KR20130068032A - 'stable antisense oligonucleotide conjugate and its manufacturing method' - Google Patents

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KR20130068032A
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한보람
김한나
박한오
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Abstract

PURPOSE: A conjugate of antisense oligonucleotide(ASO) of a polymer is provided to improve stability of ASO in vivo, to effectively transfer a therapeutic ASO, and to ensure ASO activities. CONSTITUTION: A conjugate of antisense oligonucleotide(ASO) of a polymer has a structure of structural formula 1(A-X-R-Y-B). In structural formula 1, one of A and B is a hydrophilic material and the other is a hydrophobic material; X and Y are individually simple covalent bond or linker-mediated covalent bond; and R is ASO. A method for preparing the conjugate comprises: a step of performing covalent bond of the hydrophilic material to the solid support; a step of synthesizing ASO based on the solid support containing the hydrophilic material; a step of performing covalent bond of the hydrophobic material to 5' end of ASO; and a step of isolating and purifying the ASO-polymer conjugate from the solid support. [Reference numerals] (AA) ASO polymer composite; (BB) Hydrophobic material; (CC) Hydrophilic material; (DD) Target specific ligand

Description

안정한 안티센스 올리고뉴클레오티드 접합체 및 그 제조방법{'Stable antisense oligonucleotide conjugate and its manufacturing method'}Stable antisense oligonucleotide conjugate and its manufacturing method

본 발명은 암 및 감염성 질병 등 다양한 질병의 유전자 치료에 유용하게 사용될 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide, 이하'ASO'라 한다)의 전달 효율성을 향상시키기 위해 ASO의 양 말단에 친수성 물질 및 소수성 물질을 단순 공유 결합 또는 링커-매개(linker-mediated) 공유결합을 이용하여 접합시킨 ASO접합체, 상기 접합체의 제조방법 및 상기 접합체로 구성된 나노입자형 ASO 전달 기술에 관한 것이다.The present invention is a hydrophilic material and a hydrophobic material at both ends of the ASO to improve the transfer efficiency of antisense oligonucleotides (hereinafter referred to as 'ASO') that can be usefully used for gene therapy of various diseases such as cancer and infectious diseases The present invention relates to an ASO conjugate conjugated using a simple covalent bond or a linker-mediated covalent bond, a method for preparing the conjugate, and a nanoparticulate ASO transfer technique composed of the conjugate.

ASO기술은 단일가닥의 RNA 또는 DNA가닥을 통해 mRNA의 중간 대사(metabolism)을 변경함으로써 유전자로부터 단백질로의 정보전달을 조절하는 기술이다. 즉, 충분히 상보적, 특이적으로 혼성화하는 염기서열을 선택하여 목표 단백질의 바람직한 발현억제가 이루어지도록 하는 것이다. ASO의 결합은 목표 유전자에 서열특이적으로 결합하므로 목표유전자 이외의 다른 유전자발현에 영향을 주지 않는다. 따라서 ASO기술은 특정 단백질의 생체 내 역할의 분석에서 유용한 도구일 뿐만 아니라, 특정 질병에 대한 유전자치료법으로 활용 가능성을 가진다(FASEBJ. 9, 1288-1296, 1995).ASO technology modulates the transfer of information from genes to proteins by altering the metabolism of mRNA through single-stranded RNA or DNA strands. In other words, a base sequence that hybridizes sufficiently complementarily and specifically is selected to achieve a desired expression inhibition of the target protein. Binding of ASOs sequence-specifically binds to a target gene and thus does not affect gene expression other than the target gene. Thus, ASO technology is not only a useful tool in the analysis of the in vivo role of specific proteins, but also has the potential to be used as a gene therapy for certain diseases ( FASEBJ. 9, 1288-1296, 1995).

안티센스 DNA는 목표 mRNA와 결합하여 RNA/DNA 이중나선을 형성하며, 이 RNA/DNA 이중나선구조는 생체 내에 존재하는 RNase H(RNase H; 리보핵산분해효소의 한 종류로서 RNA/DNA 혼성 이중나선이 형성되어있는 mRNA를 특이적으로 분해하는 효소)의 공격을 받아 분해가 유발된다. 안티센스 RNA는 RNA/RNA 이중나선을 형성하며, RNase L의 공격을 받아 목표 mRNA의 분해가 유발된다. RNase L은 이중나선 RNA 가닥 주변의 단일가닥 RNA를 우선적으로 분해하는 리보핵산분해효소이다 (Pharmacol. Toxicol.32, 329-376,1992).Antisense DNA binds to the target mRNA to form an RNA / DNA double helix, which is a type of RNase H (RNase H; ribonuclease that exists in vivo). Degradation is caused by an attack by an enzyme that specifically degrades the formed mRNA. Antisense RNA forms RNA / RNA double helix and is subject to RNase L attack to cause degradation of target mRNA. RNase L is a ribonuclease that preferentially degrades single-stranded RNA around double-stranded RNA strands ( Pharmacol. Toxicol. 32, 329-376 , 1992).

하지만 ASO가 목표 세포로 효과적으로 전달되어야 목적하는 효과를 거둘 수 있고, 혈액 내에 존재하는 핵산 분해효소에 의해 ASO 가 분해 될 수 있기 때문에 ASO를 치료 목적으로 이용하기 위해서는 ASO접합체가 세포막을 효율적으로 투과하여 전달되어야 하며, 체내에서 ASO안정성이 확보되어야만 한다. (Shigeru Kawakami and Mitsuru Hashida, Drug Metab. Pharmacokinet. 22(3): 142-151, 2007). However, since ASO can be effectively delivered to the target cell to achieve the desired effect, and ASO can be degraded by nucleic acid enzymes present in the blood, in order to use ASO for therapeutic purposes, the ASO conjugate effectively penetrates the cell membrane. It must be delivered and ASO stability must be ensured in the body. Shigeru Kawakami and Mitsuru Hashida, Drug Metab. Pharmacokinet. 22 (3): 142-151, 2007.

따라서 대부분의 ASO는 생체 내 안정성을 향상시키기 위해 핵산분해효소 저항성을 갖는 다양한 변형(modification)이 이루어진 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN; oligodeoxynucleotide)형태를 가지는데, 상기 변형은 하나 이상의 뉴클레오티드 내 당 구조의 2´탄소 위치에서 -OH 기가 - CH3(메틸), -OCH3, -NH2, -F(불소), -O-2-메톡시에틸, -O-프로필(propyl), -O-2-메틸티오에틸(methylthioethyl), -O-3-아미노프로필, -O-3-디메틸아미노프로필, -O-N-메틸아세트아미도 또는 -O-디메틸아미도옥시에틸로의 치환에 의한 변형; 뉴클레오티드 내 당 구조 내의 산소가 황으로 치환된 변형; 뉴클레오티드 간 결합의 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 또는 보라노포스페이트(boranophosphophate), 메틸포스포네이트(methyl phosphonate) 결합으로의 변형 등에서 하나 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, PNA(peptide nucleic acid) 또는 LNA(locked nucleic acid) 형태로의 변형도 사용 가능하다(Crooke 등, Ann. Rev. Med. Vol.55: pp61-65 2004, US 5,660,985, US 5,958,691, US 6,531,584, US 5,808,023, US 6,326,358, US 6,175,001 Braasch D. A. 등 Bioorg. Med. Chem. Lett. 14:1139-1143, 2003; Chiu Y. L. 등., RNA, 9:1034-1048, 2003; Amarzguioui M. 등, Nucleic Acid Res. 31:589-595, 2003 등 참조). Therefore, most ASOs have an oligodeoxynucleotide (ODN) form in which various modifications have been made with nuclease resistance in order to improve in vivo stability. -OH groups at the carbon position are -CH 3 (methyl), -OCH 3 , -NH 2 , -F (fluorine), -O-2-methoxyethyl, -O-propyl, -O-2- Modification by substitution with methylthioethyl, -O-3-aminopropyl, -O-3-dimethylaminopropyl, -O- N -methylacetamido or -O-dimethylamidooxyethyl; A modification in which the oxygen in the sugar structure in the nucleotide is replaced with sulfur; One or more combinations of nucleotide-to-nucleotide linkages with phosphorothioate or boranophosphophate, methyl phosphonate linkages, etc. may be used in combination, and may be used as PNA (peptide nucleic acid) or LNA (LNA). locked nucleic acid) is also available (Crooke et al., Ann. Rev. Med. Vol. 55: pp 61-65 2004, US 5,660,985, US 5,958,691, US 6,531,584, US 5,808,023, US 6,326,358, US 6,175,001 Braasch DA See Bioorg.Med. Chem. Lett. 14: 1139-1143, 2003; Chiu YL et al., RNA, 9: 1034-1048, 2003; Amarzguioui M. et al., Nucleic Acid Res. 31: 589-595, 2003 et al. ).

ASO를 목표 세포 내로 전달 하기 위해서 아데노바이러스 또는 레트로바이러스 등 바이러스를 이용한 유전자 전달기술과 리포좀, 양이온 성 지질 또는 양이온 성 고분자를 이용한 비 바이러스성 전달체(non-viral carrier)를 이용한 유전자 전달 기술들이 개발되어 왔다. 그러나 바이러스성 전달체는 숙주의 염색체에 이입되어 숙주유전자의 정상기능의 이상을 유발하거나 발암 유전자를 활성화시키지 않는다는 확신을 할 수 없어 안전성에 문제점이 있으며, 바이러스 유전자가 적은 양이라도 계속 발현이 되어 자가 면역증을 유발하거나, 바이러스 전달체로부터 변형된 형태의 바이러스성 감염이 유발되는 경우 효율적인 ASO 전달을 못할 수 있다. Gene delivery technology using viruses such as adenovirus or retrovirus and non-viral carrier using liposomes, cationic lipids or cationic polymers have been developed to deliver ASO into target cells. come. However, there is a problem in safety because viral transporters are not convinced that they do not cause abnormal function of host genes or activate carcinogenic genes by entering the chromosomes of the host, and there is a safety problem. Efficacy may occur, or if a modified form of viral infection is triggered from the virus carrier, it may not be able to efficiently deliver ASO.

따라서 이와 같은 문제점들을 개선하기 위해 비 바이러스성 전달체인 리포좀에 유전자를 융합시키는 방법이나 양이온을 지닌 지질이나 고분자를 이용한 방법 등이 그들이 가진 단점을 개선하는 방향으로 연구가 진행되고 있다. 이들 비 바이러스성 전달체는 바이러스성 전달체에 비하여 효율성이 떨어지지만, 생체 내 안전성과 경제성을 고려해 볼 때 부작용이 적고 생산가격이 저렴해 질 수 있다는 장점이 있다(Lehrman S. Nature. 401(6753):517-518, 1999). Therefore, in order to improve these problems, researches are being conducted in order to improve their disadvantages such as fusion of genes to liposomes, which are non-viral transporters, or methods using lipids or polymers with cations. These non-viral carriers are less efficient than viral carriers, but have the advantage of lower side effects and lower production costs, given in vivo safety and economics (Lehrman S. Nature. 401 (6753): 517-518, 1999).

비 바이러스성 전달체를 이용한ASO를 포함한 ODN분자의 안정적(stable) 전달을 효과적으로 이루기 위해서 효소 또는 비 효소적인 분해를 막는 효과적 방법이 요구되는데, ASO를 화학적으로 변형시키는 방법을 통해 핵산분해효소에 대한 불안정성 및 세포 내 낮은 흡수율을 개선하는 방법이 제안되고 있다 (Shigery Kawakami and Mitsuru Hashida. Drug Metab.Parmacokinet. 22(3): 142-151, 2007). In order to achieve stable delivery of ODN molecules including ASOs using non-viral carriers, an effective method of preventing enzymatic or non-enzymatic degradation is required.The instability to nucleases through chemical modification of ASOs is required. And methods for improving low uptake in cells have been proposed (Shigery Kawakami and Mitsuru Hashida. Drug Metab. Parmacokinet. 22 (3): 142-151, 2007).

한편, PEG(polyethylene glycol)을 접합시킨 고분자들은 서로 간의 상호작용으로 인해 자발적으로 형성된 미셀 구조를 지닌 복합체를 형성하는데, 이를 고분자 복합체 미셀이라고 한다(Kataoka K. et al. Macromolecules, 29:8556-8557, 1996). 이들 고분자 복합체 미셀들은 약물 전달 운반체로 쓰이는 다른 시스템, 즉, 미소구체(microsphere), 나노입자(nanoparticle) 등에 비해 그 크기가 극히 작으면서도 분포가 매우 일정하고, 자발적으로 형성되는 구조이므로 제제의 품질 관리 및 재현성 확보가 용이하다는 장점이 있다. On the other hand, polymers conjugated with polyethylene glycol (PEG) form a complex having a micelle structure spontaneously formed due to interaction with each other, which is called a polymer complex micelle (Kataoka K. et al. Macromolecules, 29: 8556-8557). , 1996). These macromolecular complex micelles are extremely uniform in size and spontaneously formed, compared to other systems used as drug delivery vehicles, such as microspheres and nanoparticles. And it is easy to secure reproducibility.

