 방출하는 것으로 알려져 있다 (도 1).Microalgae cells, such as photosynthetic microorganisms, such as Chlamydomonas, usually grow exponentially in a nutrient-rich medium. There is a tendency to accumulate internally. At this time, Chlamydomonas can accumulate starch through nutrient deficiency under autotrophic conditions within 24 hours due to physiological characteristics, of which starch is hydrogen through fermentation under anaerobic conditions. , Metabolites such as ethanol and acetate are known to be released in the fermentation process by light, in particular, in the case of fermentation by light, compared with other metabolites. It is known to release and release (FIG. 1).

미세조류를 이용한 수소생산에 절대적인 영향을 미치는 하이드로게나아제(hydrogenase)의 발현은 산소에 매우 민감하기 때문에 혐기조건의 조성이 매우 중요하며(J. R. Benemann, J. Appl . Phycol ., 12:291, 2000), 미세조류 세포 내 광합성에 의하여 축적된 전분(starch)은 세포 내 혐기조건 조성을 위하여 사용되기도 하지만, H+이온에 전자공여체(electron donor) 역할을 하여 H2(수소)로 환원시키는 역할도 한다(A. A. TsygankoV et al ., Int . J. Hydrogen Energ., 31:1574, 2006). 또한, 유기산을 사용하지 않는 자가영양조건에서의 광전환수소생산시스템(autotrophic MHPS)의 경우 유기영양생물들에 의한 오염방지에 효과적이지만 혐기조건에서는 이산화탄소의 고정화로 세포 내 축적된 전분(starch)만이 에너지원으로 사용되기 때문에 이산화탄소만을 이용한 수소생산시스템의 개량을 위해서는 자가영양조건에서 짧은 시간 내에 (24시간 전 후로) 미세조류 내 전분 축적능력을 향상시킬 수 있는 새로운 공정의 개발이 필요하다 (D. D. Wykoff et al ., Plant Physiol., 117:129, 1998).Using microalgae expression dehydrogenase kinase (hydrogenase) on the absolute effect on hydrogen production is the anaerobic tank and the results composition is important because it is very sensitive to oxygen (JR Benemann, J. Appl Phycol, 12:.. 291, 2000) Starch accumulated by photosynthesis in microalgae cells is used for the formation of anaerobic conditions in cells, but also serves to reduce H 2 (hydrogen) by acting as an electron donor to H + ions. AA TsygankoV et al ., Int . J. Hydrogen Energ ., 31: 1574, 2006). In addition, autotrophic MHPS in autotrophic condition without organic acid is effective in preventing contamination by organic nutrients, but in starch anaerobic conditions, only starch accumulated in cells by immobilization of carbon dioxide Since it is used as an energy source, the improvement of hydrogen production system using carbon dioxide only requires the development of a new process that can improve starch accumulation in microalgae within a short time (after 24 hours) under autotrophic conditions (DD Wykoff). et al ., Plant Physiol ., 117: 129, 1998).

이에 본 발명자들은 미세조류의 전분축적을 증가시키고, 축적된 전분을 이용하여 수소 및 에탄올 생산 수율을 향상시키기 위해 예의 노력한 결과, 황결핍 및 낮은 CO2 농도에서 유발되는 이산화탄소농축 메커니즘(CCM, CO2 concentrating mechanism)을 이용하면 클라미도모나스(Chlamydomonas)에서 전분축적이 증가하고, 수소 및 에탄올 생산 수율이 향상되는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
The present inventors have found that increasing the starch accumulation of algae and, courtesy sought results, sulfur deficiency and low CO 2 and ethanol production in order to improve hydrogen yield by using the accumulated starch By using a concentration of carbon dioxide concentration mechanism (CCM, CO 2 concentrating mechanism), Chlamydomonas ( Chlamydomonas ) increases the starch accumulation, hydrogen and ethanol production yield was confirmed to complete the present invention.

본 발명의 목적은 황결핍 및 CO2 농축메커니즘을 통해 미세조류의 전분축적을 증가시키는 방법 및 축적된 전분을 이용한 수소 및 에탄올 고수율 생산 방법을 제공하는 데 있다.
The object of the present invention is sulfur deficiency and CO 2 The present invention provides a method for increasing starch accumulation of microalgae through a concentration mechanism and a high yield of hydrogen and ethanol using accumulated starch.

상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 (a) 미세조류를 3~8%의 높은 CO2 농도에서 늦은 지수기(late exponential phage)단계 까지 배양하는 단계; 및 (b) 0.02~0.05%의 낮은 CO2 농도에서 4시간 동안 유지시켜 CO2 농축메커니즘(CCM ; CO2 concentrating mechanism)을 유발한 다음, 3~8%의 높은 CO2 농도로 20시간 동안 유지시킴과 동시에 황결핍을 통한 미세조류의 성장억제를 통하여 전분축적을 가속화하는 단계를 포함하는 미세조류의 전분생산을 증가시키는 방법을 제공한다. In order to achieve the above object, the present invention comprises the steps of (a) culturing the microalgae to a late exponential phage step at a high CO 2 concentration of 3-8%; And (b) to maintain at a low CO 2 concentration of 0.02 to 0.05% CO 2 for 4 hours Induces a concentration mechanism (CCM; CO 2 concentrating mechanism), and then maintains at a high CO 2 concentration of 3-8% for 20 hours and accelerates starch accumulation by inhibiting growth of microalgae through depletion of sulfur. It provides a method for increasing starch production of microalgae comprising.

본 발명은 또한, (a) 상기 미세조류의 전분생산을 증가시키는 방법으로 전분이 축적된 미세조류를 혐기조건에서 광발효하여 수소를 생산하는 단계; 및 (b) 상기 생성된 수소를 회수하는 단계를 포함하는 미세조류에서 수소를 생산하는 방법을 제공한다. The present invention also provides a method of increasing starch production of microalgae, producing hydrogen by photo-fermenting microalgae in which starch is accumulated under anaerobic conditions; And (b) provides a method for producing hydrogen in the microalgae comprising the step of recovering the generated hydrogen.

본 발명은 또한, (a) 상기 미세조류의 전분생산을 증가시키는 방법으로 전분이 축적된 미세조류를 혐기조건에서 암발효하여 에탄올을 생산하는 단계; 및 (b) 상기 생성된 에탄올을 회수하는 단계를 포함하는 미세조류에서 에탄올을 생산하는 방법을 제공한다.
The present invention also comprises the steps of: (a) a method of increasing starch production of the microalgae to produce ethanol by dark fermentation of starch accumulated microalgae under anaerobic conditions; And (b) provides a method for producing ethanol in the microalgae comprising the step of recovering the produced ethanol.

