KR20130076093A - 형광 스펙트럼 테스트를 이용한 분말상 대두의 저장 중 산패도 측정방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 형광 분석을 이용한 대두 분말의 산패도(rancidity) 측정방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 일정한 조건에서 저장시킨 대두 분말의 추출용액으로부터 형광을 분석하여 산패도를 측정하는 방법, 대두 분말의 산패도 측정용 키트, 및 상기 방법을 이용한 지방 산패 방지물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 형광 분광법을 이용한 분말상 대두의 산패도 측정 방법은 종래의 산패도 측정 방법인 TBA 측정방법에 비해 더 민감하고 정확하며, 산가(acid value) 방법보다 간편하고 신속하게 측정할 수 있는 장점이 있다.

Description

형광 스펙트럼 테스트를 이용한 분말상 대두의 저장 중 산패도 측정방법{Direct evaluation of the rancidity of soybean in powder form during storage using fluorescence spectrum test}

본 발명은 형광 분석을 이용한 대두 분말의 산패도(rancidity) 측정방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 일정한 조건에서 저장시킨 대두 분말의 추출용액으로부터 형광을 분석하여 산패도를 측정하는 방법, 대두 분말의 산패도 측정용 키트, 및 상기 방법을 이용한 지방 산패 방지물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

콩은 우수한 단백질과 불포화지방산 함량이 높은 지방, 탄수화물 및 비타민, 미네랄 등 미량 영양성분을 갖춘 식품일 뿐 아니라 여러 가지 생리활성을 가져 식품소재로 많이 사용되고 있다(Kim SO. 2006. Research and Industrial Trend of the Functional Components of Soybean, Food Science and Industry. 39(1): 2-10). 대두는 청국장, 된장, 간장, 두부, 식용유 등 다양하게 가공에 이용되고 있으며, 대두 분말 또한 식품산업에서 가공제품의 영양적 가치를 높이기 위해서 첨가물로 광범위하게 사용되고 있다. 대두의 분말화 공정에서 분쇄는 식품의 물리적 형태를 바꾸는 것뿐만 아니라 분말화하여 원료에 비하여 표면적을 증가시키고, 조직 세포를 파괴하여 세포 속에 있는 성분이 노출되게 하여 건조, 추출, 용해와 같은 조작을 촉진하는 효과로 제품의 생산성에 영향을 줄 수 있고 또한 맛, 향기, 식감 등을 향상시킬 수 있다(Chun et al., 2003; Shu et al., 2004). 그러나, 대두의 분말화는 산소와의 접촉면적을 증가시켜 지질 산화를 빠르게 진행시키므로 품질저하의 원인이 될 수 있다(Lee SB, Uhm BH, Yoon WB. 2011. Effect of High Pressure Processing on the Rancidity of Yeonhaeju Soybean (Bazaz) Powder during Storage. Food Engineering Process. 15(3): 209-213). 특히 산패로 이어지는 고도 불포화지방의 산화는 지질 함량이 매우 적은 경우에도 식품의 품질을 저하시키는 주요 원인 중 하나이다.

식용 유지나 지방질 식품 등에서 사용되는 '산패'라는 용어는 일반적으로 유지나 식품 중의 지방질 성분에서 일어나는 어떤 비정상적인 불쾌한 냄새와 맛의 발생과 그 발전에 사용되고 있다. 식용유지나 지방질 식품에 있어서 가장 중요한 품질의 저하는 이 유지나 지방질 성분의 산패에 기인되는 경우가 많다. 따라서 유지의 산패현상은 식품화학적으로 매우 중요하다. 유지나 지방질 식품 중의 지방질 성분의 산패는 그 원인에 따라, 유지 등이 외부의 악취를 흡수하는 경우, 가수분해에 의한 산패, 유지 등의 산화에 의한 산패 등으로 분류된다. 먼저, 유지나 지방질 식품들이 외부의 휘발성 성분들을 잘 흡수하는 사실은 오래전부터 알려져 왔는데, 이와 같은 경우에도 본래의 냄새와는 다른 냄새를 가졌다는 의미에서 산패라고 말할 수 있다. 가수분해에 의한 산패는 보통 유지의 구성성분인 트리글리세라이드들이 물과 접촉하는 동안에 일어나는 화학적인 가수분해에 의한 산패와 트리글리세라이드들이 동식물의 조직 중에 존재하는 라이페이스와 같은 유지분해효소에 의해서 촉진되는 효소에 의한 가수분해에 의한 산패로 나뉠 수 있다.

이와 같은 가수분해에 의한 산패는 수분함량이 크거나 수분과의 접촉 기회가 많은 식품들과 그 가공품들의 경우 매우 중요하다. 마지막으로, 산화에 의한 산패는 유지나 지방질 식품들이 공기 중의 산소를 자연적으로 흡수함으로써 발생하는 산패이다. 이 산패는 저장 또는 가공과정에 있는 유지나 지방질 식품들과 공기 사이에 접촉이 있는 한, 정도의 차이는 있겠으나 언제나 일어날 수 있는 산패이며, 또 일부 특수한 형태의 가공식품들을 제외하고는 공기와의 접촉을 피할 수 없으므로 전자의 두 가지 형태의 산패에 비해서 훨씬 더 일반적이고 중요한 산패의 원인이다. 따라서, 일반적으로 식용유지나 지방질 식품에 있어서의 산패라면 거의 대부분 산화에 의한 산패를 말한다. 산화에 의한 산패는 유지나 식품 중의 지방이 공기 중의 산소를 자연적으로 흡수하여 일어나는 삼패이다. 즉 유지는 공기 중의 산소와 반응하여 산화되고 중량이 증가하며 알데히드(Aldehyde)나 케톤(Kerone)을 형성하고 중합하여 비중이 증가하는데 거의 대부분의 산패가 자동산화에 의한 산패이다.

