KR20130040509A - Production of polyhydroxyalkanoates from the saccharified solution of hydrodictyaceae algal biomass - Google Patents

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KR20130040509A
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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Abstract

PURPOSE: A method for preparing polyhydroxyalkanoate from a saccharified solution of Hydrodictyaceae algal biomass is provided to cheaply saccharify and to produce biochemical products. CONSTITUTION: A method for preparing polyhydroxyalkyanoate from a saccharified solution of Hydrodictyaceae algal biomass comprises a step of saccharifying Hydrodictyaceae algal biomass and preparing a saccharified solution containing monosaccharides. The Hydrodictyaceae algae are selected from the group consisting of Hydrodictyon sp., Pediastrum sp., and Sorastrum sp. The saccharification is performed using a hydrolysis catalyst, a polysaccharide decomposition enzyme, or a mixture thereof. The polysaccharide decomposition enzyme is selected from the group consisting of cellulase, beta-glucosidase, beta-agarase, betas-gallactosidase, endo-1,4-beta-glucanase, alpha-amylase, beta-amylase, amyloglucosidase, alpha-D-glucosidase, beta-D-glucosidase, sucrase, maltase, isomaltase, and lactase. [Reference numerals] (AA) Collected algal biomass; (BB) Previously extracting effective materials using water or a solvent; (CC) Powderization, drying, and sterilization; (DD) Collected algal biomass(living body, dried body); (EE) Algal solid after extraction; (FF) Saccharifying complex enzyme; (GG) Chemical hydrolyzing; (HH) Low concentration saccharified liquid; (II) Separating saccharified liquid, filtering, concentrating(reducing fermentation suppressing materials); (JJ) High quality sugar concentrated liquid; (KK) Culturing microorganisms for producing PHAs; (LL) Gathering the microorganisms, separating the PHAs, and refining; (MM) Producing polyhydroxyalkanoate;

Description

그물말 과 조류 당화액으로부터의 폴리하이드록시알카노에이트 제조방법{Production of Polyhydroxyalkanoates from the Saccharified Solution of Hydrodictyaceae Algal Biomass}Production of Polyhydroxyalkanoates from the Saccharified Solution of Hydrodictyaceae Algal Biomass

본 발명은 그물말 과(Family Hydrodictyaceae) 조류 당화액으로부터의 폴리하이드록시알카노에이트 제조방법에 관한 것이다.
The present invention is a net ( Family Hydrodictyaceae ) relates to a method for producing polyhydroxyalkanoate from algae saccharified solution.

석유자원의 고갈, 에너지 수요 증가, 지구온난화와 CO2 배출 문제, 환경규제 강화 등의 여러 문제에 직면한 상황에서 미래 환경과 자원고갈을 슬기롭게 대비하기 위해서는 필수적으로 식물자원(바이오매스)의 효율적 활용기술 개발이 필요하다. 이에 적합한 식물자원은 다음의 몇 가지 요인 즉, 1) 식량 및 사료 확보와의 충돌이 최소화 될 것, 2) 생장시 이산화탄소 저감 또는 환경오염 경감 능력이 상대적으로 우수할 것, 3) 생산성이 뛰어나거나 생산물의 산업적 가치가 높아 경제성이 높을 것 등이 필수적으로 구비되어야 한다고 본다. 상기 요인을 비교적 높게 만족시키는 식물은 제3세대 바이오매스라고도 일컫는 조류(algae)인 것 같다. 특히 조류 중에는 특정 성분이 고함량 존재하는 종들이 많고 리그닌이 거의 없기 때문에 섬유질계 바이오매스(리그닌 15-30% 함유)보다 값싼 공정개발이 가능하다. 그리고 폐이산화탄소 또는 각종 폐수를 활용하여 재배할 수도 있다. 따라서 이러한 긍정적 기능들을 최대한 활용하면 CO2 저감/환경정화/대체에너지 및 친환경 산업원료 생산의 다중효과를 창출할 수 있어 과학계에서는 이에 큰 기대를 가지고 있으며 최근 들어 많은 연구자들이 보다 이용가치가 높은 조류종의 발굴 및 개선, 조류 바이오매스의 생산 또는 이의 활용기술 개발에 많은 노력을 투입하고 있다.Efficient use of plant resources (biomass) is essential to wisely prepare for the future environment and resource depletion in the face of problems such as depletion of petroleum resources, increased energy demand, global warming and CO 2 emissions, and strengthening environmental regulations. Technology development is needed. Plant resources suitable for this are 1) minimizing collisions with food and feed securing, 2) relatively good ability to reduce carbon dioxide or reduce environmental pollution during growth, and 3) have good productivity or I believe that the economic value of the product is high and the economic efficiency must be provided. The plant that satisfies these factors relatively high seems to be algae, also referred to as third generation biomass. In particular, many algae species with a high content of certain components and few lignin are available, making the process cheaper than fibrous biomass (containing 15-30% of lignin). It can also be grown using waste carbon dioxide or various wastewater. Therefore, the maximum utilization of these positive functions can create multiple effects of CO 2 reduction, environmental purification, alternative energy and eco-friendly industrial raw material production, and the scientific community has great expectations for it. Many efforts are being made to develop and develop algae biomass or to utilize it.

조류(algae)의 산업적 응용은 유가 상승 경험 이전의 경우 건강식품 및 기능성의약품, 색소생산, 양식사료, 화장품 소재 등의 분야로(Karina., Comparative Biochemistry and Physiology, Part C 146:60-78(2007)) 제한되어 왔었으나 유가상승 경험 이후에는 대체에너지원 확보를 위한 미세조류 연구가 전 세계적으로 대단한 열풍으로 진행되고 있다. 주로 바이오디젤 생산기술 개발에 집중되고 있으며(Scott., Current Opinion in Biotechnology, 21:1-10(2010); Mata., Renewable and Sustainable Energy Reviews , 14:217232(2010)), 한편 미세조류 및 해양거대조류를 이용한 바이오에탄올 또는 바이오부탄올 등의 생산기술이 보고되고 있다(Ge., Renewable Energy. 36:84-89(2011); Harun., Renewable and Sustainable Energy Reviews, In press(2011); Adams., J. Appl . Phycol., 21:569574(2009); Lee., J. Korean Ind . Eng . Chem . 20(3):290-295(2009); Isa., Journal of the Japan Institute of Energy, 88:912-917(2009); Ueno., Journal of Fermentation and Bioengineering. 86(1):38-43(1998); Brennan과 Owende, Renew . Sustain . Energy Rev . 14:557577(2010); John., Bioresource Technology, 102:186-193(2011); Choi., Bioresource Technology 101:5330-5336(2010); 강., 대한민국특허 제10-0908425호, 2009; 김., 대한민국 공개특허번호 제10-2009-0025221호, 2009; 이., 대한민국 공개특허 제10-2010-0125104호, 2010; 장., 대한민국특허 제10-0919299호, 2009). 상기 바이오연료 이외의 분야에서는 식품 및 사료성분으로서 젖산 이용을 위해 전분 고함유 조류바이오매스의 발효 연구가 일부 보고되고 있다(Ike., Journal of Fermentation and Bioengineering . 84(5):428-433(1997)). 그러나 석유자원 고갈을 대비하여 조류 바이오매스를 화학산업의 원료물질 공급원(chemical feedstocks)으로서 활용하고자 하는 연구, 예를 들면, 바이오플라스틱과 같은 분야로의 활용에 대한 성과는 아직 보고된 바 없다.The industrial application of algae is in the fields of health food and functional medicine, pigment production, aquaculture feed, and cosmetic materials before the oil price increase experience (Karina., Comparative Biochemistry and Physiology , Part C 146: 60-78 (2007)) Although it has been limited, research on microalgae to secure alternative energy sources has been a hot craze worldwide. Mainly focused on developing biodiesel production technology (Scott., Current Opinion in Biotechnology , 21: 1-10 (2010); Mata., Renewable and Sustainable Energy Reviews , 14: 217232 (2010)), while production techniques of bioethanol or biobutanol using microalgae and marine macroalgae have been reported (Ge., Renewable) . Energy . 36: 84-89 (2011); Harun., Renewable and Sustainable Energy Reviews , In press (2011); Adams., J. Appl . . Phycol, 21: 569574 (2009 ); Lee., J. Korean Ind . Eng . Chem . 20 (3): 290-295 (2009); Isa., Journal of the Japan Institute of Energy , 88: 912-917 (2009); Ueno., Journal of Fermentation and Bioengineering. 86 (1): 38-43 (1998); Brennan and Owende, Renew . Sustain . Energy Rev. 14: 557577 (2010); John., Bioresource Technology , 102: 186-193 (2011); Choi., Bioresource Technology 101: 5330-5336 (2010); Kang, Korea Patent No. 10-0908425, 2009; Kim, Korea Patent Publication No. 10-2009-0025221, 2009; E., Republic of Korea Patent Publication No. 10-2010-0125104, 2010; Jang, Korean Patent No. 10-0919299, 2009). In fields other than the biofuels, some studies on fermentation of starch-rich algae biomass for use of lactic acid as food and feed ingredients have been reported (Ike., Journal of Fermentation). and Bioengineering . 84 (5): 428-433 (1997). However, there have been no reports on the use of algae biomass as a chemical feedstocks for the chemical industry in preparation for the depletion of petroleum resources, such as bioplastics.

바이오플라스틱 산업은 2008년 이후 환경규제 강화 및 친환경제품 선호도 증가에 따라 그 시장이 급속히 확대되고 있어, 현재 플라스틱 전체시장의 1%의 점유율을 가졌지만 환경규제가 강한 미국. 유럽, 일본을 중심으로 연간 13%의 성장률로 빠르게 증가하고 있는 상황이다(Nampoothiri., Bioresource Technology , 101:84938501(2010)). 따라서 현재 많은 연구자가 저비용으로 바이오플라스틱 원료물질을 생산하는 기술개발에 노력을 경주하고 있다. 바이오플라스틱 주요 원료물질로서는 유기산(젖산, 숙신산), 폴리하이드록시알카노에이트(Polyhydroxyalkanoates, PHAs), 전분 및 단백질과 같은 고분자 물질 등이 알려져 있는데 그 중에서 폴리하이드록시알카노에이트의 독특한 화학적, 기계적, 열적 특성으로 인해 그의 응용에 대한 기대를 크게 가지고 있다. Since 2008, the bioplastics industry has been expanding rapidly due to the strengthening of environmental regulations and increasing preference for eco-friendly products. Currently, the bioplastics industry has a 1% share of the entire plastics market. The annual growth rate is 13%, especially in Europe and Japan (Nampoothiri., Bioresource Technology , 101: 84938501 (2010)). Therefore, many researchers are currently making efforts to develop technologies for producing bioplastic raw materials at low cost. Major raw materials for bioplastics include organic acids (lactic acid, succinic acid), polyhydroxyalkanoates (PHAs), starch and high molecular materials such as proteins, among which the unique chemical, mechanical, Due to its thermal nature, it has high expectations for its application.

폴리하이드록시알카노에이트는 세균에서 탄소원 및/또는 환원능 저장 물질로 사용되는 여러 종류의 하이드록시카복시산(hydroxy-carboxylic acid)으로 구성된 생분해성, 생체적합성 폴리에스테르이다. 폴리하이드록시알카노에이트는 여러 종류의 하이드록시아실-CoA를 기질로 사용하는 PHA 합성효소에 의하여 합성된다. 하이드록시아실-CoA가 하이드록시기의 탄소위치에 비대칭 중심을 가지면, 이는 모두 (R)-배치형태가 된다. 3-하이드록시아실-CoAs, 4-하이드록시아실-CoAs나 5-하이드록시아실-CoAs, 6-하이드록시아실-CoAs 등 여러 하이드록시아실-CoA 중에서 PHA 합성효소가 가장 선호하는 기질은 3-하이드록시아실-CoAs(3HA-CoAs) 이다. Polyhydroxyalkanoates are biodegradable, biocompatible polyesters composed of a variety of hydroxy-carboxylic acids used in bacteria as carbon sources and / or reducing capacity storage materials. Polyhydroxyalkanoates are synthesized by PHA synthase using several kinds of hydroxyacyl-CoA as a substrate. If hydroxyacyl-CoA has an asymmetric center at the carbon position of the hydroxy group, it is all in the (R)-configuration. Among the various hydroxyacyl-CoAs such as 3-hydroxyacyl-CoAs, 4-hydroxyacyl-CoAs, 5-hydroxyacyl-CoAs, 6-hydroxyacyl-CoAs, and the like, PHA synthase is the most preferred substrate. Hydroxyacyl-CoAs (3HA-CoAs).

폴리하이드록시알카노에이트를 구성하고 있는 모노머의 탄소수에 따라 탄소수가 3개에서 5개인 모노머로 구성되어 있는 짧은 사슬 길이 폴리하이드록시알카노에이트(Short-Chain-Length Polyhydroxyalkanoates, SCL PHAs), 탄소수가 6개에서 14개인 모노머로 구성되어 있는 중간 사슬길이 폴리하이드록시알카노에이트(Medium-Chain-Length Polyhydroxyalkanoates, MCL PHAs) 로 나누어진다. 짧은 사슬 길이 폴리하이드록시알카노에이트는 열가소성의 성질을 가지며 그 중 대표적인 폴리(3-하이드록시부틸레이트) [P(3HB)]는 폴리프로필렌의 물성과 비슷하여 화학유래의 고분자 대체가능성이 있는 고분자로 생각되어지고 있다. P(3HB)는 미생물 내에서 아세틸코에이(acetyl-CoA)를 아세토아세틸코에이(acetoacetyl-CoA)로 합성하는 베타케토티올라제(β-ketothiolase, PhaA), 아세토아세틸-CoA를 3-하이드록시부틸릴-CoA로 환원하는 NADPH-의존성 아세토아세틸-CoA 환원효소(PhaB), 3-하이드록시부틸릴-CoA를 P(3HB)로 합성하는 PHA 합성효소 (PhaC)에 의해 만들어지고 미생물 내부에 축적된다.Short-Chain-Length Polyhydroxyalkanoates (SCL PHAs), consisting of monomers of 3 to 5 carbon atoms depending on the carbon number of the monomers constituting the polyhydroxyalkanoate, Medium-Chain-Length Polyhydroxyalkanoates (MCL PHAs) consisting of 6 to 14 monomers. Short chain length polyhydroxyalkanoates have thermoplastic properties, and representative poly (3-hydroxybutylate) [P (3HB)] is similar to the physical properties of polypropylene, so that it is possible to replace chemically derived polymers. It is thought to be. P (3HB) is a 3-hydroxy hydrolyzed beta ketothiolase (β-ketothiolase (PhaA), acetoacetyl-CoA) that synthesizes acetyl-CoA into acetoacetyl-CoA in microorganisms. NADPH-dependent acetoacetyl-CoA reductase (PhaB) reducing to hydroxybutylyl-CoA, PHA synthase (PhaC) which synthesizes 3-hydroxybutylyl-CoA to P (3HB) Accumulate.

