KR20120137803A

KR20120137803A - 백혈병 진단용 조성물

Info

Publication number: KR20120137803A
Application number: KR1020110056875A
Authority: KR
Inventors: 서상범; 김지영; 국현; 국훈; 백희조
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2011-06-13
Filing date: 2011-06-13
Publication date: 2012-12-24
Also published as: KR101304034B1

Abstract

본 발명은 JMJD1B (jumonji domain containing 1B)유전자, 이의 전사체 또는 발현된 단백질을 포함한 백혈병 진단용 조성물을 제공한다. 보다 구체적으로, 상기 JMJD1B의 전사, 단백질 발현 또는 단백질 활성을 억제하면 암 유전자의 활성이 억제되고 세포자살 유전자를 활성화시켜 백혈병 치료에 효과가 있으므로, 상기 유전자, 유전자의 전사나 발현, 활성을 조절함으로 백혈병 진단제, 약물 스크리닝 등이 가능하고, 본 발명의 유전자를 백혈병 치료 타겟으로 활용할 수 있을 것이다.

Description

백혈병 진단용 조성물 {Composition for diagnosing leukemia}

본 발명은 백혈병 진단용 조성물 및 백혈병 치료제 스크리닝 방법을 제공하고자 한다.

백혈병은 골수 (bone marrow)와 혈액의 악성암으로, 혈액세포의 억제되지 않은 성장을 특징으로 한다.

백혈병의 통상적인 형태는 다음의 네 가지 카테고리로 분류된다: 골수 (백혈구, 적혈구, 거핵구)와 같은 골수구성 세포 (myeloid elements)를 포함하는 급성 또는 만성 골수성 백혈병 및, 임파구성 세포 (lymphoid lineage)를 포함하는 급성 또는 만성의 임파성 백혈병이 존재한다.

급성 백혈병은 골수 및 혈액 중 미숙하고 기능이 떨어진 세포 (아세포,blast)의 대량축적의 결과로 빠르게 진행되는 질병인데, 이러한 골수는 흔히 충분한 정상 적혈구, 백혈구 및 혈소판을 오랫동안 생산할 수 없다. 적혈구결핍증상인 빈혈은 실질적으로 모든 백혈병 환자에서 나타난다.

정상적인 백혈구의 부족은 병원균과의 싸움에서 신체의 능력을 해친다. 혈소판의 감소로 인해 좌상 (bruising) 및 출혈이 쉽게 나타난다. 반대로 만성백혈병은 아주 천천히 진행되며, 비정규적인 증식이 유도되며, 따라서 성숙 (차별화된)세포의 범위가 과확장되는 특징이 있다.

백혈병을 치료하는 표준방법에는 통상적으로 화학요법 및/ 또는 골수이식 및/ 또는 방사선요법이 포함된다.

골수이식의 두 가지 주요형태는 자기성이식 (autologus, 환자 자신의 골수를 사용)과 이상성이식 (allogeneic, 모순되지 않는 공여자의 골수를 사용)이다. 높은 에너지선을 사용하는 방사선 요법은 통상적으로 모든 백혈병성 세포를 죽이기 위해서 골수이식을 하기 전에 처치된다.

백혈병에 대한 화학요법은 통상 둘 또는 그 이상의 항암제의 병용방법을 포함하는데, 거의 40종의 약물이 현재 백혈병 치료에 사용되고 있다. 몇몇 통상의 병용요법에는 시타리빈과 함께 독소루비신, 다우노루비신, 미토산트론 또는 티오구아닌중 하나를 병용하던가, 머캅토푸린과 메토트렉세이트의 병용, 미토산트론과 에토포시드의 병용, 아스파라기나제와 빈크리스틴, 다우노루비신 및 푸레드니손과의 병용, 사이클로포스파마이드와 빈크리스틴, 시타라빈 및 푸레드니손의 병용, 사이클로포스파마이드와 빈크리스틴 및 푸레드니손의 병용, 다우노루비신과 시타라빈 및 티오구아닌의 병용, 및 다우노루비신과 빈크리스틴 및 푸레드니손의 병용요법이 포함된다.

백혈병의 새로운 치료법에는 다수약물의 저항성 전환제를 포함하고, 여기에는 화학요법제의 손상효과를 피하기 위하여 종양세포가 되는 기전을 감소시키는 약제의 사용을 포함하며 (무반응성 또는 재발성을 유발하기도 한다); 생물학적 치료법으로 생물학적 반응 조절제 (biological response modifiers ; BRMS)로서 알려진 물질의 사용을 포함한다. 이들 물질은 암이나 다른 질병에 신체의 고유반응의 일부분으로서 적은 양으로 정상적으로 생산된다. BRMS 형태에는 단일클론 항체가 포함되며, 톡신 (toxins)은 종양세포에서 유도된 보충항체와 반응하는 항체에 부착되어 진다; 또 사이토킨 (예를들면, 인터페론, 인터루킨, 콜로니자극인자 (CSFS))은 자연적으로 생성된 화학품으로 혈구세포생성을 자극하고, 치료후 아주 빠르게 혈구세포수가 회복되는데 도움을 준다. 이들 약물의 예로는 다수약품 저항성 전환제인 PSC 833, 모노클로날항체인 리툭산 및 다음의 사이토킨: 에리트로포에틴 및 적혈구세포의 생산을 자극하는 이포에틴; G-CSF, GM-CSF, 필그라스팀, 및 백혈구세포 생산을 자극하는 살그라모스팀 (Sargramostim); 및 혈소판의 생산을 자극하는 트롬보포이에틴이 포함된다.

백혈병의 초기발생의 진단으로서는, 환자의 말초혈중의 백혈구 수를 측정하여, 계측치가 정상치를 웃도는 경우에 백혈병의 발생을 의심하는 방법을 들 수 있다. 그러나, 감기 등의 백혈병 이외의 질환에 있어서도, 체내의 면역 반응의 항진에 의해 백혈구 수는 증대하므로, 백혈구 수의 측정만으로는, 의사양성(擬似陽性)의 가능성이 있다. 또, 말초혈중의 백혈구 수의 정상치는, 4,000~8,000개/μL로서 폭이 넓고, 의사음성(擬似陰性)의 가능성이 있다. 따라서, 보다 확실도가 높은 백혈병의 진단방법이 요구되고 있다.

본 발명에서는 백혈병 진단 또는 치료에 효과적인 타겟 유전자를 발굴하고자 하며, 이를 이용하여 백혈병 진단용 조성물 및 백혈병 치료제 스크리닝 방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산을 코딩하는 JMJD1B (jumonji domain containing 1B) 유전자, 이의 전사체 또는 발현된 단백질 중에서 선택된 어느 하나를 포함하는 백혈병 진단용 조성물을 제공하고자 한다.

상기 JMJD1B 단백질은 히스톤 디메틸라아제 H3K9-me1/2 활성을 가질 수 있다.

상기 JMJD1B 단백질은 암유전자 lmo2 (LIM domain only protein 2)를 활성화시키거나 세포자살을 억제하는 유전자 Bcl-xL를 활성화시킬 수 있다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산을 코딩하는 JMJD1B 유전자, 이의 전사체 또는 이의 발현된 단백질 중에서 선택된 어느 하나를 표적물질로 이용하여 시험대상물질을 접촉시키고, 표적물질과 시험대상물질 간의 반응을 확인하여, 시험대상물질이 상기 유전자의 전사, 단백질 발현 또는 단백질 활성을 억제시키는지를 결정하는 단계를 포함하는 백혈병 치료제 스크리닝 방법을 제공하고자 한다.

JMJD1B 유전자, 이의 전사체 또는 발현된 단백질이 백혈병과 깊은 관련성을 가지므로, 상기 유전자와 단백질을 백혈병 진단 또는 치료의 타겟으로 삼을 수 있다. 상기 발현량을 확인함으로써 백혈병 진단, 스크리닝 등에 활용할 수 있으며, 상기 유전자의 전사나 발현, 활성을 조절하는 물질은 백혈병 치료제로 사용할 수 있다.

