KR20130002826A - Ｔｌｔ-6 단백질에 대한 항체 및 그 응용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 TLT(TREM-like transcript;TREM-유사 트랜스크립트)-6 단백질에 대한 항체 및 그 응용에 관한 것이다.

Description

ＴＬＴ-6 단백질에 대한 항체 및 그 응용{Antibody against TLT-6 and use of the same}

본 발명은 TLT(TREM-like transcript;TREM-유사 트랜스크립트)-6 단백질에 대한 항체 및 그 응용에 관한 것이다.

Trem(Triggering receptor expressed on myeloid cells) 단백질 및 Trem- 유사 단백질은 마우스의 17C 염색체 상에 존재하는 싱글 가변 타입 면역글로불린 도메인을 포함하는 구조적으로 연관된 단백질 계열이다. Trem 및 Trem-유사 수용체들은 거핵세포, 혈소판, T 세포 및 B 림프구뿐만 아니라 호중구, 단핵구, 마크로파지, 미세아교세포, 파골세포 및 수지상 세포와 같은 여러 골수 계열 세포 상에서 발현된다.

Trem 계열 단백질들은 선천성 및 후천성 면역 반응의 조절 모두에 중요한 역할을 한다. 예를 들어, Trem-1은 주로 염증과 관련되고 lipopolysaccharide에 의하여 유도된 조건 동안에 발현된다(Klesney-Tait J, Turnbull IR, Colonna M. (2006) Nat Immunol 7:1266-1273). 또한 Trem-2는 자가면역 질환의 네가티브 조절에 주된 역할을 한다(Jill F. and Daniel W.M. (2009) Current Opinion in Immunology 21:38-46;Turnbull IR, Gilfillan S, Cella M, Aoshi T, Miller M, Piccio L, Hernandez M, Colonna M. (2006) J Immunol . 15;177:3520-3524).

Trem-유사 계열에서, TLT(TREM-like transcript)-1는 마우스 및 인간에서 혈소판 응집에 의하여 염증 관련 출혈의 보호에 중요한 역할을 나타낸다,

본 발명은 목적은 TLT(TREM-유사 트랜스크립트)-6 단백질에 대한 항체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 과민성 면역 질환 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 과민성 면역 질환 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 과민성 면역 질환 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 TLT(TREM-유사 트랜스크립트)-6 단백질에 대한 항체를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서,상기 TLT(TREM-유사 트랜스크립트)-6 단백질은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 항체는 서열번호 7에 기재된 TLT(TREM-유사 트랜스크립트)-6 단백질의 에피토프에 결합하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 항체를 유효 성분으로 포함하는 과민성 면역질환 진단용 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 항체를 유효 성분으로 포함하는 과민성 면역질환 진단용 키트를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 항체를 유효 성분으로 포함하는 과민성 면역질환 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 '과민성 면역질환'은 '자가 면역질환'과 같은 의미로 사용되며, 자기의 체조직 자신에 대한 항체를 생산하거나, 체조직의 일부가 병적인 이물로 되어, 항생성을 가질 경우에, 자기 자신의 체조직에 대한 항체가 생성되어 여기서 일어나는 항원항체 반응이 여러 가지 질환을 일으키는 것을 의미하며, 대표적인 예는 류마티스성 관절염, 연소성 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염,쇼그렌 증후군, 홍반성 루프스, 구드패스츄어 증후군, 라이터 증후군, 피부경화증, 혈관염, 다발성 근염 및 피부근염을 포함한다. 이들 질환 중 대부분은 면역 질환과 관계된 이상 염증 반응을 포함한다.

본 발명은 본원에서 치료제 및/또는 진단제로서 사용할 수 있는 항-TLT-6 항체를 제공한다. 항체의 예로는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인간화 항체, 이중특이적 항체 및 이종접합체 항체가 있다.

폴리클로날 항체는 관련 항원과 면역보강제를 여러번 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 주사함으로써 동물에서 발생시키는 것이 바람직하다. 면역화될 종에서 면역원성을 나타내는 단백질에 관련 항원 (특히, 합성 펩티드가 사용되는 경우)을 접합시키는 것이 유용할 수 있다. 예를 들어, 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpethemocyanin; KLH), 혈청 알부민, 소 티로글로불린, 또는 이관능성 또는 유도체화 제제를 사용하는 대두 트립신 억제제, 예를 들어 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통해 접합됨), N-히드록시숙신이미드 (리신 잔기를 통해 접합됨), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl2 또는 R1N=C=NR (여기서, R 및 R1은 상이한 알킬기임)에 관련 항원을 접합시킬 수 있다.

예를 들어, 단백질 또는 접합체 100 ㎍ 또는 5 ㎍ (각각 토끼 또는 마우스에 대한 용량임)을 3배 부피의 프로인트 (Freund) 완전 면역보강제와 합하여, 이 용액을 여러 부위에 피내 주사함으로써 항원, 면역원성 접합체 또는 유도체에 대해 동물을 면역화시킨다. 1개월 후, 프로인트 완전 면역보강제에 포함된 펩티드 또는 접합체를 본래 양의 1/5 내지 1/10로 여러 부위에 피하 주사함으로써 동물에게 추가접종을 수행한다. 7일 내지 14일 후에,상기 동물을 채혈하여 혈청의 항체 역가를 분석한다. 역가가 정체 상태에 이를 때까지 동물에게 추가접종을 수행한다. 접합체는 또한 재조합 세포 배양물에서 단백질 융합체로 제조될 수 있다. 또한, 백반과 같은 응집제를 적합하게 사용하여 면역 반응을 증대시킨다.

모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 최초로 기재된 하이브리도마 방법을 이용하여 제조하거나, 재조합 DNA 방법 (미국 특허 제4,816,567호 참조)으로 제조할 수 있다.

하이브리도마 방법에서는, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물 (예컨대, 햄스터)을 상기 기재된 바와 같이 면역화시켜, 면역화에 사용된 단백질에 특이적으로 결합될 항체를 생성시키거나 또는 생성시킬 수 있는 림프구를 유도한다. 별법으로, 림프구를 시험관내 면역화시킬 수도 있다. 면역화시킨 후에, 림프구를 단리한 다음 적합한 융합제 (예컨대, 폴리에틸렌 글리콜)를 사용하여 골수종 세포주와 융합시킴으로써 하이브리도마 세포를 형성한다 (문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)]).

위와 같이 제조된 하이브리도마 세포를, 바람직하게는 융합되지 않은 모 골수종 세포 (융합 파트너로도 지칭됨)의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에 접종하여 성장시킨다. 예를 들어, 모 골수종 세포에 히포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT) 효소가 없는 경우, 하이브리도마용 선별 배양 배지는 통상적으로 HGPRT-결핍 세포의 성장을 억제하는 물질인 히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지)을 포함할 것이다.

바람직한 융합 파트너인 골수종 세포는 효율적으로 융합되고, 선별된 항체 생성 세포에 의해 항체가 안정하게 높은 수준으로 생성되는 것을 지지하는 세포이며, 융합되지 않은 모 세포로부터 상기 골수종 세포를 선별하는 선별 배지에 민감하다. 바람직한 골수종 세포주는 뮤린 골수종 세포주, 예컨대 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양으로부터 유래된 것 (살크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터 (Salk Institute Cell Distribution Center; 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)로부터 입수가능함), 및 SP-2 및 유도체 (예를 들어, X63-Ag8-653 세포; 아메리칸타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection; 미국 버지니아주 매나서스 소재)으로부터 입수가능함)이다. 인간 모노클로날 항체를 제조하기 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주 또한 문헌[Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)] 및 [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]에 기재되어 있다.

하이브리도마 세포가 성장하고 있는 배양 배지를 상기 항원에 대해 제시된 모노클로날 항체의 생성에 대해 분석한다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생성되는 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전법 또는 시험관내 결합 분석법, 예컨대 방사성면역분석법 (RIA) 또는 효소-연결 면역흡착분석법 (ELISA)에 의해 결정된다.

