KR20130005900A

KR20130005900A - Ｐｒｘ3 를 표적으로 하는 스트레스 장애 치료제 및 이의 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR20130005900A
Application number: KR1020110067571A
Authority: KR
Inventors: 한평림; 서지선
Original assignee: 이화여자대학교 산학협력단
Priority date: 2011-07-07
Filing date: 2011-07-07
Publication date: 2013-01-16
Also published as: KR101352932B1

Abstract

본 발명은 스트레스 민감 반응 완화제의 제조방법, 스트레스 민감 반응 완화제를 함유하는 스트레스 개선용 식품 또는 사료, 이의 제조방법, 스트레스 민감 반응 완화제의 스크리닝 방법, 스트레스 장애의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물, 이의 제조방법, 스트레스 장애의 예방 또는 치료방법, 스트레스 감소 또는 완화, 또는 스트레스 장애의 예방 또는 개선용 식품 조성물, 및 스트레스 민감 반응 또는 만성 스트레스로 인해 발생하는 스트레스 장애 진단을 위한 정보제공방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, PRX3 또는 TRX2 유전자에서 히스톤의 탈아세틸화를 억제하여 PRX3 또는 TRX2 유전자 발현 감소를 억제시키는 기전을 이용한 약물들을 개발할 수 있으며, 본 발명의 방법으로 스크리닝된 약물들은 스트레스, 특히, 만성 스트레스에 의해 그 증상이 촉발되거나 악화될수 있는 우울증, 퇴행성 뇌질환 등을 예방 또는 치료할 수 있다.

Description

ＰＲＸ3 를 표적으로 하는 스트레스 장애 치료제 및 이의 스크리닝 방법{Therapeutic agents targeting PRX3 for stress disorder and method of screening thereof}

본 발명은 스트레스 민감 반응 완화제의 제조방법, 스트레스 민감 반응 완화제를 함유하는 스트레스 개선용 식품 또는 사료, 이의 제조방법, 스트레스 민감 반응 완화제의 스크리닝 방법, 스트레스 장애의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물, 이의 제조방법, 스트레스 장애의 예방 또는 치료방법, 스트레스 감소 또는 완화, 또는 스트레스 장애의 예방 또는 개선용 식품 조성물, 및 스트레스 민감 반응 또는 만성 스트레스로 인해 발생하는 스트레스 장애 진단을 위한 정보제공방법에 관한 것이다.

현대 산업 사회는 구조적으로나 기능적으로 빠르고 복잡하게 변화하고 있다. 뿐만 아니라 개인이 소화하기 어려울 정도의 엄청난 양의 정보가 매일 쏟아지고 있다. 새로운 기술, 새로운 환경에 계속 적응해 나가야 하는 현대인들의 대부분은 많은 신체적·심리적 부담감을 느끼게 된다. 이런 부담감을 일명 스트레스(stress)라 한다.

인간이 내·외적 환경의 자극에 의해 신체적·심리적인 스트레스를 받게 되면 인체는 스트레스에 적응하기 위해 뇌에서 청반 노르에피네프린(LC-NE: locus ceruleus norepinephrine)과 부신피질 자극 호르몬 유리 호르몬(CRH: corticotropin releasing hormone)을 분비한다. LC-NE는 교감 신경계를 활성화시키고 부교감 신경계의 작용을 억제하여 혈압, 심박동, 호흡을 증가시키며, 기관지를 확장시킬 뿐 아니라 피부에 소름이 끼치면서 털이 일어나는 발한 작용을 증가시킨다. 시상하부에서 분비된 CRH는 뇌하수체 전엽으로부터 부신피질 자극 호르몬 (Adrenocorticotropic hormone: ACTH)을 일반 체순환으로 방출한다. 이 ACTH가 혈액을 따라 옮겨가서 부신피질의 ACTH 수용체에 결합하게 되면, cAMP라고 불리는 2차 신호전달자를 합성하게 된다. cAMP에 의해 활성화된 단백질 인산화 효소 PKA(protein kinase A)는 미토콘드리아에 위치한 글루코코르티코이드(Glucocorticoid) 합성 단백질을 활성화시킨다. 그러면 글루코코르티코이드 합성 단백질이 콜레스테롤을 이용하여 스트레스 호르몬들을 만들어 낸다. 코르티졸(cortisol), 코르티코스테론(corticosterone), 코르티손(cortisone)등이 대표적인 글루코코르티코이드의 예이다. CRH-ACTH-글루코코르티코이드까지 연결되는 스트레스 경로를 일반적으로 시상하부-뇌하수체-부신(Hypothalamus-Pituitary gland-Adrenal gland: HPA) 축이라고 한다. 글루코코르티코이드는 간에서 포도당 신합성(gluconeogenesis)과 글리코겐의 저장, 혈당치 상승 등의 탄수화물대사조절을 한다. 그밖에 글루코코르티코이드는 면역을 담당하는 면역세포의 각종 면역물질 생성 유전자의 발현을 억제함으로써 항염증 작용을 한다. 또한 혈액 내 이 호르몬 함량이 높아지면 음성 피드백(negative feedback)으로 뇌하수체에 작용하여 ACTH 분비를 억제한다.

신체가 허용할 수 있는 수준의 스트레스는 우리 몸의 적절한 자극제로 작용을 하게 되지만, 허용 범위를 벗어난 강하고도 지속적으로 가해지는 심리적 육체적 스트레스는 글루코코르티코이드를 장시간 동안 과량 분비하게 유도한다. 이렇게 장기간 과량 분비되는 글루코코르티코이드는 몸의 면역력을 떨어뜨리게 되므로, 외부 감염에 의한 저항성을 떨어뜨리게 되고, 우리몸에 다양한 질병을 유발하게 된다. 면역력 감퇴뿐만 아니라 특별히 뇌세포 손상 및 재생을 억제하여 불면증, 무기력증, 기억력 감퇴, 우울증 유발은 물론 자살 충동까지 일으킨다.

한편, 우울증은 조울증과 함께 기분장애의 한 종류로 분류되며, 침체된 기분, 무쾌감증, 수면장애, 비사교성, 피로 및 집중력 저하 (DSM-IV-TR)를 포함한 심리적이고 육체적인 증상을 갖는 정신질환의 가장 일반적인 형태 중 하나이다. 우울증은 평생 유병율이 15%, 특히 여자에서는 25% 정도에 이르며, 감정, 생각, 신체 상태, 그리고 행동 등에 변화를 일으키는 심각한 질환이다. 세계보건기구(WHO)는 2020년에 이르면 우울증이 모든 연령에서 나타나는 질환 중 1위를 차지할 것으로 내다보고 있다. 또한, 우울증은 자살로 이어지는 경우가 적지 않아, 만약 우울증이 2020년 '미래 질병 1위'로 급상한다면 암과 같은 육체적 질병으로 인한 사망률보다 우울증에 의한 사망률이 더 높아질 수 있을 것이라고 하였으나, 우울증의 정확한 병태생리는 밝혀지지 않았다.

우울증의 주된 원인으로는 호르몬의 불균형을 주목하고 있는데 그중에서도 ‘세로토닌’을 주된 원인으로 보고 있다. 세로토닌은 뇌척수액에서 발견되는 신경대사물질로, 부족하면 근심, 걱정이 많아지고 충동적인 성향이 나타난다. 따라서 우울증 치료제는 세로토닌의 작용과 관련이 많다.

현재 임상에서 사용하는 항우울제는 대부분 신경 시냅스 부위에서 모노 아민계 신경전달물질의 약리작용을 증가시키는 특성을 갖는 약물(SSRI, SNRI, SDRI, TCAs, MAOIs 계열 등)들이다. 이들 약물의 경우 환자에 따라 항우울 효과가 분명하게 나타나기도 하지만 역설적이게도 신경과학적 관점에서 이들의 약효는 대체로 2-3 주 이상 장기 투여시 나타나는 점을 고려하면 그 약리작용 기전이 불분명하다. 상기 약물들의 경우, 항염증제와 함께 투여할 경우, 항염증제제와 반응하여 항우울제 효과가 감소될 수 있다는 보고가 있다. 또한, 상기 약물들은 구토, 성욕 감소, 불면, 피로, 비만, 자살 충동 등의 부작용이 발생할 수 있으며, 우울증 환자의 30%의 경우에는 현재 사용 중인 약물이 전혀 효과가 없는 한계를 가지고 있다.

모노 아민계 신경전달물질의 약리 작용을 증가시켜 우울증을 치료하는 기존의 치료제에서는 상기 살펴본 바와 같이 부작용이 다수 발생하고 있으며, 그 치료 효과에도 한계가 발생하는 바, 이와는 다른 새로운 기전의 우울증 치료 및 이에 기반을 둔 약물을 포함하는 치료 시스템의 개발이 절실히 요구된다.

이에 본 발명자들은, 만성 스트레스를 받은 동물 모델 또는 스트레스 호르몬을 투여한 신경세포에서, 미토콘드리아 또는 혈액에 존재하는 PRX3 또는 TRX2 유전자의 발현이 스트레스를 받지 않은 대조군에 비해 지속적으로 감소되어 나타나고, 상기 PRX3 또는 TRX2 유전자 발현이 후성유전학적(epigenetic)으로 조절되며 특히, 히스톤 아세틸레이션이 감소됨으로써 PRX3 또는 TRX2의 발현이 감소된다는 점을 확인하여, 이를 바탕으로 PRX3 또는 TRX2를 타겟으로 하는 스트레스 민감 반응 완화제를 스크리닝 할 수 있고, PRX3, TRX2, PRX3 또는 TRX2의 발현을 촉진할 수 있는 물질을 사용하여 스트레스 장애 예방 또는 치료할 수 있다는 점을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 스트레스 민감 반응 완화제의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 스트레스 개선용 식품 또는 사료, 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 스트레스 민감 반응 완화제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 스트레스 장애의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물, 이의 제조방법, 및 스트레스 장애의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 스트레스 감소 또는 완화, 또는 스트레스 장애의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 스트레스 민감 반응 또는 만성 스트레스로 인해 발생하는 스트레스 장애 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위해, 하나의 양태로서 본 발명은 (1) 스트레스 민감 반응 완화제를 대량생산하는 단계; 및 (2) 상기 생산된 스트레스 민감 반응 완화제 중 일부를 추출하여, PRX3(Peroxiredoxin3) 또는 TRX2(thioredoxin 2)의 발현, 활성, 기능 중 하나 이상을 증진하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 스트레스 민감 반응 완화제의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 (1) 시험물질이 PRX3 또는 TRX2의 발현, 활성, 기능 중 하나 이상을 증진하는지 여부를 확인하는 단계; 및 (2) 상기 단계에서 PRX3 또는 TRX2의 발현, 활성, 기능 중 하나 이상을 증진하는 것으로 확인된 시험물질을 대량생산하는 단계를 포함하는, 스트레스 민감 반응 완화제의 제조방법을 제공한다.

다른 양태로서, 본 발명은 PRX3 또는 TRX2의 발현, 활성, 기능 중 하나 이상을 증진시키는 특성을 나타내는 스트레스 민감 반응 완화제를 함유하는 스트레스 개선용 식품 또는 사료를 제공한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 스트레스 개선용 식품 또는 사료가 PRX3 또는 TRX2의 발현, 활성, 기능 중 하나 이상을 증진시키는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 것이 특징인 스트레스 개선용 식품 또는 사료의 제조방법을 제공한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 (1) 세포를 준비하여 PRX3 또는 TRX2의 mRNA 또는 단백질의 발현을 감소시키는 제1단계; (2) 시험물질을 상기 세포에 접촉시키는 제2단계; 및 (3) 상기 시험물질을 접촉시킨 세포에서의 PRX3 또는 TRX2의 mRNA 또는 단백질의 발현량과 시험물질을 접촉시키지 않은 세포에서의 PRX3 또는 TRX2의 mRNA 또는 단백질의 발현량을 비교하는 제3단계를 포함하는, 스트레스 민감 반응 완화제의 스크리닝 방법을 제공한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 PRX3, TRX2, PRX3의 발현 증진제, TRX2의 발현 증진제, PRX3의 활성제, 및 TRX2의 활성제로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질을 유효성분으로 포함하는, 스트레스 장애의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 스트레스 장애의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 또는 이의 유효성분이 PRX3 또는 TRX2의 발현, 활성 및 기능 중 하나 이상을 증진하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 것이 특징인 스트레스 장애의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물의 제조방법을 제공한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 PRX3, TRX2, PRX3의 발현 증진제, TRX2의 발현 증진제, PRX3의 활성제, 및 TRX2의 활성제로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질을 인간을 제외한 개체에 투여하여 스트레스 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 PRX3, TRX2, PRX3의 발현 증진제, TRX2의 발현 증진제, PRX3의 활성제, 및 TRX2의 활성제로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질을 포함하는, 스트레스 감소 또는 완화, 또는 스트레스 장애의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 개체로부터 분리된 생체 시료의 PRX3 또는 TRX2의 발현 레벨을 측정하는 단계를 포함하는, 스트레스 민감 반응 또는 만성 스트레스로 인해 발생하는 스트레스 장애 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 자세히 설명한다.

본 발명은 (1) 스트레스 민감 반응 완화제를 대량생산하는 단계; 및 (2) 상기 생산된 스트레스 민감 반응 완화제 중 일부를 추출하여, PRX3(Peroxiredoxin3) 또는 TRX2(thioredoxin 2)의 발현, 활성, 기능 중 하나 이상을 증진하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 스트레스 민감 반응 완화제의 제조방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 (1) 시험물질이 PRX3 또는 TRX2의 발현, 활성, 기능 중 하나 이상을 증진하는지 여부를 확인하는 단계; 및 (2) 상기 단계에서 PRX3 또는 TRX2의 발현, 활성, 기능 중 하나 이상을 증진하는 것으로 확인된 시험물질을 대량생산하는 단계를 포함하는, 스트레스 민감 반응 완화제의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 퍼오시레독신 3(peroxyredoxin 3; PRX3)는 항산화 효소의 일종으로, 동형이합체(homodimer) 형태로 존재하고, 활성산소를 제거할 때 Prx의 활성부위에 있는 시스테인은 Cys51-SOH로 산화되며, 곧 다른 서브유닛의 Cys172-SH와 이황화결합을 형성하는 특징을 가진다. 본 발명에서 PRX3은 그 생물학적 동등체, 유도체, 및 유사체도 포함하는 의미이며, NCBI Accession No. 가 마우스; NM_007452.2, 사람; NM_006793.2인 것이 바람직하다.

본 발명의 티오레독신 2 (thioredoxin 2; TRX2)는 미토콘드리아에 특이적으로 존재하는, 세포 내 산화환원 균형을 조절하는 단백질을 의미한다. 본 발명에서 TRX2는 그 생물학적 동등체, 유도체, 및 유사체도 포함하는 의미이며, NCBI Accession No.가 마우스; NM_019913.5, 사람; NM_006440.3인 것이 바람직하다.

