KR20130138948A - Method of porous hydrogel scaffold for osteanagenesis - Google Patents

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Abstract

Disclosed is a method for manufacturing a porous hydrogel scaffold for osteanagenesis. The present invention can includes a step of dissolving gelatin (10 w/v %, 300 Bloom) in distilled water, a step of preparing mixed slurry by mixing pectin (5 w/v %) with the gelatin solution, a step of mixing the mixed slurry, a step of injecting the mixed slurry into a mold, a step of refrigerating the polyethylene mold filled with the mixed slurry to -80 deg. C and freeze-drying the mixed slurry at -70 deg. C, and a step of cross-linking the dried mixed slurry. The present invention can obtain a biological mimic scaffold having improved biocompatibility and biodegradation properties.

Description

골 재생을 위한 다공성 하이드로젤 지지체의 제조방법{METHOD OF POROUS HYDROGEL SCAFFOLD FOR OSTEANAGENESIS}Method for producing porous hydrogel support for bone regeneration {METHOD OF POROUS HYDROGEL SCAFFOLD FOR OSTEANAGENESIS}

본 발명은 골재생을 위한 다공성 하이드로젤 지지체의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 젤라틴-펙틴 하이드로젤과 이상인산칼슘(BCP)을 이용하여 생체적합성이 우수하고, 생분해성과 생체모방성 미세환경을 가지며, 골재생 공학에 응용가능한 새로운 구조를 갖는 골재생을 위한 다공성 하이드로젤 지지체의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing a porous hydrogel support for bone regeneration, and more specifically, using a gelatin-pectin hydrogel and bicalcium phosphate (BCP), excellent biocompatibility, biodegradability and biomimetic microenvironment It relates to a method for producing a porous hydrogel support for bone regeneration having a new structure applicable to bone regeneration engineering.

하이드로젤은 고분자로 이루어진 3D 네트워크 형태로 많은 양의 수분을 흡수하고 있다. 이러한 하이드로젤은 높은 수분 흡수량과 우수한 생분해성, 약물과 영양분의 저장 공간 확보 및 세포의 부동화, 세포의 부착 및 조직의 생성을 증진시키기 위해 적합한 기계적 강도, 우수한 생체적합성을 가지고 있다. 그리고, 독성이 없어 동물 실험에도 수행되고 있으며 세포 배양을 위한 영양분 및 세포의 대사산물의 확산을 위한 미세환경을 생성하는 등의 특성으로 최근까지 조직 공학 분야에서 널리 사용되고 있다.Hydrogel absorbs large amounts of water in the form of a 3D network of polymers. These hydrogels have high mechanical absorption and excellent biocompatibility to enhance high water absorption and excellent biodegradability, to secure storage space for drugs and nutrients, and to promote cell immobilization, cell adhesion and tissue formation. In addition, it has been used in animal experiments because it is not toxic and has been widely used in tissue engineering until recently due to its characteristics such as generating a microenvironment for diffusion of nutrients and metabolites of cells.

또한, 하이드로젤을 제조하기 위하여 온도 감응성 고분자를 사용하며 물리적 또는 화학적 가교를 기초로 하는 다양한 방법이 있으며, 최근에는 조직의 상호작용을 증진시키기 위한 목적으로 고분자와 세라믹을 혼합하여 개발하는 방법이 적용되고 있다.In addition, there are a variety of methods based on physical or chemical crosslinking, using temperature sensitive polymers to prepare hydrogels, and recently, a method of mixing polymers and ceramics for the purpose of enhancing the interaction of tissues is applied. It is becoming.

이상인산칼슘(BCP: biphasic calcium phosphate) 세라믹은 수산화인회석(Hydroxyapatite(HAp))와 인산삼칼슘(Tricalcium Phosphate(TCP))가 혼합된 물질로서 분해성이 조절 가능하며 우수한 생물학적 특성으로 이상적인 치과 임플란트 및 본 필러(bone filler) 등 정형외과용 골 충진제로 적용되고 있다.Biphasic calcium phosphate (BCP) ceramic is a mixture of hydroxyapatite (HAp) and tricalcium phosphate (TCP), which is degradable and has excellent biological properties, making it an ideal dental implant and bone It is applied as an orthopedic bone filler such as a filler (bone filler).

젤라틴(Gelatin: GE)은 가수분해에 의하여 콜라겐의 3층 나선구조를 파괴하여 얻어지며, 세포의 부착 및 이동, 분화 및 증식을 증진시키는 특성을 가진다.Gelatin (GE) is obtained by destroying the three-layered spiral structure of collagen by hydrolysis, and has properties that promote cell adhesion and migration, differentiation and proliferation.

펙틴(Pectin: P)은 대부분 일차 식물의 세포벽에서 다량으로 발견되며 거대분자량을 가져 지지체를 코팅할 수 있어 세포 실험 및 동물 실험에 적합한 특성을 가진다.Pectin (P) is mostly found in large quantities in the cell walls of primary plants and can have a large molecular weight to coat the scaffold, which is suitable for cell experiments and animal experiments.

