KR20130110854A - Ｋｓｈｖ 잠복성 복제 검출용 프라이머 및 이를 이용한 ｋｓｈｖ 잠복성 복제 검출 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 KSHV 잠복성 복제를 검출하기 위한 real-time PCR용 프라이머 서열 및 실시간 중합효소 연쇄반응을 이용한 KSHV 잠복성 복제의 검출 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 KSHV 잠복성 복제 검출용 프라이머 세트는 KSHV 잠복성 복제 유무 및 복제 효율 증감을 정량적으로 제공할 수 있다.
Description
본 발명은 KSHV 잠복성 복제를 검출하기 위한 real-time PCR용 프라이머 서열 및 실시간 중합효소 연쇄반응을 이용한 KSHV 잠복성 복제의 검출 방법에 관한 것이다.
KSHV(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus using)는 1994년 Chang과 Moore에 의해 발견된 이 후, 다양한 연구진들에 의해 연구되고 있다. KSHV는 카포시 육종과 B 세포의 림프종을 유발하며, 특히 카포시 육종의 경우 에이즈 감염 환자의 2차 질환으로 잘 알려져 있다. KSHV는 가장 최근에 발견된 사람에게 감염하여 암을 유발하는 허피스바이러스로 각 분야 연구진들에 의해 다양한 연구가 진행되어 왔다. 다른 허피스바이러스들과 마찬가지로 잠복성과 용해성 주기를 가지며 잠복기 동안에는 매우 한정된 수의 유전자만을 발현한다. 잠복기 동안 발현되는 KSHV 단백질은 자신의 유전체를 복제하거나 숙주 세포의 면역 시스템으로부터 회피하기 위한 기능을 가지고 있다. B 세포에 감염한 KSHV의 오랜 잠복기를 통해 결국 림프종을 유발하는 단계에 이른다. 따라서 이러한 KSHV의 잠복성 복제에 대한 이해는 암 억제제 기술 개발로 이어질 수 있기 때문에 매우 중요하다.
지금까지 많은 연구진들에 의해 KSHV 잠복성 복제에 대한 연구가 진행되어 왔다. 그 결과, KSHV의 잠복성 복제에는 바이러스 단백질인 LANA와 바이러스의 유전체에 존재하는 TR 부위만이 필요하며 나머지는 숙주의 복제 시스템에 의존한다는 것이 밝혀졌다. 이 때 TR 부위는 바이러스 유전체가 복제되기 위한 복제원점을 포함하며 LANA 단백질은 복제에 필요한 다양한 숙주 단백질과 상호작용한다고 알려져 있다. 단 두 가지 인자만을 숙주세포로 전달하면 숙주의 복제 시스템에 의해 복제가 일어날 수 있기 때문에 KSHV의 잠복성 복제 기작을 연구하기에 적절한 모델로 인식되고 있다. 이에 많은 연구진들은 TR 부위를 가지는 벡터와 LANA를 발현할 수 있는 벡터를 제작하여 숙주세포에 co-형질전환시킴으로써 이를 확인하고자 하였다.
이 과정에서 세 가지 핵심 기술에 의해 새로이 복제된 TR 벡터만을 확인할 수 있게 되었다. 첫 번째 기술은 도입된 포유동물 세포로부터 다시 벡터를 얻어내는 방법이다. 이는 1967년 Hirt에 의해 개발되어 Hirt’s method 또는 Hirt’s extraction이라고 불리는 방법으로 포유동물 세포로부터 비교적 작은 크기의 바이러스 DNA를 추출하기 위해 설계되었다. 간단히 요약하면 포유동물 세포를 SDS가 포함된 버퍼를 이용해서 용해시킨 뒤, 염화나트륨을 1M의 농도가 되도록 넣어주는 과정이 필요하다. 그 후 4℃에서 16시간 이상 경과한 후 원심분리기를 이용하여 상층액을 얻은 뒤 일반적인 DNA 추출 방법에 따라 페놀을 이용하여 추출하는 방법이다. 이러한 방법을 통해 포유동물 세포에 형질전환 시킨 TR 벡터를 추출할 수 있게 되었다.
두 번째 기술은 Dam 메틸화를 특이적으로 인식하여 자르는 DpnI 이라는 효소의 사용이었다. 박테리아를 이용해서 대량 생산된 TR 벡터는 Dam 메틸화가 되어있기 때문에 DpnI 효소에 의해 인식 서열들이 잘리게 되어있다. 포유동물 세포에서 새롭게 복제된 벡터의 경우 Dam 메틸화가 되어있지 않기 때문에 구분 될 수 있다. 즉, 박테리아로부터 얻어진 TR 벡터를 포유동물 세포에 도입시킨 뒤 다시 추출하여 DpnI 효소를 처리하면 포유동물 세포에서 복제가 일어난 TR 벡터만을 얻을 수 있는 원리였다.
