KR20130121464A - Bio senser using electrocatalytic activity of electrochemically reduced graphene oxide, method for preparing the same, and sensing method thereof - Google Patents

Bio senser using electrocatalytic activity of electrochemically reduced graphene oxide, method for preparing the same, and sensing method thereof Download PDF

Info

Publication number
KR20130121464A
KR20130121464A KR1020120044691A KR20120044691A KR20130121464A KR 20130121464 A KR20130121464 A KR 20130121464A KR 1020120044691 A KR1020120044691 A KR 1020120044691A KR 20120044691 A KR20120044691 A KR 20120044691A KR 20130121464 A KR20130121464 A KR 20130121464A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
electrode
graphene oxide
biosensor
probe material
enzyme
Prior art date
Application number
KR1020120044691A
Other languages
Korean (ko)
Other versions
KR101338168B1 (en
Inventor
김규원
몬술 하크
Original Assignee
인천대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 인천대학교 산학협력단 filed Critical 인천대학교 산학협력단
Priority to KR1020120044691A priority Critical patent/KR101338168B1/en
Publication of KR20130121464A publication Critical patent/KR20130121464A/en
Application granted granted Critical
Publication of KR101338168B1 publication Critical patent/KR101338168B1/en

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5302—Apparatus specially adapted for immunological test procedures
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Electrolytic Production Of Non-Metals, Compounds, Apparatuses Therefor (AREA)

Abstract

The present invention relates to an electrochemical biosensor using electrocatalysis of electrochemically reduced graphene oxides, a method for producing the same, and a sensing method. The electrochemical biosensor according to the present invention shows superior selectivity, sensitivity, and economic efficiency compared to an existing biosensor, needs a dye for inducing a change in optical properties according to a bond between materials, and has economic efficiency compared with an optical method needing a process of labeling a target material or a probe material with the dye because the electrochemical biosensor senses the target material or a probe material by an electrochemical method.

Description

전기화학적으로 환원된 그래핀 산화물의 전기촉매현상을 이용한 전기화학 바이오 센서, 이의 제조방법 및 센싱방법 {Bio senser using electrocatalytic activity of electrochemically reduced graphene oxide, method for preparing the same, and sensing method thereof}Biosensor using electrocatalytic activity of electrochemically reduced graphene oxide, method for preparing the same, and sensing method according to electrochemical biosensor using electrocatalyst of electrochemically reduced graphene oxide

본 발명은 전기화학적으로 환원된 그래핀 산화물의 전기촉매현상을 이용한 전기화학 바이오 센서, 이의 제조방법, 및 센싱방법에 관한 것이다.The present invention relates to an electrochemical biosensor using an electrocatalyst of electrochemically reduced graphene oxide, a preparation method thereof, and a sensing method.

클락형(Clack-type) 포도당 센서의 출현 이후로, 전기화학적 바이오 센서는 그 선택성, 간단성, 민감도, 및 경제성 때문에 질병의 진단, 음식의 분석, 환경의 관찰 및 분석의 분야에서 우수한 분석 기술로 발전되어 왔다. 게다가 다른 바이오 센서에 비해서 그 성능의 저하가 없이도 소형화를 할 수 있다는 장점이 있다. 새로운 바이오 센서의 플랫폼과 새로운 전략을 이용하여 전기화학적 바이오 센서의 민감도와 선택성 등을 더욱 발달시키기 위한 연구가 진행되고 있다. 그 중에서도 그래핀을 이용한 바이오 센서의 플랫폼에 대한 관심이 높아지고 있다.Since the advent of the Clack-type glucose sensor, electrochemical biosensors have been selected for their excellent selectivity, simplicity, sensitivity, and economics, making them an excellent analytical technology in the areas of disease diagnosis, food analysis, Has been developed. In addition, there is an advantage that the biosensor can be downsized without deterioration in performance compared to other biosensors. Research is underway to further develop the sensitivity and selectivity of electrochemical biosensors using new biosensor platforms and new strategies. Among them, interest in the platform of biosensors using graphene is increasing.

그래핀(graphene)은 탄소원자가 2차원(2D) 격자 내로 채워진 평면 단일층 구조를 의미하며, 이것은 모든 다른 차원구조의 흑연(graphite) 물질의 기본 구조를 이룬다. 즉, 상기 그래핀은 0차원 구조인 풀러린(fullerene), 1차원 구조인 나노튜브 또는 3차원 구조로 적층된 흑연의 기본 구조가 될 수 있다. 2004년 Novoselev 등은 SiO2/Si 기판의 상부 상에서 프리-스탠딩 그래핀 단일층을 수득하였다고 보고하였으며, 이것은 기계적인 미세 분할법에 의하여 실험적으로 발견되었다. 최근 많은 연구그룹들이 그래핀이 갖는 허니콤(벌집)형태의 결정 구조, 두 개의 상호침투하는 삼각 형태의 하위 격자 구조, 및 하나의 원자 크기에 해당하는 두께 등에 의하여 그래핀이 특이한 물리적 특성(예를 들면 제로 밴드갭)을 보이는 점에 주목하고 있다. 또한 그래핀은 특이한 전하 운송 특성을 갖는데, 이로 인하여 그래핀은 종래에는 관찰되지 않았던 독특한 현상을 보여준다. 예를 들면, 반정수 양자 홀 효과 및 바이폴라 초전류 트랜지스터 효과 등이 그 예이며, 이 또한 상기 설명한 그래핀의 특유한 구조에 기인하는 것으로 여겨진다.Graphene refers to a planar monolayer structure in which carbon atoms are filled into a two-dimensional (2D) lattice, which forms the basis for all other dimensional graphite materials. That is, the graphene may be a basic structure of graphite stacked in a fullerene, a one-dimensional nanotube, or a three-dimensional structure. In 2004, Novoselev et al reported that a free-standing graphene monolayer was obtained on top of a SiO2 / Si substrate, which was found experimentally by mechanical microfractionation. In recent years, many research groups have shown that graphene has unique physical properties due to its honeycomb crystal structure, two interpenetrating triangular sub lattice structures, and the thickness of one atomic size. For example, attention is paid to the fact that it shows zero band gap). In addition, graphene has unique charge transport characteristics, which causes graphene to exhibit a unique phenomenon that has not been observed in the past. For example, the semi-integer quantum Hall effect, the bipolar supercurrent transistor effect, and the like are examples, and this is also considered to be due to the unique structure of the graphene described above.

그래핀 산화물(Graphene Oxide, GO)과 전기화학적으로 환원된 그래핀 산화물(Electrochemically Reduced Graphene Oxide, ERGO)은 바이오 센서의 구성물, 세포 이미징(cellular imaging), 약물 전달 등에 있어서 활용 가능성이 높은 물질로 알려져 있다. 이들은 기존의 그라파이트보다 매우 큰 표면적을 가지며, 높은 전기전도도 및 강력한 기계적 강도를 가진다. 또한 부서지기 쉬운 그라파이트보다 유연하여, 유연성이 필요한 전기제품 등에 대해서 장점을 가지며, 그라파이트보다 더 많은 균일분포된 전기화학적 활성사이트를 가진다. 또한 기존에 전극표면의 재료로 많이 사용되어온 카본나노튜브가 많은 정제과정을 거친다고 하더라도, 카본나노튜브 내부에 촉매로 사용된 금속나노입자가 남아있는 것은 확인된 사실이며, 이 불순물은 전기화학적 성질을 가지기 때문에 카본나노튜브의 전기화학적 성질이 변하게 된다는 점에서, 이러한 단점을 가지지 않는 그래핀은 우수한 전극 표면 재료라는 평가를 받고 있다.Graphene Oxide (GO) and Electrochemically Reduced Graphene Oxide (ERGO) are known to be highly applicable materials for biosensor composition, cellular imaging, and drug delivery. have. They have a much larger surface area than conventional graphite, have high electrical conductivity and strong mechanical strength. It is also more flexible than brittle graphite and has advantages for electrical appliances that require flexibility and has more uniformly distributed electrochemically active sites than graphite. In addition, even if carbon nanotubes, which have been conventionally used as materials for electrode surfaces, undergo many purification processes, it has been confirmed that metal nanoparticles used as catalysts remain inside the carbon nanotubes. This impurity has electrochemical properties , The electrochemical properties of the carbon nanotubes are changed. Thus, graphenes without such disadvantages are evaluated as excellent electrode surface materials.

