KR20130122886A - 테트라클로로에틸렌 및 트리클로로에틸렌 완전 탈염소화능을 가지는 디할로코코이데스 속 미생물 균주의 개체수 증가용 배양배지 및 이를 이용한 ｊｌ-1 미생물 군집의 배양방법 - Google Patents

테트라클로로에틸렌 및 트리클로로에틸렌 완전 탈염소화능을 가지는 디할로코코이데스 속 미생물 균주의 개체수 증가용 배양배지 및 이를 이용한 ｊｌ-1 미생물 군집의 배양방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 디할로코코이데스 속(Dehalococcoides spp.) 균주의 개체수가 증가된 미생물 군집 JL-1(KCTC 11782BP)을 제공하는 효과가 있고 또 상기 미생물 군집을 생물학적 정화에 이용하여 테트라클로로에틸렌(PCE) 및 트리클로로에틸렌(TCE)의 탈염소화 메커니즘(mechanism)에서 발암물질로 알려진 비닐클로라이드(VC)의 축적 없이 에텐으로 완전분해하는 미생물 제제를 제공하는 효과가 있다.

Description

테트라클로로에틸렌 및 트리클로로에틸렌 완전 탈염소화능을 가지는 디할로코코이데스 속 미생물 균주의 개체수 증가용 배양배지 및 이를 이용한 ＪＬ-1 미생물 군집의 배양방법{A culture medium for growing Dehalococcoides sp. microbial strain community capable of complete dechlorination of PCE and TCE to ethene and culture method of the same}
본 발명은 테트라클로로에틸렌(tetrachloroethylene: PCE) 및 트리클로로에틸렌(trichloroethylene: TCE)의 완전 탈염소화능이 우수한 미생물 군집 JL-1 (KCTC 11782BP)에서 디할로코코이데스 속(Dehalococcoides spp.) 균주의 개체수가 증가된 미생물 군집 JL-1(KCTC 11782BP) 및 그 배양방법에 관한 것이다.
산업화에 따른 유기성 유해폐기물에 의한 토양 및 지하수의 오염이 증가 되고 있으며, 특히 테트라클로로에틸렌(tetrachloroethylene: PCE) 및 트리클로로에틸렌(trichloroethylene: TCE) 등의 염소계 유기화합물에 의한 오염은 사회적으로 문제시되고 있다. 염소계 유기화합물은 휘발성이 매우 강하고 발암성을 갖고 있으며, 분자 구조가 매우 안정한 난분해성 물질로써 그 처리에 어려움이 있다. 상기 염소계 유기화합물의 처리는 유지관리 비용이 많이 드는 물리·화학적 처리 방법보다 경제적이고 친환경적인 생물학적 정화에 대한 개발이 절실하다.
생물학적 정화(bioremediation) 기술은 토양 내에 존재하는 미생물, 곰팡이, 식물 등을 오염물질 정화를 위한 도구로써 활용하여, 오염물질의 농도 저감을 목적으로 하는 기술이다. 상기 생물학적 정화에 있어서 가장 중요한 미생물은 공기, 물, 토양에서 발견되는 미생물이며, 상기에서 발견된 미생물에 의한 오염물 처리 방법 중에는 자연저감(passive biodegradation, natural attenuation) 방법이 있다. 이 방법은 상기 미생물들이 오염지역에 풍부하게 분포하거나 오염물 농도가 자연 저감을 통하여 충분히 처리 가능할 수 있는 정도로 저농도일 때 쓰이는 가장 일반적인 방법이다. 또 다른 방법은 생물정화 증진(enhanced bioremediation) 방법으로써 이는 전자 공여체 주입에 의해 상기 미생물의 (1) 성장속도를 증가시켜 오염물질의 분해를 촉진하는 방법과, (2) 오염물질 자체가 전자 공여체 또는 수용체로 활용되는 방법과, (3) 물질 대사에 필요한 전자 공여체 또는 수용체를 별도로 주입하여 오염물 분해속도를 증가시키는 방법이 있다. 상기 전자 공여체는 특정 오염물의 분해 능력을 갖는 박테리아 종류에 따라 달라질 수 있으며, 다양한 개체군 중 주도적인 박테리아에 대한 적절한 기질 공급으로 이루어진다. 상기 생물학적 정화에 이용되는 미생물은 증식 환경에 따라 aerobes, anaerobes, facultative anaerobes로 분류되며, 상기 미생물의 특성에 따라 그 미생물의 이용 용도와 미생물의 물질 대사를 유도하기 위해 주입되는 전자 수용체의 종류가 달라진다.