종래의 산패도 측정방법으로는 선행문헌인 Liang, J. H. 2000. Kinetics of fluorescence formation in whole milk powders during oxidation. Food Chemistry. 71: 459-463에서 살펴볼 수 있듯이, 과산화가(peroxide value)나 TBA 밸류(2-thiobarbituric acid(TBA) value)를 이용하는 측정방법 등이 있는데, 이러한 측정방법은 분말상태로부터 유지를 추출하는 공정이 사용되며 이에 따라 추출 시 소요되는 시료의 양과 추출시간 및 추출 공정 중에서 실험 오차를 유발하는 등의 단점이 있다. 예를 들어, 과산화가(peroxide value)는 물질의 초기 자동산화의 peroxide 형성에 대해서만 적용이 가능하다(Frankel, E. N. 1993. In Search of better methods to evaluate natural antioxidants and oxidative stability in food lipids. Trends in Food Science and Technology. 4: 220-225). 또한 산화 과정 동안 과산화가는 최고값에 도달한 후 감소할 수 있다(Liang, 2000).

한편, 산화 과정은 여러 복잡한 반응을 포함하고, 단백질, 인지질 (phospholipids), 핵산과 함께 보조 산화 물질의 상호 작용으로 인해 특유의 형광 스펙트럼을 보여주는 발색단을 생산할 수 있다(Forss, D. A. 1972. Odor an flavor compounds from lipids. Progress in the Chemistry of Fats and Other Lipids. 13: 181-258; Mottram, D. 1987. Lipid oxidation and flavor in mea and meat products. Food Science and Technology Today. 1: 159-162; Frankel, E. N. 1998. Lipid oxidation. Dundee: The Oily Press LDT). 이러한 형광 스펙트럼은 산화물질에 대해서만 특이하게 일어나는 현상은 아니다. 이것은 다양한 아미노산과 고분자 알데히드(aldehydes) 반응으로 형성된 청색 영역의 스펙트럼을 형성하는 형광화합물을 만들어 내는 것으로 알려져 있다(Kikugawa, K, Takayanagi K. Watanabe S. 1985. Polylysines modified with malonaldehyde, hydroperoxylinoleic acid and monofunctional aldehydes. Chemical & Pharmaceutical Bulletin. 33(12): 5437-5444).

이에 본 발명자들은 위와 같은 종래기술의 단점을 보완하기 위해 형광 분광법을 이용하여 유지 추출 공정을 최소화하여 분말 상태의 대두의 산패도를 측정하는 방법을 제공하고자 한다. 또 따른 본 발명의 선행문헌인 Veberg, A, Vogt, G, Wold, J.P. 2006. Fluorescence in aldehyde model systems related to lipid oxidation. Swiss society of Food Science and Technology. 39: 562-570에서 살펴볼 수 있듯이, 형광 분광법은 빠르고, 비파괴적이고, 매우 민감성이 좋은 측정방법이다. 동물 조직에서 노화와 관련된 형광 lipofuscin 색소는 아미노 화합물과 peroxides의 반응에서 나온 것으로 간주되었다. 산화 지질과 단백질의 상호작용으로부터 나온 형광물질은 식품에서 산화 변패의 평가에도 사용되었다(Kikugawa, K. 1986. Fluorescent products derived from the reaction of primary amines and components in peroxidized lipids. Free Radical Biology and Medicine. 2: 389-417).

그러나 이런 기작 또한 대두 분말에서의 지질 산화와 관련된 고유 형광에서만 사용할 수 있다는 단점이 있었기에, 기존 단점들을 극복할 수 있는 새로운 대두 분말의 산패도 측정방법이 요구되는 실정이다.

이에 본 발명자들은 대두 분말을 여러 조건에서 저장하면서 형광분광을 이용하여 산화변수를 조사하고, 그것을 통해 형광광도계를 이용하여 대두 분말 저장중의 산패도 측정법을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 대두 분말 시료의 형광을 분석함으로써 대두 분말의 산패도를 측정하는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 형광분석을 이용한 대두 분말의 산패도 측정에 사용되는 산패도 측정용 키트를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 형광분석을 이용한 대두 분말의 산패도 측정 방법을 이용한 지방 산패 방지물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 대두 분말 시료의 형광을 분석함으로써 대두 분말의 산패도를 측정하는 방법을 제공한다.

본 발명의 산패도 측정방법은, 클로로포름 및 메탄올을 혼합시킨 용액에 대두 분말 시료를 넣어 반응물을 제조하는 단계; 상기 반응물을 거르는 단계; 상기 걸러진 용액을 원심분리시켜 상층액을 얻는 단계; 및 상기 상층액의 형광을 측정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 클로로포름 및 메탄올을 혼합시킨 용액의 클로로포름:메탄올 혼합비율은 2:1(v/v)이 될 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 반응물을 거르는 방법은 주사기(syringe) 및 주사기 필터를 사용하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 원심분리시키는 용액은 상기 걸러진 용액에 증류수를 혼합시킨 용액일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 원심분리는 1000×g의 속도로 10분간 이루어질 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 형광을 측정하는 방법은 형광광도계(fluorescence spectrometer)를 사용하는 것일 수 있으며, 이 경우 측정 조건은 방출(emission) 400~500nm, 여기(excitation) 360 nm, 슬릿(slit) 5.0mm 및 측정간격 600ms가 될 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 대두 분말 시료의 평균 입자크기는 40㎛ 이하일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 대두 분말 시료는 90℃ 이상의 온도에서 저장된 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 대두 분말 시료는 10일 이상 저장된 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 클로로포름 및 메탄올의 혼합용액, 주사기 및 주사기 필터를 포함하는 대두 분말의 산패도 측정용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명의 형광분석을 이용한 대두 분말의 산패도 측정 방법을 이용한 지방 산패 방지물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 스크리닝 방법은, 대상물질을 대두 분말 시료에 처리하는 단계; 상기 대두 분말을 클로로포름 및 메탄올 혼합용액에 넣어 반응물을 제조하는 단계; 상기 반응물을 정제한 용액으로부터 형광을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 형광을 대조군의 것과 비교하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 반응물을 정제한 용액은 상기 반응물을 주사기 필터로 거른 용액을 원심분리시킨 상층액일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 방법은 상기 대상물질을 대두 분말 시료에 처리하는 단계 이후에 상기 시료를 90℃~100℃에서 10일 이상 저장하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 형광 분광법을 이용한 분말상 대두의 산패도 측정 방법은 종래의 산패도 측정 방법인 TBA 측정방법에 비해 더 민감하고 정확하며, 산가(acid value) 방법보다 간편하고 신속하게 측정할 수 있는 장점이 있다. 따라서 종래의 것보다 우수한 산패도 측정방법으로 볼 수 있고, 나아가 지방 산패 방지물질의 스크리닝 방법 등에 활용될 수 있다.