도 1은 ATRA에 의한 백혈병 세포주 HL-60의 분화를 나타낸 것이다. 도 1A은 1mM ATRA로 48시간 처리한 김자액 염색된 세포의 형태를 관찰한 것이고, 도 1B는 세포를 NBT용액으로 분석하고 NBT 양성 세포를 카운트하였다.
도 2은 ATRA 처리된 HL-60 세포에서 H3K9-me2 타겟유전자로서 JMJD1B를 동정한 것이다. 도 2A는 JMJD1B locus가 염색체 5에 있음을 나타낸 것이고, 도 2B는 쥐 성체조직 블롯 (Mouse adult tissue blot)이 α-JMJD1B 항체와 잡종화된 것으로, β-액틴 (β-actin)은 대조군으로 사용되었다. 도 2C는 ATRA-처리된 HL-60 세포 (ATRA-treated HL-60 cells)에서의 JMJD1B발현 수준을 RT-PCR로 검출한 것이다. 도 2D 내지 2G는 48시간 동안 ATRA-처리된 HL-60 세포를 분화한 것으로, 교차결합된 샘플들은 α-H3K9-me2 (도 2D), α-H3K4-me2 (도 2E), α-AcH3, α-AcH4 (도 2F), α-HDAC1, α-HP-1a, 및 α-SMRT 항체 (도 2G)와 면역침강되었다. 침강된 DNA 조각을 real-time PCR에 사용하였다.
도 3는 JMJD1B가 H3K9 특이적 디메틸라아제 (demethylase)임을 나타낸 것으로, 도 3A는 인간, 쥐와 마우스 JMJD1 패밀리의 단백질 서열 데이터에 근거한 계통발생적 분석을 나타낸 것이고, 도 3B는 JMJD1B 및 JMJD1B (H558A) 점돌연변이체가 293T세포에 트랜스펙션되고, 히스톤 디메틸라이제 활성을 지시된 항체로 면역블롯 (immunoblot analysis) 분석을 사용하여 분석한 것이다. 도 3C 및 3D는 GFP-JMJD1B 또는 GFP-JMJD1B (H558A)가 293T 세포에 트랜스펙션되고 다른 메틸기 마크를 지닌 지시된 히스톤 H3 리신잔기에 대한 항체를 사용하여 면역염색 (immunostained)된 것이다. SYTO61 염색은 핵산에 해당하고, 화살표는 트랜스펙션된 세포를 나타낸다.
도 4는 JMJD1B이 H3K9 특이적 디메틸라아제임을 나타낸 것이다. 도 4A는 기능을 지닌 도메인을 지닌 JMJD1B와 결실 돌연변이를 보여준 것이다. 도 4B는 실험실에서 GST-JMJD1B 또는 GST-JMJD1B 결실돌연변이의 디메틸라아제 분석은 보조인자로서 a-KG, 아스코르베이트 (ascorbate), 및 Fe(II)를 사용한 코어 히스톤으로 수행한 후, 이를 지시된 항체로 면역블롯하였다.
도 5은 H3K9-me1/-me2/-me3 펩티드를 GST-JMJD1B, GST-JMJD1B (H558A) 또는 GST와 배양한 것으로, 변형된 펩티드를 LC-MS로 분석하였다.
도 6는 JMJD1B가 lmo2전사를 활성화시키는 것을 나타낸 것으로, 도 6A는 293T 세포를 β-갈락토시다이제 발현 플라스미드 (β-galactosidase expression plasmid )와 함께 SV40, 농도를 증가시킨 JMJD1B, JMJD1B (H558A) 또는 si-JMJD1B로 일시적으로 공동 트랜스펙션시킨 것이다. 각 p 값은 하나의 분석으로부터 5개 replicates의 평균을 나타낸다. *p < 0.05, **p < 0.01 and ***p < 0.001. 도 6B는 HL-60 세포를 ATRA 또는 DMSO로 처리한 것이다. 48시간 후에, RT-PCR은 타겟 유전자의 발현수준과 비교하기 위하여 수행되었다. 도 6C는 HL-60 세포를 pcDNA6 또는 pcDNA6-JMJD1B로 트랜스펙션시켰다. JMJD1B, lmo2, Bcl-xL, Raf-1, 및 Myc의 발현수준은 RT-PCR로 검출되었는데, β-액틴 (β-actin)을 로딩 대조군으로 사용하였다. 도 6D는 일시적으로 JMJD1B를 과발현시키거나 녹다운시킨 HL-60 세포에서 JMJD1B, lmo2 및 Bcl-xL의 발현수준을 real-time PCR로 검출하였다. *p < 0.05, and **p < 0.01. 도 6E는 일시적으로 JMJD1B를 과발현시키거나 녹다운시킨 HL-60 세포에서 Survivin, BIRC3, XIAP, Raf-1 및d Myc의 발현수준을 real-time PCR로 검출하였다. 에러바 (error bars)는 세 개의 독립적 실험의 2^-△△ ^Ct±s.d.를 나타낸다. 도 6F는 si-JMJD1B로 처리된 HL-60세포를 용해하고 α-lmo2, α-Bcl-xL, 및 α-JMJD1B 항체로 면역블롯 (immunoblotted)시킨 것으로, β-액틴 (β-actin)을 로딩 대조군으로 사용하였다.
도 7은 JMJD1B가 lmo2 및 Bcl-xL의 전사를 활성화시킴을 나타낸 것이다. 도 7A 및 B는 293T 세포를 pcDNA6, pcDNA6-JMJD1B 또는 si-JMJD1B로 트랜스펙션시킨 것이다. JMJD1B, lmo2,Bcl-xL,Survivin, BIRC3, XIAP, Raf-1 및 Myc의 발현수준을 실시간 PCR로 검출하였다. 도 7C는 si-JMJD1B로 처리된 293T세포를 용해시키고 a-lmo2 및 a-Bcl-xL 항체로 면역블롯하였다. β-액틴 (β-actin)을 로딩 대조군으로 사용하였다.
도 8는 lmo2 프로모터에 JMJD1B를 도입시킨 것으로, 도 8A는 293T 세포를 pGL-lmo2 프로모터 리포터, 지시된 DNA 구조체 (DNA constructs)와 sh-RNAs로 트랜스펙션시키고, 루시퍼라이제 활성에 대해 상기 세포추출물을 분석하였다. 도 8B 및 8C는 ChIP 분석 (upper panel)에서 프라이머 쌍의 도식도를 나타낸 것이다 (upper panel). ATRA-처리된 HL-60 세포와 함께 lmo2 프라이머의 ChIP 분석은 α-JMJD1B (도 8B) 및 α-H3K9-me2 (도 8C)를 사용하여 수행하였고 real-time PCR로 조사하였다. 도 8D 내지 도 8F는 HL-60 세포를 JMJD1B 및 sh-JMJD1Bs로 트랜스펙션시키고, lmo2 프로모터 및 엑손 지역에서 α-H3K9-me2 (도 8E), α-H3K9-me1 및 α-H3K9-me3 항체 (도 8F)의 메틸화 상태를 위한 α-JMJD1B 항체 (도 8D)를 사용하여 ChIP 분석과 real-time PCR를 수행하였다. 도 8G 및 도 8H는 ChIP 분석에서 프라이머쌍의 도식도를 나타낸 것이다 (upper panel). 화살표는 real-time PCR 증폭에 대한 프라이머를 나타낸다. JMJD1B 및 sh-JMJD1Bs로 트랜스펙션된 HL-60세포를 α-JMJD1B 항체를 사용하여 ChIP 분석된 것이다. 이 면역침전된 DNA는 Raf-1 (도 8G) 및 Myc (도 8H)의 프로모터를 사용하여 PCR에 의해 증폭된 것이다.
도 9는 두 개의 독립적 sh-RNAs로 JMJD1B를 녹아웃 시킨 것이다. 도 9A 및 B는 sh-JMJD1B #1 또는 sh-JMJD1B #2 또는 sh control vector (CTL)로 트랜스펙션시킨 HL-60 (A) 및 293T (B)에서 JMJD1B 발현의 녹아웃은 RT-PCR 및 면역블롯 분석에 의해 확인되었다. β-액틴 (β-actin)을 동일한 RNA 및 단백질량에 대한 발현 대조군으로 사용하였다. 도 9C는 α-JMJD1B 및 α-GFP를 사용하여 sh-JMJD1B #1 또는 #2 로 트랜스펙션된 293T세포에서 내생 JMJD1B 및 외생 JMJD1B의 발현수준에 대해 면역블롯분석한 것을 보여준다.
도 10는 JMJD1B가 lmo2 전사를 활성화시킴을 나타낸 것이다. 도 10A는 ATRA-처리된 HL-60 세포에서 lmo2 프로모터 및 엑손지역에 대한 ChIP 분석을 α-H3K9-me1 및 α-H3K9-me3를 사용하여 수행한 것으로 실시간 PCR로 조사하였다. 도 10B 내지 D에서 293T 세포를 JMJD1B 및 sh-JMJD1Bs로 트랜스펙션시키고, lmo2 프로모토와 엑손 지역에서 α-H3K9-me2 (C), α-H3K9-me1 및 α-H3K9-me3 항체 (D)의 메틸화 상태에 대한 α-JMJD1B 항체 (B)를 사용하여 ChIP 분석 및 real-time PCR을 수행한 것이다.
도 11은 JMJD1B가 CBP와의 상호작용을 통해 lmo2 전사를 조절함을 나타낸 것으로, 도 11A 및 도 11B는 293T 세포를 lmo2 프로모터 리포터 플라스미드, 및 JMJD1B, sh-JMJD1Bs와 CBP (A) 또는 PCAF (B)를 사용하여 일시적으로 트랜스펙션시킨 것이다. **p < 0.01, compared with untreated control. 도 11C는 293T세포를 pcDNA6-JMJD1B, Gal4-CBP 및 FLAG-PCAF로 트랜스펙션시킨 것이다. 면역침강법은 α-JMJD1B, α-CBP, α-PCAF 또는 α-IgG 항체를 사용하여 수행되었는데, 침강 후에 α-Gal4, α-PCAF 또는 α-JMJD1B 항체를 사용하여 웨스턴 블럿 분석 (Western blot analysis)을 수행하였다. 도 11D 및 11E 세포를 JMJD1B 및 sh-JMJD1Bs로 트랜스펙션시켰고, ChIP 분석 및 real-time PCR을 α-CBP 항체 (D) 및 α-AcH3 항체 (E)를 사용하여 수행하였다.
도 12은 JMJD1B가 세포증식을 유도함을 나타낸 것이다. 도 12A는 293T 세포를 MTT 분석에서 지시된 구조체 (constructs)로 트랜스펙션시킨 것이다. 도 12B는 293T 세포를 JMJD1B, si-JMJD1B로 트랜스펙션시킨 것이다. ***p < 0.001, compared with untreated control. 도 12C는 아넥신 V (Annexin-V)와 PI로 이중 라벨된 293T 세포의 유세포 분석의 FACS 분석을 나타낸 것이다. 왼쪽 하단의 사분면은 아넥신 V의 결합과 PI 흡수에 대해 음성적인 살아있는 세포를 나타내고, 오른쪽 하단의 사분면은 세포자살 세포를 포함한다 (아넥신 V에 양성적/PI에 음성적). 왼쪽과 오른쪽 상단의 사분면은 각각 살아있는 괴저성 세포 (아넥신 V에 음성적/PI에 양성적)와 손상된 세포 (아넥신 V에 양성적/PI에 양성적)를 나타낸다. 도 12D는 JMJD1B 또는 sh-JMJD1B 구조체 (constructs)로 293T 세포를 트랜스펙션시킨 것이다. 도 12F는 생체 내에서 JMJD1B 구조체 (constructs)를 발현하는 MCF-7 세포의 이종이식을 나타낸 것이다. 암의 무게는 매일 2일마다 측정하였다.
도 13은 백혈병 환자 샘플에서 증가된 JMJD1B 발현을 나타낸 것이다. 도 13A에서 총 RNA는 건강한 정상인과 백혈병 환자의 혈액으로부터 분리한 것이다. RT-PCR 분석은 JMJD1B에 대한 프라이머를 가지고 수행하였다. β-액틴 (β-actin)은 RNA로딩 대조군 (RNA loading control)으로 사용되었다. 도 13B는 건강한 정상인과 백혈병 환자의 혈액세포로부터 추출된 전체 세포를 8% SDS-PAGE로 분리하고, α-JMJD1B 항체에 대해 면역블롯하였다. 도 13C는 정상 조직과 암조직에서 JMJD1B의 발현을 나타낸 Boxplot이다 (1. No value; 2. 급성 골수성 백혈병 (Acute Myeloid Leukemia, p = 4.98e-5); 3. 유방선암 (Breast Adenocarcinoma, p = 0.3e-5); 4. 전립선암 (Prostate Carcinoma, p = 4.3e-4); 5. 난소선암 (Ovarian Adenocarcinoma, p = 2.65e-4); 6. B세포 급성 림프구성 백혈병 (B cell Acute Lymphoblastic Leukemia, p = 1.83e-3); 7. T 세포 급성 림프구성 백혈병 (T cell Acute Lymphoblastic Leukemia, p = 4.2e-4)을 나타낸다). 도 13D는 ATRA-매개된 HL-60 분화 (ATRA-mediated HL-60 differentiation)에서 JMJD1B의 조절 역할 모델을 나타낸 것이다.