이와 같이 폴리하이드록시알카노에이트는 특정 미생물내의 대사과정을 통해 축적되기 때문에 폴리하이드록시알카노에이트 고생산 균주를 탐색하거나 제조한 다음, 여기에 여러 가지 탄소원을 제공하여 대량생산하는 방법을 개발하고 있는데 현재까지는 대부분 식용자원 또는 농림부산물 유래의 탄소원을 이용하고 있다(Salehizadeh & Loosdrecht, Biotech . Adv . 22:261-279(2004); Loo et al., Biotechnology Letters , 27:1405-1410(2005); Defoirdt et al., Biotech . Adv ., 27(6):680-685(2009)). 그러나 이들의 원료가 식품, 사료등과 경쟁하기 때문에 앞으로는 이들과 경쟁이 적은 비식용자원(목질계, 조류 등)으로부터 원료의 대체 확보가 요구되고 있다. 그런데 이 경우 해결해야할 가장 큰 도전중의 하나는 당화물 생산비용의 절감이다. 식용자원과는 달리 비식용자원의 경우 전처리, 당화가 보다 어렵고 추가 공정이 요구되기 때문이다. 그리고 자원의 종류마다 화학적 조성 및 물리적 구조에 차이가 있기 때문에 각각의 종에 최적화된 생산 방법이 개발되어야 한다. 한편 발효의 경우도 균주에 따라 여러 당을 모두 소화하는 계통이 있기는 하지만 대부분 몇 가지 당(글루코오스, 프락토오스, 포도당 등)을 우선적으로 선호함에 따라 이들 탄수화물이 상대적으로 높게 생산될 수 있는 자원을 사용하는 것이 바람직하다. 따라서 비식용 자원 중에서 발효에 유용한 당이 많이 함유되어 있는 것을 골라 저비용/친환경적으로 당화물을 제조한 다음, 이를 발효 기질로서 사용하여 보다 경제적으로 폴리하이드록시알카노에이트를 생산하는 것이 본 산업 분야에서 지속적으로 추구해야 할 과제중의 하나이다.
Thus, since polyhydroxyalkanoate is accumulated through metabolism in specific microorganisms, the polyhydroxyalkanoate high-producing strains are searched or manufactured, and then various methods are provided to develop a mass production method. To date, most of them use carbon sources derived from edible resources or agricultural and forest products (Salehizadeh & Loosdrecht, Biotech . Adv . 22: 261-279 (2004); Loo et al., Biotechnology Letters , 27: 1405-1410 (2005)). Defoirdt et al., Biotech . Adv ., 27 (6): 680-685 (2009)). However, since these raw materials compete with food and feed, it is required to secure the replacement of raw materials from non-edible resources (wooden, algae, etc.) which are less competitive with them in the future. However, one of the biggest challenges to be solved in this case is the reduction of sugar-cargo production costs. Unlike edible resources, non-edible resources are more difficult to pretreat, saccharify, and require additional processing. And because the chemical composition and physical structure of the resources are different, production methods optimized for each species must be developed. In fermentation, although some strains digest all sugars, most prefer the sugars (glucose, fructose, glucose, etc.) to provide resources that can produce relatively high levels of these carbohydrates. It is preferable to use. Therefore, in the industry, it is possible to produce sugars in a low cost / environmentally manner by selecting a large amount of sugars useful for fermentation among non-edible resources, and then to use them as fermentation substrates to produce polyhydroxyalkanoates more economically. It is one of the tasks to be pursued continuously.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
Numerous papers and patent documents are referenced and cited throughout this specification. The disclosures of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to better understand the state of the art to which the present invention pertains and the content of the present invention.

본 발명자들은 상술한 종래기술의 문제점 및 당업계의 기술적 요구를 달성하기 위하여, 예의연구 노력하였다. 그 결과, 그 활용에 대해 아직 보고된 바 없는 탄수화물 고함유 조류 바이오매스인 그물말 과 조류로부터 폴리하이드록시알카노에이트를 저비용으로 제조할 수 있는 방법을 개발하고, 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors made an earnest research effort in order to achieve the above-mentioned problem of the prior art and the technical requirements of the art. As a result, the inventors have developed a method for producing polyhydroxyalkanoate at low cost from netting and algae, a high-carbohydrate-rich algae biomass that has not been reported for its use, and completed the present invention.

따라서 본 발명의 목적은 그물말 과(Family Hydrodictyaceae)조류로부터 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법을 제공하는 데 있다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for preparing polyhydroxyalkanoate from family Hydrodictyaceae algae.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해서 제조된 폴리하이드록시알카노에이트를 제공하는 데 있다.
Another object of the present invention is to provide a polyhydroxyalkanoate prepared by the above method.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 그물말 과(Family Hydrodictyaceae)조류로부터 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법을 제공한다: According to one aspect of the invention, the invention provides a process for the preparation of polyhydroxyalkanoates from Family Hydrodictyaceae algae comprising the following steps:

(a) 그물말 과 조류를 당화시켜 단당류를 포함하는 당화액을 수득하는 단계; 및(a) saccharifying the net and algae to obtain a saccharified solution comprising a monosaccharide; And

(b) 상기 당화액을 탄소원으로 이용하여 미생물을 배양하여 폴리하이드록시알카노에이트를 제조하는 단계.
(b) preparing a polyhydroxyalkanoate by culturing the microorganism using the saccharified solution as a carbon source.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 방법으로부터 제조된 폴리하이드록시알카노에이트를 제공한다
According to another aspect of the invention, the invention provides a polyhydroxyalkanoate prepared from the process of the invention described above.

본 발명자들은 상술한 종래기술의 문제점 및 당업계의 기술적 요구를 달성하기 위하여, 예의연구 노력하였다. 그 결과, 그 활용에 대해 아직 보고된 바 없는 탄수화물 고함유 조류 바이오매스인 그물말 과 조류로부터 폴리하이드록시알카노에이트를 저비용으로 제조할 수 있는 방법을 개발하였다.The present inventors made an earnest research effort in order to achieve the above-mentioned problem of the prior art and the technical requirements of the art. As a result, we have developed a low-cost method for producing polyhydroxyalkanoates from net horses and algae, a high-carbohydrate-rich algae biomass that has not yet been reported for its use.

그물말 과 조류 바이오매스(biomass)로부터 폴리하이드록시알카노에이트를 제조하기 위한 본 발명의 방법을 각각의 단계 별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:The method of the present invention for preparing polyhydroxyalkanoate from mesh and algal biomass is described in detail for each step as follows:

단계 (a): 그물말 과( Family Hydrodictyaceae ) 조류로부터의 당화액 수득 Step (a): the end of the net (Family Hydrodictyaceae) Hydrolyzate obtained from birds

우선, 그물말 과 조류를 당화시켜 단당류를 포함하는 당화액을 수득한다.First, the net and algae are glycosylated to obtain a saccharified solution containing monosaccharides.

본 발명에서 바이오매스로 이용되는 그물말 과(Family Hydrodictyaceae) 조류는 당업계에 공지된 다양한 그물말 과 조류를 포함한다. 예를 들어, 본 발명에서 이용 가능한 그물말 과 조류는 히드로딕티온 속(Hydrodictyon sp.), 훈장말 속(Pediastrum sp.), 소라스트럼 속(Sorastrum sp.), 유아스트롭시스 속(Euastropsis sp .), 페르난디넬라 속(Fernandinella sp .), 라쿠나스트럼 속(Lacunastrum sp .), 모나크티누스 속(Monactinus sp .), 파라독시아 속(Paradoxia sp.), 파라페디아스트럼 속(Parapediastrum sp .), 슈도페디아스트럼 속(Pseudopediastrum sp .), 스패라스트럼 속(Sphaerastrum sp .), 스타우리디움 속(Stauridium sp .) 및 테트라페디아 속(Tetrapedia sp .)을 포함한다. Family Hydrodictyaceae algae used as biomass in the present invention include various nets and algae known in the art. For example, the end of the net and birds can be used in the present invention is tetrahydro-thione in Dick (Hydrodictyon sp.), In the end of Medal (Pediastrum sp.), Soraseu spectrum in (Sorastrum sp.), Infant strobe in cis (Euastropsis sp . ), Fernandinella sp . Lacunastrum sp . ), Monactinus sp . ), Paradoxia sp. , Parapediastrum sp . Pseudopediastrum sp . ), Sphaerastrum sp . , Stauridium genus sp . ) And Tetrapedia sp . ).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용 가능한 그물말 과 조류는 히드로딕티온 속(Hydrodictyon sp .), 훈장말 속(Pediastrum sp.) 및 소라스트럼 속(Sorastrum sp.)으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 조류이고, 가장 바람직하게는 히드로딕티온 속(Hydrodictyon sp .)이다.According to a preferred embodiment of the present invention, the nets and algae usable in the present invention are Hydrodictyon sp . ), Genus ( Pediastrum sp .) and Sorastrum sp .), one or two or more birds selected from the group consisting of, and most preferably the Hydrodictyon sp . )to be.

본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 본 발명에는 담수 녹조류 중 그물말 과 조류를 선택되며, 이는 탄수화물 함량이 50-70 중량%까지 되며, 특히 주요 단당류로서 글루코오스와 만노오스를 포함하고, 효소 당화 시 글루코오스 함량이 바이오매스 중량대비 30-60 중량%까지 생산될 수 있는 탄수화물 고함유 바이오매스이다.According to a specific embodiment of the present invention, the nettle and algae among the freshwater green algae are selected in the present invention, which has a carbohydrate content of 50-70% by weight, particularly glucose and mannose as the main monosaccharides, and during enzyme saccharification. It is a high carbohydrate biomass that can produce up to 30-60% by weight of glucose content by weight of biomass.

본 발명에서 이용되는 그물말 과 조류는 시료의 수집/선별 시 단순히 건지개로만 이용해도 될 정도로 용이하여 원심분리 또는 여과과정을 거쳐 수집해야만 하는 다른 미세조류의 공정에 비해 저에너지/저비용으로 시료를 공급받을 수 있으며, 세척, 탈수, 건조 및 분말화 등의 작업도 매우 간편한 장점을 가진다. 또한, 그물말 과 조류는 리그닌이 없고 탄수화물이 보통 50-70 중량% 차지하고 있으며, 특히 발효에 가장 많이 활용되는 육탄당(글루코오스+만노오스) 함량 비율이 90 중량% 이상 차지함으로써 기타 조류 종들에 비해 매우 유리한 장점이 있다.The net and algae used in the present invention are so easy that they can be used only as a dry shell when collecting / selecting a sample, so that the sample is supplied at low energy / low cost compared to other microalgal processes that must be collected through centrifugation or filtration. In addition, washing, dehydration, drying and pulverization may also be very easy. In addition, net horses and algae are lignin free and carbohydrates are usually 50-70% by weight, and the most frequently used fermentation of charcoal sugar (glucose + mannose) is more than 90% by weight. There is an advantage.

한편, 본 발명에 있어서, 그물말 과 조류는 생체; 건조체; 탄소수 1 내지 5의 저급 알코올로 침출 여과 후 남은 잔사물; 유기물 정제 장치를 이용하여 물, 탄소수 1 내지 5의 저급 알코올 또는 이들의 연속 용매로 추출 후 남은 잔사물; 및 유기용매를 이용하여 지질성분을 추출하고 남은 잔사물로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있다.On the other hand, in the present invention, the net and algae are living bodies; Dried body; Residues remaining after filtration with a lower alcohol having 1 to 5 carbon atoms; Water, a lower alcohol having 1 to 5 carbon atoms or residues after the extraction with a continuous solvent thereof using an organic material refining apparatus; And one or two or more kinds selected from the residues obtained by extracting the lipid component using the organic solvent.

보다 상세하게는, 본 발명에 적용되는 그물말 과 조류는, 야외에서 직접 수집하거나, 배양과정을 통해서 얻어진 생체 또는 건조체를 고운 입자로 마쇄하여 이용할 수 있으며, 시료에 따라서는 마쇄 없이 직접 당화에 적용하여 사용할 수 있다.In more detail, the net and algae applied to the present invention can be used by directly collecting the outdoors or grinding the living body or dry body obtained through the culturing process with fine particles, and depending on the sample, it is directly applied to the saccharification without grinding. Can be used.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 적용되는 그물말 과 조류의 시료는 당화공정에 투입 전, 부가가치를 높이면서 고품질의 당화액을 제조하기 위하여 다음과 같이 별도의 추출과정을 거칠 수 있다. 상기 용어 “고품질”이란 당화액 내에 6탄당(글루코오스, 만노오스 등) 함량이 높고 발효에 저해역할을 하는 억제물질의 함량이 낮아서 발효에 적합하도록 제조된 상태를 말한다. According to a preferred embodiment of the present invention, the sample of the net and algae applied to the present invention may be subjected to a separate extraction process as follows in order to produce a high-quality saccharified solution while increasing the value added before the saccharification process. . The term "high quality" refers to a state prepared to be suitable for fermentation because of a high content of hexasaccharides (glucose, mannose, etc.) in the saccharified solution and a low content of inhibitors that inhibit the fermentation.