이상에서 설명한 바와 같이 미생물을 이용한 환경정화의 효율은 환경정화에 이용되는 미생물의 생물학적 특성인 성장조건, 물질대사 조건, 전자 공여체, 전자 수용체와, 환경 조건, 기질 조건 등에 영향을 받기 때문에 오염물질 특성에 따른 미생물의 탐색 및 선별 그리고 최대 생물정화 효율을 나타내는 미생물배양 시스템의 확립이 필요하다.
상기 염소계 유기화합물 테트라클로로에틸렌(tetrachloroethylene: PCE) 및 트리클로로에틸렌(trichloroethylene: TCE)의 분해는 혐기 상태에서 효과적으로 분해되는 경향을 보인다. 상기 염소계 유기화합물의 염소 원자가 수소 원자와 치환 되면서 점차적으로 분해되며, 이러한 혐기 상태에서의 염소계 유기화합물의 분해는 sulfate reducing, methanogenic 상태에서 효과적인 것으로 알려져 있다. 염소계 유기화합물을 분해하는 미생물(chlorinated-ethene-dehalorespiring)들은 PCE나 TCE를 cis-DCE(cis- dichloroethylene)까지 탈염소화시키는 그룹과 cis-DCE를 VC(vinyl chloride) 또는 ethene으로 탈염소화시키는 또 다른 그룹(Dehalococcoides sp.)으로 나뉜다. 이러한 미생물들은 독자적으로 존재하는 경우는 드물며, 다른 미생물과 주변 환경과 상호관계를 이루는 미생물 군집(microbial community)을 형성한다.
이와 같이 혐기성 미생물에 의한 염화에텐 분해 과정에 다양한 미생물들이 단계별로 개별적으로 관여하므로, 미생물을 단독으로 분리하여 응용하기보다는 미생물 군집 자체를 확보하여 탈염소화능을 갖는 미생물 군집을 연구하는 것이 필요하다.
탈염소화능을 갖는 미생물 군집에 관한 특허로는, 대한민국 등록특허 제10-0957166호에서 PCE 탈염소화능을 갖는 데할로코코이데스 속(Dehalococcoides sp.), 지오박터 속(Geobacter sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) 데설피토박테리움 속(Desulfitobacterium sp.), 데설포비브리오 속(Desulfovibrio sp.), 스피로캐타 속(Spirochaeta sp.) 및 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia)을 포함하는 혐기성 미생물 커뮤니티 FMC-4P(KCTC 11277BP)에 대하여 기재하고 있으며, 대한민국 공개특허 제10-2009-0088367호에서 지오박터 속(Geobacter sp.), 디할로코코이드 속(Dehalococcoides sp.), 디설포비브리오 속(Desulfovibrio sp.), 언에어로무사 속(Anaeromusa sp.), 펠로박터 속(Pelobacter sp.) 및 언에어로비브리오 속(Anaerovibrio sp.)을 포함하는 테트라클로로에텐 탈염소화능을 갖는 미생물 커뮤니티 FMC-KBKC14(KCTC 11436BP)에 대해 나타내고 있다.
본 발명자들은 PCE 및 TCE 완전 탈염소화능을 가지는 미생물 군집 JL-1(KCTC 11782BP)을 분리 정제하여 제10-2010-0108230호로 특허출원한바 있다.