본 발명은 JMJD1B (jumonji domain containing 1B) 발현 및 활성의 억제가 백혈병 치료에 효과가 있음을 확인하고, 이를 이용한 백혈병 진단용 조성물 및 백혈병 치료제 스크리닝 방법을 제공하고자 한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산을 코딩하는 JMJD1B (jumonji domain containing 1B) 유전자, 이의 전사체 또는 발현된 단백질 중에서 선택된 어느 하나를 포함하는 백혈병 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 JMJD1B는 JMJD1A (JHDM2A) 및JMJD1C (JHDM2C)을 포함하는 JmjC 도메인을 지닌 단백질 서브패밀리에 속한다 (도 3A). 이러한 단백질은 아미노 말단에 아연핑거 유사 도메인 (zinc finger (ZF)-like domain)과 카르복실 말단 근처에 JmjC 도메인을 지닌 유사한 단백질 도메인 구조를 공유할 수 있으며, 혈액생성 (hematopoiesis)에 관계된 흉선 (thymus), 지라 (spleen) 및 태반 (placenta)에 많이 존재한다.

본 발명에서 JMJD1B (jumonji domain containing 1B) 유전자는 서열번호 1 아미노산을 코딩하는 핵산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하되 이에 한정되지 않고, 상기 핵산 서열과 90% 이상의 상동성, 바람직하게는 95%, 더욱 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 가지는 핵산은 본 발명의 유전자에 포함될 수 있다.

본 발명의 백혈병이란 혈액 세포 중 백혈구에 발생한 암으로서, 비정상적인 백혈구(백혈병 세포)가 과도하게 증식하여 정상적인 백혈구와 적혈구, 혈소판의 생성이 억제되는 질병을 포함할 수 있으며, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프성 백혈병이 포함될 수 있다.

상기 JMJD1B 유전자의 번역된 단백질은 암유전자 lmo2 (LIM domain only protein 2)를 활성화시키거나 세포자살을 억제하는 유전자 Bcl-xL를 활성화시킬 수 있다.

JMJD1B 유전자의 번역된 단백질은 히스톤 디메틸라아제 H3K9-me1/2 활성을 가지고, JMJD1B 녹다운 (knock-down)된 세포에서는 세포 생존력이 상당히 감소되는데 반해, JMJD1B 과발현된 세포에서는 세포 생존력이 크게 증가되었다. 또한, JMJD1B는 독소루비신 (doxorubicin)처리로 유도된 세포자살을 감소시켰으며, JMJD1B를 과발현한 세포를 주입 후 바로 암세포 성장이 야기되었다.

또한, 하기 실험예 8에서 나타난 바와 같이, 정상세포와 비교할 때 JMJD1B가 백혈병 환자에서 과발현되었다.

이와 같이, JMJD1B (jumonji domain containing 1B) 유전자, 이의 전사체 또는 발현된 단백질은 백혈병 세포에서 특이적으로 발현이 증가되므로, 상기 유전자 또는 단백질을 이용하여 과발현 및 활성 여부를 조사하면 백혈병을 진단할 수 있다.

본 발명의 조성물은 JMJD1B (jumonji domain containing 1B) 유전자, 이의 전사체 또는 발현된 단백질 외에도 상기 유전자 또는 단백질의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 포함할 수 있다.

상기 JMJD1B (jumonji domain containing 1B) 유전자, 이의 전사체 또는 발현된 단백질을 포함한 백혈병 진단용 조성물과 대상 시료 간의 반응의 확인은 DNA-DNA, DNA-RNA, DNA-단백질 간, RNA-단백질, 단백질-단백질의 반응 여부를 확인하는데 사용되는 통상적인 방법들, 예컨대 DNA 칩, 단백질 칩, 중합효소 연쇄반응 (PCR), 노던 블롯팅, 서던 블롯팅, 웨스턴 블롯팅, ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent assay), 효모 이중 혼성법 (yeast twohybrid), 2-D 겔 분석 및 시험관 내 결합 에세이 (in vitro binding assay) 등을 이용할 수 있다. 예컨대 상기 유전자의 전부 또는 일부 또는, 상기 유전자들로부터 발현된 단백질의 전부 또는 일부를 프로브로 사용하여 대상자의 체액으로부터 분리한 핵산 또는 단백질과 하이브리드화한 후 당분야에 상기와 같이 공지된 다양한 방법 등으로 검출함으로써 대상자에서 상기 유전자 또는 단백질이 과발현된 상태인지 또는 저발현된 상태인지 조사하면 백혈병의 발생 여부를 판단할 수 있다. 상기 프로브를 방사선 동위원소 또는 효소 등으로 표지하면 용이하게 유전자의 존재를 확인할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 상기 단백질에 대한 특이적 항체를 포함할 수 있다. JMJD1B (jumonji domain containing 1B) 유전자, 이의 전사체는 백혈병 세포에서 특이적으로 발현이 증가하여 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 양 또한 증가하게 되기에, 상기 유전자로부터 발현된 단백질에 대한 항체를 이용하는 경우, 항원-항체 반응을 통해 상기 단백질을 검출해 내어 백혈병을 진단할 수 있다.