이를 위해 본 발명에서는 (i) 수집된 그물말 과의 생체 및 건조체 조류를 70-100%의 메탄올 또는 에탄올로 추출한 다음, 추출 후 남은 잔사(고형분)를 고농도의 단당류의 제조에 이용하거나, (ii) 또한 생체 또는 건조체의 그물말 과의 조류를 속슬렛 장치를 이용하여 물 또는 물과 에탄올로 연속하여 추출한 다음, 추출 후 남은 잔사를 단당류의 제조에 사용하거나, 또는 (iii) 생체 또는 건조체의 그물말 과(Family Hydrodictyaceae)의 조류를 유기용매(예컨대, 클로로포름＋메탄올)를 가지고 지질성분을 추출한 다음, 추출 후 남은 잔사를 고농도의 단당류의 제조에 사용할 수도 있다.To this end, in the present invention, (i) the biological and dry algae of the collected net family with 70-100% methanol or ethanol, and then the residue (solid) remaining after extraction is used to prepare a high concentration of monosaccharides, or (ii ) Also, the algae of the living body or dried nets of the algae are successively extracted with water or water and ethanol using a Soxhlet apparatus, and the residue remaining after extraction is used for the preparation of monosaccharides, or (iii) Horse and Family Algae of Hydrodictyaceae may be extracted with an organic solvent (eg, chloroform + methanol), and then the remaining residues may be used to prepare high concentrations of monosaccharides.

단계 (a)의 그물말 과 조류는 바람직하게는 고형분 함량이 1-30 중량%이다.The nets and algae of step (a) preferably have a solids content of 1-30% by weight.

단계 (a)에서 당화액 수득을 위한 그물말 과 조류의 시료 공급은 초기에 모두 공급하거나 또는 분할하여 공급할 수 있으며, 최종 공급된 고형분 함량은, 바람직하게는, 배양액 무게대비 1-30 중량%까지 투입할 수 있다.Sample feed of net and algae for the saccharification solution obtained in step (a) may be initially supplied all or dividedly supplied, the final solid content is preferably, up to 1-30% by weight of the culture medium It can be put in.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (a)의 당화액 수득은 가수분해 촉매, 다당류 분해효소 또는 가수분해 촉매 및 다당류 분해효소를 이용하여 실시할 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the saccharification solution obtained in step (a) can be carried out using a hydrolysis catalyst, a polysaccharide degrading enzyme or a hydrolysis catalyst and a polysaccharide degrading enzyme.

상기 가수분해 촉매는 당업계에 공지된 다양한 가수분해 촉매를 포함하고, 바람직하게는, 황산, 염산, 브롬산, 질산, 아세트산, 과염소산, 인산, 파라-톨루엔설폰산(p-toluene sulfonic acid, PTSA) 및 고체산(예컨대, 구연산, 옥살산, 각종 아미노산, 말레산, 프탈산, 푸마르산 및 설파민산)으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 산 촉매 또는 수산화칼륨, 수산화나트륨, 수산화칼슘 및 암모니아 수용액으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 알칼리 촉매를 사용할 수 있다.The hydrolysis catalyst may contain a variety of hydrolysis catalysts are known in the art, preferably, sulfuric acid, hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitric acid, acetic acid, perchloric acid, phosphoric acid, para-toluene sulfonic acid (p -toluene sulfonic acid, PTSA ) And one or two or more acid catalysts selected from solid acids (e.g., citric acid, oxalic acid, various amino acids, maleic acid, phthalic acid, fumaric acid and sulfamic acid) or one selected from aqueous potassium, sodium hydroxide, calcium hydroxide and aqueous ammonia solution. Species or two or more alkali catalysts can be used.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 가수분해 촉매를 이용한 당화액의 수득은, 20-200℃의 온도에서 0.5-6시간 동안 1차 가수분해 및 2차 가수분해시킴으로써 실시한다. 예를 들어, 30℃의 온도에서 1시간 동안 1차 가수분해 후, 121℃에서 1시간동안 2차 가수분해시킴으로써 실시한다.According to a preferred embodiment of the present invention, the saccharification solution obtained using the hydrolysis catalyst is carried out by primary hydrolysis and secondary hydrolysis at a temperature of 20-200 ° C. for 0.5-6 hours. For example, it is carried out by primary hydrolysis at a temperature of 30 ° C. for 1 hour and then secondary hydrolysis at 121 ° C. for 1 hour.

또한, 본 발명에 있어서 당화액의 제조에 이용되는 다당류 분해효소는 당업계에 공지된 다양한 다당류 분해효소를 포함하고, 바람직하게는, 셀룰라아제, β-글루코시다아제, β-아가라제, β-갈락토시다제, 엔도-1,4-β-글루카나제, α-아밀라아제, β-아밀라아제, 아밀로글루코시다아제, 라미나린나아제, α-D-글루코시다아제, β-D-글루코시다아제, 수크라아제, 말타아제, 이소말타아제, 락타아제, 드리할라제 및 울바나아제로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합 분해효소를 포함한다.In addition, in the present invention, the polysaccharide degrading enzyme used in the preparation of the saccharification liquid includes various polysaccharide degrading enzymes known in the art, and preferably, cellulase, β-glucosidase, β-agarase, β- Galactosidase, endo-1,4-β-glucanase, α-amylase, β-amylase, amyloglucosidase, laminarinase, α-D-glucosidase, β-D-glucosidase One or two or more mixed degrading enzymes selected from azeases, sukrases, maltase, isomaltase, lactase, drihalase and ulbanase.

다당류 분해효소의 공급은 그물말 과 조류의 시료 공급 직후에 필요량 모두를 공급할 수 있으나 조건에 따라 분할하여 투입할 수 있다.The polysaccharide degrading enzyme can supply both the required amount immediately after the feed of the net and algae, but can be dividedly added according to the conditions.

다당류 분해효소 공급 후의 온도조절은 효소 투입시기와 효소 반응 최적조건에 따라 달라질 수 있으며, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 20-60℃에서 0.5-5일 동안 반응시킨다.Temperature control after the polysaccharide degrading enzyme supply may vary depending on the timing of the enzyme input and the optimum conditions for the enzyme reaction, and according to a preferred embodiment of the present invention, the reaction is performed at 20-60 ° C. for 0.5-5 days.

또한, 상기 다당류 분해효소를 이용한 당화액 수득과정은, 품질이 우수한 고농도 당화액을 제조하기 위해 효소 반응 시 완충액 염 농도가 최소화되도록 당화를 실시하며, 바람직하게는, 증류수 또는 0.01 mM 내지 1.0 M 범위의 완충액에서 당화를 실시한다. In addition, the saccharification solution obtained by using the polysaccharide degrading enzyme, the saccharification is performed to minimize the buffer salt concentration during the enzyme reaction in order to prepare a high concentration saccharification solution, preferably, distilled water or 0.01 mM to 1.0 M range Saccharification is carried out in a buffer of.

한편 가수분해 촉매 또는 다당류 분해효소를 이용한 당화액의 수득 과정은, 발효억제물질 생성을 최소화 하도록 실시하는 것이 바람직하다. 일반적으로 당화효율을 높이기 위해 바이오매스를 고온/고압처리 하거나, 산 가수분해 처리를 하게 되는데 이 작업과정에서 당이 화학적 전환을 일으켜 하이드록시메틸풀푸랄(Hydroxymethylfurfural, HMF) 및 풀푸랄(Furfural)이 생성되고, 이는 발효 균주의 강력한 저해제로 작용하기 때문에 바람직하지 않다. 따라서, 이러한 발효억제물질이 생성되는 것을 가능한 억제되는 조건 하에서 반응을 진행하여야 한다. 예컨대, 가수분해를 이용한 화학적 가수분해의 경우는 발효 억제물질 생성을 최소화하기 위해서 낮은 반응온도와 반응시간을 설정하는 것이 바람직하다.Meanwhile, the process of obtaining saccharified solution using a hydrolysis catalyst or a polysaccharide degrading enzyme is preferably performed to minimize the production of fermentation inhibitors. In general, biomass is subjected to high temperature / high pressure treatment or acid hydrolysis to increase glycosylation efficiency. In this process, sugars undergo chemical conversion, which leads to hydroxymethylfurfural (HMF) and furfural. Produced, which is undesirable because it acts as a strong inhibitor of fermentation strains. Therefore, the reaction should be carried out under conditions that can be inhibited to produce such fermentation inhibitors. For example, in the case of chemical hydrolysis using hydrolysis, it is preferable to set a low reaction temperature and reaction time in order to minimize the production of fermentation inhibitors.

하이드록시메틸풀푸랄은 C6H6O3, 융점 31.5℃의 결정으로, 물, 알코올 등의 유기용매에 쉽게 용해되며, 공기, 빛에 의해 자동 산화되어 착색이 일어나기 쉽다. 신선식품(fresh foods)에는 거의 함유되어 있지 않으나, 당-함유 식품을 건조, 가열, 장기보관 중에 자연적으로 생긴다. 옥수수 등의 당류를 약산성하에 가열함으로써 공업적으로 얻어지고, 의약, 농약의 중간체 합성에 이용되고 있다. 시험관 연구 및 쥐실험에서 하이드록시메틸풀푸랄은 독성 및 발암 가능성이 제기되고 있지만, 아직은 인간에 있어 하이드록시메틸풀푸랄의 섭취와 질병간의 관계에 대해서 알려진 것은 없다. Hydroxymethyl full fural is a crystal of C 6 H 6 O 3 , a melting point of 31.5 ° C., and is easily dissolved in organic solvents such as water and alcohol, and is easily oxidized by air and light to easily cause coloring. Fresh foods are rarely contained, but sugar-containing foods occur naturally during drying, heating, and long-term storage. It is industrially obtained by heating sugars such as corn under weak acidity, and is used for the synthesis of intermediates for medicine and pesticides. Although in vitro studies and rat experiments have raised the potential for toxicity and carcinogenesis, there is no known relationship between hydroxymethylfurfural intake and disease in humans.

풀푸랄은 분자식 C2H2O2 , 비점 161.8℃의 무색 액체로, 알데히드와 유사한 향기를 갖는다. 공기, 빛에 의해 자동산화되어 착색이 일어나기 쉽고, 공업적으로는 곡류의 당을 산과 가열함으로써 얻고 수지의 원료, 용제로서 사용된다. 또한 식품에 있어서 단당, 올리고당, 다당류의 가열에 의해 생성하는 휘발성 카보닐 화합물의 주성분이며, 식품의 처리, 가공 또는 저장 중 생기는 품질저하에 의한 성분변화의 지표의 하나로서 하이드록시메틸풀푸랄과 동시에 취급된다.Fulfural is a colorless liquid with molecular formula C 2 H 2 O 2 , boiling point 161.8 ° C., and has a odor similar to that of aldehyde. It is automatically oxidized by air and light, and coloring is easy to occur. Industrially, it is obtained by heating sugar of grains with an acid, and is used as a raw material and a solvent of resin. It is the main component of volatile carbonyl compounds produced by heating of monosaccharides, oligosaccharides, and polysaccharides in foods, and is one of the indicators of component change caused by deterioration during processing, processing or storage of foods. Are treated.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 단계 (a)에 따라 수득한 당화액은 하이드록시메틸풀푸랄, 풀푸랄 또는 이들의 혼합물이 0.07 중량% 이하(바람직하게는, 5% 글루코오스 기준으로), 보다 바람직하게는 0.00001-0.07 중량%이다.According to a preferred embodiment of the present invention, the saccharified solution obtained according to step (a) of the present invention has a hydroxymethylpulfural, fufural or a mixture thereof of 0.07% by weight or less (preferably on a 5% glucose basis). ), More preferably 0.00001-0.07 wt%.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (a)의 당화액은 고농도 당농축액을 제조하기 위해서, 1차적으로 당화한 용액을 2회 이상 원심분리를 하거나 여과과정을 통해 모은 다음, 이어 감압건조 또는 막투과증발법 등을 더 진행하여 농축하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the saccharified solution of step (a) is prepared by centrifugation or filtration process two times or more after the first saccharified solution to prepare a high concentration of sugar concentrate, followed by drying under reduced pressure or The method may further include the step of concentrating by further performing membrane pervaporation.

본 발명의 단계 (a)를 통해 수득되는 단당류는 당업계에 공지된 다양한 단당류를 포함하며, 바람직하게는, 갈락토오스, 갈락토오스 유도체(갈락튜론산 등), 3,6-안하이드로갈락토오스, 크실로오스, 글루코오스, 람노오스, 크실로오스 및 만노오스로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합 단당류이며, 보다 바람직하게는, 글루코오스, 만노오스 또는 이들의 혼합 단당류이다.
Monosaccharides obtained through step (a) of the present invention include various monosaccharides known in the art, preferably, galactose, galactose derivatives (such as galacturonic acid), 3,6-anhydrogalactose, xylose , One or two or more mixed monosaccharides selected from glucose, rhamnose, xylose and mannose, and more preferably glucose, mannose or mixed monosaccharides thereof.

단계 (b): 미생물을 이용한 폴리하이드록시알카노에이트의 제조 Step (b): Preparation of Polyhydroxyalkanoate Using Microorganisms

이어, 단계 (a)에서 수득한 당화액을 탄소원으로 이용하여 미생물을 배양하여 폴리하이드록시알카노에이트를 제조한다.Next, polyhydroxyalkanoate is prepared by culturing the microorganism using the saccharified solution obtained in step (a) as a carbon source.

상기 미생물은 바람직하게는, Ralstonia eutropha 또는 Ralstonia eutropha phaCAB 유전자를 발현하는 재조합 대장균을 이용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 Ralstonia eutropha phaCAB 유전자를 발현하는 재조합 미생물을 이용하는 것이다.The microorganism is preferably Ralstonia eutropha or Ralstonia Recombinant E. coli expressing the eutropha phaCAB gene can be used, more preferably Ralstonia The recombinant microorganism expresses the eutropha phaCAB gene.

Ralstonia eutropha phaCAB 유전자를 발현하는 재조합 미생물을 이용하는 경우, 미생물은 대장균, 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 속 균주, 세라티아 속 균주 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 이용될 수 있다. 예컨대, 상기 미생물은 E. coli JM109, E. coli BL21(DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli XL1-Blue, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다. Ralstonia When using a recombinant microorganism expressing the eutropha phaCAB gene, the microorganism may be E. coli, Bacillus strains, and enterobacteria such as Salmonella strains, Serratia strains and various Pseudomonas species. For example, the microorganism may be E. coli JM109, E. coli BL21 (DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli Strains of the genus Bacillus, such as XL1-Blue, E. coli X 1776, E. coli W3110, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, and enterococci and strains such as Salmonella typhimurium, Serratia marcensons and various Pseudomonas species. There is this.