생체재료로 사용되는 천연 고분자로 콜라겐, 젤라틴, 산화 알긴산염(oxidized alginate), 황산콘드로이틴(chondroitin sulphate), 키토산(chitosan), 피브린(fibrin)과 히알루론산(hyaluronic acid) 등이 있다.Natural polymers used as biomaterials include collagen, gelatin, oxidized alginate, chondroitin sulphate, chitosan, fibrin and hyaluronic acid.

콜라겐은 세포외기질(ECM)에 적용되는 생체재료로 널리 사용되고 있으나, 여전히 몇몇 연구에서 면역반응을 일으키는 것으로 보고된 바 있어, 본 발명에서는 젤라틴(GE)을 사용하였다.Collagen is widely used as a biomaterial applied to extracellular matrix (ECM), but it has been reported to cause an immune response in some studies. In the present invention, gelatin (GE) was used.

하이드로젤을 가교하는 방법으로 물리적 방법과 화학적 방법이 있는데, 물리적 방법을 사용하게 되면 하이드로젤 지지체의 약한 기계적 강도를 개선하지 못하는 한계점과 pH 및 온도, 이온강도 등의 외부 환경에 의한 많은 물성 변화가 야기되므로 이를 해결하기 위하여 화학적 가교방법을 사용하였다.There are physical and chemical methods for crosslinking hydrogels. When the physical method is used, many physical properties change due to limitations that do not improve the weak mechanical strength of the hydrogel support and external environment such as pH, temperature, and ionic strength. In order to solve this problem, chemical crosslinking was used.

본 발명의 목적은 상기의 문제점들을 해결하기 위하여 이루어진 것으로 골 재생 공학에 적용하기 위해 젤라틴과 펙틴이 혼합된 다공성 하이드로젤에 이상인산칼슘 입자를 로딩하여 우수한 생체적합성과 생분해성을 가진 생체모방성 지지체를 획득할 수 있도록 한 골 재생을 위한 다공성 하이드로젤 지지체의 제조방법을 제공하는 데 있다.An object of the present invention is to solve the above problems and to load the calcium phosphate particles into a porous hydrogel mixed with gelatin and pectin to apply to bone regeneration engineering biomimetic support having excellent biocompatibility and biodegradability To provide a method for producing a porous hydrogel support for bone regeneration to obtain the.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 골 재생을 위한 다공성 하이드로젤 지지체의 제조방법은,In order to achieve the above object, the method for producing a porous hydrogel support for bone regeneration according to the present invention,

젤라틴(10 w/v %, 300 Bloom)을 증류수에 용해시키는 단계; 펙틴(5 w/v %)을 상기 젤라틴 용액에 혼합하여 혼합슬러리를 제조하는 단계; 상기 혼합슬러리를 교반하는 단계; 교반된 혼합슬러리를 몰드에 주입하는 단계; 상기 혼합슬러리가 주입된 폴리에틸렌 몰드를 -80℃에서 냉동시킨 후 -70℃에서 동결 건조시키는 단계; 및 건조된 상기 혼합슬러리를 가교 반응시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
Dissolving gelatin (10 w / v%, 300 Bloom) in distilled water; Mixing pectin (5 w / v%) into the gelatin solution to prepare a mixed slurry; Stirring the mixed slurry; Injecting the stirred mixed slurry into a mold; Freezing the polyethylene mold in which the mixed slurry is injected at -80 ° C and freeze-drying at -70 ° C; And crosslinking the dried mixed slurry.

상기 혼합슬러리를 제조하는 단계에, 5% 이상인산칼슘(BCP) 수용액을 더 첨가하는 것을 특징으로 한다.
In preparing the mixed slurry, 5% or more of calcium phosphate (BCP) aqueous solution is further added.

상기 혼합슬러리를 제조하는 단계에, 10% 이상인산칼슘(BCP) 수용액을 더 첨가하는 것을 특징으로 한다.
To prepare the mixed slurry, it is characterized in that the addition of more than 10% calcium phosphate (BCP) aqueous solution.

상기 가교 반응 단계는,The crosslinking reaction step,

80% 에탄올에 EDAC(1-ethyl-3(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide)와 NHS(N-Hydroxyl succinimide)의 혼합비율을 5:2로 고정하여 용해시키는 단계; 상기 혼합용액을 사용하여 상기 GE-P 하이드로젤 지지체를 가교반응시키는 단계; 및 가교된 지지체로부터 가교제를 제거하기 위하여 증류수로 초음파 세척한 후에, -20℃에서 냉동하고, -70℃에서 동결 건조시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
Dissolving the dissolved ratio of EDAC (1-ethyl-3 (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) and NHS (N-Hydroxyl succinimide) in 80% ethanol at 5: 2; Crosslinking the GE-P hydrogel support using the mixed solution; And after ultrasonically washing with distilled water to remove the crosslinking agent from the crosslinked support, freezing at -20 ° C and freeze drying at -70 ° C.

상기 젤라틴(GE)과 펙틴(P)의 혼합비율은 80:20인 것을 특징으로 한다.The mixing ratio of the gelatin (GE) and pectin (P) is characterized in that 80:20.

