KR20130022266A - Polydiacetylene liposome biosensor and producing method thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 히스티딘 표지(histidine tag) 또는 이미다졸(imidazole)을 포함하는 생체물질을 특이적으로 검출할 수 있는 바이오센서, 이의 제조방법, 이를 활용한 생체물질의 검출방법 및 약물의 전달방법에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명의 바이오센서는 폴리다이아세틸렌(polydiacetylene, PDA)을 필수적으로 포함하는 리포좀을 포함한다. The present invention relates to a biosensor capable of specifically detecting a biomaterial including a histidine tag or an imidazole, a method for preparing the same, a method for detecting a biomaterial using the same, and a drug delivery method. will be. Specifically, the biosensor of the present invention includes liposomes that essentially include polydiacetylene (PDA).
나노기술(Nanotechnology), 치료(therapy), 이미징(imaging)을 접목한 융합 바이오 기술은 암 환자의 경우 치료 효과를 높이고 암의 조기 발견을 위해서 나노기술을 이용한 나노물질(nanomaterial)과 치료제를 결합하여 환자에게 투여하고 이것을 이미징(imaging)을 통해 확인해 봄으로써 선택적인 암 치료와 동시에 진단을 할 수 있기 때문에 실험실, 전 임상 및 임상영역에서 활발하게 연구되고 있는 추세이다(Caraglia, M.; Marra, M.; Budillon, A., Highlights of the Annual Meeting of the Italian Association for Cell Cultures (AICC): new drug delivery strategies and technological platforms for diagnosis and therapy of tumors. Part II. 6 - 7 December 2007, Naples, Italy. Expert Opin Biol Ther 2008, 8 (7), 1031-5).Convergence biotechnology that combines nanotechnology, therapy, and imaging combines nanomaterials and therapeutics using nanotechnology to enhance the effectiveness of treatment for cancer patients and early detection of cancer. It is being actively studied in the laboratory, preclinical and clinical areas because it can be diagnosed simultaneously with selective cancer treatment by administering it to patients and confirming it through imaging (Caraglia, M .; Marra, M). Budillon, A., Highlights of the Annual Meeting of the Italian Association for Cell Cultures (AICC): new drug delivery strategies and technological platforms for diagnosis and therapy of tumors.Part II. 6-7 December 2007, Naples, Italy. Expert Opin Biol Ther 2008, 8 (7), 1031-5).
특히 바이오센서 시스템의 경우 세포 수준(cellular level) 이나 생체 내 수준(in vivo level)에서 형광을 띠는 나노물질의 특성을 이용하여 신호를 검출함으로써 데이터를 분석하는데 보다 쉽고 유용한 정보를 제공해 줄 수 있다. 화학 및 바이오센서는 측정 대상물로부터 정보를 감지, 측정하여 그 측정량을 인식 가능한 유용한 신호로 변화하는 물질 또는 장치이다. 센서는 표적(target)으로부터 정보를 획득할 때 색, 형광, 전기적 신호 등과 같이 인식 가능한 신호로 변환시켜 인간의 판단을 돕는다. 센서가 표적물질을 인식하면 사람이 인식할 수 있도록 신호 변환기를 통해서 신호를 보내게 된다. 특히, 바이오센서에 이용되는 센서는 검출하고자 하는 표적 물질에 대한 높은 선택성과 감도가 요구된다. 효소와 항체의 경우 뛰어난 기질 특이성과 높은 결합력을 가지고 있으나 센서 장치에 고정화되었을 때 안정성이 떨어지고 가격이 비싼 단점을 지닌다. In particular, in the case of biosensor systems, the detection of signals using characteristics of fluorescent nanomaterials at the cellular level or in vivo level can provide easier and more useful information for data analysis. . Chemical and biosensors are materials or devices that detect and measure information from an object to be measured and change the measurable amount into a usable signal. When the sensor acquires information from the target, the sensor converts the signals into recognizable signals such as color, fluorescence, and electrical signals to assist human judgment. When the sensor recognizes the target material, it sends a signal through a signal converter for human recognition. In particular, sensors used in biosensors require high selectivity and sensitivity to target materials to be detected. Enzymes and antibodies have excellent substrate specificity and high binding capacity, but have the disadvantage of low stability and high price when immobilized in a sensor device.
센서 소재로 연구되고 있는 폴리다이아세틸렌(polydiacetylene, PDA)은 자기 조립된 다이아세틸렌(diacetylene) 단량체의 광중합에 의해 만들어진다. 다이아세틸렌 단량체들이 조직적으로 배열되고, 분자 간의 거리가 충분히 가까울 경우 254nm 의 자외선 노광에 의해 1,4-첨가 중합이 일어나 고분자 주쇄에 이중 결합과 삼중 결합이 교대로 존재하는 PDA가 만들어진다(Okada, S.; Peng, S.; Spevak, W.; Charych, D., Color and chromism of polydiacetylene vesicles. Accounts Chem Res 1998, 31 (5), 229-239).Polydiacetylene (PDA), which is being studied as a sensor material, is made by photopolymerization of self-assembled diacetylene monomers. When the diacetylene monomers are systematically arranged and the distance between molecules is close enough, 1,4-addition polymerization occurs by ultraviolet exposure at 254 nm, resulting in a PDA having double and triple bonds alternately present in the polymer backbone (Okada, S Peng, S. Spevak, W. Charych, D., Color and chromism of polydiacetylene vesicles.Accounts Chem Res 1998, 31 (5), 229-239).
이때 중합과정에서 화학적 개시제나 촉매가 요구되지 않기 때문에 합성이 매우 간단한 특징을 지닌다. 폴리다이아세틸렌이 센서 소재로써 가지는 특징은 다음과 같다((a) Lee, J.; Kim, H. J.; Kim, J., Polydiacetylene liposome arrays for selective potassium detection. J Am Chem Soc 2008, 130 (15), 5010-1; (b) Kim, J. M.; Lee, Y. B.; Yang, D. H.; Lee, J. S.; Lee, G. S.; Ahn, D. J., A polydiacetylene-based fluorescent sensor chip. J Am Chem Soc 2005, 127 (50), 17580-1). (1) 폴리다이아세틸렌은 수용액 상에서 합성이 쉬운 장점을 지닌다. DNA, 단백질, 탄수화물, 및 이온 등과 같은 생물학적으로 중요한 표적물질은 대부분 친수성을 띠기 때문에 센서물질 또한 수용성이거나 친수성인 것이 유리하다. (2) 고분자의 중합이 빛을 조사함으로써 이루어지기 때문에 부가적인 촉매 또는 개시제의 사용이 요구되지 않는다. (3) 폴리다이아세틸렌이 분산된 수용액은 일반적으로 약 640nm에서 최대흡수파장을 지니는 청색을 띠게 되며 자극에 의해 약 550nm의 최대흡수파장을 띠는 적색으로 색 전이가 일어나게 된다. 폴리다이아세틸렌이 센서 소재로 많이 연구되고 있는 주된 이유 중의 하나는 환경의 변화를 인식하여 온도, pH, 화학물질 그리고 단백질, DNA와 같은 생체 물질 등의 접근이나 결합이 이루어지면 적색으로 색 전이가 일어나게 되기 때문이다(도 1)((a) Reppy, M. A.; Pindzola, B. A., Biosensing with polydiacetylene materials: structures, optical properties and applications. Chem Commun 2007, (42), 4317-4338; (b) Mino, N.; Tamura, H.; Ogawa, K., Photoreactivity of 10,12-Pentacosadiynoic Acid Monolayers and Color Transitions of the Polymerized Monolayers on an Aqueous Subphase. Langmuir 1992, 8 (2), 594-598; (c) Kaneko, F.; Shibata, M.; Kobayashi, S., Absorption Properties and Structure Changes Caused by Pre-Annealing in Polydiacetylene Langmuir-Blodgett-Films. Thin Solid Films 1992, 210 (1-2), 548-550). 또한 육안으로도 쉽게 구별이 되는 선명한 청색-적색의 색 변화 뿐만 아니라 청색에서는 형광이 나타나지 않고 적색에서는 형광이 나타난다는 특징이 있다(도 2)(Su, Y. L.; Li, J. R.; Jiang, L., Chromatic immunoassay based on polydiacetylene vesicles. Colloid Surface B 2004, 38 (1-2), 29-33). At this time, the synthesis is very simple because no chemical initiator or catalyst is required in the polymerization process. The characteristics of polydiacetylene as a sensor material are as follows ((a) Lee, J .; Kim, HJ; Kim, J., Polydiacetylene liposome arrays for selective potassium detection. J Am Chem Soc 2008, 130 (15), 5010-1; (b) Kim, JM; Lee, YB; Yang, DH; Lee, JS; Lee, GS; Ahn, DJ, A polydiacetylene-based fluorescent sensor chip.J Am Chem Soc 2005, 127 (50), 17580-1). (1) Polydiacetylene has the advantage of easy synthesis in aqueous solution. Since biologically important target materials such as DNA, proteins, carbohydrates, and ions are mostly hydrophilic, the sensor material is advantageously water-soluble or hydrophilic. (2) Since the polymerization of the polymer is accomplished by irradiation of light, the use of an additional catalyst or initiator is not required. (3) A polydiacetylene-dispersed aqueous solution generally has a blue color with a maximum absorption wavelength at about 640 nm and a color transition to red with a maximum absorption wavelength of about 550 nm by stimulation. One of the main reasons why polydiacetylene is being studied as a sensor material is to recognize the change of environment and to cause the color transition to red when the access or combination of temperature, pH, chemicals and biological materials such as protein and DNA is made. ((A) Reppy, MA; Pindzola, BA, Biosensing with polydiacetylene materials: structures, optical properties and applications.Chem Commun 2007, (42), 4317-4338; (b) Mino, N. ; Tamura, H .; Ogawa, K., Photoreactivity of 10,12-Pentacosadiynoic Acid Monolayers and Color Transitions of the Polymerized Monolayers on an Aqueous Subphase.Langmuir 1992, 8 (2), 594-598; (c) Kaneko, F ;; Shibata, M .; Kobayashi, S., Absorption Properties and Structure Changes Caused by Pre-Annealing in Polydiacetylene Langmuir-Blodgett-Films.Thin Solid Films 1992, 210 (1-2), 548-550). In addition, there is a characteristic of not only a vivid blue-red color change easily distinguished by the naked eye but also fluorescence in blue and fluorescence in red (Fig. 2) (Su, YL; Li, JR; Jiang, L., Chromatic immunoassay based on polydiacetylene vesicles.Colloid Surface B 2004, 38 (1-2), 29-33).