효소면역분석법(ELISA, Enzyme-linked immunosorbent assay)은 효소를 표식자로 하여 항원항체반응을 이용한 항원 또는 항체량의 측정 방법을 말한다. 그 중에서도 샌드위치 효소면역분석법(sandwich ELISA)은 1, 2차 항원 항체 반응을 이용하여 알아내고자 하는 특정 단백질, 항원 또는 항체 등의 유무 및 양을 측정하는 데에 쓰인다.Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) refers to a method for measuring the amount of antigen or antibody using an antigen-antibody reaction using an enzyme as a marker. Among them, sandwich ELISA is used to determine the presence and amount of specific proteins, antigens or antibodies to be detected by using first and second antigen antibody reactions.

따라서, 그래핀 산화물 및 샌드위치 효소면역분석법을 이용하여 만든, 선택성 및 민감도가 월등한 전기화학적 바이오 센서에 대한 연구의 필요성이 절실히 요구되고 있다.Therefore, there is an urgent need for research on electrochemical biosensors having excellent selectivity and sensitivity, which are made using graphene oxide and sandwich enzyme immunoassay.

본 발명자들은 전기화학적으로 환원된 그래핀 산화물을 재료로 이용하여 만든 전극을 이용하고 샌드위치 효소면역분석법을 응용한, 전기화학적 바이오 센서가 기존의 바이오 센서에 비해 선택성 및 민감도가 월등하다는 사실을 밝혀내고, 본 발명을 완성하였다.The inventors have found that electrochemical biosensors using an electrode made from electrochemically reduced graphene oxide as a material and applying sandwich enzyme immunoassay have superior selectivity and sensitivity compared to conventional biosensors. The present invention has been completed.

따라서, 본 발명은 전기화학적으로 환원된 그래핀 산화물의 전기촉매현상을 이용한 전기화학 바이오 센서를 제공하고자 한다.Accordingly, the present invention is to provide an electrochemical biosensor using the electrocatalyst of the electrochemically reduced graphene oxide.

또한, 본 발명은 전기화학적으로 환원된 그래핀 산화물의 전기촉매현상을 이용한 전기화학 바이오 센서의 제조방법 및 센싱방법을 제공하고자 한다.In addition, the present invention is to provide a manufacturing method and a sensing method of the electrochemical biosensor using the electrocatalyst of the electrochemically reduced graphene oxide.

본 발명은 전기화학적으로 환원된 그래핀 산화물의 전기촉매현상을 이용한 전기화학 바이오 센서를 제공한다.The present invention provides an electrochemical biosensor using the electrocatalyst of the electrochemically reduced graphene oxide.

또한, 본 발명은 전기화학적으로 환원된 그래핀 산화물의 전기촉매현상을 이용한 전기화학 바이오 센서의 제조방법 및 센싱방법을 제공한다.The present invention also provides a manufacturing method and a sensing method of an electrochemical biosensor using the electrocatalyst of the electrochemically reduced graphene oxide.

본 발명에 따른 전기화학적으로 환원된 그래핀 산화물의 전기촉매현상을 이용한 전기화학 바이오 센서는 기존의 바이오 센서보다 우수한 선택성, 민감도 및 경제성을 제공한다. 또한 물질간의 결합에 따른 광학적 특성 변화를 유도하기 위한 염료(dye)가 필요하고, 표적 물질 또는 프로브 물질을 염료로 표지화(labeling)시켜야 하는 공정상의 필요가 있는 광학적 방식에 비해, 전기화학적 방식을 이용하여 센싱을 하는 본 발명은 경제성에 있어서 우수한 효과를 제공한다.The electrochemical biosensor using the electrocatalyst of the electrochemically reduced graphene oxide according to the present invention provides superior selectivity, sensitivity, and economics than conventional biosensors. In addition, the electrochemical method is used in comparison with the optical method, which requires a dye to induce optical property change due to the binding between materials, and a process need to label a target material or a probe material with a dye. By sensing the present invention provides an excellent effect in economics.

도 1은 본 발명의 전기화학적으로 환원된 그래핀 산화물을 이용한 전기화학 바이오 센서의 제조과정과 센싱방법을 나타낸 도이다.
도 2는 주사전자현미경을 이용하여 촬영된 ITO 전극, AEBD/ITO 전극, GO/AEBD/ITO 전극 및 ERGO/AEBD/ITO 전극에 대한 표면구조 나타낸 도이다.
도 3은 poly(B.P.N.)/ERGO/AEBD/ITO 전극 표면에 대해 H2O2의 농도별로 측정한 순환전압전류법에 따른 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 BSA의 양에 따른 백그라운드 전류의 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 ITO 전극 표면, AEBD/ITO 전극 표면, GO/AEBD/ITO 전극 표면 및 ERGO/AEBD/ITO 전극 표면에 대한 순환전압전류법의 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 원자력 현미경에 의해 촬영된 그래핀 산화물의 구조를 나타낸 도이다.
도 7은 항원의 검출 이후에 poly(B.P.N.)/GO/AEBD/ITO 전극 표면 및 poly(B.P.N.)/ERGO/AEBD/ITO 전극 표면에 대한 순환전압전류법의 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 poly(B.P.N.)/ERGO/AEBD/ITO 전극 표면에 대해, 다른 종류의 항원을 이용하여 측정한 순환전압전류법의 결과를 나타낸 도이다.
도 9은 마우스 IgG의 농도를 변화시키며 각각 (A) femtograms/mL (B) picograms/mL (C) nanograms/mL (D) micrograms/mL의 스케일로 나타낸 순환전압전류법의 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 항원의 농도에 따른 환원 피크 전류의 변화 그래프를 나타낸 도이다.
GO는 Graphene Oxide,
ERGO는 Electrochemically Reduced Graphene Oxide,
AEBD는 Aminoethyl benzenediazonium,
poly(B.P.N)은 poly(BMA-r-mPEGMA-r-NAS)를 각각 나타낸다.1 is a view showing a manufacturing process and a sensing method of an electrochemical biosensor using the electrochemically reduced graphene oxide of the present invention.
FIG. 2 illustrates surface structures of an ITO electrode, an AEBD / ITO electrode, a GO / AEBD / ITO electrode, and an ERGO / AEBD / ITO electrode photographed using a scanning electron microscope.
3 is a diagram showing the results of the cyclic voltammetry measured for each concentration of H 2 O 2 on the surface of the poly (BPN) / ERGO / AEBD / ITO electrode.
4 is a diagram illustrating a measurement result of background current according to the amount of BSA.
5 shows the results of cyclic voltammetry on the surface of the ITO electrode, the AEBD / ITO electrode surface, the GO / AEBD / ITO electrode surface, and the ERGO / AEBD / ITO electrode surface.
6 is a diagram showing the structure of graphene oxide taken by atomic force microscopy.
FIG. 7 shows the results of cyclic voltammetry on the surface of poly (BPN) / GO / AEBD / ITO electrode and the surface of poly (BPN) / ERGO / AEBD / ITO electrode after antigen detection.
Fig. 8 is a diagram showing the results of cyclic voltammetry measured using different types of antigens on the surface of poly (BPN) / ERGO / AEBD / ITO electrodes.
9 is a diagram showing the results of cyclic voltammetry, varying the concentration of mouse IgG (A) femtograms / mL (B) picograms / mL (C) nanograms / mL (D) micrograms / mL respectively.
10 is a graph showing a change in the reduction peak current according to the concentration of the antigen.
GO is Graphene Oxide,
ERGO uses Electrochemically Reduced Graphene Oxide,
AEBD is Aminoethyl benzenediazonium,
poly (BPN) represents poly (BMA-r-mPEGMA-r-NAS), respectively.

본 발명은 전기화학적으로 환원된 그래핀 산화물의 전기촉매현상을 이용한 전기화학 바이오 센서를 제공한다.The present invention provides an electrochemical biosensor using the electrocatalyst of the electrochemically reduced graphene oxide.