최근ASO의 세포 내 전달 효율성을 향상시키기 위해, ASO에 생체 적합성 고분자인 PEG 등의 친수성 물질을 단순 공유결합 또는 링커-매개(linker-mediated) 공유결합을 이용하여 접합시킨 접합체를 통해, ASO의 안정성 확보 및 효율적인 세포막 투과성을 위한 기술이 개발되었다(대한민국 등록특허 공보0466254호). 하지만 화학적 변형 및 PEG(polyethylene glycol)의 접합(PEGylation)만으로는 ASO의 생체 내 안정성을 개선하고, 목표 조직으로의 전달이 원활히 이루어지지 않는 단점을 여전히 가진다.In order to improve the intracellular delivery efficiency of ASO, the stability of ASO through a conjugate in which a hydrophilic material such as PEG, a biocompatible polymer, is conjugated to ASO using simple covalent or linker-mediated covalent bonds. Techniques for securing and efficient cell membrane permeability have been developed (Korean Patent Publication No. 0466254). However, only chemical modification and PEG (PEGylation) of PEG (PEGylation) improves the in vivo stability of ASO, and still has the disadvantage that the delivery to the target tissue is not smooth.

한편, siRNA의 전달을 위한siRNA에 소수성 및 친수성 물질을 부여하여 세포전달을 개선시킨 나노입자에 대한 기술인 자가조립(self-assembly) 나노입자 형성 기술(대한민국 공개특허 공보2009-0042297호)이 개발되었으나, 상기 기술이 ASO의 전달에 적용된 사례는 보고된 바 없다. 따라서 ASO에 여러 가지 화학적 변형의 도입 및 고분자물질의 접합을 통해 이들을 분해효소로부터 보호하여 안정성을 향상시키고자 하는 시도를 통해 ASO의 안정성 확보 및 효율적인 세포막 투과성 향상을 담보할 수 있는 ASO의 전달체 및 그 제조 기술 개발이 필연적으로 요구된다.On the other hand, self-assembly nanoparticle formation technology (Korea Patent Publication No. 2009-0042297) has been developed, which is a technique for nanoparticles that have improved hydrolysis by assigning hydrophobic and hydrophilic substances to siRNA for delivery of siRNA. However, no case has been reported in which the technique has been applied to the delivery of ASOs. Therefore, by introducing various chemical modifications to ASO and conjugation of high molecular materials, the ASO transporter and its transporter can secure the stability of ASO and the efficient cell membrane permeability by attempting to improve the stability by protecting them from degrading enzymes. Development of manufacturing technology is inevitably required.

대한민국 등록특허공보 0466254호: 세포내 전달을 위한 올리고 뉴클레오티드와 친수성 고분자로 구성되는 유전자 전달용 접합체, 고분자 전해질 복합 미셀 및 그의 제조방법 등록일자:2005년 01월 04일, 출원인: 한국과학기술원Republic of Korea Patent Publication 0466254: A gene delivery conjugate consisting of oligonucleotides and hydrophilic polymers for intracellular delivery, polyelectrolyte complex micelle and preparation method thereof Date of registration: Jan 04, 2005, Applicant: Korea Advanced Institute of Science and Technology 대한민국 공개특허공보 2009-0042297호: siRNA 접합체 및 그 제조방법. 공개일자 2010년 11월24일, 출원인 : 바이오니아Republic of Korea Patent Publication No. 2009-0042297: siRNA conjugate and a method for producing the same. Publication date November 24, 2010 Applicant: Bioneer

본 발명의 목적은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 개발된 것으로 ASO의 세포 내 전달 효율성을 향상시키기 위해, ASO의 양 말단에 생체 적합성 고분자인 친수성 물질 및 소수성 물질을 단순 공유 결합 또는 링커-매개(linker-mediated) 공유결합을 통해 접합시킨 ASO-고분자 접합체 및 그의 제조방법을 제공하는 것이다.An object of the present invention was developed to solve the problems of the prior art as described above, in order to improve the intracellular delivery efficiency of ASO, a simple covalent bond or linker to the hydrophilic material and hydrophobic material that is a biocompatible polymer at both ends of the ASO It is to provide an ASO-polymer conjugate conjugated through a linker-mediated covalent bond and a method for preparing the same.

본 발명의 다른 목적은 상기 ASO-고분자 접합체로 이루어진 나노입자를 이용한 ASO 전달기술 및 이를 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide an ASO delivery technology using a nanoparticle consisting of the ASO-polymer conjugate and a pharmaceutical composition comprising the same.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

상기 과제를 달성하기 위한 본 발명은 하기구조의 ASO-고분자 접합체를 제공한다. The present invention for achieving the above object provides an ASO-polymer conjugate of the following structure.

A-X-R-Y-B 식(1)A-X-R-Y-B Formula (1)

상기 식(1)에서 A와B 중 하나는 친수성 물질이며, 다른 하나는 소수성 물질이고, X와 Y는 서로 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합이며, R은 ASO를 나타낸다.In Formula (1), one of A and B is a hydrophilic material, the other is a hydrophobic material, X and Y are independently a covalent bond or a linker mediated covalent bond, and R represents ASO.

상기 식(1)에서 친수성 물질은 목표 특이적인 리간드가 부착된 형태를 가질 수 있다. 상기 타겟 특이적 리간드는 목표 특이적으로 세포내재화(internalization)를 증진시키는 RME(receptor-mediated endocytosis) 특성을 가진 타겟 특이적 항체나 앱타머(aptamer), 수용체 특이적 리간드 등에서 선택되는 펩타이드; 또는 엽산, N-아세틸 갈락토사민(N-acetyl galactosamine, NAG), 만노스(mannose)를 비롯한 화학물질 등에서 선택될 수 있다. 이 때 타겟팅 모이어티(moiety)는 타겟 특이적으로 전달을 수행하도록 하는 물질로 상기 항체, 앱타머, 펩타이드 및 화학물질에만 한정되는 것만은 아니다. In the formula (1), the hydrophilic material may have a form to which a target specific ligand is attached. The target specific ligand may include a peptide selected from a target specific antibody, an aptamer, a receptor specific ligand, and the like, having a receptor-mediated endocytosis (RME) characteristic that specifically targets internalization; Or folic acid, N - may be selected from acetyl galactosamine (N -acetyl galactosamine, NAG), chemical, including mannose (mannose). In this case, the targeting moiety is a substance that performs target-specific delivery, and is not limited to the antibodies, aptamers, peptides, and chemicals.

본 발명의 접합체에 있어서, 상기 ASO는10 내지 50 개의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 13 내지 25개의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. In the conjugate of the present invention, the ASO preferably contains 10 to 50 oligonucleotides, more preferably 13 to 25 oligonucleotides.

또한, 생체 내 안정성을 향상시키기 위해 핵산분해효소 저항성을 갖는 다양한 변형(modification)이 이루어진 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN; oligodeoxynucleotide)형태를 포함한다. 상기 변형은 하나 이상의 뉴클레오티드 내 당 구조의 2탄소 위치에서 -OH 기가 - CH3(메틸), -OCH3, -NH2, -F(불소), -O-2-메톡시에틸, -O-프로필(propyl), -O-2-메틸티오에틸(methylthioethyl), -O-3-아미노프로필, -O-3-디메틸아미노프로필, -O-N-메틸아세트아미도 또는 -O-디메틸아미도옥시에틸로의 치환에 의한 변형; 뉴클레오티드 내 당 구조 내의 산소가 황으로 치환된 변형; 뉴클레오티드 간 결합의 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 또는 보라노포스페이트(boranophosphophate), 메틸포스포네이트(methyl phosphonate) 결합으로의 변형 등에서 하나 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, PNA(peptide nucleic acid) 또는 LNA(locked nucleic acid) 형태로의 변형도 사용 가능하다.In addition, it includes oligodeoxynucleotide (ODN) forms in which various modifications have been made with nuclease resistance to enhance stability in vivo. The modification is such that the —OH group at the two carbon positions of the sugar structure in one or more nucleotides is —CH 3 (methyl), —OCH 3 , —NH 2 , —F (fluorine), —O-2-methoxyethyl, —O— Propyl, -O-2-methylthioethyl, -O-3-aminopropyl, -O-3-dimethylaminopropyl, -O- N -methylacetamido or -O-dimethylamido Modification by substitution with oxyethyl; A modification in which the oxygen in the sugar structure in the nucleotide is replaced with sulfur; One or more combinations of nucleotide-to-nucleotide linkages with phosphorothioate or boranophosphophate, methyl phosphonate linkages, etc. may be used in combination, and may be used as PNA (peptide nucleic acid) or LNA (LNA). Modifications to the locked nucleic acid form are also possible.

본 발명에서 사용 가능한 ASO는 치료용 또는 연구용으로 사용되고 있는 것으로 특별히 한정되지 않고, 유전자 치료용 또는 연구를 위해 사용되거나 사용될 가능성이 있는 어떠한 유전자에 대한ASO도 채택될 수 있다. The ASOs usable in the present invention are not particularly limited to those used for therapeutic or research purposes, and ASOs for any genes used or likely to be used for gene therapy or research may be adopted.

또한, 본 발명에서의 ASO는 목적하는 mRNA와 완벽하게 상보적 결합(perfect match) 관계에 있는 경우뿐만 아니라, 일부 서열에서 상보적 결합을 이루지 않더라도 목적하는 mRNA와 결합하여 그러한 mRNA의 번역(translation)을 저해할 수 있는 불완전한 상보적 결합(mismatch) 관계에 있는 것도 사용 가능함은 통상의 기술자에게는 자명한 것이다. In addition, the ASO in the present invention is not only in a perfect match relationship with the desired mRNA, but also in combination with the desired mRNA even if not complementary binding in some sequences translation of such mRNA It is obvious to those skilled in the art that it is possible to use an incomplete complementary (mismatch) relationship that can impair this.

상기 친수성 물질은 분자량 200 내지 10,000 인 친수성 물질이 바람직하고, 분자량이1,000 내지 2,000인 고분자 화합물 더욱 바람직하다. 또한 상기 친수성 물질은 양이온성 또는 비이온성 고분자 화합물인 것이 바람직하다. The hydrophilic material is preferably a hydrophilic material having a molecular weight of 200 to 10,000, more preferably a high molecular compound having a molecular weight of 1,000 to 2,000. In addition, the hydrophilic material is preferably a cationic or nonionic high molecular compound.

예를 들어, 친수성 고분자 화합물은 폴리에틸린글리콜(PEG, polyethylene), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrolidone), 및 폴리옥사졸린(polyoxazoline) 등의 비이온성 친수성 고분자 화합물을 사용하는 것이 바람직하지만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. For example, it is preferable to use a nonionic hydrophilic polymer compound such as polyethylin glycol (PEG, polyethylene), polyvinylpyrolidone, and polyoxazoline as the hydrophilic polymer compound. It is not limited.

상기 친수성 물질은 필요에 따라 다른 물질의 접합을 위해 필요한 기능기를 갖도록 변경되어도 무방하다. 상기 친수성 물질 중에서도 특히, PEG는 다양한 분자량과 기능기를 도입할 수 있으며, 생체 내 친화성이 좋고 면역반응을 유도하지 않는 등의 생체 적합성(bio-compatibility)이 우수하며, 생체 내에서 ASO의 안정성을 증가시키고, 전달 효율을 증가 시키므로 본 발명의 접합체의 제조에 매우 적합하다. The hydrophilic material may be modified to have a functional group necessary for bonding other materials as necessary. Among the hydrophilic substances, PEG can introduce various molecular weights and functional groups, and has excellent bio-compatibility such as in vivo affinity and induction of immune response, and stability of ASO in vivo. It is very suitable for the preparation of the conjugates of the present invention as it increases the transfer efficiency.

또한, 상기 소수성 물질은 분자량 250 내지 1,000인 소수성 물질인 것이 바람직한데, 그 중에서도 바람직한 소수성 물질로는 스테로이드(steroid) 유도체, 글리세라이드(glyceride) 유도체, 글리세롤 에테르(glycerol ether), 폴리프로필렌 글리콜(polypropylene glycol), C12 내지 C50의 불포화 또는 포화 탄화수소(hydrocarbon), 디아실포스파티딜콜린(diacylphosphatidylcholine), 지방산(fatty acid), 인지질(phospholipid), 리포폴리아민(lipopolyamine) 등이 사용될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 목적에 부합하는 것이라면 어떠한 소수성 물질도 사용 가능하다는 점은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명한 것이다. In addition, the hydrophobic material is preferably a hydrophobic material having a molecular weight of 250 to 1,000, and among them, a preferred hydrophobic material is a steroid derivative, a glyceride derivative, a glycerol ether, a polypropylene glycol glycols, C 12 to C 50 unsaturated or saturated hydrocarbons, diacylphosphatidylcholine, fatty acids, phospholipids, lipopolyamines and the like may be used, but are not limited thereto. It is obvious to those skilled in the art that any hydrophobic material can be used as long as it meets the object of the present invention.