본 발명에 의하면, 골재생 공학에 적용하기 위한 새로운 구조를 갖는 지지체로서 우수한 생체적합성과 생분해성을 가진 생체모방성 지지체를 얻을 수 있는 효과가 있다. According to the present invention, it is possible to obtain a biomimetic support having excellent biocompatibility and biodegradability as a support having a novel structure for application to bone regeneration engineering.

또한, 본 발명에 의하면, 이상인산칼슘(BCP)입자가 젤라틴-펙틴(GE-P) 하이드로젤에 분산되어 있는 구조로서 완벽하게 상호 연결된 삼차원적 기공을 생성함으로써 세포의 증식율을 획기적으로 증대시키는 효과가 있다.In addition, according to the present invention, as a structure in which bicalcium phosphate (BCP) particles are dispersed in gelatin-pectin (GE-P) hydrogels, the effect of dramatically increasing the proliferation rate of cells by generating three-dimensionally interconnected pores. There is.

도 1은 본 발명에 따른 GE-P, GE-P-B-5, GE-P-B-10의 주사전자현미경 사진으로서, (a)는 GE-P, (b)는 GE-P-B-5, (c)는GE-P-B-10의 사진이고, (d),(e),(f)는 각각 (a), (b), (c)의 확대사진이다.
도 2는 하이드로젤 지지체의 세포증식 정도를 MTT분석법으로 나타낸 그래프이다.
도 3은 (a, d) GE-P, (b, e) GE-P-B-5, (c, f) GE-P-B-10에 전조골세포 MC3T3-E1를 1, 3일 동안 배양한 후의 증식율을 나타낸 주사현미경 이미지이다.
도 4는 (a1-a3) GE-P (b1-b3) GE-P-B-5, (c1-c3) GE-P-B-10에 전조골세포 MC3T3-E1 전조골세포를 1, 3일 동안 배양한 후의 증식 정도를 공초점 현미경으로 관찰한 이미지이다.
도 5는 GE-P, GE-P-BCP-5와 GE-P-B-10에 MC3T3-E1 전조골세포를 3, 7일 동안 배양한 후 collagen Type I (Col-I)과 osteopontin의 발현 정도를 면역학적 블로팅 방법으로 관찰한 이미지이다.
도 6은 GE-P-B-10 하이드로젤 지지체를 이식한 대퇴부를 적출한 뒤, Micro-CT를 사용하여 분석한 이미지이다.
도 7은 GE-P과 GE-P-B-10 하이드로젤을 2개월 동안 이식 후, 조직염색을 수행하여 관찰한 이미지이다.1 is a scanning electron micrograph of the GE-P, GE-PB-5, GE-PB-10 according to the present invention, (a) is GE-P, (b) is GE-PB-5, (c) Are photographs of GE-PB-10, and (d), (e) and (f) are enlarged photographs of (a), (b) and (c), respectively.
Figure 2 is a graph showing the degree of cell proliferation of the hydrogel support by MTT assay.
Figure 3 shows the proliferation rate after culturing progenitor bone cells MC3T3-E1 in (a, d) GE-P, (b, e) GE-PB-5, (c, f) GE-PB-10 for 1, 3 days. It is a scanning microscope image.
Figure 4 (a1-a3) GE-P (b1-b3) GE-PB-5, (c1-c3) progenitor bone cells MC3T3-E1 precursor bone cells incubated for 1 to 3 days in GE-PB-10 It is the image which observed the degree of proliferation after with a confocal microscope.
Figure 5 shows the expression level of collagen Type I (Col-I) and osteopontin after MC3T3-E1 progenitor bone cells were cultured in GE-P, GE-P-BCP-5 and GE-PB-10 for 3 to 7 days. The image was observed by immunological blotting method.
6 is an image analyzed by using Micro-CT after extracting the thighs implanted with the GE-PB-10 hydrogel support.
7 is an image observed by performing tissue staining after transplanting GE-P and GE-PB-10 hydrogels for 2 months.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 골 재생을 위한 다공성 하이드로젤 지지체의 제조방법에 대하여 상세히 설명한다.
Hereinafter, a method for preparing a porous hydrogel support for bone regeneration according to the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings.

다공성 젤라틴-펙틴(Porous Gelatin-Pectin ( GEGE -P) -P) 하이드로젤Hydrogel 지지체의 제조방법 Method of manufacturing support

젤라틴(10 w/v %, 300 Bloom)을 30℃에서 증류수에 용해시키고, 펙틴(5 w/v %)을 상기 젤라틴 용액에 혼합하여 혼합슬러리를 제조한다. 이때, 젤라틴(GE)과 펙틴(P)의 혼합비율은 80:20인 것이 바람직하다.Gelatin (10 w / v%, 300 Bloom) is dissolved in distilled water at 30 ℃, pectin (5 w / v%) is mixed with the gelatin solution to prepare a mixed slurry. At this time, the mixing ratio of gelatin (GE) and pectin (P) is preferably 80:20.

상기 혼합슬러리는 30℃에서 2시간 동안 교반된 후에, 폴리에틸렌 몰드에 주입된다.The mixed slurry is stirred at 30 ° C. for 2 hours and then injected into a polyethylene mold.