세 번째 기술은 이렇게 얻어진 TR 벡터를 확인하는 방법으로 서던블랏기법이 이용되었다. 얻어진 TR 벡터를 제한효소 처리를 통해 linear 형태로 잘라 준 뒤, 이를 아가로스 전기영동을 통해 절편을 확인하는 방법이었다. 서던블랏기법을 통해 이를 확인하기 위해 전기영동이 끝난 아가로스 겔에 denaturation, neutralization 과정을 거쳐준 뒤, 이를 16시간 이상 membrane으로 옮겨주는 과정이 필요하다. 또한 이렇게 준비된 membrane은 UV를 통한 fixation 과정, 실험자가 원하는 부위에 탐침자를 결합시키기 위한 pre-hybridization 과정, hybridization 과정이 필요하다. 이 과정에서 방사성 동위원소가 labeling된 탐침자를 사용할 경우는 washing 과정 후 필름 현상을 통해 원하는 탐침자가 결합된 TR 벡터를 필름을 통해 확인할 수 있다. 방사성 동위원소를 사용하지 않는 경우는 biotin이 labeling된 탐침자를 이용하여 membrane에 추가적으로 streptavidin, biotinylated-AP를 처리하고 ECL solution을 이용하여 이를 확인하여야 한다.
또 다른 카포시 육종 허피스 바이러스 감염을 진단하는 방법에 관한 문헌(US 6,093,550(2000.7.25)에서는 (a) 샘플을 얻는 단계; (b) KSHV 항원과 이에 특이적인 항체를 얻는 단계; 및 (c) KSHV 항원 항체의 결합을 확인하는 단계를 포함한다.
잠복성 복제를 확인하고 연관된 숙주 인자의 분석을 위해서는 위와 같은 시스템의 확립이 반드시 필요하다. 하지만 간략하게 설명된 위의 과정에서도 알 수 있듯이, 그 방법이 복잡하고 시간이 오래 걸린다는 단점이 있었다. 또한 서던블랏기법을 통해 잠복성 복제를 연구하기에는 한계가 있다. 단지 복제의 유무만을 정성적으로 확인하기 위해서는 문제가 없어 보일 수 있으나, KSHV의 잠복성 복제에 영향을 미치는 인자들과의 관계를 파악하여 특정 인자에 의한 복제 효율의 증감을 확인하기 위한 정량적 분석을 위해서는 서던블랏기법으로는 부족한 면이 있었다. 이에 보다 정량적이고 효율적인 real-time PCR 방법을 통해 KSHV 잠복성 복제 효율을 검출하기 위해 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 KSHV 잠복성 복제를 검출하기 위한 real-time PCR용 프라이머 서열 및 정량적 분석이 가능한 KSHV 잠복성 복제의 검출 방법 및 형질전환 효율 검증방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 서열번호 1 및 2의 핵산서열을 갖는 프라이머를 포함하는 KSHV 잠복성 복제 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명은 (a) 포유동물 세포로부터 추출한 DNA에 DpnI 제한효소를 처리하는 단계; 및 (b) 서열번호 1 및 2의 핵산서열을 갖는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 이용하여 real-time PCR을 실행하고 증폭산물을 2delta 역가 사이클로 분석하는 단계를 포함하는 KSHV 잠복성 복제 검출방법을 제공한다.
본 발명은 서열번호 3 및 4의 핵산서열을 갖는 프라이머를 포함하는 KSHV 잠복성 복제 효율검증을 위한 형질전환 효율 검증용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명은 (a) 포유동물 세포로부터 추출한 DNA에 서열번호 3 및 4의 핵산서열을 갖는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 처리하여 real-time PCR을 실행하는 단계; (b) 상기 real-time PCR의 증폭산물을 2delta 역가 사이클로 분석하는 단계; 및 (c) 포유동물 세포로부터 추출한 DNA에 DpnI 제한효소를 처리하고 서열번호 1 및 2의 핵산서열을 갖는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 이용하여 real-time PCR을 수행한 증폭산물의 2delta 역가 사이클 값과 비교하는 단계를 포함하는 KSHV 잠복성 복제 효율검증을 위한 형질전환 효율 검증방법을 제공한다.
본 발명은 서열번호 1 및 2의 핵산서열을 갖는 프라이머 세트를 포함하는 KSHV 잠복성 복제의 검출용 키트를 제공한다.
본 발명은 서열번호 3 및 4의 핵산서열을 갖는 프라이머 세트를 포함하는 KSHV 잠복성 복제 효율검증을 위한 형질전환 효율 검증용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 KSHV 잠복성 복제 검출용 프라이머 세트는 KSHV 잠복성 복제 유무 및 복제 효율 증감을 정량적으로 평가할 수 있는 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 TR 부위를 가지는 플라스미드에 관한 것이다.
도 2는 LANA를 발현하는 플라스미드에 관한 것이다.
도 3은 TR 벡터의 모식도 및 이를 복제하는 프라이머 서열에 관한 것이다.