상기 바이오 센서는 산화 인듐(indium tin oxide, ITO) 전극에 대해, 아미노에틸 벤젠디아조늄(Aminoethyl benzenediazonium, AEBD)을 전착시키고, 그래핀 산화물(Graphene oxide, GO)를 코팅한 뒤, 전기화학적으로 환원시키고, 이어서 poly(B.P.N.)를 결합하여 만든 전극에 1차 프로브 물질, 표적 물질, 및 2차 프로브 물질을 부착하여 제조된다.The biosensor electrodeposits aminoethyl benzenediazonium (AEBD) on an indium tin oxide (ITO) electrode, and coats graphene oxide (GO), followed by electrochemical reduction. Then, it is prepared by attaching a primary probe material, a target material, and a secondary probe material to an electrode made by combining poly (BPN).

상기 표적 물질은 항원이고, 1차 프로브 물질 및 2차 프로브 물질은 항체인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
The target material is an antigen, and the primary probe material and the secondary probe material are preferably antibodies, but are not limited thereto.

또한, 본 발명은In addition,

1) 산화인듐(ITO)을 포함하는 전극을 그래핀 산화물(GO)로 코팅하고, 전기화학적으로 환원시키는 단계; 및1) coating an electrode including indium oxide (ITO) with graphene oxide (GO) and electrochemically reducing; And

2) 상기 1)단계에서 얻은 전기화학적으로 환원된 그래핀 산화물(ERGO)이 코팅된 전극에 1차 프로브 물질을 결합하고, 표적 물질을 결합한 뒤, 효소가 결합된 2차 프로브 물질을 결합하는 단계;2) binding the primary probe material to the electrode coated with the electrochemically reduced graphene oxide (ERGO) obtained in step 1), binding the target material, and then binding the enzyme-bound secondary probe material ;

를 포함하는 바이오 센서의 제조방법을 제공한다.It provides a method of manufacturing a biosensor comprising a.

상기 표적 물질은 항원이고, 1차 프로브 물질 및 2차 프로브 물질은 항체인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.The target material is an antigen, and the primary probe material and the secondary probe material are preferably antibodies, but are not limited thereto.

하기에, 본 발명에 따른 바이오 센서의 제조방법에 대해 단계별로 상세히 설명한다. 모든 실험은 실온에서 진행한다.
In the following, the method of manufacturing the biosensor according to the present invention will be described in detail step by step. All experiments are conducted at room temperature.

상기 1)단계는 전기화학적으로 환원된 그래핀 산화물(Electrochemically Reduced Graphene Oxide, ERGO)이 코팅된 산화인듐 전극을 제조하는 단계로, 먼저 ITO를 포함하는 전극을 아세톤, 에탄올 및 물을 이용해 세척한 후, 질소 기체 하에서 건조시킨다. 이후, 상기 전극을 piranha 용액(H2SO4 : H2O2 = 3 : 1)에 담근 뒤, 다량의 물로 세척하고 질소 기체 하에서 건조시킨다. 이후, 전기화학적 반응을 일으키기 전에 질소 기체를 이용하여 15분간 AEBD의 공기를 제거하고, 아세토니트릴 하에서 0.05M~0.2M의 Bu4NBF4(tetrabutylammonium tetrafluoroborate)과 함께, 바람직하게는 0.1M Bu4NBF4과 함께 아미노에틸벤젠디아조늄염(AEBD salt) 용액 1~5mM, 바람직하게는 2mM을 전극과 혼합한 뒤, 삼극식셀을 이용하여 +0.1V에서 -1.0V까지 20~80mV/s의 주사 속도(scan rate)로, 바람직하게는 50mV/s의 주사 속도로 전극에 AEBD를 전착시킨다. 전착 후, 상기 전극을 물 및 아세토니트릴을 이용하여 세척한 뒤, 질소 기체 하에서 건조시킨다. In step 1), an electrochemically reduced Graphene Oxide (ERGO) -coated indium oxide electrode is coated. First, the electrode containing ITO is washed with acetone, ethanol and water. And dried under nitrogen gas. Thereafter, the electrode is immersed in piranha solution (H 2 SO 4 : H 2 O 2 = 3: 1), washed with a large amount of water and dried under nitrogen gas. Thereafter, the air of AEBD was removed for 15 minutes using nitrogen gas before the electrochemical reaction, and with 0.05M-0.2M Bu 4 NBF 4 (tetrabutylammonium tetrafluoroborate) under acetonitrile, preferably 0.1M Bu 4 NBF 1 to 5 mM, preferably 2 mM, of the aminoethylbenzenediazonium salt (AEBD salt) solution with 4 were mixed with the electrode, and then scanning speed of 20 to 80 mV / s from +0.1 V to -1.0 V using a tripolar cell. AEBD is electrodeposited on the electrode at a scan rate, preferably at a scanning rate of 50 mV / s. After electrodeposition, the electrode is washed with water and acetonitrile and then dried under nitrogen gas.

이후, 상기 전극을 그래핀 산화물(~0.1mg/mL) 용액에 2~6시간 동안, 바람직하게는 4시간 동안 잠기게 하여 그래핀 산화물이 코팅된 산화인듐 전극을 제조한다.Thereafter, the electrode is immersed in a graphene oxide (˜0.1 mg / mL) solution for 2 to 6 hours, preferably 4 hours to prepare an indium oxide electrode coated with graphene oxide.

상기에서 얻어진 그래핀 산화물이 코팅된 산화인듐 전극을 전기화학적으로 환원시키기 위하여, 0.0V을 기점으로 20~80mV/s의 속도로, 바람직하게는 50mV/s의 속도로 전위 소인(potential scan)을 시행한다. 그리고 0.2~0.8M의, 바람직하게는 0.5M의 NaCl 용액 내에서, 약 -1.0V로 측정된 피크 전위로 15초~30초간, 바람직하게는 20초간 유지하여 전기화학적으로 환원된 그래핀 산화물이 코팅된 산화인듐 전극을 제조한다.
In order to electrochemically reduce the graphene oxide-coated indium oxide electrode obtained above, a potential scan is performed at a speed of 20 to 80 mV / s, preferably 50 mV / s, starting from 0.0 V. Do it. And in the 0.2 ~ 0.8M, preferably 0.5M NaCl solution, the graphene oxide electrochemically reduced by holding for 15 seconds to 30 seconds, preferably 20 seconds at a peak potential measured by about -1.0V Prepare a coated indium oxide electrode.

상기 2)단계는 상기 1)단계에서 얻은 전기화학적으로 환원된 그래핀 산화물이 코팅된 전극에 1차 프로브 물질을 결합하고, 표적 물질을 결합한 뒤, 효소가 결합된 2차 프로브 물질을 결합하는 단계로서, 먼저 1차 프로브 물질을 용이하게 전극 표면에 결합시키기 위해서 15~40mg/mL, 바람직하게는 20mg/mL 농도의 poly(B.P.N.) 40~70μL, 바람직하게는 50μL을 상기 전극에 떨어뜨려 상기 전극에 코팅한다.In step 2), the primary probe material is bound to the electrochemically reduced graphene oxide-coated electrode obtained in step 1), the target material is bound, and then the enzyme is coupled to the secondary probe material. First, in order to easily bind the primary probe material to the electrode surface, 40 to 70 μL, preferably 50 μL, of poly (BPN) at a concentration of 15 to 40 mg / mL, preferably 20 mg / mL, is dropped onto the electrode. To coat.

1차 프로브 물질을 결합시키기 위하여, 1차 프로브 물질 용액 30~70μL, 바람직하게는 50μL를 상기 전극 표면에 떨어뜨리고, 1~4시간 동안, 바람직하게는 2시간 동안 배양한다. 이후, PBST(poly butylene succinate-co-terephthalate)와 물로 세척하고, 질소 기체 하에서 건조시킨다.To bind the primary probe material, 30-70 μL, preferably 50 μL, of the primary probe material solution is dropped on the electrode surface and incubated for 1-4 hours, preferably for 2 hours. Then, it is washed with PBST (poly butylene succinate-co-terephthalate) and water, and dried under nitrogen gas.

추가적인 활성 그룹과 비특이적인 결합부위를 막기 위해 PBS(phosphate buffered saline) 용액 내에서, 상기 전극을 2~5% BSA(bovin serum albumin)와 함께, 바람직하게는 3% BSA와 함께 약 1시간 동안 배양한다. 이후, 전극 표면을 PBS 용액과 물로 세척하고, 질소 기체 하에서 건조시킨다.Incubate the electrode with 2-5% bovin serum albumin (BSA), preferably with 3% BSA, for about 1 hour in phosphate buffered saline (PBS) solution to prevent additional active groups and nonspecific binding sites. do. The electrode surface is then washed with PBS solution and water and dried under nitrogen gas.

