KR20130101348A - MANUFACTURING METHOD FOR γ-DODECALACTONE FROM HYDROXY FATTY ACID WITH HIGH YIELD AND COMPOSITION THEREOF - Google Patents

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Abstract

PURPOSE: A method for preparing gamma-dodecalactone with high yield from hydroxy fatty acids is provided to show eco-friendly property and high specificity and to produce a large amount of peach-flavored gamma-dodecalactone which is a raw material of a food additive. CONSTITUTION: A method for preparing gamma-dodecalactone from hydroxy fatty acids comprises the step of using Waltomyces lipofer KCTC17657 which is yeast. The yeast is cultured in a reaction medium containing 7.5-12.5 g/L of Tris-HCl. The hydroxy fatty acid is 10-hydroxystearic acid. A composition for preparing gamma-dodecalactone from hydroxy fatty acid contains the yeast as an active ingredient.

Description

하이드록시 지방산으로부터 고수율의 감마-도데카락톤의 제조방법 및 그 조성물{Manufacturing method for γ-dodecalactone from hydroxy fatty acid with high yield and Composition thereof}Manufacturing method for γ-dodecalactone from hydroxy fatty acid with high yield and Composition according to the present invention.

본 발명은 효모를 이용한 고수율의 감마-도데카락톤(-Dodecalactone)의 제조방법 및 그 제조용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 효모 월토마이세스 리포퍼(Waltomyces lipofer)를 이용하여 10-하이드록시스테아르산(10-Hydroxystearic acid)을 반응시켜 식품첨가제의 원료 물질인 복숭아향의 감마-도데카락톤을 대량 생산하는 방법 및 그 제조용 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to a method for producing a high yield gamma-dodecaractone (-Dodecalactone) using the yeast, and a composition for producing the same, more specifically using a yeast Waltomyces lipofer (10-hydroxy) The present invention relates to a method for mass-producing peach-flavored gamma-dodecaractone by reacting stearic acid (10-Hydroxystearic acid) and a composition for producing the same.

최근 현대인의 식생활이 풍부해지면서 친환경 식품에 대한 소비자의 욕구가 크게 높아지고 있는 추세에 있다. 이러한 소비자의 의식변화에 발맞춰 식품 및 음료시장에서도 다양한 천연식품첨가제인 향료 수요가 급증하고 있다. 현재 중국에서 많이 유통되고 있는 화학합성 향료는 자연계의 향료소재와 비교하여 광학이성체가 존재함에 따라 이들 간의 물리적 성질은 같으나 조향이나 안정성에 있어서 큰 차이를 보인다. 이에 따라 자연계와 유사하고 실물감에 가까운 광학이성체의 감마-락톤류의 생산은 소비자에게 자연의 풍미를 가장 가깝게 전달할 수 있는 산업적으로 중요한 기술이다. 이러한 하이드록시 지방산 유래 락톤류는 자연계에 폭 넓게 존재하는 물질로서 동식물, 효모, 그리고 곰팡이 등에서 발견되었고 과일이나 우유, 버터의 주요 방향성분이다. 효모는 다양한 위치의 하이드록시 지방산을 생물학적으로 전환하여 주로 감마(γ) 또는 델타(δ) 두 가지 유형의 락톤을 생산한다.Recently, as the diet of modern people is getting richer, the consumer's desire for eco-friendly food is increasing. In line with the changing consumer consciousness, the demand for flavors, which are various natural food additives, is rapidly increasing in the food and beverage market. Currently, chemical synthetic fragrances widely distributed in China have the same physical properties as optical isomers as compared to natural fragrance materials, but show a great difference in steering and stability. Accordingly, the production of gamma-lactones of optical isomers similar to the natural world and close to life is an industrially important technology that can convey the natural flavor to consumers most closely. These hydroxy fatty acid-derived lactones are widely found in nature, found in plants, yeasts, and molds and are the main aromatic components of fruits, milk and butter. Yeasts biologically convert hydroxy fatty acids at various positions to produce mainly two types of lactones, gamma (γ) or delta (δ).

기존에 10-하이드록시스테아르산을 생산하는 미생물로는 플라보박테리움 (Flavobacterium. sp. NRRL B-14859), 노카디아 콜레스테로리큠(Nocardia cholesterolicum) 및 루니말 박테리아(runimal bacteria) 가 있다. 이들 미생물은 10-하이드록시스테아르산을 낮은 수율로 생산 할 뿐만 아니라 부산물이 같이 생산되어 산업화시 비 경제적이다.Microorganisms that produce 10-hydroxystearic acid include Flavobacterium (sp. NRRL B-14859) and Nocardia cholesterolithe ( Nocardia). There are cholesterolicum) and Rooney say bacteria (runimal bacteria). These microorganisms not only produce 10-hydroxystearic acid in low yields, but also produce by-products, making them uneconomical for industrialization.

기존에 감마-락톤류를 생산하는 효모로 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 피치아 귀일리어몬디(Pichia guilliermondii), 스폴리디오볼루스 살모니컬러(Sporidiobolus salmonicolor), 료도토룰라 아우란티아카(Rhodotorula aurantiaca), 그리고 료도토룰라 글루티니스(Rhodotorula glutinis) 등이 있으나 이들 효모의 감마-락톤류 생산수율은 현저히 낮으며 감마-락톤류가 다시 하이드록시 지방산으로 되돌아가는 가역반응으로 인해 산업화시 매우 비경제적이다. 또한 기존에 발효를 통한 감마-락톤류 생산은 많은 양의 배지 소모와 시간 소요가 따르며 적용 사례에 있어서 효모의 세포막 투과성을 높이거나 발효가 아닌 세포 자체 효소반응을 통한 감마-락톤류를 생산한 사례는 현재까지 보고되지 않았다.Gamma existing - with yeast to produce lactones Yaroslavl Li Wia poly Utica (Yarrowia lipolytica), blood tooth gwiil rear Mondi (Pichia guilliermondii ), Sporidiobolus salmonicolor ), Rhodotorula aurantiaca , and Rhodotorula glutinis glutinis ), but the yield of gamma-lactones of these yeasts is remarkably low and it is very uneconomical for industrialization due to the reversible reaction of gamma-lactones back to hydroxy fatty acids. In addition, the production of gamma-lactones through fermentation requires a large amount of medium consumption and time consuming, and in the case of application, a case of increasing the cell membrane permeability of yeast or producing gamma-lactones through cell self-enzyme reaction rather than fermentation. Has not been reported to date.

관련 선행특허로 대한민국특허공개번호 제1020010085948 (2001.09.07)는 배양물을 포함하는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)를 사용하여 감마-데카락톤을 제조하는 방법에 관한 것이 기재되어 있으며,As a related prior patent, Korean Patent Publication No. 1020010085948 (2001.09.07) discloses a method for preparing gamma-dekaralactone using Yarrowia lipolytica comprising a culture.

유럽특허 EP0795607(1997.09.17)는 감마-decalactone의 생산을 위한 미생물학적 방법에 관한 것으로, Mucor 속 미생물을 carboxylic acid ester와 배양하여, 감마-decalactone를 생산하는 방법에 관한 것이 기재되어 있다. European patent EP0795607 (1997.09.17) relates to a microbiological method for the production of gamma-decalactone and describes a method for producing gamma-decalactone by culturing a microorganism of Mucor with a carboxylic acid ester.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 고수율의 감마-도데카락톤 제조방법을 제공하는 것이다.The present invention solves the above problems and the object of the present invention is to provide a high yield gamma-dode caractone production method.

본 발명의 다른 목적은 고수율의 감마-도데카락톤 제조용 조성물을 제공하는 것이다.
Another object of the present invention is to provide a composition for producing gamma-dodecaractone with high yield.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 효모균주인 월토마이세스 리포퍼를 이용하여 하이드록시 지방산으로부터 감마-도데카락톤의 제조방법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a method for producing gamma-dodecaractone from hydroxy fatty acid using the yeast strain Woltomyces reoper.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 효모는 월토마이세스 리포퍼 KCTC 17657인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.In one embodiment of the present invention, the yeast is preferably Woltomyces reaper KCTC 17657, but is not limited thereto.

본 발명의 다른 구현예에 있어서,상기 방법은 효모를 7.5 내지 12.5 g/ℓ Tris-HCl를 포함하는 반응 배지에서 배양하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.In another embodiment of the present invention, the method is preferably but not limited to culturing yeast in a reaction medium containing 7.5 to 12.5 g / l Tris-HCl.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 하이드록시 지방산은 10-하이드록시스테아르산인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.In another embodiment of the present invention, the hydroxy fatty acid is preferably 10-hydroxystearic acid, but is not limited thereto.

본 발명의 바람직한 실시예에 있어서,상기 방법은 효모의 세포막 투과성을 향상하는 물질을 추가적으로 투여하는 것이 바람직하고, 상기 세포막 투과성을 향상하는 물질은 메탄올, 에탄올, 소디움도데실설페이트(Sodium dodecyl sulfate; SDS) 또는 Triton X-100 또는 이들의 혼합물인 것이 더욱 바람직하며, 본 발명에서는 상기 에탄올은 30% 내지 70%, 상기 Triton X-100은 0.1% 내지 1.0% 범위로 투여되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.In a preferred embodiment of the present invention, the method is preferably to additionally administer a substance for improving the cell membrane permeability of yeast, the substance for improving the cell membrane permeability is methanol, ethanol, sodium dodecyl sulfate (SDS) Or Triton X-100 or a mixture thereof, and in the present invention, the ethanol is preferably administered in the range of 30% to 70%, and the Triton X-100 in the range of 0.1% to 1.0%, but is not limited thereto. .