도 4는 pcDNA5/FRT/TO 벡터의 hygromycinB 유전자 부위와 TR 벡터의 luciferase 유전자 부위에 대한 프라이머의 증폭 산물에 관한 것이다.
도 5는 hygromycinB 유전자와 luciferase 유전자 증폭 산물의 역가 사이클(cycle threshold)에 관한 것이다.
도 6은 LANA 벡터가 없을 때의 수치를 1로 정하고 LANA 벡터를 함께 형질전환 했을 때의 증감 비율을 나타낸 것이다.
도 7은 MAPK 신호 전달이 KSHV 잠복성 복제에 미치는 영향을 본원 발명에 따른 방법으로 확인한 결과이다.
도 2는 LANA를 발현하는 플라스미드에 관한 것이다.
도 3은 TR 벡터의 모식도 및 이를 복제하는 프라이머 서열에 관한 것이다.
도 4는 pcDNA5/FRT/TO 벡터의 hygromycinB 유전자 부위와 TR 벡터의 luciferase 유전자 부위에 대한 프라이머의 증폭 산물에 관한 것이다.
도 5는 hygromycinB 유전자와 luciferase 유전자 증폭 산물의 역가 사이클(cycle threshold)에 관한 것이다.
도 6은 LANA 벡터가 없을 때의 수치를 1로 정하고 LANA 벡터를 함께 형질전환 했을 때의 증감 비율을 나타낸 것이다.
도 7은 MAPK 신호 전달이 KSHV 잠복성 복제에 미치는 영향을 본원 발명에 따른 방법으로 확인한 결과이다.
본 발명은 서열번호 1 및 2의 핵산서열을 갖는 프라이머를 포함하는 KSHV 잠복성 복제 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
상기 서열번호 1 및 2의 프라이머는 KSHV 잠복성 복제 원점을 가진다고 알려진 TR(Terminal Repeat) 벡터에 존재하는 Luciferase 유전자 부위 일부를 대상으로 제작되어, 중합효소 연쇄반응(PCR)시 첨가되어 TR 유전자 부위를 증폭시킨다. 그러나 TR 부위가 제한효소 등에 의하여 손상된 경우에는 증폭시키지 못한다.
본 발명은 (a) 포유동물 세포로부터 추출한 DNA에 DpnI 제한효소를 처리하는 단계; 및 (b) 서열번호 1 및 2의 핵산서열을 갖는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 이용하여 real-time PCR을 실행하고 증폭산물을 2delta 역가 사이클로 분석하는 단계를 포함하는 KSHV 잠복성 복제 검출방법을 제공한다.
포유동물 세포는 일반적인 모든 세포에서 가능하고 DNA 추출은 통상적인 추출법을 사용할 수 있다.
DpnI 제한효소는 Dam 메틸화(DNA adenine methylation)된 DNA만을 자를 수 있는 제한효소이다. 박테리아로부터 추출하여 형질전환에 이용되는 벡터들은 박테리아 시스템에 의하여 Dam 메틸화 되어 있으나 포유동물 세포는 이러한 시스템이 없어 형질전환한 벡터의 복제가 일어나면 메틸화 되어 있지 않으므로 DpnI 제한효소의 영향을 받지 않아 복제된 벡터를 선별할 수 있다.
본 발명에 의한 서열번호 1 및 2의 핵산서열을 갖는 프라이머는 4곳에 Dam 메틸화 부위를 가져 DpnI 제한효소에 의해 잘릴 경우 증폭이 되지 않는다.
한 구체예에서 상기 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR)의 총 반응 부피는 20ul일 수 있고, 각 샘플은 95℃에서 3분 반응 후 95℃에서 3초 60℃에서 20초 반응을 60회 반복하여 수행할 수 있다.
본 발명은 포유동물 세포의 TR벡터 유무를 확인하는 것임을 특징으로 하는 KSHV 잠복성 복제 검출방법을 제공한다.
KSHV 잠복성 복제 원점을 가지는 TR(Terminal Repeat) 벡터의 유무로 KSHV 잠복성 복제를 검출할 수 있다.
TR(Terminal Repeat) 벡터는 801bp의 반복되는 서열이며 TR 서열 내에는 NotI 제한효소에 의해 인식되는 서열이 한군데 존재하여 NotI 제한효소를 이용한 부분 절단을 통해 TR 부위를 여러 개 가지는 TR 벡터를 제작할 수 있다.
본 발명은 포유동물 세포가 TR벡터 및 LANA벡터가 형질전환된 것을 특징으로 하는 KSHV 잠복성 복제 검출방법을 제공한다.
KSHV의 잠복성 복제에는 바이러스 단백질인 LANA와 바이러스의 유전체에 존재하는 TR 부위만이 필요하며 나머지는 숙주의 복제 시스템에 의존한다. TR 부위는 바이러스 유전체가 복제되기 위한 복제원점을 포함하며 LANA 단백질은 복제에 필요한 다양한 숙주 단백질과 상호작용한다. LANA 벡터는 pcDNA3에 재조합된 형태인 pcDNA3-LANA로 형질전환될 수 있다.