그 후에, 다공성 구조의 지지체를 만들기 위하여 상기 혼합슬러리가 주입된 폴리에틸렌 몰드를 -80℃에서 2시간 동안 냉동시킨 후 -70℃에서 밤새 동결 건조시킨다.Thereafter, the polyethylene mold injected with the mixed slurry is frozen at -80 ° C for 2 hours and then freeze-dried at -70 ° C overnight to make a porous structure of support.

동결 건조 후, 80% 에탄올에 EDAC(1-ethyl-3(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) 와 NHS(N-Hydroxyl succinimide)의 혼합비율을 5:2로 고정하여 용해시킨 뒤, 이 용액을 사용하여 4℃에서 밤새도록 상기 GE-P 하이드로젤 지지체를 가교반응시켰다.After freeze-drying, the ratio of EDAC (1-ethyl-3 (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) and NHS (N-Hydroxyl succinimide) and NHS (N-Hydroxyl succinimide) was fixed at 5: 2, and then dissolved. The GE-P hydrogel support was crosslinked overnight at < RTI ID = 0.0 >

또한, 가교된 지지체로부터 가교제를 제거하기 위하여 증류수로 초음파 세척한 후에, -20℃에서 2시간 동안 냉동하고, -70℃에서 동결 건조시켰다.In addition, after ultrasonic washing with distilled water to remove the crosslinking agent from the crosslinked support, it was frozen for 2 hours at -20 ℃, and lyophilized at -70 ℃.

상기 가교 단계는 지지체의 세포실험 평가를 수행할 시, 지지체의 안정성을 유지하기 위하여 2번 반복할 수도 있다.The crosslinking step may be repeated twice to maintain the stability of the support when performing a cell experiment evaluation of the support.

이와 같은 제조방법을 통해서, 본 발명에 따른 다공성의 젤라틴-펙틴 하이드로젤(GE-P) 지지체가 얻어진다.
Through this preparation method, a porous gelatin-pectin hydrogel (GE-P) support according to the present invention is obtained.

다공성 젤라틴-펙틴-5% Porous Gelatin-Pectin-5% BCPBCP (( GEGE -P-B-5) -P-B-5) 하이드로젤Hydrogel 지지체의 제조방법 Method of manufacturing support

젤라틴(10 w/v %, 300 Bloom)을 30℃에서 증류수에 용해시키고, 펙틴(5 w/v %)을 상기 젤라틴 용액에 혼합하여 슬러리를 제조한 후에, 그 슬러리에 이상인산칼슘(BCP) 5%수용액을 투입하여 혼합슬러리를 제조한다. 이때, 젤라틴(GE)과 펙틴(P)의 혼합비율은 80:20인 것이 바람직하다. 상기 5% BCP는 상기 젤라틴-펙틴의 혼합량에 대해 BCP의 양이 5%라는 의미이다.Gelatin (10 w / v%, 300 Bloom) was dissolved in distilled water at 30 ℃, pectin (5 w / v%) was mixed with the gelatin solution to prepare a slurry, then the calcium phosphate (BCP) in the slurry 5% aqueous solution is added to prepare a mixed slurry. At this time, the mixing ratio of gelatin (GE) and pectin (P) is preferably 80:20. The 5% BCP means that the amount of BCP is 5% with respect to the amount of gelatin-pectin mixed.

상기 혼합슬러리는 30℃에서 2시간 동안 교반된 후에, 폴리에틸렌 몰드에 주입된다.The mixed slurry is stirred at 30 ° C. for 2 hours and then injected into a polyethylene mold.

그 후에, 다공성 구조의 지지체를 만들기 위하여 상기 혼합슬러리가 주입된 폴리에틸렌 몰드를 -80℃에서 2시간 동안 냉동시킨 후 -70℃에서 밤새 동결 건조시킨다.Thereafter, the polyethylene mold injected with the mixed slurry is frozen at -80 ° C for 2 hours and then freeze-dried at -70 ° C overnight to make a porous structure of support.

동결 건조 후, 80% 에탄올에 EDAC(1-ethyl-3(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) 와 NHS(N-Hydroxyl succinimide)의 혼합비율을 5:2로 고정하여 용해시킨 뒤, 이 용액을 사용하여 4℃에서 밤새도록 상기 GE-P-B-5 하이드로젤 지지체를 가교반응시켰다.After freeze-drying, the ratio of EDAC (1-ethyl-3 (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) and NHS (N-Hydroxyl succinimide) and NHS (N-Hydroxyl succinimide) was fixed at 5: 2, and then dissolved. The GE-PB-5 hydrogel support was crosslinked overnight at < RTI ID = 0.0 >

또한, 가교된 지지체로부터 가교제를 제거하기 위하여 증류수로 초음파 세척한 후에, -20℃에서 2시간 동안 냉동하고, -70℃에서 동결 건조시켰다.In addition, after ultrasonic washing with distilled water to remove the crosslinking agent from the crosslinked support, it was frozen for 2 hours at -20 ℃, and lyophilized at -70 ℃.