또 본 발명은 효모균주인 월토마이세스 리포퍼를 유효성분으로 포함하는 하이드록시 지방산으로부터 감마-도데카락톤 제조용 조성물을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a composition for preparing gamma-dodecaractone from hydroxy fatty acid comprising a yeast strain Woltomyces reporter as an active ingredient.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 세포막 투과성 향상물질을 더욱 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.In one embodiment of the invention, the composition preferably further comprises a cell membrane permeability enhancer, but is not limited thereto.

또 본 발명은 효모균주를 세포막 투과성 향상물질과 하이드록시 지방산을 처리하여 감마-도데카락톤의 생산성을 향상시키는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for improving the productivity of gamma-dodecaractone by treating yeast strains with cell membrane permeability enhancing substances and hydroxy fatty acids.

이하 본 발명을 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described.

본 발명은 10-하이드록시스테아르산을 복숭아향의 감마-도데카락톤으로 전환하기 위하여 효모 선발, 온도, pH, 질소원, 교반속도, 효모 농도, 기질 농도, 그리고 세포막 투과성 등의 반응조건을 최적화하여 감마-도데카락톤을 고수율로 얻는 제조방법을 제공한다.The present invention optimizes reaction conditions such as yeast selection, temperature, pH, nitrogen source, stirring speed, yeast concentration, substrate concentration, and cell membrane permeability in order to convert 10-hydroxystearic acid into peach-based gamma-dodecaractone. Provided is a method for obtaining gamma-dodecaractone in high yield.

본 발명은 효모을 이용하는 생물전환 반응으로 감마-도데카락톤의 고수율 제조 방법을 제공한다.The present invention provides a method for producing high yield of gamma-dodecaractone in a bioconversion reaction using yeast.

구체적으로, 본 발명은 10-하이드록시스테아르산을 감마-도데카락톤으로 전환할 수 있는 월토마이세스 리포퍼를 이용하여 반응조건(온도, pH, 교반속도, 세포막 투과성, 효모농도, 기질농도)을 최적화하고 최적화된 조건에서 감마-도데카락톤을 얻는 제조 방법을 제공한다. Specifically, the present invention using the waltomyis reporter that can convert 10-hydroxystearic acid to gamma-dodecaractone (temperature, pH, stirring speed, cell membrane permeability, yeast concentration, substrate concentration) And a method for producing gamma-dodecaractone under optimized conditions.

본 발명에서는 효모 월토마이세스 리포퍼의 효모배양배지는 YM(Yeast Malt) broth가 가능하고, 10-하이드록시스테아르산을 감마-도데카락톤으로 전환을 위한 반응 배지는 기존에 방법이 아닌 새로운 방법으로 1.0 내지 20.0 g/ℓ 질소원이 함유된 Tris-HCl 반응배지가 바람직하고, 7.5 내지 12.5 g/ℓ에서 더욱 바람직하다.In the present invention, yeast culture medium of yeast Wolto Myis repopper is YM (Yeast Malt) broth, the reaction medium for converting 10-hydroxystearic acid to gamma-dodecaractone is a new method rather than the conventional method The Tris-HCl reaction medium containing 1.0 to 20.0 g / L nitrogen source is preferred, and more preferably at 7.5 to 12.5 g / L.

또한, 상기 생물전환 반응은 균체를 배양액으로부터 분리한 후 농축하여 사용하는 것이 바람직하며, 효모의 농도는 20 g/ℓ 내지 40g/ℓ가 바람직하고, 25g/ℓ 내지 35g/ℓ에서 더욱 바람직하다.In addition, the bioconversion reaction is preferably used after the cells are separated from the culture medium and concentrated, and the concentration of the yeast is preferably 20 g / L to 40 g / L, more preferably from 25 g / L to 35 g / L.

또한, 상기 생물전환 반응 온도는 30℃ 내지 40℃ 범위에서 이루어지는 것이 바람직하고, 온도 33℃ 내지 37℃ 범위에서 이루어지는 것이 더욱 바람직하다. In addition, the bioconversion reaction temperature is preferably made in the range of 30 ° C to 40 ° C, more preferably in the temperature range of 33 ° C to 37 ° C.

또한, 상기 생물전환 반응은 pH 6.0 내지 pH 7.0 범위에서 이루어지는 것이 바람직하고, pH 6.2 내지 pH 6.7 범위에서 이루어지는 것이 더욱 바람직하다. 반응배지는 Tris-HCl 반응배지를 사용하는 것이 바람직하다.In addition, the bioconversion reaction is preferably made in the pH 6.0 to pH 7.0 range, more preferably in the pH 6.2 to pH 6.7 range. The reaction medium is preferably a Tris-HCl reaction medium.

또한, 상기 생물전환 반응은 150 rpm 내지 250 rpm 범위에서 이루어지는 것이 바람직하고, 200 rpm 내지 250 rpm 범위에서 이루어지는 것이 더욱 바람직하다.In addition, the bioconversion reaction is preferably made in the range of 150 rpm to 250 rpm, more preferably in the range of 200 rpm to 250 rpm.

또한, 상기 생물전환 반응은 에탄올 및 Triton X-100을 각각 30% 내지 60%, 0.2% 내지 0.7% 범위에서 이루어지는 것이 바람직하고, 40% 내지 50% 그리고 0.4% 내지 0.6% 범위에서 이루어지는 것이 더욱 바람직하다.In addition, the bioconversion reaction is preferably made in the range of 30% to 60%, 0.2% to 0.7%, and more preferably 40% to 50% and 0.4% to 0.6% of ethanol and Triton X-100, respectively. Do.

또한, 상기 기질은 10-하이드록시스테아르산인 것이 바람직하고, 상기 10-하이드록시스테아르산의 농도는 40 g/ℓ 내지 80 g/ℓ 범위에서 조정되는 것이 바람직하며, 50 g/ℓ 내지 70 g/ℓ 범위에서 조정되는 것이 더욱 바람직하다. 이외에도 감마 또는 델타-락톤류 생산을 위한 다양한 종류의 하이드록시 기질을 사용할 수 있다.In addition, the substrate is preferably 10-hydroxystearic acid, the concentration of the 10-hydroxystearic acid is preferably adjusted in the range of 40 g / l to 80 g / l, 50 g / l to 70 g / More preferably, it is adjusted in the L range. In addition, various types of hydroxy substrates for the production of gamma or delta-lactones can be used.

본 발명은 감마-도데카락톤(γ-Dodecalactone)의 생산방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 효모 월토마이세스 리포퍼(Waltomyces lipofer)의 세포내 베타-산화과정(β-Oxidation)을 이용하여 10-하이드록시스테아르산(10-Hydroxystearic acid)을 반응시켜 감마-도데카락톤을 고수율로 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing gamma-dodecaractone (γ-Dodecalactone), more specifically using the intracellular beta-oxidation process (β-Oxidation) of the yeast Waltomyces lipofer 10 It relates to a method for mass production of gamma-dodecaractone in high yield by reacting hydroxystearic acid (10-Hydroxystearic acid).

기존에 감마-락톤류를 생산하는 효모로 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 피치아 귀일리어몬디(Pichia guilliermondii), 스폴리디오볼루스 살모니컬러(Sporidiobolus salmonicolor), 료도토룰라 아우란티아카(Rhodotorula aurantiaca), 그리고 료도토룰라 글루티니스(Rhodotorula glutinis) 등이 있으나 이들 효모의 감마-락톤류 생산수율은 현저히 낮으며 감마-락톤류가 다시 하이드록시 지방산으로 되돌아가는 가역반응으로 인해 산업화시 매우 비경제적이다. 또한 기존에 발효를 통한 감마-락톤류 생산은 많은 양의 배지 소모와 시간 소요가 따르며 적용 사례에 있어서 효모의 세포막 투과성을 높이거나 발효가 아닌 세포 자체 효소반응을 통한 감마-락톤류를 생산한 사례는 현재까지 보고되지 않았다.Gamma existing - with yeast to produce lactones Yaroslavl Li Wia poly Utica (Yarrowia lipolytica), blood tooth gwiil rear Mondi (Pichia guilliermondii ), Sporidiobolus salmonicolor ), Rhodotorula aurantiaca , and Rhodotorula glutinis glutinis ), but the yield of gamma-lactones of these yeasts is remarkably low and it is very uneconomical for industrialization due to the reversible reaction of gamma-lactones back to hydroxy fatty acids. In addition, the production of gamma-lactones through fermentation requires a large amount of medium consumption and time consuming, and in the case of application, a case of increasing the cell membrane permeability of yeast or producing gamma-lactones through cell self-enzyme reaction rather than fermentation. Has not been reported to date.

본 발명에 따르면, 효모를 이용한 생산방법은 종래의 화학적인 생산방법보다 환경 친화적이고 높은 특이성을 보이는 방법이다. 또한 기존에 사용하지 않은 세포막 투과성을 향상시킨 효모를 이용해 세포 자체 효소반응을 통한 생산방법으로 식품첨가제의 원료 물질인 복숭아향의 감마-도데카락톤을 높은 수율로 대량 생산할 수 있다.According to the present invention, the production method using yeast is an environmentally friendly method showing a higher specificity than the conventional chemical production method. In addition, it is possible to mass-produce peach-flavored gamma-dodecaractone, which is a raw material of food additives, by using the yeast which has not been used previously and improves cell membrane permeability.