TR 서열 내에는 NotI 제한효소에 의해 인식되는 서열이 한군데 존재하여 NotI 제한효소를 이용한 부분 절단을 통해 TR 부위를 여러 개 가지는 TR 벡터를 제작할 수 있다.
본 발명은 추출한 DNA 샘플 1ug에 DpnI 제한효소를 10unit 첨가하는 것을 특징으로 하는 KSHV 잠복성 복제 검출방법을 제공한다.
본 발명은 luciferase 유전자부위를 타겟으로 하는 프라이머 세트를 이용한 KSHV 잠복성 복제 검출방법을 제공한다.
본 발명에 따른 프라이머는 TR 벡터에 존재하는 Luciferase 유전자 부위를 대상으로 제작되었다.
본 발명은 증폭산물을 확인하는 단계가 2delta 역가 사이클 분석을 통하는 것을 특징으로 하는 KSHV 잠복성 복제 검출방법을 제공한다.
증폭산물을 확인하는 단계는 실시간 중합효소 연쇄반응 결과 분석 방법 중 하나인 2델타 역가 사이클법일 수 있고 이에 도출되는 Ct값을 이용하여 KSWV 잠복성 복제를 검출할 수 있다..
본 발명에 따른 프라이머를 이용하여 비특이적 밴드가 형성되지 않은 증폭 산물 분석이 가능하다.
본 발명은 서열번호 3 및 4의 핵산서열을 갖는 프라이머를 포함하는 KSHV 잠복성 복제의 형질전환 효율 검증용 프라이머 세트를 제공한다.
상기 서열번호 3 및 4의 프라이머는 pcDNA5/FRT/TO 벡터의 hygromycinB 유전자 부위 일부를 대상으로 제작되어, 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR)시 첨가되어 hygromycinB 유전자 부위를 172bp 크기로 증폭시킨다. pcDNA5/FRT/TO 벡터는 포유동물 세포에서 스스로 복제가 불가능하여 형질전환 효율 검증에 활용될 수 있다.
형질전환 시 실험군에 따라 형질전환 되는 효율이 다를 수 있는데 모든 실험군에 동일하게 pcDNA5/FRT/TO벡터를 넣어준 후 그 양을 측정함으로써 이를 보정할 수 있다. 포유동물 내에서 스스로 복제가 된다면 그 복제 정도가 다를 수 있기 때문에 포유동물에서 복제가 가능한 Origin을 가지지 않는 공벡터를 이에 이용할 수 있다.
본 발명은 (a) 포유동물 세포로부터 추출한 DNA에 서열번호 3 및 4의 핵산서열을 갖는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 처리하여 real-time PCR을 실행하는 단계; (b) 상기 real-time PCR의 증폭산물을 2delta 역가 사이클로 분석하는 단계; 및 (c) 포유동물 세포로부터 추출한 DNA에 DpnI 제한효소를 처리하고 서열번호 1 및 2의 핵산서열을 갖는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 이용하여 real-time PCR을 수행한 증폭산물의 2delta 역가 사이클 값과 비교하는 단계를 포함하는 KSHV 잠복성 복제 효율검증을 위한 형질전환 효율 검증방법을 제공한다.
본 발명은 새롭게 복제된 벡터만을 검출하는 것을 특징으로 하는 KSHV 잠복성 복제 효율검증을 위한 형질전환 효율 검증방법을 제공한다.
본 발명은 상기 포유동물 세포가 TR벡터, LANA벡터 및 pcDNA5/FRT/TO 벡터가 공형질전환된 것을 특징으로 하는 KSHV 잠복성 복제 효율검증을 위한 형질전환 효율 검증방법을 제공한다.
LANA벡터는 pcDNA3-LANA일 수 있다.
또한 본 발명은 상기 포유동물 세포에 TR벡터, pcDNA3벡터 및 pcDNA5/FRT/TO 벡터가 공형질전환된 것을 특징으로 하는 KSHV 잠복성 복제 효율검증을 위한 검증방법을 제공한다.
이 때 샘플 당 TR 벡터는 100ng, pcDNA5/FRT/TO 벡터는 100 내지 500ng, LANA 벡터와 pcDNA3 벡터는 1ug을 이용할 수 있다.
상기 두 개의 공형질전환된 세포를 LANA 벡터의 유무에 따라 비교하여 KSHV 잠복성 복제의 형질전환 효율을 비교할 수 있다.
본 발명은 상기 서열번호 1 및 2의 핵산서열을 갖는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트는 luciferase 유전자부위를 타겟으로 하는 것을 특징으로 하는 KSHV 잠복성 복제 효율검증을 위한 형질전환 효율 검증방법을 제공한다.