상기 Ralstonia eutropha는 베타-프로테오 박테리아 강(Class)의 그람 음성 토양세균이며, 다른 세균들과는 달리 생명유지를 위해 단지 수소와 이산화탄소만을 필요로 한다. Ralstonia eutropha는 베타케토티올라제(PhaA), NADPH-의존성 아세토아세틸-CoA 환원효소(PhaB), PHA 합성효소(PhaC)를 발현하여 폴리하이드록시알카노에이트 중의 하나인 폴리하이드록시부틸레이트(P[3HB])를 합성하는 미생물이며, 동물들이 지방을 축적하듯이 대부분의 에너지를 플라스틱과 유사한 분자인 폴리하이드록시알카노에이트 형태로 저장한다. Ralstonia eutropha는 균주개량을 통해 바이오플라스틱의 효율적인 생산이 가능해 질 것으로 예측되며, 예컨대 Ralstonia eutropha H16 및 Ralstonia eutopha AER5 등의 개량균주가 있다. 이것은 고농도의 폴리하이드록시알카노에이트를 생성할 수 있도록 균을 유전자 조작한 것이다. Ralstonia eutropha is a Gram-negative soil bacterium of the beta-proteobacteria class, and unlike other bacteria, only hydrogen and carbon dioxide are needed to sustain life. Ralstonia eutropha expresses beta ketothiolase (PhaA), NADPH-dependent acetoacetyl-CoA reductase (PhaB), and PHA synthase (PhaC) to form polyhydroxybutylate (P [ 3HB]) is a microorganism that synthesizes and stores most of its energy in the form of polyhydroxyalkanoates, plastic-like molecules, as animals accumulate fat. Ralstonia eutropha is expected to enable efficient production of bioplastics through strain improvement, for example Ralstonia. eutropha H16 and Ralstonia There are improved strains such as eutopha AER5. This genetically engineered bacteria to produce high concentrations of polyhydroxyalkanoate.

Ralstonia eutropha phaCAB 유전자를 발현하는 재조합 미생물은 당업계에 공지된 클로닝 및 형질전환 방법으로 제조될 수 있다. 예를 들어, phaCAB 오페론 유전자를 포함하는 벡터로 미생물을 형질전환 할 수 있다. 상기 벡터는 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, phaCAB 유전자의 프로모터, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pL λ프로모터, pR λ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열(예컨대, phaCAB 유전자의 터미네이터)을 포함할 수 있다. Ralstonia Recombinant microorganisms expressing the eutropha phaCAB gene can be prepared by cloning and transformation methods known in the art. For example, microorganisms can be transformed with a vector containing the phaCAB operon gene. The vector may be a potent promoter capable of promoting transcription (e.g., promoter of phaCAB gene, tac promoter, lac Promoter, lac UV5 promoter, lpp promoter, p L λ promoter, p R λ promoter, rac 5 promoter, amp promoter, recA promoter, SP6 promoter, trp promoter and T7 promoter, etc.), ribosomal binding site for initiation of detoxification And transcription / detox termination sequences (eg, terminators of the phaCAB gene).

본 발명의 일 실시예에 따르면, phaCAB 유전자를 포함하는 벡터는 phaCAB 유전자를를 pCn 플라스미드에 삽입하여 제작한 pCnCAB이다(Yang et al., Biotechnol . Bioeng ., 105:150-160(2010)).According to one embodiment of the present invention, the vector containing the phaCAB gene is pCnCAB prepared by inserting the phaCAB gene into the pCn plasmid (Yang et al., Biotechnol . Bioeng ., 105: 150-160 (2010)).

단계 (b)에서 미생물의 배양은 단계 (a)에서 수득한 당화액을 이용하여 당업계에 공지된 통상적인 배양 방법에 따라 실시할 수 있다(Kubitschek, H. E., Introduction to Research with Continuous Cultures. Englewood Cliffs, N.J.:Prentice-Hall, Inc., 1970; Mandelstam, J., et al., Biochemistry of Bacterial Growth, 3rd ed. Oxford:Blackwell, 1982; Meynell, G.G., et al., Theory and Practice in Experimental Bacteriology, 2nd ed. Cambridge: Cambridge University Press, 1970; Gerhardt, P., ed., Manual of Methods for General Bacteriology, Washington: Am. Soc. Microbiol, 1981). 배양 과정에서 탄소원으로서의 당화액 이외에 질소원을 포함할 수 있으며, 예컨대 효모 추출액 및 트립톤을 포함할 수 있다.Cultivation of the microorganism in step (b) can be carried out according to a conventional culture method known in the art using the saccharification liquid obtained in step (a) (Kubitschek, HE, Introduction) to Research with Continuous Cultures . Englewood Cliffs, NJ: Prentice-Hall, Inc., 1970; Mandelstam, J., et al., Biochemistry of Bacterial Growth , 3rd ed. Oxford: Blackwell, 1982; Meynell, GG, et al., Theory and Practice in Experimental Bacteriology , 2nd ed. Cambridge: Cambridge University Press, 1970; Gerhardt, P., ed., Manual of Methods for General Bacteriology , Washington: Am. Soc. Microbiol, 1981). In addition to the saccharified solution as a carbon source in the culturing process, it may include a nitrogen source, such as yeast extract and tryptone.

본 발명의 방법에 따라 수득된 폴리하이드록시알카노에이트는, 바람직하게는 , 탄소수 3-5개인 모노머로 구성되어 있는 짧은 사슬 길이 폴리하이드록시알카노에이트(SCL PHAs) 또는 탄소수가 6개에서 14개인 모노머로 구성되어 있는 중간 사슬길이 폴리하이드록시알카노에이트(MCL PHAs)이며, 보다 바람직하게는 짧은 사슬 길이 폴리하이드록시알카노에이트, 예컨대 폴리(3-하이드록시프로피에이트), 폴리(3-하이드록시부틸레이트) 또는 폴리(3-하이드록시펜타노에이트)이며, 가장 바람직하게는 폴리(3-하이드록시부틸레이트)이다.
The polyhydroxyalkanoates obtained according to the process of the invention are preferably short chain length polyhydroxyalkanoates (SCL PHAs) consisting of monomers having 3-5 carbon atoms or 6 to 14 carbon atoms. Medium chain length polyhydroxyalkanoates (MCL PHAs) composed of individual monomers, more preferably short chain length polyhydroxyalkanoates such as poly (3-hydroxypropioate), poly (3- Hydroxybutylate) or poly (3-hydroxypentanoate), most preferably poly (3-hydroxybutylate).

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다: The features and advantages of the present invention are summarized as follows:

(a) 그물말 과 조류로부터의 화학물질 생산은 옥수수, 밀과 같은 식용자원이 아닌 비식용자원인 조류(algae)를 활용하기 때문에 바이오매스의 산업적 수요가 높아졌을 때 식품 가격 폭등 및 윤리적 문제의 발생 소지가 없고, 안정적으로 자원의 지속적 공급이 가능한 장점이 있다.(a) The production of chemicals from nets and algae uses non-edible algae, not edible sources such as corn and wheat, so that food price spikes and ethical issues arise when industrial demand for biomass increases. There is no possession, and there is an advantage that the continuous supply of resources can be stable.

(b) 또한, 본 발명에 따른 그물말 과 조류는 생화학적/화학적 당화가 매우 용이한 특징을 가져 수집 후 생체를 직접 사용할 수 있고, 건조체를 이용할 때에도 특별한 전처리 없이도 높은 당화율을 나타내며, 이는 보다 저비용으로 당화할 수 있는 경제성 뿐 아니라 당화공정시 환경오염물질 배출가능성도 낮아 향후 산업바이오화학제품 생산으로의 크게 기여할 것이다.(b) In addition, the net horse and algae according to the present invention has the characteristics that biochemical / chemical glycosylation is very easy to use the living body directly after collection, and even when using a dry body shows a high glycation rate without special pretreatment, which is more The economic feasibility of saccharification at low cost as well as the possibility of environmental pollutant emission during the saccharification process will contribute greatly to the production of industrial biochemical products.

(c) 따라서 본 발명에 따라 생산된 폴리하이드록시알카노에이트는 생분해성 물질로서 바이오플라스틱 및 기타 화학제품의 원료물질로 제공되어 석유계 유래의 난분해성 플라스틱 등을 대체시킬 수 있기 때문에 석유화학제품의 환경 및 인축독성 문제를 해결하는데 크게 기여할 것이다.
(c) Therefore, the polyhydroxyalkanoate produced according to the present invention is a biodegradable material, which is provided as a raw material of bioplastics and other chemical products, and thus can replace petroleum-based hardly decomposable plastics. Will greatly contribute to solving environmental and human toxicity problems.

도 1은 본 발명에 따른 그물말 과 조류를 이용한 고농도의 단당류를 수득하고 이의 당화액으로부터 폴리하이드록시알카노에이트를 생산하는 방법에 대한 공정을 모식화한 것이고,
도 2는 본 발명에 따른 그물말의 주요 당 조성을 고성능액체크로마토그래피를 이용하여 분석한 결과이다. Figure 1 is a schematic of the process for obtaining a high concentration of monosaccharides using the nettle and algae according to the present invention and producing polyhydroxyalkanoate from its saccharified solution,
Figure 2 is the result of analyzing the main sugar composition of the net according to the present invention using high performance liquid chromatography.

본 발명은 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다. 이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
The invention is explained in more detail by the following examples. However, the following examples are only to aid the understanding of the present invention, and the scope of the present invention in any sense is not limited by these examples. Hereinafter, the technical and scientific terms used herein will be understood by those skilled in the art without departing from the scope of the present invention. Descriptions of known functions and configurations that may be unnecessarily blurred are omitted.

실시예Example

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 “%“는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
Throughout this specification, "%" used to denote the concentration of a particular substance is intended to include solids / solids (wt / wt), solid / liquid (wt / The liquid / liquid is (vol / vol)%.

실시예 1: 그물말의 탄수화물 함량 및 조성 분석Example 1 Carbohydrate Content and Composition Analysis of Net Horse

1. 화학적 성분조성 조사1. Chemical composition investigation

수집된 담수조류 중 그물말 과의 대표적인 히드로딕티온 속(Hydrodictyon sp.) 그물말에 대하여 총탄수화물, 단백질, 조지질 및 회분의 상대적 함량 비율을 조사하였다.The relative proportions of total carbohydrates, proteins, crude lipids and ash were investigated for the representative Hydrodictyon sp .

우선, 수집된 그물말은 2회 이상 수돗물로 세척하였다. 이를 45℃ 컨벤션 오븐에 1일 이상 두어 건조시킨 다음 분쇄기를 이용하여 1 mm 이하의 분말로 조제하여 분석용 시료로 사용하였다.First, the harvested horses were washed twice with tap water. The mixture was dried in a 45 ° C convention oven for 1 day or more and then dried and pulverized to a powder having a size of 1 mm or less.

건조시료의 성분분석은 한국식품연구원에 의뢰하여 실시하였으며, 수분은 식품공전(2009) 상압가열건조법, 조지질은 식품공전(2009) 에테르추출법, 단백질은 크옐달법(Kjeldahl method), 회분은 식품공전(2009) 회분시험법에 준하여 정량하였다.Component analysis of dried samples was conducted by the Korea Food Research Institute, moisture content in the Food Code (2009), atmospheric pressure drying method, crude oil in the Food Code (2009), ether extraction method, protein in the Kjeldahl method, and ash content in the Food Code. (2009) Quantified according to the batch test method.

그 결과, 그물말은 수분 5.3%, 조지질 1.9%, 단백질 12.9%, 총 탄수화물 64.6%, 회분 15.3%의 화학적 조성을 가지는 것을 확인할 수 있었다. 일반적으로 성분조성은 생육단계 및 환경에 따라 다소 변화가 있는 것으로 보고되기 있기 때문에 향후 분석 시 이를 참고하였다.
As a result, it was confirmed that the horse had a chemical composition of 5.3% moisture, crude lipid 1.9%, protein 12.9%, total carbohydrate 64.6% and ash 15.3%. In general, the composition of the composition is reported to be somewhat changed depending on the growth stage and the environment, so the analysis was used for future analysis.

2. 그물말의 탄수화물 조성 및 함량 조사2. Carbohydrate Composition and Content of Net Horse

조류 바이오매스 내 총 탄수화물 함량 뿐 아니라 어떤 종류의 당이 어느 정도 함유되어있는지를 안다는 것은 당화처리 조건의 효율성, 발효 균주 선택, 발효에 의한 특정성분으로의 전환율 등을 판단하는데 있어서 근간이 된다. 바이오매스의 탄수화물 조성 및 함량은 일반적으로 산 가수분해를 통해 조사되는데 보다 정확한 데이터를 얻기 위해서는 바이오매스 각 종류별로 온도, 산농도, 처리시간, 압력 등 제반 처리조건의 최적화가 필요하다. 본 연구에서는 그물말 내의 주요 탄수화물 조성과 그 함량을 알아보기 위하여 실험하였다.
Knowing the total carbohydrate content in the algae biomass as well as the content of certain types of sugars is fundamental to determining the efficiency of glycation treatment conditions, the selection of fermentation strains, and the conversion rate to specific components by fermentation. Carbohydrate composition and content of biomass are generally investigated through acid hydrolysis. Optimization of various treatment conditions such as temperature, acid concentration, treatment time, and pressure is required for each type of biomass in order to obtain more accurate data. In this study, we investigated the composition and contents of major carbohydrates in the horses.

(1) 그물말의 탄수화물의 조성을 알기위한 GC 분석(1) GC analysis to know the composition of carbohydrates in the net

그물말 조류의 탄수화물 조성을 알기 위해서 먼저 산 가수분해를 실시하였다. 바이오매스 준비, 바이오매스 내의 추출성분(extractives) 제거, 시료의 1차/2차 산 가수분해 등은 “NREL 프로토콜(NREL, 2009, Laboratory anayltical procedure)”에 준하여 실험하였다. In order to know the carbohydrate composition of the birds, acid hydrolysis was performed first. Biomass preparation, removal of extractives in biomass, and primary / secondary acid hydrolysis of samples were tested according to the NREL protocol (NREL, 2009, Laboratory anayltical procedure).