상술한 바와 같이, 본 발명은 효모 월토마이세스 리포퍼를 이용하여 식품첨가제의 원료 물질인 복숭아향의 감마-도데카락톤을 고수율로 대량 생산하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로 기질은 10-하이드록시스테아르산을 사용하고 효모 월토마이세스 리포퍼를 이용하여 효모 선발, 온도, pH, 질소원, 교반속도, 효모 농도, 기질 농도, 그리고 세포막 투과성 등의 반응조건을 최적화하였다. 본 발명은 종래의 화학적인 방법과 달리 환경 친화적인 생물전환을 통해 자연에 가까운 풍미의 향료를 생산하고 기존에 방식과 차별화된 기술을 사용하여 생산시간을 단축함으로써 생산효율을 극대화시켰다. 또한 기존에 낮은 효율의 생산성을 극복하고 특이적으로 감마-도데카락톤을 고수율로 대량 생산을 가능하게 하였다.As described above, the present invention relates to a method for mass production of peach-flavored gamma-dodecaractone, which is a raw material of a food additive, using a yeast waltomyces reaper. Specifically, 10-hydroxystearic acid was used as the substrate, and the yeast Woltomyceth reaper was used to optimize the reaction conditions such as yeast selection, temperature, pH, nitrogen source, stirring speed, yeast concentration, substrate concentration, and cell membrane permeability. . The present invention maximizes the production efficiency by producing a flavor of a flavor close to nature through environmentally friendly bioconversion unlike conventional chemical methods and shortening the production time by using a technology different from the conventional method. In addition, it overcomes the low-efficiency productivity and specifically enables mass production of gamma-dodecaractone in high yield.

본 발명에 따르면, 본 발명의 효모를 이용한 생산방법은 종래의 화학적인 생산방법보다 환경 친화적이고 높은 특이성을 보이는 방법이며, 또한 기존에 사용하지 않은 세포막 투과성을 향상시킨 효모를 이용해 세포 자체 효소반응을 통한 생산방법으로 식품첨가제의 원료 물질인 복숭아향의 감마-도데카락톤을 높은 수율로 대량 생산할 수 있다.According to the present invention, the production method using the yeast of the present invention is a method that is environmentally friendly and high specificity than the conventional chemical production method, and also uses the yeast improved the cell membrane permeability that has not been used previously, the cell self-enzymatic reaction Through the production method, it is possible to mass-produce peach-flavored gamma-dodecaractone, a raw material of food additives, in high yield.

도 1은 본 발명에서 생산성이 우수한 효모(Cryptococcus curvatus, Rhodosporidium toruloides, Rhodotorula glutinis, Myxozyma lipomycoides, Rhodotorula aurantiaca, Candida oleophila, Yarrowia lipolytica, Lipomyces spencermartinsiae, Candida palmioleophila, Waltomyces lipofer)를 선발하는 하기위해 10-하이드록시스테아르산을 감마-도데카락톤으로 전환하는 상대적인 생산 활성을 비교한 그래프이다.
도 2는 본 발명에서 월토마이세스 리포퍼의 질소원 반응배지 종류(A; ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium citrate, ammonium phosphate, calcium nitrate, Tris buffer, MES buffer, PIPES buffer, urea) 및 질소원 농도(B)에 따른 10-하이드록시스테아르산을 감마-도데카락톤으로 전환하는 상대적인 생산 활성을 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명에서 월토마이세스 리포퍼의 pH(A) 및 온도(B)에 따른 10-하이드록시스테아르산을 감마-도데카락톤으로 전환하는 상대적인 생산 활성을 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명에서 월토마이세스 리포퍼의 교반속도 0 rpm(◆), 100 rpm(▼), 150 rpm(▲), 200 rpm(●), 250 rpm(■)에 따른 감마-도데카락톤의 상대적인 생산 활성을 나타내는 그래프이다.
도 5는 도 6은 본 발명에서 월토마이세스 리포퍼의 세포막 투과성을 향상시키기 위한 유기용매와 계면활성제의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명에서 월토마이세스 리포퍼의 세포막 투과성을 향상시키기 위한 유기용매와 계면활성제인 ethanol(A)과 Triton X-100(B)의 농도에 따라 4℃에서 15분간 처리하여 10-하이드록시스테아르산에서 감마-도데카락톤으로 전환되는 상대적인 생산 활성을 나타내는 그래프이다.
도 7은 본 발명에서 월토마이세스 리포퍼의 세포막 투과성을 향상시키기 위해 ethanol, Triton X-100, ethanol 처리 후 Triton X-100 처리에 따른 10-하이드록시스테아르산에서 감마-도데카락톤으로 전환되는 상대적인 생산 활성을 나타내는 그래프이다.
도 8은 본 발명의 월토마이세스 리포퍼의 효모농도(A)와 기질농도(B)에 따른 감마-도데카락톤의 생산량을 그래프로 나타낸 것이고,
도 9는 본 발명의 월토마이세스 리포퍼의 효모농도 30 g/l, 10-하이드록시스테아르산 60 g/ℓ를 pH 6.5의 10 g/L 질소원이 함유된 Tris-HCl 반응배지, 교반속도 200 rpm, 35℃에서 반응시켰을 때, 감마-도데카락톤(●)의 생산량 및 10-하이드록시스테아르산(○)의 감소량을 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명에 효모 월토마이세스 리포퍼와 해당 기질(10-hydroxytetradecanoic acid, 10-hydroxyhexadecanoic acid, 10-hydroxystearic acid, ricinoleic acid, 12-hydroxystearic acid)을 반응한 후, 그 반응물을 GC/MS로 분석한 결과이다.1 is an excellent yeast ( Cryptococcus) in the present invention curvatus , Rhodosporidium toruloides , Rhodotorula glutinis , Myxozyma lipomycoides , Rhodotorula aurantiaca , Candida oleophila , Yarrowia lipolytica , Lipomyces spencermartinsiae , Candida palmioleophila , Waltomyces lipofer ) are graphs comparing the relative production activity of converting 10-hydroxystearic acid to gamma- dodecaractone .
Figure 2 is a nitrogen source reaction medium of the waltomyis reporter in the present invention (A; ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium citrate, ammonium phosphate, calcium nitrate, Tris buffer, MES buffer, PIPES buffer, urea) and nitrogen source It is a graph showing the relative production activity of converting 10-hydroxystearic acid to gamma-dodecaractone according to the concentration (B).
FIG. 3 is a graph showing the relative production activity of converting 10-hydroxystearic acid to gamma-dodecaractone according to pH (A) and temperature (B) of the waltomyces re- hopper in the present invention.
Figure 4 gamma-dodecaractone according to the stirring speed 0 rpm (◆), 100 rpm (▼), 150 rpm (▲), 200 rpm (●), 250 rpm (■) Is a graph showing the relative production activity of
FIG. 5 is a graph showing the effects of an organic solvent and a surfactant for improving cell membrane permeability of the waltomyis reporter in the present invention.
6 is treated with 15 minutes at 4 ℃ according to the concentration of the organic solvent and surfactant ethanol (A) and Triton X-100 (B) to improve the cell membrane permeability of the waltomyis reporter in the present invention 10-hydr It is a graph showing the relative production activity of the conversion of oxystearic acid to gamma-dodecaractone.
7 is converted to gamma-dodecaractone from 10-hydroxystearic acid after treatment with Triton X-100 after treatment with ethanol, Triton X-100, and ethanol in order to improve cell membrane permeability of Woltomyces reaper in the present invention. It is a graph showing the relative production activity.
8 is a graph showing the production of gamma-dodecaractone according to the yeast concentration (A) and the substrate concentration (B) of the waltomicis reporter of the present invention,
Figure 9 is a Tris-HCl reaction medium containing a yeast concentration of 30 g / l, 10-hydroxystearic acid 60 g / ℓ of 10 g / L nitrogen source of pH 6.5, agitation rate 200 When it reacts at 35 degreeC by rpm, it shows the production amount of gamma-dodecaractone ((circle)) and the decrease of 10-hydroxystearic acid ((circle)).
10 is a reaction of the yeast waltomyces reporter and the substrate (10-hydroxytetradecanoic acid, 10-hydroxyhexadecanoic acid, 10-hydroxystearic acid, ricinoleic acid, 12-hydroxystearic acid) according to the present invention, the reaction by GC / MS The result of the analysis.

이하, 비한정적인 실시 예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of non-limiting examples.

단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.

실시 예 1. 효모의 종류에 따른 생물 전환 활성 조사 및 효모 선발Example 1 Investigation of Bioconversion Activity and Selection of Yeast by Kinds of Yeast

본 발명에서는 10-하이드록시스테아르산을 감마-도데카락톤으로 전환하는 베타-산화 관여 효소의 발현을 증가된 효모 및 월토마이세스 리포퍼를 얻기 위하여 기존 균주 배지를 사용하지 않고, 유도물질로서 기질인 10-하이드록시스테아르산이 포함된 반응배지를 사용하였다. 먼저 효모 및 월토마이세스 리포퍼는 YM broth 3㎖이 들어있는 시험관에 접종하여 12 시간동안 배양한 다음, 10-하이드록시스테아르산을 감마-도데카락톤으로 전환하는 베타-산화 관여 효소의 발현배지 0.1 내지 1.0 g/ℓ 질소원이 함유된 Tris-HCl 반응배지, 0.1 내지 0.5 ml/ℓ 트윈80(tween 80) 및 0.1 내지 1.0 g/ℓ 10-하이드록시스테아르산 500㎖이 들어있는 2ℓ 베플드 플라스크(baffled flask)에 접종하여 본 배양을 실시하였다. 이 때 상기 배양 과정 중에서 교반 속도는 200 rpm, 배양 온도는 35℃로 유지되도록 조정하였고 48시간 동안 배양하여 효소의 발현을 유도하였다. 또한 상기 배양액을 10,000×g로 4 ℃에서 20분 동안 원심분리 한 다음, 50 mM Tris-HCl 반응배지(pH 6.5)으로 두 번 세척한 후 기질인 10-하이드록시스테아르산과 반응하여 동일 비율의 에틸아세테이트(Ethyl acetate)로 반응을 정지 및 추출이 이루어졌다.In the present invention, the substrate is used as an inducer without using a conventional strain medium in order to obtain increased yeast and waltomyis reporters by increasing the expression of beta-oxidation enzymes that convert 10-hydroxystearic acid to gamma-dodecaractone. A reaction medium containing phosphorus 10-hydroxystearic acid was used. First, yeast and Wolto Myces reporter was inoculated in a test tube containing 3 ml of YM broth and incubated for 12 hours, and then the expression medium of beta-oxidation involved enzyme converting 10-hydroxystearic acid to gamma-dodecaractone. 2 l beppled flask containing Tris-HCl reaction medium containing 0.1 to 1.0 g / l nitrogen source, 0.1 to 0.5 ml / l tween 80 and 500 ml of 0.1 to 1.0 g / l 10-hydroxystearic acid The incubation was carried out by inoculation into a baffled flask. At this time, the stirring rate of the culture process was adjusted to 200 rpm, the culture temperature was maintained at 35 ℃ and cultured for 48 hours to induce the expression of the enzyme. In addition, the culture solution was centrifuged at 10,000 × g for 20 minutes at 4 ° C., washed twice with 50 mM Tris-HCl reaction medium (pH 6.5), and then reacted with 10-hydroxystearic acid as a substrate to obtain the same ratio of ethyl. The reaction was stopped and extracted with ethyl acetate.