GFP(Green Fluorescent Protein)는 Shimomura 등에 의해 처음 jellyfish Aequorea victoria 에서 발견되었으며 28kDa 의 분자량을 가지는 단량체로 살아있는 세포나 조직에서 유전자 발현, 단백질의 기능, 위치, 이동경로뿐만 아니라 세포 분화 등을 연구하는데 아주 좋은 모델 단백질이다(Chalfie, M.; Tu, Y.; Euskirchen, G.; Ward, W. W.; Prasher, D. C., Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science 1994, 263 (5148), 802-5). 특히 관찰하는데 따로 염색할 필요 없이 바로 관찰이 가능하며 무엇보다 살아있는 세포에서 관찰이 가능하다는 큰 장점을 가지고 있다. GFP 는 238개의 아미노산으로 구성되어 있으며 형광을 중재하는 보결 분자단의 도움 없이도 형광을 낼 수 있다. 그 대신 단백질 자체에 존재하는 아미노산 잔기 3개 세린(serine), 티로신(tyrosine), 글라이신(glycine)이 반응하여 발색단(Chromophore)이라는 색소 복합체를 형성하고 있다((a) Heim, R.; Prasher, D. C.; Tsien, R. Y., Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci USA 1994, 91 (26), 12501-4; (b) Reid, B. G.; Flynn, G. C., Chromophore formation in green fluorescent protein. Biochemistry 1997, 36 (22), 6786-91). GFP의 구조를 보면 cylinder 와 같은 구조로 11 개의 ß-strand 가 규칙적인 패턴으로 수소결합을 이루고 있으며 α-helix 는 cylinder 구조의 위, 아래를 감싸고 있어 발색단(chromophore)을 보호하는 견고한 3차원 구조로 이루어져 있다((a) Bokman, S. H.; Ward, W. W., Renaturation of Aequorea greefluorescent protein. Biochem Biophys Res Commun 1981, 101 (4), 1372-80; (b) Ward, W. W.; Bokman, S. H., Reversible denaturation of Aequorea greenfluorescent protein: physical separation and characterization of the renatured protein. Biochemistry 1982, 21 (19), 4535-40). GFP의 특징을 정리하면 다음과 같다(표 1).Green Fluorescent Protein (GFP) was first discovered in jellyfish Aequorea victoria by Shimomura et al. It is a monomer having a molecular weight of 28 kDa, which is very useful for studying gene expression, protein function, location and migration as well as cell differentiation in living cells or tissues. Model protein (Chalfie, M .; Tu, Y .; Euskirchen, G .; Ward, WW; Prasher, DC, Green fluorescent protein as a marker for gene expression.Science 1994, 263 (5148), 802-5). In particular, it can be observed immediately without the need for staining, and above all, it has the great advantage that it can be observed in living cells. GFP consists of 238 amino acids and can fluoresce without the help of a complementary molecule that mediates fluorescence. Instead, serine, tyrosine, and glycine, three amino acid residues present in the protein itself, react to form a pigment complex called chromophore ((a) Heim, R .; Prasher, DC; Tsien, RY, Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein.Proc Natl Acad Sci USA 1994, 91 (26), 12501-4; (b) Reid, BG; Flynn, GC, Chromophore formation in green fluorescent protein. Biochemistry 1997, 36 (22), 6786-91). In the structure of GFP, cylinder-like structure, 11 ß-strands form hydrogen bonds in a regular pattern, and α-helix is a solid three-dimensional structure that protects the chromophore by covering the top and bottom of the cylinder structure. ((A) Bokman, SH; Ward, WW, Renaturation of Aequorea greefluorescent protein.Biochem Biophys Res Commun 1981, 101 (4), 1372-80; (b) Ward, WW; Bokman, SH, Reversible denaturation of Aequorea greenfluorescent protein: physical separation and characterization of the renatured protein.Biochemistry 1982, 21 (19), 4535-40). The characteristics of GFP are summarized as follows (Table 1).
기존의 DNA-칩은 대부분 프로브(probe) DNA를 고정화시킨 후 반응시키고자 하는 표적(target) DNA 끝에 고가의 형광염료를 부착하는 방식을 채택하고 있다. 이러한 방식은 DNA 합성시 형광염료를 부착시키는 별도의 번거로운 과정을 필요로 한다. 이러한 단점을 극복하기 위해, 본 발명자들은 외부 자극에 의한 색 전이와 형광 생성이 가능한 폴리다이아세틸렌(PDA)을 기본으로 Ni-NTA DOGS (nickel-1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodi acetic acid]succinyl} (nickel salt)) 지질(lipid)을 도입함으로써 무 표지(label-free)방식의 폴리다이아세틸렌 리포좀을 제조하고자 하였다(도 4 참조).Most existing DNA-chips employ a method of immobilizing expensive DNA dyes by immobilizing probe DNA and then attaching an expensive fluorescent dye to a target DNA to be reacted. This approach requires a separate cumbersome process to attach fluorescent dyes to the DNA synthesis. In order to overcome this drawback, the present inventors have used Ni-NTA DOGS (nickel-1,2-dioleoyl-sn-glycero-3- {) based on polydiacetylene (PDA) capable of color shift and fluorescence generation by external stimulation. By introducing a [N- (5-amino-1-carboxypentyl) iminodi acetic acid] succinyl} (nickel salt) lipid (lipid), a polydiacetylene liposome of a label-free method was prepared (FIG. 4). Reference).
또한 MPEG (methoxy polyethyleneglycol) 결합(conjugated) PCDA (10,12-pentacosadiynoic acid)는 면역 반응을 일으키지 않고 리포좀에 도입함으로써 반감기를 늘릴 수 있기 때문에 이러한 선행연구를 토대로 리포좀의 수용액에서의 용해도를 향상시키기 위해 MPEG-PCDA를 도입하였다((a) Harris, J. M.; Chess, R. B., Effect of pegylation on pharmaceuticals. Nat Rev Drug Discov 2003, 2 (3), 214-221; (b) Slaughter, J. N.; Schmidt, K. M.; Byram, J. L.; Mecozzi, S., Synthesis and self-assembly properties of a novel [poly(ethylene glycol)]-fluorocarbon-phospholipid triblock copolymer. Tetrahedron Lett 2007, 48 (22), 3879-3882).In addition, the methoxy polyethyleneglycol (PCJ) conjugated PCDA (10,12-pentacosadiynoic acid) can increase the half-life by introducing into liposomes without causing an immune response. MPEG-PCDA was introduced ((a) Harris, JM; Chess, RB, Effect of pegylation on pharmaceuticals. Nat Rev Drug Discov 2003, 2 (3), 214-221; (b) Slaughter, JN; Schmidt, KM; Byram, JL; Mecozzi, S., Synthesis and self-assembly properties of a novel [poly (ethylene glycol)]-fluorocarbon-phospholipid triblock copolymer.Tetrahedron Lett 2007, 48 (22), 3879-3882).
본 발명의 목적은 히스티딘 표지(histidine tag) 또는 이미다졸(imidazole)을 포함하는 생체물질을 특이적으로 검출할 수 있는 PDA (polydiacetylene) 리포좀(liposome)을 제공하는 것이다.Disclosure of Invention An object of the present invention is to provide a PDA (polydiacetylene) liposome capable of specifically detecting a biomaterial including a histidine tag or an imidazole.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 리포좀을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for preparing the liposome.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 리포좀을 포함하는 생체물질 검출용 바이오센서를 제공하는 것이다.In addition, another object of the present invention is to provide a biosensor for detecting a biological material including the liposome.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 PDA 리포좀을 이용하여 생체물질을 검출하는 방법을 제공하는 것이다. In addition, another object of the present invention to provide a method for detecting a biological material using the PDA liposome.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 PDA 리포좀을 이용하여 약물의 전달을 확인하는 방법을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a method for confirming delivery of a drug using the PDA liposome.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 폴리다이아세틸렌(polydiacetylene, PDA) 또는 그 유도체를 기본골격(backbone)으로 하고, Ni-NTA-DOGS(nickel-1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodi acetic acid]succinyl} (nickel salt)) 지질(lipid), 및 메톡시폴리에틸렌글라이콜(methoxy polyethyleneglycol, MPEG)이 접합된(conjugated) 폴리다이아세틸렌 또는 그 유도체를 포함하는 생체물질 검출용 리포좀(liposome)을 제공한다.In order to achieve the object of the present invention as described above, the present invention uses a polydiacetylene (PDA) or a derivative thereof as a backbone, and Ni-NTA-DOGS (nickel-1,2-dioleoyl-sn). conjugated with -glycero-3-{[N- (5-amino-1-carboxypentyl) iminodi acetic acid] succinyl} (nickel salt)) lipid, and methoxy polyethyleneglycol (MPEG) Provided is a liposome for detecting a biological material including a conjugated polydiacetylene or a derivative thereof.
본 발명의 일실시예에 있어서, 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 PDA 유도체는 PCDA (10,12-pentacosadiynoic acid)가 될 수 있고, 상기 MPEG가 접합된 폴리다이아세틸렌 유도체는 MPEG가 접합된 PCDA(MPEG-PCDA)가 될 수 있다. In one embodiment of the invention, the present invention is not limited thereto, but the PDA derivative may be PCDA (10,12-pentacosadiynoic acid), and the MPEG-conjugated polydiacetylene derivative is MPEG-conjugated PCDA (MPEG). -PCDA).
본 발명의 일실시예에 있어서, 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 리포좀의 구조는 도 21과 같이 PDA 또는 그 유도체의 소수성 부분이 막의 내부에 서로 맞닿아 있고 친수성 부분이 외막 및 내막에 위치하는 구형의 PDA 또는 그 유도체의 이중막(bilayer)을 기본골격으로 하고, 그 외막 사이에 Ni-NTA-DOGS 지질 및 MPEG가 접합된 PDA 또는 그 유도체가 삽입된 구조일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the structure of the liposome is not limited thereto, but the structure of the liposome is spherical in that the hydrophobic portions of the PDA or its derivatives are in contact with each other and the hydrophilic portions are located in the outer membrane and the inner membrane, as shown in FIG. 21. A bilayer of a PDA or a derivative thereof may be a basic skeleton, and a PDA or a derivative of which a Ni-NTA-DOGS lipid and MPEG are conjugated may be inserted between the outer membrane.
본 발명의 일실시예에 있어서, 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 삽입된 Ni-NTA-DOGS 지질 및 MPEG가 접합된 PCDA(MPEG-PCDA)의 몰 비는 각각 10몰(mol)%와 1몰(mol)%일 수 있으며, 바람직하게는 모두 1몰(mol)%일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the molar ratio of the inserted Ni-NTA-DOGS lipid and MPEG-conjugated PCDA (MPEG-PCDA) is not limited thereto, but 10 mol (mol) and 1 mol ( mol)%, preferably all 1 mol (mol)%.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 생체물질은 히스티딘 표지(histidine tag) 또는 이미다졸(imidazole)을 포함하는 단백질일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the biomaterial may be a protein including a histidine tag or an imidazole.