또한 상기 서열번호 3 및 4의 핵산서열을 갖는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트는 hygromycin 유전자부위를 타겟으로 하는 것을 특징으로 하는 KSHV 잠복성 복제 효율검증을 위한 형질전환 효율 검증방법을 제공한다.
본 발명은 상기 증폭산물을 확인하는 단계는 2delta 역가 사이클 분석을 통하는 것을 특징으로 하는 KSHV 잠복성 복제 효율검증을 위한 형질전환 효율 검증방법을 제공한다.
본 발명은 서열번호 1 및 2의 핵산서열을 갖는 프라이머 세트를 포함하는 KSHV 잠복성 복제의 검출용 키트 및 서열번호 3 및 4의 핵산서열을 갖는 프라이머 세트를 포함하는 KSHV 잠복성 복제의 형질전환 효율 검증용 키트를 제공한다.
상기 키트는 본 발명에 따른 검출방법 및 검증방법에 적용할 수 있다.
본 발명에 따른 프라이머 세트 및 이를 이용한 실시간 중합효소 연쇄반응을 통해 KSHV 잠복성 복제에 대한 연구를 보다 간편하고 빠르게 할 수 있도록 하고 추가적인 연구를 진행할 수 있도록 할 수 있다. KSHV 잠복성 복제에 영향을 미친다고 알려진 TR 및 LANA 뿐만 아니라, KSHV 잠복성 복제에 영향을 미친다고 판단되는 인자에 대한 추가적인 연구에 응용이 가능하다. 일례로 MAPK 신호 전달 기작이 KSHV 잠복성 복제에 미치는 영향을 판단할 수 있다(도 7).
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
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실시예
1>
TR
부위를 가지는 플라스미드 제작
KSHV 잠복성 복제 원점을 가진다고 알려진 TR(Terminal Repeat) 벡터(도 1)를 우선 제작하였다. TR 부위를 가지는 Z6 코스미드를 제한효소인 EcoRI과 XhoI을 이용하여 절단한 뒤 pBluescript II KS(-) 벡터에 클로닝하였다. TR 부위는 801bp의 반복되는 서열이며 TR 서열 내에는 NotI 제한효소에 의해 인식되는 서열이 한군데 존재한다. 따라서 NotI 제한효소를 이용한 부분 절단을 통해 TR 부위를 4개 가지는 4TR 벡터를 제작하였다. 최대한 TR 부위만을 포함하도록 제작하기 위해 SacI과 PstI 제한효소를 이용하여 다시 잘라준 뒤 pBluescript II KS(-) 벡터에 클로닝 하였다. 박테리아로부터의 추출 효율을 높이기 위해 다시 SacI과 HindIII 제한효소를 이용하여 잘라 준 뒤 pGL2-basic 벡터에 클로닝하여 p4TR-luc라 명명하였다. 본 벡터는 포유동물에서 복제될 수 있는 복제원점이 없기 때문에 포유동물 세포에서는 스스로 복제되지 않는다.
<
실시예
2>
LANA
를 발현하는 플라스미드의 제작
도 2와 같은 LANA를 발현하는 플라스미드를 제작하였다. KSHV에 감염된 BCBL-1 세포주로부터 KSHV 유전체를 추출하여 LANA에 대한 프라이머를 이용하여 real-time PCR을 한 뒤 pcDNA3 벡터의 EcoRI, XhoI 부위에 클로닝하였다.
<
실시예
3> 형질전환 효율을 검증을 위한 벡터 선정
실시예 1 및 2의 TR 벡터와 LANA 벡터를 포유동물 세포로 형질전환하는 과정의 효율을 검증하기 위하여 공형질전환(cotransfection)할 벡터를 선정하였다.
TR 벡터는 LANA에 의해 세포 내에서 영향을 받으며 LANA 벡터는 형질전환할 포유동물 세포인 293T 세포에서 복제가 가능하기 때문에 형질전환 효율을 검증하기 위한 방법으로 적절하지 않다. 따라서 본 연구에서는 포유동물 세포에서 스스로 복제가 불가능한 pcDNA5/FRT/TO 벡터를 선정하여 공형질전환하였다. pcDNA5/FRT/TO 벡터는 hygromycinB 유전자를 갖고 있기 때문에 후에 이 유전자에 대한 프라이머를 통해 실시간 중합효소 연쇄반응을 거쳐 형질전환 효율 검증에 활용될 수 있다.