본 발명에서는 10-하이드록시스테아르산을 감마-도데카락톤으로 전환하는 베타-산화 관여 효소의 활성이 높은 효모를 선별하기위해 해당 효모(Cryptococcus curvatus, Rhodosporidium toruloides, Rhodotorula glutinis, Myxozyma lipomycoides, Rhodotorula aurantiaca, Candida oleophila, Yarrowia lipolytica, Lipomyces spencermartinsiae, Candida palmioleophila, Waltomyces lipofer)와 기질을 반응하였으며 상대적인 생산 활성을 비교해본 결과는 도 1에 나타내었고 월토마이세스 리포퍼가 가장 높은 생산성을 보여 감마-도데카락톤 생산 균주로 선정하였다.In the present invention, to select yeast with high activity of the beta-oxidation related enzyme converting 10-hydroxystearic acid to gamma- dodecaractone ( Cryptococcus curvatus , Rhodosporidium toruloides , Rhodotorula glutinis , Myxozyma lipomycoides , Rhodotorula aurantiaca , Candida oleophila , Yarrowia lipolytica , Lipomyces spencermartinsiae , Candida palmioleophila , Waltomyces lipofer ) and the substrate were compared and the results of comparing the relative production activity is shown in Figure 1 and the waltomyos reperper was selected as the gamma-dode caractone producing strain showing the highest productivity.

본 발명에 모든 효모 균주는 대한민국 대전시 유성구 소재 생물자원센터(http://kctc.kribb.re.kr/)에서 구매하였으며, 이들에 대한 상세정보는 다음과 같다;Cryptococcus curvatus(KCTC 17162), Rhodosporidium toruloides(KCTC 7130), Rhodotorula glutinis(KCTC 27048), Myxozyma lipomycoides(KCTC 7899), Rhodotorula aurantiaca(KCTC 7776), Candida oleophila(KCTC 7652), Yarrowia lipolytica(KCTC 17777), Lipomyces spencermartinsiae(KCTC 17184), Candida palmioleophila(KCTC 17452) 및 Waltomyces lipofer(KCTC 17857)이다.
All yeast strains in the present invention was purchased from the biological resource center (http://kctc.kribb.re.kr/), Yuseong-gu, Daejeon, Korea. Cryptococcus curvatus (KCTC 17162 ), Rhodosporidium toruloides (KCTC 7130), Rhodotorula glutinis (KCTC 27048), Myxozyma lipomycoides (KCTC 7899), Rhodotorula aurantiaca (KCTC 7776), Candida oleophila (KCTC 7652), Yarrowia lipolytica (KCTC 17777), Lipomyces spencermartinsiae (KCTC 17184), Candida palmioleophila (KCTC 17452), and Waltomyces lipofer (KCTC 17857).

실시 예 2. 효모 월토마이세스 리포퍼의 질소원 종류 및 Tris-HCl 농도에 따른 생물 전환 활성 조사Example 2 Investigation of Bioconversion Activity According to Nitrogen Source Type and Tris-HCl Concentration of Yeast Woltomyces Reaper

본 발명은 효모 월토마이세스 리포퍼의 10-하이드록시스테아르산으로부터 감마-도데카락톤을 생산하는 효소의 활성을 조사하기 위하여, 상기 실시 예 1과 동일한 과정으로 월토마이세스 리포퍼를 배양하였다.In the present invention, to investigate the activity of the enzyme producing gamma-dodecaractone from 10-hydroxystearic acid of the yeast waltomyces reporter, the waltomyces reporter was cultured in the same manner as in Example 1.

질소원 반응배지 종류에 따른 효과를 조사하기 위하여 반응은 distilled water를 포함하여 질소원 각 0.5 g/ℓ의 ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium citrate, ammonium phosphate, calcium nitrate, Tris, MES, PIPES, 그리고 urea를 1 g/ℓ 10-하이드록시스테아르산과 1 g/ℓ 효모를 함유한 반응배지와 함께 pH 6.5 조건에서 각각 5시간 동안 반응시켰으며 동일 비율의 에틸아세테이트(Ethyl acetate)로 반응을 정지 및 추출이 이루어졌다. 이후 감마-도데카락톤의 생산량을 측정하여 그 상대적인 결과를 도 2(A)에 나타내었고 질소원 반응 배지로 Tris가 가장 최적임을 확인하였다.To investigate the effects of nitrogen source reaction medium, the reaction was performed with ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium citrate, ammonium phosphate, calcium nitrate, Tris, MES, PIPES and urea was reacted with a reaction medium containing 1 g / l 10-hydroxystearic acid and 1 g / l yeast at pH 6.5 for 5 hours, respectively, and the reaction was stopped and extracted with the same ratio of ethyl acetate. This was done. Since the production of gamma-dodecaractone was measured, the relative results are shown in FIG.

Tris의 질소원 농도별 효과를 조사하기 위하여 0 g/ℓ에서 20 g/ℓ까지 범위에서 1 g/ℓ 10-하이드록시스테아르산과 1 g/ℓ 효모를 함유한 반응배지를 pH 6.5 조건에서 각각 5시간 동안 반응시켰으며 동일 비율의 에틸아세테이트(Ethyl acetate)로 반응을 정지 및 추출이 이루어졌다. 반응을 종료 한 후 감마-도데카락톤의 생산량을 측정하여 상대적인 결과를 도 2(B)에 나타냈고 10 g/ℓ 질소원이 함유된 Tris-HCl이 가장 최적임을 확인하였다.In order to investigate the effect of Tris nitrogen source concentration, the reaction medium containing 1 g / l 10-hydroxystearic acid and 1 g / l yeast in the range of 0 g / l to 20 g / l for 5 hours each at pH 6.5 The reaction was stopped and extracted with ethyl acetate (Ethyl acetate) in the same ratio. After completion of the reaction, the production of gamma-dodecaractone was measured, and the relative results are shown in FIG. 2 (B), and it was confirmed that Tris-HCl containing 10 g / L nitrogen source was the most optimal.

도 2는 본 발명의 효모 월토마이세스 리포퍼에서 질소원 반응배지의 종류와 Tris 질소원 농도에 따른 감마-도데카락톤의 생산량을 분석하여 상대적인 활성을 나타낸 것이다. 도 2(A)는 질소원 반응배지의 종류에 따른 상대적인 활성을 나타낸 것이고, 도 2(B)는 Tris 질소원 농도에 따른 활성을 나타낸 것이다. 그 결과, 감마-도데카락톤이 생산되는 최적 질소원 반응배지는 Tris이며 최적 Tris 질소원의 농도는 10 g/ℓ인 것으로 확인되었다.
Figure 2 shows the relative activity by analyzing the production of gamma-dodecaractone according to the type of nitrogen source reaction medium and Tris nitrogen source concentration in the yeast Wolto Myis reaper of the present invention. Figure 2 (A) shows the relative activity according to the type of nitrogen source reaction medium, Figure 2 (B) shows the activity according to the Tris nitrogen source concentration. As a result, it was confirmed that the optimum nitrogen source reaction medium for producing gamma-dodecaractone was Tris and the concentration of the optimum Tris nitrogen source was 10 g / l.

실시 예 3. 효모 Example 3 Yeast 월토마이세스Wolto Myth 리포퍼의Reporter pHpH 및 온도 변화에 따른 생물 전환 활성 조사 Of bioconversion activity with temperature and temperature

본 발명은 효모 월토마이세스 리포퍼의 10-하이드록시스테아르산으로부터 감마-도데카락톤을 생산하는 효소의 활성을 조사하기 위하여, 상기 실시 예 1과 동일한 과정으로 월토마이세스 리포퍼를 배양하였다.In the present invention, to investigate the activity of the enzyme producing gamma-dodecaractone from 10-hydroxystearic acid of the yeast waltomyces reporter, the waltomyces reporter was cultured in the same manner as in Example 1.

본 발명에서는 효모 월토마이세스 리포퍼의 생물전환반응에서 pH 및 온도 변화에 따라 10-하이드록시스테아르산이 감마-도데카락톤으로 전환되는 최적 활성을 조사하기 위하여, 다양한 pH 및 온도 조건에서 효모와 기질을 반응시키고 상대적인 활성을 비교하였다.In the present invention, in order to investigate the optimal activity of converting 10-hydroxystearic acid to gamma-dodecaractone according to pH and temperature change in the bioconversion reaction of the yeast Wolto Myis reaper, yeast and substrate at various pH and temperature conditions Was reacted and the relative activity was compared.

