KR20130074621A - Repeat usable electrochemical immunosensor using multimeric protein g - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 반복 사용이 가능한 전기화학 면역 센서에 대한 것이다.The present invention relates to an electrochemical immune sensor that can be used repeatedly.
항원-항체 반응을 이용한 면역센서, 진단키트 등의 응용 분야에서 대부분의 항체는 다양한 고체 물질 표면에 고정화된 형태로 사용된다. In applications such as immunosensors and diagnostic kits using antigen-antibody responses, most antibodies are used in immobilized forms on various solid material surfaces.
항체의 고유한 결합 특성 및 활성을 손상시키지 않으면서 항체의 활성 부위가 표면에 잘 노출될 수 있도록 다양한 고체기판에 항체를 단분자막 형태 및 배향성을 조절하면서 고정화시키는 기술은 칩이나 센서의 검출 감도와 직접적으로 연결되므로 매우 중요하다. 특히 항체에서 항원에 대한 결합 부위는 Fab 영역에 존재하기 때문에 항체의 Fab 영역을 외부로 노출시키도록 항체를 고정화시키는 것은 항체의 성능과 감도를 높이는데 매우 중요하며 Fab 영역이 노출되지 않은 항체는 항체의 고정화에도 불구하고 그 기능을 상실하게 되어 고정화 양과 상관없이 센서 및 검출에는 효과가 없다. 결국 항체의 고정화시 고정화양만이 중요한 것이 아니라 배향성이 확보된 고정화가 중요한 요소가 되는 것이다.The technique of immobilizing the antibody on various solid substrates while controlling the monomolecular layer morphology and orientation so that the active site of the antibody is well exposed to the surface without compromising the inherent binding properties and activity of the antibody is directly related to the detection sensitivity of the chip or sensor. It is very important because it leads to. In particular, since the binding site for the antigen in the antibody is present in the Fab region, immobilizing the antibody to expose the Fab region of the antibody to the outside is very important for improving the performance and sensitivity of the antibody. In spite of the immobilization, the sensor loses its function and thus is ineffective for the sensor and detection regardless of the immobilization amount. After all, not only the amount of immobilization is important when immobilizing the antibody, but also the immobilization of the alignment is an important factor.
또 다른 고려할 요소는, 항체의 단분자막으로부터 항원-항체 반응을 감도 높게 측정하기 위해서는 항원-항체간의 결합 반응이 입체제한(steric hindrance)을 최소로 하는 조건에서 높은 수준으로 이루어져야 한다는 것이다. 입체 제한은 주로 고체 표면에 고정화된 항체분자의 밀도에 의해 발생하며 밀도가 높은 경우 항원 결합 효율이 심각하게 떨어지게 된다. Another factor to consider is that in order to measure antigen-antibody responses sensitively from monomolecular membranes of antibodies, antigen-antibody binding reactions must be at high levels under conditions of minimal steric hindrance. The steric limitation is mainly caused by the density of the antibody molecules immobilized on the solid surface, and the high density results in a severe decrease in antigen binding efficiency.
일반적으로 입체제한을 줄이기 위하여 스트렙타비딘-비오틴(streptavidin-biotin) 결합이 널리 이용되는데, 이는 배향성 고정화를 할 수 있으나, 트렙타비딘 및 비오틴이 고가의 시료라서 대량 생산 및 상업화이 곤란한 단점이 있다. 한편 항체의 Fc 영역에 특이적으로 결합하는 단백질 A 또는 단백질 G를 이용하여 항체의 배향성을 확보하는 방법도 있는데(Boyle and Reis, Biotech. 5:697, 1987; Hoffman and O'Shannessay, J. Immunol. Methods, 112:113, 1988), 항체결합 단백질을 고체기판에 고정하는 과정에서 단백질의 배향성 조절이 어려워 항체의 고정 효율을 최적화하는데 문제가 되어 왔다.In general, streptavidin-biotin bonds are widely used to reduce steric limitation, which can be used for orientation immobilization, but since treptavidin and biotin are expensive samples, mass production and commercialization are difficult. On the other hand, there is also a method for securing the orientation of the antibody using a protein A or protein G that specifically binds to the Fc region of the antibody (Boyle and Reis, Biotech. 5: 697, 1987; Hoffman and O'Shannessay, J. Immunol Methods, 112: 113, 1988), it is difficult to control the alignment of proteins in the process of immobilizing the antibody-binding protein on a solid substrate has been a problem to optimize the fixing efficiency of the antibody.
상기와 같은 검출 효율 문제 외에도, 면역 센서는 1회 사용 후 폐기하는 것이 일반적인데, 현재 많이 사용되는 전기화학 바이오센서의 경우 필연적으로 전극이 사용되는데 많이 활용되고 있는 금 전극 기판의 경우 고가이고 한번의 실험으로 항체에 항원이 결합하고 나면 더 이상 항체를 사용할 수 없기 때문에 고가의 전극을 폐기해야 하는 점을 감안할 때 반복 사용이 가능한 면역 센서의 필요성이 대두되고 있다.In addition to the problem of detection efficiency as described above, it is common to discard the immune sensor after one use. In the case of electrochemical biosensors, which are widely used today, electrodes are inevitably used for gold electrodes, which are expensive and once Experiments have raised the need for an immune sensor that can be used repeatedly, since expensive antibodies must be discarded because the antibody can no longer be used after the antigen has been bound to the antibody.
본 발명의 목적은 배향성, 입체 제한 등이 개선될 뿐 아니라 반복 사용이 가능한 전기화학 면역 센서칩을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide an electrochemical immune sensor chip that can be used repeatedly as well as improved orientation, steric limitation, and the like.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 단백질 G 다합체를 포함하는 전기화학 면역 센서칩을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides an electrochemical immune sensor chip comprising a protein G multimer.
또한 본 발명은 단백질 G 다합체를 포함하는 전기화학 면역 센서칩을 이용한 검출 방법을 제공한다.The present invention also provides a detection method using an electrochemical immune sensor chip comprising a protein G multimer.
본 발명의 면역 센서칩은 단백질 G 다합체를 이용함으로써 항체 결합부위의 3차원 구조를 형성하여 항체 결합에 있어 가장 접근성이 높은 구조를 제공하며, 이로써 항체 고정화가 증강되고 피검사체의 결합을 위한 적절한 항체 배향성을 확보하여, 검출 민감도가 향상된 특징이 있다. 또한 본 발명의 면역 센서칩은 시험 물질을 검출한 후, 시험 물질과 결합된 항체를 세척하여 새로운 항체를 고정화하여 전기화학 면역 센서칩을 반복 사용하는 것이 가능하다.The immune sensor chip of the present invention forms the three-dimensional structure of the antibody binding site by using the protein G multimer to provide the most accessible structure for antibody binding, thereby enhancing antibody immobilization and appropriate for binding of the subject. By securing the antibody orientation, the detection sensitivity is improved. In addition, the immunosensor chip of the present invention can detect the test substance, wash the antibody bound to the test substance, and immobilize new antibodies to repeat the use of the electrochemical immune sensor chip.