표적 물질을 상기 1차 프로브 물질이 결합된 전극 표면에 떨어뜨리고, 30분~3시간, 바람직하게는 1시간 동안 배양한다. 이후, PBST와 물로 세척하고, 질소 기체 하에서 건조시킨다.The target material is dropped on the electrode surface to which the primary probe material is bound and incubated for 30 minutes to 3 hours, preferably 1 hour. It is then washed with PBST and water and dried under nitrogen gas.

효소가 결합된 2차 프로브 물질을 상기 전극 표면에 떨어뜨리고, 30분~3시간, 바람직하게는 1시간 동안 배양한다. 이후, PBST와 물로 세척하고, 질소 기체 하에서 건조시킨다. Enzyme bound secondary probe material is dropped on the electrode surface and incubated for 30 minutes to 3 hours, preferably 1 hour. It is then washed with PBST and water and dried under nitrogen gas.

상기 표적 물질은 항원이고, 1차 프로브 물질 및 2차 프로브 물질은 항체인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
The target material is an antigen, and the primary probe material and the secondary probe material are preferably antibodies, but are not limited thereto.

또한, 본 발명은In addition,

1) 산화인듐을 포함하는 전극을 그래핀 산화물로 코팅하고, 전기화학적으로 환원시키는 단계; 1) coating an electrode comprising indium oxide with graphene oxide and electrochemically reducing it;

2) 상기 1)단계에서 얻은 전기화학적으로 환원된 그래핀 산화물이 코팅된 전극에 1차 프로브 물질을 결합하고, 표적 물질을 결합한 뒤, 효소가 결합된 2차 프로브 물질을 결합하는 단계; 및2) binding the primary probe material to the electrochemically reduced graphene oxide coated electrode obtained in step 1), binding the target material, and then binding the secondary probe material to which the enzyme is bound; And

3) 상기 2)단계의 2차 프로브 물질에 결합된 효소의 촉매반응에 의해 생성되는 생성물의 산화-환원반응에 의한 전류를 측정하는 단계를 포함하는 바이오 센싱방법을 제공한다.3) It provides a bio-sensing method comprising the step of measuring the current by the oxidation-reduction reaction of the product produced by the catalytic reaction of the enzyme bound to the secondary probe material of step 2).

하기에, 본 발명에 따른 바이오 센서의 센싱방법에 대해 상세히 설명한다.
Hereinafter, the sensing method of the biosensor according to the present invention will be described in detail.

표적 물질의 검출을 위하여, 전극을 1.0~2.0mM, 바람직하게는 1.5mM의 H2O2와 1.0~3.0mM, 바람직하게는 2.0mM의 hydroquinin(HQ)이 포함된 PBS 용액에 담그어, 효소 반응이 일어나는 동안, 약 5분간 방치한다. 이후, -0.03V부터 0.2V 사이에서 순환전압전류법(Cyclic Voltammetry)을 시행한다. 효소 반응으로부터 생성된 Benzoquinin(BQ)으로 부터의 환원 피크 전류(Reduction peak current)를 기록한다.
For detection of the target substance, the electrode is immersed in a PBS solution containing 1.0-2.0 mM, preferably 1.5 mM H 2 O 2 and 1.0-3.0 mM, preferably 2.0 mM hydroquinin (HQ), to enzymatic reaction. During this time, leave for about 5 minutes. Then, cyclic voltammetry is performed between -0.03V and 0.2V. Record the reduction peak current from Benzoquinin (BQ) generated from the enzymatic reaction.

상기 제조된 전기화학적으로 환원된 그래핀 산화물의 전기촉매현상을 이용한 전기화학 바이오 센서는 기존의 바이오 센서보다 우수한 선택성, 민감도 및 경제성을 제공한다. 또한 물질간의 결합에 따른 광학적 특성 변화를 유도하기 위한 염료(dye)가 필요하고, 표적 물질 또는 프로브 물질을 염료로 표지화(labeling)시켜야 하는 공정상의 필요가 있는 광학적 방식에 비해, 전기화학적 방식을 이용하여 센싱을 하는 본 발명은 경제성에 있어서 우수한 효과를 제공한다.
The electrochemical biosensor using the electrocatalyst of the electrochemically reduced graphene oxide prepared above provides superior selectivity, sensitivity, and economics than conventional biosensors. In addition, the electrochemical method is used in comparison with the optical method, which requires a dye to induce optical property change due to the binding between materials, and a process need to label a target material or a probe material with a dye. By sensing the present invention provides an excellent effect in economics.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, preferred embodiments and experimental examples are provided to facilitate understanding of the present invention. However, the following examples are provided only for the purpose of easier understanding of the present invention, and the present invention is not limited by the examples.

실시예1. 마우스 IgG 센싱Example 1. Mouse IgG Sensing

1. 아미노에틸 벤젠디아조늄(AminoEthyl BenzeneDiazonium, AEBD), 그래핀 산화물(Graphene Oxide, GO), poly(BMA-r-mPEGMA-r-NAS)의 제조 1. Preparation of aminoethyl benzenediazonium (AEBD), graphene oxide (GO), poly (BMA-r-mPEGMA-r-NAS)

전극의 재료로 쓰이는 상기 재료는 각각 하기의 논문에 나와 있는 제조방법에 따라 제조되었다. The materials used as materials for the electrodes were each prepared according to the manufacturing method described in the following paper.

1) 아미노에틸 벤젠디아조늄은 Griveau, S.; Mercier, D.; Vautrin-UI, C.; Chausse, A. Electrochem. Commun. 2007, 9, 2768-2773에 기재된 제조방법에 따라 제조하였다.1) aminoethyl benzenediazonium is described in Griveau, S .; Mercier, D .; Vautrin-UI, C .; Chausse, A. Electrochem. Commun. It manufactured according to the manufacturing method described in 2007, 9, 2768-2773.

2) 그래핀 산화물은 수정된 Hummers method에 따라 Hummers, W.; Offeman, R. J. Am. Chem. Soc. 1958, 80, 1339., Cote, L. J.; Kim, F.; Huang, J. J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 1043-1049., Xu, Y.; Wu, Q.; Sun, Y.; Bai, H.; Shi, G. ACS Nano 2010, 4, 7358-7362에 기재된 제조방법에 따라 제조하였다.2) Graphene oxides were prepared according to the modified Hummers method, Hummers, W .; Offeman, R. J. Am. Chem. Soc. 1958, 80, 1339., Cote, L. J .; Kim, F .; Huang, J. J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 1043-1049., Xu, Y .; Wu, Q .; Sun, Y .; Bai, H .; Shi, G. ACS Nano 2010, 4, 7358-7362.

3) poly(BMA-r-mPEGMA-r-NAS)은 Sung, D.; Shin, D. H.; Jon, S. Biosens. Bioelectron. 2011, 26, 3967-3972에 기재된 제조방법에 따라 제조하였다.
3) poly (BMA-r-mPEGMA-r-NAS) is described in Sung, D .; Shin, DH; Jon, S. Biosens. Bioelectron. It manufactured according to the manufacturing method described in 2011, 26, 3967-3972.