먼저 pH의 효과를 조사하기 위하여 1 g/ℓ 10-하이드록시스테아르산과 1 g/ℓ 효모, 그리고 10 g/ℓ 질소원이 함유된 Tris 반응배지 조건에서 각각 5시간 동안 반응시켰으며 동일 비율의 에틸아세테이트(Ethyl acetate)로 반응을 정지 및 추출이 이루어졌다. 상기의 반응양은 10 ㎖로 100㎖의 베플드 플라스크에서 35℃, 200 rpm으로 이루어졌고 생산된 감마-도데카락톤의 양을 측정하여 그 생산량을 바탕으로 상대적인 활성을 알아본 결과를 도 3(A)에 나타내었고 pH 6.5에서 최적을 보였다.First, to investigate the effect of pH, 1 g / l 10-hydroxystearic acid, 1 g / l yeast, and 10 g / l nitrogen source were reacted for 5 hours under Tris reaction medium. The reaction was stopped and extracted with (Ethyl acetate). The reaction amount was 10 ml to 100 ml of a beppled flask at 35 ° C. and 200 rpm. The amount of gamma-dodecaractone produced was measured to determine the relative activity based on the yield. ) And optimal at pH 6.5.

온도의 효과를 조사하기 위하여 반응은 온도 25℃에서 45℃까지 범위에서 1 g/ℓ 10-하이드록시스테아르산과 1 g/ℓ 효모, 그리고 10 g/ℓ 질소원이 함유된 Tris 반응배지(pH 6.5) 조건에서 각각 5시간 동안 반응시켰으며 동일 비율의 에틸아세테이트(Ethyl acetate)로 반응을 정지 및 추출이 이루어졌다. 상기의 반응양은 10 ㎖로 100㎖의 베플드 플라스크에서 35℃, 200 rpm으로 이루어졌고 감마-도데카락톤의 생산량을 측정하여 그 상대적인 결과를 도 3(B)에 나타내었으며 최적 온도는 35℃를 보여주었다.In order to investigate the effect of temperature, the reaction was carried out in the range from 25 ° C to 45 ° C with Tris reaction medium containing 1 g / l 10-hydroxystearic acid, 1 g / l yeast and 10 g / l nitrogen source (pH 6.5). The reaction was carried out for 5 hours under the conditions, and the reaction was stopped and extracted with the same ratio of ethyl acetate. The reaction amount was 10 ml and was made at a temperature of 35 ° C. and 200 rpm in a 100 ml beveled flask, and the production of gamma-dodecaractone was measured. The relative results are shown in FIG. 3 (B), and the optimum temperature was 35 ° C. Showed.

도 3은 본 발명의 효모 월토마이세스 리포퍼가에서 pH(A) 및 온도(B)에 따른 감마-도데카락톤의 생산량을 분석하여 상대적인 활성을 나타낸 것이다. 그 결과, 감마-도데카락톤이 생산되는 최적 pH 및 온도는 각각 pH 6.5 및 35 ℃인 것으로 확인되었다.
Figure 3 shows the relative activity by analyzing the production of gamma-dodecaractone according to pH (A) and temperature (B) in the yeast Woltomyces reaper of the present invention. As a result, the optimum pH and temperature at which gamma-dodecaractone is produced were found to be pH 6.5 and 35 ° C, respectively.

실시 예 4. 효모 Example 4 Yeast 월토마이세스Wolto Myth 리포퍼의Reporter 교반속도Stirring speed 변화에 생물 전환 활성 조사 Investigating Biotransformation Activity in Change

본 발명은 효모 월토마이세스 리포퍼의 10-하이드록시스테아르산으로부터 감마-도데카락톤을 생산하는 효소의 활성을 조사하기 위하여, 상기 실시 예 1과 동일한 과정으로 월토마이세스 리포퍼를 배양하였다.In the present invention, to investigate the activity of the enzyme producing gamma-dodecaractone from 10-hydroxystearic acid of the yeast waltomyces reporter, the waltomyces reporter was cultured in the same manner as in Example 1.

본 발명에서는 효모 월토마이세스 리포퍼의 생물전환반응에서 교반속도 변화에 따라 10-하이드록시스테아르산이 감마-도데카락톤으로 전환되는 최적 활성을 조사하기 위하여, 다양한 rpm 조건에서 효모와 기질을 반응시키고 상대적인 활성을 비교하였다.In the present invention, in order to investigate the optimal activity of converting 10-hydroxystearic acid to gamma-dodecaractone according to the stirring speed change in the bioconversion reaction of yeast Wolto Myis reaper, and reacting the yeast and substrate at various rpm conditions Relative activity was compared.

교반속도의 효과를 조사하기 위하여 반응은 0 rpm에서 250 rpm까지 범위에서 1 g/ℓ 10-하이드록시스테아르산과 1 g/ℓ 효모, 그리고 10 g/ℓ 질소원이 함유된 Tris 반응배지(pH 6.5) 조건에서 각각 5시간 동안 반응시켰으며 동일 비율의 에틸아세테이트(Ethyl acetate)로 반응을 정지 및 추출이 이루어졌다. 상기의 반응양은 10 ㎖로 100㎖의 베플드 플라스크에서 35℃로 이루어졌고 감마-도데카락톤의 생산량을 측정하여 그 상대적인 결과를 도 4에 나타내었으며 최적 교반속도는 200 rpm을 보여주었다.In order to investigate the effect of the stirring speed, the reaction was carried out in the range of 0 rpm to 250 rpm in which Tris reaction medium containing 1 g / l 10-hydroxystearic acid, 1 g / l yeast and 10 g / l nitrogen source (pH 6.5) The reaction was carried out for 5 hours under the conditions, and the reaction was stopped and extracted with the same ratio of ethyl acetate. The reaction was carried out at 35 ℃ in a 100 ml beppled flask with 10 ml and the production of gamma-dodecaractone was measured. The relative results are shown in FIG. 4 and the optimum stirring speed was 200 rpm.

도 4는 본 발명의 효모 월토마이세스 리포퍼에서 교반속도에 따른 감마-도데카락톤의 생산량을 분석하여 상대적인 활성을 나타낸 것이다. 도 4는 본 발명에서 월토마이세스 리포퍼의 교반속도 0 rpm(◆), 100 rpm(▼), 150 rpm(▲), 200 rpm(●), 250 rpm(■)에 따른 감마-도데카락톤의 상대적인 활성을 나타내었다. 그 결과, 감마-도데카락톤이 생산되는 최적 교반속도는 200 rpm인 것으로 확인되었다.
Figure 4 shows the relative activity by analyzing the production of gamma-dodecaractone according to the stirring speed in the yeast waltomyces reporter of the present invention. Figure 4 gamma-dodecaractone according to the stirring speed 0 rpm (◆), 100 rpm (▼), 150 rpm (▲), 200 rpm (●), 250 rpm (■) Relative activity was shown. As a result, it was confirmed that the optimum stirring speed at which gamma-dodecaractone was produced was 200 rpm.

실시 예 5. 효모 Example 5 Yeast 월토마이세스Wolto Myth 리포퍼의Reporter 세포막 투과성 향상을 위한 유기용매 및 계면활성제의 농도 변화에 생물 전환 활성 조사 Investigation of Bioconversion Activity in Concentration of Organic Solvents and Surfactants for Improving Cell Membrane Permeability

본 발명은 효모 월토마이세스 리포퍼의 10-하이드록시스테아르산으로부터 감마-도데카락톤을 생산하는 효소의 활성을 조사하기 위하여, 상기 실시 예 1과 동일한 과정으로 월토마이세스 리포퍼를 배양하였다.In the present invention, to investigate the activity of the enzyme producing gamma-dodecaractone from 10-hydroxystearic acid of the yeast waltomyces reporter, the waltomyces reporter was cultured in the same manner as in Example 1.

효모 월토마이세스 리포퍼의 세포막 투과성을 향상시키기 위해 각 50% 유기용매(ethanol, methanol, toluene) 및 0.5% 계면활성제(SDS, Triton X-100, Tween 80)로 4℃에서 15분간 처리하여 그 효과를 조사하기위해 1 g/ℓ 10-하이드록시스테아르산과 1 g/ℓ 효모, 10 g/ℓ 질소원이 함유된 Tris-HCl(pH 6.5) 조건에서 각각 5시간 동안 반응시켰으며 동일 비율의 에틸아세테이트(Ethyl acetate)로 반응을 정지 및 추출이 이루어졌다. 반응을 종료 한 후 각 유기용매 및 계면활성제로 처리한 효모의 감마-도데카락톤의 생산량을 측정하여 상대적인 결과를 도 5에 나타내었으며 50% ethanol, methanol, toluene으로 처리한 효모는 도 5a에 나타내고 0.5% SDS, Triton X-100, Tween 80으로 처리한 효모는 도 5b에 나타내었다. 유기용매 처리에 따른 상대적인 활성은 ethanol에서 가장 높았고 계면활성제 처리에 따른 상대적인 활성은 Triton X-100에서 가장 높았다.In order to improve the cell membrane permeability of yeast Woltomyces reaper, treatment with 50% organic solvent (ethanol, methanol, toluene) and 0.5% surfactant (SDS, Triton X-100, Tween 80) for 15 minutes at 4 ℃ To investigate the effect, 1 g / l 10-hydroxystearic acid, 1 g / l yeast, and 10 g / l nitrogen source in Tris-HCl (pH 6.5) were reacted for 5 hours, respectively. The reaction was stopped and extracted with (Ethyl acetate). After completion of the reaction, the yield of gamma-dodecaractone of yeast treated with each organic solvent and surfactant was measured, and the relative results are shown in FIG. 5, and the yeast treated with 50% ethanol, methanol, and toluene is shown in FIG. 5A. Yeast treated with 0.5% SDS, Triton X-100, Tween 80 is shown in Figure 5b. The relative activity of organic solvent treatment was the highest in ethanol and the activity of surfactant treatment was highest in Triton X-100.