모노클로날 항체의 결합 친화도는 예를 들어 문헌 [Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)]에 기재된 스캣차드 (Scatchard) 분석에 의해 측정할 수 있다.

하이브리도마 세포가 원하는 특이성, 친화성 및/또는 활성을 갖는 항체를 생성하는 것으로 확인되면, 이 클론을 제한적 희석 절차에 의해 서브클로닝하여, 표준 방법에 의해 성장시킬 수 있다 (문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)]). 이러한 목적에 적합한 배양 배지로는 예를 들어 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지가 있다. 또한, 예를 들어 하이브리도마 세포를 마우스에 복강내 주사함으로써 하이브리도마 세포를 동물에서 복수 종양으로서 생체내에서 성장시킬 수 있다.

상기 서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 통상적인 항체 정제 절차, 예를 들어 친화성 크로마토그래피(예를 들어, 단백질 A-세파로스 또는 단백질 G-세파로스를 사용함), 이온 교환 크로마토그래피, 수산화인회석 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 등에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 분리하는 것이 적합하다.

모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 절차 (예를 들어, 뮤린 항체의 중쇄와 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함)을 이용하여 용이하게 단리하여 서열분석한다.

하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로서 기능한다. 단리된 후에, DNA는 발현 벡터 내에 위치할 수 있으며, 이 벡터는 이후에 숙주 세포, 예컨대 이. 콜라이 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 달리 항체 단백질을 생성시키지 않는 골수종 세포에 형질감염시켜 이 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체를 합성할 수 있다. 항체를 코딩하는 DNA를 박테리아에서 재조합 발현시키는 것에 대한 검토를 위해, 문헌 [Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993)] 및 [Plueckthun, Immunol.Revs., 130:151-188 (1992)]을 참조한다.

추가의 실시양태에서, 문헌 [McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)]에 기재된 기술을 이용하여 제작된 항체 파지 라이브러리로부터 모노클로날 항체 또는 항체 단편을 단리할 수 있다. 문헌 [Clackson et al.,Nature, 352:624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]에는 파지 라이브러리를 사용하여 각각 뮤린 항체 및 인간 항체 각각을 단리하는 방법이 기재되어 있다. 후속 간행물들은 쇄 셔플링(chain shuffling)에 의해 높은 친화성 (nM 범위)을 갖는 인간 항체를 제조하는 방법에 대해 기재하고 있으며(문헌 [Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)]), 또한 매우 큰 파지 라이브러리를 제작하기 위한 전략으로서 조합 감염과 생체내 재조합을 기재하고 있다 (문헌 [Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res.,21:2265-2266 (1993)]). 따라서, 이들 기술은 모노클로날 항체를 단리하기 위한 종래의 모노클로날 항체 하이브리도마 기술을 대체할 수 있는 방안이다.

항체를 코딩하는 DNA는, 예를 들어 동종 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄의 불변 도메인 (CH 및 CL) 서열로 대체하거나 (미국 특허 제4,816,567호, 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851(1984)]), 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드 (이종 폴리펩티드)에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부와 이뮤노글로불린 코딩 서열을 융합시킴으로써, 키메라 또는 융합 항체 폴리펩티드가 생성되도록 변형시킬 수 있다. 항체의 불변 도메인을 이러한 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드 서열로 대체시키거나, 또는 항체의 한 항원-결합 부위의 가변 도메인을 이들 폴리펩티드로 대체시켜, 항원에 대한 특이성을 나타내는 한 항원-결합 부위, 및 상이한 항원에 대한 특이성을 나타내는 다른 항원-결합 부위를 포함하는 2가의 키메라 항체를 생성할 수 있다.

또한, 본 발명의 항-TLT-6 항체는 인간화 항체 또는 인간 항체를 포함할 수 있다. 비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 인간화 형태는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 이뮤노글로불린, 이뮤노글로불린쇄 또는 이들의 단편 (예컨대, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열)이다. 인간화 항체는, 수용자의 상보성 결정 영역 (CDR)으로부터의 잔기를 원하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비-인간 종 (공여 항체)의 CDR로부터의 잔기로 대체시킨 인간 이뮤노글로불린 (수용 항체)을 포함한다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용 항체에서도 발견되지 않고, 도입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 통상적으로는 2개 이상의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 이뮤노글로불린의 영역에 상응하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 이뮤노글로불린 공통 서열의 영역에 해당한다. 또한, 인간화 항체는 적어도 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc)의 일부, 통상적으로는 적어도 인간 이뮤노글로불린 영역의 일부를 포함하는 것이 가장 적합할 것이다 (문헌 [Jones et al., Nature, 321:522-525(1986)]; [Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988)] 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596(1992)]).

비인간 항체를 인간화시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 인간화 항체에는 비-인간 공급원으로부터 유래된 하나 이상의 아미노산 잔기가 도입되어 있다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 흔히 "임포트(import)" 잔기로 언급되며, 통상적으로는 "임포트" 가변 도메인으로부터 얻는다. 인간화는 본질적으로 인간항체의 상응하는 서열을 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 치환함으로써 윈터 (Winter) 및 그의 동료들의 방법 (문헌[Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988)], [Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)])에 따라 수행할 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 무손상인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 적은 서열이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 치환된 키메라 항체 (미국 특허 제4,816,567호)이다. 실제로, 인간화 항체는 통상적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기를 설치류 항체의 유사한 부위로부터의 잔기로 치환시킨 인간 항체이다.

인간화 항체 제조에 사용될 인간 가변 도메인 (경쇄 및 중쇄 둘 모두)을 선택하는 것은 항체가 인간 치료용으로 사용되는 경우에 항원성 및 HAMA 반응 (인간 항-마우스 항체)을 감소시키는데 매우 중요하다. 소위 "가장-적합한 (best-fit)" 방법에 따라, 공지된 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리를 대상으로 설치류 항체의 가변 도메인 서열을 스크리닝한다. 설치류의 V 도메인 서열과 가장 유사한 인간 V 도메인 서열을 확인하고, 이 서열 내의 인간 프레임워크 영역 (FR)이 인간화 항체에 수용된다 (문헌 [Sims et al., J. Immunol. 151:2296(1993)], [Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)]). 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위군에 속하는 모든 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 특정 프레임워크 영역을 사용한다. 이와 동일한 프레임워크를 여러 상이한 인간화 항체에 대해 사용할 수 있다 (문헌 [Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,89:4285 (1992)], [Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)]).

또한, 항체를 항원에 대한 높은 결합 친화성 및 다른 유리한 생물학적 특성을 유지한 상태로 인간화시키는 것도 중요하다. 상기 목적을 달성하기 위해, 바람직한 방법에 따라, 모 서열 및 인간화 서열의 3차원적 모델을 이용하여 모 서열 및 다양한 이상적 인간화 생성물의 분석 방법에 의해 인간화 항체를 제조한다. 3차원적 이뮤노글로불린 모델은 시판되고 있으며, 이는 당업자에게 친숙한 것이다. 선별된 후보 이뮤노글로불린 서열의 가능한 3차원 입체구조를 설명하고 보여주는 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다. 이 디스플레이를 사용하여 정밀조사함으로써 후보 이뮤노글로불린 서열이 기능함에 있어 잔기의 가능한 역할, 즉 항원에 결합하는 후보 이뮤노글로불린의 능력에 영향을 끼치는 잔기를 분석할 수 있다. 이러한 방법에서는, FR 잔기를 수용 서열과 임포트 서열로부터 선별하여 조합함으로써 원하는 항체 특징이 달성되도록, 예를 들어 표적 항원(들)에 대한 친화성이 증가되도록 할 수 있다. 일반적으로, 초가변 영역 잔기는 항원 결합에 영향을 주는데 있어서 직접적으로 및 가장 실질적으로 관여한다.

인간화 항-TLT-6 항체의 다양한 형태도 고려된다. 예를 들어, 인간화 항체는 면역접합체를 생성시키기 위해 임의로는 1종 이상의 세포독성제(들)에 접합시킨 항체 단편, 예컨대 Fab일 수 있다. 별법으로, 인간화 항체는 무손상 IgG1 항체와 같은 무손상 항체일 수 있다.