도 1은 대두 분말 입자의 크기에 따른 형광 강도의 차이를 나타낸다.
도 2는 25℃, 50℃, 90℃에서 대두 분말 산화 과정 동안의 시간에 따른 형광 강도 변화를 나타낸다.
도 3은 25℃, 50℃, 90℃에서 대두 분말 산화 과정 동안의 시간에 따른 TBA가(value) 변화를 나타낸다.
도 4는 25℃, 90℃에서 대두 분말 산화 과정 동안의 시간에 따른 산가(acid value) 변화를 나타낸다.

본 발명은 형광 스펙트럼 측정을 이용하여 대두 분말의 산패도를 측정하는 방법에 관한 것이다.

상술한 바와 같이 일반적으로 식용 유지 등에서의 '산패'는 대부분 산화에 의한 산패이다. 산화에 의한 산패는 대체로, 유지가 자연발생적으로 산소를 흡수함으로써 일어나는 자동산화, 광선의 조사에 의해 일어나는 감광체에 의한 산화, 비교적 높은 온도로 가열된 유지에서 일어나는 가열 산화 등의 세 가지의 기본적인 형태로 나눌 수 있는데, 일반 유지나 지방질 식품들은 단시일의 가공처리과정을 제외하면 대체로 실온 부근 또는 그보다 낮은 온도에서 장기간 저장되는 경우가 많기 때문에 첫 번째의 자동산화 과정이 특히 중요하다.

유지를 저장하면 공기 중의 산소를 흡수하여 유지마다 속도의 차이가 있지만 반드시 어느 단계에 이르면 산화가 일어난다. 이러한 산화는 상온 이하의 낮은 온도 및 낮은 농도의 산소 조건에서도 자연 발생적으로 일어나고 유리 라디칼이 계속 관여하여 연쇄적으로 진행되기 때문에 자동산화라고 한다. 일반적으로 유지가 산소를 흡수하는 속도는 자동산화가 일어나는 초기에는 아주 낮으나 어느 기간이 지난 후에는 매우 급격하게 증가된다. 산소 흡수 속도가 매우 낮은 어느 일정기간을 유도기간이라고 하는데 지방질의 종류에 따라 유도기간이 다르다. 일정한 유도기간이 지나면 산소의 흡수속도가 매우 빠르고 산화 생성물인 히드로퍼옥시드 (hydroperoxide) 함량이 크게 증가한다. 유도기간에 영향을 주는 요인은 유지의 저장온도, 유지의 불포화도, 항산화제, 산화촉진제의 존재 여부 등이 있는데, 일반적으로 유지의 산소 흡수속도는 유지의 불포화도에 가장 큰 영향을 받는다.

자동산화는 그 본질이 활성 라디칼 연쇄반응이며, 개시단계, 전파 단계, 종결 단계로 이루어진 전형적인 유리 라디칼 반응 기작에 의하여 진행된다. 개시 단계에서는 가열 에너지, 기계적 에너지, 광에너지, 화학에너지, 금속촉매제 등의 개시제에 의해서 활성화 되며 분자내에 공유결합을 이루고 있는 수소가 떼내져 유리 라디칼이 생성되거나 또는 생성된 hydroperoxide로부터 각종 라디칼이 생성되는 단계이다. 생성된 유리 라디칼은 공기 중의 산소와 결합하여 과산화 라디칼이 되고 이것은 또 다른 유지로부터 수소를 떼내어 hydroperoxide와 유리 라디칼을 생성하며 이러한 반응은 연속적으로 진행된다. hydroperoxide로부터 쉽게 유리 라디칼이 생성될 수 있으므로 hydroperoxide가 생성되는 즉시 산화반응은 기하급수적으로 연속 진행된다. 이상에서 활성이 매우 큰 각종 라디칼에 의해서 수소를 떼내기 쉬운 지방질이 거의 소진되면 라디칼끼리 결합하여 산소의 양에 따라 중합 화합물이 생성되고, 이 중합 생성물은 유지의 이화학적 성질에 영향을 준다.

한편, 지방질의 산패도 측정은 산화 중 여러 가지 화학적, 물리적 반응이 관여하므로 매우 복잡하다. 유지의 산패 측정은 1차적으로 유지에 흡수된 산소나 산화물의 양을 측정할 수 있으며, 2차적으로 과산화물의 분해 산물을 측정할 수 있다. 이 분해 산물은 종류가 매우 다양하고 분해생성물의 생성 반응들이 여러 가지 변수에 의하여 영향을 받기 때문에 한 가지 종류의 분해 산물만을 측정하는 경우 오류를 범하기 쉽다. 지금까지 공지되어 있는 산패도 측정방법들의 예로는 다음과 같은 것들이 있다.