다음으로, 효모 월토마이세스 리포퍼의 세포막 투과성을 향상시키기 위한 유기용매 및 계면활성제로 선정된 ethanol(도 6 A)과 Triton X-100(도 6 B)을 농도별로 4℃에서 15분간 처리하여 그 효과를 조사하기위해, ethanol은 0%에서 90%까지 범위, Triton X-100은 0%에서 1.0%까지 범위에서 1 g/ℓ 10-하이드록시스테아르산과 1 g/ℓ 효모, 10 g/ℓ 질소원이 함유된 Tris-HCl(pH 6.5) 조건에서 각각 5시간 동안 반응시켰으며 동일 비율의 에틸아세테이트(Ethyl acetate)로 반응을 정지 및 추출이 이루어졌다. 반응을 종료 한 후 ethanol을 처리한 효모의 감마-도데카락톤의 생산량을 측정하여 상대적인 결과를 도 6(A)에 나타내었으며 Triton X-100으로 처리한 효모는 도 6(B)에 나타내었다. Ethanol을 처리한 효모는 50%가 가장 최적이었고 Triton X-100으로 처리한 효모는 0.5%가 최적임을 확인하였다.Next, ethanol (FIG. 6 A) and Triton X-100 (FIG. 6 B) selected as organic solvents and surfactants for improving cell membrane permeability of yeast Wolto Myis repertoire were treated for 15 minutes at 4 ° C by concentration. To investigate the effect, ethanol ranges from 0% to 90% and Triton X-100 ranges from 0% to 1.0% with 1 g / l 10-hydroxystearic acid and 1 g / l yeast, 10 g / l The reaction was carried out for 5 hours in Tris-HCl (pH 6.5) containing nitrogen source, and the reaction was stopped and extracted with the same ratio of ethyl acetate. After completion of the reaction, the production of gamma-dodecaractone in yeast treated with ethanol was measured and the relative results are shown in FIG. 6 (A), and the yeast treated with Triton X-100 is shown in FIG. 6 (B). 50% of yeast treated with ethanol was optimal, and 0.5% of yeast treated with Triton X-100 was optimal.

도 6은 본 발명의 효모 월토마이세스 리포퍼의 세포막 투과성을 향상시키기 위한 유기용매 및 계면활성제로 선정된 ethanol과 Triton X-100의 농도에 따른 감마-도데카락톤의 생산량을 분석하여 상대적인 활성을 나타낸 것이다. 도 6(A)는 ethanol 처리의 농도에 따른 상대적인 활성을 나타낸 것이고, 도 6(B)는 Triton X-100의 농도에 따른 상대적인 활성을 나타낸 것이다. 그 결과, 감마-도데카락톤이 생산되는 최적 농도는 각각 50% ethanol과 0.5% Triton X-100인 것으로 확인되었다.
Figure 6 shows the relative activity by analyzing the production of gamma-dodecaractone according to the concentration of ethanol and Triton X-100 selected as an organic solvent and a surfactant for improving the cell membrane permeability of the yeast Wolto Myis reporter of the present invention It is shown. Figure 6 (A) shows the relative activity according to the concentration of ethanol treatment, Figure 6 (B) shows the relative activity according to the concentration of Triton X-100. As a result, the optimum concentration of gamma-dodecaractone produced was found to be 50% ethanol and 0.5% Triton X-100, respectively.

실시 예 6. 효모 Example 6 Yeast 월토마이세스Wolto Myth 리포퍼의Reporter 세포막 투과성 변화에 생물 전환 활성 조사 Investigating Biotransformation Activity in Cell Membrane Permeability Changes

본 발명은 효모 월토마이세스 리포퍼의 10-하이드록시스테아르산으로부터 감마-도데카락톤을 생산하는 효소의 활성을 조사하기 위하여, 상기 실시 예 1과 동일한 과정으로 월토마이세스 리포퍼를 배양하였다.In the present invention, to investigate the activity of the enzyme producing gamma-dodecaractone from 10-hydroxystearic acid of the yeast waltomyces reporter, the waltomyces reporter was cultured in the same manner as in Example 1.

본 발명은 효모 월토마이세스 리포퍼의 세포막 투과성을 향상시키기 위한 유기용매, 계면활성제, 유기용매 처리 후 계면활성제로 4℃에서 15분간 처리한 효과를 조사하기위해서 처리하지 않은 효모, 50% ethanol, 0.5% Triton X-100, 50% ethanol 처리 후 0.5% Triton X-100을 1 g/ℓ 10-하이드록시스테아르산과 1 g/ℓ 효모, 10 g/ℓ 질소원이 함유된 Tris-HCl(pH 6.5) 조건에서 각각 5시간 동안 반응시켰으며 동일 비율의 에틸아세테이트(Ethyl acetate)로 반응을 정지 및 추출이 이루어졌다. 반응을 종료 한 후 각 시료의 감마-도데카락톤의 생산량을 측정하여 상대적인 결과를 도 7에 나타내었다. 그 결과 50% ethanol을 처리 후 다시 0.5% Triton X-100로 처리한 효모가 높은 감마-도데카락톤의 상대적인 활성을 보였다.The present invention is an untreated yeast, 50% ethanol, to investigate the effects of treatment with organic solvent, surfactant, organic solvent for 15 minutes at 4 ° C. after treatment with organic solvent to improve cell membrane permeability of yeast Wolto Myis reporter 0.5% Triton X-100, 0.5% Triton X-100 after 50% ethanol treatment with 1 g / l 10-hydroxystearic acid, 1 g / l yeast, 10 g / l nitrogen source, Tris-HCl (pH 6.5) The reaction was carried out for 5 hours under the conditions, and the reaction was stopped and extracted with the same ratio of ethyl acetate. After completion of the reaction, the production of gamma-dodecaractone in each sample was measured, and the relative results are shown in FIG. 7. As a result, the yeast treated with 50% ethanol and then treated with 0.5% Triton X-100 showed high activity of gamma-dodecaractone.

도 7은 본 발명에서 효모 월토마이세스 리포퍼의 세포막 투과성을 향상시키기 위해 처리하지 않은 효모, 유기용매 처리, 계면활성제 처리, 유기용매로 처리 후 계면활성제 처리한 효모의 감마-도데카락톤의 생산량을 분석하여 상대적인 활성을 나타낸 것이다. 그 결과, 감마-도데카락톤의 생산성이 높은 처리 방법은 50% ethanol로 처리한 후 0.5% Triton X-100로 다시 처리한 효모인 것으로 확인되었다.
Figure 7 shows the production of gamma-dodecaractone in yeast treated with an untreated yeast, an organic solvent treatment, a surfactant treatment, and a surfactant treatment after the treatment with an organic solvent in order to improve the cell membrane permeability of the yeast waltomyces reporter in the present invention Analysis shows the relative activity. As a result, it was confirmed that the high productivity treatment method of gamma-dodecaractone was yeast treated with 50% ethanol and then again treated with 0.5% Triton X-100.

실시 예 7. 효모 Example 7. Yeast 월토마이세스Wolto Myth 리포퍼의Reporter 농도 및 10- Concentration and 10- 하이드록시스테아르산의Of hydroxystearic acid 농도 변화에 생물 전환 활성 조사 Investigating Biotransformation Activity in Concentration Changes

본 발명은 효모 월토마이세스 리포퍼의 10-하이드록시스테아르산으로부터 감마-도데카락톤을 생산하는 효소의 활성을 조사하기 위하여, 상기 실시 예 1과 동일한 과정으로 월토마이세스 리포퍼를 배양하였다.In the present invention, to investigate the activity of the enzyme producing gamma-dodecaractone from 10-hydroxystearic acid of the yeast waltomyces reporter, the waltomyces reporter was cultured in the same manner as in Example 1.

본 발명은 효모 월토마이세스 리포퍼의 효모농도 및 기질농도에 따른 10-하이드록시스테아르산으로부터 감마-도데카락톤으로 전한되는 생산량을 조사하기 위하여, 각 효모농도 및 기질농도에서 효모와 기질을 반응하여 감마-도데카락톤의 생산량을 비교하였다.The present invention reacts the yeast and the substrate at each yeast concentration and substrate concentration to investigate the yield transferred from the 10-hydroxystearic acid to gamma-dodecaractone according to the yeast and substrate concentrations of the yeast Woltomicis reaper. To compare the production of gamma-dodecaractone.

먼저 월토마이세스 리포퍼의 효모농도에 따른 효과를 조사하기 위하여 50 g/ℓ 10-하이드록시스테아르산과 10 g/ℓ 질소원이 함유된 Tris (pH 6.5)반응배지 조건에서 각각 10시간 동안 반응시켰으며 동일 비율의 에틸아세테이트(Ethyl acetate)로 반응을 정지 및 추출이 이루어졌다. 상기의 반응양은 10 ㎖로 100㎖의 베플드 플라스크에서 35℃, 200 rpm으로 이루어졌고 감마-도데카락톤의 생산량을 측정하여 그 결과를 도 8(A)에 나타내었고 30 g/ℓ의 효모 농도에서 최대전환을 보였다.First, to investigate the effect of the yeast concentration of Woltomicis Reaper was reacted for 10 hours in Tris (pH 6.5) reaction medium containing 50 g / l 10-hydroxystearic acid and 10 g / l nitrogen source The reaction was stopped and extracted with the same ratio of ethyl acetate. The reaction amount was 10 ml to 100 ml of a beppled flask at 35 ° C. and 200 rpm. The yield of gamma-dodecaractone was measured and the results are shown in FIG. 8 (A). Showed maximum conversion.