인간화에 대한 대안으로서, 인간 항체를 제조할 수 있다. 예를 들어, 면역화시킬 때, 내인성 이뮤노글로불린의 부재하에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생성할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)을 제조하는 것이 현재 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 생식세포주 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역 (JH) 유전자를 모두 결실시키면 내인성 항체 생성이 완전히 억제된다고 기재된 바 있다. 인간 생식세포주 이뮤노글로불린 유전자 어레이를 이러한 생식세포주 돌연변이 마우스에 전달하면 항원 접종시 인간 항체가 생성될 것이다 (문헌[Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)], [Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993)], [Bruggemann et al., Year in Immuno. 7:33 (1993)], 미국 특허 제5,545,806호, 동 제5,569,825호, 동 제5,591,669호 (모두 겐파름 (GenPharm)의 특허임), 동 제5,545,807호 및 국제 공개 제97/17852호 참조).

별법으로, 파지 디스플레이 기술 (문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)])을 이용하여 면역화되지 않은 공여자로부터의 이뮤노글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 시험관내에서 제조할 수 있다. 이러한 기술에 따라, 항체 V 도메인 유전자는 M13 또는 fd와 같은 섬사상 박테리오파지의 주요 또는 부수적인 외피 단백질 유전자로 프레임에 맞게 클로닝되어 파지 입자의 표면 상에 기능적 항체 단편으로 디스플레이된다. 섬사상 입자가 파지 게놈의 단일 가닥 DNA 카피를 함유하기 때문에, 항체의 기능성에 기초한 선별로부터 이러한 특성을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자를 선별할 수 있다. 따라서, 파지는 B-세포의 성질 중 일부를 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 형식으로 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌[Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)]). V-유전자 절편의 여러 공급원을 파지 디스플레이에 사용할 수 있다. 클랙슨 (Clackson) 등은 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 작은 무작위적인 조합 라이브러리로부터 다양한 항-옥사졸론 항체 어레이를 단리하였다 (문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)]. 면역화되지 않은 인간 공여자로부터의 V 유전자 레퍼토리를 제작할 수 있으며, 다양한 항원 어레이 (자가 항원 포함)에 대한 항체는, 본질적으로 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)] 또는 [Griffith et al., EMBO J. 12:725-734(1993)]에 기재된 기술에 따라 단리할 수 있다. 또한, 미국 특허 제5,565,332호 및 동 제5,573,905호를 참조한다.

상기 논의된 바와 같이, 인간 항체는 시험관내에서 활성화된 B 세포에 의해서도 생성될 수도 있다 (미국 특허제5,567,610호 및 동 제5,229,275호 참조).

본 발명에 따라 사용되는 항-TLT-6항체의 치료 제제는, 원하는 순도의 항체, 폴리펩티드, 올리고펩티드 또는 유기 분자를 임의의 제약상 허용되는 담체,부형제 또는 안정화제 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)])와 혼합하고, 이를 동결건조된 제제 또는 수용액의 형태로 저장하여 제조한다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이며, 아세테이트, 트리스 (Tris), 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제; 보존제 (예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀,부틸 알콜 또는 벤질 알콜; 메틸 파라벤 또는 프로파일 파라벤 등의 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로

헥산올; 3-펜탄올 및 m-크레졸); 저분자량 (잔기 약 10개 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘,아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이팅제; 트레할로스 및 염화나트륨과 같은 등장화제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당; 폴리소르베이트와 같은 계면활성제; 나트륨과 같은 염-형성 카운터이온; 금속 착제 (예를 들어, Zn-단백질 착제) 및/또는 트윈(등록상표), 플루로닉스(등록상표) 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 비이온성 계면활성제가 있다. 바람직하게는, 상기 제제는 5 내지 200 mg/mL의 농도, 바람직하게는 10 내지 100 mg/mL의 농도의 항체를 포함한다.

필요한 경우, 본 발명의 제제는 필요하다면 치료될 특정 징후에 사용되는 1종 초과의 활성 화합물, 바람직하게는 서로에 대해 유해한 영향을 끼치지 않는 보완 활성을 나타내는 화합물을 함유할 수도 있다.

또한, 활성 성분은 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어 리포좀, 알부민 미소구, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노-캡슐) 또는 마크로에멀젼에서 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합체와 반응 (예를 들어, 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트)마이크로캡슐)에 의해 제조된 마이크로캡슐에 넣어 제조할 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition,Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.

서방형 제제를 제조할 수 있다. 서방형 제제의 적합한 예로는 상기 항체를 함유하는 고상 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 있는데, 이러한 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐 형태이다. 서방형매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 γ에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포 (LUPRON DEPOT; 등록상표) (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 미소구) 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 있다.

생체내 투여에 사용될 제제는 멸균되어야만 한다. 이는 멸균 여과막을 통해 여과시킴으로써 용이하게 달성된다.

과민성 면역질환에서의 TLT-6 발현을 결정하기 위해서, 다양한 진단 분석법이 이용가능하다. 한 실시양태에서, TLT-6폴리펩티드의 과다발현은 면역조직화학법 (IHC)으로 분석할 수 있다.

TLT-6 과다발현 또는 증폭은, 예를 들어 검출할 분자에 결합하고 검출가능한 표지 (예를 들어 방사성 동위원소 또는 형광 표지) 태그가 부착된 분자 (예컨대, 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자)를 투여하고, 상기 표지가 국소화되어 있는 위치에 대해 환자를 외부에서 스캐닝하는 생체내 진단 분석법을 이용하여 평가할 수 있다.

상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 항-TLT-6항체는 다양한 비치료 분야에 적용할 수도 있다. 상기 항체는 세포로부터 TLT-6 폴리펩티드를 정제하거나 면역침전시키는 경우, TLT-6 폴리펩티드를 예를 들어 ELISA 또는 웨스턴 블롯 등을 통해 시험관내에서 검출하여 정량하는 경우, 다른 세포의 정제를 위한 한 단계로서 혼합된 세포 집단으로부터 TLT-6-발현 세포를 사멸시키고 제거하는 데에도 유용하다.

항-TLT-6항체는 공지된 방법, 예를 들어 일정 기간에 걸친 연속 주입에 의한 정맥내 투여에 의해, 또는 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활액낭내, 초내, 경구, 국소 또는 흡입 투여 경로에 의해 인간 환자에게 투여된다.

과민성 면역 질환을 예방하거나 치료하기 위해서, 의사는 공지된 기준에 따라 투여량 및 투여 방식을 선택할 것이다. 항체의 적절한 투여량은 상기 정의된 바와 같이 치료될 질환의 유형, 질환의 중증도와 경과 상태, 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자를 예방 목적으로 투여하는지 또는 치료 목적으로 투여하는지의 여부, 선행 요법, 환자의 임상 병력, 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자에 대한 환자의 반응, 및 담당의사의 판단에 따라 달라질 것이다. 상기 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자는 환자에게 한번에 투여하거나, 또는 치료 기간 전반에 걸쳐 연속적으로 투여하는 것이 적합하다.질환의 유형과 중증도에 따라서, 환자에게 예를 들어 1회 이상 개별 투여하거나 연속 주입에 의해 투여하기 위한 초기 후보 투여량은 체중 1 kg 당 항체 약 1 ㎍ 내지 약 50 mg (예를 들어, 약 0.1 내지 15 mg/kg/투여량)일 수 있다. 투약법은 항-TLT-6항체 약 4 mg/kg의 초기 로딩투여량을 투여한 후에 항-TLT-6항체 약 2 mg/kg의 유지 투여량을 매주 투여하는 것을 포함할 수 있다. 그러나,다른 투약법이 유용할 수도 있다. 통상적인 일일 투여량은 상기 언급된 요인들에 따라 약 1 ㎍/㎏ 내지 100mg/㎏ 이상의 범위일 것이다. 상태에 따라, 며칠 또는 그 이상에 걸쳐 반복하여 투여하는 경우에는, 질환의 징후가 원하는 만큼 저해될 때까지 지속적으로 처치한다. 이러한 치료법의 진행 과정은 의사 또는 다른 당업자에 게 공지되어 있는 기준을 바탕으로 통상적인 방법 및 분석에 의해 용이하게 모니터링할 수 있다.