본 발명에서 용어, "스트레스 민감 반응"은 스트레스에 의해 발생할 수 있는 반응을 의미하며, 예를 들어서, 스트레스에 의해 청반 노르에피네프린(LC-NE: locus ceruleus norepinephrine) 또는 부신피질 자극 호르몬 유리 호르몬(CRH: corticotropin releasing hormone)이 분비되어 직접 또는 간접적으로 발생되는 반응 또는 스트레스에 의해 분비된 글루코코르티코이드(glucocorticoid) 호르몬에 의해 직접 또는 간접적으로 발생되는 반응을 의미한다. 또한, 스트레스로 인해서 최종적으로 발생할 수 있는 질환인, 우울증, 불안증, 공포기억, 정신적 공황, 강박장애, 외상후 스트레스 장애, 정신분열증, 스트레스로 인한 두통, 신경변성 질병, 피로 증후군, 식사장애, 신경성 식욕부진, 위염, 위궤양, 알츠하이머성 치매, 파킨슨병, 뇌졸중 또는 ALS이 발생되기 전에 나타나는, 상기 질환에 도달하기 전에 나타나는 스트레스 관련 반응을 포함한다.

상기 "스트레스 민감 반응 완화제"는 상기 설명한 "스트레스 민감 반응"을 감소시키고 완화시킬 수 있는 물질을 의미하며, 항스트레스제로 통칭될 수도 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 반복적으로 주어지는 만성 스트레스가 우울증 및 불안증을 유발하고, 뇌신경 세포에 다량의 산화성 스트레스를 축적하고, 미토콘드리아의 기능저하를 유발함을 확인하였으며, 상기의 증상의 원인이 스트레스에 의한 PRX3 또는 TRX2의 발현 억제라는 분자기전을 처음으로 규명하였다(실시예 1 내지 7).

또한, 마우스에 지속적인 스트레스를 가했을 때 뇌의 지질과산화가 시간에 따라 축적되는 것을 확인하였고, 만성적 스트레스에 따라 PRX3 또는 TRX2의 발현이 감소되고 만성적 스트레스 처리 후 재스트레스를 주었을 때에는 PRX3 또는 TRX2의 발현이 더 감소되는 것을 확인하였으며, PRX3의 발현을 증진시키는 물질을 처리한 경우 만성적 스트레스에 의한 우울증적 행동이 사라진 것을 확인하였다. 이를 바탕으로 본 발명은 스트레스에 의해 발생하는 반응, 또는 스트레스가 점차 축적됨으로써 유도되는 스트레스 장애가 발생하기 전 단계에서, PRX3 또는 TRX2의 발현, 기능, 또는 활성을 증진시킴으로써 스트레스 민감 반응을 완화시키고, 더 나아가 스트레스 장애의 발생을 미리 예방할 수 있을 뿐만 아니라, PRX3 또는 TRX2의 발현, 기능, 또는 활성을 증진시키는 여부를 확인하는 단계를 포함하여 스트레스 민감 반응 완화제를 제조할 수 있다.

본 발명은 스트레스 민감 반응 완화제를 대량생산한 후, 대량생산된 스트레스 민감 반응 완화제 중 일부를 추출하여, PRX3 또는 TRX2의 발현, 활성, 기능 중 하나 이상을 증진하는지 여부를 확인하는, 즉, 상기 완화제가 스트레스 민감 반응을 완화시킬 수 있는 기능을 가지고 있는지를 확인하는 단계를 수행함으로써, 스트레스 민감 반응 완화제를 제조할 수 있다. 또는, 본 발명은 PRX3 또는 TRX2의 발현, 활성, 기능 중 하나 이상을 증진하는 것으로 확인된 시험물질을 선별하고, 이를 대량생산함으로써, 스트레스 민감 반응 완화제를 제조할 수 있다.

본 발명에서 "시험물질" 은 PRX3 또는 TRX2의 발현 감소를 억제시킬 수 있는 물질, 즉, 감소된 PRX3 또는 TRX2의 발현을 증가시킬 수 있을 것으로 기대되는 물질로, 천연 화합물, 합성 화합물, 저분자량 화합물, 고분자량 화합물, 핵산 분자(예컨대, DNA, RNA, PNA 및 앱타머), 단백질, 당, 박테리아 또는 진균의 대사산물, 생활성 분자 및 지질 등을 포함하나 이로 한정되는 것은 아니다. 시험물질의 양은 사용하는 구체적인 실험방법 및 시험물질의 종류에 따라 달라지며, 당업자라면 적절한 양을 선택할 수 있을 것이다.

본 발명에서 PRX3 또는 TRX2의 발현, 활성, 기능 중 하나 이상을 증진하는지 여부는 이에 제한되지는 않으나, PRX3 또는 TRX2의 발현량을 측정하여 판단할 수 있다. PRX3 또는 TRX2 mRNA의 발현량 측정은 RT-PCR, 정량적 또는 반정량적 RT-PCR(Quentitative or semi-Quentitative RT-PCR), 정량적 또는 반정량적 리얼 타임 PCR(Quentitative or semi-Quentitative real-time PCR), 노던 블롯(northern blot) 및 DNA 또는 RNA 칩(chip)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법을 이용하여 측정될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, PRX3 또는 TRX2 단백질의 발현량 측정은 웨스턴 블롯, 조직면역염색법, 조직형광염색법으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법을 이용하여 측정될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

다른 양태로서, 본 발명은 PRX3 또는 TRX2의 발현, 활성, 기능 중 하나 이상을 증진시키는 특성을 나타내는 스트레스 민감 반응 완화제를 함유하는 스트레스 개선용 식품 또는 사료에 관한 것이다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 스트레스 개선용 식품 또는 사료가 PRX3 또는 TRX2의 발현, 활성, 기능 중 하나 이상을 증진시키는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 것이 특징인 스트레스 개선용 식품 또는 사료의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 일 실시 예에서는 만성적 스트레스를 가한 마우스의 뇌의 미토콘드리아에서 ROS 생성이 증가되고, 우울증적 행동이 나타나는 것을 확인하였고, 스트레스 호르몬인 글루코코르티코이드를 처리한 인간 뉴로블라스토마 세포주에서 ROS 생성이 증가되는 것을 확인하였으며, 상기 마우스 및 세포주에서 PRX3 또는 TRX2의 mRNA 및 단백질 수준에서 발현이 감소되고, 정상 마우스 및 정상 세포주에 PRX3의 shRNA을 처리한 결과, 우울증적 행동 및 ROS 생성이 증가되는 것을 확인하였다. 또한, PRX3의 발현을 촉진시키는 물질을 첨가한 결과, 우울증적 행동이 감소되는 것을 확인하였다.

상기 실험 내용을 바탕으로, 본 발명은 PRX3 또는 TRX2의 발현, 활성, 기능 중 하나 이상을 증진시키는 특성을 나타내는 스트레스 민감 반응 완화제를 함유하는 스트레스 개선용 식품 또는 사료를 제공하는 것이다. 상기 스트레스 개선용 식품 또는 사료는 스트레스에 의해 발생하는 반응, 또는 반복적인 스트레스로 인해 유도되는 스트레스 장애가 발생하기 전에 나타나는 증상을 개선시킬 수 있다. 상기 스트레스 민감 반응 완화제는 PRX3 또는 TRX2의 발현, 활성, 기능 중 하나 이상을 증진시키는 특성을 나타내는 물질이라면 화합물, 천연물, 신규 단백질 등 그 종류가 제한되지 않는다. 상기 PRX3 또는 TRX2의 발현 증진제에는, PRX3 또는 TRX2의 발현 감소 억제제 또는 발현이 감소된 PRX3 또는 TRX2의 발현을 증진시키는 물질도 포함한다. 또한, 상기 PRX3 또는 TRX2의 활성제에는, PRX3 또는 TRX2의 활성 감소 억제제 또는 활성이 감소된 PRX3 또는 TRX2의 활성을 증진시키는 물질도 포함된다. 상기, PRX3 또는 TRX2의 mRNA 또는 단백질의 발현을 증진시킬 수 있는 물질 또는 PRX3 또는 TRX2의 활성을 촉진시킬 수 있는 물질은 바람직하게는 각종 항산화제, 설피레독신(sulfiredoxin), FOXO3a(Forkhead box O3a), PGC-1α(Peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator 1α), 아포사이닌(apocynin), 또는 p47phox 작용 억제 물질 예를 들어, p47phox-siRNA 등이나, 이에 제한되지는 않는다.

또한, 본 발명의 일 실시예에서는 PRX3 또는 TRX2의 발현 감소가 히스톤 아세틸레이션이 감소, 히스톤 이메틸레이션이 증가됨에 따라 일어나는 것을 확인하였으며, 히스톤 탈아세틸레이션을 억제시킬 수 있는 물질인 SAHA(suberoylanilide hydroxamic acid)를 처리한 결과, 감소되었던 PRX3의 발현이 증가되어 스트레스 민감 반응 완화제로 사용할 수 있음을 확인하였다(실시예 9). 상기 실험 내용을 바탕으로 본 발명의 스트레스 민감 반응 완화제는 히스톤 탈아세틸레이즈(deacetylases)의 억제제인 것이 바람직하며, 그 종류로는 TSA(trichostatin A), NaBu(sodium butyrate), VAP(valproic acid), SAHA이며, 바람직하게는, 상기 히스톤 탈아세틸레이즈의 억제제는 SAHA이다.

상기 식품 또는 사료에 함유되는 스트레스 민감 반응 완화제는 상기 설명한 스트레스 민감 반응 완화제의 제조방법에 의해 제조된 것이 바람직하다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다. 본 발명의 건강음료는 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g 이다.

상기 외에 본 발명의 식품에는 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 식품 100 중량부 당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다. 그밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 과육의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 ~ 10 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다. 이들 성분들은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

본 발명에서 상기 사료는 영양가, 주성분, 유통, 수분 함량 배합상태 및 가공형태 등에 따라 여러 가지로 분류할 수 있으며, 상기 사료는 조사료, 농후사료, 보충사료, 단백질사료, 녹말사료, 지방질사료 또는 섬유질사료가 사용가능하나, 이에 한정하지 않으며, 사료첨가제도 포함하는 개념이다. 또한 상기 사료에는 추가적으로 가금류 및 가축 등에 허용되는 담체를 함유할 수 있다. 본 발명에 있어서는 상기 사료를 그대로 또는 공지의 담체, 안정제 등을 가할 수 있으며, 필요에 따라 비타민, 아미노산류, 미네랄 등의 각종 양분, 항산화제, 항생물질, 항균제 및 기타의 첨가제 등을 가할 수도 있으며, 그 형상으로서는 분체, 과립, 펠릿, 현탁액 등의 적당한 상태일 수 있다. 본 발명의 사료를 공급하는 경우는 가금류 및 가축 등에 대하여 단독 또는 사료에 혼합하여 공급할 수 있으며, 상기 사료는 가금류 및 가축 등이 받은 스트레스를 감소시킬 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 (1) 세포를 준비하여 PRX3 또는 TRX2의 mRNA 또는 단백질의 발현을 감소시키는 제1단계; (2) 시험물질을 상기 세포에 접촉시키는 제2단계; 및 (3) 상기 시험물질을 접촉시킨 세포에서의 PRX3 또는 TRX2의 mRNA 또는 단백질의 발현량과 시험물질을 접촉시키지 않은 세포에서의 PRX3 또는 TRX2의 mRNA 또는 단백질의 발현량을 비교하는 제3단계를 포함하는, 스트레스 민감 반응 완화제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

본 발명에서는 반복적으로 주어지는 만성 스트레스가 우울증 및 불안증을 유발함을 확인하였으며, 뇌신경 세포에 다량의 산화성 스트레스가 축적되고 심한 미토콘드리아의 기능저하를 유발하는 원인이 스트레스에 의한 PRX3 또는 TRX2의 발현 억제라는 분자기전을 처음으로 규명하였다(실시예 1 내지 7). 특히, 본 발명은 PRX3 또는 TRX2의 히스톤 아세틸레이션이 만성적 스트레스에 의해 감소됨을 확인함으로써, 이와 같은 후성학적 변형이 PRX3 또는 TRX2의 발현을 억제하여 우울증 유사 행동이 나타남을 확인하였다(실시예 8 및 9). 이러한 관점에서 본 발명은 PRX3 또는 TRX2의 발현 억제를 제어하는 스트레스 민감 반응 완화제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 스크리닝 방법에서, 상기 제1단계의 세포를 준비하여 PRX3 또는 TRX2의 mRNA 또는 단백질의 발현을 감소시키는 단계는, PRX3 또는 TRX2의 전사체 또는 전사체의 단백질 합성을 특이적으로 억제할 수 있는 siRNA(small interfering RNA), shRNA(small hairpin RNA) 또는 miRNA(micro RNA)을 사용하여 발현을 억제할 수 있다. 또는, 세포에 스트레스 호르몬인 글루코코르티코이드(glucocorticoid)를 처리하여 세포의 PRX3 또는 TRX2의 mRNA 또는 단백질의 발현을 감소시킬 수 있다.

또한, 상기 제1단계에서 사용되는 세포는 신경세포의 특성을 갖는 다양한 세포주가 사용될 수 있으며, 예를 들면, SH-SY5Y(인간 뉴로블라스토마 세포주), HT22(마우스 해마 세포주)가 사용될 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니며, 비신경세포주인 A549(인간 폐 아데노카시노마 상피 세포주), KEK 293(인간 배아신장 유래 세포주)가 사용될 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는 SH-SY5Y 인간 뉴로블라스토마 세포에서 글루코코르티코이드를 처리한 결과, ROS의 생성이 증가되고, 미토콘드리아의 기능이 저하되며, PRX3과 TRX2의 발현이 저하되는 것을 전사적 수준 및 단백질 수준에서 확인하였다(실시예 4 및 7).

또한, 상기 제1단계에서 사용되는 세포는 실험동물의 형태로 제공될 수 있으며, 이 경우 본 발명의 스크리닝 방법은 상기 실험동물에게 만성적 및/또는 지속적 스트레스를 가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 실험동물은 래트, 마우스, 초파리, 꼬마선충을 예로 들수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

본원에서 사용하는 용어“만성(적) 스트레스 또는 지속적 스트레스”란 중장기적인 기간 동안 스트레스가 반복적으로 주어질 경우 그 영향으로 지속적인 신경적 및 정신적 뇌손상을 유발하는 신체 생리 반응 및 그 결과를 지칭하는 것이다.