먼저 효모 월토마이세스 리포퍼의 기질농도에 따른 효과를 조사하기 위하여 30 g/ℓ 효모와 10 g/ℓ 질소원이 함유된 Tris (pH 6.5)반응배지 조건에서 각각 10시간 동안 반응시켰으며 동일 비율의 에틸아세테이트(Ethyl acetate)로 반응을 정지 및 추출이 이루어졌다. 상기의 반응양은 10 ㎖로 100㎖의 베플드 플라스크에서 35℃, 200 rpm으로 이루어졌고 감마-도데카락톤의 생산량을 측정하여 그 결과를 도 8(B)에 나타내었고 60 g/ℓ의 효모 농도에서 최대전환을 보였다.First, in order to investigate the effect of yeast Wolto Myces reporter according to the substrate concentration, it was reacted for 10 hours under Tris (pH 6.5) reaction medium containing 30 g / l yeast and 10 g / l nitrogen source, The reaction was stopped and extracted with ethyl acetate. The reaction amount was 10 ml, 100 ml of a beppled flask at 35 ° C. and 200 rpm. The production of gamma-dodecaractone was measured and the results are shown in FIG. 8 (B). The yeast concentration of 60 g / L was measured. Showed maximum conversion.

도 8은 본 발명의 효모 월토마이세스 리포퍼에서 효모농도와 기질농도에 따른 감마-도데카락톤의 생산량을 분석하여 나타낸 것이다. 도 8(A)는 효모농도에 따른 생산량을 나타낸 것이고, 도 8(B)는 기질농도에 따른 생산량을 나타낸 것이다. 그 결과, 감마-도데카락톤이 생산되는 최적 효모농도는 30 g/ℓ이며 최적 기질농도는 60 g/ℓ인 것으로 확인되었다.
Figure 8 shows the analysis of the production of gamma-dodecaractone according to the yeast concentration and substrate concentration in the yeast Woltomyces reporter of the present invention. 8 (A) shows the yield according to the yeast concentration, and FIG. 8 (B) shows the yield according to the substrate concentration. As a result, it was confirmed that the optimum yeast concentration for producing gamma-dodecaractone was 30 g / l and the optimum substrate concentration was 60 g / l.

실시 예 8. 효모 Example 8 Yeast 월토마이세스Wolto Myth 리포퍼를Refurbish 이용한 감마- Gamma using 도데카락톤의Dodekaractone 생산 조사 Production survey

본 발명은 효모 월토마이세스 리포퍼의 10-하이드록시스테아르산으로부터 감마-도데카락톤을 생산하는 효소의 활성을 조사하기 위하여, 상기 실시 예 1과 동일한 과정으로 월토마이세스 리포퍼를 배양하였다.In the present invention, to investigate the activity of the enzyme producing gamma-dodecaractone from 10-hydroxystearic acid of the yeast waltomyces reporter, the waltomyces reporter was cultured in the same manner as in Example 1.

생물전환 반응은 60 g/ℓ 10-하이드록시스테아르산, 30 g/ℓ의 효모 및 0.5 ㎖/ℓ 트윈80이 함유된 10 g/ℓ Tris-HCl (pH 6.5) 반응배지조건에서 30시간까지 반응을 진행하였다. 이 때 반응 온도는 35℃, 교반속도는 200 rpm으로 반응하였다. 시간에 따라 베플드 플라스크에서 1 ㎖씩을 회수하여 동일 비율의 에틸아세테이트(Ethyl acetate)로 반응을 정지 및 추출이 이루어졌다. 반응을 종료시킨 다음 10-히드록시스테아르산의 감소량과 감마-도데카락톤의 생산량을 측정하여 그 결과를 도 9에 나타내었다.The bioconversion reaction was carried out for up to 30 hours at 10 g / l Tris-HCl (pH 6.5) reaction medium containing 60 g / l 10-hydroxystearic acid, 30 g / l yeast and 0.5 ml / l Tween80. Proceeded. At this time, the reaction temperature was 35 ℃, the stirring speed was reacted at 200 rpm. 1 mL of the flask was recovered from the flask with time, and the reaction was stopped and extracted with ethyl acetate (Ethyl acetate) in the same ratio. After the reaction was completed, the amount of reduced 10-hydroxystearic acid and the amount of gamma-dodecaractone were measured, and the results are shown in FIG. 9.

도 9는 본 발명에 효모 월토마이세스 리포퍼를 30 g/ℓ 효모량, 60 g/ℓ 10-하이드록시스테아르산을 반응시켜 배양할 때, 10-하이드록시스테아르산(○)의 감소량 및 그에 따른 감마-도데카락톤(●)의 생산량을 나타낸 것이다.Figure 9 shows the reduced amount of 10-hydroxystearic acid (○) when culturing the yeast Woltomyces reporter in accordance with the present invention 30 g / l yeast amount, 60 g / l 10-hydroxystearic acid This shows the production of gamma-dodekaractone (●).

그 결과 , 도 9에 나타난 것과 같이, 10-히드록시스테아르산과 효모 월토마이세스 리포퍼를 반응시킨 후 20시간이 경과하였을 때, 감마-도데카락톤이 약 46 g/ℓ의 생산을 보이고 1.5 g/ℓ/h의 생산성을 나타내고 수율은 76%였다. 현재까지 감마-데카락톤에서 가장 높은 생산성을 보인 효모는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica HR145)로 각각 11 g/ℓ와 0.2 g/ℓ/h(Rabenhorst J. 2000. Process for the production of γ-decalactone. Int Patent WO0024920)이며 감마-도데카락톤에서 역시 가장 높은 생산성을 보인 효모는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)로 3.5 g/ℓ(Farbood M. I. 1994. Fermerntation process for preparing 10-hydroxy-C18-carboxylic acid and γ-dodecalactone derivatives. Eur Patent EP0578388)이다. 본 실험의 효모 월토마이세스 리포퍼는 야로위아 리폴리티카의 감마-도데카락톤 생산과 비교하였을 때, 생산농도를 13배 향상시켰으며 감마-데카락톤과 비교하였을 때, 생산농도는 3배, 생산성은 7.5배가 높은 결과를 얻었다. 또한 지금까지 76% 감마-락톤류의 생산수율을 나타낸 것은 본 특허의 효모 월토마이세스 리포퍼가 처음이다.As a result, as shown in FIG. 9, 20 hours after the reaction of 10-hydroxystearic acid and the yeast Woltomicase reporter, gamma-dodecaractone produced about 46 g / l and 1.5 g The productivity was / l / h and the yield was 76%. The highest productivity yeasts in gamma-dekaralactone to date are Yarrowia lipolytica HR145, 11 g / l and 0.2 g / l / h (Rabenhorst J. 2000. Process for the production of γ- decalactone.Int Patent WO0024920) and the highest productivity yeast in gamma-dodecaractone is Yarrowia lipolytica , 3.5 g / l (Farbood MI 1994. Fermerntation process for preparing 10-hydroxy-C18-). carboxylic acid and γ- dodecalactone derivatives.Eur Patent EP0578388). The yeast Woltomyces re-hopper in this experiment improved the production concentration by 13 times when compared to the gamma-dodecaractone production of Yarrowia lipolitica, and the production concentration was 3 times when compared with gamma-decaractone. The productivity was 7.5 times higher. It is also the first yeast Woltomyces reporter of the present patent that has produced a yield of 76% gamma-lactones.

따라서 본 발명의 생촉매를 통한 감마-도데카락톤의 생산 방법은 그 수율이 매우 우수한 방법임을 알 수 있다.Therefore, it can be seen that the production method of gamma-dodecaractone through the biocatalyst of the present invention is a very excellent method.

실시 예 9. 효모 Example 9 Yeast 월토마이세스Wolto Myth 리포퍼를Refurbish 이용한 다른 기질 사용에 따른 생산 Production from other substrates used

효모 월토마이세스 리포퍼의 10-하이드록시스테아르산으로부터 감마-도데카락톤을 생산하는 효소의 활성을 조사하기 위하여, 상기 실시 예 1과 동일한 과정으로 월토마이세스 리포퍼를 배양하였다.In order to investigate the activity of the enzyme producing gamma-dodecaractone from 10-hydroxystearic acid of the yeast Wolto Myces reporter, Wolto Myces reporter was incubated in the same manner as in Example 1.

본 발명에서는 효모 월토마이세스 리포퍼의 다양한 기질에 대한 그 효과를 조사하기위해 진행하였으며, 생물전환 반응은 각 60 g/ℓ 10-hydroxytetradecanoic acid, 10-hydroxyhexadecanoic acid, 10-hydroxystearic acid, ricinoleic acid, 12-hydroxystearic acid를 기질로 사용하였고, 30 g/ℓ의 효모 및 0.5 ㎖/ℓ 트윈80이 함유된 10 g/ℓ Tris-HCl (pH 6.5) 반응배지조건에서 24시간까지 반응을 진행하였다. 이 때 반응 온도는 35℃, 교반속도는 200 rpm으로 반응하였다. 이후 동일 비율의 에틸아세테이트로 반응을 정지 및 추출이 이루어졌다. 반응을 종료시킨 후, 해당 반응물의 락톤을 확인하기 위해 GC/MS를 통하여 물질분석을 하였고 그 결과를 표 1, 도 10에 나타내었다.In the present invention, progress was made to investigate the effect on the various substrates of yeast Wolto Myis reaper, the biotransformation reaction of each 60 g / l 10-hydroxytetradecanoic acid, 10-hydroxyhexadecanoic acid, 10-hydroxystearic acid, ricinoleic acid, 12-hydroxystearic acid was used as a substrate, and the reaction was performed for 24 hours under 10 g / l Tris-HCl (pH 6.5) reaction medium containing 30 g / l yeast and 0.5 ml / l Tween80. At this time, the reaction temperature was 35 ℃, the stirring speed was reacted at 200 rpm. Thereafter, the reaction was stopped and extracted with ethyl acetate in the same ratio. After the reaction was terminated, the material was analyzed by GC / MS in order to confirm the lactone of the reaction, and the results are shown in Table 1 and FIG. 10.