또한, 본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위하여 폴리다이아세틸렌(PDA) 또는 그 유도체를 기본골격으로 하고, Ni-NTA-DOGS 지질, 및 MPEG가 접합된 폴리다이아세틸렌(MPEG-PDA) 또는 그 유도체를 포함하는 생체물질 검출용 리포좀을 제조하는 방법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention also uses polydiacetylene (PDA) or a derivative thereof as a basic skeleton, and Ni-NTA-DOGS lipids and MPEG-conjugated polydiacetylene (MPEG-PDA) or a derivative thereof. It provides a method for producing a liposome for detecting a biological material comprising a.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 방법은, PDA 또는 그 유도체, Ni-NTA DOGS 지질, 및 MPEG-PDA 또는 그 유도체를 유기용매에 녹이는 단계; 상기 유기용매를 휘발시키는 단계; 증류수를 더하고 수조(water bath)에서 가열하는 단계; 및 초음파분해(sonication)를 시킨 뒤 여과하는 단계를 포함할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the method comprises the steps of dissolving PDA or derivatives thereof, Ni-NTA DOGS lipids, and MPEG-PDA or derivatives thereof in an organic solvent; Volatilizing the organic solvent; Adding distilled water and heating in a water bath; And filtration after sonication.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 Ni-NTA-DOGS 지질, 및 MPEG가 접합된 폴리다이아세틸렌(MPEG-PDA) 또는 그 유도체는 각각 1몰(mol)% 의 몰 비로 첨가될 수 있다.In one embodiment of the present invention, the Ni-NTA-DOGS lipids and MPEG-conjugated polydiacetylene (MPEG-PDA) or derivatives thereof may be added in a molar ratio of 1 mol (mol)%, respectively.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 생체물질은 히스티딘 표지(histidine tag) 또는 이미다졸(imidazole) 그룹을 포함할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the biomaterial may include a histidine tag or an imidazole group.
또한, 본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위하여 상기의 리포좀을 포함하는, 히스티딘 표지(histidine tag) 또는 이미다졸(imidazole)을 포함하는 생체물질 검출용 바이오센서를 제공한다.In addition, the present invention provides a biosensor for detecting a biomaterial comprising a histidine tag or an imidazole, including the liposome, in order to achieve the above object.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 바이오센서는, 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 폴리다이아세틸렌 마이크로어레이 센서 칩, 마이크로플루이딕(microfluidic) 센서 칩, 폴리다이아세틸렌 센서가 함유된 초 미세 섬유, 또는 폴리다이아세틸렌 스트립 센서의 형태로 제작될 수 있다.In one embodiment of the present invention, the biosensor is, but is not limited to, for example, polydiacetylene microarray sensor chip, microfluidic sensor chip, ultra-fine fibers containing polydiacetylene sensor Or polydiacetylene strip sensor.
또한, 본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위하여 상기의 리포좀을 이용하여 히스티딘 표지(histidine tag) 또는 이미다졸(imidazole)을 포함하는 생체물질을 검출하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for detecting a biomaterial comprising a histidine tag or imidazole using the liposomes to achieve the above object.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 방법은, 대상 생체물질을 추출하는 단계; 상기 생체물질을 상기 리포좀과 반응시키는 단계; 및 상기 리포좀의 색 변화 또는 형광 발현 여부를 확인하는 단계를 포함할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the method comprises the steps of: extracting a biological material of interest; Reacting the biomaterial with the liposomes; And it may include the step of confirming the color change or fluorescence expression of the liposomes.
또한, 본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위하여 상기의 리포좀을 이용하여 히스티딘 또는 이미다졸 그룹이 포함된 약물의 전달을 확인하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for confirming the delivery of a drug containing a histidine or imidazole group using the liposomes to achieve the above object.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 방법은, 상기 약물을 상기 리포좀에 부착시키는 단계; 및 상기 리포좀의 색 변화 또는 형광 발현 여부를 검출함으로써 상기 약물의 표적 위치로의 전달을 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
In one embodiment of the invention, the method comprises the steps of: attaching the drug to the liposomes; And confirming delivery of the drug to a target position by detecting the color change or fluorescence expression of the liposome.
본 발명의 폴리다이아세틸렌(PDA) 리포좀에 도입된 Ni-NTA DOGS 지질이 His-tag GFP나 이미다졸을 검출함으로써 나타내는 색 변화와 형광을 이용하여 센서로써 이용될 수 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 본 발명의 Ni-NTA / MPEG-PCDA / PDA 리포좀은 제조방법이 간단하고, 따로 형광 물질을 부착시키지 않아도 되기 때문에 값이 보다 저렴하고 여러 분야에 응용이 가능하다. 특히 단백질 운반(protein delivery)의 수단으로써 본 발명의 리포좀을 이용할 경우, 리포좀에 결합된 단백질이 생체 내 표적 부위에 안전하게 도입되었는지 여부를 리포좀 자체의 형광을 통해 확인해 볼 수 있으므로 약물 전달(drug delivery) 시스템에도 응용이 가능하다.
Ni-NTA DOGS lipids introduced into the polydiacetylene (PDA) liposome of the present invention was confirmed that can be used as a sensor using the color change and fluorescence indicated by detecting His-tag GFP or imidazole. In addition, the Ni-NTA / MPEG-PCDA / PDA liposome of the present invention is a simple manufacturing method, since it does not need to attach a fluorescent material separately, the value is cheaper and can be applied to various fields. In particular, when using the liposome of the present invention as a means of protein delivery, drug delivery can be confirmed whether the liposome-bound protein is safely introduced to the target site in vivo through fluorescence of the liposome itself. It can also be applied to the system.
도 1은 폴리다이아세틸렌(PDA) 리포좀의 색 변화를 나타낸 것이다.
도 2는 폴리다이아세틸렌(PDA)의 형광 이미지이다.
도 3은 폴리다이아세틸렌 물질을 이용한 바이오센싱의 예로서, 형광, 광학적 성질 및 그 응용을 나타낸 것이다.
도 4는 His6-표지가 부착된 단백질에 결합하기 위해 니트로트라이아세트산(NTA)으로 변형된 폴리다이아세틸렌의 표면을 나타낸 것이다.
도 5는 Ni-NTA/MPEG-PCDA/PCDA His6-표지 단백질의 검출 과정을 나타낸 그림이다.
도 6은 10,12-pentacosadiynoic acid(A), methoxy polyethyleneglycol- amin(B) 및 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[N(5-amino-1-Carboxypentyl) iminodiacetic acid]succinyl} (nickel salt)(C)의 구조식을 나타낸 것이다.
도 7은 His6-GFP 또는 이미다졸과의 상호작용에 따른 본 발명의 PDA 센서의 색 전이를 나타낸다.
도 8은 실온에서 다양한 농도의 GFP 또는 이미다졸과 함께 배양한 후에 관찰한 PDA의 형광 현미경 이미지이다. 빨간색 형광의 강도가 GFP나 이미다졸의 농도증가에 따라 증가함을 확인할 수 있다.
도 9는 본 발명의 리포좀에 GFP나 이미다졸을 첨가함에 따라 나타나는 가시광선 파장의 흡수 변화를 분석하기 위해 수행된 흡수 파장 스캐닝 실험의 결과이다.
도 10은 GFP(μM) 또는 이미다졸(mM) 농도의 함수로 표시한 비색 변화(Colorimetric response)를 나타낸다.
도 11은 본 발명에 따른 Ni-NTA/MPEG-PCDA/PCDA 센서로부터의 신호가 His6-GFP에 의해 특이적으로 발생하는 것인가를 알아보기 위해, BSA를 음성 대조군으로 사용하여 배양, 처리 및 실험한 결과이다.
도 12는 본 발명의 리포좀에 GFP나 BSA를 첨가함에 따라 나타나는 가시광선 파장의 흡수 변화를 분석하기 위해 수행된 흡수 파장 스캐닝 실험의 결과이다.
도 13은 본 발명에 따른 Ni-NTA/MPEG-PCDA/PCDA 센서로부터의 신호가 His6-GFP에 의해 특이적으로 발생하는 것인가를 알아보기 위해, PDA 리포좀으로 실험한 결과이다.
도 14는 본 발명에 따른 10mol% Ni-NTA/1mol% MPEG-PCDA/2mM PCDA 리포좀에 GFP 또는 이미다졸을 첨가함에 따라 나타나는 가시광선 파장의 흡수 변화를 분석하기 위해 수행된 흡수 파장 스캐닝 실험의 결과이다.
도 15는 2mM PDA 리포좀에 GFP 또는 이미다졸을 첨가함에 따라 나타나는 가시광선 파장의 흡수 변화를 분석하기 위해 수행된 흡수 파장 스캐닝 실험의 결과이다.
도 16은 His6-GFP 또는 이미다졸과의 상호작용에 따른 1mol% Ni-NTA/1mol% MPEG-PCDA/PDA 리포좀의 색 변화를 나타낸다.
도 17은 1mol% Ni-NTA/MPEG-PCDA/PDA 리포좀의 형광 현미경 이미지이다.
도 18은 본 발명에 따른 1mol% Ni-NTA/1mol% MPEG-PCDA/PDA 리포좀에 GFP 또는 BSA를 첨가함에 따라 나타나는 가시광선 파장의 흡수 변화를 분석하기 위해 수행된 흡수 파장 스캐닝 실험의 결과이다.
도 19는 GFP(μM) 또는 이미다졸(mM) 농도의 함수로 표시한 비색 변화(Colorimetric response)를 나타낸다.
도 20은 10mol% Ni-NTA/MPEG-PCDA/PDA 리포좀과 1mol% Ni-NTA/MPEG-PCDA/PDA 리포좀의 구조를 그림으로 비교한 것이다.
도 21은 본 발명의 Ni-NTA / MPEG-PCDA / PCDA 의 구조를 나타낸 그림이다.Figure 1 shows the color change of polydiacetylene (PDA) liposomes.
2 is a fluorescence image of polydiacetylene (PDA).
FIG. 3 shows fluorescence, optical properties and applications thereof as an example of biosensing using a polydiacetylene material.
Figure 4 shows the surface of polydiacetylene modified with nitrotriacetic acid (NTA) to bind His 6 -labeled protein.
5 is a diagram illustrating a detection process of Ni-NTA / MPEG-PCDA / PCDA His 6 -labeled protein.
6 is 10,12-pentacosadiynoic acid (A), methoxy polyethyleneglycol-amin (B) and 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[N (5-amino-1-Carboxypentyl) iminodiacetic acid] succinyl} The structural formula of (nickel salt) (C) is shown.
7 shows the color shift of the PDA sensor of the present invention upon interaction with His 6 -GFP or imidazole.
8 is a fluorescence microscope image of PDA observed after incubation with various concentrations of GFP or imidazole at room temperature. It can be seen that the intensity of red fluorescence increases with increasing concentration of GFP or imidazole.
FIG. 9 shows the results of an absorption wavelength scanning experiment performed to analyze changes in absorption of visible light wavelengths resulting from addition of GFP or imidazole to liposomes of the present invention.
10 shows Colorimetric response expressed as a function of GFP (μM) or imidazole (mM) concentration.
FIG. 11 shows cultures, treatments and experiments using BSA as a negative control to determine whether signals from Ni-NTA / MPEG-PCDA / PCDA sensors according to the present invention are specifically generated by His 6- GFP. One result.
FIG. 12 shows the results of an absorption wavelength scanning experiment performed to analyze changes in absorption of visible light wavelengths as a result of adding GFP or BSA to liposomes of the present invention.
13 is a result of experiments with PDA liposomes to determine whether the signal from the Ni-NTA / MPEG-PCDA / PCDA sensor according to the present invention is specifically generated by His 6- GFP.
14 shows the results of an absorption wavelength scanning experiment performed to analyze the change in absorption of visible wavelengths caused by the addition of GFP or imidazole to 10 mol% Ni-NTA / 1 mol% MPEG-PCDA / 2 mM PCDA liposome according to the present invention. to be.
FIG. 15 shows the results of an absorption wavelength scanning experiment performed to analyze the change in absorption of visible wavelengths as GFP or imidazole is added to 2 mM PDA liposomes.