항체 단백질을 환자에게 투여하는 것과는 별개로, 본 출원은 항체를 유전자 요법에 의해 투여하는 것을 고려한다. 이처럼 항체를 코딩하는 핵산을 투여하는 것은 "치료 유효량의 항체 투여"라는 표현이 포괄한다. 예를 들어, 세포내 항체를 제조하는 유전자 요법의 이용에 대해서는 국제 공개 제96/07321호 (1996년 3월 14일자로 공개됨)을 참조한다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명에서 본 발명자들은 in silico differential display 방법을 사용하여 조혈 세포의 분화 또는 성숙의 과정에 관여할 수 있는 조혈모세포 또는 조혈 계보 세포(lineage cell)에서 발현된 새로운 수용체 타입 유전자를 동정하고자 하였다. 본 발명자들은 성숙한 조혈 세포에서보다 조혈 모세포에서 더 발현되는 몇 수용체 타입 유니진(unigene)을 발견하였다. 그들 중에서, 본 발명자들은 조혈 줄기/전구 세포, 단핵구, 마크로파지, T 세포, 및 B 세포를 포함하는 다수의 조혈 계보 세포상에서 발현되는 새로운 TREM 계열 유전자인 TLT-6을 동정하였다.

본 발명에서 본 발명자들은 TLT-6의 생물학적 역할을 포함하여 분자 및 발현의 특성을 기술한다.

조혈 모세포의 증식 및 분화에 관련된 새로운 유전자를 찾기 위한 시도에서 본 발명자들은 in silico 바이오인포매틱스를 통해서 Trem(Triggering receptor expressed on myeloid cells) 계열의 새로운 멤버인 Trem-like 6(TLT-6) 유전자를 동정하였다. TLT-6는 SHP-2와 작용할 수 있는 두 ITIM(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif-like) 도메인을 포함하는 긴 사이토프라즈믹 부위 및 세포외 부위에 단이 면역글로불린(Ig) 도메인을 가진다. 흥미롭게도, TLT-6 전사체 및 단백질은 조혈 모/전구 세포, 단핵구, 마크로파지, T 세포, 및 B 세포를 포함하는 대부분의 조혈 계보 세포에서 세포내 또는 세포 표면에서 발현된다. TLT-6 단백질은 자극에 의해서 T 세포, B 세포 및 마크로파지의 표면 상에서 업-레귤에이트된다. 기능 분석은 TLT-6은 조혈 전구 세포의 분화 및 증식에 관련되나 T 세포 및 마크로파지에서 항 증식 효과를 보였다. 본 발명의 결과는 새로운 Trem 게열 분자인 TLT-6는 여러 조혈 계보 세포에서 발현되고 조혈 전구 세포, T 세포, 또는 마크로파지의 활성화 및 증식을 포지티브 또는 네가티브하게 조절한다는 것을 나타낸다.

본 발명을 상세하게 설명한다.

TLT -6의 클로닝 및 특성

조혈 모세포(HSC;hematopoietic stem cells)에서 주로 발현되는 새로운 후보 유전자들을 동정하기 위하여, 본 발명자들은 마우스 HSCs(c-Kit+Sca-1+ Lin-) 및 성숙 조혈 세포 사이의 발현서열표지(EST;expressed sequenced tag) 유니진 라이브러리를 사용하여 디지털 차별(differentiation) 디스플레이를 수행하였다. 많은 수의 유전자들이 성숙 조혈 세포와 비교하여 HSCs에서 과발현되었다. 그들 중에서, 본 발명자들은 그것의 단백질 서열에 기초하여 막횡단 도메인을 가지는 18개 유전자를 최종적으로 선택하였다. 그들 중 하나는 TREM(triggering receptors expressed on myeloid cells) 수용체 계열과 큰 호모로지를 가지는 것을 발견하여서 TLT-6로 명명하였다. 그 예측된 아미노산 서열은 22-aa 리더 서열, 56-aa 세포외 도메인, 23-aa 막횡단 도메인 및 112-aa 원형질 부위를 나타내었다. 다른 Trem 계열 유전자와 같이, TLT-6는 두 대표적인 ITIM(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif-like) 유사 모티프(ICYASL, VEYASI) 를 가지는 사이토프라즈믹 부위 및 하나의 면역글로불린(Ig) 도메인을 가지는 세포외 부위를 가지며 이것은 TLT-6가 타이로신 매개된 저해 신호전달 경로에 관련되었다는 것을 암시한다(도 1A). TLT-6의 분자량을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 인 비트로 번역 방법을 사용한 Flag-tagged TLT-6 cDNA로 단백질을 번역하였고 약 42 kD 단백질을 나타내었다(도 1B). TLT-6는 사이토프라즈믹 부위에 두 대표적인 ITIM 모티프인 ICYASL 및 VEYASI를 포함하고, 따라서 인산화된 경우에 SHP-1 또는 SHP-2와 같은 단백질 포스파테이즈를 모집할 수 있을 것이다. 이 가능성을 테스트하기 위해서, HA 태그된 TLT-6 트랜스진을 SHP-1 및 SHP-2 단백질을 발현하는 HeLa 세포에 넣었다. pervanadate 처리로 자극화한 후, 본 발명자들은 항-HA 항체로 면역침전을 수행한 후 웨스턴 블럿팅으로 항-SHP-1 또는 SHP-2 단백질을 확인하였다. 본 발명자들은 TLT-6가 SHP-2와는 상호작용하나, SHP-1와는 작용하지 않는 것을 관찰하였고, 이것은 SHP-2가 주로 TLT-6 매개된 저해 신호 경로에 관련되었다는 것을 나타낸다(도 1C)

TLT -6의 발현

여러 조직에서 mRNA 발현을 확인하기 위하여, 노던 블럿 분석을 수행하였다. 본 발명자들은 TLT-6가 다른 조직에서는 발현되지 아니하고 오직 골수에서만 발현된다는 것을 발견하였고 이것은 TLT-6가 골수 조혈작용에 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다. 조혈 계보 세포에서 TLT-6의 발현 프로파일을 더 특성화하기 위하여 각 조혈 계보 세포를 골수, 비장, 및 말초 혈액으로부터 유세포 분석기로 얻었다. RT-PCR 분석은 TLT-6는 B 세포, 적혈구, CD4⁺ T 세포, CD8⁺ T 세포, CD11b⁺ 단핵구, 과립구 및 CD11c⁺ 세포에서는 발현되었지만 NK1.1⁺ 세포에서는 낮게 발현되었다(도2B). 또한, TLT-6 전사체는 조혈 모세포(c-Kit⁺Sca-1⁺Lin^-) 또는 전구세포에서 상대적으로 강한 발현을 나타내었다(도 2C)

TLT -6의 세포내 위치

TLT-6 단백질을 위치를 확인하기 위하여, Flag 태그된 TLT-6 발현 벡터를 HeLa 세포에 트랜스팩션 후 유세포 분석기를 사용하여 발현을 확인하였다. 유세포 분석 방법으로부터, TLT-6 단백질은 HeLa 세포의 세포 표면상에서 검출되었다(도 3A). 또한, GFP 융합 TLT-6 단백질은 막횡단 부위 및 세포내 부위 모두에서 관찰되었다(도 3B). TLT-6 단백질이 미토콘드리아 막에서도 발현되는지를 더 상세하게 분석하기 위하여, 본 발명자들은 GFP 융합 TLT-6 및 mitotracker, 막 포텐셜-의존적인 염료를 사용하여 면역형광 분석을 수행하였고, TLT-6-GFP 단백질이 mitotracker 양성 부위와 같은 위치에 있었다는 것을 관찰하였고 이것은 TLT-6가 미토콘드리아 막과 세포 표면 모두에서 발현된다는 것을 나타낸다(도 3C). TLT-6가 HeLa 세포에서 과발현될 때, 미토콘드리아 형태는 비고정된 조건에서 크게 변하였다. 미토콘드리아 변화의 정도는 TLT-6의 발현 수준과 상관관계가 있었다. 60% 이상의 TLT-6 발현 HeLa 세포는 핵 주위에 미토콘드리아 뭉침을 나타내었고 결국 세포의 형태적 변화를 야기하였다.