그물말의 산처리에 의해 단당류로 변환된 당용액을 가스 크로마토그래피(Gas chromatography, GC)를 이용하여 단당류의 종류를 파악하였다. 정성분석은 0.5 g 정도의 시료를 취하여 동결 건조한 후 실릴화(silylation)하여 분석하였다. 실릴화제(silylating agent)(Sigma-Aldrich)는 헥사메틸디실라젠(Hexamethyldisilazane), 클로로트리메틸실란(Chlorotrimethylsilane), 피리딘(pyridine)을 각각 3:1:9의 부피비로 혼합한 것으로, 0.5 mL의 동결 건조된 샘플에 투입하여 30분 교반한 후 상부의 맑은 액만 사용하여 분석을 진행하였다.The type of monosaccharides was determined by gas chromatography (GC) of the sugar solution converted to monosaccharides by acid treatment of the net. Qualitative analysis was taken by taking a sample of about 0.5 g, lyophilized, and then silylation. Silylating agent (Sigma-Aldrich) is a mixture of hexamethyldisilazane, chlorotrimethylsilane and pyridine in a volume ratio of 3: 1: 9, respectively, 0.5 mL of freezing. The sample was added to the dried sample, stirred for 30 minutes, and analyzed using only the clear liquid at the top.

정성분석에 사용된 기기는 Agilent사의 가스 크로마토그래피(Gas Chromatography, GC, model:6890N)을 사용하였다. 검출기는 FID, 컬럼은 DB-1HT(30 m× 0.32 ㎜× 0.1 ㎛)을 사용하였다. 온도조건은 주입구와 검출기는 250℃를 유지하였으며, 오븐의 온도는 초기 100℃에서 분당 5℃씩 250℃까지 승온하여 5분간 대기하였다. 그리고 표준당과 시료의 체류시간을 비교하여 시료의 당 성분을 정성 분석하였다.
The instrument used for qualitative analysis was Agilent's gas chromatography (Gas Chromatography, GC, model: 6890N). The detector used FID and the column used DB-1HT (30 m × 0.32 mm × 0.1 μm). The temperature and temperature of the inlet and the detector were maintained at 250 ° C. The temperature of the oven was increased from 250 ° C to 5 ° C per minute at an initial temperature of 100 ° C, and then the apparatus was kept waiting for 5 minutes. Then, the sugar content of the sample was qualitatively analyzed by comparing the retention time of the standard sugar and the sample.

(2) 그물말 효소가수분해물의 단당류 정량분석(2) Quantitative Analysis of Monosaccharides of Enzyme Hydrolysates

그물말의 효소가수분해를(하기 실시예 2 참조) 통해 얻어진 당류의 정량분석을 위해 고성능 액체크로마토그래피(highperformance liquid chromatography, HPLC)(Waters 2427) 분석을 실시하였으며, 제반 분석조건은 NREL 프로토콜(NREL, 2009, Laboratory anayltical procedure)을 참고하였다. High performance liquid chromatography (HPLC) (Waters 2427) analysis was performed for quantitative analysis of sugars obtained through enzymatic hydrolysis of the net horse (see Example 2 below). , 2009, Laboratory anayltical procedure).

그 결과, 그물말 건조시료를 속슬렛 추출시 물 추출성분(water-extractive) 무게는 29.5%, 물 추출성분 제거 후 남은 고형분(WEFS)은 건조시료 전체 무게의 70.5%를 차지하였다. 상기 시료에 대해 고압멸균기를 이용하여 1차, 2차 가수분해를 실시한 다음 얻어진 가수분해물을 가스 크로마토그래피로 정성분석한 결과, 그물말 시료의 주요 당성분은 글루코오스와 만노오스인 것을 확인할 수 있었다.As a result, the water-extractive weight was 29.5% and the solids content (WEFS) of the dried sample was 70.5%. As a result of performing the first and second hydrolysis using autoclave on the sample and qualitative analysis of the obtained hydrolyzate by gas chromatography, it was confirmed that the main sugar components of the net sample were glucose and mannose.

상기의 결과를 기반으로 하여 그물말 조류에 대한 효소 가수분해물의 당조성 및 함량을 고성능 액체크로마토그래피(디텍터 : 굴절률디텍터, Refractive index detector)로 분석하였다. 그 결과 도 2에서 보는 바와 같이 글루코오스와 만노오스가 주요 성분임을 재확인 할 수 있었으며, 각각의 함량은 건조된 바이오매스 100 g 당 46.82±0.46 g, 10.56±0.48 g 이었다. Based on the above results, the sugar composition and the content of the enzyme hydrolyzate for the net algae were analyzed by high performance liquid chromatography (detector: Refractive index detector). As a result, as shown in Figure 2 it was confirmed that glucose and mannose are the main components, each content of 46.82 ± 0.46 g, 10.56 ± 0.48 g per 100 g of dried biomass.

이는 그물말의 총탄수화물이 64.6%이었던 것을 감안할 때 효소가수분해에 의한 육탄당(glucose＋mannose) 수득율은 총탄수화물 기준 88.8%였고, 바이오매스 건물중 기준 57.4%였다. 이는 조류로부터의 당생성율에 있어서 현재까지 보고된 결과들 중에서 매우 높은 수준임을 확인할 수 있었다.Considering that 64.6% of the total carbohydrates in the horses were produced, the yield of glucose + mannose by enzymatic hydrolysis was 88.8% based on total carbohydrate and 57.4% based on biomass. It was confirmed that this is a very high level of sugar production from birds to date.

이상의 결과는 그물말 시료가 발효용, 바이오리파이너리 또는 바이오에너지용 바이오매스로서 매우 우수한 품질의 재료가 될 수 있음을 확인한 결과이다. 왜냐하면 대부분의 상업용 발효균주는 오탄당보다 육탄당을 잘 이용하며 육탄당 중에서도 글루코오스가 다량 함유된 시료를 가장 선호하기 때문이다.
These results are the result of confirming that the netting sample can be a very high quality material for fermentation, biorefinery, or biomass for bioenergy. This is because most commercial fermenting bacteria prefer the hexane sugar rather than the pentane sugar and prefer the sample containing a large amount of glucose among the hexane sugar.

실시예Example 2: 여러 농도의  2: various concentrations 당화액Saccharification 제조 Produce

그물말 시료에 대해 고형분 함량에 따른 당화 및 글루코오스 생성 패턴을 파악하여 여러 농도의 당화액을 제조하기 위하여 실험하였다.For the net samples, the glycosylation and glucose production patterns according to the solid content were identified to prepare a saccharified solution of various concentrations.

식물재료는 온실에서 배양한 그물말을 수확하여 탈수시킨 다음 이를 45℃에서 컨벤션 오븐에 1일 동안 건조시킨 후 믹서기로 분쇄하여 잘게 부서진 상태의 분말을 실험재료로 사용하였다(HR-d3). 본 시료는 글루코오스 함량이 약 40-45% 함유되는 것으로 조사되었다. The plant material was harvested from the greenhouse harvested and dehydrated. The plant material was dried in a convention oven at 45 ° C for 1 day, and then pulverized with a blender to obtain finely pulverized powder (HR-d3). The sample was found to contain about 40-45% glucose content.

125 mL 삼각 플라스크에 상기 건조시료를 고형분 함량이 2-10%(w/v) 되도록 넣고 0.1 M 시트레이트 완충액(pH 4.8) 23.9 mL 및 1% NaN3 1.1 mL를 가한 다음, 120℃에서 20분 고압살균하였다. The dried sample was placed in a 125 mL Erlenmeyer flask with a solids content of 2-10% (w / v), 23.9 mL of 0.1 M citrate buffer (pH 4.8) and 1.1 mL of 1% NaN 3 were added, followed by 20 minutes at 120 ° C. Autoclaved.

무균상에서 효소용액을 고형분 함량에 비례하여 가하였는바, 사용된 효소량은 E1＋E2＋E3＋E4를 건조물 1 g당 0.2＋0.04＋0.2＋0.2 mL 수준이었다. 이때 사용된 효소는 셀룰라아제(Celluclast 1.5 L, Novozymes사 제품, E1으로 표시), β-글루코시다아제(Sigma C6105, E2로 표시), α-아밀라아제(Sigma A8220, E3로 표시), 아밀로글루코시다아제(Sigma A7095, E4로 표시) 이었다. 이후 50℃, 150 rpm에 2일 동안 배양하면서 가수분해 시키고, 당화액내의 글루코오스 생성정도를 생화학 분석기(YSI Incorporated, YSI 2700 SELECT)로 분석, 정량하였다.In the aseptic phase, the enzyme solution was added in proportion to the solids content. The amount of enzyme used was 0.2 + 0.04 + 0.2 + 0.2 mL per 1 g of the dried product of E1 + E2 + E3 + E4. The enzymes used were cellulase (Celluclast 1.5 L, manufactured by Novozymes, denoted by E1), β-glucosidase (denoted by Sigma C6105, E2), α-amylase (denoted by Sigma A8220, E3), and amyloglucosidase. Aze (denoted Sigma A7095, E4). Thereafter, the mixture was hydrolyzed while incubated at 50 ° C. and 150 rpm for 2 days, and glucose production in the saccharified solution was analyzed and quantified by a biochemical analyzer (YSI Incorporated, YSI 2700 SELECT).

그 결과, 그물말 건조시료의 고형분의 함량이 10% 될 때 까지는 어떠한 장애 없이 비례적으로 글루코오스 생성량이 증가되어 10%(w/v)의 고형분이 함량 된 처리구에서는 약 4.1% 내외의 글루코오스 당용액이 생산되었다. As a result, glucose production was increased proportionally without any disturbance until the solid content of the net dried sample became 10%, and the glucose sugar solution was about 4.1% in the treatment group containing 10% (w / v) solids. This was produced.

본 그물말 시료의 경우는 건조물 100 g 당 약 45 g 전후의 글루코오스가 생성될 수 있는 시료로서 10%의 고형분 함량까지도 당화율에 있어서는 큰 변함이 없는 것으로 나타났다.In the case of this net sample, about 45 g of glucose per 100 g of dry matter was produced, and even a solid content of 10% showed no significant change in the glycosylation rate.

그러나 15% 이상의 고형분 함량에서는 건조시료 투입량에 따른 글루코오스 생성량이 비례적으로 증가되지는 않았고 당화율도 점점 낮아지는 경향을 보였다.
However, at 15% solids content, glucose production amount did not increase proportionally with the amount of dry sample, and the glycation rate tended to decrease gradually.

실시예Example 3: 산 가수분해에 따른  3: by acid hydrolysis 그물말로부터의From the net 글루코오스 생산 Glucose production

그물말의 산가수분해에 따른 글루코오스 생성정도를 알아보기 위하여 실험하였다. Experiments were conducted to determine the degree of glucose production by acid hydrolysis of the horsetail.

식물재료는 45℃에서 1일 건조된 그물말 시료를 분말화 하여 1-2 mm 체에 통과되도록 하였다. 물 추출성분이 제거된 고형분(WEFS)과 물 및 에탄올 추출성분이 제거된 고형분 시료는(EFS) 시료는 다음과 같이 제조하였다. 즉, 물 추출성분이 제거된 고형분(Water-extractive free solid, WEFS) 제조의 경우, 2 g의 건조 분말시료를 심블(thimble, 28×100 mm)에 넣고 190 mL의 물을 이용하여 250℃에서 약 8시간 추출한 다음, 잔사를 취하여 45℃에 1일 동안 건조시켜 조제하였다. 물 및 에탄올 추출성분이 제거된 고형분(Water&ethanol-extractive free solid, EFS) 제조의 경우는 2 g의 건조 분말시료를 심블(thimble, 28×100 mm)에 넣고 190 mL의 물을 이용하여 250℃에서 약 8시간 추출한 후, 이를 다시 190 mL 에탄올로 150℃에서 3-4시간 추출한 후, 잔사를 취하여 45℃에 1일 동안 건조시켜 조제하였다. The plant material was powdered and dried at 45 ° C. for 1 day to pass through a 1-2 mm sieve. Solids (WEFS) from which the water extract component was removed and solids (EFS) sample from which the water and ethanol extracts were removed were prepared as follows. That is, in the case of water-extractive free solid (WEFS) manufacturing, 2 g of dry powder sample was placed in a thimble (28 × 100 mm) at 250 ° C. using 190 mL of water. After extraction for about 8 hours, the residue was taken and dried at 45 ° C. for 1 day to prepare. For the manufacture of water and ethanol-extracted solids (Water & ethanol-extractive free solid, EFS), 2 g of dry powder sample is placed in a thimble (28 × 100 mm) at 250 ° C using 190 mL of water. After extraction for about 8 hours, this was again extracted with 190 mL of ethanol for 3-4 hours at 150 ℃, the residue was taken to dry at 45 ℃ for 1 day to prepare.

산 가수분해는 상기와 같이 준비된 건조분말시료(분말, WEFS, EFS) 0.3 g을 취한 다음 72% 황산 3 mL를 넣고, 30℃ 항온기에 1시간 두었다가(1차 가수분해, 5-10분 마다 교반), 이후 증류수를 가하여 1-4%로 희석한 다음 마개를 한 후, 위 아래로 흔들어 혼합시켜 121℃에서 1시간 가수분해하였다(2차 가수분해). 그 후 가수분해물을 탄산칼슘(calcium carbonate)으로 중화시켰다.0.3 g of dry powder sample (powder, WEFS, EFS) prepared as described above was added, and 3 mL of 72% sulfuric acid was added thereto and placed in a 30 ° C. thermostat for 1 hour (primary hydrolysis, stirring every 5-10 minutes). ), And then distilled water was diluted to 1-4% and then plugged and then shaken up and down to mix and hydrolyzed at 121 ° C. for 1 hour (secondary hydrolysis). The hydrolyzate was then neutralized with calcium carbonate.