상기 제1단계에서 실험동물에게 만성적 또는 지속적 스트레스를 주는 방법은 이에 제한되는 것은 아니나, 마우스나 래트의 경우, 전기충격 처치, 공격적 마우스에 노출, 저온보관, 강제수영, 음식/물 박탈, 고음의 소리 및 강한 점멸성 빛 노출, 수면박탈, 일주기성 교란, 포르말린, 기타 약물을 이용한 화학적/ 통증 스트레스 처치, LPS 포함 미생물의 감염 처치, 고립, 감금 등이 가능하다. 본 발명의 일 실시예에서는 2시간씩 마우스를 감금시키는 스트레스를 14일간 가한 경우, 우울증적 행동이 증가되고, 마우스 뇌의 미토콘드리아 내 ROS 레벨이 증가되고, 미토콘드리아에서 PRX3과 TRX2의 발현이 전사적 수준 및 단백질 수준에서 감소됨을 확인할 수 있었다(실시예 1 내지 3 및 실시예 5).

상기 제2단계는 시험물질을 PRX3 또는 TRX2의 mRNA 또는 단백질의 발현이 감소된 세포에 접촉시키는 단계이다. 세포주를 사용하는 경우, 시험물질과의 접촉은 시험물질을 세포 배양 배지에 추가한 후 세포를 일정 시간 배양하는 것을 의미한다. 또는 상기 세포가 실험동물로 형태로 제공될 때, 시험물질과의 접촉은 비경구 또는 경구 투여, 정위주사를 포함하는 이로 제한되는 것은 아니며, 당업자라면 시험물질을 동물에게 테스트하기 위해 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이다.

본 발명의 상기 제3단계에서는 시험물질을 접촉시킨 세포에서의 PRX3 또는 TRX2의 mRNA 또는 단백질의 발현량과 시험물질을 접촉시키지 않은 세포에서의 PRX3 또는 TRX2의 발현량을 비교하는 단계를 포함한다.

상기 단계 3)의 PRX3 또는 TRX2 mRNA의 발현량 측정은 RT-PCR, 정량적 또는 반정량적 RT-PCR(Quentitative or semi-Quentitative RT-PCR), 정량적 또는 반정량적 리얼 타임 PCR(Quentitative or semi-Quentitative real-time PCR), 노던 블롯(northern blot) 및 DNA 또는 RNA 칩(chip)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법을 이용하여 측정될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 단계 3)의 PRX3 또는 TRX2 단백질의 발현량 측정은 웨스턴 블롯, 조직면역염색법, 조직형광염색법으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법을 이용하여 측정될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 방법에서는 시험물질을 접촉시킨 세포에서의 PRX3 또는 TRX2의 발현량이 시험물질을 접촉시키지 않은 세포에서의 PRX3 또는 TRX2 발현량보다 높은 시험물질을 스트레스 민감 반응 완화제로 선별하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 글루코코르티코이드 또는 만성적 스트레스 처리에 따라 PRX3과 TRX2의 발현이 감소되는 분자적 기전이 PRX3와 TRX2 유전자의 후성학적 변화에 의한 것임을 새롭게 밝혀냈다. 특히, PRX3과 TRX2 유전자의 아세틸화가 만성 스트레스 후 대조군에 비해 반으로 감소되었으며, 전전두엽 피질 내의 PRX3 유전자에서 H4 아세틸화는 대조군에 비해 68%로 감소되었고, PRX3 유전자에서 H3 이메틸화는 만성 스트레스 후 대조군에 비해 2.8배로 증가하였으며, PRX3 유전자에서 HDAC5 결합은 만성 스트레스 후 대조군에 비해 거의 3배로 증가하였음을 염색질 면역침전 (ChIP) 분석으로 확인하였다. 즉, 만성 스트레스로 인해 PRX3와 TRX2 유전자의 히스톤 아세틸레이션이 감소됨에 따라, PRX3와 TRX2 유전자의 mRNA 발현 및 단백질의 발현이 감소됨을 확인할 수 있었다.

상기 실험 내용을 바탕으로, 본 발명의 스크리닝 방법에서 시험물질은 히스톤의 아세틸레이션을 촉진시키는 물질, 히스톤의 탈아세틸레이션을 억제시키는 물질 또는 히스톤의 이메틸레이션을 억제시키는 물질이 바람직하며, 특히, 히스톤 H3의 아세틸레이션을 촉진시키는 물질, 히스톤 H3의 탈아세틸레이션 또는 이메틸레이션을 억제시키는 물질이 바람직하다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 PRX3, TRX2, PRX3의 발현 증진제, TRX2의 발현 증진제, PRX3의 활성제, 및 TRX2의 활성제로 구성된 군으로부터 선택된 1 이상의 물질을 유효성분으로 포함하는, 스트레스 장애의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

또 다른 양태로서, 본 발명에 따른 스트레스 장애의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물은 스트레스 장애의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 또는 이의 유효성분이 PRX3 또는 TRX2의 발현, 활성 및 기능 중 하나 이상을 증진하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하여 제조될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 PRX3, TRX2, PRX3의 발현 증진제, TRX2의 발현 증진제, PRX3의 활성제, 및 TRX2의 활성제로 구성된 군으로부터 선택된 1이상의 물질을 개체에 투여함으로써, 스트레스 장애를 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 일 실시에에서는 마우스에 지속적인 스트레스를 가했을 때 뇌의 지질과산화가 시간에 따라 축적되는 것을 확인하였고, 만성적 스트레스에 따라 PRX3 또는 TRX2의 발현이 감소되고 만성적 스트레스 처리 후 재스트레스를 주었을 때에는 PRX3 또는 TRX2의 발현이 더 감소되는 것을 확인하였으며, PRX3의 발현을 증진시키는 물질을 처리한 경우 만성적 스트레스에 의한 우울증적 행동이 사라진 것을 확인하였다. 즉, 우울증적 행동 등의 스트레스 장애가 발생하기 전 단계에서 상기 장애을 예방할 수 있고, 이미 스트레스 장애가 발생한 경우 PRX3 또는 TRX2의 발현을 증진시킴으로써 스트레스 장애를 치료할 수 있다.

상기 조성물의 유효성분으로서, PRX3 또는 TRX2의 mRNA 또는 단백질의 발현을 증진시킬 수 있는 물질 또는 PRX3 또는 TRX2의 활성을 촉진시킬 수 있는 물질이라면 화합물, 천연물, 신규 단백질 등 그 종류가 제한되지 않는다. 상기 PRX3 또는 TRX2의 발현 증진제에는, PRX3 또는 TRX2의 발현 감소 억제제 또는 발현이 감소된 PRX3 또는 TRX2의 발현을 증진시키는 물질도 포함한다. 또한, 상기 PRX3 또는 TRX2의 활성제에는, PRX3 또는 TRX2의 활성 감소 억제제 또는 활성이 감소된 PRX3 또는 TRX2의 활성을 증진시키는 물질도 포함된다. 상기, PRX3 또는 TRX2의 mRNA 또는 단백질의 발현을 증진시킬 수 있는 물질 또는 PRX3 또는 TRX2의 활성을 촉진시킬 수 있는 물질은 바람직하게는, 각종 항산화제, 설피레독신(sulfiredoxin), FOXO3a, PGC-1α, 아포사이닌(apocynin), 또는 p47phox 작용 억제 물질 예를 들어, p47phox-siRNA 등이나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에서 용어, “예방”이란, 조성물의 투여에 의해 스트레스 관련 질환의 증상을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 또한, 본 발명에서 용어, “치료”란, 조성물의 투여에 의해 스트레스 관련 질환의 증상이 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

상기 스트레스 장애는 정신적 및/또는 신체적 만성 스트레스에 의해 증상이 촉발되거나 악화될 수 있는 질환을 의미하며, 구체적으로는 정신적 및/또는 신체적 만성 스트레스로 인한, 우울증, 불안증, 공포기억, 정신적 공황, 강박장애, 외상후 스트레스 장애, 정신분열증, 스트레스로 인한 두통, 신경변성 질병, 피로 증후군, 식사장애, 신경성 식욕부진, 위염, 위궤양, 알츠하이머성 치매, 파킨슨병, 뇌졸중 및 ALS로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 질환이 포함되나, 이로 제한되는 것은 아니다.

본원의 조성물에는 상기 언급한 PRX3, TRX2, PRX3의 발현 증진제, TRX2의 발현 증진제, PRX3의 활성제 및 TRX2의 활성제로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 또는 유효성분의 용해성 및/또는 흡수성을 유지/증가시키는 화합물을 추가로 함유할 수 있다.

또한 본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.

상기 본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 용어 "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본원의 조성물의 투여방법은 특별히 이에 제한되는 것은 아니며, 공지된 PRX3, TRX2, PRX3의 발현 증진제, TRX2의 발현 증진제, PRX3의 활성제, 및 TRX2의 활성제로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질의 투여방법을 적용할 수 있으며, 목적하는 방법에 따라 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여의 경우 피부에 붙이는 패치형, 코/호흡기를 통해 투여할 수 있으며, 신속한 치료효과를 얻기 위하여 정맥내 주사에 의한 투여가 바람직할 수 있다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 매우 다양할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 PRX3, TRX2, PRX3의 발현 증진제, TRX2의 발현 증진제, PRX3의 활성제, 및 TRX2의 활성제로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질을 포함하는, 스트레스 감소 또는 완화, 또는 스트레스 장애의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.

스트레스 장애 및 식품에 관한 설명은 상기 설명한 바와 동일하다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 개체로부터 분리된 생체 시료의 PRX3 또는 TRX2의 발현 레벨을 측정하는 단계를 포함하는, 스트레스 민감 반응 또는 만성 스트레스로 인해 발생하는 스트레스 장애 진단을 위한 정보제공방법에 관한 것이다.

본 발명의 일 실시예에서는 반복적인 스트레스르 받은 마우스의 뇌 뿐만 아니라, 혈액에서도 PRX3 또는 TRX2의 발현이 감소되는 것을 확인하였다(실시예 6). 상기 실험결과를 바탕으로 본 발명은 스트레스 민감 반응 또는 만성 스트레스로 인해 발생하는 스트레스 장애 여부를 진단받고자 하는 개체를 대상으로, PRX3 또는 TRX2의 발현 레벨을 측정하여 스트레스 민감 반응 또는 스트레스 장애 여부를 진단할 수 있다. 상기 진단을 위한 정보제공방법에서는 이에 제한되지는 않으나, 진단받고자 하는 개체의 혈액을 채취하여, 혈액 내의 PRX3 또는 TRX2의 발현 레벨을 확인할 수 있다. 상기 방법에서는 진단받고자 하는 개체의 PRX3 또는 TRX2의 발현 레벨이 스트레스를 받지 않은 개체의 PRX3 또는 TRX2의 발현 레벨에 비해 감소된 경우, 스트레스 민감 반응이 발생하고 있거나, 스트레스 장애 질환으로 진단하는 것이 바람직하다.

본 발명에서는 PRX3 또는 TRX2 유전자에서 히스톤의 탈아세틸화를 억제하여 PRX3 또는 TRX2 유전자 발현 감소를 억제시키는 기전을 이용한 약물들을 개발할 수 있으며, 본 발명의 방법으로 스크리닝된 약물들은 스트레스, 특히 만성 스트레스에 의해 그 증상이 촉발되거나 악화될수 있는 우울증, 퇴행성 뇌질환 등을 예방 또는 치료할 수 있다. 아울러, 스트레스가 축적되면 비가역적인 메카니즘이 진행되나, PRX3의 발현을 잘 조절하면 스트레스 발생기전을 가역적으로 조절할 수 있는 특징을 갖는다.