본 발명의 황결핍 및 CO2 농축메커니즘을 통한 미세조류의 전분축적 능력 향상은 수소 및 에탄올 생산을 증가시킬 뿐만 아니라 온실가스 저감 능력의 향상 및 축적된 전분을 사용하여 다양한 대사 산물들의 생산성을 증가시킬 수 있으므로 산업 전반에 유용하게 사용할 수 있다.
Sulfur deficiency and CO 2 of the present invention Improving the starch accumulation capacity of microalgae through the enrichment mechanism not only increases hydrogen and ethanol production, but also improves the greenhouse gas reduction capacity and can increase the productivity of various metabolites by using accumulated starch. Can be.

도 1은 클라미도모나스의 광발효 시 전분(starch)으로부터 수소 및 에탄올이 생산되는 대사경로를 도식화한 것이다.
도 2는 클라미도모나스의 자가영양조건에서 배양 시 전분축적, 수소 및 에탄올 생산 향상을 위한 공정 개발 모식도를 나타낸 것이다.
도 3은 이산화탄소를 이용한 자가영양조건에서 클라미도모나스의 배양공정시스템의 구축을 도식화한 것이다.
도 4는 클라미도모나스의 자가영양조건에서 대조군과 실험공정 1(experement 1)의 전분축적 과정 및 수소/에탄올 생산 과정을 도식화하고, 생산된 전분, 수소 및 에탄올의 생산량을 비교한 그래프이다.
도 5는 클라미도모나스의 자가영양조건에서 실험공정 1(experement 1) 및 실험공정 2(experement 2)의 전분축적 과정 및 수소/에탄올 생산 과정을 도식화하고, 생산된 전분, 수소 및 에탄올의 생산량을 비교한 그래프이다.
도 6은 클라미도모나스의 자가영양조건에서 실험공정 1(experement 1) 및 실험공정 3(experement 3)의 전분축적 과정 및 수소/에탄올 생산 과정을 도식화하고, 생산된 전분, 수소 및 에탄올의 생산량을 비교한 그래프이다. 1 is a schematic diagram of metabolic pathways in which hydrogen and ethanol are produced from starch during photo-fermentation of Chlamydomonas.
Figure 2 shows a process development schematic diagram for improving starch accumulation, hydrogen and ethanol production in culture under autotrophic conditions of Chlamydomonas.
Figure 3 is a schematic of the construction of Chlamydomonas culture process system under autotrophic conditions using carbon dioxide.
Figure 4 is a graph of the starch accumulation process and hydrogen / ethanol production process of the control and experimental process (experement 1) and the production of starch, hydrogen and ethanol in the autotrophic conditions of Chlamydomonas.
5 is a diagram showing the starch accumulation process and the hydrogen / ethanol production process of experimental process 1 (experement 1) and experimental process 2 (experement 2) in the autotrophic condition of Chlamydomonas, and shows the production of the starch, hydrogen and ethanol produced It is a graph comparing.
FIG. 6 is a diagram illustrating the starch accumulation process and the hydrogen / ethanol production process of the experimental process 1 (experement 1) and the experimental process 3 (experement 3) in the autotrophic condition of Chlamydomonas, and shows the production of the produced starch, hydrogen and ethanol. It is a graph comparing.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. In general, the nomenclature used herein is well known and commonly used in the art.

높은 CO2 농도(5%, v/v) 조건에서 성장해온 미세조류를 낮은 농도의 CO2(Air level, 0.035% (v/v))으로 유지시키면 CO2 농축메커니즘(CCM)이 유발되는 것으로 잘 알려져 있으며, CO2 농축메커니즘이 유발되면 무기탄소원(inorganic carbon source)인 이산화탄소(CO2)와 탄산수소이온(HCO3 -)의 운송 단백질 및 이산화탄소를 고정화하는데 주된 효소인 탄산무수화효소(Carbonic anhydrase)의 발현이 증가하게 된다. 이때, 클라미도모나스에서 CO2 농축메커니즘에 관여하는 단백질들의 활성은 24시간 지속하는 것으로 밝혀졌으며, 그 유발기간은 4시간 정도면 충분한 것으로 밝혀졌다 (A. A. TsygankoV et al ., Int . J. Hydrogen Energ ., 31:1574, 2006; Z. Ramazanov et al ,, Planta, 195:210, 1994; S. Fouchard et al ., Appl . Environ . Microb ., 71:6199, 2005). If maintaining a high CO 2 concentrations (5%, v / v) fine for low concentrations of algae CO 2 (Air level, 0.035% (v / v)) has grown at CO 2 conditions It is well known that a concentration mechanism (CCM) is induced and CO 2 When the enrichment mechanism is triggered, the expression of carbon dioxide (CO 2 ) and hydrogen carbonate (HCO 3 − ) transport proteins and carbon anhydrase, the main enzyme for immobilizing carbon dioxide, is increased. Done. At this time, CO 2 in Chlamydomonas The activity of proteins involved in the enrichment mechanism was found to last 24 hours, and the induction period was found to be sufficient for 4 hours (AA TsygankoV et. al ., Int . J. Hydrogen Energ . , 31: 1574, 2006; Z. Ramazanov et al , Planta , 195: 210, 1994; S. Fouchard et al . , Appl . Environ . Microb . , 71: 6199, 2005).

본 발명은 이러한 특성을 미세조류에 적용하여 4시간 동안 CO2 농축메커니즘 유발과정을 통하여 일차적으로 CO2에 대한 고정화능력을 강화하고, CO2 고정화능력이 증가된 상태에서 다시 고농도의 CO2를 공급하는 동시에 황결핍을 통하여 전분생산을 극대화하였다 (도 2).The present invention applies these characteristics to the microalgae CO 2 for 4 hours Primarily to enhance the immobilization ability of the CO 2 enrichment mechanism caused by the process, and, CO 2 At the same time, the immobilization capacity was increased to supply high concentrations of CO 2 while maximizing starch production through sulfur deficiency (FIG. 2).