도 1은 단백질 G 다합체를 전극에 고정화시키는 과정을 도시한 것이다.
도 2는 단백질 G 다합체, 제 1 항체(마우스 유래 항-E.coli 항체), 시험 물질 및 HRP 표지된 표지 항체(염소 유래 항-E.coli 항체)를 이용하여, 시험 물질을 검출하는 방법을 나타낸다.
도 3은 단백질 G 다합체를 이용한 면역 센서를 반복 사용하는 원리를 나타낸다.
도 4는 합성된 단백질 G 모노머, 다이머 및 트리머를 나타내며(a), 아울러 이들의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여준다(b): 단백질 G 모노머(1), 다이머(2), 트리머(3).
도 5는 단백질 G 다합체의 종류에 따른 항체 결합능을 나타낸다.
도 6은 단백질 G 다합체의 종류에 따른 검출 민감도를 나타낸다.
도 7은 단백질 G 다합체의 종류에 따른 면역 센서의 반복 사용 가능성을 나타낸다.1 illustrates a process of immobilizing a protein G multimer on an electrode.
2 is a method for detecting a test substance using a protein G multimer, a first antibody (mouse-derived anti-E.coli antibody), a test substance and an HRP labeled label antibody (goat-derived anti-E.coli antibody) Indicates.
3 shows the principle of repeated use of an immune sensor using protein G multimers.
Figure 4 shows the synthesized protein G monomers, dimers and trimers (a), and also shows the results of their SDS-PAGE analysis (b): protein G monomers (1), dimers (2), trimers (3).
Figure 5 shows the antibody binding capacity according to the type of protein G multimer.
6 shows the detection sensitivity according to the type of protein G multimer.
7 shows the repeatability of using an immune sensor according to the type of protein G multimer.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
Advantages and features of the present invention and methods of achieving them will become apparent with reference to the embodiments described in detail below. It should be understood, however, that the invention is not limited to the disclosed embodiments, but is capable of many different forms and should not be construed as limited to the embodiments set forth herein. Rather, these embodiments are provided so that this disclosure will be thorough and complete, To fully disclose the scope of the invention to those skilled in the art, and the invention is only defined by the scope of the claims.
본 발명은 단백질 G 다합체를 포함하는 전기화학 면역 센서를 제공한다.
The present invention provides an electrochemical immune sensor comprising a protein G multimer.
본 발명은 또한,The present invention also relates to
단백질 G 다합체에 제 1 항체를 결합시키는 단계;Binding the first antibody to the Protein G multimer;
상기 단백질 G 다합체-제 1 항체의 복합체에 시험 물질을 가하는 단계;및Adding a test substance to the complex of protein G multimer-first antibody; and
상기 시험 물질과 제 1 항체의 결합 여부를 검출하는 단계를 포함하는 검출 방법을 제공한다.
It provides a detection method comprising the step of detecting the binding of the test substance and the first antibody.
본 발명은 또한,The present invention also relates to
단백질 G 다합체에 제 1 항체를 결합시키는 단계;Binding the first antibody to the Protein G multimer;
상기 단백질 G 다합체-제 1 항체의 복합체에 시험 물질을 가하는 단계;Adding a test substance to the complex of protein G multimer-first antibody;
상기 시험 물질과 제 1 항체의 결합 여부를 검출하는 단계; Detecting whether the test substance binds to the first antibody;
상기 단백질 G 다합체-제 1항체-시험 물질의 복합체에 항체 제거제를 가하는 단계;및Adding an antibody scavenger to the complex of protein G multimer-antibody-testing agent; and
상기 단백질 G 다합체에 제 2 항체를 결합시키는 단계를 포함하는 검출 방법을 제공한다.
It provides a detection method comprising the step of binding a second antibody to the protein G multimer.
단백질 G Protein G 다합체Multimer
단백질 G 다합체는 복수 개의 단백질 G 모노머가 연결된 것이다. 바람직하게는 상기 단백질 G 모노머는 링커에 의하여 서로 연결된다. 상기 링커는 단백질 모노머를 연결하는데 사용되는 일반적인 링커면 제한없이 사용할 수 있으며, 예컨대, 상기 링커는 flexible한 (GGGGS)3 링커일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.Protein G multimers are those in which a plurality of protein G monomers are linked. Preferably the protein G monomers are linked to each other by a linker. The linker may be used without limitation as long as it is a general linker used to link protein monomers. For example, the linker may be a flexible (GGGGS) 3 linker, but is not limited thereto.
상기 단백질 G 다합체는 2~10개의 모노머를 포함하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 2~5 개의 모노머를 포함한다. 가장 바람직하게는 상기 단백질 G 다합체는 다이머 또는 트리머이나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자는 시험 물질, 항체 등의 종류에 따라 적절한 개수의 모노머를 이용하여 단백질 G 다합체를 제조할 수 있을 것이다.The protein G multimer preferably contains 2 to 10 monomers, more preferably 2 to 5 monomers. Most preferably, the protein G multimer is a dimer or trimer, but is not limited thereto. Those skilled in the art will be able to prepare a protein G multimer using an appropriate number of monomers according to the type of test substance, antibody, and the like.
본 발명의 단백질 G 다합체는 단백질 G 다합체-커플링된 금 전극칩의 형태로 사용하는 것이 바람직하다.
The protein G multimer of the present invention is preferably used in the form of a protein G multimer-coupled gold electrode chip.
전극칩Electrode chip
본 발명의 전극칩은 면역 센서에 사용되는 일반적인 전극칩이면 된다. 예컨대, 본 발명의 전극칩은 금 전극칩, 탄소 전극칩 등이 될 수 있으며, 그래핀을 이용할 수 있다. 그러나 이에 제한되는 것은 아니며 당업자는 목적 및 조건에 따라 적절한 전극칩을 이용할 수 있을 것이다.
The electrode chip of this invention should just be a general electrode chip used for an immune sensor. For example, the electrode chip of the present invention may be a gold electrode chip, a carbon electrode chip, or the like, and may use graphene. However, the present invention is not limited thereto, and a person skilled in the art will be able to use an appropriate electrode chip according to the purpose and condition.
본 발명의 전극칩은 세라믹 기판 위에 전극이 스크린 프린티드 되어 있는 형태로써, 효과적인 반응을 위해서 시험 물질과 결합하는 반응물(예컨대 단백질 G 다합체-항체 복합체)의 부피가 1~5 μl인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. In the electrode chip of the present invention, the electrode is screen printed on the ceramic substrate, and for the effective reaction, the volume of the reactant (eg, protein G multimer-antibody complex) that binds to the test substance is preferably 1 to 5 μl. It is not limited to this.