도 1은 만성적 스트레스가 지속적인 우울증 유사 행동을 초래할 수 있다는 결과를 나타낸 것이다. 1A는 구금 스트레스 및 항우울제 투여 후 행동 시험를 수행하는, 실험 과정을 도식화 한 것이다. 7주령의 수컷 C57BL/6 마우스에 매일 2시간 동안 구금 스트레스를 14일 동안 가하고, 마지막 구금일 다음날부터 식염수 또는 이미프라민 (20 mg/kg/day)을 투여한 후, 일련의 행동 시험을 수행하는 실험 과정을 설명한다. 1B 내지 1E는 29-30일 (스트레스 후 15-16일; B, C)에 그리고 40-41일 (스트레스 후 26-27일; D, E)에 꼬리 매달기 시험 (TST; B, D)과 강제 수영 시험 (FST; C, E)에서 부동 시간을 측정한 결과를 나타낸 것이다(Con, 대조군; RST, 2h-14d 스트레스 처리된 마우스; RST+imi, 2h-14d 스트레스 후 이미프라민 처리된 마우스). 데이터는 평균± 표준오차 (n=16-22)로 표기하였으며, *와 **은 각각 p<0.05와 p<0.01에서 두 그룹간의 유의한 차이를 나타낸다. 일방 ANOVA Newman-Keuls 복수 비교 검정이 사용되었다.
도 2는 구금 스트레스의 길이 및 시간에 따라, 뇌의 ROS 레벨과 심각한 미토콘드리아 기능장애를 증가시킬 수 있다는 결과를 나타낸 것이다. 2A는 구금 스트레를 1, 3, 7, 또는 14일 동안 매일 2시간씩 행해진 그룹 및 2h-14d 구금 처리된 마우스를 1, 3, 또는 7일 동안 2시간씩 재구금시킨 그룹(ReRST 군)으로 나누어 뇌의 지질 과산화 정도를 측정하는 실험과정을 도식화한 것이다. 도 2B는 대조군 및 다양한 기간 동안 구금 스트레스를 가한 그룹, 및 14일동안 구금 스트레스를 준 후 재구금 스트레스를 주지 않은 대조군 및 14일동안 구금 스트레스를 준 후 다양한 기간 동안 재구금 스트레를 준 그룹에서, 마우스 해마의 지질 과산화 정도를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 도 2C 및 2D는 전전두엽 피질 (PFCX; C)과 해마 (HP; D)에서 복합체 I, 복합체 II, 복합체 IV와 구연산 합성효소의 미토콘드리아 대사 활성을 나타낸 것이다. 데이터는 평균± 표준오차 (n=6-8)로 표기되었다. *와 **은 각각 p<0.05와 p<0.01에서 두 그룹간의 유의한 차이를 나타낸다. 일방 ANOVA Newman-Keuls 복수 비교 검정이 사용되었다.
도 3은 SH-SY5Y 세포에서 글루코코르티코이드(GC)가 미토콘드리아의 기능장애를 일으킬 수 있음을 나타낸 것이다. 3A 및 3B 는 투여하는 GC의 용량 및 시간에 의존적으로 ROS 생성과 미토콘드리아의 기능장애가 일어남을 나타낸 것이다. SH-SY5Y 세포에 1-3일간 다양한 용량의 GC (200, 400, 800, 2,000 및 4,000 ng/ml)로 처리한 후, 측정된 MDA (A)와 미토콘드리아 막전위 (MMP) (B) 수준을 나타내었다. MDA와 MMP 수준은 각각 DCF (10 mM)와 JC-1 (1 μg/ml)을 사용하여 측정했다. 각 시료에 대한 값을 초기 대조값에 대한 백분율로 나타내었다. 3C 및 3D는 GC (400 ng/ml)를 처리한 SH-SY5Y 세포에서 ROS 수준 (C)과 MMP 수준 (D)의 시간별로 나타낸 것이다. 또한, 3E는 GC의 농도에 따라, MDA 수준과 MMP 수준을 함께 기록한 결과이다. 데이터는 평균± 표준오차 (n=6)로 표기되었다. *와 **은 각각 p<0.05와 p<0.01에서 두 그룹간의 유의한 차이를 나타낸다. 선택된 쌍의 데이터를 비교하기 위해 양방 ANOVA와 Bonferroni posttests가 사용되었다.
도 4는 반복된 2h-14d 구금 스트레스가 뇌에서 ROS 수준을 조절하는 미토콘드리아 유전자의 발현을 지속적으로 변화시키는 결과를 나타낸 것이다. 4A 및 4B는 대조군과 스트레스 받은 마우스 (2h-14d 구금)의 전전두엽 피질 (A)과 해마 (B)에서, ROS 수준을 조절하는 유전자의 발현에 대한 실시간 qRNA 분석결과를 나타낸 것이다. 상부 패널에 묘사된 바와 같이, 마지막 2h 구금 후 즉시 (RST) 또는 17일 후 (RSTp17d) 재구금시킨 마우스의 뇌 시료를 수집하여 측정하였다. 퍼옥시레독신 1 (peroxyredoxin 1; PRX1), PRX2, PRX3, PRX4, PRX5, PRX6, 티오레독신 1 (thioredoxin 1; TRX1), TRX2, 티오레독신 환원효소 1 (thioredoxin reductase 1; TRXR1), TRXR2, 글루타치온 과산화제 1 (glutathione peroxidase 1; GPX1), GPX2, 글루타치온 환원효소 (glutathione reductase; GSR), 글루타치온 S-전이효소 알파 1 (glutathione S-trasnferase alpha 1; GST a1)의 발현을 스트레스 처리되지 않은 마우스의 것과 비교한 결과를 나타낸 것이다. 데이터는 평균± 표준오차 (n=6-9)로 표기되었다. *와 **은 각각 p<0.05와 p<0.01에서 두 그룹간의 유의한 차이를 나타낸다. 일방 ANOVA Newman-Keuls 복수 비교 검정이 사용되었다.
도 5는 반복된 2h-14d 구금 스트레스가 뇌에서 ROS 수준을 조절하는 미토콘드리아 단백질의 발현을 지속적으로 변화시키는 결과를 나타낸 것이다. 5A 및 5B는 미토콘드리아 막 부분과 미토콘드리아 단백질에서 측정한 웨스턴블롯 결과를 나타낸 것이며, 5C는 그 정량적 수준을 도시한 것이다. 데이터는 평균± 표준오차 (n=4-6)로 표기되었다. **은 p<0.01에서 두 그룹간의 유의한 차이를 나타낸다. Student t- 검정이 사용되었다.
도 6은 반복적인 구금 스트레스를 받은 마우스의 혈액에서 PRX3 및 TRX2의 발현이 하향 조절될 수 있음을 나타낸 것이다. 데이터는 평균표준오차 (n=4-6)로 표현했다. **은 표시된 그룹 사이에 p<0.01에서 유의한 차이를 의미한다(Student t- 검정).
도 7은 GC가 SH-SY5Y 세포에서 PRX3과 TRX2의 발현을 하향 조절시킬 수 있음을 나타낸 것이다. 7A 및 7B는 GC로 조절된 PRX3과 TRX2의 발현 결과를 나타낸 것으로서, PRX3과 TRX2의 발현 수준은 qPCR에 의해 결정하였다. SH-SY5Y 세포를 비타민 C (200 μM) 존재 또는 비존재 하에 GC (400 ng/ml) 또는 과산화수소 (200 μM)로 72시간동안 처리했다. 각 시료에 대한 값은 대조값에 대한 배수로 변환되었다. 데이터는 평균± 표준오차 (n=6-8)로 표기되었다. *와 **은 각각 p<0.05와 p<0.01에서 두 그룹간의 유의한 차이를 나타낸다. 일방 ANOVA Newman-Keuls 복수 비교 검정이 사용되었다.
도 8은 반복된 2h-14d 구금 스트레스는 뇌의 BDNF 프로모터 P1-P5에서 후성적 변형을 야기시킴을 나타낸 것이다. 8A는 2h-14d 스트레스 전과 후의 전전두엽 피질 또는 해마에서 BDNF의 발현 수준을 측정한 결과를 나타낸 것이다. 8B는 사용된 염색질 면역침전 분석(ChIP 분석)의 일반적 실험과정을 나타낸 것이다. 또한, 전전두엽 피질과 해마에서, 5개의 BDNF 프로모터 P1-P5 각각에서 항-AcH3-k9/14 (C, G), 항-AcH4-k5/8/12/16 (D, H), 항-DimeH3-K9 (E, I)와 항-HDAC5 (F, J)와의 결합 수준을 보여주는 ChIP 분석 데이터를 나타낸 것이며, 프로모터 향상 수준은 qPCR에 의해 정량되었다 (n=6). 데이터는 평균± 표준오차로 표기되었다. *와 **은 각각 p<0.05와 p<00.01에서 두 그룹간의 유의한 차이를 나타낸다. Student t 검정이 사용되었다.
도 9는 반복된 2h-14d 구금 스트레스는 뇌의 PRX3과 TRX2 프로모터에서 후성적 변형을 일으킬 수 있음을 나타낸 것이다. 전전두엽 피질과 해마에서, PRX1, PRX3, PRX5, TRX1 또는 TRX2 프로모터에서 항-AcH3-k9/14 (C, G), 항-AcH4-k5/8/12/16 (D, H), 항-DimeH3-K9 (E, I)와 항-HDAC5 (F, J)와의 결합 수준을 보여주는 ChIP 분석 데이터를 나타낸 것이며, 프로모터 향상 수준은 qPCR에 의해 정량되었다 (n=6). GAPDH와 베타 액틴이 qPCR의 대조군으로 사용되었다. 데이터는 평균± 표준오차로 표기되었다. *와 **은 각각 p<0.05와 p<0.01에서 두 그룹간의 유의한 차이를 나타낸다. Student t 검정이 사용되었다.
도 10은 HDAC 억제제 SAHA가 스트레스로 유도된 우울증 유사 행동 및 PRX3과 TRX2 하향조절을 변화시킬 수 있음을 나타낸 것이다. 10A는 2h-14d 구금 스트레스 후, SAHA(HDAC 억제제; 50 mg/kg) 또는 부티르산 나트륨(sodium butyrate; NaBu; 1.2 g/kg)로 처리한 마우스를 이용하여, TST 및 FST 행동시험 수행 과정을 시간별로 도식화한 것이다. 10B 및 10C는 스트레스 받은 마우스 또는 스트레스 받은 후 SAHA 또는 NaBu를 투여한 마우스의 뇌에서 PRX3과 TRX2의 mRNA 수준을 나타낸 것이다. 각각의 유전자의 발현은 qPCR 분석으로 결정하였으며, 각 시료에 대한 값은 대조군에 대한 배수로 변환했다. 10D 및 10E는 스트레스로 유도된 우울증 유사 행동을 TST와 FST로 측정한 결과이다. 2h-14d 구금 스트레스는 TST와 FST 실험에서 부동 시간을 증가시키는 반면, SAHA를 처리한 군에서는 상기 결과가 바뀌었다. CON, 대조군 마우스 (무 스트레스); RST, 2h-14d 스트레스 처리된 마우스; RST+SAHA, 2h-14d 스트레스 후 SAHA로 처리한 마우스; RST+NaBu, 2h-14d 스트레스 후 NaBu 로 처리한 마우스. 데이터는 평균± 표준오차(n=6-10)로 표기되었다. **은 각각 p<0.01에서 두 그룹간의 유의한 차이를 나타낸다. 일방 ANOVA Newman-Keuls 복수 비교 검정이 사용되었다.
도 11은 해마에서 Lenti-shRNA-PRX3에 의한 PRX3의 하향조절이 우울증 유사 행동을 유발시킨다는 결과를 나타낸 것이다. 11A는 양쪽 해마의 치아이랑 (dentate gyrus; DG)으로 렌티-GFP(Lenti-GFP)를 주입하여, 해마 수준에서 뇌 단면의 관상영상과 해마를 강조한 GFP 형광 영상(우측 사각형)을 나타낸 것이다. 11B는 렌티-GFP 또는 렌티-shRNA-PRX3(GFP을 발현하는)을 주입한 마우스의 해마에서 PRX3의 발현 수준과 ROS 수준을 나타낸 것이다. 11C 및 11D는 TST(C)와 FST(D) 행동시험에서 렌티-GFP 또는 렌티-shRNA-PRX3를 가진 마우스의 부동 시간을 나타낸 것이다. CON, 대조군 마우스 (무 스트레스, 무 렌티 벡터); GFP, Lenti-GFP 주입된 마우스; PRX3, Lenti-shRNA-PRX3 주입된 마우스. 데이터는 평균± 표준오차 (n=8-12)로 표기되었다. *와 **은 각각 p<0.05와 p<0.01에서 두 그룹간의 유의한 차이를 나타낸다. 일방 ANOVA Newman-Keuls 복수 비교 검정이 사용되었다.
도 12는 PRX3의 발현은 만성 스트레스로 유도된 지속적 우울증 유사 행동의 발생 기전에서 NADPH 산화제에 의해 조절될 수 있음을 나타낸 것이다. 12A 는 p47phox+/-마우스의 해마에서 2h-14d 구금 스트레스 전 또는 후의 PRX3과 TRX2의 발현 수준을 나타낸 것이다. 12B는 치아이랑에 Lenti-GFP 또는 Lenti-shRNA-PRX3를 주입한 마우스의 해마에서 2h-14d 구금 스트레스 전 또는 후의 PRX3과 TRX2의 발현 수준을 나타낸 것이다. 데이터는 평균± 표준오차 (n=6-12)로 표기되었다. *와 **은 각각 p<0.05와 p<0.01에서 두 그룹간의 유의한 차이를 나타낸다. 일방 ANOVA Newman-Keuls 복수 비교 검정이 사용되었다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험재료 및 방법

동물

7주령의 수컷 C57BL6 마우스를 대한 바이오링크에서 구입했다. P47phox 유전자에 고안된 유전자 변이를 가진 마우스(Huang et al., 2000)는 Jackson Laboratories에서 구입했고 C57BL6/J와 역교배하여 유지시켰다. 유전형을 알아보기 위해, 꼬리 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출하고 다음의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행했다; 5’-TGG AAG AAG CTG AGA GTT GAG G -3’, 5’-TCC AGG AGC TTA TGA ATG ACC-3’

요약하면, 1 ㎕ 게놈 DNA를 최종 부피 20 ㎕로 증폭시켰고, 이는 각각 20μM의 프라이머와 10X PCR 완충액, 5X Q 완충액, 25 mM MgCl₂, 2.5mM dNTP및 1U Tag 중합효소를 포함하였다. PCR 조건은 다음과 같았다; 95℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분씩 32회 반복.

PCR 생성물은 최종 부피를 20 ㎕로 하여 37℃에서 16시간 동안 MspI과 반응시켰고, 이는 10 ㎕ PCR 생성물, 10X 반응 완충액, 10 mg/ml BSA, 및 MspI를 포함하였다. 증폭된 밴드의 예상되는 크기는 야생형 (+/+)에 대해 160 bp, 이형접합체 (+/-)에 대해 160, 102, 58 bp였다.

7-18 주령의 수컷 p47phox 마우스가 사용되었다. 실험을 시작하기 전 1주일간 온도와 습도가 조절된 환경의 표준 투명 플라스틱 우리(케이지)에 쌍으로 거주시켰다. 모든 동물은 이화 여자 대학교 의과대학의 동물 관리 지침에 따라 처리했다.

구금 스트레스(Restraint Stress)

본 실험에 사용된 구금 스트레스 관련 실험은 종전에 기술된 바와 같이 수행하였다(Kim and Han, 2006; Lee et al., 2009). 요약하면, 약 20~23g의 7주령 수컷 C57BL/6 마우스를 개별적으로 환기가 잘되는 50 ml 폴리프로필렌 원뿔형 튜브에 머리부터 넣고, 약 3 cm 길이의 중간 크기의 튜브로 막은 후, 50 ml 튜브의 뚜껑을 채워서 마우스를 이 기구 안에 완전히 구금시켰다. 이러한 구금 실험은 오전 10시부터 매일 두 시간씩 수행하였고, 이 과정은 14일간 연속적으로 반복되었다. 각 회차의 구금 후, 스트레스 받은 동물들은 음식과 물을 자유롭게 섭취할 수 있는 정상의 플라스틱 우리에서 쌍으로 거주하는 환경에서 사육하였다.

약물 투여

2 시간 감금 시작하기 한 시간 전에 관심 약물을 마우스에 복강 내 주사하였고, 이 과정을 14일간 반복했다. 각각의 약물에 대한 출처, 용량과 투여 경로는 다음과 같았다: 이미프라민 염산염(Imipramine hydrochloride, Sigma (St. Louis, MO)), 투여량 20 mg/kg(i.p.); SAHA (suberoylanilide hydroxamic acid, Selleck Chemicals(TX, USA)), 투여량 50mg/kg(i.p.); 부티르산 나트륨(Sodium butyrate, Sigma (St. Louis, MO)), 투여량 1.2 g/kg(i.p.). SAHA는 DMSO에 용해한 후, 식염수로 희석시켰다. 다른 약물은 식염수에 용해하여 사용하였으며 최종적으로 0.9% 식염수 100 ㎕로 희석된 각각의 약물은 상기 언급한 투여방법 및 투여량에 따라 투여하였다.

행동 평가

마우스는 각 행동 평가 시험을 시작하기 30분 전에 실험방으로 옮겨와 시험하는 내내 같은 방에 머물도록 하였다. 시험은 도 1A에 기재된 바와 같이 수행하였다. 행동 시험은 컴퓨터 비디오-추적 시스템 (SMART; Panlab S.I., Barcelona, Spain)을 사용하여 수행하였으며, 마지막 주사 1시간 후에 마우스를 분석하였다. 모든 회차에서 소리는 55-60 dB 백색소음(잡음)으로 차단하였다.

꼬리 매달기 검사 (tail suspension test; TST)

조사하려는 마우스의 꼬리를 금속 막대에 매달리게 하였다. 막대는 소리가 차단된 방 안에서 안전 매트가 덮인 탁상의 표면에서 50 cm 위에 고정되었다. 꼬리의 끝은 접착력있는 스카치 테이프를 사용하여 고정하였으며, 시험은 6분간 지속되었다. 부동 시간을 6분의 시간 동안 측정하였다(Steru et al.,1985).