상기 가교 단계는 지지체의 세포실험 평가를 수행할 시, 지지체의 안정성을 유지하기 위하여 2번 반복할 수도 있다.The crosslinking step may be repeated twice to maintain the stability of the support when performing a cell experiment evaluation of the support.

이와 같은 제조방법을 통해서, 본 발명에 따른 5% BCP가 로딩된 다공성의 젤라틴-펙틴 하이드로젤(GE-P-B-5) 지지체가 얻어진다.
Through this preparation method, a porous gelatin-pectin hydrogel (GE-PB-5) support loaded with 5% BCP according to the present invention is obtained.

다공성 젤라틴-펙틴-10% Porous Gelatin-Pectin-10% BCPBCP (( GEGE -P-B-10) -P-B-10) 하이드로젤Hydrogel 지지체의 제조방법 Method of manufacturing support

젤라틴(10 w/v %, 300 Bloom)을 30℃에서 증류수에 용해시키고, 펙틴(5 w/v %)을 상기 젤라틴 용액에 혼합하여 슬러리를 제조한 후에, 그 슬러리에 이상인산칼슘(BCP) 10%수용액을 투입하여 혼합슬러리를 제조한다. 이때, 젤라틴(GE)과 펙틴(P)의 혼합비율은 80:20인 것이 바람직하다. 상기 5% BCP는 상기 젤라틴-펙틴의 혼합량에 대해 BCP의 양이 10%라는 의미이다.Gelatin (10 w / v%, 300 Bloom) was dissolved in distilled water at 30 ℃, pectin (5 w / v%) was mixed with the gelatin solution to prepare a slurry, then the calcium phosphate (BCP) in the slurry 10% aqueous solution is added to prepare mixed slurry. At this time, the mixing ratio of gelatin (GE) and pectin (P) is preferably 80:20. The 5% BCP means that the amount of BCP is 10% with respect to the amount of gelatin-pectin mixed.

상기 혼합슬러리는 30℃에서 2시간 동안 교반된 후에, 폴리에틸렌 몰드에 주입된다.The mixed slurry is stirred at 30 ° C. for 2 hours and then injected into a polyethylene mold.

그 후에, 다공성 구조의 지지체를 만들기 위하여 상기 혼합슬러리가 주입된 폴리에틸렌 몰드를 -80℃에서 2시간 동안 냉동시킨 후 -70℃에서 밤새 동결 건조시킨다.Thereafter, the polyethylene mold injected with the mixed slurry is frozen at -80 ° C for 2 hours and then freeze-dried at -70 ° C overnight to make a porous structure of support.

동결 건조 후, 80% 에탄올에 EDAC(1-ethyl-3(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) 와 NHS(N-Hydroxyl succinimide)의 혼합비율을 5:2로 고정하여 용해시킨 뒤, 이 용액을 사용하여 4℃에서 밤새도록 상기 GE-P-B-10 하이드로젤 지지체를 가교반응시켰다.After freeze-drying, the ratio of EDAC (1-ethyl-3 (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) and NHS (N-Hydroxyl succinimide) and NHS (N-Hydroxyl succinimide) was fixed at 5: 2, and then dissolved. The GE-PB-10 hydrogel support was crosslinked overnight at < RTI ID = 0.0 >

또한, 가교된 지지체로부터 가교제를 제거하기 위하여 증류수로 초음파 세척한 후에, -20℃에서 2시간 동안 냉동하고, -70℃에서 동결 건조시켰다.In addition, after ultrasonic washing with distilled water to remove the crosslinking agent from the crosslinked support, it was frozen for 2 hours at -20 ℃, and lyophilized at -70 ℃.

상기 가교 단계는 지지체의 세포실험 평가를 수행할 시, 지지체의 안정성을 유지하기 위하여 2번 반복할 수도 있다.The crosslinking step may be repeated twice to maintain the stability of the support when performing a cell experiment evaluation of the support.

이와 같은 제조방법을 통해서, 본 발명에 따른 10% BCP가 로딩된 다공성의 젤라틴-펙틴 하이드로젤(GE-P-B-10) 지지체가 얻어진다.
Through this preparation method, a porous gelatin-pectin hydrogel (GE-PB-10) support loaded with 10% BCP according to the present invention is obtained.

상기와 같이 제조된 다공성 하이드로젤 지지체의 생체적합성 평가를 위하여, 10%의 우태혈청과 1%의 항생제가 함유된 MEM배지에 배양한 MC3T3-E1 전조골세포를 사용하여 MTT분석법을 수행하여 세포의 증식율을 관찰하였으며, 주사전자현미경과 공초점현미경을 사용하여 지지체에 배양된 세포의 부착능 및 증식율을 관찰하였다.In order to evaluate the biocompatibility of the prepared porous hydrogel scaffold, MTT assay was performed using MC3T3-E1 progenitor bone cells cultured in MEM medium containing 10% fetal calf serum and 1% antibiotic. The proliferation rate was observed, and the adhesion and proliferation rate of the cells cultured on the support were observed using a scanning electron microscope and a confocal microscope.

