KR20130099356A

KR20130099356A - 3차원 하이브리드 세포담체 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR20130099356A
Application number: KR1020120020800A
Authority: KR
Inventors: 김근형; 안승현; 이형진
Original assignee: 조선대학교산학협력단
Priority date: 2012-02-29
Filing date: 2012-02-29
Publication date: 2013-09-06
Also published as: KR101346094B1

Abstract

본 발명은 3차원 하이브리드 세포담체 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 통상의 용융플로팅 방법과 전기유체역학 프린팅 방법을 조합하여 수직 지주층 상에 가늘고 표면이 거친 실 구조를 적층함으로써 기계적 특성과 세포 부착 및 증식에 필요한 생물학적 특성을 모두 갖춘 3차원 하이브리드 세포담체를 제공한다.

Description

3차원 하이브리드 세포담체 및 그 제조방법 {3-dimensional hybrid scaffold and manufacturing method thereof}

생체의학 구조체는 다양한 조직과 기관을 재생하는데 널리 이용되고 있다. 구조체 제조에 이용되는 한 가지 기술은 쾌속조형 (rapid prototyping: RP)이며, 이는 구조체 내부의 마이크로구조를 용이하게 제어할 수 있는 장점이 있다. 그렇지만, 쾌속조형 기술을 이용하여 제조된 구조체는 지주 (strut)의 해상도가 낮고, 지주가 너무 매끄러워서 최초의 세포 부착 및 증식을 악화시킬 수 있다. 이 문제를 극복하기 위하여 본 발명자들은 쾌속조형 방법에 제어할 수 있는 기계적 특성으로 세포 작용을 강화시키는 아주 거친 마이크로크기의 실을 생성하는데 이용되어 온 전기유체역학 직접 기록 (electrohydrodynamic direct writing)을 조합한 하이브리드 기술을 제안한다. 이 결과 얻어지는 구조물은 마이크로크기의 지주와 매우 거친 실이 교차로 층을 형성한다. 조골 유사세포를 배양한 결과는 종래 쾌속조형 방법을 이용하여 제조된 세포담체에 비하여 세포담체의 생물학적 특성이 현저히 증대되었음을 보여주며 (세포 생존율이 약 2배이고 골 미네랄화가 2.5배임), 본 발명의 방법이 연성 및 경성 조직 재생에서 3차원 생체의학 세포담체 제조에 유용함을 말해준다.

조직 공학에 있어서, 모든 세포는 성장을 위하여 형판 (template)으로 기능하는 고정시킬 부위가 필요하기 때문에 세포 및 적합한 기질은 생체 내의 손상 부위에 이식된다 (R. Langer and J. P. Vacanti, Science, 1993, 260, 920, S. Yang, K.-F. Leong, Z. Du and C.-K. Chua, Tissue Eng., 2001, 7, 679.). 성공적으로 조직을 재생하기 위해서는 인 비트로 및 인 비보 세포 배양에 적합한 기질 (세포담체)이 필수적이다. 세포의 증식과 분화는 세포담체의 통공 구조 (통공 크기, 모양, 공극률 및 상호연결성)와 결정적으로 관련이 있기 때문에, 세포담체의 내부 디자인은 중요한 기술적 변수이다 (J. D. Kretlow and A. G. Mikos, AIChE J., 2008, 52, 3048, E. Sachlos and J. T. Czernuszka, Eur. Cells Mater., 2003, 5, 29. S. J. Hollister, Nat. Mater., 2005, 4, 518.). 몇몇 연구자들에 따르면, 골 재생을 위한 세포담체의 공극 크기는 100 내지 400 ㎛가 추천된다 (V. Karageorgiou and D. Kaplan, Biomaterials, 2005, 26, 5474, L. Cyster, D et al., Biomaterials, 2005, 26, 3230, S. M. Roosa et al., J. Biomed. Mater. Res., Part A, 2009, 92, 359.). 공극률은 높아야 하지만, 새로운 조직 형성을 지탱하기 위해서는 세포담체의 기계적 강도와 적절한 균형을 맞추어야 한다 (V. Karageorgiou and D. Kaplan, Biomaterials, 2005, 26, 5474). 공극 간 상호연계성은 3차원 매트릭스 내에서 주사된 세포의 증식 및 영양분과 노폐물의 운반을 위해 100%가 되어야 한다. 나아가, 세포담체는 형상 제어 가능한 대체물로서 이식 세포를 수용하고 새 조직으로 대체하기 위하여 3차원 공극 구조의 생분해성 물질이어야 한다 (R. Landers et al., J. Mater. Sci., 2002, 37, 3107).