강제 수영 검사 (forced swim test; FST)

마우스를 14 cm 깊이로 24 의물을 채운 플렉시글라스 실린더(높이; 27 cm, 지름; 15 cm)에 넣어, 탈출하거나 바닥에 닿을 수 없도록 하였으며, 마우스를 15분간 미리 수영하게 하였다. 15분 후 마우스를 꺼내 수건으로 물기를 닦고, 우리로 돌려보냈다. 하루 뒤 마우스를 6분간 강제로 수영하게 하였다. 처음 1분간 마우스들이 적응하도록 두고, 다음 5분간 행동을 관찰하였다. 부동 시간은 모든 팔다리의 움직임 없이 동물이 떠있는 시간의 합으로 정의된다. 자세한 기록방법은 참조문헌(Kim and Han, 2006)에 기재되어 있다.

지질 과산화의 측정

지질 과산화는 종전에 기술된(Im et al., 2006; Seo et al., 2010a-c; 2011a-b) 바와 같이, Bioxytech MDA-586 kit를 사용하여 말론디알데히드 (MDA) 수준을 측정하여 평가하였다.

요약하면, 뇌 조직을 5 mM 부틸화 히드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene)을 포함하는, 4 부피의 빙냉의 20 mM PBS(pH 7.4)로 균질화하였다. 균질물은 4℃ 에서 3,000 g로 10분간 원심분리 했고, 상층액은 각각의 분석에 사용되었다. 각각의 반응에 10 ㎕의 프로부콜과 640 ㎕의 희석된 R1 시약 (1:3 메탄올:N-메틸-2-페닐인돌)을 첨가하고, 150 ㎕의 12N HCl과 혼합하였다. 45℃ 에서 60분간 반응시킨 후, 10,000 g로 10분간 원심분리하였다. 상층액을 분리하여, 586 nm에서 흡광도를 측정하였다. MDA 데이터는 단백질 농도에 대해 적정화(normalization)하였고, 값은 대조군(sham control)에 대한 백분율로 나타냈다. 단백질-결합된 MDA 함량은 차감하여 수득하였다.

단백질 카보닐화의 함량 측정

단백질 카보닐 수준은 Lee et al. (2009)에 기재된 방법으로 정량화하였다. 뇌 균질물의 상층액 (500 ㎕)을 500 ㎕의 20% 트리클로르아세트산 (TCA)로 침전시켰다. 10,000g에서 15분간 원심분리 후, 펠렛을 50℃ 에서 2M HCl의 10 mM 2,4-디니트로페닐히드라진 0.5 ml로 재부유시켰다. 매 10분마다 주기적으로 교반하면서, 암실의 실온에서 한 시간 동안 반응시킨 후, 시료를 0.5 ml의 20% TCA로 침전시켰다. 이 과정을 10% TCA를 사용하여 3회 반복하였다. 결과로 얻은 침전물은 37℃ 에서 2 mM NaOH에 용해시켰다. 단백질 카보닐 함량은 360 nm에서 흡광도를 측정하여 결정했고 nmol/mg 단백질의 단위로 표시했다.

혈액 분리

1 ml 일회용 플라스틱 주사기로 마취한 쥐의 복부 대동맥에서 채취한 혈액으로부터 마우스 혈구를 준비하였다. 전혈을 튜브에 수집하고 1,500 rpm으로 15분간 실온에서 원심분리하여 얻어진 상층액과 펠렛을 각각 혈청과 혈구라 지칭했다.

실시간 PCR에 의한 mRNA의 정량

RNA 준비와 실시간 PCR은 종전에 기술된 바와 같이 수행하였다 (Ha et al., 2008). RNA 정량을 위해, 만성적으로 RTS를 처리한 마우스의 상전 전두엽 피질(Superior prefrontal cortex)과 해마(Hippocampus), 혈구를 수집했다. 총 RNA 는 TRI(Invitrogen Carlsbad, CA, USA) 시약을 이용하여 정제하였고, 유전자적 오염을 막기 위해 DNaseI을 처리하였다. 역전사는 역전사 시스템(Promega, Madison, WI, USA)을 사용하여 제조자의 지시에 따라 수행하였다. 첫-가닥 cDNA는 Promega RT PCR kit를 사용하여, 총 부피 20 ㎕에서 1 μg의 총 RNA로 합성하였다.

PCR 반응은 10 ㎕ 2X iQ SYBR Green supermix(Bio-Rad, Richmond, CA, USA), 5 pmol/㎕의 정방향과 역방향 프라이머 각각 1 ㎕, 및 5 ㎕ cDNA (1/100 희석)을 포함하는 최종 부피 20 ㎕에서, CFX 96 실시간 PCR 시스템 검출기(Real-Time PCR　System Detector）를 사용하여 수행하였다. 반응 주기는 다음과 같았다; 95℃ 에서 5분간 처리 후, 95℃ 에서 20초, 56℃ 에서 20초, 72℃ 에서 20초간 처리를 40회 반복. 증폭의 특이성은 내장된 소프트웨어를 사용하여 55℃ 에서 95℃ 까지 점진적인 온도증가 (0.5℃) 동안 담아낸 자동 형광 데이터에 대한 DNA 융해 곡선에 의해 결정하였다. 증폭 배수의 차이는 Bio-Rad CFX Manager에 대해 유전자 발현 분석(Gene Expression Analysis)이라는 내장된 소프트웨어를 사용하였고, 참고로 사용한 GAPDH 및 베타 액틴(β-actin)에 대해 표적 유전자의 실시간 PCR 증폭을 기초로 하여 계산하였다. 실시간 PCR 분석은 표 1(실시간 PCR 프라이머 세트(마우스, 서열번호 1 내지 36))및 표 2(실시간 PCR 프라이머 세트 (인간, 서열번호 37 내지 44))의 프라이머 세트를 사용하여 수행하였다. 실시간 PCR은 각각의 그룹과 각각의 부위에 대해 6번씩 시행하였다.

렌티바이러스를 포함하는 벡터( Lentiviral vector )의 생성과 농축

재조합 렌티바이러스는 종전 (Min et al., 2010)에 기술된 대로 생산하였다. 요약하면, 전이 벡터, 막 당단백질 발현 렌티바이러스 벡터 및 패키징(packaging) 벡터를 포함하는 3개의 플라스미드를 293T 세포에 1:1:1의 몰비율로 리포펙타민 플러스(Invitrogen Corp., CA, USA)와 함께 핵내 주입하였다. 바이러스 벡터 입자를 포함한 배양 상층액을 핵내 주입한 후 48시간에 수집하고, 0.45 μm 막으로 여과 후 -70℃ 냉동고에 보관했다. 렌티바이러스 벡터의 발현 정도는 RT-PCR, 웨스턴 블롯, 및 ELISA로 분석하였다. 역가(적정량)는 HeLA 세포에 감염 후 p24 ELISA에 의해 결정하였다. 이렇게 얻어진 값은 약 10⁶-10⁷형질도입 단위 (transduction unit, TU)/ml이었다. GFP 발현은 HeLA 세포 또는 A594 세포에 핵내주입 후 확인되었고, 형광 현미경(Nikone TE2000U, Japan)을 사용하여 사진으로 찍었다. 바이러스는 센트리콘(Centricon, Millipore Corp., Billerica, MA, USA)로 여과하였다. 바이러스 입자를 80,000g에서 2시간 동안 초원심분리하여 보다 농축하였으며, 이러한 농축과정을 두번 반복했다. 마침내 약 10¹⁰-10¹²TU/ml의 양으로 얻어졌다.

렌티바이러스 - shRNA 의 정위 주사 ( stereotaxic injection )

수컷인 C57BL/6 마우스(20-25 g)에 케타민(50 mg/ml) 및 자일라진 염산염 (23.3 mg/ml)의 3.5:1 혼합물을 g 체중 당 1.0 ㎕의 양으로 복강내 주사하여 마취시키고, 종전 연구에서 기술된 바와 같이 정위 장치에 위치시켰다(Kim and Han, 2006). 3 ㎕ 부피의 렌티 shRNA를 28 G 바늘을 사용하여 0.5 ㎕/min의 속도로 각각의 치아이랑으로 우측 측뇌실로 주입했다(정수리점(bregma)을 기준으로 한 mm 단위의 정위 좌표: 앞-뒤(anterior-posterior), -2.4; 측면중앙(midlateral), 2.0; 등-배(dorsal-ventral), -2.1) (Franklin and Paxinos, 1997). 5분 후 역류를 최소화 하기 위해 3분간 3단계를 거쳐 바늘을 제거하였고, 마우스는 깨지 않도록 따뜻한 패드에 계속 두었다. 마취에서 깨어난 마우스는 분석에 사용될 때까지 우리에 두었다. 주사 14일 후 우울증 유사 행동 검사를 수행하였다. shRNA 대조군; 마우스 pGIPZ 렌티바이러스 shRNXmir (RMM4431), 렌티 shRNA-p47phox (RMM4431-98723759, V2LMM_3405) 및 렌티 shRNA-PRX3 (RMM4431-98724865, V2LMM_77744)를 Open Biosystems, Inc. (Huntsville AL, USA)에서 구입하였다.

조직면역화학

뇌는 경심관류로 4% 파라포름알데히드로 고정하였으며, 동일 용액에 4℃에서 하룻밤 후고정하였다. 종전의 연구에서 기술된 바와 같이, 바이브라톰(vibratome을 이용하여, 뇌를 40 μm 간격으로 잘라 뇌 절편을 준비했다 (Lee et al., 2006; Seo et al., 2009; 2011a). Zeiss LSM510/META/NLO 레이저 주사 현미경을 사용하여 Zwiss Plan-Neofluar software를 가지고 공초점상을 수집하였다.

세포 배양과 약물 처리

SH-SY5Y 신경모세포종(neuroblastoma cell) 세포주의 세포 배양은 종전 연구에서 기재된 바와 같다(Seo et al., 2010b-c; 2011a). 요약하면, SH-SY5Y 세포를 10% 열-비활성화 FBS, 페니실린(20 units/ml)및 스트렙토마이신 (20 mg/ml)을 포함하는 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)로 37 에서습식인큐베이터(95% 공기와 5% 이산화탄소)에서 배양하였다. 세포가 배양디쉬를 70-80% 채울 정도(confluence)로 자랐을 때, 실험에 사용하였다. GC (코르티졸 또는 코르티코스테론), 과산화수소, 및 비타민 C는 Sigma (Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였다. 과산화수소와 비타민 C는 PBS에 100 μM의 농도로 용해시켰다. GC는 100 μM의 농도로 DMSO에 녹이고 PBS로 희석시켰다. 무혈청 DMEM에 GC와 과산화수소를 더하여 세포를 배양하였다.

배양된 세포에서 ROS 측정

96-웰 플레이트의 SH-SY5Y 세포를, 10 μM DCF를 포함한 배지에서 37℃ 로30분간 인큐베이션했다. 종전 기술에 기재된 바와 같이, 과산화수소 관련 ROS에 민감한 세포막투과성 형광 색소인 CM-H2DCFDA[5-(and-6)-chloromethyl-2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate]를 사용하여 ROS를 가시화하였다(Im et al., 2006; Seo et al., 2011a).

요약하면, SH-SY5Y 세포를 HEPES 완충액으로(120 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 0.8 mM MgCl₂, 1.8mM CaCl₂, 20mM HEPES, 10mM NaOH, 15mM 글루코즈) 세척하여 형광 수준 분석에 사용하였다. 형광수준은 분광형광계(SpectraMaxM5, Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA. USA)를 사용하여, DCF에 대해 488 nm에서 여기(excitation)와 510 nm에서 발광(emission)을 측정했다. 3회 측정하여 평균값을 내어, 하나의 데이터로서 사용하였다..

미토콘드리아 막 전위 측정

미토콘드리아 막 전위 (MMP)는 이전에 묘사된 바와 같이 Molecular Probe사의 5,5,6,6’-테트라클로로-1,1,3,3’-테트라에틸-벤즈이미다졸-카보시아닌 요오드화물(JC-1)을 사용하여 측정했다. JC-1은 MMP에 민감하여 높은 막전위에서 붉은 형광 군집으로 낮은 막전위에서는 초록 형광 군집으로 보여진다. 따라서 녹색과 빨간색 형광 사이의 비율의 변화는 MMP에 관한 정보를 제공한다. 요약하면, 24-웰 플레이트에서 배양된 SH-SY5Y 세포는 1 μg/ml의 JC-1과 37℃ 에서 30분간 인큐베이션하였다. MMP 탈분극은 형광 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 485 nm와 550 nm 여기 파장을 사용하여 530 nm와 590 nm의 발광 파장에서 형광세기를 측정하여 구하였다. 각각의 발광 파장에서 세포의 자가형광을 JC-1 형광 값으로부터 감하였다. 데이터는 단량체 형광에 대한 JC-1 군집 형광의 비율 (F₅₉₀/F₅₃₀)로 표현하였다. 각각의 개별적인 처리/시점은 4개의 사본을 반영한다.

미토콘드리아 준비

요약하면, 종전 기술에 기재된 바와 같이, QProteome 미토콘드리아 분리 키트(Mitochondria Isolation kit)를 이용하여 제조자의 지시에 따라 뇌의 해마로부터 미토콘드리아 분리하였다(Seo et al., 2011a). 상전 전두엽 피질(superior prefrontal cortex) 또는 해마 조직을 단백질 분해 효소(protease) 억제제를 포함한 빙냉의 용해 완충액 500 ㎕로 균질화하였다. 균질물은 4℃ 에서 1,000g로 10분간 원심분리 했고, 펠렛은 수거하여 1.5 ml 용해 완충액으로 다시 부유시켰다. 21G 바늘의 주사기에 10회 통과시킨 후, 펠렛을 4℃에서 1,000g로 10분간 원심분리 했고 미토콘드리아를 포함한 상층액을 수거하여 4℃ 에서 6,000g로 10분간 다시 원심분리 했다. 펠렛을 1 ml의 10 mM Tris 완충액(pH 7.6)으로 재부유시켰다. 단백질 농도 분석 후 이를 웨스턴 블롯과 미토콘드리아 활성 분석에 사용하였다.

