KR20130056596A - 말에서 비티비/피오즈 도메인-포테슘 채널 도메인과 유사성을 가지는 신규 유전자 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 말에서 전사억제 도메인으로 알려진 BTB/POZ 도메인을 가지는 신규 유전자에 관한 것으로 경주마의 혈액과 근육 조직으로부터 RNA를 추출하여 RNA-seq 기법을 이용하여 말 조직에서 발현하는 BTB/POZ potassiumchannel 단백질 도메인을 가지는 신규 유전자를 동정하였다. 그 염기서열 분석 및 생물정보학 분석을 통하여 이 유전자가 전사억제 도메인 BTB/POZ을 포함하는 신규 단백질을 코딩함을 밝혔다.
Description
본 발명은 말에서 전사억제 도메인으로 알려진 BTB/POZ 도메인을 가지는 신규 유전자에 관한 것으로 경주마의 혈액과 근육 조직으로부터 RNA를 추출하여 RNA-seq 기법을 이용하여 말 조직에서 발현하는 BTB/POZ potassiumchannel 단백질 도메인을 가지는 신규 유전자를 동정하였다. 그 염기서열 분석 및 생물정보학 분석을 통하여 이 유전자가 전사억제 도메인 BTB/POZ을 포함하는 신규 단백질을 코딩함을 밝혔다.
BTB domain(Broad-Complex, ramtrack, andricabrac)은 초파리부터 사람에 이르기까지 진화적으로 보전적인 도메인으로서 주로 N-말단에 위치하는 징크 핑거 구조를 가지며(Godt D, Couderc JL, Cramton SE et al., 1993), 또한 POZ (poxvirusandincfinger)라고도 불린다(BardwellVJ,TreismanR., 1994). BTB 도메인은 배 발생을 조절하는 전사조절인자와 상호작용하는 부위로 국소적인 크로마틴 구조를 영향을 주어 타겟 유전자의 전사를 활성화하거나 억제한다(Albagli O, Dhordain P, Deweindt C., 1995). Potassium channel tetramerization domain (KCTD)는 한 개의 BTB 도메인을 가진다. 이 도메인은 앞에서 기술한 바와 같이 전사조절인자의 활성을 조절하며 KCTD 단백질은 다양한 생물학적 과정에서 타겟 유전자의 전사 조절을 통해 성장, 발달을 조절한다.
BTB/POZ 도메인을 가지는 KCTD단백질은 세포의 분화 및 발생(예:신경세포의 발생)에 중요한 역할을 하는 유전자의 전사조절 능력을 가지는 단백질로서 말에서는 보고된 바가 없으며, 또한 이 단백질의 타겟 유전자에 대한 정보는 아직 알려진 바가 없다.
BTB/POZ 도메인을 가지는 유전자와 관련된 참고기술로는, 악성 종양에서나 헥사클로로벤젠 노출과 관련된 유전자에 관한 기술(제 10-2010-0092164 호, 제 10-2010-0109075 호)이 있으나, 이 기술들은 인간에 존재하는 BTB/POZ 도메인 관련 유전자에 관한 기술로, 말에서의 BTB/POZ 도메인을 가지는 유전자에 대한 기술은 전무한 실정이다.
본 발명은 상기 문제점을 해결하고, 상기 필요성에 의해 말의 BTB/POZ channel 도메인을 가지는 유전자를 대량 RNA-seq 기법을 이용하여 동정하여 BTB/POZ 도메인을 가지는 단백질의 구조를 밝혀 이 단백질의 기능 규명에 기여하고자 한다.
상기와 같은 기술적 과제를 달성하기 위한 본 발명은 말에서 BTB/POZ 도메인-포테슘 채널 도메인과 상동성을 가지는 신규 단백질 유전자와 관련된 기술을 제공하고자 한다.
첫째, 말의 혈액 또는 근육으로부터 분리된, 서열번호 1에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 말의 신규 유전자를 제공한다.