다공성 세포담체를 제조하기 위해 미립자 침출법 (particulate leaching), 가스 발생법 (gas foaming), 전기방사법 (electrospinning) 및 동결건조법이 시도되었다 (P. D. Dalton, T. Woodfield and D. W. Hutmacher, Biomaterials, 2009, 30, 701). 이러한 방법들을 이용하면 높은 공극률의 공극을 간단하고 용이하게 제조할 수 있다. 그러나, 이 방법들은 세포담체 내부의 마이크로 구조를 제어할 수 없기 때문에 제조된 세포담체는 공극간 상호 연결성이 낮다. 이 문제를 극복하기 위해 임의형상제작 (solid freeform fabrication; SFF) 방법이 도입되었다. CAD 시스템에 의해 높은 제작 정확도와 재현성을 바탕으로, 이 방법은 골, 피부, 혈관 등 다양한 조직의 재생에 널리 적용되어 왔다 (S. J. Hollister, Nat. Mater., 2005, 4, 518). 그러나, 이 방법이 세포담체 제조에 굉장한 가능성이 있긴 하지만, 저해상도 지주 (low-resolution struts), 재료 선택의 한계, 공정시간이 긴 점 및 지주의 표면이 매끄러워 최초 세포 부착 및 증식을 저해한다는 점 등의 몇몇 한계점을 드러낸다 (P. D. Dalton et al., Biomaterials, 2009, 30, 701, R. Mulhaupt et al., Eur. Cells Mater., 2003, 6, 12, E. M Antonov et al., Adv. Mater., 2005, 17, 327).

본 발명은 상기 종래 조직공학 방법으로 제조되는 세포담체의 단점을 해결하려는 것으로서, 충분한 기계적 견고함을 나타내면서도 표면이 거칠고 공극이 충분히 형성되고, 공극간 상호연결성이 충분한 3차원 세포담체를 간단한 공정으로 제조하려는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 통상의 용융플로팅 시스템과 전기유체역학 직접기록 공정을 조합하여 3축 로봇 시스템으로 새로운 하이브리드 세포담체를 제조하였다. 전기유체역학 공정은 쉽고 단순하며, 마이크로 크기부터 나노 크기까지 다양한 크기의 실을 제조할 수 있었다. 그렇지만, 전기유체역학 공정만으로는 3차원 세포담체를 제조하는 것은 비현실적이었다. 본 발명에서는 전기유체역학 프린팅 공정에 통상의 용융플로팅 시스템을 응용하여 디자인된 3차원 세포담체를 얻었다. 조합된 공정을 이용하여 전기유체역학 프린팅된 실 (Electrohydrodynamic thread)의 다양한 물리적 장점 (높은 수분흡수능과 거친 실 표면)을 갖는 새로운 3차원 하이브리드 세포담체를 얻었다. 이 세포담체의 생물학적 측면을 평가하기 위해 조골 유사세포를 배양하여 세포담체의 세포 반응 (세포 생존율 및 칼슘 축적)에서 복잡한 내부 마이크로 구조의 효과를 시험하였다. 세포 거동의 결과는 하이브리드 세포담체가 통상의 세포담체와 비교하여 높은 세포 생존율과 높은 칼슘 축적을 나타냄을 보여주었다.

임의형상제작 (SSF) 방법의 한계점을 극복하기 위해 본 발명자들은 SSF 공정을 앞서 언급한 전기방사 (G. H. Kim, J. G. Son, S. Park and W. D. Kim, Macromol. Rapid Commun., 2008, 29, 1577, L. Moroni et al., Adv. Funct. Mater., 2008, 18, 53, S. H. Ahn, Y. H. Koh and G. H. Kim, J. Micromech. Microeng., 2010, 20, 065015) 및 동결건조 (H. Jiankang et al., Acta Biomater., 2009, 5, 453)와 같은 종래 제조방법과 조합하였다. 조합된 기술을 이용하여 제조된 세포담체는 종래의 임의형상제작 방법으로 제조된 세포담체와 비교하여 세포 거동 (cellular behavior)이 개선되었다.

본 발명자들은 임의형상제작 방법의 일종인 용융플로팅 방법과 전기유체역학 공정을 조합한 새로운 하이브리드 기술을 제시한다. 전기유체역학 직접기록 방법은 마이크로크기 및 나노크기의 실을 이용하여 전자 (T. Shimoda et al., Nature, 2006, 440, 783.), 광학재료 (S. H. Ahn and G. H. Kim, Appl. Phys. A: Mater. Sci. Process., 2009, 97, 125) 및 마이크로메카닉 장치에 응용되어 왔다. 전기유체역학 직접기록 방법은 최초로 Edirisinghe 등에 의하여 생분해성 코폴리머로 이루어진 가늘고 거친 실을 제조하기 위해 생체의학 세포담체 제조에 적용되었다 (A. Gupta et al., J.Bioact. Compat. Polym., 2007, 22, 265, Z. Ahmad et al., Macromol. Mater. Eng., 2010, 295, 315.). 전기유체역학 공정이 마이크로 단위로부터 나노 단위까지에 이르는 미세한 실을 쉽고, 저렴하고, 빠르게 제조할 수 있기 때문에 이는 매우 독창적인 아이디어였다. 그렇지만, 이 방법은 적층 구조를 형성함에 있어서는 제어가 어렵기 때문에 3차원 세포담체를 제조할 수는 없었다. 이러한 현상은 지주 내의 잔여 전하와 용매 때문에 발생하는 현상으로, 이는 먼저 침적된 실의 위치를 바꾸거나 부서지게 할 수 있다.