먼저, 과산화물값을 이용한 측정이다. 과산화물은 자동산화의 주요 개시 산물이다. 과산화물값은 유지 1kg 중에 함유된 과산화물의 당량수로써 표시한다. 과산화물의 측정은 요드 적정법, 즉 산화된 유지와 KI를 반응시켜 생성된 I₂를 NaS₂O₃로 측정하는 법과 2가철을 3가철로 산화시킬 때 색의 변화를 측정하는 티오시안법이 많이 이용되고 있다. 산화과정 중에 과산화물은 최고값에 도달한 후 감소한다. 산패한지 오래된 유지는 과산화물값이 낮게 측정된다. 정확도도 실험과정의 방법과 실험온도에 따라 영향을 받는다. 산소의 흡수량이나 생성된 과산화물의 양은 유지의 조성, 산화방지제, 미량 금속, 산화조건에 따라 다를 수 있다. 과산화물값은 산화 초기에 생성되는 과산화물을 측정함으로써 유지의 유도 기간을 측정하는 데 많이 이용한다.

다음으로 지방산화를 평가하는 데 가장 널리 사용하는 방법 중의 하나인 TBA 가(또는 값)이다. 이 방법은 thiobarbituric acid 두 분자가 불포화 지방의 산화생성물은 malonaldehyde 한 분자와 축합하여 붉은 색소를 생성하는 데 근거를 두고 있다. 그러나 alkanal, alkenal 등의 TBA와 노란 색소를 생성하고 dienal은 또 붉은 색소를 생성하므로 450nm 및 530nm 모두 측정하는 것이 바람직하다. TBA 값은 과산화물값보다 재현성이 낮은 경우가 많으나 산화가 진행됨에 따라 과산화물값과는 달리 TBA 값이 계속 증가한다. TBA 값은 한 가지 유지로 된 시료를 여러 가지 산화단계에서 비교할 때 가장 유용하고 산화 시의 향미값과도 가장 잘 일치하여 많이 이용되고 있다.

다음으로 총 Carbonyl 화합물 측정 방법이 있다. 유지나 지방질 식품이 산패하면 과산화물을 거쳐 많은 종류의 carbonyl 화합물을 생성한다. 총 carbonyl 화합물을 측정하는 방법은 알데히드와 케톤화합물이 2,4-dinitrophenyl hydrazine 과 작용하여 붉은 색소의 2,4-dinitrophenol hydrazone을 생성하므로 이 색을 비색정량하는 방법이다. Carbony 화합물 중에는 비휘발성인 고분자의 것이 비교적 많다. 저분자량의 carbonyl 화합물은 휘발성이 크므로 유지의 향기와 직접적인 관계가 있다. 저분자량의 carbonyl 화합물을 증류하고 회수한 후 적절한 시약으로 반응시키거나 chromatograph 방법으로 정량 할 수 있다. Headspace 분석법에 의한 hexanal의 정량법도 많이 이용되고 있다.

다음으로 아니시딘(anisidine) 값 측정이 있다. 아세트산 존재하에 p-anisidine 은 알데히드와 반응하여 황색 색소를 생성한다. 알데히드가 이중결합을 가지고 있으면 350nm에서의 흡광도가 증가하므로 anisidine 값은 주로 2-alkenal 양의 추정치가 된다. Totox값 혹은 산화값은 과산화물값과 과산화물의 분해산물인 anisidine 값으로 다음과 같이 계산하는데 유지의 산화정도를 평가하는 데 자주 이용된다.

산업적으로 지방질의 산화를 평가하는데 이용한 가장 오래된 방법 중 하나로 Kreis 시험이 있다. 이 방법은 산화생성물 중의 carbonyl 화합물이 phloroglucinol과 반응하여 적색으로 정색되는 것을 측정한다. 이 방법은 산화 생성물이 없는 신선한 유지도 Kreis 시약과 반응하여 정색이 되는 경우가 있고 실험하는 사람에 따라 다른 결과가 나오기 때문에 주로 정성시험에 이용한다.

다음으로 자외선 분광광도법이 있다. 유지가 산화되면 1,4-pentadiene 형태의 이중결합이 콘쥬게이션 이중 결합으로 변화한다. 콘쥬게이션 이중결합은 234nm에서, 콘쥬게이션 triene은 268nm에서 높은 흡광도를 나타낸다. 이 흡광 정도는 산화 초기단계를 제외하고는 산화 정도와 잘 일치되지 않는 단점이 있다.

다음으로 Oxirane 시험이 있다. 이 방법은 Epoxide 함량을 추정하는 것으로 oxirane기에 수소할로겐 화합물의 첨가반응에 기초를 둔 것으로 이 반응은 감수성이 낮고 특이성이 없다. 또한 수소 할로겐 화합물은 β-불포화 카르보닐 화합물이나 콘쥬게이션 이중결합 화합물과도 반응한다. Epoxide 기과 피크린산과의 반응을 기초로 한 비색법은 수소할로겐 화합물의 첨가방법보다 감수성이 높고 단점도 적은 편이다.

또한, 여러 가지 크로마토그래피 기술, 즉 얇은 막 크로마토그래피, HPLC, 가스크로마토그래피법 등이 지방질의 산화정도를 측정하는데 이용될 수 있다. 이 방법은 자동산화 중에 생성된 전형적인 산화생성물 pentane, hexanal 과 같은 휘발성 물질 또는 극성 중합체 등의 특이성분을 분리하고 정량할 수 있다.