중화된 그물말 가수분해물을 막여과 또는 원심분리한 후, 고성능 액체크로마토그래피 분석(디텍터 : 코로나디텍터, Corona detector)을 실시하였다. 글루코오스 정량을 위해서 글루코오스 표준곡선과 동일조건에서의 글루코오스 손실률(loss factor)을 구하여 환산해 주었다. After neutralizing the net hydrolyzate, membrane filtration or centrifugation was performed, followed by high performance liquid chromatography analysis (detector: Corona detector). To quantify glucose, the glucose loss factor was calculated and converted under the same conditions as the glucose standard curve.

상기 시료에 대해 산 가수분해 후 생성된 글루코오스 함량을 분석한 결과, 하기 표 1에서 확인할 수 있듯이 속슬렛 추출을 하지 않은 시료는 건조물 100 g당 38.22 g의 글루코오스를 생성하였고, 물 추출성분이 제거된 고형분(Water-extractive free solid, WEFS), 물 및 에탄올 추출성분이 제거된 고형분(Water&ethanol-extractive free solid, EFS)는 각각 56.35 g, 53.72 g의 글루코오스 생성량을 나타내었다.As a result of analyzing the glucose content generated after the acid hydrolysis of the sample, as shown in Table 1, the sample without Soxhlet produced 38.22 g of glucose per 100 g of dry matter, and the water extraction component was removed. Water-extractive free solids (WEFS), water and ethanol-extracted solids (Water & ethanol-extractive free solids, EFS) showed 56.35 g and 53.72 g of glucose, respectively.

추출 후 남은 잔사(WEFS, EFS)가 무처리의 경우 보다 글루코오스함량 높은데, 이는 추출물이 제거된 상태에서 셀룰로오스 성분을 가진 조직이 상대적으로 높게 포함되었기 때문이다.Residues after extraction (WEFS, EFS) are higher in glucose content than in the case of no treatment, because the tissue containing the cellulose component is relatively high in the state in which the extract is removed.

여러 종류 그물말 고형분의 산가수분해로부터 얻어진 글루코오스 함량Glucose Content from Acid Hydrolysis of Various Net Solids 그물말 고형분 종류Net Solids Type 산가수분해후 글루코오스 함량
(g/100 g 건조 그물말 분말시료)Glucose content after acid hydrolysis
(g / 100g dry net powder sample) 무처리No treatment 38.22± 1.8738.22 ± 1.87 WEFSWEFS 56.35± 4.7856.35 ± 4.78 EFSEFS 53.72± 2.4653.72 ± 2.46

실시예Example 4:  4: 당화시료내의In saccharified samples 발효억제물질( Fermentation inhibitors HMFHMF , , furfuralsfurfurals ) 함량조사) Content investigation

바이오매스 기원 당용액으로부터 화학제품 원료물질을 생산하기 위해서는 고농도 당용액을 제조하여 생물학적 전환을 위한 발효용 기질로서 제공하여야 한다. 이때 중요하게 고려되어야 할 사항은 발효에 유용한 당이 가능한 한 최대로 많이 함유되면서 발효균주의 생육을 저해하는 물질이 최소화되어야 한다. 그런데 일반적으로 당화효율을 높이기 위해 바이오매스를 고온/고압처리 하거나, 산 가수분해 처리를 하게 되는데 이 작업과정에서 당이 화학적 전환을 일으켜 하이드록시메틸풀푸랄(Hydroxymethylfurfural, HMF) 및 풀푸랄(furfural)이 생성되고, 이는 발효균주의 강력한 저해제로 보고되고 있다. To produce chemical raw materials from solutions per biomass source, high-concentration sugar solutions should be prepared and provided as a fermentation substrate for biological conversion. At this time, it is important to minimize the substances that inhibit the growth of fermented strains while containing as much sugar as possible for fermentation. However, in general, biomass is subjected to high temperature / high pressure treatment or acid hydrolysis treatment to increase glycosylation efficiency. In this process, sugars undergo chemical conversion, which results in hydroxymethylfurfural (HMF) and furfural. Is produced and it is reported to be a potent inhibitor of fermented strains.

본 실시예에서는 그물말 시료를 가지고 효소당화 또는 산 가수분해하는 과정에서 하이드록시메틸풀푸랄 및 풀푸랄이 어느 정도 생성되는지를 알아보고 발효균주의 억제여부를 예측해 보고자 실험하였다. In this example, the experiment was performed to find out how much hydroxymethylfurfural and fufural are produced in the process of enzymatic saccharification or acid hydrolysis with a net sample, and to predict whether the fermentation strain is inhibited.

효소당화는 상기 실시예 1에서와 동일하게 진행하였고, 산 가수분해는 상기 실시예 2에서와 같이 실험하였다.Enzymatic glycosylation was performed in the same manner as in Example 1, and acid hydrolysis was performed as in Example 2.

발효억제물질의 분석은 고성능 액체크로마토그래피(Waters)로 하이드록시메틸풀푸랄 및 풀푸랄을 정량하였다. 컬럼은 Comosil 5C18-MS-II(4×150 mm)을 사용하였고, 이동상은 100% 증류수(펌프 A)와 100% 메탄올(펌프 B)로 시간별 구배를 두었으며, 유량은 0.6 mL/min, 측정 파장은 280 nm이었다.
Analysis of fermentation inhibitors quantified hydroxymethylfurfural and fufural by high performance liquid chromatography (Waters). The column used Comosil 5C18-MS-II (4 × 150 mm) and the mobile phase was gradientd hourly with 100% distilled water (Pump A) and 100% methanol (Pump B), flow rate 0.6 mL / min, measured The wavelength was 280 nm.

(1) 효소 당화물 내의 발효억제물질 함량(1) Content of Fermentation Inhibitor in Enzymatic Glycosaccharide

고형물 함량이 2-10%(w/v)이 되도록 하여 효소당화시킨 시료의 퓨란 유도체를 분석한 결과, 하기 표 2에서도 확인할 수 있듯이, 하이드록시메틸풀푸랄은 미량 검출되었으나 풀푸랄은 검출되지 않았다. As a result of analyzing the furan derivative of the enzyme-glycosylated sample with a solid content of 2-10% (w / v), as shown in Table 2 below, trace amounts of hydroxymethylfurfural were detected but no fufural was detected. .

상기의 결과를 바탕으로 그물말 건조시료로부터 10% 글루코오스 함량의 당농축액을 제조했을 때 포함될 수 있는 하이드록시메틸풀푸랄의 농도가 15-28.3 ppm(0.12-0.23 mM)임을 확인할 수 있었다. 보고에 의하면 하이드록시메틸풀푸랄의 경우 대장균(Escherichia coli, E. coli)에 대해 0.265% 농도에서 50% 생육을 저해하고, 기타 균주에 대해서 0.1-0.5%에서 저해하는 것으로 보고된 바(Almeida. Appl . Microbiol . Biotechnol, 82:625-638(2009)), 이에 준하면 본 그물말 유래 당용액(10% 글루코오스 함량)은 하이드록시메틸풀푸랄의 생육저해활성 농도 보다 50배 이상 낮게 함유되어 있기 때문에 발효균주를 전혀 저해하지 않음을 예측할 수 있었다.On the basis of the above results, it was confirmed that the concentration of hydroxymethylpulfural which may be included when preparing a sugar concentrate having a 10% glucose content from a dried net sample was 15-28.3 ppm (0.12-0.23 mM). Reportedly, hydroxymethylfurfural is known as Escherichia coli , E. coli ) inhibited 50% growth at a concentration of 0.265% and at 0.1-0.5% for other strains (Almeida. Appl . Microbiol . Biotechnol , 82: 625-638 (2009) )), And accordingly, the sugar solution (10% glucose content) of the net horsetail was predicted that it did not inhibit fermented strains at all because it contained more than 50 times lower than the growth inhibitory activity concentration of hydroxymethylpulfural.

그물말 고형분 함량별로 얻어진 효소 당화물 내의 발효억제물질 함량Fermentation Inhibitor Content in Enzyme Glycosaccharides Obtained by Solid Content 고형분 함량 (w/v)1) Solids content (w / v) 1) 함량(㎎/L)Content (mg / L) 생성량
(㎎/g 건조 그물말 분말시료)Production amount
(Mg / g dry net powder sample) 푸랄데하이드
(mg/g DM)Furaldehyde
(mg / g DM) 하이드록시 메틸풀푸랄Hydroxy methyl fulfural 풀푸랄Fulfural 하이드록시 메틸풀푸랄Hydroxy methyl fulfural 풀푸랄Fulfural 2%2% 3.8± 0.263.8 ± 0.26 ND2 ) ND 2 ) 0.205±0.0140.205 ± 0.014 NDND 0.2050.205 6%6% 11.2± 0.4611.2 ± 0.46 NDND 0.209±0.0080.209 ± 0.008 NDND 0.2090.209 7%7% 14.5± 1.5714.5 ± 1.57 NDND 0.233±0.0250.233 ± 0.025 NDND 0.2330.233 8%8% 12.4± 0.13 12.4 ± 0.13 NDND 0.175±0.0020.175 ± 0.002 NDND 0.1750.175 9%9% 12.7± 0.10 12.7 ± 0.10 NDND 0.161±0.0010.161 ± 0.001 NDND 0.1610.161 10%10% 13.9± 0.1313.9 ± 0.13 NDND 0.159±0.0010.159 ± 0.001 NDND 0.1590.159

1)효소가수분해가 48시간동안 50℃, 150 rpm 회전배양조건에서 진행되었음. 1) Enzymatic hydrolysis was carried out at 50 ° C and 150 rpm rotational culture for 48 hours.

2)ND: Not determined
 2) ND: Not determined

(2) 산가수분해물의 발효억제물질 함량(2) Content of fermentation inhibitory substance of acid hydrolyzate

물 및 에탄올 추출 후 남은 잔사 시료를(EFS) 고압멸균기에서 산 가수분해 시켰을 경우, 하이드록시메틸풀푸랄(Hydroxymethylfurfural, HMF) 및 풀푸랄(furfural) 생성량이 각각 건조물 1 g당 3.8 mg 및 3.3 mg으로서 하이드록시메틸풀푸랄이 풀푸랄보다 약간 높게 생성됨을 확인할 수 있었다. 이를 근간으로 그물말 건조시료로부터 산 가수분해를 통해 5% 글루코오스 함량의 당농축액을 제조했을 때 포함될 수 있는 퓨란 유도체 총량은 약 0.07%가 되는 것으로 추측할 수 있었고, 이는 보고된 문헌을 통해서 볼 때 발효균주를 심하게 억제하지는 않을 것으로 판단되었다.
After acid and hydrolysis of the residual sample after extraction of water and ethanol (EFS) in an autoclave, the amount of hydroxymethylfurfural (HMF) and furfural was 3.8 mg and 3.3 mg per gram of dry matter, respectively. It was confirmed that hydroxymethylfurfural was slightly higher than fufural. Based on this, it was estimated that the total amount of furan derivatives that could be included when preparing a sugar concentrate having 5% glucose content by acid hydrolysis from dried powder samples was about 0.07%. The fermented strains would not be severely inhibited.

실시예Example 5: 몇 가지  5: some 그물말Net 과 고형물로부터  From and solids 당농축액Sugar concentrate 생산 production

바이오매스 기원 당용액으로부터 화학제품 원료물질을 생산하기 위해서는 고농도 당용액을 제조하여 생물학적 전환용 기질로서 제공하여야 한다. In order to produce chemical raw materials from sugar solutions of biomass origin, high concentration sugar solutions should be prepared and provided as a substrate for biological conversion.

이를 위해서는 유용한 당이 가능한 최대로 많이 함유되면서 화학적 간섭 또는 생육억제물질이 최소화되도록 조제하는 기술이 확보되어야 한다. 본 실시예에서는 몇 가지 처리된 그물말 시료를 가지고 고농도 당용액을 제조하는 방법을 실험하고자 하였다. To this end, it is necessary to secure a technology that contains the maximum amount of useful sugars while minimizing chemical interference or growth inhibitory substances. In this example, a method of preparing a high concentration of sugar solution with several treated net horse samples was attempted.

식물재료는 온실에서 배양한 그물말을 수확하여 탈수시킨 다음 이를 45℃에서 컨벤션 오븐에 1일 동안 건조시킨 후, 믹서기로 분쇄하여 잘게 부서진 상태의 분말을 실험재료로 사용하였다. The plant material was harvested and dehydrated in a greenhouse grown in a greenhouse, then dried in a convention oven at 45 ° C. for 1 day, and then pulverized with a blender to use finely divided powder as an experimental material.

당농축액 제조는 그물말 건조시료, 물 추출물이 제거된 잔사(WEFS), 물/에탄올 추출물이 제거된 잔사(EFS)를 가지고 제조하였다. 물 및 에탄올로의 추출은 실시예 2에서와 같았다.Sugar concentrate preparation was prepared with a net dried sample, residue (WEFS) from which water extract was removed, and residue (EFS) from which water / ethanol extract was removed. Extraction with water and ethanol was the same as in Example 2.

상기와 같이 조제된 건조분말시료(분말, WEFS, EFS)를 가지고 당화액을 제조하기 위해서는 건조시료(8 g)를 500 mL 삼각 플라스크에 넣고 0.5 mM 시트레이트 완충용액(pH 4.8) 100 mL를 가한 다음, 120℃에서 20분 고압살균 하였다. 무균상에서 여과멸균된 당화효소 E1＋E2＋E3＋E4 용액을(아래 참조) 각각 건조물 1 g 당 0.2, 0.04, 0.2, 0.2 mL 양으로 가한 후 50℃, 170 rpm에 2일 동안 배양하면서 가수분해 시켰다. 이때 사용된 효소는 셀룰라아제(Celluclast 1.5 L, Novozymes사 제품, E1으로 표시), β-글루코시다아제(Sigma C6105, E2로 표시), α-아밀라아제(Sigma A8220, E3로 표시), 아밀로글루코시다아제(Sigma A7095, E4로 표시) 이었다.To prepare a saccharified solution with the dry powder samples (powder, WEFS, EFS) prepared as described above, add a dry sample (8 g) to a 500 mL Erlenmeyer flask and add 100 mL of 0.5 mM citrate buffer (pH 4.8). Then, autoclaved for 20 minutes at 120 ℃. Aseptically filtered sterilized glycosylase E1 + E2 + E3 + E4 solution (see below) was added in 0.2, 0.04, 0.2, and 0.2 mL amounts per g of dry matter, respectively, and then hydrolyzed at 50 ° C. and 170 rpm for 2 days. The enzymes used were cellulase (Celluclast 1.5 L, manufactured by Novozymes, denoted by E1), β-glucosidase (denoted by Sigma C6105, E2), α-amylase (denoted by Sigma A8220, E3), and amyloglucosidase. Aze (denoted Sigma A7095, E4).