전기유체역학 프린팅 방법의 한계를 극복하고 제어 가능한 기계적 및 생물학적 특성을 나타내는 하이브리드 세포담체를 얻기 위해 본 발명자들은 일반적인 용융 플로팅 방법과 전기유체역학 직접기록 공정을 이용하여 새로운 방법을 제안한다. 이 방법을 이용하여 본 발명자들은 수직 지주와 전기유체역학방법으로 놓인 미세한 실이 차곡차곡 적층된 3차원 하이브리드 세포담체를 제조하였다. 이 하이브리드 세포담체는 완벽하게 상호 연결되는 공극들을 용이하게 제어할 수 있다. 이 하이브리드 세포담체는 용융플로팅으로 제조된 세포담체와 기계적 성질이 유사한 반면, 수분흡수능력과 생물학적 특성이 뛰어난 것으로 나타났다.

본 발명은

a) 쾌속조형 방법으로 생체적합성 재료를 이용하여 스테이지 상에 지주 (strut)층을 형성하는 단계;

b) 상기 지주층에 전도성 또는 비전도성 점성 용액을 가하고 전기유체역학 노즐과 스테이지 사이에 전기장을 형성하는 단계;

c) 상기 전기장 내의 상기 점성 용액 내 지주층 위에 전기유체역학 방법으로 생체적합성 재료를 이용하여 한 방향 이상 실 (thread) 층을 형성하는 단계;

d) 전기장을 가하지 않고 상기 실 층 위에 쾌속조형 방법으로 생체적합성 재료를 이용하여 지주층을 형성하는 단계;

e) 전기장을 가하며 상기 d)의 점성 용액 내 지주층 위에 전기유체역학 방법으로 생체적합성 재료를 이용하여 한 방향 이상 실 (thread) 층을 형성하는 단계; 및

f) 상기 점성 용액을 제거하고 전기장을 제거하는 단계;를 포함하는 3차원 하이브리드 세포담체 제조방법을 제공한다.

상기 점성 용액 제거에는 다양한 방법을 이용할 수 있으며, 예컨대 에탄올 용액을 스프레이하여 점성 용액이 좀더 잘 제거될 수 있도록 할 수 있다.

본 발명은 상기 e) 단계 이후 d) 단계와 e) 단계를 반복함을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

본 발명은 상기 b) 단계의 전기장 세기가 0.01 ~ 5 kV/㎜인 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다. 전기장 세기가 너무 약하면 전기유체역학 공정이 제대로 이루어지지 못하며, 전기장 세기가 너무 강하면 안정적인 콘-제트 모드를 얻을 수 없다.

상기 생체적합성 재료는 조직공학에서 사용되는 생체적합성 재료이면 특별한 제한은 없으나, 좀더 구체적으로는 본 발명은 상기 a) 단계 및 c) 단계의 상기 생체적합성 재료가 푸코이단, 콜라겐, 알지네이트, 키토산, 히알루론산, 실크, 폴리이미드(polyimides), 폴리아믹스 산(polyamix acid), 폴리카프로락톤(polycarprolactone), 폴리에테르이미드(polyetherimide), 나일론(nylon), 폴리아라미드(polyaramid), 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 폴리벤질글루타메이트(poly-benzyl-glutamate), 폴리페닐렌테레프탈아마이드(polyphenyleneterephthalamide), 폴리아닐린(polyaniline), 폴리아크릴로나이트릴(polyacrylonitrile), 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide), 폴리스티렌(polystyrene), 셀룰로오스(cellulose), 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate), 폴리락산(polylactic acid; PLA), 폴리글리콜산(polyglycolic acid; PGA), 폴리락산과 폴리글리콜산의 공중합체(PLGA), 폴리{폴리(에틸렌옥사이드)테레프탈레이트-co-부틸렌테레프탈레이트}(PEOT/PBT), 폴리포스포에스터(polyphosphoester; PPE), 폴리포스파젠(PPA), 폴리안하이드라이드(Polyanhydride; PA), 폴리오르쏘에스터{poly(ortho ester; POE}, 폴리(프로필렌푸마레이트)-디아크릴레이트{poly(propylene fumarate)-diacrylate; PPF-DA} 및 폴리에틸렌글라이콜디아크릴레이트{poly(ethylene glycol) diacrylate; PEG-DA}로 이루어진 그룹 중에서 선택된 1종 이상임을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 c) 단계에서 한 층 이상 실 층을 형성하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 c) 단계의 전기유체역학적 방법이 전기유체역학적 노즐과 스테이지 사이에 형성된 전기장 내에서, 전기유체역학적 노즐로부터 전도성 생체적합성 재료를 분류 (jet)하여 스테이지에 적층시키는 것임을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조되며, 공극 상호연결성 100%이고, 표면이 거칠고 다공성인 3차원 하이브리드 세포담체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 세포담체의 공극 크기가 50 ㎛ ~ 700 ㎛임을 특징으로 한다. 이 범위 내에서 양분 및 노폐물 수송이 잘 일어나고, 세포의 부착 및 증식이 가장 용이하다.

또한, 본 발명은 상기 세포담체가 조직 재생용으로 이용됨을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 세포담체가 골 조직 재생용임을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 세포담체가 피부 조직 재생용임을 특징으로 한다.

본 발명의 방법에 의해 제조된 3차원 하이브리드 세포담체는 충분한 기계적 견고함을 나타내면서도 표면이 거칠고 공극이 충분히 형성되고, 공극간 상호연결성이 충분하여 세포의 초기 부착 및 증식에 매우 효과적이다.