<
실시예
4> 실시간 중합효소 연쇄반응을 위한
프라이머의
선정
포유동물 세포에서 새롭게 복제된 벡터만을 검출하기 위하여 DpnI 제한효소를 이용하였다. DpnI 제한효소에 의해 잘리지 않은 벡터만을 검출하기 위하여 이 벡터만을 증폭 시킬 수 있는 프라이머가 필요하므로 TR 벡터에 존재하는 Luciferase 유전자 부위를 대상으로 프라이머를 제작하였다. 본 발명에서 사용된 프라이머에 의해 증폭되는 부위는 4곳에 Dam 메틸화 부위가 있기 때문에 DpnI에 의해 잘릴 경우 증폭을 시키지 못한다. 본 발명에서는 Luc-319F (제1서열: 5’-TTGTACCAGAGTCCTTTGAT-3’)와 Luc-319R (제2서열: 5’-AGCAACGCACTTTGAATT-3’) 프라이머 세트를 이용하여 DpnI에 의해 잘리지 않은 luciferase 유전자 부위가 319bp 크기로 증폭되도록 설계하였다. 또한 형질전환 효율 비교를 위해 HygroB-F (제3서열: 5’-TGTATCACTGGCAAACTG-3’)와 HygroB-R (제4서열: 5’-TCAATGACCGCTGTTATG-3’) 프라이머 세트에 의해 hygromycinB 유전자 부위를 172bp 크기로 증폭되도록 설계하였다. 프라이머는 COSMO GENETHECH사에서 구입하였다.
<
실시예
5> 포유동물 세포의 선정과 형질전환
본 발명에서는 293T 세포 주를 10% FBS와 1%penicillin, streptomycin이 포함된 배지에서 배양하였으며 배양 조건은 37℃, 5% 이산화탄소 농도로 설정하였다. 복제 효율을 확인하기 위해 형질전환 24시간 전에 6-well 배양 접시에 계대배양을 하였으며 2배 농도의 Hepes-buffered saline과 2M 염화칼슘을 이용하였다. TR 벡터와 pcDNA5/FRT/TO 벡터는 모든 샘플에 형질전환 하였으며 한 샘플은 pcDNA3 벡터를, 또 다른 샘플에는 LANA 벡터를 함께 형질전환 하였다. 이 때 샘플 당 TR 벡터는 100ng, pcDNA5/FRT/TO 벡터는 500ng, LANA 벡터와 pcDNA3 벡터는 1ug을 이용하였다.
<
실시예
6> 포유동물 세포로부터 벡터 추출
형질전환된 동물세포로부터 벡터를 다시 추출하기 위해 Hirt 추출법을 이용하였다. 복제 효율을 검증하기 위해 형질전환 후 24시간째 총 세포의 1/4 양을 따로 모으고 또 다른 1/4 세포는 100파이 배양 접시에 옮긴 후 계속 배양하였다. 따로 모은 세포는 PBS로 워싱한 뒤 300ul의 PBS를 이용하여 세포를 풀어준다. 풀어준 세포에 300ul의 2X Hirt soulution을 첨가한 뒤 15분 간 세포를 용해시켰다. 15분 후 염화나트륨의 최종 농도가 1M이 되도록 첨가하고 4℃ 에서 16시간 정도 둔다. 16시간 후 원심분리기를 이용하여 상층액만을 얻어서 동량의 PCI 를 첨가하였다. 1분간 섞어준 뒤 5분간 원심분리기를 이용하여 층을 분리시켰다. 상층액을 따로 모아서 동량의 chloroform을 첨가하고 섞어준 뒤 2분간 원심분리기를 이용하여 층을 분리시켰다. 최종적으로 얻어진 상층액의 1/10 부피의 3M 아세트산나트륨을 첨가하고 2-3배 부피의 100% 에탄올을 넣었다. 영하 70℃에서 30분간 DNA를 침전시킨 뒤 원심분리기를 이용하여 침전시키고 70% 에탄올로 워싱하였다. 그 후 에탄올을 제거하고 DNA 펠렛을 말린 후 50ul의 증류수에 녹이고 농도를 측정하였다. 복제 효율을 위한 샘플은 형질전환 96시간 후에 같은 방법으로 준비하였고, 최종 DNA 펠렛을 20ul의 증류수에 녹이고 농도를 측정하였다.
<
실시예
7> 실시간 중합효소 연쇄반응
상기 방법으로 준비된 24 시간째 샘플 100ng을 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응을 통해 형질전환 효율을 측정하였다. 또한 96 시간째 샘플 1ug을 총 20ul의 반응부피로 하여 DpnI 10Unit을 2시간 동안 처리하였다. 2시간 후 DpnI에 의해 잘려진 가닥을 확실히 제거하기 위해 ExonucleaseIII 100Unit을 30분간 처리하고 70℃에서 20분간 실행시켰다. 실시간 중합효소 연쇄반응을 위해 24 시간째 샘플은 hygromycinB에 대한 프라이머를, 96 시간째 샘플은 luciferase 유전자에 대한 프라이머를 각각 5pmol의 농도로 사용하였다. 2X 농도의 SYBR GREEN master mix( KAPA BIOSYSTEMS사)를 이용하며 실시간 중합효소 연쇄반응의 총 반응 부피는 20ul로 하였다. 각 샘플은 95℃에서 3분 반응 후 95℃에서 3초 60℃에서 20초 반응을 60회 반복하며 RoterGene 6000 (Qiagen사)을 이용하였다. 각 3회씩 반복 수행하여 결과를 도출하였다.