본 발명은 일 관점에서, (a) 미세조류를 3~8%의 높은 CO2 농도에서 늦은 지수기(late exponential phage)단계 까지 배양하는 단계; 및 (b) 0.02~0.05%의 낮은 CO2 농도에서 4시간 동안 유지시켜 CO2 농축메커니즘(CCM ; CO2 concentrating mechanism)을 유발한 다음, 3~8%의 높은 CO2 농도로 20시간 동안 유지시킴과 동시에 황결핍을 통한 미세조류의 성장억제를 통하여 전분축적을 가속화하는 단계를 포함하는 미세조류의 전분생산을 증가시키는 방법에 관한 것이다. The present invention in one aspect, (a) culturing the microalgae to late late exponential (late exponential phage) step at a high CO 2 concentration of 3-8%; And (b) to maintain at a low CO 2 concentration of 0.02 to 0.05% CO 2 for 4 hours Induces a concentration mechanism (CCM; CO 2 concentrating mechanism), and then maintains at a high CO 2 concentration of 3-8% for 20 hours and accelerates starch accumulation by inhibiting growth of microalgae through depletion of sulfur. It relates to a method of increasing starch production of microalgae comprising.

본 발명에 있어서, 미세조류는 클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii) UTEX90인 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the microalga is Chlamydomonas Reinhard tiara reinhardtii ) can be characterized as UTEX90.

본 발명의 미세조류는 바람직하게는 녹조류일 수 있으며, 녹조류는 바람직하게는 클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii)일 수 있으나, 이제 한정되지는 않는다. The microalgae of the present invention may preferably be a green alga, and the green alga is preferably Chlamydomonas ( Chlamydomonas). reinhardtii ), but is not limited thereto.

본 발명의 클라미도모나스 레인하드티아이가 일반적으로 높은 CO2 농도에 노출되는 조건은 보통 최소 3% 이상이며, 세포가 과도한 CO2 농도에 노출되어 생육이 저해되는 시점의 농도는 대략 8%이다. 따라서, 본 발명에서 높은 CO2 농도 범위는 바람직하게 3~8%이며, 더욱 바람직하게는 5%인 것을 특징으로 할 수 있다. The Chlamydomonas reinhardtia of the present invention generally have high CO 2 Conditions exposed to concentrations are usually at least 3% or higher, and cells are exposed to excessive CO 2 The concentration at the time when exposure to concentration inhibits growth is approximately 8%. Therefore, high CO 2 in the present invention The concentration range is preferably 3 to 8%, more preferably 5%.

또한, CO2 농축메커니즘의 유발시 낮은 CO2 농도 범위의 경우, 대개 대기 중의 CO2 농도인 약 0.035%의 위아래 수준에서 이루어지며, CO2 농축메커니즘의 유발시 0.05% 이상의 CO2 농도가 공급되면 효과적인 유발이 이루어지지 않아 전분축적 능력이 감소되고, 이에 따라 수소 및 에탄올의 생산수율이 감소한다. 따라서. 본 발명에서 낮은 CO2 농도의 범위는 바람직하게는 0.02~0.05%이며, 더욱 바람직하게는 0.035%인 것을 특징으로 할 수 있다. In addition, CO 2 Low CO 2 at induction of enrichment mechanism For concentration ranges, usually CO 2 in the atmosphere Up and down at a concentration of about 0.035%, CO 2 More than 0.05% CO 2 when inducing enrichment mechanism When the concentration is supplied, effective induction is not achieved, which reduces the starch accumulation capacity, thereby decreasing the yield of hydrogen and ethanol. therefore. Low CO 2 in the present invention The concentration range is preferably 0.02% to 0.05%, and more preferably 0.035%.

본 발명에 있어서, 미세조류는 (a)단계에서는 22~24℃의 온도에서 20~40μmol/m2/s의 빛 세기 조건으로 배양하고, (b)단계에서는 22~24℃의 온도에서 120~140μmol/m2/s의 빛 세기 조건으로 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the microalgae are incubated in a light intensity condition of 20 ~ 40μmol / m 2 / s at a temperature of 22 ~ 24 ℃ in step (a), 120 ~ at a temperature of 22 ~ 24 ℃ in step (b) It may be characterized by culturing in a light intensity condition of 140μmol / m 2 / s.

본 발명의 미세조류에서 전분축적유도 및 수소생산을 위하여 20~40μmol/m2/s의 빛 세기로 배양한 미세조류에 120~140μmol/m2/s 세기의 강한 빛을 조사하는데, 낮은 빛 세기에 적응한 세포를 높은 빛 세기에 노출시키면 황결핍과 더불어 광시스템 II(photosystem II)의 활성이 급속히 감소하여 산소발생이 정지되므로 하이드로게나아제(hydrogenase)의 활성이 유지되어 수소 생산이 증가하게 된다. Irradiating strong light of 120-140μmol / m 2 / s intensity to microalgae incubated with light intensity of 20-40μmol / m 2 / s for starch accumulation induction and hydrogen production in the microalgae of the present invention, low light intensity When exposed to high light intensity, cells that have been adapted to high-intensity light intensity rapidly deplete the activity of photosystem II and stop oxygen production, thus maintaining hydrogenase activity and increasing hydrogen production. .

본 발명에 있어서, 상기 (b)단계의 황결핍은 황성분이 결핍된 배지에서 미세조류를 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the sulfur deficiency of step (b) may be characterized by culturing the microalgae in a medium deficient in sulfur.

본 발명의 황결핍 조건에서는 황함유 아미노산인 시스테인과 메테오닌의 합성이 이루어지지 않고 단백질 합성도 저해를 받기 때문에 미세조류의 성장 억제되어 전분축적능력이 향상되며 또한, 광시스템 II(photosystem II)의 활성도 저해되므로 수소 생산이 증가하게 된다.In the sulfur deficiency condition of the present invention, since the synthesis of sulfur-containing amino acids cysteine and metheonine is not performed and protein synthesis is also inhibited, growth of microalgae is inhibited and the starch accumulation ability is improved. Activity is also inhibited, increasing hydrogen production.

본 발명의 황결핍 및 CO2 농축메커니즘을 통한 미세조류의 전분축적을 증가시키는 방법은 축적된 전분을 이용하여 수소 및 에탄올을 생산할 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 전분을 탄소원으로 하여 생산되는 바이오에너지를 제공할 수 있다.Sulfur deficiency and CO 2 of the present invention The method of increasing the starch accumulation of the microalgae through a concentration mechanism may produce hydrogen and ethanol using the accumulated starch, but is not limited thereto, and may provide bioenergy produced using starch as a carbon source.