또한, 본 발명의 3차원 하이브리드 세포담체 제조방법은 간단한 공정으로 공극 크기, 공극률 등을 제어할 수 있다.

도 1은 본 발명의 방법으로 3차원 하이브리드 세포담체를 제조하는 공정을 나타낸다. (a)는 원뿔형 전극으로 수행하는 전기유체역학 공정의 개략적인 다이아그램이다 (내부 도면은 노즐 팁과 바닥 사이에 적용된 전압 (0.25 kV/㎜)으로 인해 분출되는 용액 선을 보여주는 안정된 콘-제트 모드를 나타낸다). (b)는 용융플로팅된 PCL 층의 제조를 보여주는 이미지이다. (c)는 제조된 세포담체이다 (40 × 40 × 1.6 ㎣).
도 2는 제조된 PCL 세포담체의 SEM 이미지이다. (a)는 통상의 용융플로팅 방법으로 제조된 지주 직경 267 ± 25 ㎛, 공극 크기 257 ± 46 ㎛의 수직 플로팅된 지주로 구성된 세포담체의 SEM 이미지, (b)는 하이브리드 기술을 이용하여 제조된 용융플로팅 지주 (직경 268 ± 25 ㎛) 및 전기유체역학 프린팅된 실 (직경 152 ± 38 ㎛)의 하이브리드 구조를 보여주는 SEM 이미지이다. 오른쪽 SEM 이미지는 왼쪽 이미지를 확대한 것이다.
도 3은 다양한 하이브리드 세포담체의 SEM 이미지이다: (a) M-1, (b) M-2, 및 (c) M-3. (d) 신장 속도 상수 (2 ㎜/sed)일 때 통상의 세포담체 (P: 50.1% ± 1.2%), M-1 (P: 68.2% ± 1.2%), M-2 (P: 66.9% ± 0.7%), 및 M-3 (P: 63.6% ± 1.6%)의 응력-변형 곡선. (e) 통상의 PCL 및 M-1 세포담체의 상대적 수분흡수능.
도 4 (a)는 세포담체 상에 시드된 MG63 세포의 MTT 분석에 의한 세포 생존율을 나타낸다. (b)와 (c)는 통상의 PCL과 하이브리드 세포담체 상에 3일간 세포배양하여 얻어진 세포의 핵을 나타내는 형광 이미지이다. (d)는 7 내지 14일 (n=5)동안 세포담체의 칼슘 미네랄화를 나타낸다. (e)와 (f)는 통상의 PCL과 하이브리드 세포담체에서 7일 후 미네랄화를 나타내는 ARS 염색을 광학현미경으로 관찰한 것이다. *p < 0.05는 유의미한 차이를 나타낸다.

이하, 구체적인 실시예를 들어 본 발명의 구성을 좀더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예의 기재 범위 내로 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다. 특히, 본 발명의 실시예에서는 생물재료로서 폴리카프로락톤을 이용하였으나, 본 발명의 방법에는 폴리카프로락톤 외에도 조직공학에 이용되는 다양한 생물재료를 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 실시예에서는 골조직 재생실험에 대하여만 기재하였으나, 실제로 본 발명자들이 피부조직 재생실험을 수행한 결과, 본 발명의 방법에 의해 제조된 3차원 하이브리드 세포담체가 피부조직 재생에도 매우 효과가 있음을 확인하였다.

< 실시예 1: 재료 및 세포담체 제조>

하이브리드 세포담체를 제조하기 위해 두 개의 공정이 필요하다: PCL 수지 (밀도 = 1.135 g/㎤, 분자량 = 60,000; 녹는점 = 60 ℃; Sigma-Aldrich, USA)를 그리기 위한 3축 로봇 시스템과 연결된 쾌속조형 시스템 (본 실시예에서는 쾌속조형의 일종으로서 용융플로팅 시스템) 및 가늘고 매우 거친 실을 제조하기 위한 전기유체역학 시스템이다. PCL 분말은 115 ℃에서 가열된 원통형 카트리지에 주입하였다. 용융된 PCL은 가열된 350 ㎛ 니들 팁을 통해 일정한 압력 (410 kPa)으로 압출되었다. 노즐 작동 속도는 5 ㎜/sec으로 고정되었다. 전기유체역학 공정에 이용할 12 중량% PCL 용액은 2.4 g의 PCL을 메틸렌 클로라이드 (MC; Junsei Chem. Co., Japan) 및 다이메틸포름아마이드 (DMF; Junsei Chem. Co., Japan)로 이루어진 용매 혼합액 30 g에 녹여 제조하였다. 용매는 MC/DMF가 80/20 중량비인 것을 사용하였다. 용액의 전기 전도율은 62 mS/m였다. 전기유체역학 프린팅은 21G 노즐 (내경 724 ㎛, 외경 800 ㎛)을 이용하였다.

먼저, PCL을 플로터의 원통형 카트리지로 옮기고, 수직 PCL 지주를 플로팅 스테이지 상에 플로팅하여 한 층을 완성하였다. 두 번째, 전기유체역학 프린팅 노즐과 연결된 근접한 스테이지가 적층된 지주로 자동으로 이동하였다. 그 다음 전기유체역학 프린팅된 실이 그 위에 분출되었다. 이 공정은 3차원 하이브리드 세포담체를 제조하기 위해 수회 반복되었다.