유지산패의 신속측정법 중의 하나로 샬 오븐 시험이 있다. 이것은 시료를 65℃에 저장하면서 산패가 검출될 때까지 정기적으로 관능검사나 과산화물값을 측정하여 유도기간을 측정하는 방법이다. 다른 유지 산패의 신속측정법의 하나로 활성산소법이 있다. 이것은 유지를 97℃의 물중탕에서 2.33ml/sec 속도로 일정하게 공기를 불어 넣어 산패를 촉진시키고, 일정한 시간간격으로 유지의 과산화물값을 측정하여 유지의 산패 유도 기간을 측정하는 방법이다. 또 다른 유지 산패의 신속측정법의 하나로 랜시매트법이 있다. 이것은 유지를 100℃로 유지하고 AOM법과 같이 공기를 주입시키면서 산화생성물의 생성을 전기전도도로 측정하여 유지의 산패유도기간을 측정하는 것이다.

그 외 다른 방법으로 요소 첨가 생성물을 이용할 수 있다. 요소를 결정화시키면 결정내에 직경 0.8~1.2mm의 긴 공극이 생성되고 이 공극에 장쇄 지방산이나 탄화수소가 내포화합물을 형성한다. 지방산과의 내포화합물 안정성은 지방산의 기화학적 구조와 관계가 있어 직쇄구조에서 벗어날수록 첨가 생성물이 적다. 같은 탄소 수이면 cis 형의 이중결합이 많을수록 약해지므로 스테아르산 > 올레산 > 리놀레산의 순으로 안정성이 낮아진다. 분지 지방산이나 중합지방산 등은 내포화합물을 만들지 못하므로 이런 지방산의 분리에 이용된다.

마지막으로 석유 에테르 불용물을 이용하는 방법도 들 수 있다. 유지의 산화물과 중합체는 석유 에테르에 불용성이다. 튀김용 유지의 석유 에테르 불용물이 0.7% 이상이고 발연점이 170℃ 이상이거나 또는 석유 에테르 불용물이 1.0% 이상이면 발연점에 관계없이 튀김용 유지로 사용할 수 없다고 판단한다. 독일에서 개발된 방법인데 오랜 시간이 소요되고 정확하지 않은 단점이 있다.

본 발명자들은 상기와 같은 공지의 방법들의 단점을 극복하고 특히 분말상 대두의 저장 중의 산패도를 측정하는데 최적화된 방법을 개발하고자 연구한 끝에 특정한 조건에서 저장시킨 대두 분말의 형광을 측정하는 본 발명에 따른 형광을 이용한 산패도 측정 방법을 발명하게 되었다. 유지 산패 과정에서 나타나는 형광은 지방의 산화 과정 중 생성되는 카르보닐 화합물이 유리 아미노기를 가진 성분과 상호작용하면서 나타나는 것으로 생각된다.

본 발명자들은 본 발명에 따른 형광을 이용한 산패도 측정 방법의 효과를 알아보기 위하여, 종래의 대표적인 산패도 측정방법인 TBA 가(value)와 산가(acid value)를 이용한 분석을 대조군으로 함께 사용하였다. 구체적으로, 25℃, 50℃, 90℃의 저장온도 조건에서 20일 동안 대두 분말 시료를 저장하면서 산패도에 따라 값을 비교하였다. 25℃ 및 50℃의 저장온도 조건에서의 결과를 비교하였을 때 데이터의 패턴은 양쪽이 비슷하게 형성되는 것을 알 수 있었다(도 2 내지 4 참조). 이 조건에서는 초기값과 비교하여 20일까지의 측정값이 크게 차이 없이 일정한 것을 알 수 있었다. 반면에 90℃의 저장온도에서는 형광 측정의 경우 저장 10일째부터 형광이 증가하다가 15일째에 크게 값이 증가하는 것을 볼 수 있었다(도 2 참조).

이것은 Liang & Lin (Liang. J.H., Lin C. C. 2000. Fluorescence Kinetics of Soybean Flour Oxidation. Journal of the American Oil Chemists' Society. 77: 709-713)의 논문에서 보고한 바와 같이, 올레산(oleic acid)과 리놀산(linoleic acid)의 함량이 높은 대두의 특징 때문인 것으로 생각된다. 산가(acid value)는 형광 측정과 같은 패턴을 보여주었다. 전체적인 패턴은 Liang & Lin(2000)의 연구에서 나온 결과와 본 발명에 따른 형광 측정, TBA 테스트와 같은 패턴을 형성하는 것을 볼 수 있었다. 위의 결과들을 종합하면, 본 발명에 따른 형광 측정은 TBA가에 비해 더 민감하고 정확하게 대두 분말의 산패도를 측정할 수 있는 방법이며, 산가(acid value)보다 빠르게 측정할 수 있는 장점이 있다.

따라서 본 발명은 대두 분말 시료의 형광을 분석함으로써 대두 분말의 산패도를 측정하는 방법을 제공할 수 있다. 본 발명의 산패도 측정방법은, 분말 상태의 대두로부터 형광 측정이 가능하도록 유지 성분을 추출하는 단계 및 상기 추출물의 형광을 측정하는 단계를 필수적으로 포함한다. 본 발명의 일실시예에서 상기 측정방법은 1) 클로로포름 및 메탄올을 혼합시킨 용액에 대두 분말 시료를 넣어 반응물을 제조하는 단계; 2) 상기 반응물을 거르는 단계; 3) 상기 걸러진 용액을 원심분리시켜 상층액을 얻는 단계; 및 4) 상기 상층액의 형광을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 추가로 본 발명에 따른 산패도 측정을 위해서는 대두 분말 시료를 적절한 조건에서 저장하는 것이 필요하다.