또한, 생물학적 안전성을 평가하기 위하여 토끼의 대퇴부에 결손 부위를 만들어 직경이 3mm이고 길이가 5mm인 원통형의 GE-P 지지체와 GE-P-B-10 지지체를 이식하였다. 이식 2개월 후, 지지체가 이식된 대퇴부를 적출하여 H&E 조직 염색을 수행하여 염증반응 및 이식 부위의 새로운 골 생성을 관찰하였다.In addition, in order to evaluate the biological safety, a defect site was made in the femoral rabbit, and a cylindrical GE-P support and a GE-P-B-10 support having a diameter of 3 mm and a length of 5 mm were implanted. Two months after transplantation, the femoral implants were implanted and H & E tissue staining was performed to observe inflammatory reactions and new bone formation at the transplant site.

이와 같은 결과의 그래프나 사진들이 도면에 도시되어 있다.
Graphs or photographs of these results are shown in the figures.

도 1은 주사현미경으로 관찰한 다공성 GE-P, GE-P-5 GE-P-10 하이드로젤 지지체의 형태를 나타낸 것으로, (a),(b),(c)는 각각 GE-P, GE-P-5 GE-P-10를 관찰한 사진이고, (d),(e),(f)는 각각 (a),(b),(c)를 확대한 사진이다. 도면에서 알 수 있는 바와 같이, 하이드로젤 지지체는 높은 다공성을 가지고 각각의 기공이 서로 연결된 삼차원적 구조를 가지며, (e)와 (f)사진에서도 알 수 있듯이 BCP 입자는 다공성 GE-P 하이드로젤 지지체에 전체적으로 잘 분산되어 있다.
Figure 1 shows the shape of the porous GE-P, GE-P-5 GE-P-10 hydrogel support observed with a scanning microscope, (a), (b), (c) are GE-P, GE, respectively -P-5 It is a photograph which observed GE-P-10, and (d), (e), (f) are enlarged photographs of (a), (b), (c), respectively. As can be seen in the figure, the hydrogel support has a high porosity and a three-dimensional structure in which the pores are connected to each other, and as shown in (e) and (f), the BCP particles are porous GE-P hydrogel supports. It is well distributed throughout.

도 2는 MTT 분석법을 이용하여 다공성 하이드로젤 지지체에 배양된 세포의 증식율을 측정한 결과로 다공성 하이드로젤 지지체에 MC3T3-E1 전조골세포를 1일, 3일, 7일 동안 배양하였다. 배양 1일 후에는 모든 하이드로젤 지지체에 배양된 세포의 수가 처음 배양한 세포의 수(104 cells/well)보다 증가한 것을 확인할 수 있으며, GE-P-B-10 하이드로젤 지지체에서 7일 동안 배양된 세포의 증식율이 가장 우수한 것을 확인할 수 있다. 이러한 결과로 MC3T3-E1 전조골세포는 GE-P, GE-P-B-5와 GE-P-B-10 하이드로젤 지지체에서 지속적으로 증식함을 확인할 수 있다.
FIG. 2 shows that MC3T3-E1 precursor bone cells were cultured on the porous hydrogel support for 1 day, 3 days, and 7 days as a result of measuring the proliferation rate of the cells cultured on the porous hydrogel support using the MTT assay. After one day of culture, the number of cells cultured on all the hydrogel supports was increased from the number of cells initially cultured (10 4 cells / well), and cells cultured for 7 days on the GE-PB-10 hydrogel support. It can be confirmed that the growth rate of the most excellent. As a result, MC3T3-E1 progenitor osteoblasts can be confirmed to continue to proliferate in the GE-P, GE-PB-5 and GE-PB-10 hydrogel support.

도 3은 GE-P, GE-P-B-5와 GE-P-B-10 하이드로젤 지지체에 각각 1일(사진 a, b, c), 3일(사진 d, e, f) 동안 배양한 세포의 증식율을 주사현미경으로 관찰한 결과로, 하이드로젤 지지체 표면에 증식하고 확산된 조골세포의 형태를 관찰할 수 있다. 또한, GE-P 지지체 보다는 GE-P-B-5 지지체에서, GE-P-B-5 지지체 보다는 GE-P-B-10 지지체에서 세포의 증식율이 우수함을 알 수 있다.
Figure 3 shows the proliferation rate of cells cultured on GE-P, GE-PB-5 and GE-PB-10 hydrogel scaffolds for 1 day (photo a, b, c) and 3 days (photo d, e, f), respectively. As a result of observing with a scanning microscope, the morphology of osteoblasts proliferated and diffused on the surface of the hydrogel support can be observed. In addition, it can be seen that the cell proliferation rate is better in the GE-PB-5 support than in the GE-P support and in the GE-PB-10 support than in the GE-PB-5 support.