TLT -6 단백질의 발현 특성

조혈 계보 세포에서 TLT-6 발현의 단백질 수준을 결정하기 위하여, 본 발명자들은 TLT-6 단백질의 세포외 도메인에 대한 단클론 항체를 제조하였다. 단클론항체를 사용하여, GFP 융합 TLT-6 단백질에 의하여 세포내 및 세포표면 모두에서 발현되기 때문에 본 발명자들은 골수, 흉선 및 림프절로부터 유래한 조혈 세포로 표면 및 세포 내에서 TLT-6의 발현 특성을 분석하였다. 유 세포분석기 분석으로부터, 본 발명자들은 TLT-6 단백질 발현하는 양성 세포가 조혈모세포(c-Kit+Sca-1+Lin- 세포)에서는 없으나, 골수의 CD11b+ 세포 및 B220+ 세포에서 약간의 양성세포가 존재하였다. 그러나, TLT-6의 세포내 염색은 HSCs 및 CD11b+에서는 TLT-6 발현 세포가 많이 존재하고, 골수의 B220+ 세포 내에서는 상대적으로 적게 존재한다는 것을 나타내었다. 또는 흉선 세포의 표면에서는 TLT-6의 양성 세포가 검출되지 않았고 림프절의 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포 및 B세포에서는 적은 양성 세포가 검출되었다. 대조적으로, TLT-6는 림프절의 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포뿐 아니라 흉선의 CD4-CD8- T 세포 및 CD4+ T 세포에서 크게 발현되어 세포 내에서 검출되었으나 흉선의 CD4+CD8+ T 세포 및 CD8+ T 세포 그리고 림프절의 B220+ 세포에서는 낮게 발현되었다. 이들 데이터는 TLT-6 단백질이 골수, 흉선 및 림프절의 일차 세포의 조혈 모세포, 단핵구, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 및 B 세포에서 발현된다는 가능성을 암시한다.

다음으로, 본 발명자들은 LPS로 복강 마크로파지의 활성화가 세포 표면의 TLT-6 발현을 유도하는지의 가능성을 테스트하였다. 세포 내로부터 세포 표면으로 TLT-6 단백질의 이동을 조사하기 위하여, 세포를 고정하고 항-TLT-6 항체로 염색한 후 항-TLT-6 (FITC) 및 F4/80(PE)로 염색하여 TLT-6의 발현을 분석하고, 공초점 현미경으로 확인하였다. 도 5에서, TLT-6 단백질은 휴지기 마크로파지에서 세포 내에서 강하게 검출되었지만 세포 표면에는 적게 발현되었다. 그러나 LPS 처리로 활성화된 마크로파지는 세포 표면에 TLT-6의 강한 발현을 나타내었다. 이들 데이터는 TLT-6 단백질이 마크로파지에서 활성화에 의하여 세포 내에서 세포 표면으로 이동한다는 것을 암시한다.

조혈 전구 세포에서 TLT -6의 발현 및 역할

인 비트로 배양한 경우, TLT-6 단백질은 Sca-1+c-Kit-Lin- 및 Sca-1-c-Kit-Lin- 조혈 전구 세포 모두에서 검출되었지만 조혈모세포(c-Kit+Sca-1+Lin-) 및 전구세포(c-Kit+Sca-1-Lin-) 모두에 존재한다. 따라서 본 발명자들은 콜로니 형성 분석을 사용한 아고니스트 항-TLT-6 mAb로 조혈 모세포의 분화의 과정에서 TLT-6의 생물학적 활성을 확인하였다. 도 5A에서 나타낸 것과 같이, TLT-6 처리된 세포는 비처리된 세포에 비하여 더 높은 수의 콜로니 형성 세포를 나타내었다. 흥미롭게도, 항-TLT-6 mAb는 과립구 콜로니의 수를 현저하게 증가시켰고 이것은 TLT-6가 골수에서 조혈 전구세포의 증식 및 분화에 관련된다는 것을 암시한다.

활성화 수반 T 세포에서 TLT -6 발현의 업- 레귤레이션

본 발명자들은 TLT-6 단백질이 림프절 유래된 T 세포에서 활성화에 의하여 이동될 수 있는지를 테스트하였다. T 세포를 항-CD3 및 -CD28 mAbs로 자극하고 유세포 분석기로 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 세포 표면에서 TLT-6의 발현을 분석하였다. 비록 TLT-6 양성 세포가 CD4+ T 세포에서 활성화에 의하여 조금 감소하였지만, 비자극된 세포와 비교하여 세포 표면 상 CD8+ T 세포에서는 TLT-6 양성세포가 크게 증가하였다. TLT-6 단백질 발현의 강도는 CD8+ T 세포에서 크게 증가하였다.

T 세포에서 TLT-6의 기능적 역할을 확인하기 위하여, TLT-6 mAb를 3일 동안 CD3+ T 세포에 항-CD3 및 -CD28 항체로 처리하였다. 도 7B에 나타낸 것과 같이, T 세포는 용량 의존적인 형태로 TLT-6 mAb의 처리에 의하여 항 증식 효과를 나타내었다. 또한, 본 발명자들은 B 세포가 활성화 신호에 의하여 세포 표면 상 발현을 업-레귤레이션하는지를 조사하였다. B220+ 세포를 림프절로부터 정제한 후 3일 동안 LPS 처리로 자극하였다. B 세포는 대조군 세포와 비교하여 LPS 자극화에 의하여 세포 표면 상 TLT-6 발현 양성 세포가 약 2배 증가하였다(도 7C). 그러나 항-TLT-6 mAb의 처리에 의하여 B 세포에서 TLT-6의 생물학적 효과는 없었다(도시 안함).

TLT -6는 마크로파지의 증식을 저해하고 그 발현을 업- 레귤레이션

Trem 수용체 계열 유전자는 염증을 포함하는 골수 세포의 분화 및 활성화의 조절에 관련되었기 때문에, 본 발명자들은 마크로파지에서 TLT-6의 발현 프로파일 및 생물학적 활성을 조사하였다. 먼저 본 발명자들은 RAW 및 복강에서 유래한 마크로파지에서 자극에 의하여 TLT-6가 업-레귤레이션되는지를 확인하였다. LPS로 자극하여, TLT-6를 발현하는 양성세포는 RAW 및 복강의 마크로파지에서 크게 증가하였다(도 6 A, B).

다음, 본 발명자들은 마크로파지에서 TLT-6의 기능적 역할을 조사하였다. TLT-6 트랜스진으로 과발현된 RAW 세포는 대조군 세포와 비교하여 세포 성장에서 큰 저해를 나타내었다. TLT-6 mAbs을 사용하여, 세포를 대조군 세포보다 항-TLT-6 mAb 처리된 세포에서 유사한 항 증식 효과를 나타내었다. 이들 데이터는 TLT-6 가 마크로파지에서 활성화 및 증식의 과정에서 직접적으로 관여한다는 것을 나타낸다.