이에 제한되는 것은 아니나, 본 발명의 일실시예에서 상기 대두 분말 시료의 평균 입자크기는 40㎛ 이하인 것이 바람직하다. 또한, 상기 대두 분말 시료의 산화를 촉진시키기 위해서는 고온의 조건에서 저장하는 것이 바람직하며, 20일 이내의 저장조건에서는, 이에 제한되는 것은 아니나, 90℃ 이상의 온도에서 저장되는 것이 바람직하다. 한편, 상기 반응물을 거르는 방법은 액체를 거를 수 있는 통상의 방법이 모두 사용될 수 있으나, 본 발명의 일실시예에서는 사용의 편의를 위하여 주사기(syringe) 및 주사기 필터를 사용할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, 상기 원심분리시키는 용액은 상기 걸러진 용액에 증류수를 혼합시킨 용액일 수 있으며, 상기 원심분리 조건은 필요에 의해 임의로 설정할 수 있으며, 본 발명의 일시예에서는 1000×g의 속도로 10분간 이루어질 수 있다. 상기 형광을 측정하는 방법은 어떠한 공지의 방법을 사용해도 무방하며, 형광광도계(fluorescence spectrometer)를 사용하는 것이 일반적이다. 이 경우 측정 조건은 필요에 의해 임의로 설정할 수 있으며, 본 발명의 일실예에서는 방출(emission) 400~500nm, 여기(excitation) 360 nm, 슬릿(slit) 5.0mm, 측정간격 600ms가 될 수 있다.

또한, 본 발명은 클로로포름 및 메탄올의 혼합용액, 주사기 및 주사기 필터를 포함하는 대두 분말의 산패도 측정용 키트를 제공할 수 있다. 상기 키트에는 추가로 기질이 포함될 수 있으며, 상기 기질은 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 니트로셀룰로오즈 막, 폴리비닐(polyvinyl) 수지로 합성된 96 웰 플레이트(96 well plate), 폴리스티렌(polystyrene) 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 유리로 된 슬라이드글라스 등이 될 수 있다. 또한, 상기 키트에는 추가적으로 반응 시약들이 포함될 수 있으며, 상기 반응 시약은 각종의 완충용액, 표식시약, 및 세척 완충용액 등 당업자에게 알려진 반응에 필요한 시약들을 모두 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명의 형광분석을 이용한 대두 분말의 산패도 측정 방법을 이용한 지방 산패 방지물질의 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 스크리닝 방법은, 대상물질을 대두 분말 시료에 처리하는 단계; 상기 대두 분말을 클로로포름 및 메탄올 혼합용액에 넣어 반응물을 제조하는 단계; 상기 반응물을 정제한 용액으로부터 형광을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 형광을 대조군의 것과 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 반응물을 정제한 용액은 상기 반응물을 주사기 필터로 거른 용액을 원심분리시킨 상층액일 수 있다. 또한 바람직하게는 필요에 의해 상기 방법에서 상기 대상물질을 대두 분말 시료에 처리하는 단계 이후에 상기 시료를 적절한 조건에서 저장하는 단계가 포함될 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, 상기 저장 기간이 20일 이상인 경우에는 상기 저장온도를, 이에 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 90℃이상, 더욱 바람직하게는 90~100℃로 설정할 수 있다.

이에 제한되는 것은 아니나 상기 '지방 산패 방지물질'의 대표적인 예로서 항산화제를 들 수 있다. 여기에서 '항산화제'라는 용어는 유지 식품의 산화를 방지하여 산화속도를 억제하여 산패 발생을 가져오는 시간을 연장하는 물질 또는 요인을 말한다. 바람직하게 상기 항산화제는 유지 산패의 첫 단계인 지방산유리기가 산소와 반응하지 못하도록 수소유리를 제공하여 유지 산패를 막아 주는 역할을 하는 것일 수 있다. 또한, 상기 항산화제는 주로 식품에 이용되기 때문에 유지식품에 잘 용해 및 혼합되고, 무색, 무취, 비독성이며, 체내축적 없이 배설되고, 식품성분과 서로 반응하지 않으며, -OH 그룹을 반드시 가지고 있는 것이 바람직하다. 항산화제의 종류로는 크게 자연 항산화제, 합성 항산화제, 협력제(synegist) 등이 있다.

지금까지 공지된 자연 항산화제로는 참기름에 존재하는 sesamol, 면실에 있는 gossypol, 각종 인지질의 혼합물인 lecitin, 대부분의 식물류, 돼지기름 등의 동물류, 어류에 함유된 tocopherol류, 그 외 로즈마리, 실비아, 세이지 등이 알려져 있다. 합성 항산화제는 크게 페놀계, 아민계, 유황계가 있다. 식용 유지에 사용하는 것은 대부분 페놀계 항산화제로서 다음과 같은 것들이 있다. BHA (Butylated hydroxy anisole)는 강력한 항산화제로서 주로 2-BHA, 3-BHA가 사용된다. BHT (Butylated Hydroxy toluene)는 BHA보다 싸기 때문에 널리 사용된다. PG (Propyl Gallate)는 BHT, BHA와 함께 사용하는 경우가 많으며 단점은 기름보다 물에 잘 녹고 철분이 있을 때는 착색된다. 그 외 TBHQ, EP 등도 있다. 마지막으로, critic acid, tartaric acid, phosphoric acid, phytic acid, ascorbic acid, isoascorobic acid, phospholipids와 같은 산성 화합물은 자신이 항산화력을 갖고 있지는 않지만 다른 항산화제와 함께 사용할 때 항산화 효과를 크게 증가시키는 협력제의 예들이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<참고예>

실험 재료

본 발명의 실시예에서 사용한 대두는 ㈜월드그린(괴산, 충청북도, 대한민국)에서 구입하였으며, 대두 200g을 다기능분쇄기(KSP-35, Korea medi Co., LTD, Korea)를 이용하여 1분간 분쇄하여 평균입자크기를 40㎛로 만든 후 실험을 진행하였다.

시료의 저장

실험에 사용할 대두 분말 시료는 25℃, 50℃, 90℃의 3가지 온도에서 저장하였으며, 50℃, 90℃ 건조 오븐(dry oven)(JISICO, 서울, 대한민국)에 각각 넣어 고르게 펼쳐 산소와 접촉하는 면적을 같게 한 후 20일 동안 저장하며 관찰하였다.