금전극칩을 이용하는 경우, 본 발명의 금전극칩은 작업 전극과 상대전극은 금으로 구성되어 있고 기준전극은 은으로 구성되어 있는 것이 바람직하다. 세라믹 기판은 가로 33 mm, 세로 10 mm 높이 0.5 mm 의 규격을 가질 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
In the case of using the gold electrode chip, the gold electrode chip of the present invention preferably comprises the working electrode and the counter electrode of gold and the reference electrode of silver. The ceramic substrate may have dimensions of 33 mm in width and 10 mm in height, but is not limited thereto.
단백질 G Protein G 다합체Multimer -- 커플링된Coupled 전극칩Electrode chip
본 발명의 단백질 G 다합체는 단백질 G 다합체-커플링된 전극칩의 형태로 사용하는 것이 바람직하다. 이 때, 단백질 G 다합체와 전극칩의 커플링 방법은 당업자가 적절히 선택할 수 있으며, 단백질 G 다합체의 항체 결합능 및 전극칩의 기판 부착력을 유지한 채 이들이 충분한 결합력을 갖고 커플링되는 한, 커플링 방법이 특별히 제한되는 것은 아니다(도 1).
The protein G multimer of the present invention is preferably used in the form of a protein G multimer-coupled electrode chip. At this time, the coupling method of the protein G multimer and the electrode chip can be appropriately selected by those skilled in the art, and as long as they are coupled with sufficient binding force while maintaining the antibody binding ability of the protein G multimer and the substrate adhesion of the electrode chip, The ring method is not particularly limited (FIG. 1).
예컨대, 단백질 G 다합체의 말단의 시스테인 그룹의 설퍼히드릴기(sulfhydryl group)을 환원시키고, 상기 환원된 설퍼히드릴기, 즉 설퍼기와 금의 반 공유결합을 이용하여, 상기 단백질 G 다합체를 금 전극칩 표면에 커플링시킬 수 있다.
For example, the sulfhydryl group of the cysteine group at the end of the protein G multimer is reduced, and the reduced sulfhydryl group, ie, the semicovalent bond of the sulfur and the gold, is used to make the protein G multimer. May be coupled to the surface of the gold electrode chip.
상기 단백질 G 다합체의 말단의 시스테인 그룹의 설퍼히드릴기의 환원은, 설퍼히드릴 기가 반응이 가능하도록 하는 것이다. 예컨대, 상기 설퍼히드릴기의 환원은 환원제를 처리하여 수행할 수 있으며, 이 때 환원제로 dl-dithiothreitol (DTT)를 이용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
The reduction of the sulfhydryl group of the cysteine group at the terminal of the protein G multimer is such that the sulfhydryl group can react. For example, the reduction of the sulfhydryl group may be performed by treating a reducing agent, in which case dl-dithiothreitol (DTT) may be used as the reducing agent, but is not limited thereto.
참고로, 상기 금 전극칩이란, 작업 전극 및/또는 상대 전극이 금으로 된 것을 가리킨다. 예컨대, 상기 금 전극칩은 작업 전극 및 상대 전극은 금으로 되어 있고, 기준 전극은 은으로 되어 있는 전극칩 등이 될 수 있다.
For reference, the gold electrode chip means that the working electrode and / or the counter electrode is made of gold. For example, the gold electrode chip may be a working electrode and a counter electrode of gold, and the reference electrode may be an electrode chip of silver.
상기 금 전극칩 표면에 환원된 설퍼기는 반 공유결합 반응을 통해서 별다른 전처리 과정이 필요없이 고정화 될 수 있다. The reduced sulfur group on the surface of the gold electrode chip can be immobilized without the need for a pretreatment process through a semi-covalent reaction.
한편, 단백질 G 다합체를 전극칩에 고정하기 전, 먼저 전극칩 표면의 이물질을 제거하는 공정을 수행할 수도 있다. 상기 이물질 제거 공정은 전극칩에 산처리 등을 하여 수행될 수 있는데, 이때 사용하는 산 용액은 염산 혹은 황산이 사용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
Meanwhile, before fixing the protein G multimer to the electrode chip, a process of removing foreign substances on the surface of the electrode chip may be performed. The foreign material removal process may be performed by performing an acid treatment on the electrode chip, but the acid solution used may be hydrochloric acid or sulfuric acid, but is not limited thereto.
단백질 G Protein G 다합체Multimer -- 커플링된Coupled 금 gold 전극칩의Electrode chip 제조예Manufacturing example 1 One
산 처리된 금 전극칩 상에 환원제를 첨가하여 단백질G 다합체의 시스테인 잔기의 설퍼하이드릴 그룹을 환원시킨 단백질 G 다합체 용액을 금 전극칩 상에 떨어뜨리서 37℃에서 반응 시킨 후 버퍼 용액을 사용하여 금 전극칩에 붙지 않은 단백질 G 다합체를 세척한다.
The reducing agent was added to the acid-treated gold electrode chip to reduce the sulfhydryl group of the cysteine residue of the protein G multimer. The protein G multimer solution was dropped on the gold electrode chip and reacted at 37 ° C. To clean protein G multimers that do not adhere to the gold electrode chip.
전기화학 면역 센서Electrochemical immune sensor
본 발명의 전기화학 면역 센서는 당업계에서 일반적으로 사용되는 전기화학 면역 센서를 가리킨다. 즉, 본 발명의 전기화학 면역 센서는 시험 물질에 대한 인식능을 갖는 생물학적 수용체가 생물학적 상호작용 또는 인식 반응을 전기화학 신호로 변환함으로써 분석하고자 하는 물질을 선택적으로 감지할 수 있는 소자로, 바이오 칩을 포함한다. The electrochemical immune sensor of the present invention refers to an electrochemical immune sensor commonly used in the art. That is, the electrochemical immune sensor of the present invention is a device capable of selectively detecting a substance to be analyzed by converting a biological interaction or recognition reaction into an electrochemical signal by a biological receptor having an ability to recognize a test substance. It includes.
예컨대 본 발명의 전기화학 면역 센서는 면역 센서일 수 있으며, 항체-항원 반응을 이용하여 인식되는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 한편, 본 발명의 전기화학 면역 센서는 전기적 신호를 전기적 측정 방법을 통하여 인식하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.For example, the electrochemical immune sensor of the present invention may be an immune sensor, but may be recognized using an antibody-antigen response, but is not limited thereto. On the other hand, the electrochemical immune sensor of the present invention may be to recognize the electrical signal through an electrical measurement method, but is not limited thereto.
본 발명의 전기화학 면역 센서는 단백질 G 다합체 커플링된 전극칩 및 항체를 포함할 수 있다. 상기 항체는 본 발명의 전기화학 면역 센서의 사용 횟수에 따라 제 1 항체, 제 2 항체 등 제 n 항체가 될 수 있다. 본 발명의 전기화학 면역 센서는 단백질 G 다합체를 5~300 ng/㎖ 포함할 수 있으며, 바람직하게는 5~200 ng/㎖ 포함할 수 있고, 더욱 바람직하게는 5~100 ng/㎖ 포함할 수 있다. 그러나 이는 단백질 G 다합체의 사용량 대비 높은 검출 효율을 갖는 단백질 G 복합체의 농도이다. 그러므로 이보다 높은 농도를 갖는 경우 비록 사용량 대비 검출 효율 자체는 낮아지더라도 검출 효율의 절대치는 증가한다는 것은 자명하므로, 상기 범위를 벗어난다고 하여 본 발명의 범위를 벗어나는 것은 아니다.