TLT -6의 인 비보 효과

본 발명자들은 CMV-프로모터의 조절 하에서 TLT-6 cDNA를 사용한 TLT-6 형질전환 마우스를 제조하였다. 형질전환 마우스를 사용하여, 본 발명자들은 먼저 TLT-6 형질전환 마우스 및 야생형 마우스 사이의 골수, 흉선, 비장 및 림프절의 전체 세포수를 비교하였다. 골수 및 흉선에서 전체 세포수는 크게 감소하였지만 비장 및 림프절에서는 그러하지 않았다. 다음 시도로, 골수, 흉선, 비장 및 림프절을 유세포 분석을 수행하였다. CD11b+ 단핵구의 퍼센트가 골수에서는 감소하였지만 다른 조혈 계보세포, T 세포, B 세포 및 골수 세포에서는 큰 차이가 없었다. 흉선 세포에서 낮은 세포수의 이유를 이해하기 위하여, 본 발명자들은 Fas 자극으로부터 흉선세포의 생존 효과를 테스트하였고 야생형 마우스와 비교하여 TLT-6 과발현 흉선세포에서 Fas 자극에 의한 세포 생존은 크게 감소하였다는 것을 확인하였다. 이들 결과는 골수 단핵구 및 흉선세포에서 생존 또는 증식의 조절에 TLT-6가 관련되었다는 것을 암시한다.

본 발명을 통해서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 항-TLT-6 항체는 과민성 면역질환의 진단 그리고 예방 및 치료 등에 사용될 수 있다.

도 1은 TLT-6의 동정 및 서열분석을 나타낸 그림. (A) TLT-6의 예측된 아미노산 서열, 도메인 및 모티프를 나타냄. 리더 서열 및 막횡단 도메인은 밑줄로 세포외 부위의 가변 타입의 면역글로불린 유사 도메인은 굵은 선으로 표시. TLT-6의 세포내 부위의 ITIM-유사 모티프는 박스로 표시. (B) Flag- 태그된 TLT-6에 대한 분자량은 in vitro 전사/번역 시스템을 사용하여 분석하였고 TLT-6는 약 40 kDa 분자량을 나타내었다. (C) 동시면역침전법을 사용하여 TLT-6와 상호작용하는 단백질을 동정하였다. 내생적으로 SHP-2 발현하는 HeLa 세포를 HA-태그된 TLT-6 트랜스팩션을 위해 사용하였고, 항-Flag 항체로 면역침전한 후 항-phospho SHIP 또는 SHP-2 mAbs으로 면역블럿팅을 하였다.
도 2는 TLT-6 발현의 RT-PCR 분석 및 노던 블럿팅을 나타낸 그림. (A) TLT-6 mRNA의 발현 특성을 노던 블럿 분석으로 분석하였다. TLT-6 전사체는 골수 조직에서만 검출됨. (B) TLT-6 분석의 RT-PCR분석은 골수, 비장 및 말초 혈액에서 정제된 조혈 계보 세포로 수행되었다. TLT-6는 테스트한 모든 조혈 계보 세포에서 발현되었다. cDNA 농도는 베타-액틴을 사용하여 표준화되고 정량되었다. (C) TLT-6 발현은 RT-PCR을 사용하여 마우스 골수로부터 분리된 조혈 모세포(K+S+L-) 및 전구세포(K+S+L-, K-S+L-, 및 K-S-L-)에서 결정하였다. TLT-6는 조혈 모/전구 세포에서 강하게 발현되었다. RT-PCR을 위하여, cDNA 농도는 베타-액틴을 사용하여 조정하였다.
도 3은 TLT-6의 세포내 위치를 나타낸 그림. (A) TLT-6는 막 분획에서 발현됨. (B) TLT-6는 세포 막에 존재. Flag-태그된 TLT-6 (SP-flag2X-mTLT-6) 및 FACS 분석을 사용함. (C) GFP-태그된 TLT-6는 세포 막 및 미토콘드리아 막 모두에 위치함. 화살표는 막을 나타내고 화살표 머리는 미토콘드리아를 나타냄.
도 4는 TLT-6가 미토콘드리아 뭉침과 에팝토시스를 조절하는 것을 나타낸 그림. (A) GFP-TLT-6 트랜스팩션된 HeLa 세포는 TLT-6가 변형된 부위에 모이는 미토콘드리아 변형을 나타냄. MitoTracker^TM 키트를 사용하여 미토콘드리아를 염색. 녹색: TLT-6, 적색: 미토콘드리아, 청색: 핵 (B) TLT-6는 에팝토시스를 야기하고 TLT-6 과발현된 세포에서 증식을 저해함. PI 및 annexin V를 염색에 사용함. (C) Cytochrome C는 TLT-6 과발현된 세포에서 증가됨. Cytochrome C-FITC를 염색에 사용함.
도 5는 인 비보 마우스에서 TLT-6의 발현 패턴을 나타낸 그림. (A) 골수; TLT-6는 CD11b 계보의 세포 내에서 강하게 발현되고, B-세포 마커인 B220에서 유사한 발현 패턴을 나타냄. (B) 흉선세포(Thymocyte); TLT-6는 더블 네가티브 및 CD4 포지티브 부위, 헬퍼 T 세포 군의 세포내 부위에서 강하게 발현됨 (C) 림프절; TLT-6는 B-세포 및 T-세포 군의 세포내 부위에서 발현됨. 이 분석에서 제조한 단클론항체#3-10를 사용함.
도 6은 림프절의 활성화 동안 TLT-6의 발현 패턴 변화를 나타낸 그림. (A) 활성화된 CD4 포지티브, 헬퍼 T 세포에서, TLT-6는 정상과 비교하여 세포내 부위에서 강하게 발현됨. TLT-6 발현 레벨의 강도는 세포 하나 당 증가되었다. (B) 활성화된 CD8 포지티브, 세포독성 T 세포에서, TLT-6는 활성화된 CD4 양성 세포에서 유사한 발현 패턴을 나타냄. 표면 염색에서, TLT-6는 5일 후에 강하게 발현됨. (C) T 세포를 1 ug/ml CD3e 및 1 ug/ml CD28을 사용하여 활성화시킬 때, T 세포 증식이 감소함.
도 7은 TLT-6는 세포가 활성화된 경우에 증가하고 림프구 및 단핵구 세포의 증식을 조절한다는 것을 나타낸 그림. (A) LPS로 활성화된 Raw 세포에서, TLT-6의 발현 수준은 용량의존적으로 세포내 부위에서는 높지 않았지만 표면에서는 높았다. (B) M-CSF를 가지는 복막 마크로파지에서, TLT-6의 강한 발현은 그 표면 부위에서 나타냄. (C) 골수 유래 CD11b 세포를 M-CSF로 처리한 경우, TLT-6는 복막 마크로파지에서와 같이 강한 발현을 나타냄. (D) Raw 세포를 10 ng/ml M-CSF 및 단클론항체 #3-10로 동시 처리한 경우, Raw 세포의 증식이 저해됨.
도 8은 TLT-6가 형질전환 마우스에서 세포 수 및 증식을 조절한다는 것을 나타낸 그림. (A) 형질전환 마우스의 생산. 게놈 PCR 및 RT-PCR을 사용하여 게놈으로부터 삽입을 체크함. (B) 전체 골수, 흉선세포, CD11b+, 및 CD11c+ 계보. 정상과 비교할 경우, 형질전환 마우스 세포가 감소됨. (C) FasL에 의한 에팝토시스 신호전달. 형질전환 마우스에서 T 세포의 전체 세포 수는 정상과 비교하여 감소함.
도 9는 TLT-6의 아미노산 서열 및 염기서열을 나타낸 그림.

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재한 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

실시예 1: 세포 배양

C57BL/6 마우스는 오리엔트로부터 구입하였고 무균 환경에서 유지하였다. Murine CD3⁺ T 세포를 항-CD3 MicroBeads로 림프절로부터 분리하였다. TLT-6 전사체의 발현을 조사하기 위하여, 골수, 흉선, 림프절 및 말초 혈액으로부터 조혈 계보 세포를 분리하고 FACSvantageSE (BD Biosciences,San Jose, CA, USA)를 사용하여 특이적인 항체로 염색하여 분석하였다. 복강 마크로파지는 복강 삼출물로부터 흡입하였다. 골수 유래 마크로파지를 제조하기 위하여, 전체 골수를 10% 우태아 혈청 및 5ng/ml M-CSF가 보충된 DMEM배지에서 배양하였다. 세포를 5-6 일간 배양하였다. Raw264.7 및 HeLa 세포는 10% 우태아 혈청 및 1% penicillin/streptomycin (Gibco, Grand Island, NY, USA)이 보충된 Dulbecco's modified Eagle's 배지(DMEM, Gibco, Grand Island, NY, USA)에서 배양하였다.