특히, 상기 스테로이드(steroid) 유도체는 콜레스테롤, 콜리스탄올, 콜산, 콜리스테릴포르메이트, 코테스타닐모르메이트 및 콜리스타닐아민으로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있으며, 상기 글리세라이드 유도체는 모노-, 디- 및 트리-글리세라이드 등에서 선택될 수 있는데 이때, 글리세라이드의 지방산은 C12 내지 C50의 불포화 또는 포화 지방산임을 특징으로 한다. In particular, the steroid derivative may be selected from the group consisting of cholesterol, colistanol, cholic acid, cholesterylformate, cotestanylmormate and colistanylamine, and the glyceride derivatives are mono-, di And tri-glycerides and the like, wherein the fatty acid of the glyceride is a C 12 to C 50 unsaturated or saturated fatty acid.

상기 소수성 물질은 소수성 상호작용(hydrophobic interaction)을 일으켜 나노입자를 형성하게 하는 역할을 수행한다. 상기 소수성 물질 중에서도 특히, 탄소 사슬이나 콜레스테롤의 경우, ASO의 제조 단계에서 용이하게 접합시킬 수 있는 장점을 가지고 있어 본 발명의 접합체 제조에 매우 적합하다.The hydrophobic material plays a role of causing hydrophobic interaction to form nanoparticles. Among the hydrophobic substances, in particular, in the case of carbon chains or cholesterol, it has an advantage that can be easily bonded in the production step of ASO is very suitable for the preparation of the conjugate of the present invention.

또한, 상기 식(1)에서 X 또는Y로 표시되는 공유결합은 비분해성 결합 또는 분해성 결합 중 어느 것이어도 무방하다. 이때, 비분해성 결합으로는 아미드 결합 (amide bond)또는 인산화 결합(phosphate bond)이 있고, 분해성 결합으로는 이황화 결합, 산분해성 결합, 에스테르결합, 안하이드라이드 결합, 생분해성 결합 또는 효소 분해성 결합 등이 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. In addition, the covalent bond represented by X or Y in Formula (1) may be either a non-degradable bond or a decomposable bond. At this time, the non-degradable bonds include amide bonds or phosphate bonds, and the degradable bonds include disulfide bonds, acid decomposable bonds, ester bonds, anhydride bonds, biodegradable bonds, or enzyme degradable bonds. There is, but is not necessarily limited to this.

ASO-고분자 접합체는 친수성 물질이 ASO의 5´ 말단 또는 3 말단에 결합할 수 있으며, 그 반대 말단에 소수성 물질이 결합되는 형태를 가진다. The ASO-polymer conjugate has a form in which a hydrophilic material may bind to the 5 ′ or 3 ends of the ASO and a hydrophobic material to the opposite end thereof.

ASO의 3 말단에 친수성 물질이 결합된 형태의 ASO-고분자 접합체를 제조하는 방법은 A method for preparing an ASO-polymer conjugate in which a hydrophilic substance is bonded to three terminals of ASO is

(a) 고형지지체에 친수성 물질을 공유결합 시키는 단계;(a) covalently bonding a hydrophilic material to the solid support;

(b) 상기 친수성 물질을 포함하는 고형지지체 기반으로 ASO를 합성하는 단계;(b) synthesizing ASO based on a solid support comprising the hydrophilic material;

(c) 상기 고형지지체 상의 ASO의 5´말단에 소수성 물질을 공유결합 시키는 단계; (c) covalently attaching a hydrophobic material to the 5 ′ end of ASO on the solid support;

(d) 상기 친수성 물질과 소수성 물질이 결합한ASO-고분자 접합체를 고형지지체로부터 분리 및 정제하는 단계;를 포함하는 ASO-고분자 접합체의 제조방법이다. (d) isolating and purifying the ASO-polymer conjugate to which the hydrophilic material and the hydrophobic material are bound from a solid support; and a method for producing an ASO-polymer conjugate.

보다 바람직한 구체적인 예는 3´말단 부위에 친수성 물질이 결합된 고형지지체(solid support; 고형지지체(solid support)는 Controlled Pore Glass(CPG)를 사용)를 기반으로 합성하는 단계; 친수성 물질이 공유결합된 고형지지체(CPG) 기반으로 차단제거(deblocking), 결합(coupling), 캐핑(capping) 및 산화(oxidation)의 과정을 통해 ASO를 합성하는 단계; 상기 ASO의 5´말단에 소수성 물질을 공유결합 시키는 과정으로 합성하는 단계로 원하는 ASO-고분자 접합체를 제조하는 방법이 있으며, ASO-고분자 접합체의 제조가 완료되면 60 ℃ 온탕기(water bath)에서 28 %(v/v) 암모니아(ammonia)를 처리하여 고형지지체(CPG)로부터 ASO-고분자 접합체를 분리하고, 고속 액체 크로마토그래피(HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY, HPLC)를 이용하여 상기 반응물들과 ASO-고분자 접합체를 분리, 정제한 뒤 MALDI-TOF 질량 분석기로 분자량을 측정하여 목적하는ASO-고분자 접합체가 제조되었는지를 확인할 수 있다. More preferred specific examples include the steps of synthesizing based on a solid support (a solid support using Controlled Pore Glass (CPG)) in which a hydrophilic material is bonded to the 3 ′ end portion; Synthesizing ASO through a process of deblocking, coupling, capping, and oxidation on the basis of a covalently bonded solid support (CPG); Synthesis of the ASO-polymer conjugate by the step of synthesizing the hydrophobic material at the 5 ′ end of the ASO is a method for producing the desired ASO-polymer conjugate, and when the preparation of the ASO-polymer conjugate is completed, the body is heated at 60 ° C. in a water bath. Treatment of% (v / v) ammonia to separate the ASO-polymer conjugate from the solid support (CPG) and the reaction and the ASO-polymer conjugate using high performance liquid chromatography (HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY, HPLC) After separation and purification, the molecular weight was measured using a MALDI-TOF mass spectrometer to confirm whether the desired ASO-polymer conjugate was prepared.

또 다른 양태로 ASO의 5´말단에 친수성 물질이 결합된 형태의 ASO-고분자 접합체를 제조하는 방법은 In another embodiment, a method of preparing an ASO-polymer conjugate in which a hydrophilic material is bound to the 5 ′ end of ASO is prepared.

(a) 기능기가 부착되어있는 고형지지체를 기반으로 ASO를 합성하는 단계;(a) synthesizing ASO based on a solid support having a functional group attached thereto;

(b) 상기 ASO 5´말단에 친수성 물질을 공유결합 시키는 단계; (b) covalently bonding a hydrophilic material to the ASO 5 'end;

(c) 상기 친수성 물질이 결합한 ASO 접합체를 고형지지체로부터 분리하는 단계; (c) separating the ASO conjugate to which the hydrophilic material is bound from the solid support;

(d) 상기 고형지지체로부터 분리된 ASO 3´말단에 소수성 물질을 공유결합 시키는 단계;를 포함하는 ASO-고분자 접합체의 제조방법이다.(d) covalently attaching a hydrophobic material to the ASO 3 'end separated from the solid support; ASO-polymer conjugate manufacturing method comprising a.

보다 바람직한 구체적인 예는 기능기가 부착되어있는 CPG를 기반으로 ASO를 합성하는 단계; 상기 ASO의 5´말단에 친수성 물질을 공유결합 시키는 과정으로 합성하는 단계; 합성이 완료되면 60 ℃ 온탕기(water bath)에서 28 %(v/v) 암모니아(ammonia)를 처리하여 고형지지체(CPG)로부터 기능기가 부착된 ASO-친수성 고분자 접합체를 분리하는 단계; 및 상기 기능기를 통해 소수성 물질을 부착하여 양 말단에 친수성 고분자 및 소수성 물질이 부착된 ASO-고분자 접합체를 합성하는 단계; 를 포함하여 이루어지며, 제조가 완료되면 고속 액체 크로마토그래피(HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY, HPLC)를 이용하여 상기 반응물들과 ASO-고분자 접합체를 분리 정제한 뒤 MALDI-TOF 질량 분석기로 분자량을 측정하여 목적하는ASO-고분자 접합체 가 제조되었는지를 확인할 수 있다.More preferred specific examples include the steps of synthesizing ASO based on CPG to which functional groups are attached; Synthesizing by covalently bonding a hydrophilic material to the 5 'end of the ASO; Separating the ASO-hydrophilic polymer conjugate to which functional groups are attached from the solid support (CPG) by treating 28% (v / v) ammonia in a 60 ° C. water bath when the synthesis is completed; And attaching a hydrophobic material through the functional group to synthesize an ASO-polymer conjugate having a hydrophilic polymer and a hydrophobic material attached to both ends thereof. When the production is complete, the reaction product and the ASO-polymer conjugate are separated and purified using high performance liquid chromatography (HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY, HPLC), and then the molecular weight is measured using a MALDI-TOF mass spectrometer. It can be confirmed whether the ASO-polymer conjugate has been prepared.

한편, 본 발명의 ASO-고분자 접합체는 리간드가 추가적으로 결합된 형태를 가질 수 있는데, 이때 리간드는 친수성 물질에 결합되어 있는 형태를 가진다. Meanwhile, the ASO-polymer conjugate of the present invention may have a form in which a ligand is additionally bound, wherein the ligand has a form in which a ligand is bound to a hydrophilic material.

친수성 물질에 리간드가 결합되는 형태는 리간드에 부착된 기능기에 따라서 결정되는데, 예를 들면, 포스포아미디트(phosphoramidite) 형태로 제조된 리간드- 포스포아미디트(phosphoramidite) 는 ASO의 합성과정과 동일한 방법으로 친수성 물질에 결합될 수 있고, 엔-하이드록시 숙시니미드(N-Hydroxy succinimide, NHS)-리간드 형태의 리간드는 친수성 물질에 엔-하이드록시숙시니미드(N-Hydroxysuccinimide(NHS)) 에스터(ester) 결합으로 결합될 수 있다. The form of binding of the ligand to the hydrophilic substance is determined according to the functional group attached to the ligand. For example, the ligand-phosphoramidite prepared in the form of phosphoramidite is the same as the synthesis of ASO. It can be bound to the hydrophilic material by the method, N- Hydroxy succinimide (NHS) -ligand ligands in the form of the N- Hydroxysuccinimide (NHS) ester (ester) can be combined by a bond.

ASO의 3 말단에 친수성 물질이 부착된 형태의 ASO-고분자 접합체에 리간드가 부착된 형태의 리간드 결합 ASO-고분자 접합체를 제조하는 방법은 The method for preparing a ligand-binding ASO-polymer conjugate in which a ligand is attached to an ASO-polymer conjugate in which a hydrophilic substance is attached to three terminals of ASO is

(a) 기능기가 부착되어있는 고형지지체에 친수성 물질을 결합 시키는 단계;(a) coupling a hydrophilic material to a solid support having a functional group attached thereto;

(b) 상기 기능기-친수성 물질이 결합되어있는 고형지지체에 ASO를 합성하는 단계; (b) synthesizing ASO to a solid support to which the functional group-hydrophilic material is bound;

(c) 상기 ASO 5말단에 소수성 물질을 공유결합 시키는 단계;(c) covalently attaching a hydrophobic material to the 5-terminal ASO;

(d) 상기 친수성 물질과 소수성 물질이 결합한 ASO-고분자 접합체를 고형지지체로부터 분리하는 단계;(d) separating the ASO-polymer conjugate in which the hydrophilic material and the hydrophobic material are bound from a solid support;

(d) 상기 고형지지체로부터 분리된 ASO-고분자 접합체의 친수성 물질 말단에 리간드를 결합시키는 단계;를 포함하는 리간드 결합 ASO-고분자 복합체 제조 방법이다.(d) binding a ligand to a hydrophilic material terminal of the ASO-polymer conjugate separated from the solid support; and a ligand-binding ASO-polymer complex manufacturing method comprising a.

보다 바람직한 구체적인 예는 기능기가 부착되어있는 고형지지체(CPG)에 친수성 물질을 결합시키는 단계; 기능기-친수성 물질이 결합되어있는 고형지지체(CPG)에 ASO를 합성하는 단계; 상기 ASO의 말단기에 소수성 물질을 공유결합 시키는 과정으로 합성하는 단계; 합성이 완료되면 고형지지체(CPG)로부터 기능기-ASO-고분자 접합체를 분리하는 단계; 및 상기 기능기를 통해 리간드를 친수성 고분자 말단에 부착하여 리간드 결합 ASO-고분자 복합체를 제조하는 단계;를 포함하여 이루어지며, 제조가 완료되면 고속 액체 크로마토그래피(HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY, HPLC)를 이용하여 상기 반응물들과 ASO-고분자 접합체를 분리 정제한 뒤 MALDI-TOF 질량 분석기로 분자량을 측정하여 목적하는 리간드 결합ASO-고분자 접합체가 제조되었는지를 확인할 수 있다. More preferred specific examples include the steps of bonding a hydrophilic material to a solid support (CPG) to which a functional group is attached; Synthesizing ASO to a solid support (CPG) to which a functional group-hydrophilic material is bound; Synthesizing by covalently bonding a hydrophobic material to the terminal group of the ASO; Separating the functional group-ASO-polymer conjugate from the solid support (CPG) when the synthesis is completed; And attaching a ligand to a hydrophilic polymer terminal through the functional group to prepare a ligand-binding ASO-polymer complex. When the preparation is completed, the high-performance liquid chromatography (HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY, HPLC) is used. After separating and purifying the reactants and the ASO-polymer conjugate, MALDI-TOF mass spectrometry can determine the desired ligand-bound ASO-polymer conjugate.