둘째, 서열번호 1에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 말의 BTB/POZ 도메인-포테슘 채널 도메인과 유사성을 가지는 신규 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
셋째, 도 3에 기재된 KCTD 단백질에서 발견되는 BTB/POZ 도메인과 90% 이상의 상동성이 있는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산분자 또는 그의 상보체를 제공한다.
넷째, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 BTB/POZ 도메인-포테슘 채널 도메인과 유사성을 가지는 단백질을 형성하는 폴리펩티드 또는 그의 일부를 제공한다.
다섯째, 상기 폴리펩티드 또는 그의 일부로부터 구성되는 말의 BTB/POZ 도메인-포테슘 채널 도메인과 상동성을 가지는 신규 단백질을 제공한다.
BTB/POZ 도메인-포테슘 채널 도메인과 상동성을 가지는 단백질의 구조 및 전사조절능력을 구명하는데 기여함으로써 BTB/POZ 도메인-포테슘 채널 도메인과 상동성을 가지는 단백질을 이용한 전사조절 네트워크의 조절을 통한 말의 번식, 면역, 운동능력의 향상에 기여할 수 있을 것이다.
도 1은 말 BTB/POZ 도메인-포테슘 채널 도메인과 유사성을 가지는 단백질을 코딩하는 염기서열을 나타낸다.
도 2는 말 BTB/POZ 도메인-포테슘 채널 도메인과 유사성을 가지는 유전자의 염기서열로부터 아미노산 서열의 번역과정을 보여준다.
도 3은 말 BTB/POZ 도메인-포테슘 채널 도메인과 유사성을 가지는 단백질과 상동성을 보이는 단백질들 간의 상동성 분석 결과를 보여준다.
도 2는 말 BTB/POZ 도메인-포테슘 채널 도메인과 유사성을 가지는 유전자의 염기서열로부터 아미노산 서열의 번역과정을 보여준다.
도 3은 말 BTB/POZ 도메인-포테슘 채널 도메인과 유사성을 가지는 단백질과 상동성을 보이는 단백질들 간의 상동성 분석 결과를 보여준다.
실시예 1 : 경주마 샘플로부터 RNA-seq 분석
(1) RNA prep
6두의 경주마로부터 50 ml의 혈액을 주사기로 채혈하여 항응고제가 들어있는 50 ml 튜브에 RNA 추출 전까지 보관하였다. 근육 조직은 삼두근으로부터 채취하였다. RNA는 Trizol(Invitrogen)과 RNeasy RNA 추출 키트(Qigen)을 이용하여 분리하였다. RNA정량은 BioAnalyzer 2000을 이용하여 실시하였다.
(2) cDNA
mRNA sequencing 라이브러리는 mRNA는 oligo-dT 비드를 이용하여 분리하였고, 분리된 mRNA를 조각내었고 random primed reverse transcription 반응에 이어 second strand합성을 실시하였다. Double-stranded short cDNA 단편은 QiaQuick PCR 분리키트(Qiagen)로 분리하였다.
(3) Sequencing library and Sequencing
각 cDNA의 양 말단은 exonuclease를 처리하여 fill-in/blunt 반응을 실시하였다. 이어 각 blunt cDNA의 양 말단에 A-염기를 첨가하였고 이를 sequencing adaptor와 결합시켰다. Adaptor와 결합 cDNA를 아가로즈 전기영동 후, QIAquick 젤 분리 키트(Qiagen)로 분리한 다음 농축하였다. 라이브러리의 정량과 정성분석은 각각 Qubit(BioRad)와 BioAnalyzer 2100를 이용하여 실시하였다. 라이브러리에 대한 염기서열 분석은 Illumina HiSeq2000를 이용하여 실시하였다.