따라서 본 발명의 목적은, 하천에서 확보한 시료로부터 탈염소화능을 갖는 혐기성 기능성 미생물 군집 JL-1(KCTC 11782BP)에서 디할로코코이데스 속(Dehalococcoides spp.) 균주의 개체수가 증가된 기능성 미생물 군집을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은, 디할로코코이데스 속(Dehalococcoides spp.) 균주의 개체수가 증가된 미생물 군집 JL-1(KCTC 11782BP)을 생물학적 정화에 이용하여 탈염소화 메커니즘(mechanism)에서 중간물질로 생성되는 발암물질로 알려진 VC(vinyl chloride)의 축적 없이 에텐으로 빠르게 완전 분해가 가능한 미생물 제제를 제공하는 데 있다.
본 발명의 상기 목적은 PCE 및 TCE 완전 탈염소화능이 우수한 미생물 군집 JL-1(KCTC 11782BP)을 배양하는 단계와; 상기 배양액 중 상등액을 전자 수용체, 전자 공여체 및 탄소원이 제공된 계대 배양용 배지에 계대 배양하는 단계와; 상기에서 얻은 계대 배양물을 동일한 조건으로 다시 한번 계대 배양하는 단계와; 상기 계대 배양물의 일부를 암피실린을 첨가하여 제조된 상기 계대 배양용 배지에 다시 계대 배양하는 단계와; 상기와 동일한 조건으로 계대 배양을 2회 더 수행하는 단계와; 상기에서 얻은 배양액의 미생물군집에서 탈염소화능의 저해활성이 있는 메탄 생성균의 성장을 억제를 위한 2-브로모에탄설폰산을 첨가하고 전자공여체를 락테이트로 전환하는 단계와; 상기에서 얻은 최종 배양액의 미생물군집의 분포를 16S rRNA 유전자수를 정량하여 분석하는 단계와; 상기에서 얻은 최종 배양액의 탈염소화능을 측정하는 단계를 통하여 달성하였다.
본 발명은 완전탈염소화능을 갖는 혐기성 기능성 미생물 군집 JL-1 (KCTC 11782BP)에서 디할로코코이데스 속(Dehalococcoides spp.) 균주의 개체수가 증가된 미생물 군집 JL-1(KCTC 11782BP)의 완전탈염소화능을 증가시킨 비메탄생성 혐기성 기능성 미생물 군집을 제공하는 효과가 있다.
또, 디할로코코이데스 속(Dehalococcoides spp.) 균주의 개체수가 증가된 미생물 군집 JL-1(KCTC 11782BP)을 생물학적 정화에 이용하여 PCE 또는 TCE의 탈염소화 메커니즘(mechanism)에서 발암물질로 알려진 VC(vinyl chloride) 중간생성물의 축적 없이 에텐으로의 완전 분해가 가능한 미생물 제재를 제공하는 효과가 있다.
도 1은 탈염소화능을 갖는 혐기성 기능성 미생물 군집 JL-1(KCTC 11782BP) 로부터 본 발명 디할로코코이데스 속 미생물 균주의 개체수가 증가된 미생물 군집 JL-1 얻기 위한 계대 방법의 모식도이다.
도 2는 본 발명 디할로코코이데스 속 미생물 균주의 개체수가 증가된 미생물 군집 JL-1(KCTC 11782BP; 6번째 계대배양물)의 디할로코코이데스 속 미생물 균주의 개체수 증가율을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명 디할로코코이데스 속 미생물 균주의 개체수가 증가된 미생물 군집 JL-1(KCTC 11782BP; 6번째 계대배양물)의 미생물 군집구성이다.
도 4는 본 발명 디할로코코이데스 균주의 개체수가 증가된 미생물 군집 JL-1(KCTC 11782BP; 6번째 계대배양물)를 이용한 PCE 분해 실험결과이다.