실시예 2: TLT -6의 클로닝

마우스 TLT-6 전장 cDNA를 5' 프라이머 (5'-GGATCCATGGCCTGGGA GCCCACATAC-3';서열번호 3) 및 3' 프라이머(5'-GAATTCTCAC TGCCCTGGGAGCTCAGC -3';서열번호 4)를 사용하여 PCR로 증폭하였다. PCR은 전체 30 사이클의 94 ℃에서, 45 sec, 56 ℃에서, 30 sec, 및 72 ℃에서 1분으로 수행되었다. 그 증폭된 PCR 산물을 pGEM-T easy vector (Promega, Madison, WI, USA)에 서브클로닝하고 자동화된 서열분석기로 cDNA의 서열을 확인하였다. Murine TLT-6 서열을 National Center for Biothechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)의 BLAST 알고리즘을 사용하여 분석하였다.

서열의 배열은 DNASTAR 프로그램을 사용하여 수행하였다(25, 26).

실시예 3: TLT -6 전사체의 발현

노던 블럿 분석을 위하여, murine 다중 조직 블럿을 Clontech (MTN^TM Blot II, Clontech, Palo Alto, CA, USA)으로부터 구입하였다. TLT-6 cDNA의 457-869bp의 고정화된 핵산을 Ready to Go DNA labeling kit (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, England)를 사용한 [³²P] dCTP 교잡에 프로브로 사용하였다. 그 막을 -70℃에서 24시간 동안 강화된 스크린을 가지는 코닥 X-레이 필름에 노출시켰다. 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR) 분석을 위하여, 신선한 세포를 골수, 흉선, 비장 및 말초혈액으로부터 분리하였다. 세포를 조혈 계보 특이적인 항체로 염색한 후 유세포분석기로 정제하였다. 전체 RNA를 Trizol(Invitrogen)로 분리하고 첫 번째 가닥 cDNA를 합성하였다. TLT-6의 RT-PCR 분석용 프라이머는 5' 프라이머 (5'-CTCGCTTCAACTT CTTCACT-3';서열번호 5) 및 3' 프라이머(5'-GCTGTAGATGGAGTCCTCAG-3';서열번호 6)이었다. Condition for RT-PCR 분석 조건은 전체 30 사이클의 94 ℃에서, 30 sec, 60 ℃에서, 30 sec, 및 72 ℃에서 1분으로 수행되었다.

실시예 4: TLT -6의 트랜스팩턴트

TLT-6 cDNA를 TLT-6의 시그널 펩타이드 하에서 두-Flag 태그를 사용하여 변형된 pEGFP-N1 (Clontech, Palo Alto, CA, USA) 발현벡터로 삽입하였다. 그 컨스트럭트를 PEI 방법(27)을 사용하여 HeLa세포로 트랜스팩션하였다. 마크로파지에서 TLT-6의 위치를 보기 위하여 세포를 복강 삼출물로부터 얻어서 LPS의 처리 또는 처리없이 TLT-6 mAb로 염색하였다. 모든 위치 이미지를 Radiocence 2100 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 상에서 공초점 현미경으로 얻었다. 유도적인 안정한 세포주를 제조하기 위하여, HA 태그된 TLT-6 cDNA를 doxycycline 처리(30)에 의하여 pRevTRE-EGFP-RSVp-rt TA2S-M2-WPRE 레트로바이러스 유도적인 벡터로 삽입하였다. TLT-6 트랜스팩턴트 세포들을 FACSvantageSE를 사용한 GFP 포지티브 세포의 소팅에 의하여 얻었다. 생물학적 기능을 확인하기 위하여, TLT-6의 컨스트럭트를 RAW 세포로 트랜스팩션시키고 1 ng/ml doxycycline의 처리에 의하여 TLT-6의 발현을 유도하였다.

실시예 5: 웨스턴 블럿팅

TLT-6 단백질의 분자량을 확인하기 위하여, HA 태그된 전장 TLT-6 cDNA를 pcDNA 3.1 발현 벡터에 직접 삽입하고 기술적인 매뉴얼에 따라서 TnT Quick Coupled Transcription/Translation Systems (Promega, Madison, WI, USA)으로 인 비트로 발현하였다. 본 발명자들은 또한 TLT-6D의 세포내 위치를 확인하기 위하여 EGFP 융합 TLT-6 트랜스진을 HeLa 세포로 트랜스팩션시켰다. SHIP, SHP-1, 및 SHP-2와 TLT-6의 상호작용을 결정하기 위하여, HA 태그된 TLT-6 유도가능한 레트로바이러스 벡터를 HeLa 세포에 넣은 후 doxycycline 처리로 유도하였다. 유도 48시간 후, 동시-면역침전이 항-HA 항체(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)로 수행되었고 웨스턴 블럿 분석이 항-SHIP, 항-SHP-1, 또는 항-SHP-2(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)로 수행되었다.

실시예 6: 단클론 항체의 제조

TLT-6 특이적인 단클론 항체를 제조하기 위하여, TLT-6의 세포외 도메인(KPELLRAQEGETVSLTCWYDSLYHSDEKIWCKQIDNLCYLFVSKSAEKPRFLIQQSSRFNFFTV

TMTKLKMSDSGIYHCGIAVNTRIIYL RSIHLVVSKASSTTTWRTTTLASTHSPV TNRSFPDSPMWK;서열번호 7)을 pET28a+ 벡터에 구축하였다. 이 컨스트럭트를 세포 발현 시스템을 사용한 구축물을 isect 세포에서 재조합 단백질을 제조하기 위하여 사용하였다. His-TLT-6의 정제는 HisTrap^TM HP (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Sweden)을 사용하여 수행하였다. His-TLT-6 단백질을 1 주간의 간격을 두고 랫트(SD, Orient Bio, SungNam, Korea)에 2회 면역화하였다. 마지막 주사 후, 면역화된 마우스의 슬와(popliteal) 림프절로부터 림프구를 얻어서 SP-2 골수종(myeloma) 세포와 융합하였다. 포지티브 하이브리도마 클론을 스크리닝하기 위하여, 본 발명자들은 His-TLT-6 단백질 코팅된 플레이트로 ELISA 분석을 수행하였고 유 세포분석기로 전장 TLT-cDNA을 가지는 트랜스팩션된 세포로 확인하였다. 이 결과 총 52개의 하이브리도마 클론을 스크리닝한 결과, 2개의 ELISA 포지티브 클론을 확보하였으며 2개의 ELISA 클론(,#2-11과 #3-10)중 #3-10한개의 단클론 항체 하이브리도마에서 TLT-cDNA을 지닌 트랜스 팩션된 세포주에서 특이적 결합 특성을 지니고 있다는 사실을 유세포분석기로 확인하였다.

실시예 7: 유체 세포분석법

일차 세포에서 TLT-6의 발현을 조사하기 위하여, 세포를 골수, 흉선 및 비장으로부터 수집하여서 염색 버퍼(PBS, 0.01%NaN3, 및 2% FBS)로 2회 세척하였다. 세포들을 각 형광물질, FITC, PE, 또는 APC, 또는 바이오틴 부착된 조혈 특이적인 단클론 항체; CD4, CD3, CD8, B220, Gr-1, Mac-1, c-Kit, Sca-1, CD11b, Ter-119, 및 CD11c 또는 매치된 아이소타입 대조군(eBiosciences로부터 구입)과 각각 염색하였다. 활성화된 세포에서 TLT-6의 발현 프로파일을 확인하기 위하여, 지라세포에서 조제된 T 세포를 항-마우스 Thy-1 항체로 염색한 후 MACS(Magnetic cell sorter)로 정제하였다. T 세포를 96웰 플레이트에서 미리 코팅된 항-CD3 (1㎍/ml) 및 -CD28 (1㎍/ml)로 자극하였다. 복강 또는 골수 유래 마크로파지를 lipopholysaccharides (LPS) 자극으로 활성화였다. TLT-6의 세포내 발현을 결정하기 위하여, 세포들을 Fixation 및 Permeabilization kit (eBioscience Kit)로 고정하고 표시된 항체를 가진 FITC-부착된 항-TLT-6 mAbs로 염색하였다. 적색 세포들을 파쇄하고 비특이적인 결합을 CD16/32에 부착되지 않은 항체로 미리배양하여 블록킹하였다. 죽은 세포를 propodium iodide 염색으로 배제하였다. 염색된 전체 세포들을 FACSvantageSE (BD Biosciences)을 사용하여 분석하였다.