당화가 끝난 시료는 원심분리를(8000 rpm, 20분) 통해 1차 상등액을 취하고, 이어 멸균수를 넣고 부유시킨 다음 동일한 조건으로 원심분리하여 2차 상등액을 취하였다. 1차와 2차 상등액을 모아 혼합한 다음 적당량의 알코올을 가하면서 감압건조기로 물 및 용매를 건조시켰다. 당농축액 내의 글루코오스 함량은 시료를 증류수에 희석하여 생화학 분석기(YSI 2710)로 분석, 정량하였다. The saccharified sample was subjected to centrifugation (8000 rpm, 20 minutes) to take the first supernatant, then sterilized water was added and suspended, and then centrifuged under the same conditions to obtain a second supernatant. The primary and secondary supernatants were collected and mixed, and then water and solvents were dried with a reduced pressure dryer while adding an appropriate amount of alcohol. The glucose content in the sugar concentrate was analyzed and quantified by diluting the sample with distilled water using a biochemical analyzer (YSI 2710).

그 결과, 10 g의 그물말 건조분말에서 약 20.2 g의 당농축액을 수득할 수 있었고, 이의 글루코오스 함량은 14.5% 정도였다. 한편 물 추출물이 제거된 잔사(WEFS) 및 물/에탄올 추출물이 제거된 잔사(EFS) 10 g을 동일한 방법으로 조제하였을 때 약 16.8 g 내외의 당농축액을 얻을 수 있었고, 이를 적당량의 멸균수와 혼합하여 얻어진 당용액의 글루코오스 함량은 각각 15.8%, 18% 정도였다. 이는 WEFS 또는 EFS를 이용했을 때 직접 분말화한 건조시료보다 약간 더 높은 고농도 당용액을 제조할 수 있음을 시사해 주지만 물/에탄올 추출 경비 등을 고려하면 그 효과가 낮을 것으로 판단된다.As a result, about 20.2 g of sugar concentrate could be obtained from 10 g of dry net powder, and its glucose content was about 14.5%. Meanwhile, when 10 g of the residue (WEFS) from which the water extract was removed and 10 g of the residue (EFS) from which the water / ethanol extract was removed were prepared in the same manner, a sugar concentrate of about 16.8 g was obtained and mixed with an appropriate amount of sterile water. The glucose content of the obtained sugar solution was about 15.8% and 18%, respectively. This suggests that when using WEFS or EFS, a slightly higher concentration of sugar solution can be prepared than the dry powder, which is directly powdered, but the effect is low considering the cost of water / ethanol extraction.

따라서 물/에탄올 추출물 제거 없이 직접 분말화한 그물말 과 시료를 가지고 당용액을 조제하여도, 적어도 글루코오스 함량이 10% 이상이 되면서 발효에 직접 적용할 수 있는 정도의 용액을 손쉽게 확보할 수 있음을 확인할 수 있었다.
Therefore, even if the sugar solution is prepared with the powdered powder and the sample directly powdered without removing the water / ethanol extract, at least 10% of glucose content can be easily obtained to obtain a solution that can be directly applied to fermentation. I could confirm it.

실시예Example 6:  6: 그물말Net 과 조류로부터 글루코오스  Glucose from Algae 고함유High content 당용액Sugar solution HRHS9HRHS9 조제 pharmacy

온실에서 배양된 그물말 과 조류 건조분말시료(HR-d7)를 가지고 보다 높은 용량과 낮은 완충용액강도(buffer strength) 하에서 당화액을 제조하기 위해서 건조시료(40 g)를 2000 mL 삼각 플라스크에 넣고 0.1 mM 시트레이트 완충용액(pH 4.8) 500 mL를 가한 다음, 120℃에서 30분 고압살균 하였다. 무균상에서 여과멸균된 당화효소 E1＋E2＋E3＋E4 용액을 각각 건조물 1 g 당 0.2, 0.04, 0.2, 0.2 mL양으로 가한 후 50℃, 170 rpm에 2일 동안 배양하면서 가수분해 시켰다. 이때 사용된 효소는 셀룰라아제(Celluclast 1.5 L, Novozymes사 제품, E1으로 표시), β-글루코시다아제(Sigma C6105, E2로 표시), α-아밀라아제(Sigma A8220, E3로 표시), 아밀로글루코시다아제(Sigma A7095, E4로 표시) 이었다.Dry sample (40 g) was added to a 2000 mL Erlenmeyer flask to prepare saccharified solution under higher capacity and lower buffer strength with net-grown and algae dry powder samples (HR-d7). 500 mL of 0.1 mM citrate buffer (pH 4.8) was added and autoclaved at 120 ° C. for 30 minutes. Aseptically filtered sterilized glycosylated enzyme E1 + E2 + E3 + E4 solution was added in an amount of 0.2, 0.04, 0.2, and 0.2 mL per 1 g of dry matter, and then hydrolyzed while incubating at 50 ° C. and 170 rpm for 2 days. The enzymes used were cellulase (Celluclast 1.5 L, manufactured by Novozymes, denoted by E1), β-glucosidase (denoted by Sigma C6105, E2), α-amylase (denoted by Sigma A8220, E3), and amyloglucosidase. Aze (denoted Sigma A7095, E4).

당화가 끝난 시료는 원심분리를(8000 rpm, 40분) 통해 1차 상등액을 취하고, 이어 멸균수를 넣고 부유시킨 다음 동일한 조건으로 원심분리하여 2차 상등액을 취하였다. 1차와 2차 상등액을 모아 혼합한 다음 적당량의 알코올을 가하면서 감압건조기로 물 및 용매를 건조시켰다. 당농축액 내의 글루코오스 함량은 시료를 증류수에 희석하여 생화학 분석기(YSI 2710)로 분석, 정량하였다. The glycosylated sample was taken from the primary supernatant by centrifugation (8000 rpm, 40 minutes), and then sterile water was added and suspended, followed by centrifugation under the same conditions to take the secondary supernatant. The primary and secondary supernatants were collected and mixed, and then water and solvents were dried with a reduced pressure dryer while adding an appropriate amount of alcohol. The glucose content in the sugar concentrate was analyzed and quantified by diluting the sample with distilled water using a biochemical analyzer (YSI 2710).

그 결과, 총 120 g의 건조 그물말에서 약 240 g의 당농축액을 수득할 수 있었고, 대략의 글루코오스 함량은 12.65% 정도였다.
As a result, about 240 g of sugar concentrate could be obtained from a total of 120 g of dry net, and the approximate glucose content was about 12.65%.

실시예Example 7:  7: 그물말Net 과 조류로부터 글루코오스  Glucose from Algae 고함유High content 당용액Sugar solution HRHS11HRHS11 조제 pharmacy

온실에서 배양된 그물말 과 조류 건조분말시료(HR-d16)를 가지고 보다 낮은 효소량과 중간정도의 완충용액강도(buffer strength) 하에서 당화액을 제조하기 위해서 건조시료(18 g)를 2000 mL 삼각 플라스크에 넣고 50 mM 시트레이트 완충용액(pH 4.8) 300 mL를 가한 다음, 120℃에서 20분 고압살균 하였다. 무균상에서 여과멸균된 당화효소 E1＋E2 용액을(아래 참조) 각각 건조물 1 g 당 0.2, 0.04 mL 양으로 가한 후 50℃, 170 rpm에 2일 동안 배양하면서 가수분해 시켰다. 이때 사용된 효소는 셀룰라아제(Celluclast 1.5 L, Novozymes사 제품, E1으로 표시), β-글루코시다아제(Sigma C6105, E2로 표시) 이었다.2000 mL Erlenmeyer flask with dry sample (18 g) to prepare saccharified solution under lower enzyme content and medium buffer strength with net-grown and algae dry powder samples (HR-d16). 300 mL of 50 mM citrate buffer (pH 4.8) was added thereto, followed by autoclaving at 120 ° C. for 20 minutes. Aseptically filtered sterilized glycosylase E1 + E2 solution (see below) was added in an amount of 0.2 and 0.04 mL per gram of dry matter, respectively, and then hydrolyzed at 50 ° C. and 170 rpm for 2 days. At this time, the enzymes used were cellulase (Celluclast 1.5 L, manufactured by Novozymes, denoted by E1) and β-glucosidase (denoted by Sigma C6105, E2).

당화가 끝난 시료는 원심분리를(8000 rpm, 40분) 통해 1차 상등액을 취하고, 이어 멸균수를 넣고 부유시킨 다음 동일한 조건으로 원심분리하여 2차 상등액을 취하였다. 1차와 2차 상등액을 모아 혼합한 다음 적당량의 알코올을 가하면서 감압건조기로 물 및 용매를 건조시켰다. 당농축액 내의 글루코오스 함량은 시료를 증류수에 희석하여 생화학 분석기(YSI 2710)로 분석, 정량하였다. The glycosylated sample was taken from the primary supernatant by centrifugation (8000 rpm, 40 minutes), and then sterile water was added and suspended, followed by centrifugation under the same conditions to take the secondary supernatant. The primary and secondary supernatants were collected and mixed, and then water and solvents were dried with a reduced pressure dryer while adding an appropriate amount of alcohol. The glucose content in the sugar concentrate was analyzed and quantified by diluting the sample with distilled water using a biochemical analyzer (YSI 2710).

그 결과, 총 108 g의 건조 그물말에서 약 260 g의 당농축액을 수득할 수 있었고, 대략의 글루코오스 함량은 13.9% 정도였다. 보다 적은 량의 고형분 함량과 효소를 사용하였음에도 불구하고 당농축액 수율과 농도가 향상되었다.
As a result, about 260 g of sugar concentrate could be obtained from a total of 108 g of dry net, and the approximate glucose content was about 13.9%. The yield and concentration of sugar concentrates were improved despite the use of lower solids content and enzymes.

실시예Example 8:  8: RalstoniaRalstonia eutrophaeutropha 균주를 이용한 조류  Algae Using Strains 당화액으로부터의From saccharified solution P(3 P (3 HBHB ) 생합성) Biosynthesis

P(3HB)의 생산을 위하여 Ralstonia eutropha 균주를 2단계 배양하였다. R. eutropha 균주를 LB (lysogeny broth medium: 1 리터당 10 g 트립톤, 5 g 효모추출물 및 5 g NaCl 포함) 아가 플레이트 상의 1개의 콜로니로부터 수득하여 3 mL의 LB배지에 접종한 후 이를 30℃에서 250 rpm의 속도로 교반해 주면서 12시간 동안 배양하였다. 이 배양액 중 1 mL를 100 mL의 LB배지에 접종한 후 LB 배지에서 24시간 배양 후 R. eutropha 균주를 원심분리를 통해 모두 회수하였다. 회수된 R. eutropha 균주를 질소(Nitrogen)가 결실된 N-MR 배지에서 조류 당화액을 탄소원으로 사용하여 30℃에서 250 rpm으로 72시간동안 진탕배양하였다. 조류 당화액은 글루코스가 20 g/L가 되도록 첨가하였다. N-MR 배지의 경우 10 N NaOH를 이용하여 초기 pH를 7로 조절해 주었다. 배양 종료 후, 원심분리하여 배양액으로부터 균체를 회수하였다. 회수된 균체를 증류수로 3번 세척한 후 100℃의 건조기에서 24시간 건조하였고, 건조된 균체 중 일부를 채취하여 가스 크로마토그래피(GC)분석을 수행함으로써 세포 내 합성된 P(3HB) 함량을 측정하였다. Ralstonia for the production of P (3HB) eutropha strains were cultured in two stages. R. eutropha strains were obtained from one colony on LB (containing 10 g tryptone, 5 g yeast extract and 5 g NaCl) agar plates, inoculated in 3 mL of LB medium and then at 30 ° C. Incubated for 12 hours while stirring at a speed of 250 rpm. 1 mL of this culture was inoculated into 100 mL of LB medium, and then cultured in LB medium for 24 hours, and then all R. eutropha strains were recovered by centrifugation. The recovered R. eutropha strain was incubated for 72 hours at 30 ° C. and 250 rpm using algae saccharin as a carbon source in N-MR medium without nitrogen. Algal saccharified solution was added so that the glucose was 20 g / L. In the case of N-MR medium, the initial pH was adjusted to 7 using 10 N NaOH. After completion of the culture, cells were recovered from the culture by centrifugation. The recovered cells were washed three times with distilled water and then dried in a drier at 100 ° C. for 24 hours. Some of the dried cells were collected and subjected to gas chromatography (GC) analysis to measure the synthesized P (3HB) content in cells. It was.

N-MR 배지 (pH 7.0) 의 1리터당 조성은 다음과 같다. 6.67 g KH2PO4, 4.3 g Na2HPO4, 0.8 g MgSO4·7H2O, 0.8 g 시트르산, 5 mL 미량금속용액(Trace metal solution). 미량금속용액 (0.5 M HCl) 의 1리터당 조성은 다음과 같다. 10 g FeSO4·7H2O, 2 g CaCl2, 2.2 g ZnSO4·7H2O, 0.5 g MnSO4·4H2O, 1 g CuSO4·5H2O, 0.1 g (NH4)6Mo7O24·4H2O, 0.02 g Na2B4O7·10H2O. The composition per liter of N-MR medium (pH 7.0) is as follows. 6.67 g KH 2 PO 4 , 4.3 g Na 2 HPO 4 , 0.8 g MgSO 4 .7H 2 O, 0.8 g citric acid, 5 mL Trace metal solution. The composition per liter of trace metal solution (0.5 M HCl) is as follows. 10 g FeSO 4 7H 2 O, 2 g CaCl 2 , 2.2 g ZnSO 4 7H 2 O, 0.5 g MnSO 4 4H 2 O, 1 g CuSO 4 5H 2 O, 0.1 g (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 4H 2 O, 0.02 g Na 2 B 4 O 7 10H 2 O.