본 발명은 하천에서 시료를 채취하고 이의 PCE 탈염소화능을 분석하여 미생물 군집을 선별하였으며, 이 미생물 군집을 JL-1로 명명하고 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2010년 10월 11일자로 기탁하여 기탁번호 KCTC 11782BP를 부여받았다.
본 발명을 위한 미생물 군집을 JL-1(KCTC 11782BP)의 배양 및 본 발명 디할로코코이데스 속의 개체수가 증가된 미생물 군집 JL-1의 배양을 위한 배지는 mineral salt medium DCB-1 배지를 사용하였고, 상기 배양용 배지를 제조용 첨가용 용액의 조성비율은 하기 표 1 내지 4에 그 조성비를 나타냈다.
본 발명 미생물 군집 JL-1(KCTC 11782BP) 배양용 배지 첨가용 salt 용액 조성표
Salts working solution(1×)[g/L] stock solution(100×)[g/L]
NaCl 1.0 100.0
MgCl2,·6H2O 0.5 50.0
KH2PO4 0.2 20.0
NH4Cl 0.3 30.0
KCl 0.3 30.0
CaCl2·2H2O 0.015 1.5
본 발명 미생물 군집 JL-1(KCTC 11782BP) 배양용 배지 첨가용 Trace element 용액 조성표
Trace element solution per liter
HCl(25% solution, w/w) 10 ml
FeCl2·4H2O 1500 mg
CoCl2·6H2O 190 mg
MnCl2·4H2O 100 mg
ZnCl2 70 mg
H3BO3 6 mg
Na2MoO4·2H2O 36 mg
NiCl2·6H2O 24 mg
CuCl2·2H2O 2 mg
본 발명 미생물 군집 JL-1(KCTC 11782BP) 배양용 배지 첨가용 Se/ Wo 용액 조성표
Se/ Wo solution mg/L
NaSeO3·5H2O 6
Na2WO4·2H2O 8
NaOH 500
본 발명 미생물 군집 JL-1(KCTC 11782BP) 배양용 배지 첨가용 vitamins 용액 조성표
Vitamins 1000×[mg/L] Final conc. [mg/L]
Biotin 20 0.02
folic acid 20 0.02
Pyridoxine hydrochloride 100 0.1
riboflavin 50 0.05
thiamine 50 0.05
Nicotinic acid 50 0.05
Pantothenic acid 50 0.05
Vitamin B12 1 0.001
p-aminobenzoic acid 50 0.05
Thioctic acid 50 0.05
본 발명 디할로코코이데스 속(Dehalococcoides spp.) 균주의 개체수가 증가된 미생물 군집 JL-1(KCTC 11782BP)을 배양하기 배지 조성물중 탄소원은 아세테이트, 포메이트, 프로피오네이트, 피루베이트, 락테이트, 메탄올 이며 아세테이트 또는 락테이트를 사용하는 것이 바람직하다. 또, 본 발명 디할로코코이데스 속(Dehalococcoides spp.) 균주의 개체수가 증가된 미생물 군집 JL-1(KCTC 11782BP)을 배양하기 배지 조성물중 전자 공여체는 수소, 아세테이트, 부틸레이트, 에탄올, 메탄올, 포메이트, 락테이트, 피루베이트, 숙시레이트, 프로피오네이트 중 어느 하나를 사용할 수 있으며 수소 또는 아세테이트를 사용하는 것이 바람직하다.