본 발명은 다른 관점에서, (a) 상기 미세조류의 전분생산을 증가시키는 방법으로 전분이 축적된 미세조류를 혐기조건에서 광발효하여 수소를 생산하는 단계; 및 (b) 상기 생성된 수소를 회수하는 단계를 포함하는 미세조류에서 수소를 생산하는 방법에 관한 것이다. In another aspect, the present invention provides a method of increasing starch production of microalgae, producing hydrogen by photo-fermenting microalgae in which starch is accumulated under anaerobic conditions; And (b) relates to a method for producing hydrogen in the microalgae comprising the step of recovering the generated hydrogen.

본 발명에 있어서, 상기 (a)단계의 광발효는 22~24℃의 온도에서 120~140μmol/m2/s의 빛 세기 조건으로 배양하는 것을 특징으로 한다. In the present invention, the photo-fermentation of the step (a) is characterized in that incubated in the light intensity conditions of 120 ~ 140μmol / m 2 / s at a temperature of 22 ~ 24 ℃.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 미세조류의 전분생산을 증가시키는 방법으로 전분이 축적된 미세조류를 혐기조건에서 암발효하여 에탄올을 생산하는 단계; 및 (b) 상기 생성된 에탄올을 회수하는 단계를 포함하는 미세조류에서 에탄올을 생산하는 방법에 관한 것이다. In another aspect, the present invention provides a method of increasing starch production of the microalgae, the method comprising the steps of dark fermentation of starch accumulated microalgae under anaerobic conditions to produce ethanol; And (b) relates to a method for producing ethanol in microalgae comprising the step of recovering the ethanol produced.

본 발명에 있어서, 상기 (a)단계의 암발효는 29~31℃의 온도에서 빛을 차단한 상태로 배양하는 것을 특징으로 한다.In the present invention, the dark fermentation of step (a) is characterized in that the culture in a state of blocking the light at a temperature of 29 ~ 31 ℃.

본 발명의 일 실시예에서, 미세조류에서 전분축적을 증가시키고 축적된 전분을 이용하여 수소 및 에탄올의 생산 수율을 향상시키기 위하여 CO2 농축메커니즘 및 황결핍을 이용하여 미세조류를 배양하였다 (실험공정 1). 클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii) UTEX 90을 12시간(광):12시간(암) 광주기 조건으로 30μmol/m2/s세기의 빛에서 5%(v/v) 이산화탄소 및 23℃ 조건으로 TAP-C 배지를 이용하여 배양하였다. 미세조류가 늦은 지수기(late exponential phage)단계에 접어들면 전분축적유도 및 수소생산을 위하여 130μmol/m2/s세기의 빛을 조사하였으며, CO2 농축메커니즘(CCM ; CO2 concentrating mechanism)을 유발시키기 위해 CO2의 농도를 대기의 수준 (0.035%)으로 낮추어 4시간 동안 세포를 유지시켜 미세조류의 CO2에 대한 친화도 및 고정화능력을 증가시켰다. 그 다음 다시 5% CO2를 20시간 동안 재공급하였으며, 이때 전분축적을 가속화하기 위하여 기존의 배지를 TAP-S로 교체하여 황결핍을 동시에 진행하였다. 전분이 축적된 미세조류를 혐기상태에서 배양하여 수소를 생산하기 위해 질소가스를 이용하여 배지 내 산소를 제거한 후 혐기챔버안에서 세포배양액을 혐기용 배양기로 옮긴 다음 23℃의 온도에서 130μmol/m2/s의 빛 세기 조건으로 광발효(light-fermentation)를 하여 수소를 생산하였다.실험 공정 1에 의한 방법으로 미세조류에서 자가영양조건에서 광발효(light-fermentation)에 의한 수소를 생산한 결과, CO2 농축메커니즘 및 황결핍에 의해 전분축적 능력이 기존의 방법보다 80% 향상되었으며, 미세조류 내 전분축적 능력이 향상됨에 따라 수소의 생산율도 160%(2.6배)향상되었다 (도 4). In one embodiment of the present invention, CO 2 is used to increase the starch accumulation in the microalgae and to improve the production yield of hydrogen and ethanol using the accumulated starch. Microalgae were cultured using the concentration mechanism and the lack of sulfur (Experimental Step 1). Chlamydomonas reinhardtii UTEX 90 was subjected to 5% (v / v) carbon dioxide and 23 ° C. at 12 μmol / m 2 / s light at 12 hours (light): 12 hours (dark) photoperiod. Cultured using TAP-C medium. Microalgae have been investigated 130μmol / m light of 2 / s century for example starch fold induction and accumulation of hydrogen produced in the late exponential phase period (late exponential phage), CO 2 To induce a concentration mechanism (CCM; CO 2 concentrating mechanism), the concentration of CO 2 was lowered to atmospheric level (0.035%) to maintain cells for 4 hours to increase the affinity and immobilization ability of CO 2 for CO 2 . . Then, 5% CO 2 was resupplied for 20 hours, and in order to accelerate starch accumulation, sulfur deficiency was simultaneously performed by replacing the existing medium with TAP-S. In order to produce hydrogen by culturing the microalgae accumulated starch in the anaerobic state to remove oxygen in the medium using nitrogen gas, transfer the cell culture solution to the anaerobic incubator in the anaerobic chamber and then 130μmol / m 2 / at a temperature of 23 ℃ Hydrogen was produced by light-fermentation under the light intensity condition of s. As a result of producing hydrogen under light-fermentation under autotrophic conditions in microalgae by the method according to Experimental Process 1, CO was produced. 2 The starch accumulation capacity was improved by 80% compared to the conventional method by the enrichment mechanism and the lack of sulfur, and the production rate of hydrogen was also improved by 160% (2.6 times) as the starch accumulation capacity was improved in the microalgae (FIG. 4).

또한, 실험공정 1에 의한 방법으로 자가영양조건에서 미세조류를 배양하여 세포배양액을 혐기용 배양기로 옮긴 다음 30℃의 온도에서 암발효(dark-fermentation)를 하여 에탄올을 생산한 결과, 80% 향상되었으며, 미세조류 내 전분축적 능력이 향상됨에 따라 에탄올의 생산율도 80%(1.8배)향상되었다 (도 4). In addition, by culturing the microalgae in the autotrophic conditions by the method according to the experimental step 1, the cell culture medium was transferred to the anaerobic incubator, and then ethanol was produced by dark fermentation at a temperature of 30 ° C., resulting in an 80% improvement. As the starch accumulation capacity in the microalgae was improved, the production rate of ethanol was also improved by 80% (1.8 times) (FIG. 4).