시약 제조

형광 실험(fluorescence test)에 사용할 클로로포름(chloroform)과 메탄올(methanol)의 혼합용액(CM 용액)은 클로로포름:메탄올의 비율이 2:1(v/v)이 되도록 각각 600ml와 300ml를 혼합하여 만들었다. TBA 실험에 사용되는 시약인 TCA 용액은 2M H₃PO₄를 만든 후 200g의 TCA시약과 2M H₃PO₄ 용액을 혼합하여 만들었다. 0.01M TBA (2-thiobarbituric acid) 용액은 시약 1.4709g을 증류수에 넣어 1L를 만들었다. 이소아밀알콜(isoamyl alcohol)과 피리딘(pyridine) 혼합용액(2:1, v/v)은 이소아밀알콜 400ml와 피리딘 200ml을 혼합하여 만들었다. 모든 시약은 빛에 노출되는 것을 막기 위해 갈색병에 넣어 어두운 곳에 보관하였다.

통계분석

엑셀 프로그램을 이용하여 통계분석 하였으며, 데이터들 간의 유의성이 나타난 자료에는 ANOVA(분산 분석)에 의한 유의성 검정을 실시하였다.

<실시예 1>

형광에 의한 산패도 측정

<1-1> 형광 실험( fluorescence test ) 방법

시료를 0.5g 넣은 15ml 코니칼 튜브(conical tube)에 위 CM 용액을 10ml 가해 시약과 시료가 충분히 섞일 정도로 섞어준 후 10분간 반응시켰다. 10분 후 주사기(syringe)와 주사기 필터(syringe filter)를 이용하여 용액을 모두 거른 후, 걸러진 용액 6ml에 증류수 2ml를 가하여 섞어주었다. 그 후 섞인 용액을 원심분리기(UNION 32R Plus, Hanil science Industrial, Incheon, Korea)에 넣고 1000 × g의 속도로 10분간 원심분리시켰다. 원심분리한 시료의 상층액 2ml을 큐벳(cuvet)에 넣어 형광광도계(fluorescence spectrometer) (Perkin Elmer LS-55B, Perkin Elmer Asia, USA)로 방출(emission) 400~500nm, 여기(excitation) 360 nm, 슬릿(slit) 5.0mm, 측정간격 600ms로 하여 측정하였다.

<1-2> 입자크기에 따른 형광 강도 차이

대두 분말 입자의 크기에 따른 대두 분말의 형광 강도(fluorescence intensity)의 상대적인 세기를 도 1에 나타내었다. 입자의 크기가 작아질수록 유의미하게 강도(intensity)가 높아지는 것을 알 수 있었다. 이것은 같은 시간을 반응 시켰을 때 입자의 크기가 작으면 반응할 수 있는 면적이 넓어져 같은 시간 동안 용출되어 나오는 산화 물질이 더 많아지기 때문인 것으로 생각된다. 따라서 본 발명의 실시예에서는 시료의 입자크기를 평균적으로 40㎛로 하여 실험함으로써 입자크기에 의한 영향을 배제시켰다.

<1-3> 형광에 의한 산패도 측정

저장온도를 25℃, 50℃, 90℃로 각각 다르게 하여 저장한 대두 분말 시료들에서 나온 형광을 이용하여 산패도 값을 측정하였다. 25℃에서 저장한 시료의 경우 저장기간 중에 형광 강도에 큰 변화가 없는 것을 확인할 수 있었다(도 2). 이것은 25℃의 저장온도가 자동산화에 미치는 영향이 적어 초기 산패도 변화에 영향을 주지 않기 때문인 것으로 생각된다. 마찬가지로 50℃에서 저장한 시료에서도 큰 변화 없이 20일 동안 비슷한 값을 나타낸 것을 확인할 수 있었다(도 2). 따라서 적어도 50℃까지는 자동산화에 미치는 영향이 미미하며 온도가 실험결과에 크게 영향을 미치지 않는 것으로 볼 수 있다. 한편, 50℃에서의 형광 강도 값이 25℃에서의 것보다 낮았지만 이것은 실험 시작시의 시료의 산패도가 달랐기 때문인 것으로 보인다. 반면에, 90℃에서 저장한 시료의 경우는 10일째부터 유의성 있게 측정값이 증가하다가 15일째 크게 값이 증가하는 패턴을 보여주었다(도 2). 이는 90℃의 저장조건에서는 온도가 산화의 진행에 영향을 주어 25℃ 및 50℃의 저장온도에서보다 더 빠른 산화 진행을 나타내었기 때문인 것으로 보인다.

<실시예 2>

TBA 테스트에 의한 산패도 측정

<2-1> TBA 테스트 방법

50ml 코니칼 튜브(conical tube)에 시료를 2g 넣은 뒤, TCA 용액 2ml과 TBA 용액 4ml을 가하여 섞은 후, 90℃ water bath(BW-05G, JEIO TECH, 대전, 대한민국)에서 15분간 중탕하고 ice bath에서 15분간 식혔다. 그 후 이소아밀알콜(isoamyl alcohol)과 피리딘(pyridine) 혼합 용액을 6ml 가한 후 교반하고 원심분리한 후 상층액을 96-웰(well) 플레이트에 넣고 Elisa(iMark Microplate Reader, BIO-RAD, USA)를 이용해 파장 550nm에서 흡광도를 측정하였다.