웨스턴 블롯

웨스턴 블롯팅 작업은 종전 연구에 기술된 바대로 수행되었다 (Lee et al., 2009; Seo et al., 2009, 2010a, 2011a). 해마를 1mM 페닐메틸술폰화 불화물, 및 단백질 분해효소 억제제를 포함한 용해 완충액 (50 mm Tris [pH 8.0], 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 0.5% 나트륨 디옥시콜레이트 (sodium deoxycholate))으로 균질화하였다. 각 레인에 30 μg의 단백질을 부하했다. 면역 블롯은 ECL 검출 시약(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA)을 사용하여 검출했다. 항-Prx3 항체 (1:2,000; Ab Frontier, Seoul, Korea), 항-Prx-SO3 항체 (1:2,000; Ab Frontier, Seoul, Korea), 항-Prx5 항체 (1:2,000; Ab Frontier, Seoul, Korea), 항-TRX2 항체 (1:1,000; Ab Frontier, Seoul, Korea), 항-카탈라아제 항체 (1:2,000; Ab Frontier, Seoul, Korea), 항-Bcl-2 항체 (1:1,000; Santa Cruz, CA, USA), 항-Bax 항체 (1:1,000; Santa Cruz, CA, USA), 항-VDAC 항체 (1:2,000; Santa Cruz, CA, USA), 항-프로히비틴 항체 (1:1,000; Santa Cruz Biotechnology, Inc,)와 항-GAPDH (1:5,000; Ab Frontier, Seoul, Korea)을 사용하였다. 이차 항체는 (항-마우스와 항-래빗 IgG HRP) Santa Cruz Biotechnology, Inc.에서 구입했다. 웨스턴 블롯 이미지는 Quantity One 1-D analysis software를 이용해 정량화하였다. 필름은 HP scanjet 5400c를 사용하여 스캔하였고, 단백질 발현은 Quantity One software version 4.6.1을 사용하여 측정하였다.

미토콘드리아 ETC 활성 분석

미토콘드리아 ETC 활성과 구연산 합성효소 활성은 종전 연구에서 제시된 방법으로 측정하였다 (Seo et al., 2011a). 요약하면, QProteome Mitochondria Isolation kit을 이용하여 제조자의 지시에 따라 세포와 뇌의 해마로부터 미토콘드리아를 분리하였다. 해마 조직은 단백질 분해 효소 억제제를 포함한 빙냉의 용해 완충액 500 ㎕로 균질화하였다. 균질물은 4℃ 에서 1,000g로 10분간 원심분리 했고 펠렛은 수거하여 1.5 ml 용해 완충액으로 다시 부유시켰다. 21G 바늘의 주사기에 10회 통과시킨 후 펠렛을 4℃에서 1,000g로 10분간 원심분리 했고 미토콘드리아를 포함한 상층액을 수거하여 4℃ 에서 6,000g로 10분간 다시 원심분리 했다. 펠렛을 1 ml의 10 mM Tris 완충액 (pH 7.6)으로 재부유시켰다. 단백질 농도 결정 후 시료를 미토콘드리아 활성 분석에 사용했다.

복합체 I 분석을 위해 미토콘드리아 시료 1 μg을 240 ㎕ 인큐베이션 혼합물 (5mM 포타슘포스페이트 (potassium phosphate), 70 g/L BSA, 60 mM DCIP, 17.5 mM 데킬루비퀴논(decylubiquinone) 및 1.0 mM 안티마이신-A(antimycine-A) [pH 7.8])로 37℃에서 미리 인큐베이션했다. 3분 후, 160 mM NADH 5 ㎕를 가하고, Spectra 190 max UV detector를 사용하여 37℃ 에서 5분간 10초 간격으로 600 nm에서의 흡광도를 측정했다. 5분 후 DMSO에 녹인 100 mM 로테논(rotenone) 2.5 mL를 가하고 다시 10초 간격으로 5분간 흡광도를 측정했다.

복합체 II 분석을 위해 미토콘드리아 시료 1 μg을 240 ㎕ 인큐베이션 혼합물 (5mM 포타슘포스페이트, 70 g/L BSA, 0.25 mM EDTA, 0.1 mM ATP, 30 mM DCIP, 17.5 mM 데킬루비퀴논, 1 mM 안티마이신-A 및 3mM 로테논 [pH 7.8])로 37℃에서 미리 인큐베이션했다. 10분 후, 혼합물에 1M 숙신산(succinate)과 0.1 M KCN을 첨가하고, 37℃에서 5분간 10초 간격으로 600 nm에서의 흡광도를 측정했다.

복합체 IV 분석을 위해 미토콘드리아 시료 1 μg을 240 ㎕ 인큐베이션 혼합물 (시토크롬 c 용액; 17 μM 시토크롬 c, 0.03 M 포타슘포스페이트 [pH 7.4]와 1.2 M 나트륨 히드로아황산염(sodium hydrosulfite))로 30℃에서 미리 인큐베이션했다. 3분 후, 0.1 M 의 최종 농도를 갖도록 KCN을 첨가하고, 30℃ 에서 5분간 10초 간격으로 550 nm에서의 흡광도를 측정했다.

구연산 합성효소 활성 분석을 위해, 미토콘드리아 시료 1 μg을 300 ㎕ 인큐베이션 혼합물(50 mM Tris-HCl [pH 7.5], 10 mM acetyl CoA와 10 mM DNTB)로 30℃에서 미리 인큐베이션했다. 10분 후 0.1 M의 최종 농도를 갖도록 KCN을 첨가하고, 30℃ 에서 5분간 10초 간격으로 410 nm에서의 흡광도를 측정했다.

염색질 면역침전 분석

염색질을 얻기 위해, 공개된 프로토콜 (Johnson and Bresnick, 2002; Wells and Farnham, 2002; Tsankova et al., 2006)에서 약간의 수정을 가하여 뇌조직을 처리했다. 이를 도 7B에 나타내었다. 절개로 치사시킨 쥐로부터 상전 전두엽 피질과 해마를 제거하고, 약 1 mm 크기의 조각으로 작게 자른 후, 즉시 실온에서 1% 포름알데히드에 15분간 교차결합시켰다. 교차결합반응은 글리신을 최종농도 0.125 M로 첨가하여 중지시켰다. 조직은 1 mM 페닐메틸술폰화 불화물과 단백질 분해효소 억제제를 포함한 차가운 PBS로 4-6회 세척하고, 드라이아이스에서 얼렸다. 염색질은 용해되고, 계면활성제 분해에 의해 추출된 후 초음파 파쇄하였다. 먼저, 작게 잘리고 고정된 해마 조직은 세포 융해 완충액(10 mM Tris, 10 mM NaCl과 0.2% NP-40)에서 10초간 두번 균질화 했다. 균질액은 5,500g로 5분간 원심분리했다. 세포외 조직파편을 포함한 상층액은 따라내고, 펠렛은 핵 용해 완충액을 사용하여 10초간 두번 더 균질화했다. 다음으로 추출된 염색질은 5 펄스로 20초간 40% 진폭으로 초음파 분쇄하여 400-600 bp로 잘랐다.

염색질 면역침전 분석은 다양한 프로모터 부위에서 히스톤 아세틸화 또는 포스포아세틸화의 정도를 측정하여 수행되었다. ChIP kit에 서술된 프로토콜을 사용했고, 몇가지를 수정했다. 염색질 용해질을 추출하고 400-600 bp로 적당히 조각낸 후, 각 시료에서 흡광도를 측정했다. 같은 양의 염색질 용해질 (60 μg)을 ChIP 희석 완충액으로 최종 부피 1.5 ml이 되도록 희석했다. 선-면역침전된 용해질 100 ㎕를, 이후 표준화를 위한 “input”으로 남겨두었다. 염색질 용액은 연어 정자 DNA/단백질 A-아가로오스 50% 겔 슬러리(catalog #22811; Pierce, Rockford, IL)로 45분간 미리 정리되었다. 이후 Lys9와 Lys14에서 아세틸화된 H3에 대한 지정된 항체 5 μg, Ser10에서 인산화되고 Lys14에서 아세틸화된 H3에 대한 지정된 항체 7 μg, 및 Lys5, Lys8, Lys12와 Lys16에서 아세틸화 된 H4에 대한 지정된 항체 5 μg으로 4℃에서 밤새도록 면역침전시켰다. 염색질 면역침전 분석에서 이들 항체의 특이성은 이미 확립되었다(Cheung et al., 2000; Huang et al., 2002; Tsankova et al., 2004). 그리고 HDAC5에 지정된 항체 5 μg도 사용되었다. 대조군으로는 비 면역 래빗 IgG(kit number 12-370; Upstate Biotechnology) 5 μg으로 시료를 면역침전 시켰다.

면역침전 후 DNA-히스톤 복합체를 40 ㎕의 연어 정자 DNA/단백질 A-아가로오스 비드로 2시간동안 수집했다. 비드는 순차적으로 저염, 고염, LiCl로 한번씩, 그리고 10 mM Tris (pH 8)/1 mM EDTA 완충액으로 두번 세척되었다. 이후 500 ㎕의 NaHCO₃/SDS용출 완충액을 사용하여, DNA-히스톤 복합체를 비드로부터 용출하였다. DNA와 히스톤은 고염 조건에서 65℃로 4시간 동안 분리되었다. 단백질은 45℃ 에서 1시간동안 단백질 분해효소 K를 처리하여 절단시켰다. 아세틸화되고 포스포아세틸화된 히스톤과 결합된 DNA는 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올로 추출하고, 100% 에탄올로 침전시킨 후, PCR-그레이드 물 80 ㎕로 재부유시켰다. ChIP 실험은 5가지 독립적인 조직 시료에 대해 3번씩 실행하였다.

관심있는 각각의 유전자 프로모터에서 특이적인 히스톤 변형의 수준은 정량적 실시간 PCR에 의해 아세틸화된 또는 포스포아세틸화된 히스톤과 결합된 DNA의 양을 측정하여 결정한다. BDNF P1, P2, P3 또는 P4 프로모터의 부분을 선택적으로 증폭시키기 위해 다음의 프라이머들을 사용했다:

5’- TGA TCA TCA CTC ACG ACC ACG-3’ (서열번호 45)

5’-CAG CCT CTC TGA GCC AGT TAC G-3’(서열번호 46)

5’-TGA GGA TAG GGG TGG AGT TG-3’(서열번호 47)

5’-GCA GCA GGA GGA AAA GGT TA-3’ (서열번호 48)

5’-GCG CGG AAT TCT GAT TCT GGT AAT-3’(서열번호 49)

5’-GAG AGG GCT CCA CGC TGC CTT GAC G-3’(서열번호 50)

5’-TGC AGG GGA ATT AGG GAT AC-3’ (서열번호 51)

5’-TCT TCG GTT GAG CTT CGA TT-3’(서열번호 52)

각각 프로모터 P1에서 P4에 의해 유도되는 BDNF 엑손 I-IV의 프로모터는 종전 기술에서 기재된 것을 사용하였다 (Tsankova et al., 2004).

Prx3의 부분을 선택적으로 증폭시키기 위해 하기의 프라이머,

5’-GTG CCT CTT GCG TGC TCT-3’ (서열번호 53)

5’-ACT TGC ATG ACG AGA ACC-3’(서열번호 54);

Trx2의 부분을 선택적으로 증폭시기 위해 하기의 프라이머,

5’-CCA AGG TAC CCC ACA CAA GT-3’(서열번호 55)

5’-CAT AGC TGG CTC CAA CCA C-3’ (서열번호 56);

GAPDH의 부분을 선택적으로 증폭시기 위해 하기의 프라이머,

5’-AGA AGG TGG TGA AGC AGG CAT C-3’ (서열번호 1)

5’-CGA AGG TGG AAG AGT GGG AGT TG-3’(서열번호 2);

β-actin의 부분을 선택적으로 증폭시키기 위해 하기의 프라이머,

5’-ATC GTG CGT GAC ATC AAA GAG AAG-3’ (서열번호 3)

5’-TGC CAC AGG ATT CCA TAC CCA AG-3’(서열번호 4)

를 사용하였다.

Input DNA와 면역침전된 DNA 증폭 반응은 iQ SYBR Green Supermix 존재하에 3회 반복하여 시행되었다. 각각의 시료로부터의 Ct 값은 CFX Manager software를 사용하여 얻었다. 배수 차이(대조 ChIP에 대한 급성 또는 만성 ChIP)는 이후 2의 DCt 제곱으로 결정하였다. 평균과 표준오차 값은 각각의 배수 차이에 의해 결정하고, 이 값들은 통계적 유의성(p < 0.05)을 결정하기 위한 양측 이점(two-tailed paired) t 검사 (복수의 비교에 대해 조절된)에 사용되었다. 각 뇌 시료에 대해 3회씩 행해진 각각의 PCR 반응은 독립적으로 적어도 2번 반복하였다.

통계적 분석

두-시료 비교는 student t 검정을 사용하여 수행했고, 복수의 비교는 Newman-Keuls 복수 범위 검정이 수반되는 일방 ANOVA 또는 양방 ANOVA를 사용하여 행했다. 데이터 중 선택된 쌍의 비교를 위해서는 Bonferroni posttests를 사용했다. 통계적 분석을 수행하기 위해 GraphPad PRISM software 4.0을 사용했다. 모든 데이터는 평균± 표준오차로 나타냈고, 통계적 차이는 달리 표기되지 않은 한 5% 수준에서 수용되었다.

실시예 1: 반복적인 구금 스트레스로 인한 지속적 우울증 관련 행동 관찰

반복적인 구금 스트레스(2h-14d, 실험 방법 참조)와 같은 만성적 스트레스가 가져오는 영향을 알아보기 위해, 도 1a의 (A)에 도식화된 내용으로 실험을 수행하였다. 구체적인 실험방법은 상기 실험방법에서 자세히 설명하였다.

2h-14d 스트레스를 받은 마우스들을 대상으로 마지막 구금 처리 후 29-30일에 TST 및 FST 를 검사하였다. 그 결과, 2h-14d 스트레스를 받은 마우스들은 대조군과 비교하여 부동성 시간이 유의적으로 증가하는 등 우울증 유사 행동이 나타났다(도 1A-C). 스트레스로 유발된 우울증적 행동은 마지막 구금 후 41일 (6주)에도 강하게 나타났다(도 1D와 E).

상기와 같은 우울증적 행동이 사람에서 발생하는 스트레스에 의해 유도되는 우울증과의 유사여부를 확인하기 위하여, 항우울제로 알려진 이미프라민을 구금이 가해진 마우스에 처리하고 위와 동일한 시험을 수행하였다. 그 결과, 이미프라민을 처리한 마우스에서는 스트레스로 의해 나타난 우울증적 행동이 관찰되지 않았다(도 1B-E).

상기의 결과로부터, 반복적인 구금 스트레스를 받은 마우스에서 나타난 행동들이 우울증과 관련된 것임을 알 수 있었으며, 만성적 2h-14d 스트레스 처리된 마우스들에게서 우울증 관련 행동이 오래 지속되는 변화가 나타남을 확인할 수 있었다.

실시예 2: 구금 스트레스와 뇌의 ROS(Reactive Oxygen Species) 조절 시스템과의 관계

본 발명자들은 스트레스로 유도된 지속적인 우울증 관련 행동이 뇌의 ROS 조절 시스템과 관련되어 있는지를 확인해보았다.