2. ITO/AEBD/GO/poly(B.P.N.) 전극의 제조2. Fabrication of ITO / AEBD / GO / poly (B.P.N.) Electrodes

2-1 산화인듐(ITO)을 포함하는 전극에 대한 AEBD 및 GO의 전착2-1 Electrodeposition of AEBD and GO to Electrodes Containing Indium Oxide (ITO)

ITO를 포함하는 전극을 아세톤, 에탄올 및 물을 이용해 세척한 후, 질소 기체 하에서 건조시켰다. 이후, 상기 전극을 piranha 용액(H2SO4 : H2O2 = 3 : 1)에 담근 뒤, 다량의 물로 세척하고 질소 기체하에서 건조시켰다. 아세토니트릴 하에서 0.1M의 Bu4NBF4(tetrabutylammonium tetrafluoroborate)과 함께 아미노에틸벤젠디아조늄염(AEBD salt) 용액 2mM을 이용하여 아미노에틸 벤젠디아조늄이 전착된 산화인듐 전극을 만들었다. 보다 구체적으로 전기화학적 반응을 일으키기 전에 질소 기체를 이용하여 15분간 AEBD의 공기를 제거하고, 아세토니트릴 하에서 0.1M Bu4NBF4과 함께 아미노에틸벤젠디아조늄염(AEBD salt) 용액 2mM을 전극과 혼합한 뒤, 삼극식셀을 이용하여 +0.1V에서 -1.0V까지 50mV/s의 주사 속도(scan rate)로 전극에 AEBD를 전착시켰다. 전착 후, 상기 전극을 물 및 아세토니트릴을 이용하여 세척한 뒤, 질소 기체 하에서 건조시켰다.The electrode containing ITO was washed with acetone, ethanol and water and then dried under nitrogen gas. Thereafter, the electrode was immersed in piranha solution (H 2 SO 4 : H 2 O 2 = 3: 1), washed with a large amount of water and dried under nitrogen gas. An indium oxide electrode electrodeposited with aminoethyl benzenediazonium was prepared using 2 mM AEBD salt solution with 0.1 M Bu 4 NBF 4 (tetrabutylammonium tetrafluoroborate) under acetonitrile. More specifically, the air of AEBD was removed for 15 minutes using nitrogen gas before the electrochemical reaction, and 2 mM of an aminoethylbenzenediazonium salt solution with electrode was mixed with 0.1M Bu 4 NBF 4 under acetonitrile. Then, AEBD was electrodeposited on the electrode using a tripolar cell at a scan rate of 50 mV / s from + 0.1V to -1.0V. After electrodeposition, the electrode was washed with water and acetonitrile, and then dried under nitrogen gas.

상기 전극을 그래핀 산화물(~0.1mg/mL) 용액에 4시간 동안 잠기게 하여 그래핀 산화물이 코팅된 산화인듐 전극을 제조하였다.The electrode was immersed in a graphene oxide (˜0.1 mg / mL) solution for 4 hours to prepare an indium oxide electrode coated with graphene oxide.

2-2 전기화학적으로 환원된 그래핀 산화물(ERGO)이 코팅된 산화인듐 전극의 제조 2-2 Preparation of Indium Oxide Electrode Coated with Electrochemically Reduced Graphene Oxide (ERGO)

상기에서 얻어진 그래핀 산화물이 코팅된 산화인듐 전극을 전기화학적으로 환원시키기 위하여, 0.0V부터 50mV/s의 속도로 전위 소인(potential scan)을 시행하였다. 그리고 0.5M의 NaCl 용액 내에서, 약 -1.0V로 측정된 피크 전위로 20초간 유지하였다.In order to electrochemically reduce the obtained graphene oxide coated indium oxide electrode, a potential scan was performed at a rate of 0.0 m to 50 mV / s. And held in a 0.5 M NaCl solution for 20 seconds at a peak potential of about -1.0 V.

2-3 전기화학적으로 환원된 그래핀 산화물(ERGO)이 코팅된 산화인듐 전극에 poly(B.P.N.)의 코팅 2-3 Coating poly (BPN) on an indium oxide electrode coated with electrochemically reduced graphene oxide (ERGO)

1차 항체를 용이하게 전극 표면에 결합시키기 위해서, 20mg/mL 농도의 poly(B.P.N.) 50μL를 상기 전극에 떨어뜨려 상기 전극에 코팅하였다.
In order to easily bind the primary antibody to the electrode surface, 50 μL of poly (BPN) at a concentration of 20 mg / mL was dropped on the electrode and coated on the electrode.

3. 1차 항체, 항원, 및 2차 항체의 결합 및 센싱3. Binding and Sensing of Primary Antibodies, Antigens, and Secondary Antibodies

3-1 전극에의 1차 항체의 결합 및 비사용 부위에 대한 비활성화Inactivation of binding and non-use sites of primary antibodies to 3-1 electrodes

항-마우스 IgG(immunoglobulin G) 1차 항체를 상기 poly(B.P.N.)이 코팅된 전극에 결합시키기 위하여, 항-마우스 IgG(100㎍/ml in PBST) 용액 50μL를 상기 전극 표면에 떨어뜨리고, 2시간 동안 배양하였다. 이후, PBST와 물로 세척하고, 질소 기체 하에서 건조시켰다. To bind anti-mouse IgG (immunoglobulin G) primary antibody to the poly (BPN) coated electrode, 50 μL of anti-mouse IgG (100 μg / ml in PBST) solution was dropped on the electrode surface and 2 hours Incubated for It was then washed with PBST and water and dried under nitrogen gas.

추가적인 활성 그룹과 비특이적인 결합부위를 막기 위해 PBS 용액 내에서, 3% BSA와 함께 1시간 동안 배양하였다. 이후, 전극 표면을 PBS와 물로 세척하고, 질소 기체 하에서 건조시켰다.Incubated with 3% BSA for 1 hour in PBS solution to prevent additional active groups and nonspecific binding sites. The electrode surface was then washed with PBS and water and dried under nitrogen gas.

3-2 항원 및 2차 항체의 전극에의 결합Binding of 3-2 Antigens and Secondary Antibodies to Electrodes

마우스 IgG를 검출하기 위해, 마우스 IgG 50μL를 상기 항-마우스 IgG 1차 항체가 결합된 전극 표면에 떨어뜨리고, 1시간 동안 배양하였다. 이후, PBST와 물로 세척하고, 질소 기체 하에서 건조시켰다. To detect mouse IgG, 50 μL of mouse IgG was dropped on the electrode surface to which the anti-mouse IgG primary antibody was bound and incubated for 1 hour. It was then washed with PBST and water and dried under nitrogen gas.

HRP(Horseradish Peroxidase)가 결합된 항-마우스 IgG 2차 항체(20㎍/mL in PBST)를 상기 전극 표면에 떨어뜨리고, 1시간 동안 배양하였다. 이후, PBST와 물로 세척하고, 질소 기체 하에서 건조시켰으며 모든 실험은 실온에서 진행되었다.An anti-mouse IgG secondary antibody (20 μg / mL in PBST) bound to Horseradish Peroxidase (HRP) was dropped on the electrode surface and incubated for 1 hour. Then, washed with PBST and water, dried under nitrogen gas and all experiments were conducted at room temperature.

3-3 순환전압전류법에 의한 항원의 검출3-3 Detection of antigen by cyclic voltammetry

상기 과정을 통해 전극을 0.45cm2 의 크기로 제작하였다. 전극을 1.5mM의 H2O2와 2.0mM의 hydroquinin(HQ)이 포함된 PBS 용액에 담그어, 효소 반응이 일어나는 동안, 약 5분간 방치하였다. 이후, -0.03V부터 0.2V 사이에서 순환전압전류법(Cyclic Voltammetry)을 시행하였다. 효소 반응으로부터 생성된 Benzoquinin(BQ)으로 부터의 환원 피크 전류(Reduction peak current)를 기록하였다.
Through the above process, the electrode was manufactured to a size of 0.45 cm 2 . The electrode was immersed in a PBS solution containing 1.5 mM H 2 O 2 and 2.0 mM hydroquinin (HQ), and left for about 5 minutes while the enzyme reaction occurred. Then, cyclic voltammetry was performed between -0.03V and 0.2V. Reduction peak current from Benzoquinin (BQ) generated from the enzymatic reaction was recorded.

실험예1. 주사전자현미경(Scanning electron microscope, SEM)Experimental Example 1 Scanning electron microscope (SEM)

ITO 전극, AEBD/ITO 전극, GO/AEBD/ITO 전극 및 ERGO/AEBD/ITO 전극에 대한 표면구조는 도 2에 나타내었다. Surface structures for the ITO electrode, AEBD / ITO electrode, GO / AEBD / ITO electrode and ERGO / AEBD / ITO electrode are shown in FIG. 2.