본 발명의 실험공정 1의 방법에 대한 효과를 검증하기 위하여 실험공정 2 및 실험공정3과 비교실험을 실시하였다. 실험공정 2에서는 CO2 농축메커니즘(CCM ; CO2 concentrating mechanism)을 유발시키기 위해 CO2의 농도를 대기의 수준 (0.035%)으로 낮추어 배양하는 단계에서 황성분이 제거된 배지로 교환하여 탄소농축메커니즘과 황결핍을 동시에 진행한 후, 다시 높은 농도의 CO2를 주입하여 전분축적을 하였으며, 실험공정 3에서는 실험공정 2와 마찬가지로 탄소농축메커니즘과 황결핍을 동시에 진행한 후 계속 낮은 CO2 농도에서 배양하여 전분축적을 하였다. In order to verify the effect of the method of Experiment Step 1 of the present invention, a comparative experiment with Experiment Step 2 and Experiment Step 3 was conducted. In Experiment 2, CO 2 In order to induce a concentration mechanism (CCM; CO 2 concentrating mechanism), the concentration of CO 2 was reduced to atmospheric level (0.035%), and the carbon enrichment mechanism and sulfur deficiency were simultaneously performed by exchanging with sulfur-free medium. After that, high concentration of CO 2 was injected again to carry out starch accumulation. In Experimental Process 3, as in Experimental Process 2, the carbon enrichment mechanism and sulfur deficiency were simultaneously performed, and the culture was continued at low CO 2 concentration for starch accumulation.

전분이 축적된 미세조류를 혐기적 상태에서 23℃의 온도, 130μmol/m2/s의 빛 세기 조건으로 광발효(light-fermentation)를 하여 수소를 생산한 결과, 실험공정 2 및 실험공정 3에서 이산화탄소저장 메커니즘의 유발과 황결핍의 동시적용은 전분축적 및 수소생산의 향상효과를 확인할 수 없었으며(도 5 및 도 6), 오히려 대조군보다 낮은 전분축적 및 수소생산성을 보였다. 또한, 전분이 축적된 미세조류를 혐기적 상태에서 30℃의 온도로 빛을 차단시켜 암발효(dark-frementation)하여 에탄올을 생산한 결과, 수소생산 공정과 마찬가지로, 실험공정 2 및 실험공정 3에서 이산화탄소저장 메커니즘의 유발과 황결핍의 동시적용은 전분축적 및 에탄올 생산의 향상효과를 확인할 수 없었으며(도 5 및 도 6), 오히려 대조군보다 낮은 전분축적 및 에탄올 생산성을 보였다. 이와 같은 결과는 황결핍에 따른 전분축적기작과 CO2 농축메커니즘의 유발에 따른 전분축적 기작의 교란에 따른 결과로 추정된다.
Hydrogen was produced by light-fermentation of starch-accumulated microalgae under anaerobic conditions at a temperature of 23 ° C. and a light intensity of 130 μmol / m 2 / s. Induction of carbon dioxide storage mechanism and simultaneous application of sulfur deficiency could not confirm the effect of improving starch accumulation and hydrogen production (FIGS. 5 and 6), but rather showed lower starch accumulation and hydrogen productivity than the control group. In addition, as a result of dark-frementation of ethanol by blocking light at a temperature of 30 ° C. under anaerobic conditions, the microalgae accumulated in starch were produced in the same manner as in the hydrogen production process. Induction of carbon dioxide storage mechanism and simultaneous application of sulfur deficiency could not confirm the improvement of starch accumulation and ethanol production (FIGS. 5 and 6), but rather showed lower starch accumulation and ethanol productivity than the control group. These results are presumed to be the result of disturbance of starch accumulation mechanism caused by sulfur deficiency and CO 2 enrichment mechanism.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these examples are for illustrative purposes only and that the scope of the present invention is not construed as being limited by these examples.

실시예Example 1: 미세조류에서 전분축적 및 수소/에탄올 생산 수율을 향상 1: Improve starch accumulation and yield of hydrogen / ethanol in microalgae

미세조류에서 전분축적을 증가시키고 축적된 전분을 이용하여 수소 및 에탄올의 생산 수율을 향상시키기 위하여 CO2 농축메커니즘 및 황결핍을 이용하여 미세조류를 배양하였다 (실험공정 1). CO 2 to increase starch accumulation in microalgae and to improve production yield of hydrogen and ethanol using accumulated starch Microalgae were cultured using the concentration mechanism and the lack of sulfur (Experimental Step 1).

먼저, 클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii) UTEX 90을 30μmol/m2/s세기의 빛을 12시간(광):12시간(암) 광주기 조건으로 5% CO2 및 23℃ 조건에서 TAP-C 배지를 이용하여 배양하였다. 미세조류가 늦은 지수기(late exponential phage)단계에 접어들면 전분축적유도 및 수소생산을 위하여 130μmol/m2/s세기의 빛을 조사하였으며, CO2 농축메커니즘(CCM ; CO2 concentrating mechanism)을 유발시키기 위해 CO2의 농도를 대기의 수준 (0.035%)으로 낮추어 4시간 동안 세포를 배양시켜 미세조류의 CO2에 대한 친화도 및 고정화능력을 증가시켰다. 그 다음 다시 5% CO2를 20시간 동안 재공급하였으며, 이때 전분축적을 가속화하기 위하여 기존의 배지를 TAP-S(표 1)로 교체하여 황결핍을 동시에 진행하였다.
First, Tlam Chlamydomonas reinhardtii UTEX 90 was lighted at 30 μmol / m 2 / s for 12 hours (light): 12 hours (dark) at 5% CO 2 and 23 ° C. Cultured using -C medium. Microalgae have been investigated 130μmol / m light of 2 / s century for example starch fold induction and accumulation of hydrogen produced in the late exponential phase period (late exponential phage), CO 2 To induce the CO 2 concentrating mechanism (CCM), the concentration of CO 2 was lowered to atmospheric level (0.035%) and the cells were incubated for 4 hours to increase the affinity and immobilization ability of CO 2 for CO 2 . . Then, 5% CO 2 was resupplied for 20 hours, and in order to accelerate starch accumulation, the existing medium was replaced with TAP-S (Table 1) to simultaneously proceed with sulfur deficiency.