실시예 8: 증식 분석

T 세포를 림프절로부터 조제하여서 항-Thy-1 항체로 염색하였다. 2회 세척 후, T 세포를 MACS(Stem cells Corp.)로 정제하였다. 유세포 분석기에 의하여, T 세포를 90% 순도 이상으로 확인하고 96웰 플레이트 내의 항-CD3 (1ug/ml) 및 -CD28(1ug/ml) 항체로 자극한 후 3일 동안 용량 의존적인 형태로 항-TLT-6 mAbs로 처리하였다. RAW 세포를 TLT-GFP 융합 레트로바이러스 벡터 또는 대조군으로 GFP 벡터로 트랜스팩션 하고 유세포 분석기 세포 분류기로 GFP 양성 세포를 분류하였다. 골수 유래 마크로파지를 4일 동안 M-CSF 자극화에 의하여 얻은 후 2일 동안 항-TLT-6 mAb로 처리하였다. 증식 효과는 Cell counting kit-8 (DOJINDO Lab, Kumamoto, Japan)를 사용하여 계산하였다. 조혈 클론형성 전구세포 활성을 메틸셀루로스 배지(M3434, StemCell Technologies)에서 골수 세포의 적당한 앨리콰트(aliquot)를 플레이팅한 후 배양 14일 후 결과물인 콜로니들을 스코어링하여서 결정하였다.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp. <120> Antibody against TLT-6 and use of the same <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 289 <212> PRT <213> murine <400> 1 Met Ala Trp Glu Pro Thr Tyr Leu Leu Ser Pro Val Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Ala Ser Gly Ser Trp Thr Gln Lys Pro Glu Leu Leu Arg Ala Gln 20 25 30 Glu Gly Glu Thr Val Ser Leu Thr Cys Trp Tyr Asp Ser Leu Tyr His 35 40 45 Ser Asp Glu Lys Ile Trp Cys Lys Gln Ile Asp Asn Leu Cys Tyr Leu 50 55 60 Phe Val Ser Lys Ser Ala Glu Lys Pro Arg Phe Leu Ile Gln Gln Ser 65 70 75 80 Ser Arg Phe Asn Phe Phe Thr Val Thr Met Thr Lys Leu Lys Met Ser 85 90 95 Asp Ser Gly Ile Tyr His Cys Gly Ile Ala Val Asn Thr Arg Ile Ile 100 105 110 Tyr Leu Arg Ser Ile His Leu Val Val Ser Lys Ala Ser Ser Thr Thr 115 120 125 Thr Trp Arg Thr Thr Thr Leu Ala Ser Thr His Ser Pro Val Thr Asn 130 135 140 Arg Ser Phe Pro Asp Ser Pro Met Trp Lys Ala Ile Val Ala Gly Val 145 150 155 160 Val Val Ala Val Leu Leu Leu Leu Thr Phe Val Ile Leu Val Ile Leu 165 170 175 Tyr Leu Arg Lys Ala Arg Arg Lys Ala Leu Asn Val Gln Asn Gln Cys 180 185 190 His Pro Ile Tyr Glu Asp Phe Ser Asp Gln Lys Glu Glu Thr Thr Ser 195 200 205 Phe Asn Gln Gln Thr His Ser Ser Glu Asp Thr Gly Thr Ile Cys Tyr 210 215 220 Ala Ser Leu Ile His Leu Asn Arg Val Asn Pro Gln Asp Ser Ile Tyr 225 230 235 240 Ser Asn Thr Gln Pro Tyr Pro Lys Pro Ser Pro Asp Pro Leu Leu Thr 245 250 255 Val Glu Tyr Ala Ser Ile Ser Arg Asn Arg Leu Gly Ser Ser Lys Pro 260 265 270 Asp Tyr Pro Arg Gly Glu Asp Gln Gln Leu Arg Ala Glu Leu Pro Gly 275 280 285 Gln <210> 2 <211> 867 <212> DNA <213> murine <400> 2 atggcctggg agcccacata cctgctctcc ccagtgctgc tgctgctcct ggcctcaggc 60 tcctggacac agaaaccaga gttacttcga gcacaggagg gtgagactgt ttctttgaca 120 tgctggtatg attcgctcta ccactccgat gagaagatct ggtgtaagca aatagacaac 180 ttgtgttacc tcttcgtcag caaaagtgcc gagaagccaa gattcctcat ccagcagtct 240 tctcgcttca acttcttcac tgtcaccatg actaagctca agatgagtga ctcgggcatc 300 tatcactgtg ggatcgctgt aaataccagg ataatttatc tcagaagtat tcacctggtg 360 gtgtcaaaag cttcatccac aaccacctgg aggacaacaa ccctggcctc tacccacagc 420 cccgtcacta acagaagctt tccagatagc ccgatgtgga aggccatcgt tgctggggtg 480 gtcgtggctg ttctgctact gctcacattc gtcatccttg tgatcctgta cctgaggaaa 540 gctcgaagaa aggccctgaa cgttcagaac caatgtcacc ctatctatga agacttttca 600 gaccagaagg aggagaccac tagcttcaat cagcagaccc actccagtga ggacactggg 660 accatctgct atgcctctct catccaccta aaccgtgtaa accctcagga ctccatctac 720 agcaacaccc agccctaccc gaagccctct cctgacccac ttctgactgt ggaatatgcc 780 agcatctcta gaaacagact cggctcttcc aagccagatt acccaagagg tgaagaccag 840 caactgaggg ctgagctccc agggcag 867 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ggatccatgg cctgggagcc cacatac 27 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gaattctcac tgccctggga gctcagc 27 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ctcgcttcaa cttcttcact 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gctgtagatg gagtcctcag 20 <210> 7 <211> 130 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 7 Lys Pro Glu Leu Leu Arg Ala Gln Glu Gly Glu Thr Val Ser Leu Thr 1 5 10 15 Cys Trp Tyr Asp Ser Leu Tyr His Ser Asp Glu Lys Ile Trp Cys Lys 20 25 30 Gln Ile Asp Asn Leu Cys Tyr Leu Phe Val Ser Lys Ser Ala Glu Lys 35 40 45 Pro Arg Phe Leu Ile Gln Gln Ser Ser Arg Phe Asn Phe Phe Thr Val 50 55 60 Thr Met Thr Lys Leu Lys Met Ser Asp Ser Gly Ile Tyr His Cys Gly 65 70 75 80 Ile Ala Val Asn Thr Arg Ile Ile Tyr Leu Arg Ser Ile His Leu Val 85 90 95 Val Ser Lys Ala Ser Ser Thr Thr Thr Trp Arg Thr Thr Thr Leu Ala 100 105 110 Ser Thr His Ser Pro Val Thr Asn Arg Ser Phe Pro Asp Ser Pro Met 115 120 125 Trp Lys 130

Claims (6)

1. TLT(TREM-유사 트랜스크립트)-6 단백질에 대한 항체.
2. 제 1항에 있어서, TLT(TREM-유사 트랜스크립트)-6 단백질은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 항체.
3. 제 1항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 7에 기재된 펩타이드에 결합하는 항체.
4. 제 1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체를 유효 성분으로 포함하는 과민성 면역질환 진단용 조성물.
5. 제 1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체를 유효 성분으로 포함하는 과민성 면역질환 진단용 키트.
6. 제 1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체를 유효 성분으로 포함하는 과민성 면역질환 예방 및 치료용 조성물.

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