The electrochemical immune sensor of the present invention may comprise a protein G multimer coupled electrode chip and an antibody. The antibody may be an n-th antibody, such as a first antibody or a second antibody, depending on the number of times the electrochemical immune sensor of the present invention is used. Electrochemical immune sensor of the present invention may comprise a
반복 사용Repeat use
본 발명의 전기화학 면역 센서는 반복 사용이 가능하다. 상기 "반복 사용"이란 본 발명의 면역 센서에 시험 물질을 가하여 시험 물질 내 특정 물질을 검출한 후, 상기 전기화학 면역 센서를 또다른 시험 물질의 검출에 재사용할 수 있는 것을 가리킨다. 상기 반복 사용은 본 발명의 전기화학 면역 센서를 2 회 이상 복수 회 사용하는 것이다.The electrochemical immune sensor of the present invention can be used repeatedly. The "repeated use" refers to the fact that the electrochemical immune sensor can be reused for the detection of another test substance after adding a test substance to the immune sensor of the present invention to detect a specific substance in the test substance. The repeated use is the use of the electrochemical immune sensor of the present invention two or more times.
예컨대, 본 발명의 전기화학 면역 센서는 기판에 부착된 단백질 G 다합체-커플링된 금 전극칩에 제 1 항체를 결합하고, 여기에 시험 물질을 가하여 상기 제 1 항체와 시험 물질, 정확히는 시험 물질 내 특정 물질의 결합을 인식함으로써, 시험 물질 내 특정 물질을 검출할 수 있다(1회 사용). 그 후 항체 제거제를 처리하여, 제 1 항체-시험 물질 복합체를 단백질 G 다합체로부터 분리하면, 금 전극칩에 부착된 단백질 G 다합체만 남게 된다. 이때 단백질 G 다합체는 제 1 항체가 분리된 상태이다. 여기에 제 2 항체를 처리하여 단백질 G 다합체에 결합시키고, 또 다른 시험 물질을 처리하는 식(2회 사용)으로 본 발명의 전기화학 면역 센서를 반복 사용하게 된다.For example, the electrochemical immune sensor of the present invention binds a first antibody to a protein G multimer-coupled gold electrode chip attached to a substrate, and adds a test substance to the first antibody and the test substance, precisely a test substance. By recognizing the binding of a specific substance in it, it is possible to detect the specific substance in the test substance (use once). The antibody scavenger is then treated to separate the first antibody-test material complex from the protein G multimer, leaving only the protein G multimer attached to the gold electrode chip. In this case, the protein G multimer is in a state in which the first antibody is separated. The second antibody is treated to bind to the protein G multimer, and another electrochemical immunosensor of the present invention is repeatedly used in a manner of treating another test substance (two times).
본 발명에서 제 1 항체는 본 발명의 면역 센서를 첫 번째 사용할 때 단백질 G 다합체에 결합시키는 항체를 가리키고, 제 2 항체는 본 발명의 면역 센서를 두 번째 사용할 때 단백질 G 다합체에 결합시키는 항체를 가리킨다. 같은 식으로 본 발명의 면역 센서를 n번째 사용하는 경우, 단백질 G 다합체에 결합시키는 항체는 제 n 항체라 부를 수 있을 것이다. 이때, 상기 n은 1, 2, 3, 4, 5,,, 와 같이, 1 이상의 임의의 정수이다.
In the present invention, the first antibody refers to an antibody that binds to the protein G multimer when using the immune sensor of the present invention for the first time, and the second antibody refers to an antibody that binds to the protein G multimer when the immune sensor of the present invention is used for the second time. Point to. In the same way, when using the immune sensor of the present invention for the nth time, the antibody that binds to the protein G multimer may be referred to as the nth antibody. In this case, n is an arbitrary integer of 1 or more, such as 1, 2, 3, 4, 5,.
항체Antibody
본 발명의 항체는 단백질 G 다합체에 결합할 수 있는 항체이면 되고 특별히 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 단백질 G 다합체-커플링된 전극칩은 단백질 G 다합체를 이용하여 항체에 결합하게 된다.
The antibody of the present invention may be any antibody capable of binding to a protein G multimer, and is not particularly limited. The protein G multimer-coupled electrode chip of the present invention is bound to the antibody using the protein G multimer.
상기 항체는 제 1 항체 및 제 2 항체 등 제 n 항체에 모두 해당된다. 예컨대, 본 발명의 항체는 Rabbit IgG, Hamster IgG, Guinea Pig IgG, Bovine IgG, Sheep IgG, Goat IgG, Pig IgG, Chicken IgG, Mouse IgG 으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
The said antibody corresponds to all nth antibodies, such as a 1st antibody and a 2nd antibody. For example, the antibody of the present invention may be one or more selected from the group consisting of Rabbit IgG, Hamster IgG, Guinea Pig IgG, Bovine IgG, Sheep IgG, Goat IgG, Pig IgG, Chicken IgG, Mouse IgG, but is not limited thereto.
항체 제거제Antibody remover
본 발명의 항체 제거제는 전기화학 면역 센서의 반복 사용을 위하여 사용된다. 본 발명의 항체 제거제를 처리함으로써, 항체가 그것이 결합되어 있던 단백질 G 다합체, 즉, 단백질 G 다합체-커플링된 전극칩으로부터 분리된다. 그러나 본 발명의 항체 제거제는 단백질 G 다합체와 전극칩간의 부착은 파괴하지 않는다.Antibody scavengers of the invention are used for repeated use of electrochemical immune sensors. By treating the antibody scavenger of the present invention, the antibody is separated from the protein G multimer to which it is bound, ie, the protein G multimer-coupled electrode chip. However, the antibody removing agent of the present invention does not destroy the adhesion between the protein G multimer and the electrode chip.
이러한 특성, 즉 항체의 분리능을 가지면서도 단백질 G-다합체-커플링된 전극칩과의 부착을 파괴하지 않는 특성을 갖는 항체 제거제라면 제한 없이 본 발명의 항체 제거제로 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 항체 제거제는 글라이신-산(acid)일 수 있으며, 바람직하게는 글라이신-HCl일 수 있고, pH 1.0~3.0일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.Any antibody scavenger having such properties, that is, a scavenger of the antibody, but which does not destroy adhesion with the protein G-multimer-coupled electrode chip can be used as the antibody scavenger of the present invention without limitation. For example, the antibody scavenger of the present invention may be glycine-acid, preferably glycine-HCl, and may be pH 1.0-3.0, but is not limited thereto.