스트레스의 길이 및 시간에 따라 뇌의 ROS 레벨과 미토콘드리아 기능장애를 초래하는지에 대해 실험을 하고자, 2A에 도식화된 내용으로 실험을 수행하였다. 뇌의 지질 과산화는 세포막 지질의 산화된 생성물인 말론디알데히드(MDA) 수준을 측정하여 평가하였다. 구체적인 MDA 측정은 상기 실험방법에서 자세히 설명하였다.

구금 스트레스를 1, 3, 7, 또는 14일 동안 매일 2시간씩 행해진 그룹 및 2h-14d 구금 처리된 마우스를 1, 3, 또는 7일 동안 2시간씩 재구금시킨 그룹(ReRST 군)으로 나누어 뇌의 지질 과산화 정도를 측정하였다. 그 결과, 스트레스를 받은 시간 및 반복횟수에 의존적으로 해마에서 지질과산화 결과인 말론디알데히드(MDA)가 증가하였으며, 특히, 2h 구금 스트레스를 7회 가한 후 ROS가 현저히 증가하였다. 이는 이전에 보고된 연구결과와 일치하였다(Seo et al., 2011a). 그러나 14일 동안의 스트레스를 가한 후, 스트레스를 가하지 않은 다음날, 지질 과산화 레벨은 스트레스 받지 않은 대조군 수준으로 감소되었다. 대조군 수준은 그 이후에도 지속되었다(도 2B). 상기 결과로부터, 만성적 스트레스의 특징은 ROS 레벨에 반영되지 않는 것처럼 보였다.

그러나 2h-14d 스트레스 처리된 마우스에, 2h-14d 스트레스 후 14일부터 다시 스트레스를 가했을 때(ReRST 군), 지질 과산화 수준이 현저하게 증가되었다. 단일 2h 재스트레스는 이전에 7d 구금에 의해 유도된 것과 같은 수준으로 (139.37% 대 134.97%) ROS 수준을 증가시켰고, 2h 재스트레스를 3 내지 7회 반복 처리한 경우에는 2h-14d 스트레스 후 검출된 ROS 수준으로 증가시켰다(165.2% 및 172.02% 대 174.97%). 이들 결과로부터 2h-14d 스트레스는 스트레스 신호를 뇌의 ROS 조절 시스템에 각인시킨다는 것을 알 수 있었다.

실시예 3: 행동 스트레스가 미토콘드리아의 기능에 미치는 영향 확인

스트레스 호르몬인 글루코코르티코이드(GC)가 스트레스 받은 마우스 뇌의 미토콘드리아에 미치는 영향을 알아보고자, 미토콘드리아 전자 전달 호흡 시스템의 기능적 활성을 측정하였다.

생화학적 분석 결과, 전전두엽 피질 (PFCX)에서 복합체 I과 복합체 II의 기능적 활성이 스트레스 받지 않은 대조군에 비해 각각 50.66%와 46.5%로 감소하였다. 스트레스 받은 마우스에서 복합체 IV 활성은, 통계적으로 눈에 띄는 감소는 아니지만, 스트레스 받지 않은 대조군 마우스들에 비해 약간 감소하였다. PFCX에서 미토콘드리아 마커 구연산 합성효소(citrate synthase)의 활성은 2h-14d 스트레스에 의해 크게 영향 받지 않았다(도 2C).

또한, 스트레스 받은 마우스의 해마(HP)에서 복합체 I과 복합체 II의 활성은 대조군 마우스에 비해 각각 42.57%와 39.81%로 감소되었다. 미토콘드리아 호흡 복합체 IV와 구연산 합성효소 활성은 2h-14d 스트레스에 의해 눈에 띄는 영향은 없었다(도 2D). 상기와 같은 결과로부터, 2h-14d 스트레스가 뇌에서 복합체 I과 복합체 II의 기능적 활성을 현저하게 손상시킴을 알 수 있었다.

실시예 4: 글루코코르티코이드의 농도 및 시간 의존적인 ROS 생성 증가 및 미토콘드리아 막전위 붕괴 유도

본 발명자들은 SH-SY5Y 인간 뉴로블라스토마 세포에서 글루코코르티코이드(GC)가 ROS를 증가시키는 분자적 기전에 대해 연구하였다.

ROS 측정은 상기 실험방법에 설명한 바대로, 과산화수소 관련 ROS에 민감한 세포막투과성 형광색소인 DCF(10 mM)를 사용하여 수행하였다. SH-SY5Y 세포에 1-3일간 다양한 용량의 GC (200, 400, 800, 2,000 및 4,000 ng/ml)로 처리한 후, MDA를 측정하였다. 그 결과, 투여한 GC의 용량 및 시간에 의존적으로 ROS 수준이 증가되었다. SH-SY5Y 세포를 400 ng/ml (1.15M)의 GC로 처리했을 때, CG 처리 24시간, 48시간 및 72시간 후 측정된 ROS 수준은 대조값에 비해 각각 128.40%, 139.4% 그리고 153.44%로 증가되었다(도 3A).

또한, GC-유도된 ROS 축적에 관해, 본 발명자들은 GC가 미토콘드리아 기능에 미치는 영향을 조사하였다. 미토코트리아 막전위(MMP)는 상기 실험방법에서 설명한 대로, 선택적으로 미토콘드리아에 들어가서 낮은 막 전위에서 초록색을 띠는 JC-1(1 mg/ml)을 사용하여 측정하였다. 그 결과, JC-1 형광 세기에 의해 결정된 바와 같이, 투여된 GC의 시간 및 용량에 의존적으로 MMP는 감소되었다. SH-SY5Y 세포를 400 ng/ml의 GC로 처리했을 때, GC (400 ng/ml)처리 후 24시간, 48시간, 및 72시간 후 결정된 MMP 수준은 대조값에 비해 각각 94.43%, 85.34% 그리고 76.17%로 감소되었다(도 3B).

SH-SY5Y 세포에서 GC 처리는 12시간에 MMP 수준의 작고 일시적인 감소를 일으켰고, 이어 18시간 후에 MMP 수준의 크고 지속적인 감소를 유발했다. MMP의 이러한 이상적 변화는 GC로 유도된 ROS 수준 변화와 역관계로 유발되었다(도 3C-E).

실시예 5: 스트레스 받은 마우스 뇌의 미토콘드리아에서 발현이 변화되는 유전자 확인

미토콘드리아 관련 산화 스트레스와 미토콘드리아 기능 장애를 야기하는 세포적 요인을 찾기 위해, 미토콘드리아 관련 산화 스트레스에 중요하다고 알려진 유전자 배열의 발현을 분석하였다.

2h-14d 구금 후 즉시(RST) 또는 17일 후(RSTp17d) 재구금시킨 마우스의 뇌 시료를 수집하여, 실시간 PCR 분석을 수행하였다.

2h-14d 구금 후 즉시 유전자의 발현을 측정한 결과, 퍼옥시레독신 3(peroxyredoxin 3; PRX3), 티오레독신 2 (thioredoxin 2; TRX2) 및 티오레독신 환원효소 2 (thioredoxin reductase 2; TRXR2)의 발현 수준이 뇌에서 현저히 감소되었고, 이들의 감소된 발현은 스트레스 후 17일까지 지속되거나 또는 더 감소되어 나타났다(도 4A 및 4B). TRXR1와 글루타치온 환원효소 (glutathione reductase; GSR)의 발현 또한 2h-14d 구금 스트레스 후 17일에 감소되었다. 이와 달리 퍼옥시레독신 1 (PRX1), PRX2, PRX4, PRX5, PRX6, 글루타치온 과산화제 1 (glutathione peroxidase 1; GPX1), GPX2, 및 글루타치온 S-전이효소 알파 1 (glutathione S-trasnferase alpha 1; GST a1)의 발현은 스트레스 받지 않은 대조군 마우스의 발현과 비슷하였다(도 4A와 4B).

전사수준에서 PRX3과 TRX2에 대한 유전자의 지속적인 하향조절로 인해 이들 단백질 수준 또한 그에 맞춰 변화하는지를 알아보았다. 해마 조직을 준비하여 세포질 (Cyto)과 미토콘드리아 분획 (Mito) 단백질의 순차적 추출물을 SDS-PAGE와 웨스턴 블롯팅 방법으로 분석하였다. 미토콘드리아 막 부위의 마커 anti-GAPDH 항체가 사용되고, 미토콘드리아 마커 anti-VDAC 항체가 사용되었다. 구체적인 SDS-PAGE와 웨스턴 블롯팅 방법은 상기 실험방법에서 설명한 바와 같았다.

웨스톤 블롯 결과, 2h-14d 스트레스 후(1일 후), PRX3의 발현이 빠르게 대조군 수준에 비해 43.4%로 감소되었다(도 5A). 이와 일치되게, 술핀화/술폰화 (sulfinylation/sulfonylation)-특이적 항체 (anti-PRX-SO3)을 사용하여 수행한 면역 블롯 분석 결과, PRX-SO3 발현이 대조 수준에 비해 211.7% 증가되었다(도 5B, 5C).

PRX 동종이합체를 구성하는 각각의 서브유닛의 산화환원 민감 시스테인 잔기는 2h-14d 스트레스에 의해 Cys-SOH로 산화되고, 이는 이후 다른 서브유닛의 이웃한 Cys-SH와 반응하여 분자간 이황화물을 형성하였다. 이러한 이황화물은 특별히 TRX에 의해 환원되고, TRX의 환원된 형태는 이후 NADPH를 사용 시점에 TRX 환원효소(TRXR)에 의해 재생성되었다. 면역블롯 분석은 스트레스 받은 마우스에서 TRX2의 발현이 스트레스 받지 않은 대조 마우스에 비해 53.94%로 감소된 반면, 스트레스 받은 마우스에서 세포소멸 촉진 인자 Bax의 발현은 스트레스 받지 않은 대조 마우스에 비해 146.93%로 증가됨을 보였다. 그리고 스트레스 받은 마우스에서 PRX5, SOD2, CAT, Bcl-2, VDAC, 및 프로히비틴(Prohibitin)의 발현 수준은 스트레스 받지 않은 대조 마우스에서와 비슷했다 (도 5A-C).

상기 결과들은 단백질 수준에서 PRX3과 TRX2의 발현이 스트레스 받은 마우스에서 하향조절됨을 제시한다.

실시예 6: 스트레스 받은 마우스의 혈액에서 PRX3 및 TRX2의 발현감소 확인

반복적인 스트레스가 마우스의 뇌 뿐만 아니라 혈액에서도 PRX3 및 TRX2의 발현을 감소시키는지 알아보았다.

반복적인 구금 스트레스(2h-14d)를 가한 마우스와 구금 스트레스를 가하지 않은 마우스의 혈액으로부터 마우스 혈구를 얻어, 혈액 내 PRX3 및 TRX2의 발현 정도를 실시간 PCR으로 확인하였다.

그 결과, 구금 스트레스를 가하지 않은 마우스의 혈액에 비하여, 반복적인 구금 스트레스를 받은 마우스의 혈액에서 PRX3 및 TRX2의 발현이 현저히 감소됨을 확인할 수 있었다(도 6).

상기 결과로부터, 반복적인 스트레스가 뇌의 미토콘드리아 내 PRX3 및 TRX2의 발현을 감소시킬 뿐만 아니라, 혈액 내 혈구에서도 PRX3 및 TRX2의 발현을 감소시키며, 이로부터 혈액를 채취하여 PRX3 또는 TRX2의 발현을 측정하여 스트레스의 영향을 받았는지, 반복적인 스트레스로 인해 우울증과 같은 스트레스 장애를 진단할 수 있다. 또한, 혈액 내 PRX3 또는 TRX2의 발현 감소를 억제시키거나, 이의 활성을 촉진시킴으로써 스트레스 민감 반응을 완화시키고, 만성적 스트레스로 인해 발생하는 스트레스 장애를 치료할 수 있다.

실시예 7: 글루코코르티코이드가 SH-SY5Y 세포에서 PRX3과 TRX2의 발현에 미치는 영향 확인

본 발명자들은 글루코코르티코이드가 PRX3과 TRX2의 발현을 조절하는 분자적 기전에 대해 연구하였다.

실시간 PCR 결과, 72시간 동안 GC (400 mg/ml)로 처리한 SH-SY5Y 세포에서 PRX3과 TRX2의 발현이 각각 대조수준에 비해 38.39%와 58.69%로 감소되었다. SH-SY5Y 세포를 과산화수소 (200 M)로 처리하였을 때, PRX3과 TRX2의 발현이 각각 대조수준에 비해 22.89%와 29.87%로 하향조절되었다(도 7A, 7B). GC로 유도된 PRX3의 하향조절은 비타민 C에 의해 완화되었으며(도 7A), 더욱이, GC로 유도된 PRX3의 하향조절은 스트레스로 향상된 ROS 레벨에 의해 조절될 수 있음을 뒷받침되었다.

PRX3와 TRX2가 글루코코르티코이드 처리된 세포에서 하향 조절될 때 더 많은 ROS가 악순환에 의해 생성될 것이다. 더불어, 상기 데이터들은 PRX3과 TRX2의 발현이 GC 및/또는 ROS-의존적 기전으로 하향조절됨을 제시한다.

실시예 8: 2h-14d 스트레스 후에 PRX3 과 TRX2 의 프로모터에서 증가된 후성학적 변형 확인

종전 연구에서 만성 사회성 결핍 스트레스가 BDNF 유전자의 후성학적 시스템에서 지속적인 변화를 가져오고, 이는 BDNF 유전자의 발현 변화와 정확히 일치됨을 확인하였다 (Tsankova et al, 2006). 따라서 본 발명자들은 2h-14d 구금 스트레스가 염색질 재형성의 기전에서 BDNF의 발현을 억제하는지를 실시간 PCR과 염색질 면역침전(ChIP) 분석을 통해 알아보았다. 구금 스트레스 전후에 실시간 PCR을 수행한 결과, 전전두엽 피질과 해마에서 BDNF의 발현이 스트레스 후 17일에 하향 조절되었다 (도 8A).

상기와 같은 BDNF의 발현 변화가 후성학적 변형 기전에서 일어난 것인지를 확인하기 위해 염색질 면역침전 (ChIP) 분석을 수행하였다. 2h-14d 구금 후 17일에 전전두엽 피질과 해마 조직을 제거하고, 즉시 포름알데히드에 교차결합시켰다. 계면활성제 용해로 염색질을 추출하고, 초음파 분쇄로 유전적 DNA를 400-600 bp로 잘랐다. 이후 아세틸화된 혹은 이메틸화된 히스톤에 지정된 항체 또는 HDAC 항체 5 mg으로 면역침전시켰다. 유전자 프로모터에서 특정한 히스톤 변형이나 HDAC 결합 수준은 아세틸화 또는 이메틸화된 히스톤 관련 DNA의 양을 정량적 실시간 PCR (qPCR)을 이용하여 측정하여 결정하였다.