본 발명은 JMJD1B 유전자, 이의 전사체 또는 이의 발현된 단백질 중에서 선택된 어느 하나를 표적물질로 이용하여 시험대상물질을 접촉시키고, 표적물질과 시험대상물질 간의 반응을 확인하여, 시험대상물질이 상기 유전자의 전사, 단백질 발현 또는 단백질 활성을 억제시키는지를 결정하는 단계를 포함하는 백혈병 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 스크리닝 방법에서 상기 JMJD1B 유전자, 이의 전사체를 포함하는 조성물과 시험대상물질 간의 반응확인은, DNA-DNA, DNA-RNA, DNA-단백질, DNA-화합물 간의 반응 여부를 확인하는데 사용되는 통상적인 방법들을 사용할 수 있다. 예를 들면, 생체 외부에서 (in vitro) 상기 유전자와 시험대상물질 사이의 결합 여부를 확인하기 위한 혼성화 시험, 포유류세포와 시험대상물질을 반응시킨 후 노던 분석, 정량적 PCR, 정량적 실시간 PCR 등을 통한 상기 유전자의 발현율 측정 방법, 또는 상기 유전자에 리포터 유전자를 연결시켜 세포 내로 도입한 후 시험대상물질과 반응시키고 리포터 단백질의 발현율을 측정하는 방법 등을 사용할 수 있다. 이러한 경우 본 발명의 조성물은 상기 유전자 외에도, 핵산의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 포함할 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법에서 상기 JMJD1B 단백질을 포함하는 조성물과 시험대상물질 간의 반응 확인은, 단백질-단백질, 단백질-화합물 간의 반응 여부를 확인하는데 사용되는 통상적인 방법들을 사용할 수 있다. 예를 들면, 상기 단백질과 시험대상물질을 반응시킨 후 활성을 측정하는 방법, 효모 이중 혼성법 (yeast two-hybrid), 상기 단백질에 결합하는 파지 디스플레이 펩티드 클론 (phage-displayed peptide clone)의 검색, 천연물 및 화학물질 라이브러리 (chemical library) 등을 이용한 HTS (high throughput screening), 드럭 히트 HTS (drug hit HTS), 세포 기반 스크리닝 (cell-based screening), 또는 DNA 어레이 (DNA array)를 이용하는 스크리닝법 등을 사용할 수 있다. 이러한 경우 본 발명의 조성물은 상기 단백질 외에도, 단백질의 구조 또는 생리 활성을 안정하게 유지시키는 완충액 또는 반응액을 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 생체 내 (in vivo) 실험을 위해, 상기 단백질을 발현하는 세포, 또는 전사율을 조절할 수 있는 프로모터 하에 상기 단백질을 발현하는 플라스미드를 함유하는 세포 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법에서, 시험대상물질은 통상적인 선정방식에 따라 백혈병 억제제로서의 가능성을 지닌 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 기타 추출물 또는 천연물, 화합물 등이 될 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법을 통해 얻은, 백혈병 고발현 유전자인 JMJD1B의 발현을 억제시키거나 단백질의 기능을 억제시키는 활성을 나타내는 시험대상물질은 백혈병 치료제 후보물질이 될 수 있다. 이와 같은 백혈병치료제 후보물질은 이후의 백혈병치료제 개발과정에서 선도물질 (leading compound)로서 작용하게 되며, 선도물질이 상기 유전자 또는 그로부터 발현되는 단백질의 기능 억제효과를 나타낼 수 있도록 그 구조를 변형시키고 최적화함으로써, 새로운 백혈병치료제를 개발할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예 들은 본 발명을 예시한 것으로, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 >

실시예 1: 시료의 준비

1) 플라스미드

pOBT7-JMJD1B (BC001202)는 Openbiosystems에서 구입하였다. JMJD1B cDNA를 pGEX-4T1박테리아 발현벡터 (Amersham Biosciences)로 삽입하여 GST-JMJD1B 융합단백질을 만들었다. JMJD1B (H558A) 점돌연변이체 (point mutants)는 Cosmo Genetech에 의해 만들어졌다. 포유동물에서의 발현벡터를 만들기 위해, 변형된 pcDNA6-HA-myc-his (Invitrogen) 및 GFP-C1 (Clontech)를 사용하여 각각의 HA-, myc-, 및 his-tagged JMJD1B, 또는 GFP-tagged JMJD1B 단백질을 만들었다. 인간 JMJD1B에 대한 shRNA (SHCLNG-NM_016604) 및 JMJD1B에 대한 siRNA (L-020378-01-0010)는 각각 Sigma 및 Dharmacon에서 구입하였다.

2) 항체

JMJD1B (ab31215, Cell Signaling), 히스톤 H3 (06-755, Millipore), 및 β-actin (sc-47778, Santa Cruz Biotechnology)에 대한 항체를 면역블롯 (immunoblot) 분석 및 ChIP 분석에 사용하였다. α-GFP 항체 (sc-40, Santa Cruz Biotechnology)를 면역침강법 (immunoprecipitation)에 사용하였다. 히스톤 H3K4-me2 (07-030, Millipore), H3K9-me1 (07-450, Millipore) / H3K9-me2 (07-441, Millipore) / H3K9-me3 (17-625, Millipore), H3K27-me2 (07-452, Millipore), 및 H3K36-me2 (07-274, Millipore)에 대한 항체를 면역블롯 (immunoblot) 분석 또는 면역세포화학 (immunocytochemistry)에 사용하였다.

실시예 2: 디메틸라아제 분석 및 질량분석법 ( Demethylase assay and mass spectrometry )

디메틸라아제 분석이 종래의 방법에 따라 수행되었다 (Yamane et al, 2006). H3K9-me1 펩티드 [TARK(me1)STG], H3K9-me2 펩티드 [TARK(me2)STG] 및 H3K9-me3 펩티드 [TARK(me3)STG]는 히스톤 H3 (Peptron)의 N-말단 아미노산 서열에 근거하여 합성되었다. 합성 펩티드 (0.1 ㎍)는 GST-JMJD1B와 함께 디메틸라아제 분석에서 기질로 사용되었다; 이 반응은 10% TCA 침전 (precipitation)에 의해 정지되었다. 원심분리에 의해 침전물을 제거한 다음, 상층액을 회수하고 상층액에 있는 메틸화된 펩티드를 Korea Basic Science Institute에서 액체크로마토그래피-질량분석기 (liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)로 분석하였다.

실시예 3: 면역세포화학

293T 세포들은 chamber slides상에서 성장되었고 리포펙타민 2000 (Lipofectamine 2000, Invitrogen)을 사용하여 GFP-JMJD1B 발현 플라스미드로 트랜스펙션 되었다. 트랜스펙션된지 48시간 후에, 세포들은 4% 파라포름알데하이드로 고정되었고 각각의 항체와 함께 배양되어 세척되고 SYTO61 (Invitrogen)로 염색되었다. 이러한 슬라이드들은 GEL/MOUNT (Biomeda)에 놓여지고 이미지들은 공초점 레이저 현미경 (confocal laser scanning microscope, Zeiss LSM5 Exiter)으로 얻어졌다.