<2-2> 형광 측정 결과와의 비교

형광에 의한 산패도 측정과 마찬가지로 25℃, 50℃, 90℃의 저장온도에서 20일 동안 저장하며 TBA 테스트로 산패도를 측정하였다. 25℃의 저장온도에서는 형광 측정 결과와 같은 패턴을 나타내었는데, 초기 산패값에 영향을 받지 않고 꾸준히 진행되는 패턴을 볼 수 있었다(도 3). 50℃에서도 마찬가지로 20일 동안 큰 변화 없이 진행되는 것을 확인하였다(도 3). 이 또한 형광 측정과 같은 패턴으로, 50℃까지는 초기 산패에 크게 영향을 받지 않는다는 것을 알 수 있었다. 반면에, 90℃에서는 0일차에서부터 꾸준히 증가하는 패턴을 보이다가 10일째를 기준으로 유의성 있게 감소하고 다시 증가하였다 감소하는 패턴을 보였다(도 3). 후반부에 감소하는 패턴을 나타낸 것은 형광 측정 결과와 일치하지 않았는데, 이는 Liang(2000)의 논문에서 알 수 있듯이 TBA 값이 산패의 최고점에 도달한 후에는 올레산(oleic acid)과 리놀산(linoleic acid)의 영향으로 인해 감소하기 때문인 것으로 생각된다. 일반적인 경우 산화가 진행된 후에 산패도가 감소할 수는 없다.

<실시예 3>

산가(acid value) 테스트에 의한 산패도 측정

<3-1> 산가( acid value ) 테스트 방법

산가 측정은 각 저장기간 별 시료로부터 헥산을 이용하여 기름을 추출하고, 추출한 기름을 소량 정량하여 95% 에탄올, 디에틸 에테르(diethyl ether) 혼합용액에 녹인 후, 1% 페놀프탈레인 지시약을 첨가한 뒤 0.1N KOH 용액으로 붉은색을 나타낼 때까지 적정한 뒤, 아래 식을 사용하여 산가를 계산하는 방법으로 수행하였다.

<3-2> 형광 측정 및 TBA 테스트 결과와의 비교

25℃ 저장에서는 다른 실험방법과 같이 증가하거나 감소하지 않고 초기값과 유의차 없이 진행되는 모습을 볼 수 있었다. 이 패턴은 Lee, et al.(Lee YH, Kum JS, Ahn YS, Kim WJ. 2001. Effect of Packaging Material and Oxygen Absorbant on Quality Properties of Yukwa. Korean Journal of Food Science And Technology. Vol33. 6: 728-736)의 논문에서 실험한 유과를 25℃에서 저장한 실험과 같은 패턴이었다. 위 결과로부터 25℃에서는 20일 저장한 대두 분말에서 산패가 진행되지 않는다는 것을 알 수 있었다. 반면에, 90℃에서는 0일차에서부터 20일차까지 꾸준히 증가하는 패턴을 보였다. 초기 값보다 8배가 증가하는 모습을 보였다. 이러한 패턴은 Lee, et al.(Lee YS, Jung HO, Lee CO. 2003. Quality Characteristics of Yukwa Fried with Palm Oil during Storage. Vol19. 1: 60-64)과 Liang(2000)의 논문에서 발표한 패턴과 유사한 모습이었다. 이로부터 저장온도가 90℃일 때에는 산패 속도가 증가한다는 것을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (10)

1. 클로로포름 및 메탄올을 혼합시킨 용액에 대두 분말 시료를 넣어 반응물을 제조하는 단계;
   상기 반응물을 거르는 단계;
   상기 걸러진 용액을 원심분리시켜 상층액을 얻는 단계; 및
   상기 상층액의 형광을 측정하는 단계를 포함하는 대두 분말의 산패도(rancidity) 측정방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 클로로포름 및 메탄올을 혼합시킨 용액의 클로로포름 : 메탄올 혼합비율은 2 : 1(v/v)인 것을 특징으로 하는 대두 분말의 산패도 측정방법.
3. 제1항에 있어서,
   상기 반응물을 거르는 단계는 주사기 및 주사기 필터를 사용하는 것을 특징으로 하는 대두 분말의 산패도 측정방법.
4. 제1항에 있어서,
   상기 원심분리는 상기 걸러진 용액에 증류수를 혼합시킨 용액에 대해 1000×g의 속도로 10분간 이루어지는 것을 특징으로 하는 대두 분말의 산패도 측정방법.
5. 제1항에 있어서,
   상기 형광을 측정하는 단계는 형광광도계(fluorescence spectrometer)를 사용하며, 측정 조건은 방출(emission) 400~500nm, 여기(excitation) 360nm, 슬릿(slit) 5.0mm 및 측정간격 600ms인 것을 특징으로 하는 대두 분말의 산패도 측정방법.
6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서,
   상기 대두 분말 시료의 평균 입자크기는 40㎛ 이하인 것을 특징으로 하는 대두 분말의 산패도 측정방법.
7. 클로로포름 및 메탄올의 혼합용액, 주사기 및 주사기 필터를 포함하는 대두 분말의 산패도 측정용 키트.
8. 대상물질을 대두 분말 시료에 처리하는 단계;
   상기 대두 분말을 클로로포름 및 메탄올 혼합용액에 넣어 반응물을 제조하는 단계;
   상기 반응물을 정제한 용액으로부터 형광을 측정하는 단계; 및
   상기 측정된 형광을 대조군의 것과 비교하는 단계를 포함하는 지방 산패 방지물질의 스크리닝 방법.
9. 제8항에 있어서,
   상기 반응물을 정제한 용액은 상기 반응물을 주사기 필터로 거른 용액을 원심분리시킨 상층액인 것을 특징으로 하는 지방 산패 방지물질의 스크리닝 방법.
10. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    상기 대상물질을 대두 분말 시료에 처리한 후 상기 시료를 90℃~100℃에서 10일 이상 저장하는 단계를 추가로 포함하여, 상기 10일 이상 저장시킨 시료를 클로로포름 및 메탄올 혼합용액에 넣는 것을 특징으로 하는 지방 산패 방지물질의 스크리닝 방법.

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