도 2에 나타난 바와 같이, ITO 전극과 AEBD가 전착된 ITO전극은 깨끗한 표면을 가지고 있었다. 반면 그래핀 산화물(GO)과 전기화학적으로 환원된 그래핀 산화물(ERGO)가 결합된 ITO 전극의 경우는 표면이 거칠었으며, 이는 GO와 ERGO의 존재를 나타내는 것이다. GO가 부착된 전극의 표면과 ERGO가 부착된 전극의 표면에서, 부착된 그래핀의 밀도의 차이가 거의 없는 것이 확인되었는데, 이는 -1.0V의 높은 환원 전위에서도 ERGO의 손실이 거의 없었다는 것을 의미한다. 이는 곧, 전극 상에서 ERGO와 AEBD간의 π-π결합이 여전히 유효하게 존재하고 있다는 것을 의미한다.
As shown in FIG. 2, the ITO electrode on which the ITO electrode and the AEBD were electrodeposited had a clean surface. On the other hand, the surface of the ITO electrode combined with graphene oxide (GO) and electrochemically reduced graphene oxide (ERGO) was rough, indicating the presence of GO and ERGO. On the surface of the electrode with GO and the surface of the electrode with ERGO, it was confirmed that there was little difference in the density of the graphene attached, which means that there was little loss of ERGO even at high reduction potential of -1.0 V. . This means that the π-π bond between the ERGO and AEBD still exists on the electrode.

실험예2. HExperimental Example 2 H 22 OO 22 의 농도에 따른 백그라운드 전류의 측정Measurement of background current according to the concentration of

poly(B.P.N.)/ERGO/AEBD/ITO 전극 표면에 대해 H2O2의 농도를 바꿔가며 측정한 순환전압전류법에 따른 결과를 도 3에 나타내었다.The results of the cyclic voltammetry measured by changing the concentration of H 2 O 2 on the surface of poly (BPN) / ERGO / AEBD / ITO are shown in FIG. 3.

도 3에 나타난 바와 같이, H2O2의 농도가 2.0mM이하 에서는 환원 전류가 매우 낮은 반면에, 농도가 5.0mM인 경우에는 환원 전류가 급격히 증가하였다. 따라서 백그라운드 전류를 줄이기 위해서는 H2O2의 농도를 줄여야 한다는 것을 나타낸다. 하지만 H2O2의 농도가 지나치게 낮으면 HRP의 효소 반응이 잘 일어나지 않을 것이기 때문에, 본 발명에서는 1.5mM의 농도를 선택하였다.
As shown in FIG. 3, the reduction current was very low when the concentration of H 2 O 2 was less than 2.0 mM, whereas the reduction current rapidly increased when the concentration was 5.0 mM. Thus, to reduce the background current, it is necessary to reduce the concentration of H 2 O 2 . However, if the concentration of H 2 O 2 is too low, since the enzyme reaction of HRP will not occur well, the concentration of 1.5 mM was chosen in the present invention.

실험예3. BSA(Bovine Serum Albumin)의 양에 따른 백그라운드 전류의 측정Experimental Example 3. Measurement of background current according to the amount of BSA (Bovine Serum Albumin)

BSA의 양에 따른 백그라운드 전류의 측정 결과를 도 4에 나타내었다.The measurement result of the background current according to the amount of BSA is shown in FIG. 4.

도 4에 나타난 바와 같이, BSA가 존재하지 않는 경우에 비해, BSA의 양이 증가하는 경우 비특이적인 결합이 매우 줄었음을 알 수 있다.
As shown in FIG. 4, it can be seen that nonspecific binding is greatly reduced when the amount of BSA is increased as compared with the case where BSA is not present.

실험예4. 전극 표면 재료의 차이에 따른 순환전압전류법(Cyclic Voltammetry, CV) Experimental Example 4. Cyclic Voltammetry (CV) According to Different Surface Material of Electrode

ITO 전극 표면, AEBD/ITO 전극 표면, GO/AEBD/ITO 전극 표면 및 ERGO/AEBD/ITO 전극 표면에 대한 순환전압전류법의 결과를 도 5에 나타내었다.The results of the cyclic voltammetry on the surface of the ITO electrode, the surface of the AEBD / ITO electrode, the surface of the GO / AEBD / ITO electrode, and the surface of the ERGO / AEBD / ITO electrode are shown in FIG. 5.

도 5에 나타난 바와 같이, ITO 전극표면에 대해 AEBD 또는 GO의 결합이 있은 후에도, ITO 전극의 전기화학적 성질은 크게 변하지 않았다. 그러나 전기화학적으로 환원되어 ERGO가 결합된 ITO 전극은 피크 전류가 크게 증가하였으며, 이는 Benzoquinin에 대한 환원에 있어서, ERGO/AEBD/ITO의 전기촉매적인 활성이 높아졌음을 의미한다.
As shown in FIG. 5, even after the binding of AEBD or GO to the ITO electrode surface, the electrochemical properties of the ITO electrode did not change significantly. However, the peak current of the electrochemically reduced ERGO-coupled ITO electrode increased significantly, indicating that the electrocatalytic activity of ERGO / AEBD / ITO was increased in the reduction to Benzoquinin.

실험예5. 원자력현미경 (Atomic Force Microscopy, AFM)Experimental Example 5. Atomic Force Microscopy (AFM)

그래핀 산화물의 구조를 도 6에 나타내었다.The structure of graphene oxide is shown in FIG. 6.

실리콘 기질을 아세톤, 에탄올 및 물로 세척한 뒤, 3-아미노프로필트리에톡시실레인(3-aminopropyltriethoxysilane, APTES) 수용액에 가하여, 15분 동안 보관하였다. 이후, 물로 세척하고 질소 기체 하에서 건조시킨 뒤, 상기 수정된 실리콘 기질을 그래핀 산화물 수용액에 가하여 3분간 보관하였다. 이후, 물로 세척하고 질소 기체 하에서 건조시켜서 샘플을 준비하였다. 그래핀 산화물의 크기는 몇십에서 몇백 나노미터로 다양했고, 평균적인 높이는 약 1.0 나노미터로 나타났다.
The silicon substrate was washed with acetone, ethanol and water, and then added to an aqueous 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) solution and stored for 15 minutes. After washing with water and drying under nitrogen gas, the modified silicon substrate was added to an aqueous solution of graphene oxide and stored for 3 minutes. The sample was then prepared by washing with water and drying under nitrogen gas. Graphene oxide varied in size from tens to hundreds of nanometers and averaged about 1.0 nanometers in height.

실험예6. ERGO 전극 표면과 GO 전극 표면에 대한 순환전압전류법Experimental Example 6. Cyclic Voltammetry for ERGO and GO Electrode Surfaces

항원의 검출 이후에 poly(B.P.N.)/GO/AEBD/ITO 전극 표면 및 poly(B.P.N.)/ERGO/AEBD/ITO 전극 표면에 대한 순환전압전류법의 결과를 도 7에 나타내었다.The results of the cyclic voltammetry on the poly (B.P.N.) / GO / AEBD / ITO electrode surface and the poly (B.P.N.) / ERGO / AEBD / ITO electrode surface after antigen detection are shown in FIG. 7.

도 7에 나타난 바와 같이, HQ와 H2O2를 포함하는 PBS 용액 내에서 GO만을 포함하고 있거나 GO 또는 ERGO를 포함하지 않는 전극 표면에서는, 뚜렷한 환원 피크 전류가 측정되지 않았다. 이는 poly(B.P.N.)가 GO보다는 ERGO에 대해 π-π결합을 통해서 더욱 잘 결합하기 때문이며, 또한 ERGO가 GO보다 더욱 전기촉매적으로 활성이 강하기 때문임을 알 수 있다.
As shown in FIG. 7, at the electrode surface containing only GO or not including GO or ERGO in a PBS solution containing HQ and H 2 O 2 , no clear reduction peak current was measured. This is because poly (BPN) binds better to ERGO through π-π bond than GO, and also because ERGO is more electrocatalytically active than GO.

실험예7. 항원의 종류에 따른 특이성의 측정Experimental Example 7. Specificity measurement by antigen type

poly(B.P.N.)/ERGO/AEBD/ITO 전극 표면에 대해, 다른 종류의 항원을 이용하여 측정한 순환전압전류법의 결과를 도 8에 나타내었다.The results of the cyclic voltammetry measured using different kinds of antigens on the surface of poly (B.P.N.) / ERGO / AEBD / ITO electrodes are shown in FIG. 8.