예컨대, 제 n 항체가 결합된 단백질 G 다합체 전극 복합체에 0.4M glycine-HCl buffer (pH 2.2)를 100 ul를 처리한다. 그리고 반응 시간 10분 후 10 mM PBS (pH7.4)로 washing한 후 제 n+1 항체를 고정화 시킬 수 있다. 이때, 상기 n은 1, 2, 3, 4, 5,,, 와 같이, 1 이상의 임의의 정수이다.
For example, 100 ul of 0.4M glycine-HCl buffer (pH 2.2) is treated to the protein G multimer electrode complex to which the n-th antibody is bound. After 10 minutes of reaction time, the cells were washed with 10 mM PBS (pH 7.4) and then immobilized with the n + 1 antibody. In this case, n is an arbitrary integer of 1 or more, such as 1, 2, 3, 4, 5,.
시험 물질Test substance
본 발명의 시험 물질은 전기화학 면역 센서로 검출하려는 특정 물질을 포함하거나 포함하고 있을 것으로 의심되는 피검 물질을 가리킨다. 본 발명의 시험 물질은 항원을 포함할 수 있다.
The test substance of the present invention refers to a test substance that contains or suspects to contain a particular substance to be detected by an electrochemical immune sensor. The test substance of the present invention may comprise an antigen.
<재료 및 방법>≪ Materials and methods >
재료material
단일클론 항-E.coli IgG, 염소 항-E.coli IgG은 보레다 바이오테크(Boreda Biotech Co., Ltd (Gyeonggi, Rep. Korea))로부터 구입하였다. the Zeba desalt spin column, BCATM 단백질 검사 키트 및 alkaline phosphotase (ALP) 항체 표지 키트는 모두 Thermo Scientific Inc. (MA, USA)로부터 구입하였다. dl-dithiothreitol (DTT)는 GenDEPOT Inc. (TX, USA)로부터 구입하였다. Dimethylsulfoxide (DMSO), phosphate buffered saline (PBS), sodium monobasic monohydrate, sodium phosphate dibasic, dodecyl sulfate sodium salt, Tween-20, glycine, bromophenol blue sodium salt 및 hydrochloric acid는 모두 Sigma-Aldrich(MO, USA)로부터 구입하였다. Sodium chloride는 Junsei Chemical Co., Ltd. (Tokyo, Japan)로부터 구입하였다.
Monoclonal anti-E.coli IgG, goat anti-E.coli IgG was purchased from Boreda Biotech Co., Ltd (Gyeonggi, Rep. Korea). The Zeba desalt spin column, BCA TM protein test kit and alkaline phosphotase (ALP) antibody labeling kit are all available from Thermo Scientific Inc. Purchased from (MA, USA). dl-dithiothreitol (DTT) is produced by GenDEPOT Inc. (TX, USA). Dimethylsulfoxide (DMSO), phosphate buffered saline (PBS), sodium monobasic monohydrate, sodium phosphate dibasic, dodecyl sulfate sodium salt, Tween-20, glycine, bromophenol blue sodium salt and hydrochloric acid are all purchased from Sigma-Aldrich (MO, USA) It was. Sodium chloride is Junsei Chemical Co., Ltd. It was purchased from (Tokyo, Japan).
박테리아 균주, 플라스미드 및 성장 조건Bacterial Strains, Plasmids and Growth Conditions
본 발명에서 사용한 박테리아 균주 및 플라스미드는 표 1과 같다. 플라프미드 유지를 위하여 카나미신(kanamycin) 50 ㎍/㎖를 포함하는 Luria-Bertani 배지에서 Streptococcus dysgalactiae 및 E. coli BL21(DE3)를 37 ℃ 조건 하 배양하였다. UV/Vis spectrophotometer (Jasco Co., Japan)를 이용하여 600nm에서 optical density를 측정함으로써 세포 성장을 모니터링하였다.
Bacteria strains and plasmids used in the present invention are shown in Table 1. Streptococcus dysgalactiae and E. coli BL21 (DE3) were incubated at 37 ° C. in Luria-Bertani medium containing 50 μg / ml of kanamycin to maintain plasmid. Cell growth was monitored by measuring the optical density at 600 nm using a UV / Vis spectrophotometer (Jasco Co., Japan).
시스테인-Cysteine 태그된Tagged 폴리머Polymer 다합체Multimer 단백질 G의 발현 및 정제 Expression and Purification of Protein G
G-spin Genomic DNA extraction kit (Intron Biotech Inc., Rep. Korea)를 이용하여 S. dysgalactiae로부터 genomic DNA를 제조하였다. 프라이머 쌍, PG-F:N(5'-accata tgactgacacttacaaatta-3'; NdeⅠ) 및 PG-R:BcysX(5'-acctcgagttagcatccggattcagttaccgta aaggt-3';BspEⅠ및 XhoⅠ)을 이용하여 PCR에 의하여 genomic DNA로부터 상기 단백질 G 코드 영역(spg 유전자)를 증폭하였다. 단백질 G 모노머 및 시스테인 태그 사이에 융합 단백질을 생기게 하기 위하여 상기 제한 부위를 포함시켰다. 상기 PCR 산물을 TA 클로닝 벡터, pLUG에 클로닝한 후, 그 결과 생기는 플라스미드(pLUG-PG)를 NdeI/XhoI로 자르고(digest), spg 단편을 pET-28a에 붙여(ligate) pEPG-M을 만들었다(표 1).
Genomic DNA was prepared from S. dysgalactiae using a G-spin Genomic DNA extraction kit (Intron Biotech Inc., Rep. Korea). Said from genomic DNA by PCR using primer pairs, PG-F: N (5'-accata tgactgacacttacaaatta-3 '; NdeI) and PG-R: BcysX (5'-acctcgagttagcatccggattcagttaccgta aaggt-3'; BspEI and XhoI) Protein G code region (spg gene) was amplified. The restriction site was included to create a fusion protein between the protein G monomer and the cysteine tag. The PCR product was cloned into a TA cloning vector, pLUG, and the resulting plasmid (pLUG-PG) was digested with NdeI / XhoI, and the spg fragment was bound to pET-28a to make pEPG-M ( Table 1).
다합체 단백질 G를 제조하기 위하여, 프라이머 PG-R:BcysX와 함께 PG-F:Alink(5'-ataccggtggaggcggttcaggcgg-aggtggctctggcggtggcggatcgactgacacttacaaatta-3';Age Ⅰ)를 이용하여 spa 유전자를 증폭하였다. 이들 DNA 단편들은 이후 글라이신/세린(GGGGS)3 링커를 통하여 pEPG-M 내 spg 유전자의 3' 말단에 융합되었다. 그 결과 생기는 플라스미드 pEPG-M, pEPG-D 및 pEPG-T는 모노머, 다이머 및 트리머 단백질 G를 각각 코드하며, 숙주인 E. coli BL21 내로 형질전환시켰다(transform).
To prepare multimeric protein G, the spa gene was amplified using PG-F: Alink (5'-ataccggtggaggcggttcaggcgg-aggtggctctggcggtggcggatcgactgacacttacaaatta-3 '; Age I) with primers PG-R: BcysX. These DNA fragments were then fused to the 3 'end of the spg gene in pEPG-M via a glycine / serine (GGGGS) 3 linker. The resulting plasmids pEPG-M, pEPG-D and pEPG-T encode monomer, dimer and trimer protein G, respectively, and were transformed into the host E. coli BL21.