<
실시예
8>
프라이머의
반응 특이성 확인
본 발명에서 사용된 pcDNA5/FRT/TO 벡터의 hygromycinB 유전자 부위와 TR 벡터의 luciferase 유전자 부위에 대한 프라이머의 증폭 산물을 도 4에 나타내었다.
본 발명에서 사용된 각각의 프라이머는 비 특이적 밴드를 형성하지 않고 해당 크기의 증폭 산물을 형성하는 것을 확인하였다.
<
실시예
10> 결과 분석을 위한
역가
사이클 검증
본 발명에서 얻어진 결과를 실시간 중합효소 연쇄반응 결과 분석 방법 중 하나인 2델타 역가 사이클법으로 분석하기 위해 일정 농도로 희석된 샘플에서 hygromycinB 유전자와 luciferase 유전자 증폭 산물의 역가 사이클을 분석하였다. 그 결과는 도 5에 나타내었다.
1/100 희석 범위에서 각각의 프라이머를 이용하여 증폭된 역가 사이클의 차를 분석한 결과 그 기울기가 0.1 이하로 확인되었다. 따라서 본 발명에 의한 결과를 2델타 역가 사이클 분석법을 이용하여 도출하는데 문제가 없음을 확인하였다.
<
실시예
11> 실시간 중합효소 연쇄반응을 이용한
KSHV
잠복성
복제 효율 검증
TR 벡터의 복제 효율을 LANA 벡터의 유무에 따라 확인해 보았다. 각 결과는 LANA 벡터가 없을 때의 수치를 1로 정하고 LANA 벡터를 함께 형질전환 했을 때의 증감 비율을 나타내었다. KSHV 잠복성 복제 효율에 대한 결과는 도 6에 나타내었다.
본 발명을 이용하여 형질전환 후 DNA 회수 시간을 각기 달리하여 TR 벡터의 복제효율을 확인한 결과, 72시간 째는 약 3.6배 증가로 큰 차이가 나지 않았다. 하지만 96시간째와 120 시간 째는 각각 77.9배, 28.9배로 증가하는 것을 확인함으로써 본 발명에서는 96시간 후에 DNA 추출 시 가장 높은 복제 효율을 보이는 것으로 확인되었다.
<
실시예
11>
MAPK
신호 전달이
KSHV
잠복성
복제에 미치는 영향 확인 실험
KSHV 잠복성 복제에 영향을 미친다고 판단되는 인자에 대한 추가적인 연구로 본 발명을 이용하여 숙주 세포 내 신호 전달 기작인 MAPK 신호 전달이 KSHV 잠복성 복제에 미치는 영향을 알아보았다.
상기 실시예에 따른 방법을 그대로 이용하였으며 도 7에 표기된 MAPK에 대한 억제제(p38 억제제, ERK와 JNK에 대한 억제제)를 24 시간 마다 처리하였다.
p38 억제제를 처리해 준 경우 LANA를 넣어준 샘플에 비해 약 2.9배 증가로 큰 차이를 보이지 않았으며 ERK와 JNK에 대한 억제제를 처리해 준 경우 각각 20.4배, 24.1배로 상당히 증가됨을 확인하였다. 본 발명을 응용한 연구를 통해 MAPK 신호 전달 기작이 KSHV 잠복성 복제 효율을 떨어뜨리는 역할을 하는 것으로 확인되었다.
<110> DONGGUK UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION
<120> Primer for detecting of latent replication of KSHV and method for
detecting latent replication of KSHV
<160> 3
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Luc-319F
<400> 1
ttgtaccaga gtcctttgat 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Luc-319R
<400> 2
agcaacgcac tttgaatt 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> HygroB-F
<400> 3
tgtatcactg gcaaactg 18
Claims (16)
- 서열번호 1 및 2의 핵산서열을 갖는 프라이머를 포함하는 KSHV 잠복성 복제 검출용 프라이머 세트.
- (a) 포유동물 세포로부터 추출한 DNA에 DpnI 제한효소를 처리하는 단계; 및 (b) 서열번호 1 및 2의 핵산서열을 갖는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 이용하여 real-time PCR을 실행하고 증폭산물을 2delta 역가 사이클로 분석하는 단계를 포함하는 KSHV 잠복성 복제 검출방법.