도 8에 나타난 바와 같이, 항원을 가하지 않은 경우, 마우스 IgG, 및 래빗 IgG를 가한 경우 모두 0.1M 의 PBS, 2mM의 HQ 및 1.5mM의 H2O2를 사용하였다. 마우스 IgG를 넣은 경우에는 뚜렷한 환원 피크 전류가 나타났고, 항원을 가하지 않은 경우 및 래빗 IgG를 가한 경우에는 환원 피크 전류가 나타나지 않았다. 이는 본 발명의 바이오 센서가 우수한 특이성과 선택성을 가지고 있다는 것을 나타낸다.
As shown in FIG. 8, when no antigen was added, both mouse IgG and rabbit IgG were used with 0.1 M of PBS, 2 mM of HQ, and 1.5 mM of H 2 O 2 . When the mouse IgG was added, a clear reduction peak current was observed, and when the antigen was not added and the rabbit IgG was added, the reduction peak current did not appear. This indicates that the biosensor of the present invention has excellent specificity and selectivity.

실험예8. 항원의 농도에 따른 환원 피크 전류의 변화 측정Experimental Example 8. Measurement of the change in reducing peak current with the antigen concentration

마우스 IgG의 농도를 변화시키며 각각 (A) femtograms/mL (B) picograms/mL (C) nanograms/mL (D) micrograms/mL의 스케일로 나타낸 순환전압전류법의 결과를 도 9에 나타내었다.9 shows the results of cyclic voltammetry with varying mouse IgG concentrations (A) femtograms / mL (B) picograms / mL (C) nanograms / mL (D) micrograms / mL.

또한, 항원의 농도에 따른 환원 피크 전류의 변화를 나타낸 그래프를 도 10에 나타내었다. In addition, a graph showing a change in the reduction peak current according to the concentration of the antigen is shown in FIG.

도 9 및 도 10에 나타난 바와 같이, 100nanograms/mL 이상의 농도부터는 항원의 농도가 증가함에 따라 환원 피크 전류가 커짐을 알 수 있다.
As shown in Figure 9 and 10, from the concentration of 100nanograms / mL or more it can be seen that the reduction peak current increases as the concentration of the antigen increases.

Claims (11)

전기화학적으로 환원된 그래핀 산화물(Electrochemically Reduced Graphene Oxide, ERGO)이 코팅된, 산화인듐을 포함하는 전극; 상기 전극에 결합된 1차 프로브 물질; 표적물질; 및 효소가 결합된 2차 프로브 물질을 포함하며,
상기 2차 프로브 물질에 결합된 효소의 촉매반응에 의해 생성되는 생성물의 환원 피크 전류가 그래핀 산화물(Graphene Oxide, GO)이 코팅된, 산화인듐을 포함하는 전극에 의한 환원 피크 전류보다 크게 나타나는 것을 특징으로 하는 바이오 센서. An electrode comprising indium oxide coated with an electrochemically reduced graphene oxide (ERGO); A primary probe material coupled to the electrode; Target material; And a secondary probe material bound to the enzyme,
The reduction peak current of the product produced by the catalytic reaction of the enzyme bound to the secondary probe material is greater than the reduction peak current by the electrode containing indium oxide coated with graphene oxide (GO) A biosensor characterized by. 제1항에 있어서, 상기 전극은 산화인듐을 포함하는 전극에 아미노에틸벤젠디아조늄을 전착시킨 후, 그래핀 산화물로 코팅하고, 전기화학적으로 환원시킨 것을 특징으로 하는 바이오 센서.The biosensor according to claim 1, wherein the electrode is electrodeposited with aminoethylbenzenediazonium on an electrode containing indium oxide, coated with graphene oxide, and electrochemically reduced. 제1항에 있어서, 상기 표적 물질은 항원이고, 1차 프로브 물질 및 2차 프로브 물질은 항체인 것을 특징으로 하는 바이오 센서.The biosensor of claim 1, wherein the target substance is an antigen, and the primary and secondary probe substances are antibodies. 제1항에 있어서, 상기 효소는 HRP(Horseradish peroxidase)인 것을 특징으로 하는 바이오 센서.The biosensor of claim 1, wherein the enzyme is HRP (Horseradish peroxidase). 1) 산화인듐을 포함하는 전극을 그래핀 산화물로 코팅하고, 전기화학적으로 환원시키는 단계; 및
2) 상기 1)단계에서 얻은 전기화학적으로 환원된 그래핀 산화물이 코팅된 전극에 1차 프로브 물질을 결합하고, 표적 물질을 결합한 뒤, 효소가 결합된 2차 프로브 물질을 결합하는 단계를 포함하는 바이오 센서의 제조방법.1) coating an electrode comprising indium oxide with graphene oxide and electrochemically reducing it; And
2) binding the primary probe material to the electrochemically reduced graphene oxide coated electrode obtained in step 1), and after binding the target material, the second probe material is coupled to the enzyme; Method of manufacturing a biosensor. 제5항에 있어서, 상기 1)단계에서 그래핀 산화물을 코팅하기 전에, 산화인듐 전극에 아미노에틸벤젠디아조늄을 전착시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오 센서의 제조방법.6. The method of claim 5, further comprising electrodepositing aminoethylbenzenediazonium on the indium oxide electrode before coating the graphene oxide in step 1). 7. 제5항에 있어서, 상기 1)단계에서 전극을 전기화학적으로 환원시키는 단계 후에, 상기 전기화학적으로 환원된 그래핀 산화물이 코팅된 전극을 poly(BMA-r-mPEGMA-r-NAS)로 코팅하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오 센서의 제조방법.The method of claim 5, wherein after the step of electrochemically reducing the electrode in step 1), the electrode coated with the electrochemically reduced graphene oxide is coated with poly (BMA-r-mPEGMA-r-NAS). Method of manufacturing a biosensor comprising the step. 제5항에 있어서, 상기 표적 물질은 항원이고, 1차 프로브 물질 및 2차 프로브 물질은 항체인 것을 특징으로 하는 바이오 센서의 제조방법.The method of claim 5, wherein the target material is an antigen, and the primary probe material and the secondary probe material are antibodies. 제5항에 있어서, 상기 효소는 HRP(Horseradish peroxidase)인 것을 특징으로 하는 바이오 센서의 제조방법.The method of claim 5, wherein the enzyme is HRP (Horseradish peroxidase). 1) 산화인듐을 포함하는 전극을 그래핀 산화물로 코팅하고, 전기화학적으로 환원시키는 단계;
2) 상기 1)단계에서 얻은 전기화학적으로 환원된 그래핀 산화물이 코팅된 전극에 1차 프로브 물질을 결합하고, 표적 물질을 결합한 뒤, 효소가 결합된 2차 프로브 물질을 결합하는 단계; 및
3) 상기 2)단계의 2차 프로브 물질에 결합된 효소의 촉매반응에 의해 생성되는 생성물의 산화-환원반응에 의한 전류를 측정하는 단계를 포함하는 바이오 센싱방법.1) coating an electrode comprising indium oxide with graphene oxide and electrochemically reducing it;
2) binding the primary probe material to the electrochemically reduced graphene oxide coated electrode obtained in step 1), binding the target material, and then binding the secondary probe material to which the enzyme is bound; And
3) bio-sensing method comprising the step of measuring the current by the oxidation-reduction reaction of the product produced by the catalytic reaction of the enzyme bound to the secondary probe material of step 2). 제10항에 있어서, 상기 전류를 측정하는 방법은 순환전압전류법인 것을 특징으로 하는 바이오 센싱 방법.


The biosensing method of claim 10, wherein the current measuring method is a cyclic voltammetry method.