FIG. 16 shows the color change of 1 mol% Ni-NTA / 1 mol% MPEG-PCDA / PDA liposomes upon interaction with His 6 -GFP or imidazole.
17 is a fluorescence microscopic image of 1 mol% Ni-NTA / MPEG-PCDA / PDA liposomes.
FIG. 18 shows the results of an absorption wavelength scanning experiment performed to analyze absorption changes in visible light wavelengths when GFP or BSA is added to 1 mol% Ni-NTA / 1 mol% MPEG-PCDA / PDA liposomes according to the present invention.
19 shows the colorimetric response expressed as a function of GFP (μM) or imidazole (mM) concentration.
20 is a graphical comparison of the structures of 10 mol% Ni-NTA / MPEG-PCDA / PDA liposomes and 1 mol% Ni-NTA / MPEG-PCDA / PDA liposomes.
21 is a diagram showing the structure of Ni-NTA / MPEG-PCDA / PCDA of the present invention.
본 발명은 바이오센서 소재로서 장점을 가지고 있는 폴리다이아세틸렌(PDA)을 기본골격(backbone)으로 하고, 히스티딘 표지(His-tag)와 결합할 수 있는 Ni-NTA DOGS 지질(lipid)과, 수용액 상에서 용해도(solubility)를 높일 수 있는 MPEG-PCDA를 도입하여 제조된 리포좀(liposomes)에 관한 것이다.The present invention uses polydiacetylene (PDA), which has advantages as a biosensor material, as a backbone, and Ni-NTA DOGS lipids capable of binding to histidine labels and aqueous solutions. The present invention relates to liposomes prepared by introducing MPEG-PCDA capable of increasing solubility.
본 발명자들은 본 발명의 리포좀에 His-tag GFP 또는 이미다졸(imidazole)을 첨가함으로써 유도되는 색 변화와 형광을 확인함으로써(도 5 참조), 본 발명의 리포좀의 히스티딘 또는 이미다졸 검출 효과를 확인하였다. The present inventors confirmed the histidine or imidazole detection effect of the liposome of the present invention by confirming the color change and fluorescence induced by adding His-tag GFP or imidazole to the liposome of the present invention (see FIG. 5). .
형광 단백질이며 히스티딘 표지(Histidine tag)가 붙어 있는 His-tag GFP를 최적 조건에서 발현시킨 후 nickel-iminodiacetic acid (Ni-IDA) metal-affinity chromatography를 이용하여 정제하고 이미다졸 제거와 동시에 농축하였다.His-tag GFP with fluorescent protein and histidine tag was expressed under optimal conditions, purified using nickel-iminodiacetic acid (Ni-IDA) metal-affinity chromatography, and concentrated simultaneously with imidazole removal.
10mol% Ni-NTA / 1mol% MPEG-PCDA / PDA 리포좀(liposomes)을 수용액 상에서 제조한 뒤 His-tag GFP 나 이미다졸을 첨가하여 색 변화를 확인하였다(도 7 참조). GFP의 경우 이미다졸 보다 낮은 농도에서도 청색에서 노란색으로의 색 전이 현상을 나타내었는데, 색이 적색이 아닌 노란색으로 변한 이유는 GFP 자체의 형광 때문인 것으로 생각된다. 이미다졸을 첨가하였을 때에는 청색에서 적색으로 색이 전이된 것을 확인할 수 있었다.10 mol% Ni-NTA / 1 mol% MPEG-PCDA / PDA liposomes were prepared in aqueous solution, and then his-tag GFP or imidazole was added to confirm the color change (see FIG. 7). GFP showed a color transition from blue to yellow even at a lower concentration than imidazole. The reason why the color changed to yellow instead of red is thought to be due to the fluorescence of GFP itself. When imidazole was added, it was confirmed that the color shifted from blue to red.
또한 폴리다이아세틸렌(PDA)이 외부 환경변화를 인식할 때 나타내는 적색 형광을 확인하기 위해 형광 현미경을 통해 관찰하였다. 그 결과 리포좀에 첨가한 His-tag GFP 나 이미다졸의 농도가 증가함에 따라 형광이 점차 증가함을 확인할 수 있었다(도 8 참조). In addition, the polydiacetylene (PDA) was observed through a fluorescence microscope to identify the red fluorescence that appears when the external environment changes. As a result, it was confirmed that the fluorescence gradually increased as the concentration of His-tag GFP or imidazole added to the liposome was increased (see FIG. 8).
반면에, 본 발명의 리포좀에 히스티딘 표지(His-tag)가 없는 BSA 단백질을 첨가하였을 때와, Ni-NTA DOGS lipid 가 도입되지 않은 PDA 리포좀에 His-tag GFP 또는 이미다졸을 첨가하였을 때 모두 색 전이 현상이나 형광은 볼 수 없었다(도 11 및 도 13 참조). 이러한 결과를 통해 본 발명의 Ni-NTA / MPEG-PCDA / PDA 리포좀이 His-tag GFP 나 이미다졸을 특이적으로 검출할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.On the other hand, when the histidine-labeled BSA protein was added to the liposome of the present invention, and when His-tag GFP or imidazole was added to the PDA liposome without Ni-NTA DOGS lipid, No transition phenomenon or fluorescence was seen (see FIGS. 11 and 13). These results confirmed that the Ni-NTA / MPEG-PCDA / PDA liposome of the present invention can specifically detect His-tag GFP or imidazole.
한편, 본 발명의 리포좀의 구성비율을 바꾸기 위해 Ni-NTA DOGS lipid 의 몰 비를 낮추어, 1mol% Ni-NTA / 1mol% MPEG-PCDA / PDA 리포좀을 제조하여, 10mol% Ni-NTA DOGS lipid 가 도입된 리포좀과 비교해 보았다(도 16 및 도 17 참조). 그 결과 1mol% Ni-NTA DOGS lipid 가 도입된 리포좀이 상대적으로 짧은 시간에 더 많은 색 전이를 유도하는 것을 확인할 수 있었다(도 19 및 도 20).On the other hand, in order to change the composition ratio of the liposome of the present invention by lowering the molar ratio of Ni-NTA DOGS lipid, 1mol% Ni-NTA / 1mol% MPEG-PCDA / PDA liposome was prepared, 10mol% Ni-NTA DOGS lipid is introduced Compared to the liposomes (see FIGS. 16 and 17). As a result, it was confirmed that liposomes into which 1 mol% Ni-NTA DOGS lipid were introduced induced more color transfer in a relatively short time (FIGS. 19 and 20).
따라서, 본 발명은 폴리다이아세틸렌(polydiacetylene, PDA) 또는 그 유도체를 기본 골격(backbone)으로 하고, Ni-NTA-DOGS (nickel-1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodi acetic acid]succinyl} (nickel salt)) 지질, 및 메톡시폴리에틸렌글라이콜(methoxy polyethyleneglycol, MPEG)이 접합된(conjugated) 폴리다이아세틸렌 또는 그 유도체를 포함하는 생체물질 검출용 리포좀(liposome)을 제공할 수 있다.Accordingly, the present invention uses polydiacetylene (PDA) or derivatives thereof as a backbone, and Ni-NTA-DOGS (nickel-1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[N- ( A biological body comprising 5-amino-1-carboxypentyl) iminodi acetic acid] succinyl} (nickel salt)) lipid and polydiacetylene or a derivative thereof conjugated with methoxy polyethyleneglycol (MPEG) Liposomes for substance detection can be provided.
본 발명의 리포좀이 검출할 수 있는 생체물질은 히스티딘 또는 이미다졸 그룹을 포함한 물질로서 바람직하게는 단백질, 더욱 바람직하게는 His-tag GFP이다. 히스티딘 또는 이미다졸 그룹의 인식은 본 발명의 리포좀의 Ni-NTA-DOGS 지질 부위에 의해 이루어진다(도 4 및 도 13 참조). 본 발명의 리포좀의 구조는 도 21과 같은 형태로 예측되며, 따라서 히스티딘 또는 이미다졸은 리포좀의 외부로 나와 있는 Ni-NTA-DOGS 지질의 인식부위에 의해 인식될 수 있으며, MPEG는 수용액에서의 용해도를 증가시키는 기능을 할 수 있다.The biomaterial detectable by the liposome of the present invention is a substance containing a histidine or imidazole group, preferably a protein, more preferably His-tag GFP. Recognition of histidine or imidazole groups is accomplished by the Ni-NTA-DOGS lipid site of liposomes of the invention (see FIGS. 4 and 13). The structure of the liposome of the present invention is predicted in the form as shown in Figure 21, therefore histidine or imidazole can be recognized by the recognition site of the Ni-NTA-DOGS lipids appearing out of the liposome, MPEG is solubility in aqueous solution It can function to increase.
또한, 본 발명은 상기 리포좀을 포함하는, 히스티딘 표지(histidine tag) 또는 이미다졸(imidazole)을 포함하는 생체물질 검출용 바이오센서를 제공할 수 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 바이오센서는 폴리다이아세틸렌 마이크로어레이 센서 칩, 마이크로플루이딕(microfluidic) 센서 칩, 폴리다이아세틸렌 센서가 함유된 초 미세 섬유, 또는 폴리다이아세틸렌 스트립 센서의 형태로 제작될 수 있다.In another aspect, the present invention can provide a biosensor for detecting a biomaterial comprising a histidine tag or imidazole, including the liposome. In one embodiment of the present invention, the biosensor is in the form of a polydiacetylene microarray sensor chip, a microfluidic sensor chip, ultra-fine fibers containing a polydiacetylene sensor, or a polydiacetylene strip sensor. Can be made.
폴리다이아세틸렌 마이크로어레이 센서 칩은 형광 특성을 이용하여 고정화된 폴리다이아세틸렌 마이크로어레이 센서를 제조함으로써 무표지 센서 기능이 가능하므로 기존의 형광 표식인자를 붙여서 사용하는 칩 센서를 보완할 수 있을 것으로 기대된다(Kim, J. M.; Lee, J. S.; Lee, J. S.; Woo, S. Y.; Ahn, D. J., Unique effects of cyclodextrins on the formation and colorimetric transition of polydiacetylene vesicles. Macromol Chem Physic 2005, 206 (22), 2299-2306). It is expected that the polydiacetylene microarray sensor chip can be used as a label-free sensor by manufacturing the immobilized polydiacetylene microarray sensor using the fluorescence property, and thus it is expected to be able to complement the chip sensor using the fluorescent labeling factor. (Kim, JM; Lee, JS; Lee, JS; Woo, SY; Ahn, DJ, Unique effects of cyclodextrins on the formation and colorimetric transition of polydiacetylene vesicles.Macromol Chem Physic 2005, 206 (22), 2299-2306).
또한, 폴리다이아세틸렌의 분자인식에 의한 형광 발현 현상을 이용하여 마이크로플루이딕(microfluidic) 센서 칩으로 제조가 가능하다. 청색의 폴리다이아세틸렌 센서 입자를 마이크로 채널의 가운데로 흐르게 하고 채널의 폴리다이아세틸렌 주위로 분석하고자 하는 표적물질을 흘려주었을 때 마이크로채널 내부에서 분자인식에 의한 형광이 발현되어 형광 띠를 생성하게 된다. In addition, it is possible to manufacture a microfluidic sensor chip using the fluorescence expression phenomenon by the molecular recognition of polydiacetylene. When the blue polydiacetylene sensor particles flow to the center of the microchannel and the target material to be analyzed is flowed around the polydiacetylene of the channel, fluorescence is generated by molecular recognition inside the microchannel to generate a fluorescent band.