그러나, 전기유체역학 프린팅된 실은 그 중량으로 인해 가라앉을 수 있다; 그리하여 본 발명자들은 5중량%의 폴리에틸렌옥사이드 (PEO; 분자량 = 900,000) 용액을 적층된 지주에 가하여 미세한 실을 유지시켰다. 전기유체역학 공정에 이용된 전기장은 0.25 kV/㎜였고, PCL 용액의 흐름 속도는 시린지 펌프 (KDS 230; KD Scientific, Holliston, MA, USA)를 이용하여 1 ㎖/h로 고정하였다. 높은 전기장을 공급하기 위해 전원 공급장치 (SHV300RD-50K; Convertech, Seoul, South Korea)를 사용하였다. 제조 후 잔여 PEO를 제거하기 위해 세포담체를 1/3 부피의 증류수로 수 회 세척하였다.

< 실시예 2: 세포담체 특성 규명>

세포담체의 표면 및 단면 구조를 광학현미경 (OM, BX FM-32; Olympus, Tokyo, Japan) 및 주사전자현미경 (SEM, Sirion; FEI, Hillsboro, OR, USA)으로 관찰하였다. 세포담체의 공극률 (P)은 다음 식 (P = 1- M/ρ hs) × 100으로 계산하였다. 이때 M은 세포담체의 부피, ρ는 PCL의 밀도 (1.135 g/㎤), h는 겉보기 세포담체 두께 (apparent scaffold thickness), 그리고 s는 직사각형 세포담체의 겉보기 표면적이다. 시편의 두께와 표면적은 디지털 캘리퍼 마이크로미터 (Ultra-Cal III; Fowler/Sylvac, Oxford, AL, USA)로 측정하였고, 세 군데에서 측정하여 평균 내었다.

수분흡수력은 증류수에 두 시간 동안 담그기 전·후의 세포담체 무게를 재어 측정하였다. 물 흡수 증가는 (%) = (W _2h - W ₀ )/W ₀ × 100과 같이 계산하였는데, 여기에서 W _2h 는 두 시간 후 세포담체의 무게이고, W ₀ 는 세포담체의 원래 무게이다. 세포담체 표면에서 흡수 동작을 측정하기 위해 적색 염료와 혼합한 물 한 방울 (10 ㎛)을 이용하였다.

세포담체 (20 × 10 × 1.6 ㎣)의 영 모듈러스는 마이크로텐실 시험기 (Toptech 2000; Chemilab, Suwon, South Korea)로 측정하였다. 기계적 데이타는 다섯 번의 독립적인 실험으로 얻었고, 모든 데이타는 단일 표준편차를 가진 평균값으로 나타내었다. 세포담체 두께는 다섯 개의 지점에서 측정하고, 평균 내었다. 시료는 실온에서 2 ㎜/sec 속도로 끊어질 때까지 잡아 늘렸다.

< 실시예 3: 인 비트로 시험>

세포배양 시험을 위해 세포담체를 70% 에탄올 및 UV로 소독하고 배양배지에 오버나잇 배양하였다. 조골 유사세포 (MG63; ATCC, Manassas, VA, USA)를 이용하여 세포담체 내에서 세포 거동을 관찰하였다. 10% 우태혈청 (Hyclone) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 (Hyclone)이 포함된 DMEM 배지 (Dulbecco's modified Eagle's medium; Hyclone, Logan, UT, USA)에서 세포를 배양하였다. 7대까지 유지한 다음 트립신-EDTA를 처리하여 세포를 모았다. 세포를 세포담체 상에 시료당 5 × 10⁴ 밀도로 시딩하고 5% CO₂ 조건에서 37 ℃로 배양하였다. 배지는 매 이틀마다 갈아주었다. 세포 형태를 확인하기 위해 세포를 SEM으로 관찰하였따. 세포/세포담체 구조물을 2.5% 글루타르알데하이드로 고정하고 농도구배 에탄올로 탈수시켰다. 건조된 세포담체를 금으로 코팅하고 주사전자현미경으로 관찰하였다. 생존 세포는 MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 분석 키트 (Cell Proliferation Kit I; Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany)로 분석하였다. 이 분석법은 생존 세포 내에서 MTT의 노란 테트라졸리움 염이 미토콘드리아 디하이드로제네이즈에 의해 쪼개져서 보라색 포마잔 결정을 만든다는데 기초한 것이다. 세포담체의 세포는 네 시간 동안 37 ℃로 0.5 ㎎/㎖ MTT를 넣고 배양하였고, 570 ㎚흡광도를 마이크로플레이트 판독기 (EL800; BioTek Instruments, Winooski, VT, USA) 로 측정하였다. 각 배양시간마다 다섯 개의 시료를 시험하였고, 각 시험은 세 번씩 반복 수행하였다.