실시예 4: 역전사 PCR 및 정량적 PCR ( Reverse transcription - PCR and quantitative PCR )

JMJD1B 또는 sh-JMJD1Bs 구조체로 트랜스펙션된 HL-60 및 293T 세포로부터 얻어진 총 RNA 샘플들은 RNAiso Plus (TaKaRa)를 사용하여 추출되었다. 총 RNA (2 ㎍)는 cDNA를 합성하기 위해 사용하였다. cDNA 합성은 oligo-dT 프라이머 (Fermentas)를 사용하였고, 정량된 cDNA (quantified cDNA)는 JMJD1B, lmo2, Bcl -xl, XIAP, Survivin, Raf -1, Myc mRNA 발현패턴 분석을 위해 사용되었다. 타겟 유전자 프라이머의 서열은 하기 표1에서 나타나 있다. 증폭반응은 94℃, 15 초 동안 변성 (denaturation)되고; 60℃, 30초 동안 어닐링 (annealing)되며; 및 72℃, 30초 동안 연장 (extension)되는 과정이 40 사이클 이루어졌다. 각 PCR로 적절한 길이의 한 개의 산물이 증폭되어진 후에, 해리곡선 (Dissociation curves)이 만들어졌다. mean threshold cycle (C_t) 및 standard error는 단계당 3개의 replicates 로부터 얻어진 개개의 C_t값으로부터 계산되어 졌다. 표준화된 평균 C_t 값 (normalized mean C_t ₎ 은 JMJD1B, lmo2, 및 Bcl - xl 값으로부터 β-actin의 평균 C_t을 뺀 것으로 △C_t 이 추정되었다. △△C_t는 대조군 △C_t 과 각 샘플로부터 얻어진 값 간의 차이로서 계산되어 진다. 무처리된 대조군에 대한 유전자 발현에서 n배 변화 (n-fold change)는 2^-△△ ^CT로 계산되어 졌다.

실시예 5: 전사활성 분석 ( Transcriptional activity assay )

전사활성 분석에서, 293T 세포들은 48-well 플레이트에서 3 x 10⁴ cells/well로 접종되었고, 리포펙타민 2000 (Lipofectamine 2000)을 사용하여 150 내지 300 ng 발현 플라스미드와, 150 ng SV40-driven 리포터 또는 pGL2-lmo2 프로모터 (-661 ~ -330) 리포터 플라스미드로 공동 트랜스펙션되었다. 48시간 후에, 이러한 세포들을 수거하고 루시퍼라아제 분석 (Promega)에 사용하였다. β-갈락토시다아제 활성 정도나 단백질 농도는 각각 리포터 루시퍼라아제 (reporter luciferase) 또는 β-갈락토시다아제 활성을 표준화 (normalize)하는데 사용되었다.

실시예 6: 면역침강법 ( Immunoprecipitation )

상호작용을 분석 (interaction assays)하기 위해, 293T 세포들을 pcDNA6-JMJD1B, Gal4-CBP 또는 FLAG-PCAF로 동시에 트랜스펙션시키고 RIPA 용해버퍼 (lysis buffer)에서 용해시킨 후, α-JMJD1B, α-CBP 또는 α-PCAF 항체 (Santa Cruz Biotechnology) 및 단백질 A/G 아가로스 비드 (GenDEPOT)와 함께 면역침강 (immunoprecipitated)시켰다. 이 결합된 단백질들을 α-JMJD1B, α-CBP, 및 α-PCAF 항체로 면역블롯 (immunoblots)하여 분석하였다.

실시예 7: 염색질 면역침강 분석과 정량적 PCR ( Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay and quantitative PCR )

HL-60 및 293T 세포들을 JMJD1B 또는 sh-JMJD1Bs로 트랜스펙션시키고 48시간 후에 수거한 다음, 실온에서 10분간 배지에 1% 포름알데히드 (formaldehyde added)를 넣어 교차결합시키고 실온에서 5분간 125 mM 글리신 (glycine)을 첨가하였다.

이 샘플들을 초음파처리하고 그 용해물 (lysates)을 지시된 항체를 사용하여 면역침강에 사용하였다. 면역침강물을 용출하고 역교차결합한 다음, DNA 조각들을 PCR 증폭을 위해 정제하였다. JMJD1B 프로모터 지역을 분석하기 위해, 프라이머 세트는 457 bp 지역 (-1067 to -611; sense 5'-CAATTTCCTGTTGCTTATTGT-3' 및 antisense 5'-TCAATGGCCCATAACAGCACC-3')으로 구성되었다.

뉴클레오티드 -687 내지 -200 lmo2 프로모터에 상응하는 488 bp 조각과, lmo2 엑손지역 (exonic region)의 446 bp 조각 (+243 to +688)을 PCR 증폭시켰다. 프라이머서열은 lmo2 프로모터 (sense5'-GGACCTGGGACCTCGAAC-3'; antisense 5'-GGGCTTCCTCCTCTCTCGGGAAG-3') 및 lmo2 엑손지역 (sense 5'-GCGCGGTGACTGTCCTTGAG-3'; antisense 5'-GTCTCTCCGGCAGAGCTTCC-3')으로 고안되었다.

Myc 및 Raf -1 프로모터 지역을 분석하기 위해, 이러한 프라이머 세트는 각각 248 bp 조각 (-710 to -463; sense 5'-TAATCATTCTAGGCATCGTTTT-3' ; antisense 5'-ATCATCGCAGGCGGAACAGCTG-3')과 180-bp 조각 (-430 to -251; sense 5'-TGCCTCAGCCTCCCGAGTAGCTGGGAC-3'; antisense 5'-ACTTCCATTAAATATTTCATAGATGAGG-3')으로 구성된다.

real-time PCR을 위한 프라이머 농도는 0.2 μM / 25 ㎕이다. 열순환기 (thermal cycler) 조건은 95℃에서 15분간 유지한 후, 94℃ 에서 15 초, 60℃에서 30 초, 그리고 72℃에서 30 초로 45 사이클을 진행하였다 (Bio-Rad).

실시예 8: MTT (3-(4,5- dimethylthiazol -2- yl )-2,5- diphenyltetrazolium bromide ) 분석

293T 세포를 48-well plates (2 X 10³cells/well)에 접종시키고, JMJD1B 및 si-JMJD1B로 트랜스팩션 시켰다. 37℃에서 0-4일간 배양한 후, 20㎕ MTT (1 mg/ml)를 첨가하고 세포들을 37℃에서 4시간 배양한 다음, 배지를 aspiration하고 100 ㎕ DMSO을 첨가하였다.

OD는 570nm 파장에서 ELISA reader (Biochrom Ltd.)로 결정하였다. DMSO만을 함유한 blank를 측정하고 실험값을 표준화하기 위해 사용되었다.

실시예 9: BrdU 흡수 분석 ( BrdU incorporation assay )

BrdU 흡수 분석을 수행하였다 (Roche Diagnostics). 293T 세포들을 48-well 플레이트에서 배양한 다음, JMJD1B 및 si-JMJD1B로 트랜스펙션 시켰다. 72시간 후, 세포들을 2시간 동안 BrdU가 함유된 배지에서 배양하고, ELISA reader (Biochrom Ltd)를 사용하여 370 nm (reference wavelength: 475 nm)에서 흡광도를 측정하였다.

실시예 10: FACS 분석

초기의 세포자살을 검출하기 위해, 트랜스펙션 후 24시간이 지난 다음에 트랜스펙션된 293T 세포를 2 μM 독소루비신 (doxorubicin)으로 처리하고 PBS로 두 번 세척한 다음, Annexin V-FLUOS kit (BioBud)을 사용하여 아넥신 V (annexin V) 및 프로피디엄 아이오다이드 (propidium iodide, PI)로 이중 라벨하였다. 라벨된 세포를 BD FACStation (BD Biosciences)으로 분석하였다. 세포자살을 검출하기 위해 detector forward scatter, side scatter, annexin V (FL1)를 위한 fluorescence 1, PI (FL3)을 위한 fluorescence 3 세팅이 사용되었고, 10,000 세포의 현광방출 (fluorescence emission )이 기록되었다. 그 결과는 FACScan Cell Quest software (BD Biosciences)로 분석되었다.

실시예 11: 콜로니 형성 분석

콜로니 형성을 위한 소프트 아가 (soft agar) 분석이 종래의 방법에 약간의 변형을 가하여 수행되었다 (Liao et al, 2005). 간단히, bottom base layer (0.8% agar)는 60-mm dishes에서 10% FBS을 함유한 2X DMEM 배지 (Welgene)로 준비되었다. 293T 세포는 JMJD1B 및 JMJD1B (H558A)와 함께 트랜스펙션되었고, 10% FBS가 첨가된 DMEM를 함유한 0.5% agar 상층에다가 10% FBS가 첨가된 DMEM를 함유한 3 ml 소프트 아가 (soft agar , Difco)에 플레이트 되었다.

이 플레이트들을 3주간 37 ℃, 5% CO₂를 함유한 humidified incubator에서 배양하였다. 배양물을 매일 3주간 관찰한 다음, 고정하고 1시간 이내로 0.5 ml의 0.005% 크리스탈 바이올렛 (crystal violet)으로 염색되었다. 이러한 콜로니들 수를 해부현미경 (dissecting microscope)을 사용하여 세었다. 이러한 분석을 3번 반복하여 수행하였다.