또한, 전기방사법(electrospinning)을 이용하여 제조된 폴리다이아세틸렌 센서가 함유된 초 미세 섬유형태로도 제조가 가능하다(Greiner, A.; Wendorff, J. H., Electrospinning: a fascinating method for the preparation of ultrathin fibers. Angew Chem Int Ed Engl 2007, 46 (30), 5670-703). 전기방사법을 이용하여 제조된 폴리다이아세틸렌 함유 미세섬유를 유기용매에 노출시킨 결과 미세섬유 제조에 사용된 다이아세틸렌의 종류에 따라 유기용매와의 반응특성이 차이가 남을 관찰할 수 있다. 따라서 생성된 칼라 패턴만으로 센서에 노출된 유기용매의 종류를 알 수 있기 때문에 유기 용매를 쉽게 구별할 수 있다((a) Yoon, J.; Chae, S. K.; Kim, J. M., Colorimetric sensors for volatile organic compounds (VOCs) based on conjugated polymer-embedded electrospun fibers. J Am Chem Soc 2007, 129 (11), 3038-+; (b) Yoon, J.; Chae, S. K.; Kim, J. M., Colorimetric sensors for volatile organic compounds (VOCs) based on conjugated polymer-embedded electrospun fibers. J Am Chem Soc 2007, 129(11), 3038-9).In addition, it can be prepared in the form of ultra-fine fibers containing polydiacetylene sensor prepared by electrospinning (Greiner, A .; Wendorff, JH, Electrospinning: a fascinating method for the preparation of ultrathin fibers Angew Chem Int Ed Engl 2007, 46 (30), 5670-703). As a result of exposing the polydiacetylene-containing microfibers prepared by the electrospinning method to the organic solvent, it can be observed that the reaction characteristics with the organic solvents differ depending on the type of the diacetylene used to prepare the microfibers. Therefore, the organic solvents can be easily distinguished because the generated color patterns reveal the types of organic solvents exposed to the sensors ((a) Yoon, J .; Chae, SK; Kim, JM, Colorimetric sensors for volatile organic compounds). (VOCs) based on conjugated polymer-embedded electrospun fibers.J Am Chem Soc 2007, 129 (11), 3038- +; (b) Yoon, J .; Chae, SK; Kim, JM, Colorimetric sensors for volatile organic compounds ( VOCs) based on conjugated polymer-embedded electrospun fibers.J Am Chem Soc 2007, 129 (11), 3038-9).
폴리다이아세틸렌 스트립 센서는 제조방법이 매우 간단하여 폴리다이아세틸렌 입자가 분산된 수용액에 폴리비닐알코올(polyvinylalcohol, PVA)을 넣은 후 페트리 접시에 붓고 건조시키면 폴리다이아세틸렌이 함유된 유연한 청색의 고분자 필름을 만들 수 있다(Kim, J. M.; Chae, S. K.; Lee, Y. B.; Lee, J. S.; Lee, G. S.; Kim, T. Y.; Ahn, D. J., Polydiacetylene supramolecules embedded in PVA film for strip-type chemosensors. Chem Lett 2006, 35 (6), 560-561). 대부분 센서의 경우 비가역적인 색 전이 특성을 나타낸다. 즉 청색에서 적색으로 색 전이가 일어나면 자극 인자를 제거해도 다시 청색으로 돌아가지 않는다. 하지만 폴리다이아세틸렌 센서의 head group의 상호작용을 조절하면 가역적 색 전이가 일어날 수 있다. 사진은 온도에 의한 가역적 청색-적색의 색 전이를 나타내고 있다(도 3)(Ahn, D. J.; Chae, E. H.; Lee, G. S.; Shim, H. Y.; Chang, T. E.; Ahn, K. D.; Kim, J. M., Colorimetric reversibility of polydiacetylene supramolecules having enhanced hydrogen-bonding under thermal and pH stimuli. J Am Chem Soc 2003, 125 (30), 8976-7).The polydiacetylene strip sensor is very simple to manufacture, so that polyvinyl alcohol (polyvinylalcohol (PVA)) is added to an aqueous solution in which polydiacetylene particles are dispersed, and then poured into a petri dish and dried to produce a flexible blue polymer film containing polydiacetylene. (Kim, JM; Chae, SK; Lee, YB; Lee, JS; Lee, GS; Kim, TY; Ahn, DJ, Polydiacetylene supramolecules embedded in PVA film for strip-type chemosensors. Chem Lett 2006, 35 ( 6), 560-561). Most sensors exhibit irreversible color transitions. In other words, if a color transition occurs from blue to red, even if the stimulus is removed, the color does not return to blue again. However, by controlling the interaction of the head group of the polydiacetylene sensor, reversible color transition can occur. Photo shows reversible blue-red color transition with temperature (FIG. 3) (Ahn, DJ; Chae, EH; Lee, GS; Shim, HY; Chang, TE; Ahn, KD; Kim, JM, Colorimetric reversibility of polydiacetylene supramolecules having enhanced hydrogen-bonding under thermal and pH stimuli.J Am Chem Soc 2003, 125 (30), 8976-7).
그 외, 본 발명의 리포좀을 포함한 바이오센서는 공지의 리포솜을 포함한 센서 칩의 제조방법에 따라 칩 형태로 제작될 수 있다. 예를 들어, 대한민국 등록특허 제10-1039629호(2011.06.01.등록, "생체물질의 검출방법, 생체물질 검출용 칩의 제조방법 및 생체물질 검출용 칩")에는 기판에 폴리디아세틸렌 리포좀을 고정화시키는 방법이 개시되어 있으며, 대한민국 등록특허 제10-0848105호(2008.07.17.등록, "단백질을 포함하는 폴리다이아세틸렌 센서칩 및 그 제조방법")에는 폴리다이아세틸렌 소포를 글래스 슬라이드에 마이크로어레이 형태로 점적, 고정화하여 센서칩으로 제조하는 방법이 개시되어 있다.In addition, the biosensor including the liposome of the present invention may be manufactured in the form of a chip according to a method for manufacturing a sensor chip including a known liposome. For example, the Republic of Korea Patent No. 10-1039629 (2011.06.01. Registered, "detection method of biological material, manufacturing method of the chip for detecting the biological material and chip for detecting the biological material") in the polydiacetylene liposomes on the substrate A method of immobilization is disclosed, and Republic of Korea Patent No. 10-0848105 (registered July 17, 2008, "Polydiacetylene sensor chip containing a protein and a method of manufacturing the same") is a poly-diacetylene vesicle microarray on a glass slide Disclosed is a method of manufacturing a sensor chip by dropping and immobilizing a shape.
또한, 본 발명은 본 발명의 리포좀의 색 변이 또는 형광 특성을 이용하여 히스티딘 또는 이미다졸 그룹이 포함된 약물의 전달을 확인하는 방법을 제공할 수 있다. 이를 위하여, 상기 리포좀은 리포좀 내부의 수용성 상에 하나 이상의 약물 분자를 포함하며 리포좀 막의 한쪽 또는 양쪽 면에 부착된 동일하거나 또는 다른 약물 분자를 추가로 포함할 수 있다. 상기 부착은 공유성 또는 비-공유성일 수 있다. 즉 상기 부착은 약물과 지질 사이의 화학 결합에 의하거나 약물과 지질 분자 사이의 반 데르 발스 힘, 수소 다리(hydrogen bridge), 정전기력, 친수성-소수성 상호작용, 친화력(affinity force), 및/또는 극성 상호작용 등(여기에 제한되지 않음)을 포함하는 화학 결합 이외의 접착력에 의할 수 있다. In addition, the present invention may provide a method for confirming delivery of a drug containing histidine or imidazole groups using the color shift or fluorescence properties of the liposomes of the present invention. To this end, the liposomes comprise one or more drug molecules on the water-soluble phase inside the liposomes and may further comprise the same or different drug molecules attached to one or both sides of the liposome membrane. The attachment can be covalent or non-covalent. That is, the attachment may be by chemical bonds between the drug and the lipid or by Van der Waals forces, hydrogen bridges, electrostatic forces, hydrophilic-hydrophobic interactions, affinity forces, and / or polarities between the drug and lipid molecules. Adhesive strength other than chemical bonds, including but not limited to interactions and the like.
상기 리포좀 내부의 수용성 상에 분포된 하나 이상의 요구되는 약물 분자를 포함하며 리포좀 막의 한쪽 또는 양쪽 면에 부착된 동일하거나 또는 다른 약물 분자를 추가로 포함하는 리포좀 제조 방법은, 예를 들어, 유기 용매 내의 지질 상(lipidic phase)을 제공하는 단계, 여기서 지질 상은 하나 이상의 지질 단편(fraction)을 포함하고 각각의 지질 분자는 하나 이상의 반응성 작용기를 가지며; 완충용액 및 완충용액에 용해된 하나 이상의 요구되는 약물을 포함하는 수용성 상을 제공하는 단계, 여기서 하나 이상의 약물은 지질의 작용기와 반응 가능한 반응성 작용기를 가지며; 리포좀의 형성을 허용하는 조건 하에서 상기 지질 상을 상기 수용성 상에 공급하는 단계; 선택적으로 리포좀에 의한 약물 업테이크(uptake)의 효율을 증가시키기 위하여 루프(loop) 내에서 수용성 상을 순환시키고 상기 전 단계를 반복하는 단계; 및 약물-부과된 리포좀을 수확하는 단계, 여기서 약물 분자의 적어도 일부는 리포좀 내에 편입되며 약물 분자의 또다른 일부는 리포좀 막의 한쪽 또는 양쪽 면에 부착되는 단계를 포함할 수 있다. 리포좀 막에 대해 요구되는 약물의 능동 결합 또는 부착을 위하여 리포좀은 약 25 내지 65℃ 및 약 중성의 pH, 즉 약 염기성 또는 약 산성, 바람직하게는 6 내지 8의 pH 에서, 예를 들면 에리트로포이에틴과 같은 요구되는 약물의 존재 하에서 제조되는 것이 바람직하다. 선택적으로 시알산 그룹과 인지질 사이의 에스테르화 반응에 의한 화학 결합을 포함하는 부착은 상기 온도와 pH 범위에서 가장 잘 수행하는 것으로 나타난다.Liposome preparation methods comprising one or more desired drug molecules distributed in the water-soluble phase inside the liposome and further comprising the same or different drug molecules attached to one or both sides of the liposome membrane, for example, in an organic solvent Providing a lipid phase, wherein the lipid phase comprises one or more lipid fractions and each lipid molecule has one or more reactive functional groups; Providing a water-soluble phase comprising a buffer and at least one desired drug dissolved in the buffer, wherein the at least one drug has a reactive functional group that can react with the functional group of the lipid; Supplying the lipid phase to the aqueous phase under conditions that allow the formation of liposomes; Optionally circulating the water-soluble phase in a loop and repeating the previous step to increase the efficiency of drug uptake by liposomes; And harvesting the drug-charged liposome, wherein at least a portion of the drug molecule is incorporated into the liposome and another portion of the drug molecule is attached to one or both sides of the liposome membrane. For active binding or attachment of the drug required for the liposome membrane, the liposomes are for example erythropoietin at about 25-65 ° C. and at about neutral pH, ie at about pH basic or weakly acidic, preferably at 6-8. It is preferably prepared in the presence of the required drug such as. Optionally, the attachment comprising chemical bonds by esterification reaction between sialic acid groups and phospholipids appears to perform best in the above temperature and pH ranges.