[표 1] 경주마 6두로부터 획득한 transcriptome 서열과 reference genome에 대한 mapping rates에 대한 통계
실시예 2 : 생물정보학 분석
분석된 염기서열을 Blast 서버(NCBI, NIH, USA)를 이용하여 이미 발표된 말의 게놈 염기서열 및 유전자와 상동성 분석을 실시하여 기존 데이터베이스에 존재하지 않은 미지의 염기서열을 찾았다(도1). 이 염기서열을 아미노산으로 번역한 다음 ExPaSy 서버에 있는 Prosite 프로그램을 이용하여 추정된 단백질의 기능적 도메인을 스캔하였다. 다른 포유류에 존재하는 단백질과의 상동성 분석을 위하여 BlastP 프로그램을 이용한 분석으로부터 상동 단백질들을 찾아내어(말 ZFP658은XP_001917682.1, 사람 ZFP658은 NP_149350.3, 사람 ZFP850은NP_001180481.1, 사람 ZFP836은 NP_001096127.1.) Clustal W 프로그램으로 상동성 분석을 실시하였다.
<110> Hankyong Industry Academic Cooperation Center
<120> A Horese Novel Gene Homologous to BTB/POZ domain-potassiumchannel
domain
<130> P11510MG
<160> 2
<170> KoPatentIn 2.0
<210> 1
<211> 473
<212> DNA
<213> Equus caballus
<400> 1
agagaaggtg ccgagccaac cttaacccca ccacattgtc cttgaagaac gtctgtgggg 60
agagaaccca actcccctgg tcccgccctc ccacactaag ggcagaacgg aagaatattg 120
gaaaacagat acaggatgag accggggcct acctcattga ccgcgacccc acctacttcg 180
gacccatcct gaacttcctc cgtcacggca agctggtgct ggacaaggac atggctgagg 240
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accggatgga agagaaggac tacaccgtca cgcaggtccc gcccaagcac gtgtaccgcg 360
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gcttcgagca ggtagccagg agcacgaggc cacaccggcc cgccagcctc cag 473
<210> 2
<211> 157
<212> PRT
<213> Equus caballus
<400> 2
Arg Arg Cys Arg Ala Asn Leu Asn Pro Thr Thr Leu Ser Leu Lys Asn
1 5 10 15
Val Cys Gly Glu Arg Thr Gln Leu Pro Trp Ser Arg Pro Pro Thr Leu
20 25 30
Arg Ala Glu Arg Lys Asn Ile Gly Lys Gln Ile Gln Asp Glu Thr Gly
35 40 45
Ala Tyr Leu Ile Asp Arg Asp Pro Thr Tyr Phe Gly Pro Ile Leu Asn
50 55 60
Phe Leu Arg His Gly Lys Leu Val Leu Asp Lys Asp Met Ala Glu Glu
65 70 75 80
Gly Val Leu Glu Glu Ala Glu Phe Tyr Asn Ile Gly Pro Leu Ile Arg
85 90 95
Ile Ile Lys Asp Arg Met Glu Glu Lys Asp Tyr Thr Val Thr Gln Val
100 105 110
Pro Pro Lys His Val Tyr Arg Val Leu Gln Cys Gln Glu Glu Glu Leu
115 120 125
Thr Gln Met Val Ser Thr Met Ser Asp Gly Trp Arg Phe Glu Gln Val
130 135 140
Ala Arg Ser Thr Arg Pro His Arg Pro Ala Ser Leu Gln
145 150 155
Claims (5)
- 말의 혈액 또는 근육으로부터 분리된, 서열번호 1에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 말의 신규 유전자.
- 서열번호 1에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 말의 BTB/POZ 도메인-포테슘 채널 도메인과 유사성을 가지는 신규 단백질을 코딩하는 핵산 분자.
- 청구항 2에 있어서, 사람의 KCTD 단백질에서 발견되는 BTB/POZ 도메인과 90% 이상의 상동성이 있는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산분자.
- 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 BTB/POZ 도메인-포테슘 채널 도메인과 유사성을 가지는 단백질을 형성하는 폴리펩티드 또는 그의 일부.
- 상기 폴리펩티드 또는 그의 일부로부터 구성되는 말의 BTB/POZ 도메인-포테슘 채널 도메인과 유사상을 가지는 신규 단백질.
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