또 다른 양태로, ASO의 5말단에 친수성 물질이 부착된 형태의 ASO-고분자 접합체에 리간드가 부착된 형태의 리간드 결합 ASO-접합체를 제조하는 방법은 In another embodiment, a method of preparing a ligand-binding ASO-conjugate in which a ligand is attached to an ASO-polymer conjugate in which a hydrophilic substance is attached to five ends of an ASO is provided.

(a) 기능기가 부착되어있는 고형지지체를 기반으로 ASO를 합성하는 단계; (a) synthesizing ASO based on a solid support having a functional group attached thereto;

(b) 상기 ASO 말단에 친수성 물질을 공유결합 시키는 단계; (b) covalently bonding a hydrophilic material to the ASO end;

(c) 상기 친수성 물질이 결합한 ASO 접합체에 리간드를 공유결합 시키는 단계;(c) covalently binding a ligand to the ASO conjugate to which the hydrophilic material is bound;

(d) 상기 기능기가 부착된 ASO-친수성 고분자-리간드 접합체를 고형지지체로부터 분리하는 단계;(d) separating the ASO-hydrophilic polymer-ligand conjugate to which the functional group is attached from the solid support;

(e) 상기 고형지지체로부터 분리된 ASO 3´말단에 소수성 물질을 공유결합 시키는 단계;를 (e) covalently attaching a hydrophobic material to the ASO 3 ′ end separated from the solid support;

포함하는 리간드 결합 ASO-고분자 접합체의 제조방법이다.It is a method for producing a ligand-binding ASO-polymer conjugate containing.

보다 바람직한 구체적인 예는 기능기가 부착되어있는 고형지지체(CPG)를 기반으로 ASO를 합성하는 단계; 상기 ASO의 말단기에 친수성 물질을 공유결합 시키는 과정으로 합성하는 단계; 상기 ASO-친수성 물질에 리간드를 공유결합 시키는 과정으로 합성하는 단계; 합성이 완료되면 고형지지체(CPG)로부터 기능기가 부착된 ASO-친수성 고분자-리간드 접합체를 분리하는 단계; 및 상기 기능기를 통해 소수성 물질을 부착하여 친수성 고분자의 반대편 말단에 소수성 물질이 부착된 리간드 결합 ASO-고분자 접합체를 합성하는 단계; 를 포함하여 이루어지며, 제조가 완료되면 고속 액체 크로마토그래피(HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY, HPLC)를 이용하여 상기 반응물들과 ASO-고분자 접합체를 분리 정제한 뒤 MALDI-TOF 질량 분석기로 분자량을 측정하여 목적하는 리간드 결합 ASO-고분자 접합체가 제조되었는지를 확인할 수 있다.More preferred specific examples include the steps of synthesizing ASO based on a solid support (CPG) to which a functional group is attached; Synthesizing by covalently bonding a hydrophilic material to the end group of the ASO; Synthesizing by covalently binding a ligand to the ASO-hydrophilic material; Separating the ASO-hydrophilic polymer-ligand conjugate to which functional groups are attached from the solid support (CPG) when the synthesis is completed; And attaching a hydrophobic substance through the functional group to synthesize a ligand-binding ASO-polymer conjugate having a hydrophobic substance attached to the opposite end of the hydrophilic polymer. When the production is complete, the reaction product and the ASO-polymer conjugate are separated and purified using high performance liquid chromatography (HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY, HPLC), and then the molecular weight is measured using a MALDI-TOF mass spectrometer. It can be confirmed whether a ligand bound ASO-polymer conjugate has been prepared.

상기와 같이 본 발명에서 합성된 ASO-고분자 접합체는 소수성 및 친수성 물질을 모두 포함하고 있는 양친매성이며, 친수성 부분은 체내에 존재하는 물 분자들과 수소결합 등의 상호작용을 통해 친화력을 가지고 있어 바깥쪽으로 향하게 되고, 소수성 물질들은 그들 간의 소수성 상호작용(hydrophobic interaction)을 통해 안쪽으로 향하게 되어 열역학적으로 안정한 나노입자(nanoparticle)를 형성하게 된다. 즉, 나노입자의 중심에 소수성 물질이 위치하게 되고, ASO의 바깥쪽에 친수성 물질이 위치하여 ASO를 보호하는 형태의 나노입자를 형성한다(도1 참조). 이렇게 형성된 나노입자는 ASO의 세포 내 전달을 향상시키며, 이를 질병의 치료목적으로 응용하는 것이 가능하다. 보다 구체적인 접합체의 제조와 접합체로 구성된 나노입자의 특징, 세포전달 효율 및 효과는 후술하는 실시예에서 더욱 상세히 설명한다. As described above, the ASO-polymer conjugate synthesized in the present invention is amphiphilic containing both hydrophobic and hydrophilic substances, and the hydrophilic portion has an affinity through interaction of water molecules existing in the body with hydrogen bonds, etc. Hydrophobic materials are inward through hydrophobic interactions between them to form thermodynamically stable nanoparticles. That is, the hydrophobic material is located at the center of the nanoparticles, and the hydrophilic material is located outside the ASO to form nanoparticles that protect the ASO (see FIG. 1). The nanoparticles thus formed improve the intracellular delivery of ASO, which makes it possible to apply them for the treatment of diseases. The production of more specific conjugates and the characteristics, cell transfer efficiency and effects of the nanoparticles composed of the conjugates will be described in more detail in the following examples.

또한, 본 발명은 상기 ASO-고분자 접합체로 구성된 나노입자를 준비하는 단계와 상기 나노입자를 통해 생체 외(in vitro)상에서 ASO를 전달하는 단계를 포함하는 유전자 치료방법을 제공한다. 상기 유전자 치료방법은 생체 외(in vitro)상에 적용하는 것에만 한정된 것은 아니다. The present invention also provides a gene therapy method comprising preparing a nanoparticle consisting of the ASO-polymer conjugate and delivering ASO in vitro through the nanoparticle. The gene therapy method is not limited only to the application in vitro .

또한, 본 발명은 상기 ASO-고분자 접합체 또는 ASO-고분자 접합체로 구성된 나노입자의 유효량을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.The present invention also provides a pharmaceutical composition comprising an effective amount of nanoparticles composed of the ASO-polymer conjugate or ASO-polymer conjugate.

본 발명의 조성물은 투여를 위하여 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체 1종 이상을 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 본 발명의 유효성분과 양립 가능하여야 하며, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 하나 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있고, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화 할 수 있다. 더 나아가 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 적절한 방법으로 또는 레밍톤의 약학 과학(Remington´s pharmaceutical Science, Mack Publishing company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.The composition of the present invention may be prepared containing one or more pharmaceutically acceptable carriers in addition to the active ingredients described above for administration. Pharmaceutically acceptable carriers should be compatible with the active ingredients of the present invention and may be used in combination with saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and one or more of these components. Other conventional additives such as antioxidants, buffers, bacteriostatics, etc. may be added as necessary. In addition, diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants may be additionally added to formulate injectable formulations such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like. Furthermore, according to the diseases or components according to the diseases or by using the methods disclosed in Remington's pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA, by appropriate methods commonly used in the art to which the present invention pertains. It can be preferably formulated according to.

본 발명의 약제학적 조성물은 통상의 환자의 증후와 질병의 심각도에 기초하여 본 기술 분야의 통상의 전문가가 결정할 수 있다. 또한 산제, 정제, 캡슐제, 액제, 주사제, 연고제, 시럽제 등의 다양한 형태로 제제화 할 수 있으며, 단위-투여량 또는 다-투여량용기, 예를 들면 밀봉된 앰플 및 병 등으로 제공 될 수도 있다. The pharmaceutical composition of the present invention can be determined by one of ordinary skill in the art based on the usual patient's symptoms and the severity of the disease. It may also be formulated in various forms, such as powders, tablets, capsules, solutions, injections, ointments, syrups, etc., and may also be provided in unit-dose or multi-dose containers such as sealed ampoules and bottles. .

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 투여경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 구강, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 장관, 설하 또는 국소 투여가 가능하다. 이와 같은 임상 투여를 위해 본 발명의 약제학적 조성물은 공지의 기술을 이용하여 적합한 제형으로 제제화 할 수 있다. The pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally. The route of administration of the pharmaceutical composition according to the present invention may be, but is not limited to, oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intradermal, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, , Sublingually or topically. For such clinical administration, the pharmaceutical composition of the present invention can be formulated into a suitable formulation using known techniques.

본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 본 기술 분야의 통상의 전문가가 용이하게 결정할 수 있다.The dosage of the composition of the present invention varies in the range depending on the weight, age, sex, health condition, diet, time of administration, method, excretion rate and severity of the disease of the patient, and easily available to those skilled in the art. You can decide.

본 발명은 암 및 감염성 질병 등의 다양한 질병의 유전자 치료에 유용하게 사용될 수 있는 ASO의 전달 효율성을 향상 시키기 위해 ASO와 고분자 화합물을 단순 공유 결합 또는 링커-매개(linker-mediated) 공유결합을 이용하여 접합시킨 ASO 접합체, 상기 접합체의 제조방법 및 상기 ASO 접합체의 세포 내 전달 기술을 제공한다. The present invention uses a simple covalent bond or linker-mediated covalent bond between ASO and a polymer compound to improve the transfer efficiency of ASO, which can be useful for gene therapy of various diseases such as cancer and infectious diseases. Provided are a conjugated ASO conjugate, a method for preparing the conjugate, and an intracellular delivery technology of the ASO conjugate.

본 발명의 ASO- 고분자 접합체 및 ASO-고분자 접합체로 구성된 나노입자는 ASO의 생체 내 안정성을 향상시킴으로써 세포 내로 치료용 ASO를 효율적으로 전달할 수 있으며, 형질주입 물질 없이도 말단이 변형되지 않은 ASO에 대비하여 비교적 낮은 농도의 투여량에서 ASO의 활성을 나타낼 수 있으므로, 암 및 감염성 질병 등의 다양한 질병을 위한 ASO 치료용 도구뿐만 아니라, 새로운 형태의 ASO 전달 시스템으로 생명공학을 위한 기초연구와 의학 산업에 매우 유용하게 사용될 수 있다. The nanoparticles composed of the ASO-polymer conjugate and the ASO-polymer conjugate of the present invention can efficiently deliver therapeutic ASO into cells by improving the in vivo stability of ASO, and in contrast to ASOs whose ends are not modified without transfection materials. ASO's activity at relatively low concentrations can result in ASO therapeutic tools for a variety of diseases, including cancer and infectious diseases, as well as new forms of ASO delivery systems that are very useful for basic research and biomedical industries. It can be usefully used.

도 1은 ASO-고분자 접합체를 포함하는 나노입자의 모식도.
도 2는 본 발명에 따른 ASO 및 ASO-고분자 접합체의 MALDI-TOF MS를 이용한 질량분석 결과 스펙트럼이며, 5과 3 양 말단에 4개의 뉴클레오사이드가 2-OCH3(Methoxy)로 변형된 뉴클레오티드(nucleotide) 서열이고, 'm'은 OCH3 (methoxy) group 을 의미한다.
(A) ASO의 MALDI-TOF data (M.W. 5967.9 Da), (B) ASO-고분자 접합체의 MALDI-TOF data (M.W. 8448 Da).
도 3은 ASO-고분자 접합체로 이루어진 나노입자의 물성 분석 결과.
(A) ASO-고분자 접합체로 이루어진 나노입자의 크기 및 다분산지수(polydispersity index, PDI) 값의 그래프,
(B) ASO-고분자 접합체로 이루어진 나노입자의 임계 미셀 농도 그래프.
도 4는 본 발명에 따른 ASO 및 ASO-고분자접합체의 종양세포 내 목표 유전자 발현 저해효과 확인을 위한 각 처리농도(10, 50, 100 nM)에 따른 mRNA 발현량 분석 결과(scramble, 대조군 서열인 서열번호 2번의 ASO; Survivin, 서바이빈 서열인 서열번호 1번의 ASO; ASO, 아무것도 접합되지 않은 ASO; ASO-고분자 접합체, 3PEG-ASO-5lipid 형태의 ASO 고분자 접합체)1 is a schematic of nanoparticles comprising an ASO-polymer conjugate.
Figure 2 is a spectrum of the mass spectrometry using MALDI-TOF MS of the ASO and ASO-polymer conjugate according to the present invention, four nucleosides at both ends of 5 and 3 nucleotides modified with 2-OCH 3 (Methoxy) ( nucleotide) sequence, and 'm' means OCH 3 (methoxy) group.
(A) MALDI-TOF data of ASO (MW 5967.9 Da), (B) MALDI-TOF data of ASO-polymer conjugate (MW 8448 Da).
3 is a physical property analysis of nanoparticles consisting of ASO-polymer conjugate.
(A) graph of the size and polydispersity index (PDI) value of nanoparticles consisting of ASO-polymer conjugates,
(B) Critical micelle concentration graph of nanoparticles consisting of ASO-polymer conjugates.
Figure 4 shows the results of mRNA expression analysis according to each treatment concentration (10, 50, 100 nM) to confirm the target gene expression inhibitory effect in tumor cells of ASO and ASO-polymer conjugate according to the present invention (sequence, the sequence of the control sequence) ASO No. 2; Survivin, ASO in SEQ ID NO: 1, the survivin sequence; ASO, ASO unconjugated; ASO-polymer conjugate, ASO polymer conjugate in the form of 3PEG-ASO-5lipid)

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for explaining the present invention in more detail, and it is obvious to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples according to the gist of the present invention. will be.