KR1020120044691A 2012-04-27 2012-04-27 Bio senser using electrocatalytic activity of electrochemically reduced graphene oxide, method for preparing the same, and sensing method thereof KR101338168B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120044691A KR101338168B1 (en) 2012-04-27 2012-04-27 Bio senser using electrocatalytic activity of electrochemically reduced graphene oxide, method for preparing the same, and sensing method thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120044691A KR101338168B1 (en) 2012-04-27 2012-04-27 Bio senser using electrocatalytic activity of electrochemically reduced graphene oxide, method for preparing the same, and sensing method thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20130121464A true KR20130121464A (en) 2013-11-06
KR101338168B1 KR101338168B1 (en) 2013-12-06

Family

ID=49851698

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020120044691A KR101338168B1 (en) 2012-04-27 2012-04-27 Bio senser using electrocatalytic activity of electrochemically reduced graphene oxide, method for preparing the same, and sensing method thereof

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101338168B1 (en)

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105510390A (en) * 2016-01-18 2016-04-20 郑州轻工业学院 Multi-stage structure nanometer In2O3/graphene composite and preparation method and application thereof
KR20160085951A (en) * 2015-01-08 2016-07-19 가천대학교 산학협력단 H_2 o_2 sensor electrodeposited of ergo-np nanocomposite films coupled with horseradish peroxidase, and method thereof
JP2017021345A (en) * 2015-07-14 2017-01-26 住友化学株式会社 Resist Composition
KR101713480B1 (en) * 2016-04-14 2017-03-08 인천대학교 산학협력단 Electrochemical sensor utilizing nanocomposite comprising reduced graphene oxide and cyclodextrin
KR20190082599A (en) * 2018-01-02 2019-07-10 한국화학연구원 Electrode for biosensor for nadh measurment and manufacturing method thereof
WO2019203493A1 (en) * 2018-04-17 2019-10-24 한국화학연구원 Multiwell electrode-based biosensor
KR20190127349A (en) * 2018-05-04 2019-11-13 전자부품연구원 A method for electrochemically measuring the concentration of biomarkers in the urine
US10690582B2 (en) 2016-09-09 2020-06-23 Korea Institute Of Science And Technology Apparatus and method for sensing biomolecules which allows restoration of sensing offset
WO2021201453A1 (en) * 2020-04-02 2021-10-07 아주대학교 산학협력단 Sensor chip for cell-derived product analysis, capable of culturing cells, and method for quantitative analysis of cell activity

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103616413A (en) * 2013-12-12 2014-03-05 苏州大学 Gas sensor based on reduction-oxidation graphene and preparation method of gas sensor
KR101649032B1 (en) * 2014-07-02 2016-08-18 인천대학교 산학협력단 Electrochemical immunosensor using hydroxyl groupenriched reduced graphene oxide
KR101636695B1 (en) 2014-08-18 2016-07-06 연세대학교 산학협력단 Bio sensor using three-dimensional graphene-silk complex and sensing system using the same
KR102012633B1 (en) * 2018-08-17 2019-08-21 재단법인 구미전자정보기술원 Method and apparatus for detecting bio-marker for liver cancer

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20060048066A (en) * 2004-05-24 2006-05-18 삼성엔지니어링 주식회사 Biosensor for detecting nitrate ion and measuring method using the same
KR100601999B1 (en) * 2005-12-09 2006-07-19 삼성전자주식회사 A method for detecting a target molecule using a novel electrically conductive polymer
KR100824731B1 (en) * 2006-07-22 2008-04-28 고려대학교 산학협력단 Biosensor and method for preparing the same

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160085951A (en) * 2015-01-08 2016-07-19 가천대학교 산학협력단 H_2 o_2 sensor electrodeposited of ergo-np nanocomposite films coupled with horseradish peroxidase, and method thereof
JP2017021345A (en) * 2015-07-14 2017-01-26 住友化学株式会社 Resist Composition
CN105510390A (en) * 2016-01-18 2016-04-20 郑州轻工业学院 Multi-stage structure nanometer In2O3/graphene composite and preparation method and application thereof
KR101713480B1 (en) * 2016-04-14 2017-03-08 인천대학교 산학협력단 Electrochemical sensor utilizing nanocomposite comprising reduced graphene oxide and cyclodextrin
US10690582B2 (en) 2016-09-09 2020-06-23 Korea Institute Of Science And Technology Apparatus and method for sensing biomolecules which allows restoration of sensing offset
KR20190082599A (en) * 2018-01-02 2019-07-10 한국화학연구원 Electrode for biosensor for nadh measurment and manufacturing method thereof
WO2019135556A1 (en) * 2018-01-02 2019-07-11 한국화학연구원 Electrode for biosensor for nadh measurement and manufacturing method therefor
CN111542751A (en) * 2018-01-02 2020-08-14 韩国化学研究院 Biosensor electrode for NADH measurement and method for manufacturing the same
US11782010B2 (en) 2018-01-02 2023-10-10 Korea Research Institute Of Chemical Technology Electrode for biosensor for NADH measurement and manufacturing method therefor
WO2019203493A1 (en) * 2018-04-17 2019-10-24 한국화학연구원 Multiwell electrode-based biosensor
KR20190127349A (en) * 2018-05-04 2019-11-13 전자부품연구원 A method for electrochemically measuring the concentration of biomarkers in the urine
WO2021201453A1 (en) * 2020-04-02 2021-10-07 아주대학교 산학협력단 Sensor chip for cell-derived product analysis, capable of culturing cells, and method for quantitative analysis of cell activity

Also Published As

Publication number Publication date
KR101338168B1 (en) 2013-12-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101338168B1 (en) Bio senser using electrocatalytic activity of electrochemically reduced graphene oxide, method for preparing the same, and sensing method thereof
Dhara et al. Review on electrochemical sensing strategies for C-reactive protein and cardiac troponin I detection
Bai et al. Fullerene-doped polyaniline as new redox nanoprobe and catalyst in electrochemical aptasensor for ultrasensitive detection of Mycobacterium tuberculosis MPT64 antigen in human serum
Muniandy et al. Carbon nanomaterial-based electrochemical biosensors for foodborne bacterial detection
Ou et al. A novel amperometric immunosensor based on layer-by-layer assembly of gold nanoparticles–multi-walled carbon nanotubes-thionine multilayer films on polyelectrolyte surface
Han et al. Highly conducting gold nanoparticles–graphene nanohybrid films for ultrasensitive detection of carcinoembryonic antigen
Wan et al. Carbon nanotube-based ultrasensitive multiplexing electrochemical immunosensor for cancer biomarkers
Kavosi et al. Au nanoparticles/PAMAM dendrimer functionalized wired ethyleneamine–viologen as highly efficient interface for ultra-sensitive α-fetoprotein electrochemical immunosensor
Liu et al. Enhanced electrochemical biosensing of alpha-fetoprotein based on three-dimensional macroporous conducting polymer polyaniline
Arya et al. Polyaniline protected gold nanoparticles based mediator and label free electrochemical cortisol biosensor
Grieshaber et al. Electrochemical biosensors-sensor principles and architectures
Dong et al. An enzyme-free ultrasensitive electrochemical immunosensor for calprotectin detection based on PtNi nanoparticles functionalized 2D Cu-metal organic framework nanosheets
Yan et al. Dual-responsive competitive immunosensor for sensitive detection of tumor marker on g-CN/rGO conjugation
Nam et al. Highly sensitive electrochemical detection of proteins using aptamer-coated gold nanoparticles and surface enzyme reactions
Li et al. New antibody immobilization strategy based on gold nanoparticles and azure I/multi-walled carbon nanotube composite membranes for an amperometric enzyme immunosensor
Yang et al. Hollow platinum decorated Fe3O4 nanoparticles as peroxidase mimetic couple with glucose oxidase for pseudobienzyme electrochemical immunosensor
Wang et al. A novel immunosensor based on gold nanoparticles and poly-(2, 6-pyridinediamine)/multiwall carbon nanotubes composite for immunoassay of human chorionic gonadotrophin
Crapnell et al. Electroanalytical point-of-care detection of gold standard and emerging cardiac biomarkers for stratification and monitoring in intensive care medicine-a review
Mao et al. A new electrochemiluminescence immunosensor based on Ru (bpy) 32+-doped TiO2 nanoparticles labeling for ultrasensitive detection of human chorionic gonadotrophin
Li et al. A sandwich-type electrochemical immunosensor for detecting CEA based on CeO2-MoS2 absorbed Pb2+
Song et al. Novel electroactive ferrocene-based covalent organic frameworks towards electrochemical label-free aptasensors for the detection of Cardiac Troponin I
Song et al. Dual amplification strategy for the fabrication of highly sensitive amperometric immunosensor based on nanocomposite functionalized interface
Huang et al. Thi-Au-Fe3O4 confined in ZIF-8 nanoreactor as signal-amplifying tag for constructing high-efficiency electrochemical platform
Zhuo et al. A tris (2, 2′-bipyridyl) cobalt (III)-bovine serum albumin composite membrane for biosensors
Liu et al. A label-free amperometric immunosensor based on horseradish peroxidase functionalized carbon nanotubes and bilayer gold nanoparticles

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20161128

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20171128

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20181105

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20191126

Year of fee payment: 7