세포배양 3일 후 지주와 실은 DAPI (diamidino-2-phenylindole)로 형광염색되어 세포담체 표면상의 세포핵을 나타내었다. 형광 이미지는 ZEISS AxioVision 1 (Germany)로 관찰하였다. 미네랄화 수준은 6웰 플레이트를 이용하여 알리자린 레드 S로 시험하였다. MG63 세포는 50 ㎍/㎖의 비타민 C와 10 mM의 β-글리세로포스페이트가 함유된 DMEM 배지에서 배양하였다. 세포는 PBS로 세 번 세척한 다음 70% (v/v) 찬 에탄올 (4℃)로 한 시간 동안 고정시켜 건조시켰다. 에탄올로 고정된 시편은 40mM ARS (pH 4.2)로 한 시간 동안 염색한 다음 정제수로 세 번 세척하였다. 시편은 10% 세틸피리디늄 클로라이드를 포함하는 10mM 인산나트륨 완충액 (pH 7.0)으로 15분간 탈색하였다. Spectra Ⅲ UV 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 562 ㎚의 흡광도를 측정하였다. 모든 데이타는 평균 ± 표준편차로 표시하였다.

<통계 분석>

모든 정량적 결과는 다섯 개의 시료에서 얻어진 것이다. 모든 데이타는 평균 ± 표준편차로 표시하였다. 통계 분석은 단일 요인 편차 분석으로 이루어졌다. 유의성 수준은 p < 0.05로 하였다.

<결과 1: 하이브리드 세포담체 제조공정 및 공극 구조>

도 1의 (a) 및 (b)는 본 발명의 세포담체 제조공정을 나타내는 도면이다. 도면과 같이, 용융 플로터로 3차원 플로팅을 먼저 실시하여 수직의 폴리카프로락톤 (PCL) 지주를 제조하였다. 한 층을 플로팅한 후, 그 위에 전기유체역학 직접 기록 방법으로 적층하였다. 전기유체역학 시스템에서 원뿔형 전극은 테일러 원뿔과 최초의 분사 젯 용액을 안정화시키기 위해 이용된다. 세포담체를 두껍게 형성하기 위해 같은 공정을 수차례 반복하였다. 도 1의 (c)는 본 발명 방법으로 제조된, 마이크로 크기위 지주와 가는 실로 이루어진 세포담체 (40×40×1.6 ㎣)를 보여준다.

본 실시예에서는 공극 크기를 250 ㎛로 선택하였는데, 본 발명자들은 세포담체 내의 공극 크기가 50 내지 700 ㎛인 것이 양분 및 노폐물 확산에 적합하며, 골 형성에도 이 공극 크기 범위가 적합하다고 판단하였다 (L. Cyster et al., Biomaterials, 2005, 26, 3230, S. M. Roosa et al., J. Biomed. Mater. Res., Part A, 2009, 92, 359). 도 2a는 일반적인 용융플로팅법으로 제조된, 지주 직경이 257 ± 25 ㎛이고, 공극 크기 즉, 지주와 지주 간의 거리가 257 ± 46 ㎛인 PCL 세포담체의 주사전자현미경 이미지를 보여준다. 도 2b는 용융플로팅된 지주와 0.25 kV/㎜ 전기장 하에서 제조된 전기유체역학으로 침적된 실로 이루어진 하이브리드 구조의 세포담체를 보여준다. 주사전자현미경 이미지는 전기유체역학방법으로 침적된 실이 플로팅된 지주 층 사이에 안정적으로 위치하며, 세포담체 내의 공극 간의 상호연결성이 100%임을 선명하게 보여준다. 도 2b의 확대 이미지는 전기유체역학으로 제조된 실의 표면이 매우 거칠고, 가는 실로 이루어진 공극이 185 내지 320 ㎛임을 보여준다. 일반적으로 세포담체 표면의 거칠기가 최초 세포 부착 및 증식에 영향을 미치기 때문에 (J. A. Schmidt and A. F. Von Recum, Biomaterials, 1991, 12, 385, Y. Wan et al., Biomaterials, 2005, 26, 4453), 본 발명의 전기유체역학방법으로 얻어진 실의 거친 표면이 세포 부착과 증식을 유도할 것이라고 판단된다.