또한, 상기 방법에서 제약학적으로 수용가능한 담체 및 상기 리포좀을 포함하는 제약학적 조성물이 사용될 수 있다. 상기 제약학적 조성물은 국부부위(topic) 또는 온몸의(systemic) 비경구 투여를 가능하게 하기 위하여, 주사액, 나잘 스프레이(nasal spray), 흡입 액체, 크림(cream), 겔, 연고(ointment), 좌약, 또는 로션(lotion) 형태와 같은, 투여 특히 비경구 투여를 위한 임의의 적절한 액체, 반-액체 또는 고체 형태일 수 있다.
In addition, a pharmaceutical composition comprising the pharmaceutically acceptable carrier and the liposomes may be used in the method. The pharmaceutical composition may be administered by injection, nasal spray, inhalation liquid, cream, gel, ointment, suppository to enable topical or systemic parenteral administration. Or any suitable liquid, semi-liquid or solid form for administration, particularly parenteral administration, such as lotion form.
이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the following examples and experimental examples. However, the following Examples and Experimental Examples are merely illustrative of the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the following Experimental Examples.
<< 실시예Example 1> 1>
GFPGFP
((
greengreen
fluorescentfluorescent
proteinprotein
)의 준비) Preparation
<1-1> <1-1> GFPGFP 의 발현Expression of
히스티딘(Histidine)이 6 개 부착(tagging)된 pET-21b 백터로 클로닝 된 플라스미드를 대장균 BL21 에 형질전환시켜 배양한 뒤, 배지에서 얻어진 콜로니(colony)를 암피실린(ampicillin)을 첨가한 LB 배지에 예비배양 (pre-culture)하였다. 12시간 동안 배양한 후 대량배양(large culture) 시킨 후에 600nm에서의 흡광도가 0.6 이 되었을 때, Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)를 처리하여 단백질의 발현을 유도하였다.
A plasmid cloned with 6 histidine-tagged pET-21b vectors was transformed into Escherichia coli BL21 and cultured, and colonies obtained from the medium were preliminarily added to LB medium to which ampicillin was added. Cultures were pre-cultured. After incubation for 12 hours and the large culture (large culture), when the absorbance at 600nm became 0.6, Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) was treated to induce the expression of the protein.
<1-2> <1-2> GFPGFP 의 정제 및 정량Purification and quantification
대량배양을 통해 다량 발현된 GFP를 원심분리(6000rpm, 30min, 37℃)를 통하여 펠렛(pellet)으로 얻었다. 얻어진 펠렛을 His-tag binding buffer(50mM Tris, 500mM NaCl, pH 8.0)로 풀어준 뒤 초음파분해(sonication)를 수행하였다. GFP는 6개의 히스티딘 표지(Histidine tag)를 포함하고 있기 때문에 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)를 통해 정제하였다. 상층액에 있는 단백질만을 얻기 위해 원심분리(8000rpm, 40min, 4℃)를 한 뒤 IDA Excellose (Bioprogen)에 결합시킨 후 His-tag washing buffer(50mM Tris, 500mM NaCl, 50mM imidazole, pH 8.0)를 넣어 히스티딘 표지(His tag)가 있는 GFP만을 얻었다. His-tag GFP 만을 용출(elution)시키기 위해 His-tag elution buffer(50mM Tris, 500mM NaCl, 100mM imidazole, pH 8.0)로 column 에 넣어 준 뒤, 각 단계별로 얻어진 정제된 단백질을 SDS-PAGE 를 수행하여 확인하였다. GFP expressed in large quantities through mass culture was obtained as pellets by centrifugation (6000 rpm, 30 min, 37 ° C.). The obtained pellet was released with His-tag binding buffer (50 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8.0) and then subjected to sonication. Since GFP contains six histidine tags, the GFP was purified by affinity chromatography. Centrifuge (8000 rpm, 40 min, 4 ° C) to obtain only the protein in the supernatant, bind to IDA Excellose (Bioprogen), and add His-tag washing buffer (50 mM Tris, 500 mM NaCl, 50 mM imidazole, pH 8.0). Only GFP with histidine label (His tag) was obtained. In order to elution only His-tag GFP, His-tag elution buffer (50mM Tris, 500mM NaCl, 100mM imidazole, pH 8.0) was added to the column, and the purified protein obtained in each step was subjected to SDS-PAGE. Confirmed.
용출 버퍼(Elution buffer)에 있는 100mM 이미다졸(imidazole)을 제거하기 위해 VIVASPIN(Sartorius stedim biotech) MWCO 10,000 으로 원심분리하여 이미다졸을 제거하고 GFP를 농축한 뒤 4℃에서 보관하였다. GFP 의 농도를 측정하기 위해 micro BCA protein assay reagent를 이용해 590nm에서 ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 리더(reader)기를 통해 흡광을 찍어 농도를 확인하였다.
In order to remove 100 mM imidazole in the elution buffer, imidazole was removed by centrifugation with VIVASPIN (Sartorius stedim biotech) MWCO 10,000, GFP was concentrated, and stored at 4 ° C. In order to measure the concentration of GFP, the absorbance was measured by using an Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) reader at 590 nm using a micro BCA protein assay reagent.
<< 실시예Example 2> 2>
NiNi
--
NTANTA
/ Of
MPEGMPEG
--
PCDAPCDA
/ Of
PDAPDA
리포좀(Liposomes)의Of liposomes
제조 Produce
<2-1> <2-1> NiNi -- NTANTA / Of MPEGMPEG -- PCDAPCDA / Of PDAPDA 리포좀의Liposome 제조 Produce
PDA 유도체인 10,12-pentacosadiynoic acid(PCDA)는 Fluka 에서 구입하였고, Ni-NTA DOGS Lipid 는 Avanti Polar Lipids 에서 구입하였다(도 6). PCDA 에 MPEG 도입을 위해 분자량 2000 Dalton 의 methoxypolyethylene glycol-amin (MPEG-NH2, MW2000) (NOF, Japan)을 구입하였다(도 6). 유기용매는 클로로포름(chloroform) (Sigma-Aldrich)을 사용하였다. 사용한 수조(water bath)는 Lab. Companion 의 CW-05GL 모델이며, bath type sonicator를 사용하였다.
리포좀의 제조방법은 다음과 같다. MPEG-PCDA, Ni-NTA DOGS Lipid, PCDA 를 클로로포름에 녹이고, 질소 가스로 유기 용매를 날려주었다. 2mM 에 맞추어 0.22 ㎛로 여과(filtering)한 3차 증류수를 더하고 80℃ 수조(water bath)에서 15분 동안 가열(heating)한 뒤, 15분간 초음파분해(sonication) 하였다. 초음파분해 후 바로 0.8 ㎛ syringe filter(Sartorius)로 여과(filtering)하고 4℃에서 12시간 이상 보관하였다.
The preparation method of liposomes is as follows. MPEG-PCDA, Ni-NTA DOGS Lipid and PCDA were dissolved in chloroform and the organic solvent was blown with nitrogen gas. 3 distilled water filtered at 0.22 μm was added to 2 mM, heated for 15 minutes in an 80 ° C. water bath, and sonicated for 15 minutes. Immediately after sonication was filtered with a 0.8 μm syringe filter (Sartorius) and stored at 4 ° C. for at least 12 hours.
<2-2> 본 발명의 <2-2> of the present invention 리포좀의Liposome 구조 rescue
His-tag GFP 와 이미다졸(imidazole)을 검출하기 위해 PDA 리포좀(liposomes)에 Ni-NTA DOGS lipid 를 도입하였으며 수용액상에서 용해도(solubility)를 높이기 위해 MPEG-PCDA 를 도입하였다. Ni-NTA DOGS lipid는 각각 1mol%, 5mol%, 10mol%의 몰 비로 넣어 리포좀을 제조하였다. 예상되는 리포좀의 구조는 도 21과 같다.
Ni-NTA DOGS lipid was introduced into PDA liposomes to detect His-tag GFP and imidazole, and MPEG-PCDA was introduced to increase solubility in aqueous solution. Ni-NTA DOGS lipids were prepared in a molar ratio of 1 mol%, 5 mol% and 10 mol%, respectively. The expected liposome structure is shown in FIG. 21.
<< 실시예Example 3> 3>
1010
molmol
% %
NiNi
--
NTANTA
/ 1 / One
molmol
% %
MPEGMPEG
--
PCDAPCDA
/ Of
PDAPDA
리포좀(Liposomes)의Of liposomes
HisHis
66
--
GFPGFP
또는 이미다졸 검출 효과 Or imidazole detection effect
제조된 리포좀을 20~30 초 동안 254nm UV 를 조사하여 중합(polymerization)시켰다. 그 후 중합된 리포좀에 His-tag GFP를 넣었을 때의 영향을 알아보고자 농도 별로 His-tag GFP를 넣어 색 변화와 형광을 관찰하고 UV-Vis spectrophotometer(OPTIZEN POP)를 이용하여 400~700nm 사이의 파장을 스캐닝(scanning)하였다.
The prepared liposomes were polymerized by irradiation with 254 nm UV for 20-30 seconds. Afterwards, his-tag GFP was added to the polymerized liposomes to determine the color change and fluorescence by concentration. The wavelength between 400 and 700 nm was measured using UV-Vis spectrophotometer (OPTIZEN POP). Was scanned.
<3-1> <3-1> HisHis 66 -- GFPGFP 또는 or 이미다졸(Imidazole)과의With imidazole 상호작용에 따른 By interaction PDAPDA 센서의 색 전이 Color transition of the sensor
10mol%의 Ni-NTA DOGS lipid와 1mol% MPEG-PCDA가 도입된 PDA 리포좀에 His-tag GFP 또는 이미다졸을 넣어 주었을 때의 색 변화를 확인해 보았다(도 7). His-tag GFP를 넣어 준 경우 초기에는 GFP의 형광 때문에 농도가 증가할수록 초록색으로 보이지만, 1시간 후 GFP가 11μM 포함된 리포좀은 노란색으로 색이 변한 것을 볼 수 있었다. 한편, 이미다졸을 넣어 준 경우에는 15분 후 이미다졸이 115.4μM 포함된 리포좀은 약간 적색을 나타냈고, 1시간 후 농도 증가에 따라 색이 적색으로 변화한 것을 볼 수 있었다.
The color change when His-tag GFP or imidazole was added to PDA liposomes into which 10 mol% Ni-NTA DOGS lipid and 1 mol% MPEG-PCDA were introduced (FIG. 7). When the His-tag GFP was added, it initially appeared green as the concentration increased due to the fluorescence of GFP, but after 1 hour, the liposome containing 11 μM of GFP was changed to yellow. On the other hand, when the imidazole was added after 15 minutes, the liposomes containing 115.4 μM of imidazole appeared slightly red, and after 1 hour, the color changed to red as the concentration increased.