표 1은 본 발명에 효모 월토마이세스 리포퍼와 해당 기질(10-hydroxytetradecanoic acid, 10-hydroxyhexadecanoic acid, 10-hydroxystearic acid, ricinoleic acid, 12-hydroxystearic acid)을 반응시켜 그에 따른 감마-락톤생산물 이름, GC/MS fragments (m/z)을 나타낸 것이다.Table 1 shows the reaction of the yeast Wolto Myis repertoire and the substrate (10-hydroxytetradecanoic acid, 10-hydroxyhexadecanoic acid, 10-hydroxystearic acid, ricinoleic acid, 12-hydroxystearic acid) according to the present invention according to the gamma-lactone product name, GC / MS fragments (m / z).

도 10은 본 발명에 효모 월토마이세스 리포퍼와 해당 기질(10-hydroxytetradecanoic acid, 10-hydroxyhexadecanoic acid, 10-hydroxystearic acid, ricinoleic acid, 12-hydroxystearic acid)을 반응한 후, 그 반응물을 GC/MS로 분석한 결과이다.10 is a reaction of the yeast waltomyces reporter and the substrate (10-hydroxytetradecanoic acid, 10-hydroxyhexadecanoic acid, 10-hydroxystearic acid, ricinoleic acid, 12-hydroxystearic acid) according to the present invention, the reaction by GC / MS The result of the analysis.

그 결과, 표 1, 도 10에 나타난 것과 같이, 각 해당 기질(10-hydroxytetradecanoic acid, 10-hydroxyhexadecanoic acid, 10-hydroxystearic acid, ricinoleic acid, 12-hydroxystearic acid)과 효모 월토마이세스 리포퍼를 반응한 후 생성된 감마-락톤은 GC/MS 분석 결과, 10-hydroxytetradecanoic acid 기질에서 γ-octalactone, 10-hydroxyhexadecanoic acid와 ricinoleic acid 그리고 12-hydroxystearic acid에서 γ-decalactone, 10-hydroxystearic acid에서 γ-dodecalactone으로 분자량이 일치하는 것으로 나타났다.As a result, as shown in Table 1, Figure 10, each of the substrates (10-hydroxytetradecanoic acid, 10-hydroxyhexadecanoic acid, 10-hydroxystearic acid, ricinoleic acid, 12-hydroxystearic acid) reacted with the yeast waltomyces reporter The resulting gamma-lactone was found to have a molecular weight of γ-octalactone, 10-hydroxyhexadecanoic acid and ricinoleic acid, 12-hydroxystearic acid and γ-decalactone for 10-hydroxystearic acid, and γ-dodecalactone for 10-hydroxystearic acid. This appeared to match.

SubstrateSubstrate namename Product nameProduct name GC/MS fragments (m/z)GC / MS fragments (m / z) 10-Hydroxytetradecanoic acid10-Hydroxytetradecanoic acid γ-Octalactone (A)γ-Octalactone (A) 85, 57, 142(M)85, 57, 142 (M) 10-Hydroxyhexadecanoic acid10-Hydroxyhexadecanoic acid γ-Decalactone (B)γ-Decalactone (B) 85, 170(M)85, 170 (M) 10-Hydroxystearic acid10-Hydroxystearic acid γ-Dodecalactone (C)γ-Dodecalactone (C) 85, 113, 198(M)85, 113, 198 (M) Ricinoleic acidRicinoleic acid γ-Decalactone (B)γ-Decalactone (B) 85, 170(M)85, 170 (M) 12-Hydroxystearic acid12-Hydroxystearic acid γ-Decalactone (B)γ-Decalactone (B) 85, 170(M)85, 170 (M)

표 1은 본 발명에 효모 월토마이세스 리포퍼와 해당 기질(10-hydroxytetradecanoic acid, 10-hydroxyhexadecanoic acid, 10-hydroxystearic acid, ricinoleic acid, 12-hydroxystearic acid)을 반응시켜 그에 따른 감마-락톤생산물 이름, GC/MS fragments (m/z)을 나타낸 것이다.Table 1 shows the reaction of the yeast Wolto Myis repertoire and the substrate (10-hydroxytetradecanoic acid, 10-hydroxyhexadecanoic acid, 10-hydroxystearic acid, ricinoleic acid, 12-hydroxystearic acid) according to the present invention according to the gamma-lactone product name, GC / MS fragments (m / z).

Claims (16)

효모균주인 월토마이세스 리포퍼를 이용하여 하이드록시 지방산으로부터 감마-도데카락톤의 제조방법.Method for producing gamma-dodecaractone from hydroxy fatty acid using a yeast strain Woltomyces reporter. 제 1 항에 있어서, 상기 효모는 월토마이세스 리포퍼 KCTC 17657인 것을 특징으로 하는 감마-도데카락톤의 제조방법.The method of claim 1, wherein the yeast is Woltomyces repopper KCTC 17657. 제 1 항에 또는 제 2 항에 있어서,
상기 방법은 효모를 7.5 내지 12.5 g/ℓ Tris-HCl를 포함하는 반응 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.The method according to claim 1 or 2,
The method is characterized in that the yeast is cultured in a reaction medium containing 7.5 to 12.5 g / l Tris-HCl. 제 1 항에 있어서,
상기 하이드록시 지방산은 10-하이드록시스테아르산인 것을 특징으로 하는 감마-도데카락톤의 제조방법.The method of claim 1,
The hydroxy fatty acid is a method for producing gamma-dodecaractone, characterized in that 10-hydroxystearic acid. 제 1항에 있어서,
상기 방법은 하이드록시 지방산을 50 g/ℓ 내지 70 g/ℓ 범위로 투여하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.The method of claim 1,
The method is characterized in that the hydroxy fatty acid is administered in the range of 50 g / L to 70 g / L. 제 1 항에 있어서,
상기 방법은 효모의 세포막 투과성을 향상하는 물질을 추가적으로 투여하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.The method of claim 1,
The method is characterized in that the additional administration of a substance for improving the cell membrane permeability of yeast. 제 6항에 있어서, 상기 세포막 투과성을 향상하는 물질은 메탄올, 에탄올, 소디움도데실설페이트 또는 트리톤(Triton) X-100 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 제조 방법. The method according to claim 6, wherein the substance which improves cell membrane permeability is methanol, ethanol, sodium dodecyl sulfate or Triton X-100 or a mixture thereof. 제7항에 있어서, 상기 에탄올은 30% 내지 70%, 상기 트리톤(Triton) X-100은 0.1% 내지 1.0% 범위로 투여되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.The method of claim 7, wherein the ethanol is 30% to 70%, Triton (Triton) X-100 is characterized in that the administration in the range of 0.1% to 1.0%. 제 1 항에 있어서,
상기 방법은 pH 6.0 내지 7.0 범위, 온도 33℃ 내지 37℃ 범위에서 수행되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.The method of claim 1,
The process is characterized in that the pH 6.0 to 7.0 range, the temperature 33 ° C to 37 ° C range. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 월토마이세스 리포퍼는 20 g/ℓ 내지 40 g/ℓ 농도 범위에서 수행되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.The method according to claim 1, wherein the method is performed in the range of 20 g / l to 40 g / l concentration of Wolto Myis reaper. 효모균주인 월토마이세스 리포퍼를 유효성분으로 포함하는 하이드록시 지방산으로부터 감마-도데카락톤 제조용 조성물.A composition for producing gamma-dodecaractone from a hydroxy fatty acid comprising a yeast strain Woltomyces reporter as an active ingredient. 제 11항에 있어서, 상기 조성물은 세포막 투과성 향상물질을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.The composition of claim 11, wherein the composition further comprises a cell membrane permeability enhancer. 효모균주를 세포막 투과성 향상물질과 하이드록시 지방산을 처리하는 단계를 포함하는 감마-락톤계 화합물 생산 방법.Method for producing a gamma-lactone compound comprising the step of treating the yeast strain cell membrane permeability enhancing material and hydroxy fatty acid. 제 13 항에 있어서,
상기 세포막 투과성을 향상하는 물질은 메탄올, 에탄올, 소디움도데실설페이트 또는 트리톤(Triton) X-100 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 13,
The substance for improving cell membrane permeability is methanol, ethanol, sodium dodecyl sulfate or Triton (Triton) X-100 or a mixture thereof. 제 13 항에 있어서, 상기 하이드록시 지방산은 10-하이드록시테트라데카노익산(Hydroxytetradecanoic acid), 10-하이드록시헥사데카노익산(Hydroxyhexadecanoic acid), 10-하이드록시스테아르산(Hydroxystearic acid),리시놀레산(Ricinoleic acid), 및 12-하이드록시스테아르산(Hydroxystearic acid)으로 구성된 군으로부터 선택된 하이드록시 지방산인 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 13, wherein the hydroxy fatty acid is 10-hydroxytetradecanoic acid (Hydroxytetradecanoic acid), 10-hydroxyhexadecanoic acid (Hydroxyhexadecanoic acid), 10-hydroxystearic acid (Hydroxystearic acid), ricinol A hydroxy fatty acid selected from the group consisting of ricinoleic acid, and 12-hydroxystearic acid. 제 13 항에 있어서,
상기 감마-락톤계 화합물은 γ-옥타락톤(Octalactone), γ-데카락톤(Decalactone) 및 감마-도데카락톤으로 구성된 군으로부터 선택된 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 13,
The gamma-lactone compound is a method selected from the group consisting of γ-octalactone (Octalactone), γ-decaractone (Decalactone) and gamma-dodecaractone.
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JP2645757B2 (en) * 1989-12-27 1997-08-25 長谷川香料株式会社 Production method of γ-dodecalactone
EP0795607A3 (en) * 1996-03-15 1999-06-30 Givaudan-Roure (International) S.A. Process for the preparation of a lactone
EP0997533A1 (en) * 1998-10-24 2000-05-03 Haarmann & Reimer Gmbh Process for the production of gamma-decalactone
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