실시예 1. ASO-고분자 접합체의 제조Example 1 Preparation of ASO-Polymer Conjugates

본 발명의 실시예에서는 서바이빈(survivin)을 억제하기 위해 서바이빈(survivin) ASO를 사용하였다(Biol. Proced. Online 2004; 6(1): 250-256). 서바이빈은 지금까지 테스트된 대부분의 신생 종양이나 형질변이된 세포주에서 공통적으로 발현되는 단백질로서, 항암치료에 있어서 중요한 타겟이 될 것으로 예측되고 있다(Abbrosini G. et al. Nat. Med. 3(8):917-921, 1997).In an embodiment of the present invention, survivin ASO was used to inhibit survivin (Biol. Proced. Online 2004; 6 (1): 250-256). Survivin is a protein commonly expressed in most neoplastic tumors or transformed cell lines that have been tested so far, and is expected to be an important target for anticancer therapy (Abbrosini G. et al. Nat. Med. 3 ( 8): 917-921, 1997).

이하, 실시예에서는 사용된 ASO는 서열번호 1번으로 기재되는 서바이빈 특이적인 서열과 서열번호 2번으로 기재되는 대조군 서열로 구성되어 있다. Hereinafter, the ASO used in the examples is composed of a survivin specific sequence described in SEQ ID NO: 1 and a control sequence described in SEQ ID NO: 2.

(서열번호 1) survivin ASO (ISIS 23722), 5-TGTGCTATTCTGTGAATT-3(SEQ ID NO: 1) survivin ASO (ISIS 23722), 5-TGTGCTATTCTGTGAATT-3

(서열번호 2) scrambled control (ISIS 28598), 5-TAAGCTGTTCTATGTGTT-3(SEQ ID NO: 2) scrambled control (ISIS 28598), 5-TAAGCTGTTCTATGTGTT-3

상기 ASO서열은 β-시아노에틸포스포아미디트 (β-cyanoethylphosphoramidite)를 이용하여 DNA골격 구조를 이루는 포스포디에스터(phosphodiester) 결합을 연결해 가는 방법을 사용하여 상기 ASO를 합성하였다(Shina et al. Nucleic Acids Research, 12:4539-4557, 1984). The ASO sequence was synthesized by using a method of linking phosphodiester bonds forming a DNA skeleton using β-cyanoethylphosphoramidite (Shina et al. Nucleic Acids Research, 12: 4539-4557, 1984).

ASO의 합성 과정은 뉴클레오사이드(nucleoside)가 부착된 고형지지체(CPG)를 기반으로 차단제거(deblocking), 결합(coupling), 캐핑(capping) 및 산화(oxidation)로 이루어지는 사이클(cycle)을 반복함으로써 원하는 서열의 DNA를 얻게 된다. Synthesis of ASO is a cycle of deblocking, coupling, capping and oxidation based on nucleoside-attached solid support (CPG). By doing so, DNA of the desired sequence is obtained.

구체적으로, 첫 단계인 차단제거(deblocking)는 뉴클레오티드가 부착된 CPG에 3 % 트라이클로로아세트산(trichloroacteic acid, TCA)를 처리하여 DMT(4,4´-dimethoxytrityl)를 제거하는 단계; 다음 단계인 결합(coupling)은 이전 단계에서 CPG에 형성된 5´-수산(hydroxyl)기와 원하는 서열의 뉴클레오사이드 포스포아미디트 단량체(nucleoside phosphoramidite monomer)와 결합반응을 통해 뉴클레오티드 사슬이 연결되는 단계; 세 번째 단계인 캐핑(capping)은 결합단계에서 반응되지 않은 5´-수산기를 차단(blocking)하여 다음 사이클에서 결합 과정에서 원하지 않는 염기 배열을 갖는 뉴클레오티드 사슬을 배제하는 단계로, 무수초산(acetic anhydride)와 엔-메틸이미다졸(N-methylimidazole)을 처리하여 아세틸화(acetylation)되는 단계; 마지막 단계인 산화(oxidation)는 결합단계에서 형성된 5´-수산기와 포스포아미디트 간의 결합이 아인산트리에스터(phosphitetriester) 결합을 이루는데 이를 포스포디에스터(phosphodiester)결합으로 변환시키는 단계로, 0.02 M 산화용액(Oxidizing solution, 0.02 M-I2 in THF/Pyridine/H2O)을 처리하여 아인산(phosphite)이 인산(phosphate)으로 변경되는 단계이다. 해당 일련의 ASO의 합성과정은 DNA 합성기(384 Synthesizer, BIONEER, 한국)를 사용하여 진행되었다.Specifically, deblocking is a step of removing DMT (4,4′-dimethoxytrityl) by treating 3% trichloroacteic acid (TCA) to CPG to which nucleotides are attached; Coupling, the next step, is a step in which a nucleotide chain is linked through a coupling reaction with a 5′-hydroxyl group formed on CPG in a previous step and a nucleoside phosphoramidite monomer of a desired sequence; The third step, capping, is the blocking of unreacted 5'-hydroxyl groups in the binding step to eliminate nucleotide chains with unwanted base sequences in the subsequent cycle. Acetic anhydride ) And acetylation by treating N- methylimidazole; The final step, oxidation, is a step in which the bond between the 5'-hydroxyl group formed in the binding step and the phosphamidite forms a phosphitetriester bond, which is converted into a phosphodiester bond, which is 0.02 M Oxidizing solution (0.02 M-I2 in THF / Pyridine / H 2 O) is treated to change phosphorous (phosphite) to phosphate (phosphate). The series of ASO synthesis was performed using a DNA synthesizer (384 Synthesizer, BIONEER, Korea).

ASO-고분자 접합체(3´PEG-ASO-5´lipid)의 합성과정은 3´말단부위에 친수성 물질 PEG가 부여된3PEG-CPG 지지체로부터 차단제거(deblocking), 결합(coupling), 캐핑(capping) 및 산화(oxidation)의 과정을 통해 ASO를 합성하고, 이황화 결합이 포함되어 있는 24개의 탄소 수(C24)를 갖는 소수성 물질인 테트라도코산(tetradocosane) 을 5´말단에 부여하여 원하는 ASO-고분자 접합체를 제조하였다(대한민국공개특허공보 2009-0042297호 참조). Synthesis of the ASO-polymer conjugate (3'PEG-ASO-5'lipid) was performed by deblocking, coupling, capping and capping the 3PEG-CPG scaffold with the hydrophilic PEG at the 3 'end. ASO is synthesized through oxidation, and tetradocosane, a hydrophobic material having 24 carbon atoms (C 24 ) containing disulfide bonds, is added to the 5 ′ end to give the desired ASO-polymer conjugate. Was prepared (see Republic of Korea Patent Publication No. 2009-0042297).

또한 리간드가 부착된 리간드 결합 ASO-고분자 접합체(3´리간드-PEG-ASO-5´lipid)를 제조하기 위해, 아민기와 같은 기능기가 부착되어 있는 CPG로부터 차단제거(deblocking), 결합(coupling), 캐핑(capping) 및 산화(oxidation)의 과정을 통해 PEG 포스포아미디트(phosphoramidite)시약을 이용하여 PEG를 결합한 뒤, 차단제거(deblocking), 결합(coupling), 캐핑(capping) 및 산화(oxidation)의 과정을 통해 ASO를 합성하고, 이황화결합이 포함되어 있는 24개의 탄소 수(C24)를 갖는 소수성 물질인 테트라도코산 (tetradocosane) 을 5´말단에 부여하여 원하는 리간드가 부착 가능한ASO-고분자 접합체(3기능기-PEG-ASO-5lipid)를 제조하였다. 합성이 완료되면 60 ℃의 온탕기(water bath)에서 28 %(v/v) 암모니아(ammonia)를 처리하여 리간드가 부착 가능한ASO-고분자 접합체를 CPG로부터 떼어낸 뒤, 기능기를 통해 리간드를 부착시켜 원하는 리간드가 부착된 ASO-고분자 접합체(3´리간드-PEG-ASO-5´lipid)를 제조하였다. In addition, to prepare ligand-bound ligand-bound ASO-polymer conjugates (3 'ligand-PEG-ASO-5'lipid), deblocking, coupling, from CPG to which functional groups such as amine groups are attached, PEG is bound using PEG phosphoramidite reagent through the process of capping and oxidation, followed by deblocking, coupling, capping, and oxidation ASO-polymer conjugate is synthesized by ASO, and tetradocosane, a hydrophobic material having 24 carbon atoms (C 24 ) containing disulfide bonds, is attached to the 5 ′ end to attach a desired ligand to the ASO-polymer conjugate. (Trifunctional group-PEG-ASO-5lipid) was prepared. After the synthesis was completed, 28% (v / v) ammonia was treated in a 60 ° C water bath to remove the ligand-attached ASO-polymer conjugate from CPG, and then the ligand was attached through a functional group. ASO-polymer conjugates (3 ′ ligand-PEG-ASO-5 ′ lipid) with the desired ligands were prepared.

한편, ASO-고분자 접합체(3´lipid -ASO-5´PEG)를 합성하기 위해, 아민(amine)기와 같은 기능기가 부여된CPG로부터 차단제거(deblocking), 결합(coupling), 캐핑(capping) 및 산화(oxidation)의 과정을 통해 ASO를 합성하고, PEG 포스포아미디트(phosphoramidite)를 이용하여 5´말단에 부여하여 원하는 기능기-ASO친수성 고분자 접합체를 제조하였다. 기능기-ASO 친수성 고분자 접합체의 합성이 완료되면 60 ℃의 온탕기(water bath)에서 28 %(v/v) 암모니아(ammonia)를 처리하여 기능기-ASO 친수성 고분자 접합체를 CPG로부터 떼어낸 뒤, 기능기를 통해 소수성 물질을 결합시켜 원하는 친수성 및 소수성 물질이 결합된 형태의ASO- 고분자 접합체를 제조하였다. 이후, 고속 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)(LC-20A Prominence, SHIMADZU, 일본)를 수행하여 상기 반응물들과 ASO-고분자 접합체를 분리 정제하고, MALDI-TOF 질량 분석(MALDI TOF-MS, SHIMADZU, 일본)을 통해 상기의 ASO 및 ASO-고분자 접합체의 분자량을 측정하여 합성하고자 하는 염기서열과 부합되는지를 확인하였다.Meanwhile, to synthesize ASO-polymer conjugates (3'lipid -ASO-5'PEG), deblocking, coupling, capping and capping from CPG to which functional groups such as amine groups are applied ASO was synthesized through oxidation, and PEG-phosphamidite was added to the 5 ′ terminal to prepare a desired functional group-ASO hydrophilic polymer conjugate. After the synthesis of the functional group-ASO hydrophilic polymer conjugate was completed, 28% (v / v) ammonia was treated in a water bath at 60 ° C. to remove the functional group-ASO hydrophilic polymer conjugate from CPG. The hydrophobic material was bonded through a functional group to prepare an ASO-polymer conjugate in the form of the desired hydrophilic and hydrophobic material. Then, high performance liquid chromatography, HPLC) (LC-20A Prominence, SHIMADZU, Japan) to separate and purify the reactants and the ASO-polymer conjugate, and the ASO and ASO above by MALDI-TOF mass spectrometry (MALDI TOF-MS, SHIMADZU, Japan). -The molecular weight of the polymer conjugate was measured to confirm whether it is consistent with the base sequence to be synthesized.

실시예 2. 포스포티오에이트(phosphothioate)로 변형된 ASO-고분자 접합체의 합성Example 2 Synthesis of ASO-Polymer Conjugates Modified with Phosphothioate

본 실시예에서 사용된 ASO는DNA골격 구조를 이루고 있는 인산(phosphate)그룹이 포스포티오에이트(phosphothioate) 그룹으로 치환되어있는 S-올리고(S-oligo)를 이용하여 포스포티오에이트(phosphothioate)결합방법으로 연결된 것이다. ASO used in the present embodiment is phosphothioate using S-oligo in which a phosphate group constituting the DNA skeleton structure is substituted with a phosphothioate group. It is connected by a coupling method.