다합체 단백질 G를 합성하기 위하여, 0.2 mM isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside(IPTG)를 이들이 600nm에서 0.6의 최적 농도에 달한 후에 가하였다. 상기 세포들을 3시간 이상 성장시킨 후, 수확하고, French press를 이용하여 파쇄하였다. 단백질의 정제는 Qiagen (Hilden, Germany)의 설명서에 따라 Ni-nitrilotriacetic acid affinity chromatography에 의하여 수행하였다.
To synthesize multimeric protein G, 0.2 mM isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) was added after they reached an optimal concentration of 0.6 at 600 nm. The cells were grown for at least 3 hours, then harvested and disrupted using the French press. Protein purification was performed by Ni-nitrilotriacetic acid affinity chromatography according to the instructions of Qiagen (Hilden, Germany).
금 gold 전극칩Electrode chip
금 전극 칩은 세라믹 기판 위에 스크린 프린팅 기법으로 금과 은을 찍어낸 것으로써 DropSens의 screen-printed gold electrode 1.6mm/ink AT를 사용하였다.
Gold electrode chips were screens printed on a ceramic substrate with gold and silver, using DropSens' screen-printed gold electrode 1.6mm / ink AT.
금 gold 전극칩Electrode chip 상 Prize 다합체Multimer 단백질 G의 커플링 Coupling of Protein G
먼저 10.91 mM dl-dithiothreitol (DTT) (Gen- DEPOT Inc., USA)을 이용하여 시스테인-태그된 단백질 G 다합체(30 μM)를 30분간 실온에서 환원시켜, sulfhydryl 그룹을 완전히 환원시켜 sulfur 그룹으로 만든다. 상기 환원된 단백질 G 다합체를 1 μl를 작업 전극에 떨어뜨리고 37℃ 조건에서 30분간 보관하였다. 이후 10 mM PBS(pH 7.4)를 사용하여 금 전극에 붙지 않은 다합체 단백질 G를 3회 세척하였다.
First, the cysteine-tagged protein G multimer (30 μM) was reduced at room temperature for 30 minutes using 10.91 mM dl-dithiothreitol (DTT) (Gen-DEPOT Inc., USA) to completely reduce the sulfhydryl group to sulfur group. Make. 1 μl of the reduced protein G multimer was dropped on the working electrode and stored at 37 ° C. for 30 minutes. Thereafter, the multimer protein G that did not adhere to the gold electrode was washed three times using 10 mM PBS (pH 7.4).
단백질 G-Protein G-
커플된Coupled
금 gold
전극칩Electrode chip
상 제 1 항체의 고정화 Immobilization of
마우스 유래 항-대장균(E.coli) IgG(제 1 항체)를 0.1% tween 20과 함께 10 mM PBS(pH 7.4) 내 200 ㎍/㎖로 용액을 준비하여 단백질 G-커플된 금 전극칩의 작업 전극에 가하였다. 상기 금 전극칩을 37℃ 조건에서 30분간 보관하였고 이후 10 mM PBS(pH 7.4)에 1% BSA (Bovine Serum Albumin)가 섞여있는 용액을 사용하여 단백질 G-커플된 금 전극칩에 붙지 않은 항체를 3회 세척하였다.
Working with protein G-coupled gold electrode chips by preparing a solution derived from mouse E. coli IgG (first antibody) at 200 μg / ml in 10 mM PBS pH 7.4 with 0.1% tween 20 Applied to the electrode. The gold electrode chip was stored at 37 ° C. for 30 minutes and then a solution containing 1% BSA (Bovine Serum Albumin) in 10 mM PBS (pH 7.4) was used to prepare an antibody that did not adhere to the protein G-coupled gold electrode chip. Wash three times.
대장균(E.Escherichia coli (E. colicoli ) 검사의 수행Performing the inspection
다양한 농도의 대장균 용액을 10mM PBS(pH 7.4)에 용해하여 준비하였다. 준비된 수용액 10 μl를 금 전극칩에 가하고, 밀봉한 후 37℃ 조건에서 2시간 동안 배양하였다. 10 mM PBS로 3 회 세척한 후, 표지 항체로 Horseradish Peroxidase (HRP) 표지된 염소 항-E.coli IgG 100 ㎍/㎖을 처리하였는데, 이는 rotary shaker에서 실온 조건 하 30분간 10 mM PBS (pH 7.4) 200 ㎕ 내에서 HRP antibody labeling kit (Thermo Scientific Inc., USA) 를 이용하여 제조한 것이다. 금 전극칩 상에서 포착된(captured) 항원과 반응한 후, 결합하지 않은 임의의 HRP-표지된 항체는 씻어내고. Autolab (Metrohm Autolab B.V., The Netherlands)를 이용하여 전류량을 측정하였다(도 2). 전류량 측정을 위해 4 mM 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine hydrochloride (TMB)를 0.06% H2O2와 0.1M KCl 이 용해되어 있는 0.05M citrate phosphate 용액에 준비하여 100 μl를 금 전극에 떨어뜨려서 측정하였다. 이때 -200mV에 대해서 600초 동안 측정한다. 측정은 Autolab Type II (Eco Chemie, The Netherlands)를 가지고 측정하며 cyclic voltammetric 측정은 50 mV s-1의 속도로 -0.3V에서 +0.8V까지 측정하였다.
E. coli solutions of varying concentrations were prepared by dissolving in 10 mM PBS pH 7.4. 10 μl of the prepared aqueous solution was added to the gold electrode chip, sealed, and incubated at 37 ° C. for 2 hours. After washing three times with 10 mM PBS, 100 μg / ml of Horseradish Peroxidase (HRP) labeled goat anti-E. Coli IgG was treated with a labeling antibody, which was treated with 10 mM PBS (pH 7.4) at room temperature under a rotary shaker for 30 minutes. ) Was prepared using an HRP antibody labeling kit (Thermo Scientific Inc., USA) in 200 μl. After reacting with the antigen captured on the gold electrode chip, any unbound HRP-labeled antibody is washed away. The amount of current was measured using Autolab (Metrohm Autolab BV, The Netherlands) (FIG. 2). To measure the amperage, 4
금 gold 전극칩Electrode chip 상의 고정화 된 제 1 항체의 탈착 및 제 2 항체의 재부착 Desorption of Immobilized First Antibody and Reattachment of Second Antibody on Top
상기 대장균 검사 수행 후 0.4M glycine-HCl buffer (pH 2.2) 100 ul 를 처리하였다. 반응시간 10분 후 10 mM PBS (pH7.4)로 세척하여 제 1항체가 분리된 것을 확인하였다. After performing the E. coli test, 100 ul of 0.4M glycine-HCl buffer (pH 2.2) was treated. After 10 minutes, the first antibody was isolated by washing with 10 mM PBS (pH 7.4).