또한 본 발명 디할로코코이데스 속(Dehalococcoides sp.) 균주의 개체수가 증가된 미생물 군집 JL-1(KCTC 11782BP)을 배양하기 배지 조성물중 전자 수용체는 테트라클로로에틸렌(PCE) 및 트리클로로에틸렌(TCE), 시스디클로로에틸렌(cis-DCE), 트랜스 디클로로에틸렌(trans-DCE), 비닐클로라이드(VC) 중 어느 하나를 사용하지만 PCE를 사용하는 것이 바람직하다.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하나, 하기 실시예는 및 실험예에 의해 본 발명의 권리 범위가 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 마이크로코즘(microcosm)설정 및 계대배양
탈염소화능을 갖는 혐기성 기능성 미생물 군집 JL-1(KCTC 11782BP)을 배양하였다. 상기 혐기성 기능성 미생물 군집 JL-1(KCTC 11782BP) 배양조건은 160mL 용량의 병(bottle)에 하기 표 5의 본 발명 미생물 군집 배양용 배지 조성물 98 mL에 기능성 미생물 군집 JL-1(KCTC 11782BP) 배양물 2mL을 접종하여 25m℃에서 7일 동안 배양하여 기능성 미생물 군집 JL-1(KCTC 11782BP)의 배양액을 얻었다. 상기 배양액 2 mL을 하기 표 5의 조성물로 제조된 본 발명 계대 배양용 배지 98 mL에 접종하여 90일 동안 25 ℃에서 배양하여 1번째 계대 배양물(1st Transfer)을 얻었다. 2번째 계대 배양물(2nd Transfer)은 1번째 계대 배양물 2mL을 상기 1번째 계대 배양과 동일한 방법 및 동일한 조건의 배양용 배지, 배양온도, 배양시간으로 배양하여 얻었다. 상기 2번째 계대 배양물의 2mL은 암피실린(ampicilin)을 더 첨가하여 제조된 상기 계대 배양용 배지에 다시 계대 배양하여 동일한 조건에서 배양하였고, 상기 3번째 계대 배양에서 첨가한 암피실린은 암피실린에 저항성이 없는 균주의 개체수를 줄이고 암피실린 저항성이 있는 디할로코코이데스 속 미생물 균주의 개체 밀도를 선택적으로 증가시키는 역할을 한다. 상기와 3번째 계대 배양물을 만드는 동일한 조건으로 계대 배양을 2회 더 수행한 후에 2-브로모에탄설폰산(2-bromoethanesulfonate)과 락테이트(lactate)가 첨가된 본 발명인 6번째 계대 배양물을 얻었다. 상기 본 발명 6번째 계대 배양에서 첨가한 2-브로모에탄설폰산은 과다한 메탄 생성에 의한 탈염소화능의 저하를 막고자 메탄 생성균의 성장을 억제하기 위한 목적으로 첨가되었고, 대량배양시 유지관리 차원에서 유리한 전자공여체인 락테이트를 첨가하였다. 상기 설명된 본 발명 디할로코코이데스 속 미생물 균주의 개체수가 증가된 미생물 군집 JL-1의 배양 과정은 도 1에서 도식화하여 나타냈다.
상기 본 균주 배양을 포함한 모든 계대배양 단계에서 전자 수용체는 0.13mM의 PCE를 제공하였고, 5번째 계대배양까지는 탄소원으로 5mM의 아세테이트(acetate)를, 전자 공여체로는 90 μmol의 수소(H2)를 사용하였다. 그러나 본 발명인 6번째 계대 배양물을 얻기 위한 6번째 계대배양시에는 락테이트(lactate)를 전자공여체/탄소원으로 사용하였다. 상기 락테이트는 대량 배양 및 유지 관리의 용이성을 위하여 전자공여체/탄소원으로 사용하였다.
본 발명 디할로코코이데스 속 미생물 균주의 개체수가 증가된 미생물 군집 JL-1(KCTC 11782BP) 배양용 mineral salt medium DCB-1 배지 조성표
To prepare medium per liter
100 × salt solution (표1) 10 mL
Trace element solution 1 mL
Se/ Wo solution 1 mL
Resazurin (0.1% solution) 0.25 mL
electron donor Optional
H2O bidest up to 1,000 mL
< 실시예 2> 본 발명 디할로코코이데스 속 균주의 개체수가 증가된 미생물 군집 JL -1( KCTC 11782 BP )의 개체수 정량
상기 <실시예 1>로서 얻은 본 발명 디할로코코이데스 균주의 개체수가 증가된 미생물 군집 JL-1(6번째 계대 배양물)에 존재하는 디할로코코이데스 균주의 개체 증가율은 본 발명 상기 6번째 계대 배양물의 디할로코코이데스 속(Dehalococcoides spp.) 균주의 16S rRNA 유전자를 qPCR을 통하여 정량하였다. 또 이와 별도로 상기 미생물 군집에 포함된 박테리아 개체수를 박테리아의 16S rRNA 유전자를 qPCR을 통하여 정량한 후 상기 결과들을 바탕으로 본 발명에서 증가된 디할로코코이데스 속 미생물 균주의 개체수를 확인하였다.