구체적으로는 우선 알려진 방법인, 차단제거(deblocking), 결합(coupling), 캐핑(capping) 및 산화(oxidation)로 이루어지는 반복과정(cycle)을 통해 ASO를 합성하였는데, S-올리고(S-oligo)를 사용하는 경우 산화 과정에서 0.02 M 산화용액(Oxidizing solution) 대신에 0.1 M 황화제(Sulfurizing Reagent)를 처리하였다. 해당 ASO의 합성과정을 통해 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열을 가지는 포스포티오에이트(phosphothioate)로 변형된 ASO를 합성하였다(Shina et al. Nucleic Acids Research, 12:4539-4557, 1984). 나머지 합성과정은 실시예 1과 유사한 방법이 사용되었다.Specifically, ASO was synthesized through a cycle consisting of deblocking, coupling, capping, and oxidation, which are known methods. S-oligo In case of using, instead of 0.02 M Oxidizing Solution, 0.1 M Sulfurizing Reagent was treated. ASO modified with phosphothioate having the sequence of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 was synthesized through the synthesis of the ASO (Shina et al. Nucleic Acids Research, 12: 4539-4557, 1984). For the rest of the synthesis, a method similar to Example 1 was used.

5과 3 양 말단에 4개의 뉴클레오사이드가 2-OCH3(Methoxy)로 변형된 ASO를 합성하는 경우, 2´-OCH3-DNA 형태로 변형된 부위의 뉴클레오사이드는 2´-OCH3-DNA 憊시아노에틸(-cyanoethyl) 포스포아미디트[rA(Bz),rC(Ac),rG(ibu),rU]를 이용하여 합성하여 골격구조를 포스포티오에이트(phosphothiolate)로 치환하는 방식으로 제조한 뒤, 앞서 기술한 바와 같이S-올리고를 이용하여 포스포티오에이트(phosphothiolate) 결합방법으로 DNA골격구조를 합성하는 방식으로 제조되었다. When synthesizing ASO with 4 nucleosides modified at 2-OCH 3 (Methoxy) at both ends of 5 and 3, the nucleosides of the modified site at 2′-OCH 3 -DNA form are 2′-OCH 3 Synthesis using DNA cyanoethyl phosphoramidite [rA (Bz), rC (Ac), rG (ibu), rU] to replace the skeletal structure with phosphothiolate After the preparation by the method, it was prepared by synthesizing the DNA skeleton structure by the phosphothiolate binding method using S-oligo as described above.

포스포티오에이트(phosphothiolate)로 변형된 ASO-고분자 접합체의 경우, 3´말단부위에 PEG가 부여된3´PEG-CPG를 지지체를 기반으로 알려진 방법인, 차단제거(deblocking), 결합(coupling), 캐핑(capping) 및 산화(oxidation)로 이루어지는 반복과정을 통해 포스포티오에이트로 변형된ASO 접합체를 합성한 뒤(대한민국공개특허공보 2009-0042297호 참조), 이황화 결합이 포함되어 있는 탄소수 24개의 소수성 물질인 테트라도코산(tetradocosane)을 5´말단에 부여함으로써, 원하는 포스포티오에이트로 변형된 ASO-고분자 접합체를 제조하였다.For ASO-polymer conjugates modified with phosphothiolates, 3 'PEG-CPG with PEG at the 3' end is known as a support-based method, deblocking, coupling, After the synthesis of phosphothioate-modified ASO conjugates through an iterative process consisting of capping and oxidation (see Korean Patent Publication No. 2009-0042297), a hydrophobic group of 24 carbon atoms containing disulfide bonds By assigning the substance tetradocosane at the 5 'end, an ASO-polymer conjugate modified with the desired phosphothioate was prepared.

또한 포스포티오에이트로 변형된 ASO-고분자 접합체 친수성 물질 말단부위에 리간드를 부여하기 위하여 3´CPG에 리간드가 결합될 수 있는 기능기를 부여한 뒤, 친수성 물질을 결합시키고 상기 반응을 수행하여 리간드가 부여될 수 있는 ASO-고분자 접합체를 제조하였다. In addition, in order to assign a ligand to the end of the ASO-polymer conjugate hydrophilic substance modified with phosphothioate, a functional group capable of binding a ligand to 3 ′ CPG is added, and then a hydrophilic substance is bound and the reaction is performed to give a ligand. ASO-polymer conjugates were prepared.

ASO-고분자 접합체의 합성이 완료되면 60 ℃의 온탕기(water bath)에서 28 %(v/v) 암모니아(ammonia)를 처리하여 ASO 및 ASO-고분자 접합체를 CPG로부터 떼어낸 뒤, 고속 액체 크로마토그래피(HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY, HPLC)(LC-20A Prominence, SHIMADZU, 일본)를 수행하여 상기 반응물들과 ASO-고분자접합체를 분리 정제하고, MALDI-TOF 질량 분석(MALDI TOF-MS, SHIMADZU, 일본)을 통해 상기의 ASO 및 ASO-고분자 접합체의 분자량을 측정하여 합성하고자 하는 염기서열과 부합되는지를 확인하였다 (도 2 참조).After the synthesis of the ASO-polymer conjugate was completed, 28% (v / v) ammonia was treated in a 60 ° C. water bath to separate the ASO and the ASO-polymer conjugate from the CPG, followed by high performance liquid chromatography. (HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY, HPLC) (LC-20A Prominence, SHIMADZU, Japan) was carried out to separate and purify the reactions and the ASO-polymer conjugate, and MALDI-TOF mass spectrometry (MALDI TOF-MS, SHIMADZU, Japan) was performed. By measuring the molecular weight of the ASO and ASO-polymer conjugate through the above to confirm whether it is compatible with the base sequence to be synthesized (see Figure 2).

실시예 3. ASO-고분자 접합체의 생체내의 동일한 조건에서의 안정성 평가Example 3. Evaluation of stability of ASO-polymer conjugates under the same conditions in vivo

상기 실시예 1및 실시예 2에서 합성, 분리한 ASO-고분자 접합체가 고분자 접합체가 결합되지 않은 원래 형태의 ASO에 비하여 ASO의 안정성이 향상되었는지 여부를 확인하였다. 고분자 접합체가 결합되지 않은 ASO와 ASO-고분자 접합체를 생체 내 조건을 모방한 형태인 30 및 50 % (v/v) FBS (fetal bovine serum)가 첨가된 배지에서 각각 0, 3, 5, 7 및 10일 동안 배양한 후 원래 ASO에 비해 분해된 정도를 전기영동법 또는 중합효소연쇄 반응법(PCR)으로 검증하였다. The ASO-polymer conjugate synthesized and separated in Examples 1 and 2 was confirmed whether the stability of the ASO is improved compared to the ASO of the original form in which the polymer conjugate is not bonded. ASO and ASO-polymer conjugates with no conjugated polymer conjugates 0, 3, 5, 7 and 7 in medium supplemented with 30 and 50% (v / v) fetal bovine serum (FBS), mimicking in vivo conditions, respectively. After incubation for 10 days, the degree of degradation compared to the original ASO was verified by electrophoresis or polymerase chain reaction (PCR).

그 결과, 사용된 FBS 농도와 무관하게ASO 고분자 접합체는 시간이 경과함에 따라 PEG가 ASO로부터 분리되는 것과 같은 양상을 보였을 뿐, ASO가 안정성을 나타낸 반면, ASO의 경우 3일 이후부터 안정성이 감소하였다. As a result, irrespective of the concentration of FBS used, the ASO polymer conjugate showed the same behavior as PEG was isolated from ASO over time, while ASO showed stability, while ASO decreased stability after 3 days. .

실시예 4. ASO-고분자 접합체의 나노입자(nanoparticle) 물성 분석Example 4 Analysis of Nanoparticle Properties of ASO-Polymer Conjugates

ASO-고분자 접합체는 ASO의 말단에 부여된 소수성 물질 간의 소수성 상호작용에 의하여 ASO-고분자 접합체로 이루어진 나노입자를 형성하게 된다(도 1참조). 제타 전위 측정기(zeta-potential measurement)를 통하여 ASO-고분자 접합체로 이루어진 나노입자의 임계 미셀 농도(critical micelle concentration, CMC) 및 크기를 측정하였다.ASO-polymer conjugates form nanoparticles consisting of ASO-polymer conjugates by hydrophobic interactions between hydrophobic materials imparted to the ends of ASO (see FIG. 1). The critical micelle concentration (CMC) and size of the nanoparticles consisting of ASO-polymer conjugates were measured by zeta-potential measurement.

실시예 4-1. ASO-고분자 접합체의 나노입자(nanoparticle)의 크기 측정Example 4-1. Size measurement of nanoparticles of ASO-polymer conjugates

실시예 2에서 제조한 서열번호 1번의 ASO-고분자 접합체의 나노입자 크기를 제타 전위 측정기로 측정하였다. 상기 ASO-고분자 접합체 50 ㎍을 1 ml의 DPBS(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) 에 녹인 뒤, 초음파분산기 (Wiseclean, DAIHAN, 한국)로 나노입자의 크기를 균질화(700 W; 진폭(amplitude) 20 %)하였다. 균질화된 나노입자는 제타전위측정기(Nano-ZS, MALVERN, 영국)으로 크기를 측정하였는데, 물질에 대한 굴절률(Refractive index)은 1.454, 흡수율(Absorption index)은 0.001로 하고, 용매인 물의 온도 25 ℃ 및 그에 따름 점도 및 굴절률을 입력하여 측정하였다. 1회 측정은 20번 반복으로 구성된 크기 측정으로 이루어졌고, 이를 3회 반복하였다. The nanoparticle size of the ASO-polymer conjugate of SEQ ID No. 1 prepared in Example 2 was measured with a zeta potential meter. 50 μg of the ASO-polymer conjugate was dissolved in 1 ml of DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline), and the size of the nanoparticles was homogenized (700 W; amplitude 20%) using an ultrasonic disperser (Wiseclean, DAIHAN, Korea). . Homogenized nanoparticles were sized with Zeta Potentiometer (Nano-ZS, MALVERN, UK). The refractive index of the material was 1.454, the absorption index was 0.001, and the solvent temperature was 25 ° C. And accordingly the viscosity and the refractive index were measured by input. One measurement consisted of a size measurement consisting of 20 iterations, which was repeated three times.

ASO-고분자 접합체로 구성된 나노입자의 크기는 100 내지 200 nm의 크기와 0.4 미만의 다분산지수(polydispersity index, PDI)값을 관찰할 수 있었다(도 3, (A) 참조), 다분산지수(polydispersity index, PDI)값은 낮을수록 해당 입자가 고르게 분포하고 있음을 판단할 수 있는 수치로, ASO-고분자 접합체로 구성된 나노입자는 비교적 균일한 크기의 나노입자를 형성하며, 이는 내포작용(endocytosis)을 통해 세포 내로 섭취되기에 충분한 크기이다(Kenneth A. Dawson et al. nature nanotechnology 4:84-85, 2009).The size of the nanoparticles composed of the ASO-polymer conjugate was observed to have a size of 100 to 200 nm and a polydispersity index (PDI) value of less than 0.4 (see FIG. 3, (A)), and the polydispersity index ( The lower the value of the polydispersity index (PDI), the more uniformly the particles are distributed.The nanoparticles composed of ASO-polymer conjugates form nanoparticles of relatively uniform size, which is called endocytosis. Is large enough to be taken into the cell through (Kenneth A. Dawson et al. Nature nanotechnology 4: 84-85, 2009).

실시예 4-2. ASO-고분자 접합체의 임계미셀농도 측정Example 4-2. Determination of Critical Micelle Concentration of ASO-Polymer Conjugates

단일 분자에 소수성 기와 친수성 기가 함께 들어있는 양친매성인 물질(amphiphile)은 계면활성제가 될 수 있는데, 계면활성제는 수용액에 용해되면 소수성 부분은 물과의 접촉을 피하기 위해 가운데로 모이고 친수성 부분은 바깥쪽으로 향하여 미셀을 형성하게 된다. 이때, 최초로 미셀을 형성하게 되는 농도를 임계 미셀 농도(critical micelle concentration, CMC)라고 한다. 형광 염료를 이용하여 CMC를 측정하는 방법은 미셀이 형성되기 전/후에 형광염료의 형광 값 그래프 곡선의 기울기가 급격하게 변하는 특성에 근거한 것이다. Amphiphiles, which contain both hydrophobic and hydrophilic groups in a single molecule, can be surfactants. When the surfactant is dissolved in an aqueous solution, the hydrophobic moieties are gathered in the middle to avoid contact with water and the hydrophilic moieties outward. To form a micelle. In this case, the concentration at which micelles are first formed is called a critical micelle concentration (CMC). The method of measuring CMC using fluorescent dyes is based on the characteristic that the slope of the fluorescent value graph curve of the fluorescent dye before and after micelles is rapidly changed.