제 2항체인 또다른 마우스 유래 항-대장균 (E.coli) IgG를 최종농도를 200㎍/㎖가 되도록 0.1% 트윈20이 들어있는 10mM PBS (pH7.4) 버퍼를 이용하여 희석한 후 상기에서 단백질 G 커플링된 금 전극칩에 1㎕ 첨가한 후, 상기 방법과 동일하게 37℃ 조건에서 30분간 보관하였고 이후 10 mM PBS(pH 7.4)에 1% BSA (Bovine Serum Albumin)가 섞여있는 용액을 사용하여 단백질 G-커플된 금 전극칩에 붙지 않은 제 2 항체를 3회 세척하였다 (도 3).
Another mouse-derived anti-E. Coli IgG, the second antibody, was diluted with 10 mM PBS (pH 7.4) buffer containing 0.1% Tween 20 to a final concentration of 200 µg / ml. 1 μl was added to the protein G-coupled gold electrode chip, and then stored at 37 ° C. for 30 minutes in the same manner as the above method. Then, a solution containing 1% BSA (Bovine Serum Albumin) in 10 mM PBS (pH 7.4) was mixed. The second antibody that did not adhere to the protein G-coupled gold electrode chip was washed three times (FIG. 3).
기계 분석 Machine analysis
단백질의 분자량은 SE-250(Amersham Biosciences, Sweden)를 이용하여 이들의 전기영동 이동성에 따라 측정되었다. 쌓이고 분리되는 젤의 젤 농도는 각각 4 % 및 12.5 %였다. 전류값 변화는 Autolab Type Ⅱ (Eco Chemie, The Netherlands)를 이용하여 측정되었다.
The molecular weights of the proteins were determined according to their electrophoretic mobility using SE-250 (Amersham Biosciences, Sweden). Gel concentrations of the stacked and separated gels were 4% and 12.5%, respectively. Current value change was measured using Autolab Type II (Eco Chemie, The Netherlands).
데이터 분석Data Analysis
모든 샘플들은 오차 분석을 위하여 3회 시험되었다.
All samples were tested three times for error analysis.
<결과><Result>
재조합 Recombination 모노머Monomer , , 다이머Dimer 및 And 트리머Trimmer 단백질 G Protein G
모노머, 다이머 및 트리머 형태의 세 가지 재조합 단백질 G이 E. coli BL21 내에서 합성되고, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)에 의하여 모노머, 다이머 및 트리머 단백질 G의 크기가 각각 16 kDa, 32 kDa and 46 kDa인 것이 확인되었다(도 4(b)). 모노머 단백질 G를 유연한 (GGGG)3 링커와 함께 반복적으로 링크함으로써 다합체 단백질 G를 구성하였다(도 4(a)). 본 발명에서 사용한 poly-gly-ser 링커는 재조합 단백질 내 불연속적인 도메인들을 분리하였으며, 이로써 항원 결합 부위의 수가 증가하였다. 같은 식으로 금 전극칩에 부착할 때, 단백질 G를 배향시키기 위하여 사용되는 단백질 G의 N-말단에 단일의 시스테인 잔기를 도입하였다.
Three recombinant proteins G in monomer, dimer and trimer form are synthesized in E. coli BL21, and monomer, dimer and trimer protein G are 16 kDa, 32, respectively, by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). It was confirmed that kDa and 46 kDa (Fig. 4 (b)). Multimeric protein G was constructed by repeatedly linking monomeric protein G with a flexible (GGGG) 3 linker (FIG. 4 (a)). The poly-gly-ser linker used in the present invention separated discrete domains in the recombinant protein, thereby increasing the number of antigen binding sites. In the same manner, when attached to the gold electrode chip, a single cysteine residue was introduced at the N-terminus of the protein G used to orient the protein G.
다합체Multimer 단백질 G를 이용한 전기화학 면역 센서의 제조 Preparation of Electrochemical Immune Sensor Using Protein G
다합체 단백질 G가 커플링 된 금 전극칩에 항-E.coli IgG를 금 전극칩 상에 고정화하였다. 단백질 G는 두개의 항체 결합 부위가 있기 때문에 모노머 단백질 G의 경우 최대 2개의 항체와 결합할 수 있고, 다이머 단백질 G의 경우 최대 4개의 항체와 결합할 수 있으며, 트리머 단백질 G의 경우 최대 6개의 항체와 결합할 수 있다. 하지만 단백질 G의 분자량과 항체의 분자량을 고려했을 때 모노머의 단백질 G에 2개의 항체가 고정화 되는 것은 구조학적으로 불가능하다. 하지만 다합체 단백질 G로 갈수록 항체 고정화 자리가 증가하여 더 많은 항체가 고정화 될 수 있으며 또한 구조적으로 보다 3차원적인 구조를 갖게 되어 항체나 후에 검체가 접근할 수 있는 물질 전달 제한성 (Mass transfer limitation)이 낮아지기 때문에 도 5와 같이 더 많은 항체의 결합과 검체 검출이 가능하다
Anti-E. Coli IgG was immobilized on the gold electrode chip to the gold electrode chip to which the multimer protein G was coupled. Because protein G has two antibody binding sites, it can bind up to two antibodies for monomeric protein G, up to four antibodies for dimer protein G, and up to six antibodies for trimer protein G. Can be combined with However, considering the molecular weight of protein G and the molecular weight of antibody, it is structurally impossible to immobilize two antibodies to protein G of monomer. However, as the multimer protein G increases, antibody immobilization sites can be increased, and more antibodies can be immobilized, and structurally more three-dimensional structures can be immobilized, resulting in mass transfer limitations that can be accessed by antibodies or later samples. Since it is lowered, more antibody binding and sample detection are possible as shown in FIG. 5.
다합체Multimer 단백질 G 기반의 전기화학 면역 센서를 이용한 증강된 E. Enhanced E. using Protein G-based Electrochemical Immune Sensors colicoli 검출 detection
샌드위치 검사는 검출 분석에 있어 일반적으로 사용되는 방법이다. 항-E.coli IgG 고정화된 금 전극칩의 민감도를 조사하기 위하여, 샌드위치 검사를 수행하였다. 다양한 농도의 E.coli 용액을 금 전극칩과 반응시키고, 세척한 후 HRP 표지된 염소 항-E.coli IgG이 이 복합체에 결합하였다. 본 반응은 고정화 된 항체에 검체인 대장균 (E.coli)가 붙게 되고 여기에 HRP가 표지된 염소 유래 항-E.coli IgG가 붙어서 HRP가 기질을 분해하면서 전자를 제거하여 검체의 농도가 증가할수록 전류값이 상쇄되어, 전류값 변화량이 증가하는 원리를 이용한다.