도 4는 GE-P, GE-P-B-5와 GE-P-B-10 하이드로젤 지지체에 세포를 배양 한 후, 공초점 현미경으로 관찰한 결과이며, 사진(a1, b1, c1)은 1일 배양한 후 관찰한 것이고, 사진(a2, b2, c2)은 3일 배양한 후 관찰한 것이고, 사진(a3, b3, c3)은 7일 배양한 후 관찰한 것이다. 이 사진을 보면, 세포를 배양한 기간이 증가할수록 세포의 증식율이 증가하는 것을 확인할 수 있다. 이 결과로 기공의 사이즈와 표면 형태가 세포 증식과 확산에 영향을 준다는 것을 확인할 수 있다. 즉, 기공의 사이즈가 작은 것이 많거나 표면에 BCP 나노입자가 많은 지지체일수록 세포 증식이 잘 된다는 것을 알 수 있다.4 is a result of culturing cells in a GE-P, GE-PB-5 and GE-PB-10 hydrogel scaffold, and observed with a confocal microscope, and photographs (a1, b1, c1) were cultured for 1 day After the observation, the photographs (a2, b2, c2) were observed after culturing for 3 days, and the photographs (a3, b3, c3) were observed after culturing for 7 days. Looking at this picture, it can be seen that the proliferation rate of the cells increases as the period of incubation of the cells increases. These results confirm that pore size and surface morphology influence cell proliferation and proliferation. That is, it can be seen that a cell having a smaller pore size or a support having more BCP nanoparticles on the surface of the cell proliferates better.

사진에서 주황색 점으로 표시되고 있는 것들은 세포핵이고, 초록색부분은 세포 F-actin인데 배약기간이 길수록 그리고, BCP 나노입자가 많이 함유될 수록 그 확산정도가 큰 것을 알 수 있다.
The orange dots in the picture are the cell nucleus, and the green part is the cell F-actin. The longer the dosing period and the more BCP nanoparticles are contained, the greater the diffusion.

도 5는 면역학적 블로팅 분석 결과로 모든 하이드로젤 지지체에 배양된 MC3T3-E1 전조골세포에서 Col-I 과 osteopontin이 발현된 것을 보여주지만, 발현 정도는 지지체의 종류와 배양 시간에 따라 다르게 나타났다.FIG. 5 shows that Col-I and osteopontin were expressed in MC3T3-E1 progenitor bone cells cultured on all hydrogel scaffolds as a result of immunological blotting analysis, but the expression level was different depending on the type of scaffold and the culture time.

세포 배양 3일 후, GE-P-B-10 하이드로젤 지지체에서의 발현 정도는 GE-P와 GE-P-B-5에 비해 높은 것을 관찰할 수 있다. 또한, 배양 7일 후의 Col-I의 발현 정도는 배양 3일 후의 하이드로젤 지지체보다 높았지만, 하이드로젤의 종류에 따른 차이는 크지 않은 것을 확인할 수 있다.After 3 days of cell culture, the expression level in the GE-P-B-10 hydrogel support was observed to be higher than that of GE-P and GE-P-B-5. In addition, the expression level of Col-I after 7 days of culture was higher than the hydrogel support after 3 days of culture, but it can be confirmed that the difference according to the type of hydrogel is not large.

그러나 GE-P-B-10 하이드로젤 지지체의 경우, osteopontin 발현 정도가 다른 하이드로젤 지지체보다 우수한 것을 확인할 수 있다. However, in the case of GE-P-B-10 hydrogel scaffold, osteopontin expression level is superior to other hydrogel scaffolds.

이러한 결과로 MC3T3-E1의 생존율 및 증식율이 Col-I 과 osteopontin 합성에 영향을 준다는 것을 알 수 있다.These results indicate that survival and proliferation of MC3T3-E1 affects the synthesis of Col-I and osteopontin.

Collagen은 ECM에서 조골세포의 형질에 의해 합성되는 필수적인 골 형성 단백질이며, 골 단백질의 90% 이상을 차지하는 Col-I은 골 기질의 템플릿으로 쓰이고, 핵 형성을 조절한다.Collagen is an essential bone-forming protein synthesized by osteoblast traits in ECM. Col-I, which accounts for more than 90% of bone protein, serves as a template for bone matrix and regulates nucleation.

Osteogenesis Imperfect (OI)와 같은 불완전한 콜라겐 발현은 골격계에 직접적으로 영향을 주는 Col-I 사슬의 변이에 의해 나타나며, osteogenesis와 조골세포 확산의 초기단계에 나타난다.Incomplete collagen expression, such as Osteogenesis Imperfect (OI), is manifested by mutations in the Col-I chain that directly affect the skeletal system and appear early in osteogenesis and osteoblast proliferation.

다른 몇몇 연구에서 Col-I 은 골 세포 형질 발현에 영향을 미치는 것으로 보고되고 있으며, 본 발명에서는 하이드로젤 지지체에 배양된 MC3T3-E1 세포에서 collagen과 osteopopin 발현을 Col-I 과 osteopontin 항체를 이용한 면역학적 블로팅 방법으로 분석하였다.Several other studies have reported that Col-I affects bone cell expression. In the present invention, collagen and osteopopin expression in MC3T3-E1 cells cultured on a hydrogel scaffold was immunologically expressed using Col-I and osteopontin antibodies. Analysis was by blotting method.