ASO-고분자접합체로 구성된 나노입자의 임계 미셀농도 측정을 위하여 형광 염료인 0.04 mM DPH(1,6-Diphenyl-1,3,5-hexatriene, SIGMA, USA)를 준비한다. 서열번호 1번의 ASO-고분자 접합체 1 nmole/㎕를 0.0977 ㎍/ml에서 최고 50 ㎍/ml의 농도로 DPBS로 단계별로 희석하여, 총 180㎕의ASO-고분자접합체 시료를 준비한다. 준비된 시료에 0.04mM DPH와 대조군으로 쓰일 DPH의 용매인 메탄올을 각각 20㎕씩 더하여 잘 섞어준 뒤, 실시예4-1과 동일한 방법으로 초음파 분산기(Wiseclean, DAIHAN, 한국)를 통해 나노입자의 크기를 균질화(700 W; 진폭(amplitude) 20 %)하였다. 균질화된 시료는 빛을 차단된 상온 조건에서 약 24 시간 반응시킨 뒤, 형광 값(excitation: 355 nm, emission: 428 nm, top read)을 측정하였다. 측정된 형광 값들은 상대적인 형광 값을 확인하는 것이기 때문에 동일 농도에서 DPH 포함된 시료의 형광 값-메탄올만 포함된 시료의 형광 값 구하여(Y축)을 처리한 ASO-고분자접합체 농도의 log 값(X축)에 대한 그래프로 도시하였다(도 3. (B) 참조).A fluorescent dye 0.04 mM DPH (1,6-Diphenyl-1,3,5-hexatriene, SIGMA, USA) is prepared to measure the critical micelle concentration of nanoparticles composed of ASO-polymer conjugates. A total of 180 μl of ASO-polymer conjugate samples were prepared by diluting 1 nmole / μl of the ASO-polymer conjugate of SEQ ID NO: 1 with DPBS stepwise at a concentration of 0.0977 μg / ml up to 50 μg / ml. After adding 0.04 mM DPH and 20 μl of methanol, a solvent of DPH, to be used as a control group, 20 μl each was mixed well. Was homogenized (700 W; 20% amplitude). The homogenized sample was reacted with light at room temperature for about 24 hours, and the fluorescence value (excitation: 355 nm, emission: 428 nm, top read) was measured. Since the measured fluorescence values confirm the relative fluorescence values, the log value (X value) of the ASO-polymer conjugate concentration obtained by obtaining the fluorescence value of the sample containing only DPH-methanol (Y axis) at the same concentration (X-axis) Axis) (see Figure 3. (B)).

각 농도 별 측정된 형광 값은 저 농도 구간에서 고 농도 구간으로 이동하면서 급격하게 증가하게 되는데, 이렇게 급격하게 증가하는 지점의 농도가 CMC농도가 된다. 따라서 형광 량이 증가하지 않는 저 농도 구간과 형광 량이 증가한 고농도 구간을 몇 지점으로 구분하여 추세 선을 그리고, 두 추세 선이 만나는 교차점의 X 값이 CMC농도가 된다. 측정된 ASO-고분자접합체의 CMC는 1.56㎍/ml로 매우 낮게 형성됨이 관찰되었으며, 이로써 ASO-고분자접합체로 이루어진 나노입자가 매우 낮은 농도에서도 미셀을 잘 형성할 수 있다는 것을 확인하였다.The fluorescence value measured for each concentration is rapidly increased while moving from the low concentration section to the high concentration section, and the concentration of the rapidly increasing point becomes the CMC concentration. Therefore, the trend line is drawn by dividing the low concentration section where the fluorescence does not increase and the high concentration section where the fluorescence is increased into several points, and the X value of the intersection point where the two trend lines meet becomes the CMC concentration. It was observed that the CMC of the measured ASO-polymer conjugate was formed very low at 1.56 µg / ml, thereby confirming that nanoparticles composed of the ASO-polymer conjugate were able to form micelles well even at very low concentrations.

실시예 5. ASO-고분자 접합체와 형질주입 물질(transfection reagent)을 이용한 종양 세포주에서의 목표 유전자의 발현 억제Example 5 Inhibition of Target Gene Expression in Tumor Cell Lines Using ASO-Polymer Conjugates and Transfection Reagents

실시예 2에서 제조한 아무것도 접합되지 않은 ASO 와 ASO-고분자 접합체를 이용하여 종양세포주인 인간 대장암 세포주 (SW480)를 형질주입 시키고, 상기 형질주입 된 종양세포주의 서바이빈의 발현 양상을 분석하였다. The human colon cancer cell line (SW480), which is a tumor cell line, was transfected using ASO and ASO-polymer conjugate to which nothing was prepared in Example 2, and the expression pattern of survivin of the transfected tumor cell line was analyzed. .

5-1. 종양 세포주의 배양 5-1. Culture of tumor cell lines

미국 종균협회(American type Culture Collection, ATCC)로부터 입수한 인간 대장암 세포주 (SW480)는 생장배지(Leibovitz´s L-15 배양배지, GIBCO/Invitorgen; 미국)에 10 %(v/v) 우태아 혈청, 페니실린 100 units/ml, 스트렙토마이신 100㎍/ml을 첨가하고 37 ℃, 5 %(v/v) 이산화탄소(CO2)의 조건하에 배양하였다.Human colorectal cancer cell line (SW480) obtained from the American Type Culture Collection (ATCC) was 10% (v / v) fetuses in growth medium (Leibovitz's L-15 culture medium, GIBCO / Invitorgen, USA). Serum, penicillin 100 units / ml, streptomycin 100 μg / ml were added and incubated under 37 ° C., 5% (v / v) carbon dioxide (CO 2 ).

실시예 5-2. ASO-고분자 접합체를 이용한 종양세포주의 형질주입Example 5-2. Transfection of Tumor Cell Lines Using ASO-Polymer Conjugates

상기 실시예 2에서 제조한 아무것도 접합되지 않은 ASO 와 ASO-고분자 접합체를 이용하여 종양세포주인 인간 대장암 세포주(SW480)를 형질주입 시키고, 상기 형질주입 된 종양세포주의 서바이빈의 발현 양상을 분석하였다. The human colon cancer cell line (SW480), which is a tumor cell line, was transfected using ASO and ASO-polymer conjugate, none of which was prepared in Example 2, and the expression pattern of survivin of the transfected tumor cell line was analyzed. It was.

상기 실시예 5-1에서 배양된 종양세포주는 웰(well)당 1.3 × 105를 상기 실시예의 5-1 조건으로 6-웰 플레이트에서 18시간 동안 생장배지(Leibovitzs L-15 배양배지, GIBCO/Invitorgen; 미국)에서 배양한 뒤, 배지를 제거한 후 각 웰당 800㎕의Opti-MEM(modification of Eagle's Minimum Essential Media, GIBCO/Invitorgen; 미국) 배지를 분주하였다.Tumor cell lines cultured in Example 5-1 were grown in a 6-well plate for 18 hours under a condition of 1.3 × 10 5 per well (Leibovitzs L-15 culture medium, GIBCO / After culturing in Invitorgen (USA), the medium was removed, and 800 μl of Opti-MEM (Modification of Eagle's Minimum Essential Media, GIBCO / Invitorgen; USA) medium was dispensed per well.

한편, 리포펙타민(Lipofectamine™ 2000, Invitrogen; 미국) 2㎕와 Opti-MEM 배지 198㎕를 혼합하고, 실온에서 5분간 반응시킨 다음, 상기 실시예 1및 실시예 2에서 제조한 각각의 ASO-고분자 접합체(25 pmole/㎕)를 최종10, 50, 100 nM의 농도로 처리한 뒤, 다시 실온에서 20분간 반응시켜서 용액을 제조하였다. Meanwhile, 2 μl of Lipofectamine ™ (Lipofectamine ™ 2000, Invitrogen; USA) and 198 μl of Opti-MEM medium were mixed and allowed to react at room temperature for 5 minutes, and then each ASO- prepared in Example 1 and Example 2 above. After treating the polymer conjugate (25 pmole / μl) to the final concentration of 10, 50, 100 nM, and reacted again at room temperature for 20 minutes to prepare a solution.

그 후, Opti-MEM이 분주된 종양세포주의 각 웰에 형질주입용 용액을 각각 200㎕씩 분주하고 6시간 동안 배양한 후, Opti-MEM 배지를 제거하였다. 여기에 생장배지(Leibovitz´s L-15 배양배지, GIBCO/Invitorgen; 미국) 2.5 ㎖를 분주한 다음 24 시간 동안 37 ℃, 5 %(v/v) 이산화탄소(CO2)의 조건하에 배양하였다. Thereafter, 200 μl of the solution for transfection was dispensed into each well of the tumor cell line to which Opti-MEM was dispensed, and cultured for 6 hours, and then the Opti-MEM medium was removed. 2.5 ml of growth medium (Leibovitz's L-15 culture medium, GIBCO / Invitorgen; USA) was dispensed and incubated under conditions of 37 ° C., 5% (v / v) carbon dioxide (CO 2 ) for 24 hours.

실시예 5-3. 서바이빈 유전자의 mRNA 상대적 정량 분석Example 5-3. Relative quantitative analysis of mRNA of survivin gene

실시예 5-3에서 형질주입된 세포주로부터 전체 RNA를 추출하여 cDNA를 합성한 뒤, 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)을 통하여 서바이빈 유전자의 mRNA 양을 특허 대한민국 공개특허 공보2009-0042297호의 방법에 따라서 상대정량 하였다(도 4 참조). After extracting the entire RNA from the cell line transfected in Example 5-3 synthesized cDNA, the mRNA amount of survivin gene through the real-time PCR (Patent Real Time) Relative quantification was carried out according to the method of 0042297 (see Fig. 4).

아무것도 접합되지 않은ASO와 ASO-고분자 접합체의 목표유전자 발현저해효과를 분석하기 위해 형질주입물질과 함께 형질 전환시킨 뒤, 서바이빈 유전자의 mRNA발현 정도를 비교한 결과, ASO-고분자 접합체는 접합체가 없는 아무것도 접합되지 않은ASO와 유사한 정도의 발현 저해를 나타내어, 고분자가 접합되어있는 형태가 ASO의 메커니즘(mechanism)을 방해하지 않는 것으로 사료된다. In order to analyze the target gene expression inhibitory effect of the ASO-ASO-polymer conjugate with no conjugates, it was transformed with the transfectants and compared with the mRNA expression level of survivin gene. It is thought that nothing without expression shows a similar degree of expression inhibition as unconjugated ASO, so that the conjugated form of the polymer does not interfere with the mechanism of ASO.

실시예 6. ASO-고분자 접합체만을 이용한 종양 세포주에서의 목표 유전자의 발현 억제Example 6 Inhibition of Target Gene Expression in Tumor Cell Lines Using ASO-Polymer Conjugates Only

실시예 1 및 실시예 2에서 제조한 각 각의 ASO-고분자 접합체를 이용하여 종양세포주인 인간 대장암 세포주 (SW480)를 형질주입 시키고, 상기 형질주입 된 종양세포주의 서바이빈의 발현 양상을 분석하였다. The human colon cancer cell line (SW480), a tumor cell line, was transfected using the respective ASO-polymer conjugates prepared in Examples 1 and 2, and the expression patterns of survivin of the transfected tumor cell line were analyzed. It was.

실시예 6-1. 종양 세포주의 배양Example 6-1. Culture of tumor cell lines

미국 종균협회(American type Culture Collection, ATCC)로부터 입수한 인간 대장암 세포주 (SW480)는 생장배지(Leibovitz´s L-15 배양배지, GIBCO/Invitorgen; 미국)에 10 %(v/v) 우태아 혈청, 페니실린 100 units/ml, 스트렙토마이신 100㎍/ml을 첨가하고 37 ℃, 5 %(v/v) 이산화탄소(CO2)의 조건하에 배양하였다.Human colorectal cancer cell line (SW480) obtained from the American Type Culture Collection (ATCC) was 10% (v / v) fetuses in growth medium (Leibovitz's L-15 culture medium, GIBCO / Invitorgen, USA). Serum, penicillin 100 units / ml, streptomycin 100 μg / ml were added and incubated under 37 ° C., 5% (v / v) carbon dioxide (CO 2 ).

실시예 6-2. ASO-고분자 접합체를 이용한 종양세포주의 형질 전환Example 6-2. Transformation of Tumor Cell Lines Using ASO-Polymer Conjugates

실시예 6-1에서 배양된 종양세포주 웰(well)당 1.3 × 105 을 상기 실시예 5-1 조건으로 6-웰 플레이트에서 18시간 동안 생장배지(Leibovitzs L-15 배양배지, GIBCO/Invitorgen; 미국)에서 배양한 뒤, 배지를 제거한 후, 각 웰당 800 ㎕의 Opti-MEM 배지를 분주하였다.1.3 × 10 5 per well of tumor cell line cultured in Example 6-1 was grown in a 6-well plate for 18 hours under the conditions of Example 5-1 (Leibovitzs L-15 culture medium, GIBCO / Invitorgen; After incubation in the US, the medium was removed and 800 μl Opti-MEM medium was dispensed per well.

Opti-MEM 배지 100㎕와 상기 실시예 1, 2에서 제조한 각각의 ASO-고분자 접합체 (1 nmole/㎕) 5, 10, 100㎕를 첨가하고(500 nM, 1 μM, 10 μM 처리), 실시예4-1과 동일한 방법으로 초음파 분산기(Wiseclean, DAIHAN, 한국)를 통해 나노입자의 크기를 균질화(700 W; 진폭(amplitude) 20 %)하여 ASO-소수성 물질 접합체로 구성된 나노입자를 균등화하여 용액을 제조하였다.100 μl of Opti-MEM medium and 5, 10, 100 μl of each ASO-polymer conjugate prepared in Examples 1 and 2 (1 nmole / μl) were added (500 nM, 1 μM, 10 μM treatment) In the same manner as in Example 4-1, homogenizing the size of the nanoparticles (700 W; 20% amplitude) through an ultrasonic disperser (Wiseclean, DAIHAN, Korea) to equalize the nanoparticles composed of ASO-hydrophobic material conjugate Was prepared.