TAP-C 및 TAP-S의 배지 조성Medium composition of TAP-C and TAP-S TAP-CTAP-C TAP-STAP-S 성분ingredient 함량(/ℓ)Content (/ ℓ) 성분ingredient 함량(/ℓ)Content (/ ℓ) Tris baseTris base 2.42ｇ2.42 g Tris baseTris base 2.42ｇ2.42 g TAP-salts
(per liter)
NH4Cl 15 g
MgSO4 H2O 4 g
CaCl2 H2O 2 gTAP-salts
(per liter)
NH 4 Cl 15 g
MgSO 4 H 2 O 4 g
CaCl 2 H 2 O 2 g 25㎖25 ml TAP-salts
(per liter)
NH4Cl 15 g
MgCl2 H2O 4 g
CaCl2 H2O 2 gTAP-salts
(per liter)
NH 4 Cl 15 g
MgCl 2 H 2 O 4 g
CaCl 2 H 2 O 2 g 25㎖ 25 ml Phosphate solution
(per liter)
K2HPO4 288 g
KH2PO4 144 gPhosphate solution
(per liter)
K 2 HPO 4 288 g
KH 2 PO 4 144 g 1㎖ 1 ml Phosphate solution
(per liter)
K2HPO4 288 g
KH2PO4 144 gPhosphate solution
(per liter)
K 2 HPO 4 288 g
KH 2 PO 4 144 g 1㎖1 ml Trace elements solution (Hunter trace elements)
(per liter)
Na2EDTA H2O 50 g
ZnSO4 H2O 22 g
H3BO3 11.4 g
MnCl2 H2O 5 g
FeSO4 H2O 5 g
CoCl2 H2O 1.6 g
CuSO4 H2O 1.6 g
(NH4)6Mo7O24 H2O 1.1 gTrace elements solution (Hunter trace elements)
(per liter)
50 g Na 2 EDTA H 2 O
ZnSO 4 H 2 O 22 g
H 3 BO 3 11.4 g
MnCl 2 H 2 O 5 g
FeSO 4 H 2 O 5 g
CoCl 2 H 2 O 1.6 g
CuSO 4 H 2 O 1.6 g
(NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 H 2 O 1.1 g 1㎖ 1 ml Trace elements solution (Hunter trace elements)
(per liter)
Na2EDTA H2O 50 g
ZnCl2 H2O 22 g
H3BO3 11.4 g
MnCl2 H2O 5 g
FeCl3 H2O 5 g
CoCl2 H2O 1.6 g
CuCl4 H2O 1.6 g
(NH4)6Mo7O24 H2O 1.1 gTrace elements solution (Hunter trace elements)
(per liter)
50 g Na 2 EDTA H 2 O
ZnCl 2 H 2 O 22 g
H 3 BO 3 11.4 g
MnCl 2 H 2 O 5 g
FeCl 3 H 2 O 5 g
CoCl 2 H 2 O 1.6 g
CuCl 4 H 2 O 1.6 g
(NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 H 2 O 1.1 g 1㎖ 1 ml

전분이 축적된 미세조류를 혐기상태에서 배양하여 수소를 생산하기 위해 질소가스를 이용하여 배지 내 산소를 제거한 후 혐기챔버안에서 세포배양액을 혐기용 배양기로 옮긴 다음 23℃의 온도에서 130μmol/m2/s의 빛 세기 조건으로 광발효(light-fermentation)를 하여 수소를 생산하였다.In order to produce hydrogen by culturing the microalgae accumulated starch in the anaerobic state to remove oxygen in the medium using nitrogen gas, transfer the cell culture solution to the anaerobic incubator in the anaerobic chamber and then 130μmol / m 2 / at a temperature of 23 ℃ Hydrogen was produced by light-fermentation under light intensity conditions of s.

대조군은 5% CO2 조건에서 TAP-S 배지로 교체하여 황결핍에 24시간 배양하였으며, 이후 상기와 같은 방법을 이용하여 혐기용 배양기로 옮긴 후 30μmol/m2/s세기의 빛 세기에서 광유발을 하여 23℃에서 배양하여 수소를 생산하였다.The control group was incubated for 24 hours in sulfur deficiency by replacing with TAP-S medium at 5% CO 2 condition, and then transferred to an anaerobic incubator using the same method, followed by photoinduction at a light intensity of 30 μmol / m 2 / s. Incubated at 23 ℃ to produce hydrogen.

실험공정 1에 의한 방법으로 자가영양조건에서 미세조류를 배양하여 광발효(light-fermentation)에 의한 수소를 생산한 결과, CO2 농축메커니즘 및 황결핍에 의해 전분축적 능력이 기존의 방법보다 80% 향상되었으며, 미세조류 내 전분축적 능력이 향상됨에 따라 수소의 생산율도 160%(2.6배)향상되었다 (도 4). The method according to the experimental result of the step 1 self culturing algae in a nutrient conditions to produce hydrogen by light fermentation (light-fermentation), CO 2 The starch accumulation capacity was improved by 80% compared to the conventional method by the enrichment mechanism and the lack of sulfur, and the production rate of hydrogen was also improved by 160% (2.6 times) as the starch accumulation capacity was improved in the microalgae (FIG. 4).

또한, 실험공정 1에 의한 방법으로 자가영양조건에서 미세조류를 배양하여 세포배양액을 혐기용 배양기로 옮긴 다음 30℃의 온도에서 암발효(dark-fermentation)를 하여 에탄올을 생산한 결과, 80% 향상되었으며, 미세조류 내 전분축적 능력이 향상됨에 따라 에탄올의 생산율도 80%(1.8배)향상되었다 (도 4).
In addition, by culturing the microalgae in the autotrophic conditions by the method according to the experimental step 1, the cell culture medium was transferred to the anaerobic incubator, and then ethanol was produced by dark fermentation at a temperature of 30 ° C., resulting in an 80% improvement. As the starch accumulation ability in the microalgae was improved, the production rate of ethanol was also improved by 80% (1.8 times) (FIG. 4).

비교예Comparative Example 1 : 실험공정 1 및 실험공정 2의 전분축적 및 수소/에탄올 생산성 비교 1: Comparison of Starch Accumulation and Hydrogen / Ethanol Productivity in Experimental Process 1 and Experimental Process 2

상기 실시예 1의 실험공정 1의 방법에 대한 효과를 검증하기 위하여 다음의 실험공정 2와 비교실험을 실시하였다. In order to verify the effect on the method of Experimental Step 1 of Example 1, a comparative experiment with Experimental Step 2 was performed.