<3-2> <3-2> NiNi -- NTANTA / Of MPEGMPEG -- PCDAPCDA / Of PCDAPCDA 리포좀의Liposome 형광 현미경 이미지 Fluorescence microscope image
육안으로도 쉽게 구별이 되는 색 변화뿐만 아니라, PDA 리포좀이 청색에서는 형광을 나타내지 않고 적색에서는 형광을 나타내는지 알아보기 위해 형광 현미경을 통해 확인하였다. GFP나 이미다졸을 넣기 전 청색의 10mol% Ni-NTA / 1mol% MPEG-PCDA / PDA 리포좀 자체에서는 적색의 형광을 볼 수 없었지만, 리포좀에 GFP 나 이미다졸을 넣어준 경우에는 형광이 농도에 따라 점차 증가하는 것을 볼 수 있었다(도 8).
In addition to color changes that can be easily distinguished by the naked eye, PDA liposomes were identified by fluorescence microscopy to see whether they fluoresce in blue and fluoresce in red. Before adding GFP or imidazole, the blue 10 mol% Ni-NTA / 1 mol% MPEG-PCDA / PDA liposomes did not show red fluorescence, but when GFP or imidazole was added to liposomes, the fluorescence gradually increased with concentration. An increase could be seen (FIG. 8).
<3-3> <3-3> UVUV /Of VISVIS 스펙트럼 spectrum
UV/VIS 스캐닝을 통해 좀더 자세하게 확인한 결과를 도 9에 나타내었다. 650nm 근처에서 증가된 흡광도 값은 중합(polymerization)된 리포좀이 청색을 띠는 것을 의미한다. 그리고 488nm에서의 증가된 흡광도 값은 넣어준 농도에 따라 His-tag GFP의 초록색을 의미한다.Figure 9 shows the results confirmed in more detail through the UV / VIS scanning. An increased absorbance value near 650 nm means that the polymerized liposomes are blue in color. And the increased absorbance value at 488nm means the green color of His-tag GFP according to the concentration added.
10mol% Ni-NTA / 1mol% MPEG-PCDA / PDA 리포좀에 GFP나 이미다졸을 넣었을 때만 500~550nm 사이의 흡광도 값이 증가하고 상대적으로 청색의 650nm 흡광도 값은 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
Only when GFP or imidazole was added to 10 mol% Ni-NTA / 1 mol% MPEG-PCDA / PDA liposomes, the absorbance values between 500 and 550 nm increased and the blue absorbance values of 650 nm decreased.
<3-4> 색 변화(<3-4> color change colorcolor responseresponse ( ( CRCR ))의 정량Quantification of))
중합된 폴리다이아세틸렌(PDA) 구조의 청색에서 적색으로의 색 전이 정도를 비율을 통해 알아보기 위해 CR(%)값을 계산해 그래프로 나타내었다. 계산식은 다음과 같다.In order to determine the degree of color transition from blue to red of the polymerized polydiacetylene (PDA) structure, the CR (%) value was calculated and graphed. The calculation is as follows.
CR(%) = 
여기에서 PB1은 UV-Vis spectrum 에서 폴리다이아세틸렌이 청색일 때(650nm 근처)와 적색일 때(550nm 근처)의 상대적인 최대 흡광도 값을 대입하였다. PB0 는 Ni-NTA / MPEG-PCDA / PDA 리포좀에 GFP 나 이미다졸을 넣지 않았을 때의 흡광도 값이고, PB1은 Ni-NTA / MPEG-PCDA / PDA 리포좀에 GFP나 이미다졸을 넣은 뒤에 얻어진 흡광도 값을 의미한다.
Here, PB 1 was substituted for the relative maximum absorbance values in the UV-Vis spectrum when the polydiacetylene was blue (near 650 nm) and red (near 550 nm). PB 0 is the absorbance value when GFP or imidazole is not added to Ni-NTA / MPEG-PCDA / PDA liposomes, and PB 1 is the absorbance obtained after GFP or imidazole is added to Ni-NTA / MPEG-PCDA / PDA liposomes. It means the value.
CR 값이 높아질수록 청색에서 적색으로 색 전이가 더 많이 일어났음을 의미한다. 리포좀에 GFP나 이미다졸을 넣어 준 경우 모두 농도에 따라 CR 값이 증가하는 것을 볼 수 있었다(도 10).
Higher CR value means more color transition from blue to red. In the case where GFP or imidazole was added to the liposomes, CR values increased with concentration (FIG. 10).
<3-5> <3-5> NiNi -- NTANTA / Of MPEGMPEG -- PCDAPCDA / Of PDAPDA 리포좀의Liposome 특이적 검출 Specific detection
본 발명에 따른 Ni-NTA / MPEG-PCDA / PDA 리포좀이 His-tag GFP와 이미다졸만을 특이적으로 검출하는지 알아보기 위해 대조군으로 His-tag이 없는 BSA(bovine serum albumin) 단백질을 사용하여 비교해 보았다. 리포좀에 GFP나 이미다졸을 첨가한 경우에는 색이 변한 것을 볼 수 있었지만 BSA를 첨가한 경우에는 색 변화를 볼 수 없었다. 또한 형광 이미지를 통해 확인해 보았을 때 GFP나 이미다졸을 넣은 경우에는 적색의 형광을 확인할 수 있었지만 BSA를 넣은 경우에는 형광을 볼 수 없었다(도 11).To determine whether the Ni-NTA / MPEG-PCDA / PDA liposomes according to the present invention specifically detect only His-tag GFP and imidazole, a comparison was made using BSA (bovine serum albumin) protein without His-tag as a control. . When GFP or imidazole was added to the liposome, the color was changed, but when BSA was added, no color change was observed. In addition, when confirmed through the fluorescence image when the GFP or imidazole was added, red fluorescence could be confirmed, but when BSA was added, no fluorescence was observed (FIG. 11).
또한 UV/VIS 스캐닝(scanning)을 통해 비교해 보았을 때 리포좀에 GFP나 이미다졸을 넣은 경우에는 500~550nm 사이에서 흡광도 값이 증가하였으나 His-tag 이 없는 BSA 를 넣어준 경우 500~550nm 사이에서 대조군인 GFP나 이미다졸을 넣지 않은 10mol% Ni-NTA / 1mol% MPEG-PCDA / PDA liposomes 과 차이가 없었다(도 12).In addition, when GFP or imidazole was added to liposomes, the absorbance increased between 500 and 550 nm, but the BSA without His-tag was added between 500 and 550 nm when compared with UV / VIS scanning. There was no difference between 10 mol% Ni-NTA / 1 mol% MPEG-PCDA / PDA liposomes without GFP or imidazole (FIG. 12).
따라서 10mol% Ni-NTA / 1mol% MPEG-PCDA / PDA 리포좀은 His-tag 이 있는 GFP나 이미다졸을 특이적으로 검출하여 색 변화와 형광을 내는 것을 알 수 있다.
Therefore, it can be seen that 10 mol% Ni-NTA / 1 mol% MPEG-PCDA / PDA liposomes specifically detect GFP or imidazole with His-tag, and change color and fluoresce.
다음으로 His-tag GFP나 이미다졸이 리포좀의 다른 lipid 부위가 아닌 Ni-NTA DOGS lipid 에만 특이적으로 결합하는지 알아보기 위해 Ni-NTA DOGS lipid가 없는 2mM PDA 리포좀을 만들고 여기에 GFP나 이미다졸을 첨가하였다. 1시간 배양 후 광학 이미지의 경우 청색에서 노란색이나 적색의 색 변화는 볼 수 없었으며, 형광 이미지에서도 적색의 형광은 나타나지 않았다(도 13).Next, to determine whether His-tag GFP or imidazole specifically binds to Ni-NTA DOGS lipid and not other lipid sites in liposomes, 2MM PDA liposomes without Ni-NTA DOGS lipid were added and GFP or imidazole Added. After 1 hour of incubation, no change in color of blue or yellow or red was observed in the optical image, and no red fluorescence appeared in the fluorescent image (FIG. 13).
UV/VIS 스캐닝을 통해 10mol% Ni-NTA / 1mol% MPEG-PCDA / PDA 리포좀과 2mM PDA 리포좀에 GFP나 이미다졸을 첨가한 것을 비교해 보았을 때 10mol% Ni-NTA / 1mol% MPEG-PCDA / PDA 리포좀의 경우에는 GFP나 이미다졸을 첨가하였을 때 500~550nm 사이에서의 흡광도 값이 증가하여 색 전이 현상을 보인 것을 의미하지만(도 14), 2mM PDA 리포좀은 His-tag GFP나 이미다졸을 검출하지 못하기 때문에 500~550nm 사이에서의 흡광도 변화는 볼 수 없었다(도 15).10 mol% Ni-NTA / 1 mol% MPEG-PCDA / PDA liposomes compared to 10 mol% Ni-NTA / 1 mol% MPEG-PCDA / PDA liposomes and 2 mM PDA liposomes with GFP or imidazole In the case of GFP or imidazole added to the absorbance value between 500 ~ 550nm means that the color transition phenomenon (Figure 14), but 2mM PDA liposome does not detect His-tag GFP or imidazole Therefore, no change in absorbance between 500 and 550 nm was observed (FIG. 15).
이러한 결과를 통해 Ni-NTA DOGS lipid 가 포함된 리포좀에서만 His-tag GFP 와 이미다졸을 검출하고 PDA 골격(backbone) 자체에 스트레스를 주기 때문에 청색에서 적색으로의 색 전이와 적색의 형광을 내는 것을 실험을 통해 확인해 볼 수 있었다.
Through these results, his-tag GFP and imidazole were detected only in liposomes containing Ni-NTA DOGS lipid and stress on PDA backbone itself. I could check through.
<< 실시예Example 4> 4>
1One
molmol
% %
NiNi
--
NTANTA
/ 1 / One
molmol
% %
MPEGMPEG
--
PCDAPCDA
/ Of
PDAPDA
리포좀(Liposomes)의Of liposomes
HisHis
66
--
GFPGFP
또는 이미다졸 검출 효과 Or imidazole detection effect
<4-1> <4-1> HisHis 66 -- GFPGFP 또는 or 이미다졸(Imidazole)과의With imidazole 상호작용에 따른 By interaction PDAPDA 센서의 색 전이 및 형광 현미경 이미지 Color Transition and Fluorescence Microscopy Images of Sensors
다음으로 Ni-NTA DOGS lipid의 몰 비를 바꾸어 리포좀을 제조하였다. 5mol% Ni-NTA DOGS lipid가 포함된 리포좀의 경우 10mol% Ni-NTA DOGS lipid에 비해 큰 차이가 없었지만 1mol% Ni-NTA DOGS lipid가 포함된 리포좀은 10mol% Ni-NTA DOGS lipid에 비해 상대적으로 짧은 시간에(10분) 색이 변화한 것을 볼 수 있었다. 하지만 GFP와 비교하기 위해 이미다졸의 양을 mM에서 μM 수준으로 낮추어 넣어준 경우에는 리포좀의 색이 변한 것을 볼 수 없었다(도 16).Next, liposomes were prepared by changing the molar ratio of Ni-NTA DOGS lipid. Liposomes containing 5 mol% Ni-NTA DOGS lipids were not significantly different than 10 mol% Ni-NTA DOGS lipids, while liposomes containing 1 mol% Ni-NTA DOGS lipids were relatively shorter than 10 mol% Ni-NTA DOGS lipids. It was seen that the color changed in time (10 minutes). However, when the amount of imidazole was lowered from mM to μM level to compare with GFP, the color of liposomes could not be seen (FIG. 16).