실험예 1. 실시간 정량 PCR ( qPCR )분석
박테리아 및 디할로코코이데스 속(Dehalococcoides spp.)의 16S rRNA 유전자 총 수를 박테리아 16S rRNA 유전자 (Harms G, Layton AC, Dionisi HM, Gregory R, Garrett M, Hawkins SA, Robinson KG, Sayler GS (2003) Real-time PCR quantification of nitrifying bacteria in a municipal wastewater treatment plant. Environ Sci Technol 37:3430351) 및 Dehalococcoides spp.(He J, Ritalahti KM, Aiello MR, Loffler FE (2003) Complete detoxification of vinyl chloride by an anaerobic enrichment culture and identification of the reductively dechlorinating population as a Dehalococcoides species. Appl Environ Microbiol 69:996-1003)를 표적으로 하는 프라이머 세트를 사용하여 정량하였다. 박테리아에 대한 프라이머 세트로 Bac1055YF [ATGGYTGTCGTCAGCT] 및 Bac1392R [ACGGGCGGTGTGTAC]을 사용하고, 디할로코코이데스에 대한 프라이머 스트로 Dhc1200F [CTGGAGCTAATCCCCAAAGCT] 및 Dhc1271R [CAACTTCATGCAGGCGGG]를 사용하였다(Macrogen, Seoul, Korea) 1X SYBR Master Mix (BIO-RAD, USA), 상기 두 프라이머 세트(각각 300 nM) 및 10배 희석된 주형 DNA를 포함하는 각 20 ㎕의 반응 혼합물을 준비하였다. iQ5 Real-Time PCR Detection System (BIO-RAD, CA, USA)을 사용하여 qPCR을 실행하였다. 클로닝된 디할로코코이데스 속 미생물 균주 BAV1 16S rRNA 유전자 단편를 포함하는 플라스미드 DNA(클로닝을 통해 직접 제작)를 10배 계열희석하여 보정곡선을 확립하였다. 유전자 복제수(Gene copy numbers) (침전물의 g 당)를 계산하였다 (Kirsti M. Ritalahti, Benjamin K. Amos, Youlboong Sung, Qingzhong Wu, Stephen S. Koenigsberg, and Frank E. Loffler (2006) Quantitative PCR targeting 16S rRNA and reductive dehalogenase genes simultaneously monitors multiple Dehalococcoides strain. Appl Environ Microbiol 72:2765-2774). 계산식은 다음과 같다.
Figure pat00001
결과는 도 2에 나타난 것과 같이 1번째, 2번째 계대 배양물에서는 디할로코코이데스 속 미생물 균주의 개체수가 JL-1 미생물 군집 중에서 불과 5내지 10%에 달하였지만 암피실린을 첨가하여 계대한 3번째 계대 배양물부터는 디할로코코이데스 속 미생물 균주 개체가 15%까지 증가하였다. 최종적으로 얻은 본 발명 디할로코코이데스 속 미생물 균주의 개체수가 증가된 미생물 군집 JL-1(6번째 계대배양물)의 디할로코코이데스 속 미생물 균주의 개체수는 도 3에 나타난 것과 같이 32.7%까지 증가하였다.