Sandwich testing is a commonly used method for detection analysis. To examine the sensitivity of anti-E. Coli IgG immobilized gold electrode chips, sandwich tests were performed. Various concentrations of E. coli solution were reacted with gold electrode chips, washed, and HRP labeled goat anti-E. Coli IgG bound to this complex. In this reaction, E. coli, which is a sample, is attached to the immobilized antibody, and HRP-labeled goat-derived anti-E.coli IgG is attached to it, and HRP decomposes the substrate and removes electrons. The principle that the current value is canceled and the amount of change in the current value increases is used.
단백질 G 다합체의 종류 및 E. coli 농도를 변화시켜 가면서, 샌드위치 검사를 수행한 결과, 트리머 단백질 G를 사용하여 제작한 전기화학 바이오센서의 경우 102개/ml의 농도에서도 데이터 값의 변화가 보였지만, 다이머 단백질 G와 모노머 단백질 G를 사용하여 제작된 전기화학 바이오센서의 경우 이 농도에서는 전류값의 변화가 보이지 않았다. 이는 동일 농도의 대장균을 이용하더라도 트리머 단백질 G를 사용하여 제작된 전기화학 바이오센서가 다이머 또는 모노머 단백질 G를 이용한 바이오센서보다 많은 양의 대장균 검체와 결합하고 후속적으로 HRP가 표지된 염소 항-E.coli와 결합하여 효소 반응 효율이 증가하였기 때문으로, 트리머 단백질 G를 이용 시, 전기화학 면역 센서의 민감도(면역 센서가 검출할 수 있는 검체의 최소 농도)가 우수하다는 것을 의미한다(도 6).
The sandwich test was performed by varying the type of protein G multimer and the concentration of E. coli. However, in the case of the electrochemical biosensor using trimmer protein G, the data value was changed even at the concentration of 102 / ml. In the case of the electrochemical biosensor manufactured using the dimer protein G and the monomer protein G, the current value was not changed at this concentration. This means that even if the same concentration of E. coli is used, electrochemical biosensors made with trimer protein G bind to larger amounts of E. coli samples than dimers or biosensors with monomeric protein G, and subsequently HRP-labeled goat anti-E Because of the increased enzymatic reaction efficiency in combination with .coli, the use of trimer protein G means that the sensitivity of the electrochemical immune sensor (minimum concentration of sample that the immune sensor can detect) is excellent (FIG. 6). .
더군다나 전류값 변화의 기울기가 트리머 단백질 G를 사용하는 경우가 현저히 컸는바, 트리머 단백질 G가 더 효과적으로 검체를 잡는 것을 알 수 있었다.
In addition, the slope of the change of the current value was significantly greater when using the trimmer protein G, indicating that the trimmer protein G captured the sample more effectively.
반복 사용 확인Repeat use confirmation
0.4M glycine-HCl buffer (pH 2.2) 처리를 통해 단백질 G와 항체간의 결합을탈착시킬 수 있다. 이때 단백질 G의 항체 부착 부위는 손상되지 않기 때문에 이후에 pH만 조절해주면 다시 항체를 결합할 수 있다. 기존 면역센서는 항체가 검체를 잡게 되면 항체와 검체를 분리할 수 없기 때문에 한번 사용한 면역센서는 다시 사용할 수 없게 되는데 특히 금 전극칩의 경우 고가인데 한번 사용하고 버려야하는 경제적인 문제가 있었다. 하지만 본 발명을 사용하면 검체와 결합한 항체를 탈착시키고 다른 종류의 항체도 결합시킬 수 있기 때문에 경제적이다. 0.4M glycine-HCl buffer (pH 2.2) treatment can be used to desorb the binding between the protein G and the antibody. At this time, since the antibody attachment site of the protein G is not damaged, the antibody can be bound again by adjusting only the pH later. Existing immune sensors can not separate the antibody and the sample when the antibody catches the sample, so once used immune sensor is not available again, especially in the case of gold electrode chip is expensive, there was an economic problem that must be used once discarded. However, the present invention is economical because the antibody bound to the sample can be detached and other types of antibodies can be bound.
처음 만들어진 전기화학 바이오센서를 가지고 105개/ml 농도의 대장균을 검출한 후 0.4M glycine-HCl buffer (pH 2.2) 처리 후 다시 동일한 마우스 유래 항-E.coli IgG 항체를 결합시켜서 대장균을 검출하여 신호를 측정하는 것을 5번 반복적하였다.
Detecting E. coli at the concentration of 105 / ml using the first electrochemical biosensor, and then treated with 0.4M glycine-HCl buffer (pH 2.2), the same mouse-derived anti-E. Coli IgG antibody was combined to detect E. coli Was repeated five times.
그 결과, 여전히 트리머 단백질 G에서 가장 높은 전류값 변화가 나오고 있으며 반복횟수에 따라서 약간의 전류값 차이는 나지만 큰 변화가 나타나지 않고 안정되고 신뢰성있는 검출 신호가 나오는 것을 확인할 수 있었다(도 7) 그러므로 본 발명의 면역센서는 반복 사용이 가능한 것으로 확인되었다.
As a result, it was confirmed that the highest current value change still occurred in the trimmer protein G, and there was a slight difference in current value according to the number of repetitions, but no significant change appeared and a stable and reliable detection signal appeared (FIG. 7). The immunosensor of the invention was found to be repeatable use.
Claims (6)
Repeatable use of an immune sensor comprising a protein G multimer.
상기 단백질 G 다합체는 전극칩에 커플링되어 있는 것을 특징으로 하는 면역 센서.
The method of claim 1,
The protein G multimer is an immune sensor, characterized in that coupled to the electrode chip.
항체-항원 반응을 이용하는 것을 특징으로 하는 면역 센서.
The method of claim 1,
An immune sensor characterized by using an antibody-antigen response.
상기 단백질 G 다합체-제 1 항체의 복합체에 시험 물질을 가하는 단계;
상기 시험 물질과 제 1 항체의 결합 여부를 검출하는 단계;
상기 단백질 G 다합체-제 1 항체-시험 물질의 복합체에 항체 제거제를 가하는 단계;및
상기 단백질 G 다합체에 제 2 항체를 결합시키는 단계를 포함하는 반복 사용이 가능한 검출 방법.
Binding the first antibody to the Protein G multimer;
Adding a test substance to the complex of protein G multimer-first antibody;
Detecting whether the test substance binds to the first antibody;
Adding an antibody scavenger to the complex of protein G multimer-first antibody-test material; and
And a second antibody binding to said protein G multimer.
상기 단백질 G 다합체는 전극칩에 부착되어 있으며,
상기 항체 제거제는 상기 제 1 항체를 상기 단백질 G 다합체로부터 분리하나,
상기 단백질 G 다합체와 전극칩 간의 부착을 파괴하지는 않는 것을 특징으로 하는 검출 방법.
5. The method of claim 4,
The protein G multimer is attached to the electrode chip,
The antibody scavenger separates the first antibody from the protein G multimer,
Detection method characterized in that it does not destroy the adhesion between the protein G multimer and the electrode chip.
상기 항체 제거제는 글라이신-산인 것을 특징으로 하는 검출 방법.
5. The method of claim 4,
And said antibody scavenger is glycine-acid.
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