음성 대조군인 BSA를 넣어 준 경우와 비교해 보았을 때 색이 변화한 것은 볼 수 없었으며 형광 이미지에서도 GFP의 경우 농도에 따라 형광이 증가하는 것을 볼 수 있지만 이미다졸이나 BSA는 형광을 확인할 수 없었다(도 17).Compared with the case of BSA, a negative control, color change was not observed. Fluorescence images also showed increased fluorescence depending on the concentration of GFP, but imidazole or BSA could not confirm fluorescence. 17).
따라서 His-tag GFP나 이미다졸의 경우 둘 다 Ni-NTA / MPEG PCDA / PDA 리포좀에 결합할 수 있지만 적은 양(μM )을 첨가하였을 경우에는 상대적으로 이미다졸 보다 His-tag GFP가 PDA 골격(backbone) 자체에 더 큰 스트레스를 주기 때문에 색 전이를 유도한 것으로 생각된다.
Therefore, both His-tag GFP and imidazole can bind to Ni-NTA / MPEG PCDA / PDA liposomes, but when a small amount (μM) is added, His-tag GFP is more likely than the imidazole. It is thought to induce color transfer because it gives more stress to itself.
<4-2> <4-2> UVUV /Of VISVIS 스펙트럼 spectrum
UV/VIS 스캐닝(scanning)을 통해 비교해 보았을 때 GFP를 넣어 준 경우에만 500~550nm 사이에서 흡광도 값이 증가하는 것을 확인하였다(도 18).
When compared through UV / VIS scanning (scanning) it was confirmed that the absorbance value increased only between 500 ~ 550nm when GFP was added (Fig. 18).
<4-3> 색 변화(<4-3> color change ( colorcolor responseresponse ( ( CRCR ))의 정량Quantification of))
CR값은 위 실시예 <3-4>에 기재된 바와 같이 계산하였다.CR values were calculated as described in Example <3-4> above.
리포좀에 이미다졸 또는 GFP 를 넣어준 경우 모두 농도에 따라 CR(%)값이 증가하는 것을 볼 수 있었다. 두 개의 그래프 값을 비교해 보면 GFP를 넣어 준 경우 이미다졸을 넣어 준 경우보다 상대적으로 적은 양으로도 높은 CR 값을 보였다.When the imidazole or GFP was added to the liposomes, the CR (%) value was increased according to the concentration. Comparing the two graphs, the CR value was higher in the case of GFP-injected than in the case of imidazole.
넣어준 Ni-NTA DOGS lipid 의 몰 비가 다른 두 리포좀을 비교해 보면 10mol% Ni-NTA DOGS lipid 가 포함된 리포좀은 GFP가 12uM 첨가되었을 때 30%의 CR 값을 보였지만 1mol% Ni-NTA DOGS lipid 가 포함된 리포좀은 50%근처의 CR 값을 가졌다(도 19).Comparing two liposomes with different molar ratios of Ni-NTA DOGS lipids, liposomes containing 10 mol% Ni-NTA DOGS lipids showed a CR value of 30% when 12 μM of GFP was added, but contained 1 mol% Ni-NTA DOGS lipids. Liposomes had a CR value near 50% (FIG. 19).
Ni-NTA / MPEG PCDA / PDA 리포좀은 PDA 리포좀 사이에 Ni-NTA DOGS lipid 가 끼어 들어가 있는 구조로 예상된다. 따라서 Ni-NTA DOGS lipid가 상대적으로 많은 10mol% Ni-NTA DOGS lipid 가 포함된 리포좀 보다 1mol% Ni-NTA DOGS lipid가 포함된 리포좀이 His-tag GFP나 이미다졸을 검출하였을 때 PDA 골격 전체에 더 쉽게 영향을 줄 수 있기 때문에 보다 짧은 시간에 색 변화와 형광을 낼 수 있다고 생각된다(도 20).
Ni-NTA / MPEG PCDA / PDA liposomes are expected to contain Ni-NTA DOGS lipids between PDA liposomes. Therefore, when liposomes containing 1 mol% Ni-NTA DOGS lipids detected His-tag GFP or imidazole, the liposomes containing 10 mol% Ni-NTA DOGS lipids had relatively higher amounts of Ni-NTA DOGS lipids. It is thought that color change and fluorescence can be made in a shorter time because it can be easily influenced (FIG. 20).
<< 실시예Example 5> 5>
본 발명의 The
리포좀의Liposome
물리적 성질 Physical properties
제조된 리포좀의 크기와 표면 전하(zeta potential)를 알아보기 위해 Zetasizer ELS-Z2(Otsuka)를 이용해 측정해 보았다(표 2).Zetasizer ELS-Z2 (Otsuka) was used to determine the size and surface charge of the prepared liposomes (Table 2).
리포좀은 100~200nm 내의 크기를 가지고 1mol% Ni-NTA / 1mol% MPEG-PCDA / PDA 리포좀과 1mol% MPEG-PCDA / PDA 리포좀에 GFP 를 넣어준 경우 둘 다 리포좀의 표면에 카르복실기(carboxyl group) 때문에 음전하(negative charge)를 띠는 것을 확인하였다.
Liposomes have a size within 100-200 nm and GFP is added to 1 mol% Ni-NTA / 1 mol% MPEG-PCDA / PDA liposomes and 1 mol% MPEG-PCDA / PDA liposomes due to carboxyl groups on the surface of liposomes. It was confirmed to have a negative charge (negative charge).
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시 예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.So far I looked at the center of the preferred embodiment for the present invention. Those skilled in the art will appreciate that the present invention can be implemented in a modified form without departing from the essential features of the present invention. Therefore, the disclosed embodiments should be considered in an illustrative rather than a restrictive sense. The scope of the present invention is defined by the appended claims rather than by the foregoing description, and all differences within the scope of equivalents thereof should be construed as being included in the present invention.
Claims (10)
상기 PDA 유도체는 PCDA (10,12-pentacosadiynoic acid)이고, 상기 MPEG가 접합된 폴리다이아세틸렌 유도체는 MPEG가 접합된 PCDA이며, 상기 리포좀의 구조는 PCDA의 소수성 부분이 막의 내부에 서로 맞닿아 있고 친수성 부분이 외막 및 내막에 위치하는 구형의 PCDA 이중막(bilayer)을 기본골격으로 하고, 그 외막 사이에 Ni-NTA-DOGS 지질 및 MPEG가 접합된 PCDA가 삽입된 것을 특징으로 하는 생체물질 검출용 리포좀.The method of claim 1,
The PDA derivative is PCDA (10,12-pentacosadiynoic acid), and the MPEG-conjugated polydiacetylene derivative is MPEG-conjugated PCDA, and the structure of the liposome is that the hydrophobic portions of the PCDA are in contact with each other inside the membrane and are hydrophilic. Liposomes for detecting biomaterials, characterized in that a spherical PCDA bilayer whose parts are located in the outer membrane and the inner membrane is a basic skeleton, and a PCDA in which Ni-NTA-DOGS lipids and MPEG are bonded is inserted between the outer membranes. .
상기 삽입된 Ni-NTA-DOGS 지질 및 MPEG가 접합된 PCDA의 몰 비는 각각 1몰(mol)% 인 것을 특징으로 하는 생체물질 검출용 리포좀.The method of claim 2,
The molar ratio of the inserted Ni-NTA-DOGS lipid and MPEG-conjugated PCDA is 1 mol (mol)%, respectively.
상기 생체물질은 히스티딘 표지(histidine tag) 또는 이미다졸(imidazole)을 포함하는 단백질인 것을 특징으로 하는 리포좀.4. The method according to any one of claims 1 to 3,
The biomaterial is a liposome, characterized in that the protein containing a histidine tag or imidazole.
PDA 또는 그 유도체, Ni-NTA DOGS 지질, 및 MPEG-PDA 또는 그 유도체를 유기용매에 녹이는 단계;
상기 유기용매를 휘발시키는 단계;
증류수를 더하고 수조(water bath)에서 가열하는 단계; 및
초음파분해(sonication)를 시킨 뒤 여과하는 단계를 포함하는, 생체물질 검출용 리포좀의 제조방법.In a method for producing a liposome for detecting a biological material comprising a polydiacetylene (PDA) or a derivative thereof as a backbone, and a poly-diacetylene (MPEG-PDA) or a derivative conjugated with Ni-NTA-DOGS lipid and MPEG In
Dissolving PDA or derivatives thereof, Ni-NTA DOGS lipids, and MPEG-PDA or derivatives thereof in an organic solvent;
Volatilizing the organic solvent;
Adding distilled water and heating in a water bath; And
Method of producing a liposome for detecting a biological material, comprising the step of sonication and filtration.
상기 Ni-NTA-DOGS 지질, 및 MPEG가 접합된 폴리다이아세틸렌(MPEG-PDA) 또는 그 유도체는 각각 1몰(mol)% 의 몰 비로 첨가되며, 상기 생체물질은 히스티딘 표지(histidine tag) 또는 이미다졸(imidazole) 그룹을 포함하는 것을 특징으로 하는 생체물질 검출용 리포좀의 제조방법.The method of claim 5,
The Ni-NTA-DOGS lipids and MPEG-conjugated polydiacetylene (MPEG-PDA) or derivatives thereof are each added in a molar ratio of 1 mol%, and the biomaterial is either a histidine tag or Method for producing a liposome for detecting a biological material, characterized in that it comprises a dazole (imidazole) group.
상기 바이오센서는 폴리다이아세틸렌 마이크로어레이 센서 칩, 마이크로플루이딕(microfluidic) 센서 칩, 폴리다이아세틸렌 센서가 함유된 초미세 섬유, 및 폴리다이아세틸렌 스트립 센서로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나의 형태인 것을 특징으로 하는 생체물질 검출용 바이오센서.The method of claim 7, wherein
The biosensor is one of a form selected from the group consisting of polydiacetylene microarray sensor chip, microfluidic sensor chip, ultrafine fiber containing polydiacetylene sensor, and polydiacetylene strip sensor. A biosensor for detecting biomaterials.
대상 생체물질을 추출하는 단계;
상기 생체물질을 상기 리포좀과 반응시키는 단계; 및
상기 리포좀의 색 변화 또는 형광 발현 여부를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.In the method for detecting a biomaterial comprising a histidine tag or imidazole using the liposome of any one of claims 1 to 3,
Extracting a target biomaterial;
Reacting the biomaterial with the liposomes; And
Determining whether the liposome has a color change or fluorescence expression.
상기 약물을 상기 리포좀에 부착시키는 단계; 및
상기 리포좀의 색 변화 또는 형광 발현 여부를 검출함으로써 상기 약물의 표적 위치로의 전달을 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.In the method for confirming the delivery of a drug containing a histidine or imidazole group using the liposome of any one of claims 1 to 3,
Attaching the drug to the liposomes; And
Confirming delivery of the drug to a target location by detecting the color change or fluorescence expression of the liposome.
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