실험공정 2에서는 상기 실험공정 1과 동일한 방법으로 클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii) UTEX 90을 TAP-C 배지를 이용하여 배양하였다. 미세조류가 늦은 지수기(late exponential phage)단계에 접어들면 전분축적유도 및 수소생산을 위하여 130μmol/m2/s세기의 빛을 조사하였으며, CO2 농축메커니즘(CCM ; CO2 concentrating mechanism)을 유발시키기 위해 CO2의 농도를 대기의 수준 (0.035%)으로 낮추어 4시간 동안 미세조류를 배양하였으며, 이때 전분축적을 가속화하기 위하여 기존의 배지를 TAP-S로 교체하여 황결핍을 동시에 진행하였다. 그 후 다시 5% CO2를 20시간 동안 재공급하였으며, 실험공정 1과 마찬가지로 전분이 축적된 미세조류를 혐기상태에서 배양하여 수소를 생산하기 위해 질소가스를 이용하여 배지 내 산소를 제거한 후 혐기챔버안에서 세포배양액을 혐기용 배양기로 옮긴 다음 23℃의 온도에서 130μmol/m2/s의 빛 세기 조건으로 광발효(light-fermentation)를 하여 수소를 생산하였다. In Experimental Step 2, Chlamydomonas reinhardtii UTEX 90 was cultured using the TAP-C medium in the same manner as in Experimental Step 1. Microalgae have been investigated 130μmol / m light of 2 / s century for example starch fold induction and accumulation of hydrogen produced in the late exponential phase period (late exponential phage), CO 2 In order to induce a concentration mechanism (CCM; CO 2 concentrating mechanism), the microalgae were incubated for 4 hours by lowering the concentration of CO 2 to the atmospheric level (0.035%). The yellow deficiency was performed at the same time by replacing with S. After that, 5% CO 2 was resupplied for 20 hours, and in the same way as in Experiment 1, starch accumulated microalgae were cultured in anaerobic state to remove hydrogen in the medium using nitrogen gas and then anaerobic chamber. The cell culture solution was transferred to an anaerobic incubator, and hydrogen was produced by light-fermentation at a light intensity of 130 μmol / m 2 / s at a temperature of 23 ° C.

또한, 실험공정 1 및 실험공정 2의 방법으로 미세조류를 배양하여 세포배양액을 혐기용 배양기로 옮긴 다음 30℃의 온도에서 암발효(dark-fermentation)를 하여 에탄올을 생산하였다. In addition, by culturing the microalgae by the method of Experimental Process 1 and Experimental Process 2, the cell culture solution was transferred to the anaerobic incubator, and then ethanol was produced by dark fermentation at a temperature of 30 ° C.

그 결과, 실험공정 2에서의 CO2 농축메커니즘의 유발과 황결핍의 동시적용은 전분축적 및 수소/에탄올 생산의 향상효과를 확인할 수 없었으며(도 5), 오히려 실시예 1의 대조군보다 낮은 전분축적 및 수소/에탄올 생산성을 보였다. 이와 같은 결과는 황결핍에 따른 전분축적 기작과 CO2 농축메커니즘의 유발에 따른 전분축적 기작의 교란에 따른 결과로 추정된다.
As a result, CO 2 in Experimental Step 2 Induction of concentration mechanism and simultaneous application of sulfur deficiency could not confirm the effect of improving starch accumulation and hydrogen / ethanol production (FIG. 5), but rather showed lower starch accumulation and hydrogen / ethanol productivity than the control of Example 1. These results indicate that starch accumulation mechanism and CO 2 It is assumed that the result of disturbance of starch accumulation mechanism caused by the induction of enrichment mechanism.

비교예Comparative Example 2 : 실험공정 1 및 실험공정 3의 전분축적 및 수소/에탄올 생산성 비교 2: Comparison of Starch Accumulation and Hydrogen / Ethanol Productivity in Experimental Process 1 and Experimental Process 3

상기 실시예 1의 실험공정 1의 방법에 대한 효과를 검증하기 위하여 다음의 실험공정 3과 비교실험을 실시하였다. In order to verify the effect on the method of Experimental Step 1 of Example 1, a comparative experiment with Experimental Step 3 was performed.

실험공정 3에서는 상기 실험공정 1과 동일한 방법으로 클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii) UTEX 90을 TAP-C 배지를 이용하여 배양하였다. 미세조류가 늦은 지수기(late exponential phage)단계에 접어들면 전분축적유도 및 수소생산을 위하여 130μmol/m2/s세기의 빛을 조사하였으며, CO2 농축메커니즘(CCM ; CO2 concentrating mechanism)을 유발시키기 위해 CO2의 농도를 대기의 수준 (0.035%)으로 낮추어 24시간 동안 세포에 노출시켰으며, 이때 전분축적을 가속화하기 위하여 기존의 배지를 TAP-S로 교체하여 황결핍을 동시에 진행하였다. 전분축적이 완료된 후에는 실험공정 1과 마찬가지로 전분이 축적된 미세조류를 혐기상태에서 배양하여 수소를 생산하기 위해 질소가스를 이용하여 배지 내 산소를 제거한 후 혐기챔버안에서 세포배양액을 혐기용 배양기로 옮긴 다음 23℃의 온도에서 130μmol/m2/s의 빛 세기 조건으로 광발효(light-fermentation)를 하여 수소를 생산하였다.In Experiment 3, Chlamydomonas reinhardtii UTEX 90 was cultured using TAP-C medium in the same manner as in Experiment 1. Microalgae have been investigated 130μmol / m light of 2 / s century for example starch fold induction and accumulation of hydrogen produced in the late exponential phase period (late exponential phage), CO 2 Concentrated mechanism (CCM; CO 2 concentrating mechanism), a stylized exposed to cells for 24 hours by lowering the concentration of CO 2 to a level (0.035%) in the atmosphere to cause, TAP- The existing culture medium in order to accelerate the accumulation of starch The yellow deficiency was performed at the same time by replacing with S. After starch accumulation was completed, the microalgae accumulated with starch were cultured in anaerobic condition as in Experiment 1 to remove oxygen in medium using nitrogen gas, and then, the cell culture solution was transferred to the anaerobic incubator in an anaerobic chamber. Next, hydrogen was produced by light-fermentation at a light intensity of 130 μmol / m 2 / s at a temperature of 23 ° C.