<결과 2: 기계적 특성>

3차원 세포담체는 적절한 기계적 지지가 매우 중요하다. 세포담체가 경성 및 연성 조직에서 적절한 기계적 지지를 해주지 못한다면, 새로운 조직 형성은 실패할 것이다 (S. J. Hollister, Nat. Mater., 2005, 4, 518). 다공성 재료의 기계적 성질은 공극률 및 공극 분포와 밀접한 관련이 있다. 도 3 (a) 내지 (c)는 용융플로팅 방법 및 전기유체역학 프린팅 방법으로 디자인된 세포담체를 보여준다. SEM 이미지와 같이, 용융플로팅된 층은 공극 크기가 M-1, M-2 및 M-3에서 각각 800 ㎛, 900 ㎛ 및 1,000 ㎛이다. 여기에 공극 크기와 공극률을 변화시키기 위해 전기유체역학 방법으로 제조된 미세한 실이 융용플로팅된 층 위에 각각 하나, 둘 및 세 개를 침적한 것을 도 3의 (a), (b), 및 (c)가 보여준다. 표면 및 단면 이미지에 나타난 것과 같이, 미세한 실은 잘 끼워져 있었다. 그렇지만, 도 3 (b), (c)와 같이 두 개 및 세 개의 경우에는 실 사이의 잔여 정전기적 전하의 간섭으로 인해 실 사이의 간격이 일정하지 않았다. 이와 같이 제조된 세포담체를 이용하여 본 발명자들은 전기유체역학 방법으로 제조된 층 내에서 실의 갯수를 조절함으로써 공극률을 제어할 수 있다. 도 3 (d)는 신장속도가 2 ㎜/sec으로 일정할 때 세포담체의 전형적인 응력-변형 곡선을 나타낸다. 그래프에서 보통의 PCL 세포담체는 도 2 (a)를 말한다. 편평한 부분과 굽이치는 부분 다음에 오는 곡선들은 준탄성 부분을 나타내는데, 이는 다층 구조의 지주 사이의 접착 (inter-adhesion) 때문임이 분명했다. 비록 M-3 세포담체 (공극률 (P)=63.6% ± 1.6%)가 M-1 세포담체 (공극률 (P)=68.2% ± 1.2%)에 비하여 상대적으로 공극률이 낮지만, 하이브리드 세포담체의 탄성 모듈러스는 전기유체역학 프린팅된 층이 아니라, 용융플로팅된 마이크로 크기의 지주로 이루어진 층에 매우 의존적이다. 이러한 현상은 하이브리드 세포담체 내에서 용융플로팅된 지주에 가장 큰 신장 스트레스가 집중되었기 때문에 발생했다; 가는 실은 탄성 모듈러스에 크게 영향을 미치지 않는 반면, 하이브리드 세포담체의 파단변형 (break-strain)은 전기유체역학 프린팅된 실에 매우 의존적이다. 이러한 이유 때문에 우리는 하이브리드 세포담체의 기계적 유지가능성이 용융플로팅된 지주층과 밀접하게 관련되어 있다고 결론지었다. 다양한 디자인의 하이브리드 세포담체를 이용하여 본 발명자들은 세포담체의 기계적 제어가 가능할 것으로 확신한다. 그렇지만, 기계적 특성이 세포 거동 또는 양분 및 노폐물 수송에 영향을 미치는 공극률과 밀접하게 관련되어 있기 때문에 세포담체의 기계적 특성과 공극률에 균형을 맞추어야 한다. 표 1과 표 2는 각각 종래 세포담체와 하이브리드 세포담체의 공극률, 공극 크기 및 기계적 성질을 나타낸다.

<결과 3: 수분흡수능력>

세포담체의 수분흡수는 세포 거동 및 재생된 조직의 구조적 형태에서 그 역할로 인해 중요하다 (Z. Ahmad, M. Rasekh and M. Edirisinghe, Macromol. Mater. Eng., 2010, 295, 315). 하이브리드 세포담체 (M-1)의 수분흡수는 용융플로팅된 세포담체의 수분흡수와 비교하여 1.8배 커서 유의미하게 개선되었는데, 이는 층간 다공성 실 때문이다. 비록 세포 형태, 세포 부착 및 세포 기능에 영향을 미치는 세포담체의 디자인 변수(공극 크기, 공극률, 표면 지형, 기계적 특성, 만곡부 (tortuosity) 및 친수성 )가 있기는 하지만, 하이브리드 세포담체의 디자인 변수가 인 비트로 및 인 비보 시험에서 증강된 수분흡수능력 덕분에 체액과 양분의 손실을 막고 세포 거동, 특히 세포 부착 및 증식을 개선할 수 있음을 예상할 수 있다.

<결과 4: 인 비트로 시험 결과>

조골 유사세포 (MG63)는 대조군으로서 용융플로팅 세포담체 (통상의 PCL) 및 하이브리드 세포담체 (하이브리드 PCL) 모두에 주사되었다 (도 2a). 세포 생존율을 정량적으로 관찰하기 위해 MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 분석을 수행하였다 (도 4a). 시간이 흐름에 따라 모든 세포담체에서 생존 세포들은 증식하였는데, 세포 생존율을 나타내는 광학 밀도 값은 통상 세포담체에 비해 하이브리드 세포담체에서 더 높았다. 이러한 현상은 전기유체역학 실의 매우 거친 표면 및 세포담체의 내부 마이크로 구조에 영향을 받는 높은 수분흡수능력에 기인한 것으로 보인다. 세포담체의 세포 증식을 확인하기 위해 세포 배양 3일 후 세포담체 표면상의 세포 핵을 나타내는 형광 이미지가 도 4b 및 4c에 제시되었다. 일반적으로, 표면이 매우 거친 구조는 세포가 부착할 수 있는 면적이 넓기 때문에 최초 세포 부착 및 증식을 촉진시킨다. 이미지에서 보듯이 세포들은 매끄러운 지주 표면보다는 전기유체역학 공정으로 직접 프린트된 거친 표면상에 더 많이 분포되어 있다. 박힌 세포들은 하이브리드 세포담체 내의 전기유체역학 프린트된 층에 가득 흩어져 있는 반면, 통상의 3차원 세포담체에 있는 용융플로팅 지주의 매끄러운 표면 상에는 산발적으로 부착되어 있었다.