- 제2항에 있어서,
상기 KSHV 잠복성 복제 검출방법은 포유동물 세포의 TR벡터 유무를 확인하는 것임을 특징으로 하는 KSHV 잠복성 복제 검출방법. - 제2항에 있어서,
상기 포유동물 세포는 TR벡터 및 LANA벡터가 형질전환된 것을 특징으로 하는 KSHV 잠복성 복제 검출방법. - 제2항에 있어서,
DpnI 제한효소는 추출한 DNA 샘플 1ug에 DpnI 제한효소를 10unit 첨가하는 것을 특징으로 하는 KSHV 잠복성 복제 검출방법. - 제2항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 luciferase 유전자부위를 타겟으로 하는 것을 특징으로 하는 KSHV 잠복성 복제 검출방법. - 서열번호 3 및 4의 핵산서열을 갖는 프라이머를 포함하는 KSHV 잠복성 복제 효율검증을 위한 형질전환 효율 검증용 프라이머 세트.
- (a) 포유동물 세포로부터 추출한 DNA에 서열번호 3 및 4의 핵산서열을 갖는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 처리하여 real-time PCR을 실행하는 단계; (b) 상기 real-time PCR의 증폭산물을 2delta 역가 사이클로 분석하는 단계; 및 (c) 포유동물 세포로부터 추출한 DNA에 DpnI 제한효소를 처리하고 서열번호 1 및 2의 핵산서열을 갖는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 이용하여 real-time PCR을 수행한 증폭산물의 2delta 역가 사이클 값과 비교하는 단계를 포함하는 KSHV 잠복성 복제 효율검증을 위한 형질전환 효율 검증방법.
- 제8항에 있어서,
상기 KSHV 잠복성 복제 효율검증을 위한 형질전환 효율 검증방법은 새롭게 복제된 벡터만을 검출하는 것을 특징으로 하는 KSHV 잠복성 복제 효율검증을 위한 형질전환 효율 검증방법. - 제8항에 있어서,
상기 포유동물 세포는 TR벡터, LANA벡터 및 pcDNA5/FRT/TO 벡터가 공형질전환된 것을 특징으로 하는 KSHV 잠복성 복제 효율검증을 위한 형질전환 효율 검증방법. - 제8항에 있어서,
상기 포유동물 세포는 TR벡터, pcDNA3벡터 및 pcDNA5/FRT/TO 벡터가 공형질전환된 것을 특징으로 하는 KSHV 잠복성 복제 효율검증을 위한 형질전환 효율 검증방법. - 제8항에 있어서,
상기 서열번호 1 및 2의 핵산서열을 갖는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트는 luciferase 유전자부위를 타겟으로 하는 것을 특징으로 하는 KSHV 잠복성 복제의 효율검증을 위한 형질전환 효율 검증방법. - 제8항에 있어서,
상기 서열번호 3 및 4의 핵산서열을 갖는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트는 hygromycinB 유전자부위를 타겟으로 하는 것을 특징으로 하는 KSHV 잠복성 복제 효율검증을 위한 형질전환 효율 검증방법. - 제8항에 있어서,
상기 증폭산물을 확인하는 단계는 2delta 역가 사이클 분석을 통하는 것을 특징으로 하는 KSHV 잠복성 복제 효율검증을 위한 형질전환 효율 검증방법. - 서열번호 1 및 2의 핵산서열을 갖는 프라이머 세트를 포함하는 KSHV 잠복성 복제의 검출용 키트.
- 서열번호 3 및 4의 핵산서열을 갖는 프라이머 세트를 포함하는 KSHV 잠복성 복제 효율검증을 위한 형질전환 효율 검증용 키트.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020120033134A KR101392137B1 (ko) | 2012-03-30 | 2012-03-30 | Ｋｓｈｖ 잠복성 복제 검출용 프라이머 및 이를 이용한 ｋｓｈｖ 잠복성 복제 검출 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020120033134A KR101392137B1 (ko) | 2012-03-30 | 2012-03-30 | Ｋｓｈｖ 잠복성 복제 검출용 프라이머 및 이를 이용한 ｋｓｈｖ 잠복성 복제 검출 방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20130110854A true KR20130110854A (ko) | 2013-10-10 |
| KR101392137B1 KR101392137B1 (ko) | 2014-05-08 |
Family
ID=49632611
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020120033134A KR101392137B1 (ko) | 2012-03-30 | 2012-03-30 | Ｋｓｈｖ 잠복성 복제 검출용 프라이머 및 이를 이용한 ｋｓｈｖ 잠복성 복제 검출 방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101392137B1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111057790A (zh) * | 2019-12-11 | 2020-04-24 | 石河子大学 | miRNA在制备用于检测KSHV潜伏感染的试剂盒中的用途 |
-
2012
- 2012-03-30 KR KR1020120033134A patent/KR101392137B1/ko active IP Right Grant
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|---|---|---|---|---|
| CN111057790A (zh) * | 2019-12-11 | 2020-04-24 | 石河子大学 | miRNA在制备用于检测KSHV潜伏感染的试剂盒中的用途 |
| CN111057790B (zh) * | 2019-12-11 | 2022-08-30 | 石河子大学 | miRNA在制备用于检测KSHV潜伏感染的试剂盒中的用途 |
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|---|---|
| KR101392137B1 (ko) | 2014-05-08 |
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