< 실시예 3> 본 발명 디할로코코이데스 속 균주의 개체수가 증가된 미생물 군집 JL -1( KCTC 11782 BP )에 의한 PCE 의 완전탈염소능 측정
상기 <실시예 1>로서 얻은 본 발명 디할로코코이데스 속 미생물 균주의 증식능력이 증가된 미생물 군집 JL-1(6번째 계대 배양물)의 PCE의 완전탈염소능을 상기 본 발명 미생물 군집 배양액에 존재하는 PCE와 PCE 분해 중간 산물인 TCE, cis-DCE, VC 및 최종 분해 산물인 ethene을 가스크로마토그래피 분석법을 통하여 측정하였다. 5번째의 계대배양 과정에 있어 탈염소화 균주들과 메탄 생성균주들이 아세테이트(acetate), 수소(H2) 등의 기질을 두고 경쟁하여 탈염소화능이 메탄이 과 생성되는 현상이 나타나, 본 발명인 6번째 배양물에서는 메탄 생성균들의 성장을 억제하는 2-브로모에탄설폰산(2-bromoethanesulfonate)를 첨가하였고, 메탄 생성 억제 효과를 가스크로마토그래피 분석법을 통하여 측정하였다.
가스-방지 테플론 밸브(gas-tight Teflon valves) 및 Luer Lock 어뎁터를 구비한 250 ㎕ 가스-방지 유리 주사기(Hamilton, NV, USA)를 사용하여 마이크로코즘의 상부 공간(headspace)에서 0.1 ml의 기체 채취하고, 이를 FID(flame ionization detector) 및 HP-624 컬럼(60 m by 0.32 mm; film thickness, 1.8 μm)이 설치된 Hewlett-Packard 6890 GC를 사용하여 휘발성 염화 에텐류를 측정하였다. 헬륨은 10 ml/min의 유속을 갖는 케리어 가스이다. 4분 동안 50 ℃로 온도를 유지시켰다가 25 ℃ min-1 to 250 ℃까지 25 ℃ min-1의 속도로 온도를 증가시킨 후 온도를 250 ℃에서 4분 동안 유지시켰다. 표준 곡선 알려진 질량의 염화에텐을 포함하는 상부 공간 기체 시료 관을 측정하여 표준곡선을 작성하였다 (Amos BK, Christ JA, Abriola LM, Pennell KD, Loffler FE (2007) Experimental evaluation and mathematical modeling of microbially enhanced tetrachloroethene (PCE) dissolution. Environ Sci Technol 41:963-970).
도 4에 나타난 것과 같이 본 발명 디할로코코이데스 속 균주의 개체수가 증가된 미생물 군집 JL-1의 6번째 계대 배양물을 이용한 PCE 분해 실험은 상기 본 발명 미생물 군집 6번째 계대 배양액을 이용하여 총 70일 동안 측정하였다. PCE는 본 발명 디할로코코이데스 속 균주의 개체수가 증가된 미생물 군집 JL-1의 배양액과 반응하여 약 60일 이후에는 완전히 분해되어 반응물에서는 PCE가 검출되지 않았다. 상기 분해된 PCE는 반응물에서 VC상태로 분해되어 존재하였고 VC는 본 발명 디할로코코이데스 속 미생물 균주의 개체수가 증가된 미생물 군집 JL-1(KCTC 11782BP)에 의해 70일 이후에는 100% 완전 분해되었다.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 디할로코코이데스 속(Dehalococcoides spp.) 균주의 개체수가 증가된 미생물 군집 JL-1(KCTC 11782BP)을 제공하는 효과가 있고 또 상기 본 발명 미생물 군집을 생물학적 정화에 이용하는 효과가 있으므로 PCE 또는 TCE의 탈염소화 메커니즘(mechanism)에서 발암물질로 알려진 VC(vinyl chloride) 중간생성물의 축적 없이 에텐으로의 완전 분해가 가능한 미생물 제제를 제공하는 뛰어난 효과가 있어 환경산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (10)