실시예 12: 생체내 암생성 분석 ( In vivo tumorigenesis assay )

생체내 암 생성을 조사하기 위해, MCF-7 세포 (10⁵)를 6주된 athymic nu/nu 암컷 마우스 (Orient)의 왼쪽 측면내의 피하부분에 주입하였다. 암은 2일마다 측정되었고 이 실험은 4주에 마쳤다. 암을 절개하고 무게를 달았다.

실시예 13: 백혈병 환자 샘플 ( Leukemia patient samples )

단핵구세포를 8명의 백혈병환자의 골수로부터 얻었다. 환자 1,2 및 3은 급성골수성 백혈병 (acute myelogenous leukemia, AML) 환자였고, 환자 4 및 5는 초기 전구체 B세포타입의 급성 림프구성 백혈병 (acute lymphoblastic leukemia, ALL) 환자였다. 환자 6-13은 전구체 B세포 타입의 급성 림프구성 백혈병 환자였다. 각각의 환자의 보호자로부터 통지하여 동의를 얻었고, 경남대 병원 (Chonnam National University Hospital) 기관감사위원회 (Institutional Review Board)로부터 연구 승인을 얻었다.

실시예 14: 온코민 데이타베이스 분석 ( Oncomine database analysis )

온코민 데이타베이스 (Oncomine database) 사용에 관하여는 종래의 방법에 따랐다 (Rhodes et al, 2004). JMJD1B의 유전자 발현데이터를 온코민 웹사이트 (Oncomine website, www.oncomine.org)로부터 검색하였다. 정상과 암조직 사이의 JMJD1B 발현에서의 차이점을 나타낸 Data sets이 선별되어졌다.

실시예 1 5: 통계 분석

데이터는 세 개 또는 그 이상의 독립적 실험의 평균 ±s.d로 표현되었다. 통계적으로 중요한 효과 (p < 0.05)가 마이크로소프트 엑셀 (Microsoft Excel)로 평가되었다. 그룹들간의 차이점이 variance (ANOVA)의 one-way analysis으로 평가되었고 적절한 Student's t-test 또는 Bonferroni's test를 수행하였다.

< 실험예 및 그 결과>

실험예 1 : H3K9 - me2 타겟 유전자의 동정

백혈구 세포가 분화하는 동안 H3K9-me2의 직접적인 타겟을 동정하기 위해, ATRA (all-trans retinoid acid)로 처리된 인간 전골수성 백혈병 세포주 HL-60에 대한 ChIP-chip 분석을 수행하였다. ATRA로 처리된 HL-60의 분화를 김자액 (giemsa) 염색과 NBT 분석으로 확인하였다 (도 1A 및 B). ChIP-chip에 의해 동정된 타겟 TSS 지역을 하기 표 2에 나타내었다.

JMJD1B은 인간 염색체 5 (5q31)에 위치하고 JMJD1B 프로모터상에서 H3K9-me2의 타겟위치를 관찰할 수 있는데, 이는 분화하는 동안 변형된다 (도 2A). 다양한 쥐 조직 샘플을 가지고 조직 블롯분석 (tissue blot analysis)을 한 결과, JMJD1B는 혈액생성 (hematopoiesis)에 관계된, 흉선(thymus), 지라 (spleen) 및 태반 (placenta)에서 풍부하게 관찰되었다 (도 2B).

실험예 2 : H3K9 타겟 유전자 JMJD1B 프로모터의 입증

히스톤 변형 전에 ATRA로 HL-60 세포를 처리하고 JMJD1B 프로모터에 염색질 리모델러 (chromatin remodelers)의 도입을 분석하였다.

하기 도 2C 및 도 2D에서 나타난 바와 같이, JMJD1B 발현이 하향조절되고 HL-60 세포의 ATRA-매개된 분화 동안 JMJD1B 프로모터는 H3K9-me2로 강화되었다. 한편, JMJD1B 프로모터에서 H3K4-me2 수준은 분화하는 동안 감소되었고 (도 2E), H3 및 H4의 히스톤 아세틸화는 세포가 ATRA로 처리되었을 때 상당히 감소되었다 (도 2F).

하기 도 2G에서 나타난 바와 같이, JMJD1B 프로모터에 대한 보조억제인자 복합체 (corepressor)인 HDAC1, HP-1a, 및 SMRT의 결합이 증가됨에 따라, ATRA 처리로 유도된 HL-60 세포가 분화되는 동안 JMJD1B이 크게 억제되었다.

실험예 3: 히스톤 H3K9 디메틸라아제인 JMJD1B

JMJD1B는 JMJD1A (JHDM2A) 및JMJD1C (JHDM2C)을 포함하는 JmjC 도메인을 지닌 단백질 서브패밀리에 속한다 (도 3A).

하기 도 3B에서 나타난 바와 같이, JMJD1B가 특이적으로 H3K9-me2를 디메틸화시켰다. JmjC 도메인에서 보존된 히스티딘이 알라닌으로 바뀌는 JMJD1B 점 돌연변이로 트랜스펙션된 세포에서는 H3K9-me2에 대한 JMJD1B 디메틸라아제 활성 (JMJD1B demethylase activity)이 나타나지 않았다.

또한, GST-purified JMJD1B 및 코어 히스톤 (core histones)으로 디메틸라아제 분석을 수행했을 때, 유사한 결과가 얻어졌다 (도 4B). 아연핑커 유사 모티브 (ZF-like motif, JMJD1B DN) 또는 JmjC 도메인 (JMJD1B DC) 중 어느 하나의 결실로 인해 H3K9-me2 디메틸라아제 활성 (H3K9-me2 demethylase activity)이 사라졌다 (도 4B).

다음, JMJD1B에 의한 H3K9-me1/2 디메틸화 (demethylation)를 분석하기 위해 면역현광을 사용하였다. JMJD1B 기질 특이성을 조사하기 위한 다른 연구뿐만 아니라, JMJD1B를 발현하는 세포에서 H3K9-me1 메틸화가 상당히 사라지는 것을 관찰하였다 (도 3C). JmjC 도메인 (JMJD1B H558A)에서 아미노산이 대체됨으로 JMJD1B 디메틸라아제 활성이 없어졌다 (도 3D).

합성 H3K9-me1/2/3 펩티드를 단독으로 또는 JMJD1B와 함께 배양하고 질량분석기(mass spectrometry)로 분석하였다. 이러한 분석은 H3K9-me1/2 펩타이드들이 모노 및 메틸화되지 않은 펩타이드로 전환됨을 설명하였다.

H3K9-me3 펩타이드를 JMJD1B와 함께 배양하였을 때, 디메틸라아제 활성은 검출되지 않았다. 웨스톤 블롯 분석 (Western blot analysis)결과 JMJD1B가 H3K9-me1에 대한 약한 디메틸화 활성 (weak demethylation activity)을 있었고, 질량 분석과 면역현광 결과에 의하면 JMJD1B이 펩타이드들로부터 모노 메틸 그룹을 제거할 수 있었다.

실험예 4: JMJD1B 에 의한 lmo2 암유전자의 전사 조절

전사활성에 대한 JMJD1B 효과를 밝히기 위해, 293T 세포에서 pCMX-Gal4-SV40 리포터 시스템을 사용하여 일시적 트랜스펙션 분석 (transient transfection assay)을 수행한 결과, 증가된 JMJD1B 함량은 SV40 전사를 성공적으로 유도하였다.

하기 도 6A에 나타난 바와 같이, 세포를 디메틸라아제-결손 돌연변이 JMJD1B (demethylase-defective mutant JMJD1B (H558A))로 트랜스펙션 시켰을 때, 전사 활성이 상당히 감소 되었는데, 이는 H3K9 디메틸화 활성을 중요성을 나타낸다. 또한, JMJD1B를 si-JMJD1B에 의해 녹다운시켰을 때 일반적인 전사가 상당히 감소되었고, JMJD1B가 전사활성화 (transcriptional activation) 활성을 가짐을 확인하였다 (도 6A).

JMJD1B는 H3K9-me1/2 디메틸라아제 및 전사활성화 (transcription activation) 활성을 가짐을 확인하고, JMJD1B에 의해 직접적으로 타겟된 유전자를 찾았다.

조혈과 관련된 조직에서 백혈병 세포 ATRA로 분화를 유도하고 풍부하게 발현하는 동안 JMJD1B 유전자 발현의 하향조절은, ATRA-유도된 분화 동안 하향조절된 가능한 후보 유전자를 찾은 결과, 특이적으로 백혈병 암유전자 lmo2 및 항세포자살인자 Bcl-xL (anti-apoptotic factor Bcl-xL)가 ATRA-유도된 분화되는 동안 발현이 감소되었다 (도 6B).