칼슘 미네랄 수준을 결정하기 위해 알리자린 레드 S (ARS)를 이용하였다. 염색된 배양물에서 추출된 ARS의 광학밀도는 도 4d에 나타내었다. 배양 7일 후에 비해 14일 후에 칼슘 수준이 증가하였음을 관찰하였다. 그러나, 하이브리드 세포담체의 미네랄화는 용융플로팅 세포담체에 비하여 의미 있게 증가하였다. 도 4e 및 4f는 광학현미경 이미지를 나타내는데, 빨간 색은 칼슘 미네랄 구역을 나타낸다. 용융플로팅 세포담체와 비교할 때 칼슘 농도가 높아 ARS 염색이 진한 부분은 하이브리드 세포담체 상에서 관찰되었다.

이러한 결과를 볼 때 하이브리드 세포담체 내에서 전기유체역학 프린팅된 층이 세포가 부착하고 증식할 활성 부위를 제공하고 나아가 주사된 세포의 분화를 촉진하는 것으로 보인다.

Claims

a) 쾌속조형 방법으로 생체적합성 재료를 이용하여 스테이지 상에 지주 (strut)층을 형성하는 단계;
b) 상기 지주층에 전도성 또는 비전도성 점성 용액을 가하고 전기유체역학 노즐과 스테이지 사이에 전기장을 형성하는 단계;
c) 상기 전기장 내의 상기 점성 용액 내 지주층 위에 전기유체역학 방법으로 생체적합성 재료를 이용하여 한 방향 이상 실 (thread) 층을 형성하는 단계;
d) 전기장을 가하지 않고 상기 실 층 위에 쾌속조형 방법으로 생체적합성 재료를 이용하여 지주층을 형성하는 단계;
e) 전기장을 가하며 상기 d)의 점성 용액 내 지주층 위에 전기유체역학 방법으로 생체적합성 재료를 이용하여 한 방향 이상 실 (thread) 층을 형성하는 단계; 및
f) 상기 점성 용액을 제거하고 전기장을 제거하는 단계;를 포함하는 3차원 하이브리드 세포담체 제조방법.
청구항 1에 있어서,
상기 b) 단계의 전기장은 세기가 0.01 ~ 5 kV/㎜인 것을 특징으로 하는 3차원 하이브리드 세포담체 제조방법.
청구항 1에 있어서,
상기 a) 단계 및 c) 단계의 상기 생체적합성 재료는 푸코이단, 콜라겐, 알지네이트, 키토산, 히알루론산, 실크, 폴리이미드(polyimides), 폴리아믹스 산(polyamix acid), 폴리카프로락톤(polycarprolactone), 폴리에테르이미드(polyetherimide), 나일론(nylon), 폴리아라미드(polyaramid), 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 폴리벤질글루타메이트(poly-benzyl-glutamate), 폴리페닐렌테레프탈아마이드(polyphenyleneterephthalamide), 폴리아닐린(polyaniline), 폴리아크릴로나이트릴(polyacrylonitrile), 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide), 폴리스티렌(polystyrene), 셀룰로오스(cellulose), 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate), 폴리락산(polylactic acid; PLA), 폴리글리콜산(polyglycolic acid; PGA), 폴리락산과 폴리글리콜산의 공중합체(PLGA), 폴리{폴리(에틸렌옥사이드)테레프탈레이트-co-부틸렌테레프탈레이트}(PEOT/PBT), 폴리포스포에스터(polyphosphoester; PPE), 폴리포스파젠(PPA), 폴리안하이드라이드(Polyanhydride; PA), 폴리오르쏘에스터{poly(ortho ester; POE}, 폴리(프로필렌푸마레이트)-디아크릴레이트{poly(propylene fumarate)-diacrylate; PPF-DA} 및 폴리에틸렌글라이콜디아크릴레이트{poly(ethylene glycol) diacrylate; PEG-DA}로 이루어진 그룹 중에서 선택된 1종 이상임을 특징으로 하는 3차원 하이브리드 세포담체 제조방법.
청구항 1에 있어서,
상기 c) 단계는 한 층 이상 실 층을 형성하는 것을 특징으로 하는 3차원 하이브리드 세포담체 제조방법.
청구항 1에 있어서,
상기 c) 단계의 전기유체역학적 방법은 전기유체역학적 노즐과 스테이지 사이에 형성된 전기장 내에서, 전기유체역학적 노즐로부터 전도성 생체적합성 재료를 분류 (jet)하여 스테이지에 적층시킴을 특징으로 하는 3차원 하이브리드 세포담체 제조방법.
청구항 1에 있어서,
상기 e) 단계 이후 d) 단계와 e) 단계를 반복함을 특징으로 하는 3차원 하이브리드 세포담체 제조방법.
청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항의 방법으로 제조되며, 공극 상호연결성 100%이고, 표면이 거칠고 다공성인 3차원 하이브리드 세포담체.
청구항 7에 있어서,
상기 세포담체는 공극 크기가 50 ㎛ ~ 700 ㎛임을 특징으로 하는 3차원 하이브리드 세포담체.
청구항 7에 있어서,
상기 세포담체는 조직 재생용으로 이용됨을 특징으로 하는 3차원 하이브리드 세포담체.
청구항 9에 있어서,
상기 조직은 골 조직임을 특징으로 하는 3차원 하이브리드 세포담체.
청구항 9에 있어서,
상기 조직은 피부 조직임을 특징으로 하는 세포담체.