그 후, Opti-MEM이 분주된 종양세포주의 각 웰에 형질주입용 용액을 각각 100㎕ 씩 분주하고 24시간 동안 배양한 후, 20% FBS가 포함된 생장배지(Leibovitz´s L-15 배양배지, GIBCO/Invitorgen; 미국) 1 ml을 첨가하였다. 여기에 24 시간 동안 추가적으로 37 ℃, 5 %(v/v) 이산화탄소(CO2)의 조건하에 배양하여, ASO-고분자 복합체 처리 후 총 48 시간 동안 배양하였다.Thereafter, 100 μl of the transfection solution was dispensed into each well of Opti-MEM-dispersed tumor cell lines and incubated for 24 hours, followed by growth medium containing 20% FBS (Leibovitz´s L-15 culture medium). 1 ml of GIBCO / Invitorgen; USA) was added. It was further incubated for 24 hours under conditions of 37 ° C., 5% (v / v) carbon dioxide (CO 2 ), followed by a total of 48 hours after ASO-polymer complex treatment.

실시예 6-3. 서바이빈 유전자의 mRNA 상대적 정량 분석Example 6-3. Relative quantitative analysis of mRNA of survivin gene

실시예 6-2에서 형질주입된 세포주로부터 전체 RNA를 추출하여 cDNA를 합성한 뒤, 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)을 통하여 서바이빈 유전자의 mRNA 양을 대한민국공개특허2009-0042297호의 방법에 따라서 상대정량 하였다. After total RNA was extracted from the cell line transfected in Example 6-2, cDNA was synthesized, and the mRNA amount of survivin gene was determined by real-time PCR. Relative quantification was performed according to the method.

아무것도 접합되지 않은ASO와 ASO-고분자 접합체의 형질주입 물질 없는 조건에서 세포에 전달되어 서바이빈 유전자의 mRNA 발현 저해 정도를 비교한 결과 형질주입 물질이 없는 조건에서 ASO-고분자 접합체의 경우, 아무것도 변형하지 않은 ASO에 비하여 상대적으로 낮은 농도에서 목표유전자의 mRNA발현 저해를 유발함을 확인할 수 있었다. When the ASO-polymer conjugate was delivered to cells in the absence of the transfectants of the ASO and ASO-unconjugated conjugates, the mRNA expression inhibition of survivin gene was compared. It was confirmed that the mRNA expression of the target gene was induced at a relatively low concentration compared to ASO without.

따라서 본 발명에서 합성한 ASO-고분자 접합체 또는 ASO-고분자 접합체로 이루어진 나노입자는 형질주입 물질이 없는 조건에서도 세포 내로 전달이 되어 ASO의 목표유전자의 발현을 저해함을 확인 할 수 있었다.Therefore, it could be confirmed that the nanoparticles composed of the ASO-polymer conjugate or ASO-polymer conjugate synthesized in the present invention were delivered into cells even in the absence of the transfection material, thereby inhibiting the expression of the target gene of ASO.

Claims (21)

하기 구조식(1)의 구조를 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)와 고분자 물질 접합체;
A-X-R-Y-B 식(1)
(식 (1)에서 A와 B 중 하나는 친수성 물질이고, 다른 하나는 소수성 물질이며; X와 Y는 서로 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합이며; R은 ASO를 의미한다.)An antisense oligonucleotide (ASO) having a structure of the following formula (1) and a polymer material conjugate;
AXRYB expression (1)
(In Formula (1), one of A and B is a hydrophilic material and the other is a hydrophobic material; X and Y are independently of each other a simple covalent bond or a linker mediated covalent bond; R means ASO.) 제 1항에 있어서,
상기 ASO 는10 내지 50 개의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 것을 특징으로 하는 접합체. The method of claim 1,
The ASO conjugate is characterized in that consisting of 10 to 50 oligonucleotides. 제 2항에 있어서,
상기 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 뉴클레오티드 내 당 구조의 2´탄소 위치에서 -OH 기가 CH3(메틸), -OCH3, -NH2, -F(불소), -O-2-메톡시에틸 -O-프로필(propyl), -O-2-메틸티오에틸(methylthioethyl), -O-3-아미노프로필, -O-3-디메틸아미노프로필, -O-N-메틸아세트아미도 또는 -O-디메틸아미도옥시에틸로의 치환에 의한 변형; 뉴클레오티드 내 당 구조 내의 산소가 황으로 치환된 변형; 뉴클레오티드 간 결합의 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 또는 보라노포스페이트(boranophosphophate), 메틸포스포네이트(methyl phosphonate) 결합으로의 변형이 하나 또는 둘 이상의 조합되어 변형되거나, PNA(peptide nucleic acid) 또는 LNA(locked nucleic acid) 형태로의 변형 된 것을 특징으로 하는 접합체.The method of claim 2,
The oligonucleotides are those in which the -OH group is CH 3 (methyl), -OCH 3 , -NH 2 , -F (fluorine), -O-2-methoxyethyl -O- at the 2 ′ carbon position of the sugar structure in one or more nucleotides. Propyl, -O-2-methylthioethyl, -O-3-aminopropyl, -O-3-dimethylaminopropyl, -O- N -methylacetamido or -O-dimethylamido Modification by substitution with oxyethyl; A modification in which the oxygen in the sugar structure in the nucleotide is replaced with sulfur; Modification of internucleotide linkages to phosphorothioate or boranophosphophate, methyl phosphonate linkages can be modified in one or more combinations, or in combination with peptide nucleic acid (PNA) or LNA ( conjugated to a locked nucleic acid) form. 제 1항에 있어서,
상기 친수성 물질은 분자량 200 내지 10,000 인 고분자 화합물인 것을 특징으로 하는 접합체.The method of claim 1,
The hydrophilic material is a conjugate, characterized in that the polymer compound having a molecular weight of 200 to 10,000. 제 4항에 있어서,
상기 친수성 물질은 폴리에틸린글리콜(PEG,polyethylene), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrolidone), 및 폴리옥사졸린(polyoxazoline)의 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 접합체.5. The method of claim 4,
The hydrophilic material is a conjugate, characterized in that selected from the group of polyethylene glycol (PEG, polyethylene), polyvinylpyrolidone (polyvinylpyrolidone), and polyoxazoline (polyoxazoline). 제 1항에 있어서,
상기 소수성 물질은 분자량 250 내지 1,000임을 특징으로 하는 접합체.The method of claim 1,
The hydrophobic material is a conjugate, characterized in that the molecular weight of 250 to 1,000. 제 6항에 있어서,
상기 소수성 물질은 C12내지C50의 탄화수소 또는 콜레스테롤인 것을 특징으로 하는 접합체.The method according to claim 6,
The hydrophobic material is a C 12 to C 50 hydrocarbon or cholesterol characterized in that the conjugate. 제 1항에 있어서,
상기 공유결합은 비분해성 결합 또는 분해성 결합인 것을 특징으로 하는 접합체.The method of claim 1,
The covalent bond is a conjugate, characterized in that the non-degradable bond or degradable bond. 제 8항에 있어서,
상기 비분해성 결합은 아미드 결합 또는 인산화 결합인 것을 특징으로 하는 접합체.The method of claim 8,
Said non-degradable bond is an amide bond or a phosphorylation bond. 제 8항에 있어서,
상기 분해성 결합은 이황화 결합, 산분해성 결합, 에스테르 결합, 하이드라이드 결합, 생분해성 결합 및 효소 분해성 결합 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 접합체.The method of claim 8,
The degradable bond is a conjugate, characterized in that selected from disulfide bonds, acid decomposable bonds, ester bonds, hydride bonds, biodegradable bonds and enzyme degradable bonds. 제 1항 내지 10항 중 어느 한 항에 따른 ASO-고분자 접합체의 친수성 물질에 리간드가 결합된 것을 특징으로 하는 리간드 결합 ASO-고분자 접합체.Ligand binding ASO-polymer conjugate, characterized in that the ligand is bound to the hydrophilic material of the ASO-polymer conjugate according to any one of claims 1 to 10. (a) 고형지지체에 친수성 물질을 공유결합 시키는 단계;
(b) 상기 친수성 물질을 포함하는 고형지지체 기반으로 ASO를 합성하는 단계;
(c) 상기 고형지지체 상의 ASO의 5´말단에 소수성 물질을 공유결합 시키는 단계;
(d) 상기 친수성 물질과 소수성 물질이 결합한ASO-고분자 접합체를 고형지지체로부터 분리 및 정제하는 단계;를 포함하는 ASO-고분자 접합체의 제조방법.(a) covalently bonding a hydrophilic material to the solid support;
(b) synthesizing ASO based on a solid support comprising the hydrophilic material;
(c) covalently attaching a hydrophobic material to the 5 ′ end of ASO on the solid support;
(d) isolating and purifying the ASO-polymer conjugate to which the hydrophilic material and the hydrophobic material are bound from a solid support; and a method for producing an ASO-polymer conjugate. (a) 기능기가 부착되어있는 고형지지체를 기반으로 ASO를 합성하는 단계;
(b) 상기 ASO 5´말단에 친수성 물질을 공유결합 시키는 단계;
(c) 상기 친수성 물질이 결합한 ASO 접합체를 고형지지체로부터 분리하는 단계;
(d) 상기 고형지지체로부터 분리된 ASO 3´말단에 소수성 물질을 공유결합 시키는 단계;를 포함하는 ASO-고분자 접합체의 제조방법.(a) synthesizing ASO based on a solid support having a functional group attached thereto;
(b) covalently bonding a hydrophilic material to the ASO 5 'end;
(c) separating the ASO conjugate to which the hydrophilic material is bound from the solid support;
(d) covalently attaching a hydrophobic material to the ASO 3 'end separated from the solid support; ASO-polymer conjugate manufacturing method comprising a. (a) 기능기가 부착되어있는 고형지지체에 친수성 물질을 결합 시키는 단계;
(b) 상기 기능기-친수성 물질이 결합되어있는 고형지지체에 ASO를 합성하는 단계;
(c) 상기 ASO 5´말단에 소수성 물질을 공유결합 시키는 단계;
(d) 상기 친수성 물질과 소수성 물질이 결합한 ASO-고분자 접합체를 고형지지체로부터 분리하는 단계;
(d) 상기 고형지지체로부터 분리된 ASO-고분자 접합체의 친수성 물질 말단에 리간드를 결합시키는 단계;를 포함하는 리간드 결합 ASO-고분자 복합체 제조 방법.(a) coupling a hydrophilic material to a solid support having a functional group attached thereto;
(b) synthesizing ASO to a solid support to which the functional group-hydrophilic material is bound;
(c) covalently attaching a hydrophobic material to the ASO 5 'end;
(d) separating the ASO-polymer conjugate in which the hydrophilic material and the hydrophobic material are bound from a solid support;
(d) binding a ligand to a hydrophilic material end of the ASO-polymer conjugate separated from the solid support; ligand binding ASO-polymer complex manufacturing method comprising a. (a) 기능기가 부착되어있는 고형지지체를 기반으로 ASO를 합성하는 단계;
(b) 상기 ASO 말단에 친수성 물질을 공유결합 시키는 단계;
(c) 상기 친수성 물질이 결합한 ASO 접합체에 리간드를 공유결합 시키는 단계;
(d) 상기 기능기가 부착된 ASO-친수성 고분자-리간드 접합체를 고형지지체로부터 분리하는 단계;
(e) 상기 고형지지체로부터 분리된 ASO 3´말단에 소수성 물질을 공유결합 시키는 단계;를 포함하는 리간드 결합 ASO-고분자 접합체의 제조방법.(a) synthesizing ASO based on a solid support having a functional group attached thereto;
(b) covalently bonding a hydrophilic material to the ASO end;
(c) covalently binding a ligand to the ASO conjugate to which the hydrophilic material is bound;
(d) separating the ASO-hydrophilic polymer-ligand conjugate to which the functional group is attached from the solid support;
(e) covalently attaching a hydrophobic material to the ASO 3 'end separated from the solid support; a method for producing a ligand-binding ASO-polymer conjugate comprising a. 제 1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 ASO-고분자 접합체를 포함하는 나노입자.A nanoparticle comprising an ASO-polymer conjugate according to any one of claims 1 to 10. 제 11항의 리간드 결합 ASO-고분자 접합체를 포함하는 나노입자.A nanoparticle comprising the ligand binding ASO-polymer conjugate of claim 11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 ASO-고분자 접합체의 약학적 유효량을 포함하는 약제학적 조성물.A pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically effective amount of the ASO-polymer conjugate according to any one of claims 1 to 10. 제 16항의 나노입자를 약학적 유효량을 포함하는 약제학적 조성물.A pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically effective amount of the nanoparticles of claim 16. 제 11항의 리간드 결합 ASO-고분자 접합체의 약학적 유효량을 포함하는 약제학적 조성물.A pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically effective amount of the ligand binding ASO-polymer conjugate of claim 11. 제 17항의 나노입자를 약학적 유효량을 포함하는 약제학적 조성물.A pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically effective amount of the nanoparticles of claim 17.
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