그 결과, 전전두엽 피질과 해마의 5개 다른 프로모터 부위 각각에서 아세틸화 H4 (AcH4-k5/8/12/16), 아세틸화 H3 (Ac H3-k9/14), 이메틸화 H3 (DimeH3-K9) 또는 히스톤 디아세틸레이트 5 (HDAC5)에 대한 항체에 의해 면역 침전된 DNA의 양이 만성 스트레스 후 눈에 띄게 변화되었다. 스트레스 받은 마우스의 전전두엽 피질에서 H3 이메틸화는 BDNF P3, P4와 P5 프로모터 부위에서 각각 6.1배, 2.7배, 그리고 4.4배로 증가되었고, HDAC5 결합은 BDNF P2와 P3 프로모터에서 각각 1.3배와 1.9배로 증가되었으며, BDNF P1 프로모터에서는 감소되었다(도 8C-F). 스트레스 받은 마우스의 해마에서 H3 이메틸화는 P2, P3, 및 P4 프로모터 부위에서 각각 1.6배, 2.2배, 그리고 1.9배 증가된 반면, HDAC5 결합은 P1, P3, 및 P4 프로모터에서 각각 5.5배, 4.3배, 및 1.9배 증가되었다(도 8G-J). 이러한 결과는 BDNF 유전자의 발현이 후성학적 변형을 통해 2h-14d 스트레스를 받은 마우스의 뇌에서 억제됨을 제시한다.

다음으로 본 발명자들은 2h-14d 스트레스가 PRX3와 TRX2 유전자에서도 후성학적 변화를 유도하는지를 ChIP 분석을 통해 알아보았다. 그 결과, 전전두엽 피질에서 PRX3과 TRX2 유전자의 H3 아세틸화가 만성 스트레스 후 대조군에 비해 반으로 감소되었으며(도 9A), 전전두엽 피질 내의 PRX3 유전자에서 H4 아세틸화는 대조군에 비해 68%로 감소되었다. 그러나 TRX2 유전자에서의 H4 아세틸화는 영향 받지 않았다(도 9B). PRX3 유전자에서 H3 이메틸화는 만성 스트레스 후 대조군에 비해 2.8배로 증가하였으며(도 9C), PRX3 유전자에서 HDAC5 결합은 만성 스트레스 후 대조군에 비해 거의 3배로 증가하였다(도 9D).

해마에서 만성적 스트레스 전후의 PRX3과 TRX2 유전자의 H3 아세틸화는 변하지 않았다 (도 9E). TRX2 유전자에서와는 달리, PRX3 유전자에서의 H4 아세틸화는 만성 스트레스 후 대조군보다 낮아졌다(도 9F). 반면 PRX3, TRX1 및 TRX2 유전자에서 H3 이메틸화는 스트레스 후 2-3배로 증가했다 (도 9G). PRX3에서 HDAC5 결합은 만성 스트레스 후 대조군보다 5.6배 더 증가되었다 (도 9H).

상기와 같은 결과들은 PRX3과 TRX2 유전자의 폭넓은 히스톤 변형이 2h-14d 스트레스로 처리 후 17일 경에 상전전두엽 피질 (superior prefrontal cortex) 또는 해마에서 일어남을 뒷받침해주었다. 또한, 상기의 몇 가지의 히스톤 변형은 전전두엽 피질 및 해마에서 스트레스로 유도된 일관적인 분자적 특징을 대표한다고 제안된다. 참고로, AcH3-k9/14와 AcH4-k5/8/12/16은 전사 활성화와 관련된 반면 DimeH3-K9과 HDAC5는 전사 억제 부위에서 발견된다(Kouzarides, 2007; Abel and Zukin, 2008).

실시예 9: PRX3 과 TRX2 의 후성학적 억제를 통한 장기간 지속되는 우울증 유사 행동의 조절

만성 스트레스로 인해 장기간동안 우울증 유사 행동이 지속되는 원인이 후성학적 변형으로 PRX3과 TRX2 유전자가 낮게 발현되기 때문이라는 점을 확실히 확인해보기 위해, 본 발명자들은 스트레스 처리 후 HDAC 억제제를 투여하여, 스트레스 받은 마우스의 우울증 유사 행동이 변화되는지를 조사하였다.

마지막 구금 처리 후부터 14-15일간 제2형 HDAC 억제제 SAHA (50 mg/kg, i.p.)의 투여는 PRX3의 발현을 증가시킨 반면, TRX2의 발현에 대해서는 크게 영향을 미치지 못했다. 스트레스 처리 후 SAHA을 투여한 마우스를 이용하여 TST와 FST 행동시험을 수행한 결과, 스트레스 받은 마우스가 보이는 우울증 유사 행동이 나타나지 않았다(도 10A-D). 이와 달리 대부분의 1형과 2형 HDAC를 억제하는 지방산 유도체인 부티르산 나트륨(sodium butyrate (NaBu; 1.2 g/kg, i.p.))를 투여한 결과, TRX2에 대한 효과는 SAHA와 마찬가지로 보통인 반면, PRX3의 발현은 약하게 변화했다. NaBu의 후처리는 우울증 유사 행동에 크게 효과적이지 않았다(도 10A-D). 이러한 결과는 특히 SAHA에 의한 히스톤 탈아세틸화의 약리적 억제가 PRX3의 발현을 상향 조절하고, 항-우울증 효과를 부여한다는 점을 뒷받침한다.

PRX3의 하향조절이 우울증 관련 행동의 중요한 요소임을 입증하기 위해 뇌에서 PRX3 유전자를 녹다운(knock-down)시켜, 마우스의 행동을 관찰하였다. 정상 마우스의 치아이랑(dentate gyrus; DG)에 렌티-PRX3-shRNA를 주입 후, 14일에 해마에서 PRX3의 발현을 측정한 결과, PRX3의 발현이 대조군에 대해 30%로 측정되었고, ROS 수준은 증가되었다 (도 11A-C). 상기 마우스를 이용하여 행동 시험을 수행한 결과, 해마에 Lenti-PRX3-shRNA를 가진 쥐가 RSR와 FST에서 우울증 유사행동을 보였다(도 11D, 11E).

스트레스 받은 마우스의 뇌에서 PRX3과 TRX2의 지속적인 하향조절이 나타나는 사실로부터, 본 발명자들은 PRX3과 TRX2의 발현이 스트레스에 노출되었을 동안 증가되는 NADPH 옥시다아제 활성에 의해 조절될 수 있는지를 연구했다. 야생형 대조군 쥐에서 PRX3과 TRX2의 발현은 현저하게 하향 조절된 반면, p47phox+/- 마우스에서는 PRX3와 TRX2 모두 2h-14d 스트레스 후 반대로 상향 조절되었다 (도 12A, 12B). 이와 일치되게, 해마에 Lenti p47phox-shRNA를 주입한 마우스들에서 2h-14d 스트레스는 PRX3 발현을 억제하지 않았고, 반대로 TRX2 발현은 증가시켰다 (도 12C, 12D). 이러한 결과는 PRX3과 TRX2 의 전사 조절이 만성 스트레스로 인해 유도되는 지속적인 우울증 유사 행동의 발생 기전에서 NADPH 옥시다아제 경로의 하류에 있음을 제시한다.

<110> Ewha University - Industry Collaboration Foundation <120> Therapeutic agents targeting PRX3 for stress disorder and method of screening thereof <130> PA110373KR <160> 56 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for mouse GAPDH <400> 1 agaaggtggt gaagcaggca tc 22 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for mouse GAPDH <400> 2 cgaaggtgga agagtgggag ttg 23 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for mouse beta-actin <400> 3 atcgtgcgtg acatcaaaga gaag 24 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for mouse beta-actin <400> 4 tgccacagga ttccataccc aag 23 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for mouse PRX1 <400> 5 tggattctca cttctgtcat ctgg 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for mouse PRX1 <400> 6 gcgcttggga tctgatatta 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Claims

(1) 스트레스 민감 반응 완화제를 대량생산하는 단계; 및
(2) 상기 생산된 스트레스 민감 반응 완화제 중 일부를 추출하여, PRX3(Peroxiredoxin3) 또는 TRX2(thioredoxin 2)의 발현, 활성, 기능 중 하나 이상을 증진하는지 여부를 확인하는 단계
를 포함하는, 스트레스 민감 반응 완화제의 제조방법.
(1) 시험물질이 PRX3 또는 TRX2의 발현, 활성, 기능 중 하나 이상을 증진하는지 여부를 확인하는 단계; 및
(2) 상기 단계에서 PRX3 또는 TRX2의 발현, 활성, 기능 중 하나 이상을 증진하는 것으로 확인된 시험물질을 대량생산하는 단계를 포함하는, 스트레스 민감 반응 완화제의 제조방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 스트레스 민감 반응은 스트레스에 의해 청반 노르에피네프린(LC-NE: locus ceruleus norepinephrine) 또는 부신피질 자극 호르몬 유리 호르몬(CRH: corticotropin releasing hormone)이 분비되어 직접 또는 간접적으로 발생되는 반응인 것인 스트레스 민감 반응 완화제의 제조 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 스트레스 민감반응은 스트레스에 의해 분비된 글루코코르티코이드(glucocorticoid) 호르몬에 의해 직접 또는 간접적으로 발생되는 반응인 것인 스트레스 민감 반응 완화제의 제조방법.
PRX3 또는 TRX2의 발현, 활성, 기능 중 하나 이상을 증진시키는 특성을 나타내는 스트레스 민감 반응 완화제를 함유하는 스트레스 개선용 식품 또는 사료.
제5항에 있어서, 상기 스트레스 민감 반응 완화제는 제1항 또는 제2항에 기재된 제조방법에 의해 제조된 것인 스트레스 개선용 식품 또는 사료.
스트레스 개선용 식품 또는 사료가 PRX3 또는 TRX2의 발현, 활성, 기능 중 하나 이상을 증진시키는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 것이 특징인 스트레스 개선용 식품 또는 사료의 제조방법.
(1) 세포를 준비하여 PRX3 또는 TRX2의 mRNA 또는 단백질의 발현을 감소시키는 제1단계;
(2) 시험물질을 상기 세포에 접촉시키는 제2단계; 및
(3) 상기 시험물질을 접촉시킨 세포에서의 PRX3 또는 TRX2의 mRNA 또는 단백질의 발현량과 시험물질을 접촉시키지 않은 세포에서의 PRX3 또는 TRX2의 mRNA 또는 단백질의 발현량을 비교하는 제3단계를 포함하는,
스트레스 민감 반응 완화제의 스크리닝 방법.
제8항에 있어서, 시험물질을 접촉시킨 세포에서의 PRX3 또는 TRX2의 mRNA 또는 단백질의 발현량이 시험물질을 접촉시키지 않은 세포에서의 PRX3 또는 TRX2 발현량보다 높은 시험물질을 스트레스 민감 반응 완화제로 선별하는 단계를 추가로 포함하는 스크리닝 방법.
제8항에 있어서, 상기 제1단계는 글루코코르티코이드를 처리하여 세포의 PRX3 또는 TRX2의 발현을 감소시키는 스크리닝 방법.
제8항에 있어서, 상기 제1단계의 세포는 실험동물의 형태로 제공되는 스크리닝 방법.
제11항에 있어서, 상기 실험동물에게 만성 스트레스를 가하는 단계를 추가로 포함하는 스크리닝 방법.
제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시험물질은 히스톤의 아세틸레이션을 촉진시키는 물질, 히스톤의 탈아세틸레이션을 억제시키는 물질 또는 히스톤의 이메틸레이션을 억제시키는 물질인 스크리닝 방법.
제13항에 있어서, 상기 시험물질은 히스톤 H3의 아세틸레이션을 촉진시키는 물질, 히스톤 H3의 탈아세틸레이션 또는 이메틸레이션을 억제시키는 물질인 스크리닝 방법.
PRX3, TRX2, PRX3의 발현 증진제, TRX2의 발현 증진제, PRX3의 활성제, 및 TRX2의 활성제로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질을 유효성분으로 포함하는, 스트레스 장애의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제15항에 있어서, 상기 발현 증진제 또는 활성제는 설피레독신(sulfiredoxin), FOXO3a, PGC-1α(Peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator 1α), 아포사이닌(apocynin), 또는 p47phox 작용 억제 물질인 것인 조성물.
제15항에 있어서, 상기 발현 증진제 또는 활성제는 PRX3 또는 TRX2와 관련된 히스톤의 아세틸레이션을 촉진시키거나, PRX3 또는 TRX2와 관련된 히스톤의 탈아세틸레이션 또는 이메틸레이션을 억제시키는 물질인 조성물.
제17항에 있어서, 상기 발현 증진제 또는 활성제는 PRX3 또는 TRX2와 관련된 히스톤 탈아세틸레이즈(deacetylases)의 억제제인 조성물.
제18항에 있어서, 상기 PRX3 또는 TRX2와 관련된 히스톤 탈아세틸레이즈의 억제제는 SAHA(suberoylanilide hydroxamic acid)인 조성물.
제15항에 있어서, 상기 스트레스 장애는 정신적 또는 신체적 만성 스트레스로 인한, 우울증, 불안증, 공포기억, 정신적 공황, 강박장애, 외상후 스트레스 장애, 정신분열증, 스트레스로 인한 두통, 신경변성 질병, 피로 증후군, 식사장애, 신경성 식욕부진, 위염, 위궤양, 알츠하이머성 치매, 파킨슨병, 뇌졸중 및 ALS로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 질환인 조성물.
스트레스 장애의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 또는 이의 유효성분이 PRX3 또는 TRX2의 발현, 활성 및 기능 중 하나 이상을 증진하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 것이 특징인 스트레스 장애의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물의 제조방법.
PRX3, TRX2, PRX3의 발현 증진제, TRX2의 발현 증진제, PRX3의 활성제, 및 TRX2의 활성제로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질을 인간을 제외한 개체에 투여하여 스트레스 장애를 예방 또는 치료하는 방법.
PRX3, TRX2, PRX3의 발현 증진제, TRX2의 발현 증진제, PRX3의 활성제, 및 TRX2의 활성제로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질을 포함하는, 스트레스 감소 또는 완화, 또는 스트레스 장애의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제23항에 있어서, 상기 스트레스 장애는 정신적 또는 신체적 만성 스트레스로 인한, 우울증, 불안증, 공포기억, 정신적 공황, 강박장애, 외상후 스트레스 장애, 정신분열증, 스트레스로 인한 두통, 신경변성 질병, 피로 증후군, 식사장애, 신경성 식욕부진, 위염, 위궤양, 알츠하이머성 치매, 파킨슨병, 뇌졸중 및 ALS로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 질환인 조성물.
개체로부터 분리된 생체 시료의 PRX3 또는 TRX2의 발현 레벨을 측정하는 단계를 포함하는, 스트레스 민감 반응 또는 반복적인 스트레스로 인해 발생하는 스트레스 장애 진단을 위한 정보제공방법.
제25항에 있어서, 상기 생체 시료는 혈액인 것인 정보제공방법.