다음으로, JMJD1B로 HL-60 세포를 트랜스펙션시키고 선택적인 암유전자와 항세포자살 유전자의 상대적인 발현수준을 결정하였다. RT-PCR 결과는 JMJD1B가 과발현되었을 때 Bcl-xL 및 lmo2 발현이 증가되었다 (도 6C). JMJD1B 또는 si-JMJD1B을 발현하는 HL-60 및 293T 세포의 Real-time PCR 분석은, lmo2 및 Bcl-xL가 JMJD1B에 의해 조절되는 추정적인 타겟 유전자임을 나타낸다 (도 6D, 도 7A).

대조적으로, 테스트된 다른 유전자는 발현수준에서 어떠한 변화를 나타내지 않았다 (도 6E 및 도 7B). 단백질 발현수준은 또한 면역블롯 분석 (immunoblot analysis)에 의해 결정되었다.

si-JMJD1B를 사용한 JMJD1B의 녹다운 (Knock-down)은 HL-60 및 293T 세포에서 lmo2 및 Bcl-xL의 하향조절을 이끌었다 (도 6F 및 도 7C). 합산하여, 이러한 데이터는 JMJD1B가 lmo2 및 Bcl-xL의 전사를 조절한다는 증거를 제공한다.

실험예 5: JMJD1B 에 의한 전사를 조절

lmo2의 JMJD1B-매개된 전사조절을 조사하기 위해, lmo2-luc 리포터 시스템을 사용하여 트랜스펙션 분석을 수행하였다.

lmo2의 전사는 JMJD1B 공동 트랜스펙션 (cotransfection)으로 강화되었다 (도 8A 및 도 9C). JMJD1B H558A 돌연변이체를 사용하여, JMJD1B에 의한 lmo2의 전사활성이 디메틸라아제 활성에 의존한다는 것을 입증하였다 (도 8A 및 도 9C). 두 가지 다른 sh-JMJD1Bs에 의한 JMJD1B의 녹다운 (Knock-down)은 JMJD1B에 의해 매개된 lmo2 전사활성을 차단하였다 (도 8A 및 도 9C). 분석에 사용된 두 가지 다른 sh-JMJD1B RNA 분자가 성공적으로 JMJD1B 단백질 및 RNA 발현을 하향조절하였다 (도 9A 및 B).

이들을 종합하면, JMJD1B가 조혈 암유전자 lmo2의 전사를 활성화시킴으로 백혈병을 유발할 수 있음을 나타낸다.

HL-60 세포를 사용한 real-time PCR과 함께 ChIP 분석을 수행한 결과, ATRA의 존재하에 lmo2 프로모터에 대한 JMJD1B 도입이 감소되고, H3K9-me2 및 H3K9-me1 수준이 증가 되었다. 이러한 관찰은 chip분석에서 ChIP 결과와 일치하는 것이다 (도 8B 및 C, 도 10A).

JMJD1B가 과발현되었을 때, 특이적으로 lmo2 프로모터를 타겟할 수 있는지를 평가하였다. 하기 도 8D 및 8E에 의하면 JMJD1B가 lmo2 프로모터에 강하게 결합되고, 이러한 프로모터의 H3K9-me2 메틸화를 감소시킴을 알 수 있다 (도 10B 및 C).

두 가지 다른 sh-JMJD1Bs에 의한 JMJD1B의 녹다운 (Knock-down)은 JMJD1B 유입을 상당히 감소시켰고 H3K9-me1/2 메틸화를 크게 증가시켰으나, HL-60 및 293 세포에서 lmo2 프로모터에 대한 H3K9-me3 메틸화를 증가시키지 않았다 (도 10C 및 D).

실험예 6: JMJD1B 와 CBP 간의 기능적 연결

HAT 활성이 lmo2의 JMJD1B-매개된 전사활성 (JMJD1B-mediated transcriptional activation)과 관련되는지를 결정하기 위해, HATs (CBP 및 PCAF)의 존자하에 루시퍼라아제 리포터 분석 (luciferase reporter assay )에 의해 lmo2의 전사활성을 분석하였다.

하기 도 11A 및 B에 나타난 바와 같이, lmo2의 JMJD1B-매개된 전사촉진 (transactivation)은 CBP 존재하에서는 증가되었지만, PCAF 첨가시에는 관찰되지 않았다 (도 11A 및 B). 더욱이, CBP 존재시 두 가지 다른 sh-JMJD1Bs에 의해 lmo2 전사가 상당히 감소된다는 것은 JMJD1B이 동시 활성화 (coactivation)와 관련된 HATs을 매개함을 알수 있다 (도 11A 및 B).

JMJD1B 및 CBP가 동시 활성자 복합체 (coactivator complex)를 형성하여 lmo2 발현을 유도하는 지를 테스트하기 위해, JMJD1B와 HATs간에 면역침강 분석 (immunoprecipitation assays)을 수행하였다.

분석 결과, 하기 도 11C에서 나타난 바와 같이 PCAF가 아닌 CBP가 JMJD1B와 강하게 상호작용하며, lmo2 전사활성 동안 CBP와 활성자 복합체 (activator complex)를 형성한다는 것을 나타낸다. HL-60 세포를 사용한 real-time PCR과 ChIP 분석을 한 결과, CBP가 lmo2 프로모터에 도입됨 (recruited)을 확인하였다(도 11D). CBP 도입 (recruitment)과 일치하여, H3 아세틸화 정도는 상향 조절되었다 (도 11E). 이러한 실험은 JMJD1B 및 CBP HAT 복합체가 물리적으로 및 기능적으로 모두 연결되어 있음을 제시한다.

실험예 7: JMJD1B 에 의한 세포증식의 촉진

JMJD1B가 세포증식을 촉진하는지를 테스트하기 위해, 293T세포에서 세포생존력에 대한 JMJD1B 녹다운 또는 과발현의 효과를 MTT 분석을 통해 비교하였다. 대조군 세포주 (control cell lines)와 비교할 때 세포 생존력에 있어 JMJD1B 녹다운 (knock-down)은 상당히 감소된 데 반해, JMJD1B 과발현에 의해 세포 생존력은 상당히 증가 되었다 (도 12A).

BrdU 흡수 (BrdU incorporation)에 따라서 세포증식에 대한 JMJD1B의 효과를 측정하였다. BrdU 흡수는 JMJD1B 과발현에 의해 증가되었고, si-JMJD1B에 의해 저해되었는데, 이는 JMJD1B가 직접적으로 세포증식을 촉진시키는데 관여함을 알 수 있다 (도 12B).

JMJD1B 과발현이 세포증식을 야기하는지를 알기 위해, FACS 분석을 통해 JMJD1B 녹다운에 의해 세포자살이 유도되는지를 조사하였다. 이를 위해, JMJD1B를 과발현시키는 세포를 아넥신 V (annexin V) 및 프로피디엄 아이오다이드 (propidium iodide)로 라벨하고, 세포자살 세포를 유세포 분석기 (flow cytometry)로 양을 측정하였다.

JMJD1B는 독소루비신 (doxorubicin) 처리 (4% to 10%)로 유도된 세포자살을 감소시켰고, 두 가지 다른 sh-JMJD1Bs는 세포자살을 수행하는 세포의 수를 18 내지 22% 증가시켰다 (도 12C). 상기 데이터는 JMJD1B가 세포증식을 유도하고 세포자살을 저해한다는 것을 제시하였다.

JMJD1B의 암유전적 특성을 조사하기 위해, JMJD1B를 과발현하는 293T 세포에서의 콜로니형성 분석을 수행하였다. 이러한 세포를 다른 JMJD1B 발현 구조체 (JMJD1B expression constructs)로 트랜스펙션시키고 3주 동안 성장시킨 후 포르말린으로 고정하고 염색하였다.

본 발명자는 야생형 JMJD1B의 발현은 콜로니수 형성을 70% 증가시켰는데, 이는 JMJD1B발현이 증가된 293T 세포성장을 야기한다는 것을 제시한다 (도 12D). JMJD1B 녹다운은 콜로니 형성을 상당히 감소시키는 데, 이는 MJD1B가 세포증식에 필수적임을 제시한다 (도 12D).

다음, 누드 마우스에 JMJD1B를 과발현시킨 MCF-7 세포를 주입하였다. JMJD1B를 과발현한 세포를 주입 후 바로 암세포 성장이 야기되었다.

JMJD1B를 과발현시킨 세포는 주입후 곧 암의 성장을 야기하였다 (도 12E). JMJD1B를 과발현시킨 HepG2 세포를 누드 마우스에 주입하였고, 그 결과는 JMJD1B를 과발현한 MCF-7 세포와 연관된 것과 비교할 때 유사한 암성장 패턴을 나타내었다.