  1. 디할로코코이데스 속 미생물 균주 배양용 배지 조성물 1L에 대하여, NaCl 1.0 g/L, MgCl2·6H2O 0.5 g/L, KH2PO4 0.2 g/L, NH4Cl 0.3 g/L, KCl, 0.3g/L, CaCl2·2H2O 0.015g/L의 염과, HCl 0.25중량%, FeCl2·4H2O 1.5 mg/L, CoCl2·6H2O 0.190 mg/L, MnCl2·4H2O 0.100 mg/L, ZnCl2 0.07 mg/L, H3BO3 0.006 mg/L, Na2MoO4·2H2O 0.036 mg/L, NiCl2·6H2O 0.024 mg/L, CuCl2·2H2O 0.002 mg/L과 NaSeO3·5H2O 0.006 mg/L, Na2WO4·2H2O 0.008 mg/L, NaOH 0.5 mg/L, Resazurin 용액 0.000025 중량% 임을 특징으로 하는 디할로코코이데스 속, 지오박터 속, 디설프로모나스 속 으로 구성된 미생물 군집 JL-1(KCTC 11782BP)의 디할로코코이데스 속 미생물 균주 세포의 개체수 증가용 배양배지
  2. 제 1항 기재의 배양배지를 이용하여 테트라클로로에틸렌(PCE) 및 트리클로로에틸렌(TCE) 완전 탈염소화능이 있는 미생물 군집 JL-1(KCTC 11782BP)을 배양하는 단계와; 상기 배양한 미생물 군집 JL-1의 배양용 배지를 이용하여 지속적으로 계대 배양하는 단계와; 상기 배양단계에서 전자 수용체, 탄소 및 전자 공여체를 제공하는 단계와; 상기 배양된 미생물 군집 JL-1 균주 중 디할로코코이데스 속 미생물 균주를 항생제를 첨가하여 배양하는 단계와; 상기에서 항생제를 첨가하여 배양한 미생물군집 배양액을 탈염소화능의 저해활성이 있는 메탄 생성균의 성장을 억제제를 첨가하여 계대하고 전자공여체를 락테이트로 전환하는 단계를 포함하여 디할로코코이데스 속(Dehalococcoides sp.) 미생물 균주의 개체수를 증가시키는 것이 특징인 미생물 군집 JL-1 배양방법
  3. 제 2항에 있어서, 상기 전자 수용체는 테트라클로로에틸렌(PCE) 및 트리클로로에틸렌(TCE), 시스디클로로에틸렌(cis-DCE), 트랜스 디클로로에틸렌(trans-DCE), 비닐클로라이드(VC) 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 배양방법
  4. 제 2항에 있어서, 상기 탄소원은 아세테이트, 포메이트, 프로피오네이트, 피루베이트, 락테이트, 메탄올 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 배양방법
  5. 제 2항에 있어서, 상기 전자 공여체는 수소, 아세테이트, 부틸레이트, 에탄올, 메탄올, 포메이트, 락테이트, 피루베이트, 숙시레이트, 프로피오네이트 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 배양방법
  6. 제 2항에 있어서, 상기 항생제는 암피실린인 것을 특징으로 하는 배양방법
  7. 제 2항에 있어서, 상기 메탄 생성균 억제제는 2-브로모에탄설폰산임을 특징으로 하는 배양방법
  8. 제 2항의 배양 방법으로 배양된 디할로코코이데스 속(Dehalococcoides spp.) 균주의 개체수가 증가된 것이 특징인 미생물 군집 JL-1(KCTC 11782BP)
  9. 제 8항 기재의 디할로코코이데스 속(Dehalococcoides spp.) 균주의 개체수가 증가된 미생물 군집 JL-1(KCTC 11782BP)의 배양물
  10. 제 8항 또는 제 9항 기재의 디할로코코이데스 속(Dehalococcoides spp.) 균주의 개체수가 증가된 미생물 군집 JL-1(KCTC 11782BP) 또는 그 배양물을 유효성분으로 함유하는 환경정화용 미생물 제제
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