또한, 실험공정 1 및 실험공정 3의 방법으로 미세조류를 배양하여 세포배양액을 혐기용 배양기로 옮긴 다음 30℃의 온도에서 암발효(dark-fermentation)를 하여 에탄올을 생산하였다. In addition, by culturing the microalgae in the method of Experiment 1 and Experiment 3, the cell culture was transferred to the anaerobic incubator and then ethanol was produced by dark fermentation at a temperature of 30 ° C.

그 결과, 실험공정 3의 CO2 농축메커니즘의 유발과 황결핍의 동시적용은 비교예 1의 실험공정 2와 마찬가지로 전분축적 및 수소/에탄올 생산의 향상효과를 확인할 수 없었으며(도 6), 오히려 실시예 1의 대조군보다 낮은 전분축적 및 수소/에탄올 생산성을 보였다. 이를 통하여 낮은 CO2 농도를 매개로 CO2 농축메커니즘 및 영양소결핍(황결핍)에 의한 전분축적공정의 동시적용은 오히려 전분축적 및 수소/에탄올 생산에 있어서 효과적이지 못함을 확인하였다.
As a result, CO 2 of Experimental Step 3 Induction of thickening mechanism and simultaneous application of sulfur deficiency could not confirm the effect of improving starch accumulation and hydrogen / ethanol production as in Experiment 2 of Comparative Example 1 (FIG. 6), but rather lower starch accumulation than the control of Example 1 And hydrogen / ethanol productivity. This allows low CO 2 CO 2 via concentration Simultaneous application of starch accumulation process by enrichment mechanism and nutrient deficiency (sulfur deficiency) was found to be ineffective in starch accumulation and hydrogen / ethanol production.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. While the present invention has been particularly shown and described with reference to specific embodiments thereof, those skilled in the art will appreciate that such specific embodiments are merely preferred embodiments and that the scope of the present invention is not limited thereby. something to do. It is therefore intended that the scope of the invention be defined by the claims appended hereto and their equivalents.

Claims (8)

다음의 단계를 포함하는 미세조류의 전분축적을 증가시키는 방법:
(a) 미세조류를 3~8%의 높은 CO2 농도에서 늦은 지수기(late exponential phage)단계 까지 배양하는 단계; 및
(b) 0.02~0.05%의 낮은 CO2 농도에서 4시간 동안 유지시켜 CO2 농축메커니즘(CCM ; CO2 concentrating mechanism)을 유발한 다음, 3~8%의 높은 CO2 농도로 20시간 동안 유지시킴과 동시에 황결핍을 통한 미세조류의 성장억제를 통하여 전분축적을 가속화하는 단계.
A method of increasing starch accumulation in microalgae comprising the following steps:
(a) culturing the microalgae to a late exponential phage step at high CO 2 concentrations of 3-8%; And
(b) kept at a low CO 2 concentration of 0.02 to 0.05% CO 2 for 4 hours Inducing a concentration mechanism (CCM; CO 2 concentrating mechanism), followed by maintaining the high CO 2 concentration of 3-8% for 20 hours and accelerating starch accumulation by inhibiting the growth of microalgae through sulfur deficiency.
제1항에 있어서, 미세조류는 클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii) UTEX90인 것을 특징으로 하는 미세조류의 전분축적을 증가시키는 방법.
The method of claim 1 wherein the microalgae is Chlamydomonas reinhardtii UTEX90.
제1항에 있어서, 미세조류는 (a)단계에서는 22~24℃의 온도에서 20~40μmol/m2/s의 빛 세기 조건으로 배양하고, (b)단계에서는 22~24℃의 온도에서 120~140μmol/m2/s의 빛 세기 조건으로 배양하는 것을 특징으로 하는 미세조류의 전분축적을 증가시키는 방법.
According to claim 1, The microalgae are incubated in a light intensity condition of 20 ~ 40μmol / m 2 / s at a temperature of 22 ~ 24 ℃ in step (a), 120 in a temperature of 22 ~ 24 ℃ in step (b) A method of increasing the starch accumulation of microalgae, which is incubated at a light intensity condition of ˜140 μmol / m 2 / s.
제1항에 있어서, 상기 (b)단계의 황결핍은 황성분이 결핍된 배지에서 미세조류를 배양하는 것을 특징으로 하는 미세조류의 전분축적을 증가시키는 방법.
The method of claim 1, wherein the sulfur deficiency of the step (b) is to increase the starch accumulation of the microalgae, characterized in that the culture of the microalgae in a medium lacking sulfur.
다음의 단계를 포함하는 미세조류에서 수소를 생산하는 방법:
(a) 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 방법으로 전분이 축적된 미세조류를 혐기조건에서 광발효하여 수소를 생산하는 단계; 및
(b) 상기 생성된 수소를 회수하는 단계.
Hydrogen production in microalgae comprising the following steps:
(a) producing hydrogen by photo-fermenting the microalgae in which starch is accumulated under anaerobic conditions by the method of any one of claims 1 to 4; And
(b) recovering the generated hydrogen.
제5항에 있어서, 상기 (a)단계의 광발효는 22~24℃의 온도에서 120~140μmol/m2/s의 빛 세기 조건으로 배양하는 것을 특징으로 하는 미세조류에서 수소를 생산하는 방법.
The method of claim 5, wherein the photo-fermentation of the step (a) is a method of producing hydrogen in microalgae, characterized in that the culture at a light intensity of 120 ~ 140μmol / m 2 / s at a temperature of 22 ~ 24 ℃.
다음의 단계를 포함하는 미세조류에서 에탄올을 생산하는 방법:
(a) 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 방법으로 전분이 축적된 미세조류를 혐기조건에서 암발효하여 에탄올을 생산하는 단계; 및
(b) 상기 생성된 에탄올을 회수하는 단계.
Process for producing ethanol in microalgae comprising the following steps:
(a) producing ethanol by fermenting microalgae in which starch is accumulated under anaerobic conditions by the method of any one of claims 1 to 4; And
(b) recovering the produced ethanol.
제7항에 있어서, 상기 (a)단계의 암발효는 29~31℃의 온도에서 빛을 차단한 상태로 배양하는 것을 특징으로 하는 미세조류에서 에탄올을 생산하는 방법.According to claim 7, wherein the fermentation of the step (a) is a method for producing ethanol in microalgae, characterized in that the culture in a state of blocking the light at a temperature of 29 ~ 31 ℃.
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