실험예 8: 백혈병 환자 조직 샘플에서 과별현된 JMJD1B

JMJD1B는 HL-60 세포에서 동정되고, 조혈과 관련 조직에서 강하게 발현되기에, 골수 단핵세포에서 JMJD1B 발현정도를 측정하여 백혈병환자에서의 JMJD1B 발현이 조절기능을 조사하였다.

다양한 유형의 백혈병을 지닌 환자와 건강한 실험체로부터 회수한 조직에서 총단백질을 분리하였다. 단핵세포를 분리한 후에, 세포 표현형을 유세포분석기 (flow cytometry)로 조사하였고, 이러한 세포의 특성을 하기 표 3에 나타내었다.

JMJD1B에 대한 특이적 프라이머를 사용하여 RT-PCR 분석을 사용하여, 정상세포와 비교할 때 JMJD1B가 백혈병 환자에서 과발현되었다 (도 13A). RT-PCR 결과와 동일하게, 웨스턴 블롯 분석은 백혈병 환자로부터 얻어진 샘플에서 높은 JMJD1B 단백질 발현을 보였다 (도 13B).

<110> CHUNG ANG University Industry Academic Cooperation <120> Composition for diagnosing leukemia <130> DP-2011-0217 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 759 <212> PRT <213> jumonji domain containing 1B # 1 aa of Homo sapiens <400> 1 Met Ser Glu Lys Glu Ala Met Met Met Val Glu Pro His Gln Lys Val 1 5 10 15 Ala Trp Lys Arg Ala Val Arg Gly Val Arg Glu Met Cys Asp Val Cys 20 25 30 Glu Thr Thr Leu Phe Asn Ile His Trp Val Cys Arg Lys Cys Gly Phe 35 40 45 Gly Val Cys Leu Asp Cys Tyr Arg Leu Arg Lys Ser Arg Pro Arg Ser 50 55 60 Glu Thr Glu Glu Met Gly Asp Glu Glu Val Phe Ser Trp Leu Lys Cys 65 70 75 80 Ala Lys Gly Gln Ser His Glu Pro Glu Asn Leu Met Pro Thr Gln Ile 85 90 95 Ile Pro Gly Thr Ala Leu Tyr Asn Ile Gly Asp Met Val His Ala Ala 100 105 110 Arg Gly Lys Trp Gly Ile Lys Ala Asn Cys Pro Cys Ile Ser Arg Gln 115 120 125 Asn Lys Ser Val Leu Arg Pro Ala Val Thr Asn Gly Met Ser Gln Leu 130 135 140 Pro Ser Ile Asn Pro Ser Ala Ser Ser Gly Asn Glu Thr Thr Phe Ser 145 150 155 160 Gly Gly Gly Gly Pro Ala Pro Val Thr Thr Pro Glu Pro Asp His Val 165 170 175 Pro Lys Ala Asp Ser Thr Asp Ile Arg Ser Glu Glu Pro Leu Lys Thr 180 185 190 Asp Ser Ser Ala Ser Asn Ser Asn Ser Glu Leu Lys Ala Ile Arg Pro 195 200 205 Pro Cys Pro Asp Thr Ala Pro Pro Ser Ser Ala Leu His Trp Leu Ala 210 215 220 Asp Leu Ala Thr Gln Lys Ala Lys Glu Glu Thr Lys Glu Ala Gly Ser 225 230 235 240 Leu Arg Ser Val Leu Asn Lys Glu Ser His Ser Pro Phe Gly Leu Asp 245 250 255 Ser Phe Asn Ser Thr Ala Lys Val Ser Pro Leu Thr Pro Lys Leu Phe 260 265 270 Asn Ser Leu Leu Leu Gly Pro Thr Ala Ser Asn Asn Lys Thr Glu Gly 275 280 285 Ser Ser Leu Arg Asp Leu Leu His Ser Gly Pro Gly Lys Leu Pro Gln 290 295 300 Thr Pro Leu Asp Thr Gly Ile Pro Phe Pro Pro Val Phe Ser Thr Ser 305 310 315 320 Ser Ala Gly Val Lys Ser Lys Ala Ser Leu Pro Asn Phe Leu Asp His 325 330 335 Ile Ile Ala Ser Val Val Glu Asn Lys Lys Thr Ser Asp Ala Ser Lys 340 345 350 Arg Ala Cys Asn Leu Thr Asp Thr Gln Lys Glu Val Lys Glu Met Val 355 360 365 Met Gly Leu Asn Val Leu Asp Pro His Thr Ser His Ser Trp Leu Cys 370 375 380 Asp Gly Arg Leu Leu Cys Leu His Asp Pro Ser Asn Lys Asn Asn Trp 385 390 395 400 Lys Ile Phe Arg Glu Cys Trp Lys Gln Gly Gln Pro Val Leu Val Ser 405 410 415 Gly Val His Lys Lys Leu Lys Ser Glu Leu Trp Lys Pro Glu Ala Phe 420 425 430 Ser Gln Glu Phe Gly Asp Gln Asp Val Asp Leu Val Asn Cys Arg Asn 435 440 445 Cys Ala Ile Ile Ser Asp Val Lys Val Arg Asp Phe Trp Asp Gly Phe 450 455 460 Glu Ile Ile Cys Lys Arg Leu Arg Ser Glu Asp Gly Gln Pro Met Val 465 470 475 480 Leu Lys Leu Lys Asp Trp Pro Pro Gly Glu Asp Phe Arg Asp Met Met 485 490 495 Pro Thr Arg Phe Glu Asp Leu Met Glu Asn Leu Pro Leu Pro Glu Tyr 500 505 510 Thr Lys Arg Asp Gly Arg Leu Asn Leu Ala Ser Arg Leu Pro Ser Tyr 515 520 525 Phe Val Arg Pro Asp Leu Gly Pro Lys Met Tyr Asn Ala Tyr Gly Leu 530 535 540 Ile Thr Ala Glu Asp Arg Arg Val Gly Thr Thr Asn Leu His Leu Asp 545 550 555 560 Val Ser Asp Ala Val Asn Val Met Val Tyr Val Gly Ile Pro Ile Gly 565 570 575 Glu Gly Ala His Asp Glu Glu Val Leu Lys Thr Ile Asp Glu Gly Asp 580 585 590 Ala Asp Glu Val Thr Lys Gln Arg Ile His Asp Gly Lys Glu Lys Pro 595 600 605 Gly Ala Leu Trp His Ile Tyr Ala Ala Lys Asp Ala Glu Lys Ile Arg 610 615 620 Glu Leu Leu Arg Lys Val Gly Glu Glu Gln Gly Gln Glu Asn Pro Pro 625 630 635 640 Asp His Asp Pro Ile His Asp Gln Ser Trp Tyr Leu Asp Gln Thr Leu 645 650 655 Arg Lys Arg Leu Tyr Glu Glu Tyr Gly Val Gln Gly Trp Ala Ile Val 660 665 670 Gln Phe Leu Gly Asp Ala Val Phe Ile Pro Ala Gly Ala Pro His Gln 675 680 685 Val His Asn Leu Tyr Ser Cys Ile Lys Val Ala Glu Asp Phe Val Ser 690 695 700 Pro Glu His Val Lys His Cys Phe Arg Leu Thr Gln Glu Phe Arg His 705 710 715 720 Leu Ser Asn Thr His Thr Asn His Glu Asp Lys Leu Gln Val Lys Asn 725 730 735 Ile Ile Tyr His Ala Val Lys Asp Ala Val Gly Thr Leu Lys Ala His 740 745 750 Glu Ser Lys Leu Ala Arg Ser 755

Claims

서열번호 1의 아미노산을 코딩하는 JMJD1B (jumonji domain containing 1B) 유전자, 이의 전사체 또는 이의 발현된 단백질 중에서 선택된 어느 하나를 포함하는 백혈병 진단용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 JMJD1B 단백질은 히스톤 디메틸라아제 H3K9-me1/2 활성을 가지는 백혈병 진단용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 JMJD1B 단백질은 암유전자 lmo2 (LIM domain only protein 2)를 활성화시키거나 세포자살을 억제하는 유전자 Bcl-xL를 활성화시키는 백혈병 진단용 조성물.
서열번호 1의 아미노산을 코딩하는 JMJD1B 유전자, 이의 전사체 또는 이의 발현된 단백질 중에서 선택된 어느 하나를 표적물질로 이용하여 시험대상물질을 접촉시키고, 표적물질과 시험대상물질 간의 반응을 확인하여, 시험대상물질이 상기 유전자의 전사, 이의 단백질 발현 또는 이의 단백질 활성을 억제시키는지를 결정하는 단계를 포함하는 백혈병 치료제 스크리닝 방법.