조류 당화액과 MgSO4·7H2O은 별도로 멸균하여 배지에 첨가하였다.Algal saccharification solution and MgSO 4 · 7H 2 O were added to the medium by sterilization separately.

R. eutropha 균주로부터 조류 당화액 HRHS9를 탄소원으로 사용하여 P(3HB)를 생산할 경우, 미생물 총 건체중량은 4.4 g/L, P(3HB)의 농도는 2.57 g/L이었으며 P(3HB) 함량은 57.9 중량% 이었다. 조류 당화액 HRHS11를 사용할 경우 미생물 건체중량 3.9 g/L, P(3HB) 농도 2.54 g/L, P(3HB) 함량 65.6 중량%였다(표 3).
 When P (3HB) was produced using algae saccharity HRHS9 as a carbon source from R. eutropha strain, the total dry weight of microorganism was 4.4 g / L, P (3HB) concentration was 2.57 g / L, and P (3HB) content was 57.9 wt%. When the algae saccharity solution HRHS11 was used, the microbial dry weight was 3.9 g / L, P (3HB) concentration 2.54 g / L, and P (3HB) content 65.6 wt% (Table 3).

실시예Example 9: 재조합 대장균 균주를 이용한 조류  9: Algae using recombinant E. coli strains 당화액으로부터의From saccharified solution P(3 P (3 HBHB ) 생합성) Biosynthesis

본 실시예에서는 R. eutropha phaCAB 유전자를 발현하는 재조합 대장균 XL1-Blue(pCnCAB)를 이용하여 조류 당화액으로부터 P(3HB)를 제조하였다. pCnCAB는 R. eutropha PHA　생합성 유전자를 포함하고 있는 플라스미드이다 (Yang et al., Biotechnol . Bioeng ., 105:150-160(2010)). In this example, P (3HB) was prepared from algal saccharification solution using recombinant E. coli XL1-Blue (pCnCAB) expressing the R. eutropha phaCAB gene. pCnCAB is a plasmid containing the R. eutropha PHA biosynthesis gene (Yang et al., Biotechnol . Bioeng ., 105: 150-160 (2010)).

재조합 대장균 XL1-Blue (pCnCAB) 균주를 암피실린이 50 mg/L로 첨가된 LB (lysogeny broth medium: 1 리터당 10 g 트립톤, 5 g 효모추출물 및 5 g NaCl 포함) 아가 플레이트 상의 1개의 콜로니로부터 수득하여 3 mL의 LB배지에 접종한 후 이를 30℃에서 250 rpm의 속도로 교반해 주면서 12시간 동안 배양하였다. 이 배양액 중 1 mL를 100 mL 메틸레드(Methyl red, MR) 배지에 접종하여 배지에서 조류 당화액을 탄소원으로 사용하여 30℃에서 250 rpm으로 72시간동안 진탕배양하였다. 조류 당화액은 글루코스가 20 g/L가 되도록 첨가하였다. XL1-Blue 균주의 성장을 위하여 티아민을 10 mg/L로 첨가하였다. 메틸레드 배지의 경우 10 N NaOH를 이용하여 초기 pH를 7로 조절해 주었다. 배양 종료 후, 원심분리하여 배양액으로부터 균체를 회수하였다. 회수된 균체를 증류수로 3번 세척한 후 100℃의 건조기에서 24시간 건조하였고, 건조된 균체 중 일부를 채취하여 가스 크로마토그래피분석을 수행함으로써 세포 내 합성된 P(3HB) 함량을 측정하였다. 메틸레드 배지 (pH 7.0) 의 1리터당 조성은 다음과 같다. 6.67 g KH2PO4, 4 g (NH4)2HPO4, 0.8 g MgSO4·7H2O, 0.8 g 시트르산, 5 mL 미량금속용액(Trace metal solution). 미량금속용액(0.5 M HCl) 의 1리터당 조성은 다음과 같다. 10 g FeSO4·7H2O, 2 g CaCl2, 2.2 g ZnSO4·7H2O, 0.5 g MnSO4·4H2O, 1 g CuSO4·5H2O, 0.1 g (NH4)6Mo7O24·4H2O, 0.02 g Na2B4O7·10H2O. 조류 당화액과 MgSO4·7H2O은 별도로 멸균하여 배지에 첨가하였다. Recombinant Escherichia coli XL1-Blue (pCnCAB) strains were obtained from one colony on an LB (lysogeny broth medium: 10 g tryptone per liter, 5 g yeast extract and 5 g NaCl) agar plate with 50 mg / L of ampicillin Inoculated into 3 mL of LB medium and incubated for 12 hours while stirring at a speed of 250 rpm at 30 ℃. 1 mL of the culture was inoculated in 100 mL methyl red (MR) medium, and the culture was shaken for 30 hours at 30 ° C. and 250 rpm using algae saccharification solution as a carbon source. Algal saccharified solution was added so that the glucose was 20 g / L. Thiamine was added at 10 mg / L for growth of the XL1-Blue strain. In the case of methyl red medium, the initial pH was adjusted to 7 using 10 N NaOH. After completion of the culture, cells were recovered from the culture by centrifugation. The recovered cells were washed three times with distilled water and then dried in a drier at 100 ° C. for 24 hours. Some of the dried cells were collected and subjected to gas chromatography to measure the P (3HB) content synthesized in the cells. The composition per liter of methyl red medium (pH 7.0) is as follows. 6.67 g KH 2 PO 4 , 4 g (NH 4 ) 2 HPO 4 , 0.8 g MgSO 4 · 7H 2 O, 0.8 g citric acid, 5 mL Trace metal solution. The composition per liter of trace metal solution (0.5 M HCl) is as follows. 10 g FeSO 4 7H 2 O, 2 g CaCl 2 , 2.2 g ZnSO 4 7H 2 O, 0.5 g MnSO 4 4H 2 O, 1 g CuSO 4 5H 2 O, 0.1 g (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 · 4H 2 O, 0.02 g Na 2 B 4 O 7 · 10H 2 O. The algae saccharification solution and MgSO 4 · 7H 2 O were separately sterilized and added to the medium.

XL1-Blue(pCnCAB) 균주로부터 조류당화액 HRHS9를 탄소원으로 사용하여 P(3HB)를 생산할 경우, 미생물 건체중량 1.1 g/L, P(3HB) 농도 0.56 g/L, P(3HB) 함량 51.49 중량%였다. 한편 조류 당화액 HRHS11를 사용할 경우 미생물 건체중량 1.58 g/L, P(3HB) 농도 1.31 g/L, P(3HB) 함량 83.2 중량%였다(표 3).When producing P (3HB) using algae saccharity HRHS9 as a carbon source from the XL1-Blue (pCnCAB) strain, the microbial dry weight was 1.1 g / L, P (3HB) concentration 0.56 g / L, P (3HB) content 51.49 weight Was%. On the other hand, when the algae saccharity solution HRHS11 was used, the microbial dry weight was 1.58 g / L, P (3HB) concentration of 1.31 g / L, and P (3HB) content of 83.2 wt% (Table 3).

그물말 유래 당화액으로부터 P(3HB) 생합성 정도Degree of P (3HB) Biosynthesis from Net-derived Saccharified Liquid -- HRHS9HRHS9 HRHS11HRHS11 균주Strain 미생물 건체중량 (DCW,g/L)Microbial Dry Weight (DCW, g / L) P(3HB) 농도 (g/L)P (3HB) concentration (g / L) P(3HB) 함량 (중량%)P (3HB) content (% by weight) 미생물 건체중량
(DCW, g/L)Microbial Dry Weight
(DCW, g / L) P(3HB) 농도 (g/L)P (3HB) concentration (g / L) P(3HB) 함량 (중량%)P (3HB) content (% by weight) R. eutropha NCIMB115991 ) R. eutropha NCIMB11599 1 ) 4.44.4 2.572.57 57.957.9 3.9 3.9 2.542.54 65.665.6 XL1-Blue (pCNCAB)XL1-Blue (pCNCAB) 1.11.1 0.560.56 51.4951.49 1.581.58 1.311.31 83.283.2

1)NCIMB: National Collections of Industrial, Marine and Food Bacteria
 1) NCIMB: National Collections of Industrial, Marine and Food Bacteria

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.Having described the specific part of the present invention in detail, it is apparent to those skilled in the art that the specific technology is merely a preferred embodiment, and the scope of the present invention is not limited thereto. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

Claims (10)

다음 단계를 포함하는 그물말 과(Family Hydrodictyaceae) 조류로부터 폴리하이드록시알카노에이트(Polyhydroxyalkanoate)의 제조방법:
(a) 그물말 과(Family Hydrodictyaceae) 조류를 당화시켜 단당류를 포함하는 당화액을 수득하는 단계; 및
(b) 상기 당화액을 탄소원으로 이용하여 미생물을 배양하여 폴리하이드록시알카노에이트를 제조하는 단계.
 Family with the following steps ( Family Hydrodictyaceae ) Preparation of Polyhydroxyalkanoate from Algae:
(a) Net horse family Hydrodictyaceae ) saccharifying algae to obtain a saccharified solution comprising a monosaccharide; And
(b) preparing a polyhydroxyalkanoate by culturing the microorganism using the saccharified solution as a carbon source.
제 1 항에 있어서, 상기 그물말 과 조류는 히드로딕티온 속(Hydrodictyon sp .), 훈장말 속(Pediastrum sp.) 및 소라스트럼 속(Sorastrum sp.)으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 조류인 것을 특징으로 하는 제조방법.
The method of claim 1, wherein the mesh and algae are Hydrodictyon sp . ), Genus ( Pediastrum sp .) and Sorastrum sp .) The production method, characterized in that one or two or more birds selected from the group consisting of.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)는 (i) 가수분해 촉매, (ii) 다당류 분해효소 또는 (iii) 가수분해 촉매 및 다당류 분해효소를 이용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
The method of claim 1, wherein step (a) is performed using (i) a hydrolysis catalyst, (ii) a polysaccharide degrading enzyme or (iii) a hydrolysis catalyst and a polysaccharide degrading enzyme.
제 4 항에 있어서, 상기 가수분해 촉매는 (i) 황산, 염산, 브롬산, 질산, 아세트산, 포름산, 과염소산, 인산, 파라-톨루엔설폰산(p-toluenesulfonic acid, PTSA) 및 고체산으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 산 촉매 또는 (ii) 수산화칼륨, 수산화나트륨, 수산화칼슘 및 암모니아 수용액으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 알칼리 촉매인 것을 특징으로 하는 제조방법.
The method of claim 4, wherein the hydrolysis catalyst is selected from: (i) sulfuric acid, hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitric acid, acetic acid, formic acid, perchloric acid, phosphoric acid, para-toluenesulfonic acid and the group consisting of (p -toluenesulfonic acid, PTSA) and the solid acid At least one acid catalyst selected from the group consisting of one or two or more acid catalysts or (ii) an aqueous potassium catalyst, sodium hydroxide, calcium hydroxide and an aqueous ammonia solution.
제 4 항에 있어서, 상기 다당류 분해효소는 셀룰라아제, β-글루코시다아제, β-아가라제, β-갈락토시다제, 엔도-1,4-β-글루카나제, α-아밀라아제, β-아밀라아제, 아밀로글루코시다아제, 라미나린나아제, α-D-글루코시다아제, β-D-글루코시다아제, 수크라아제, 말타아제, 이소말타아제 및 락타아제로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합 분해효소인 것을 특징으로 하는 제조방법.
The method according to claim 4, wherein the polysaccharide degrading enzyme is a cellulase, β-glucosidase, β-agarase, β-galactosidase, endo-1,4-β-glucanase, α-amylase, β- One or two selected from the group consisting of amylase, amyloglucosidase, laminarinase, α-D-glucosidase, β-D-glucosidase, sucrase, maltase, isomaltase and lactase The above method is characterized in that the mixed enzyme.
제 4 항에 있어서, 상기 단계 (a)는 가수분해촉매를 이용하여 20-200℃의 온도에서 1-6시간 동안 1차 가수분해 후, 20-200℃의 온도에서 1-6시간 동안 2차 가수분해 하여 실시하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
The method of claim 4, wherein step (a) is carried out using a hydrolysis catalyst for 1-6 hours at a temperature of 20-200 ° C., followed by secondary for 1-6 hours at a temperature of 20-200 ° C. A method for producing a water, characterized in that the hydrolysis is carried out.
제 4 항에 있어서, 상기 단계 (a)는 다당류 분해효소를 이용하여 증류수 또는 0.01 mM-1.0 M 범위의 완충액에서 20-60℃, 0.5-5일 반응시켜 실시하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
The method of claim 4, wherein step (a) is carried out using a polysaccharide degrading enzyme in a distilled water or a buffer in the range of 0.01 mM-1.0 M at 20-60 ° C. for 0.5-5 days.
제 1 항에 있어서, 상기 당화액은 하이드록시메틸풀푸랄(Hydroxymethylfurfural, HMF), 풀푸랄(furfural) 또는 이들의 혼합물이 0.07 중량% 이하인 것을 특징으로 하는 제조방법.
The method of claim 1, wherein the saccharified solution is hydroxymethylfurfural (Hydroxymethylfurfural, HMF), furfural (furfural) or a mixture thereof is a manufacturing method, characterized in that less than 0.07% by weight.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)의 미생물은 (i) Ralstonia eutropha 또는 (ii) Ralstonia eutropha phaCAB 유전자를 발현하는 재조합 대장균인 것을 특징으로 하는 제조방법.
The method of claim 1, wherein the microorganism of step (b) is (i) Ralstonia eutropha or (ii) a method for producing recombinant E. coli expressing the Ralstonia eutropha phaCAB gene.
상기 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 폴리하이드록시알카노에이트.Polyhydroxyalkanoate produced by the method of any one of the preceding claims.
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KR20220152502A (en) 2021-05-09 2022-11-16 한국에너지공과대학교 Method of medium-chain length polyhydroxylalkanoate from waste biomass
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