도 6는 GE-P와 GE-P-B-10 하이드로젤 지지체를 토끼의 대퇴부에 2개월 동안 이식한 사진과 직경 3 mm, 길이 5 mm의 원형 하이드로젤 지지체의 생분해성을 확인하기 위하여 Micro-CT로 관찰한 결과이다. 두번째 사진에서 흰색으로 나타나는 부분이 본 발명에 따른 하이드로젤 지지체이다.
FIG. 6 is a micro-CT image of the GE-P and GE-PB-10 hydrogel scaffolds implanted in the femur of rabbits for 2 months and the biodegradability of a circular hydrogel scaffold 3 mm in diameter and 5 mm in length. Observed. The part shown in white in the second picture is the hydrogel support according to the present invention.

도 7을 통해 천연골 생성 및 천연골과 하이드로젤 지지체 표면의 접촉면을 확인할 수 있다. 조직염색을 통해 GE-P-B-10 지지체의 기공과 내부에서 천연골이 생성된 것을 관찰할 수 있다. 서로 연결된 기공과 하이드로젤 지지체 경계에서 생성된 천연골의 생성 정도는 하이드로젤 지지체 종류마다 큰 차이가 있으며, 천연골과 하이드로젤 지지체 사이의 경계가 모호한 것은 염증반응이 없고, 천연골을 포함한 하이드로젤 지지체가 매우 조밀하다는 것을 보여준다.
Through Figure 7 can be confirmed the natural bone generation and the contact surface of the natural bone and the hydrogel support surface. Through tissue staining, natural bone can be observed in the pores and inside of GE-PB-10 scaffold. The degree of generation of natural bone produced at the boundary between the pores and the hydrogel support varies greatly depending on the type of the hydrogel support, and the ambiguity between the natural bone and the hydrogel support has no inflammatory reaction, and the hydrogel including the natural bone. It shows that the support is very dense.

Claims (5)

젤라틴(10 w/v %, 300 Bloom)을 증류수에 용해시키는 단계;
펙틴(5 w/v %)을 상기 젤라틴 용액에 혼합하여 혼합슬러리를 제조하는 단계;
상기 혼합슬러리를 교반하는 단계;
교반된 혼합슬러리를 몰드에 주입하는 단계;
상기 혼합슬러리가 주입된 폴리에틸렌 몰드를 -80℃에서 냉동시킨 후 -70℃에서 동결 건조시키는 단계; 및
건조된 상기 혼합슬러리를 가교 반응시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 골 재생을 위한 다공성 하이드로젤 지지체의 제조방법.Dissolving gelatin (10 w / v%, 300 Bloom) in distilled water;
Mixing pectin (5 w / v%) into the gelatin solution to prepare a mixed slurry;
Stirring the mixed slurry;
Injecting the stirred mixed slurry into a mold;
Freezing the polyethylene mold in which the mixed slurry is injected at -80 ° C and freeze-drying at -70 ° C; And
Crosslinking the dried slurry mixture; Method of producing a porous hydrogel support for bone regeneration characterized in that it comprises a. 제 1항에 있어서,
상기 혼합슬러리를 제조하는 단계에,
5% 이상인산칼슘(BCP) 수용액을 더 첨가하는 것을 특징으로 하는 골 재생을 위한 다공성 하이드로젤 지지체의 제조방법.The method of claim 1,
In the step of preparing the mixed slurry,
Method for producing a porous hydrogel support for bone regeneration, characterized in that the addition of more than 5% calcium phosphate (BCP) aqueous solution. 제 1항에 있어서,
상기 혼합슬러리를 제조하는 단계에,
10% 이상인산칼슘(BCP) 수용액을 더 첨가하는 것을 특징으로 하는 골 재생을 위한 다공성 하이드로젤 지지체의 제조방법.The method of claim 1,
In the step of preparing the mixed slurry,
Method for producing a porous hydrogel support for bone regeneration, characterized in that the addition of more than 10% calcium phosphate (BCP) aqueous solution. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 가교 반응 단계는,
80% 에탄올에 EDAC(1-ethyl-3(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide)와 NHS(N-Hydroxyl succinimide)의 혼합비율을 5:2로 고정하여 용해시키는 단계;
상기 혼합용액을 사용하여 상기 GE-P 하이드로젤 지지체를 가교반응시키는 단계; 및
가교된 지지체로부터 가교제를 제거하기 위하여 증류수로 초음파 세척한 후에, -20℃에서 냉동하고, -70℃에서 동결 건조시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 골 재생을 위한 다공성 하이드로젤 지지체의 제조방법.4. The method according to any one of claims 1 to 3,
The crosslinking reaction step,
Dissolving the dissolved ratio of EDAC (1-ethyl-3 (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) and NHS (N-Hydroxyl succinimide) in 80% ethanol at 5: 2;
Crosslinking the GE-P hydrogel support using the mixed solution; And
Ultrasonic washing with distilled water in order to remove the crosslinking agent from the crosslinked support, frozen at -20 ℃, and freeze-dried at -70 ℃; method of producing a porous hydrogel support for bone regeneration, comprising the . 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 젤라틴(GE)과 펙틴(P)의 혼합비율은 80:20인 것을 특징으로 하는 골 재생을 위한 다공성 하이드로젤 지지체의 제조방법.4. The method according to any one of claims 1 to 3,
Method for producing a porous hydrogel support for bone regeneration, characterized in that the mixing ratio of the gelatin (GE) and pectin (P) is 80:20.
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