KR20120135992A - Methods for detecting enterohemorrhagic escherichia coli o157:h7 - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 장출혈성 대장균 O157:H7 검출용 프라이머 및 이를 이용한 장출혈성 대장균 O157:H7 검출방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a primer for detecting E. coli O157: H7, and a method for detecting E. coli O157: H7 using the same.
산업의 발전과 수입 자유화에 따른 식품 교역량 증가와 더불어 웰빙문화에 따른 식품 안전성에 대한 국민의 관심은 더욱 높아졌다. 그러나, 최근에 일어난 중국산 기생충 김치, 납 꽃게, 돼지고기에서 다이옥신 검출, 살모넬라, 장출혈성 대장균 O157:H7, 수입 소시지에서 검출된 리스테리아균 등은 모두 수입식품으로 인한 파동 및 집단 식중독을 거치면서 먹거리에 대한 불신은 극에 달했다. 이러한 식품 안정성 논란이 있을 때마다 소비자들은 식품에 대한 검역조치를 강화할 것을 요구하고 있다. 미국, 유럽, 일본 등의 여러 선진국 경우도 지난 20년간 비슷한 경험을 하면서 농장에서 식탁까지 오염될 수 있는 식품 유해물질의 퇴치를 위해 부단히 노력해 왔다. 하지만, 지구 온난화 및 환경적인 변화로 식중독 발생은 매년 증가하고 있어 이에 맞는 식품 안정성 확보를 위한 대책이 절실히 요구되고 있다. 또한, 재래식 방법을 통한 식품 유해물질 검사는 아직도 높은 비용과 오랜 시간을 요구하는 노동 집약적인 방법이 사용되는 경우가 많아서 신속 정확한 검사 방법이 시급한 상황이다.As food trade increased due to industrial development and import liberalization, the public's interest in food safety caused by well-being culture increased. However, recent Chinese parasites such as kimchi, lead crab, dioxin detection in pork, salmonella, enterocoliform E. coli O157: H7, and Listeria found in imported sausages are all affected by food and food during the wave and mass poisoning. Disbelief has reached its pole. Whenever there is a food safety debate, consumers are calling for increased food quarantine. Many developed countries, such as the United States, Europe, and Japan, have had similar experiences over the past two decades and have worked tirelessly to combat harmful foods that can be contaminated from farm to table. However, due to global warming and environmental changes, food poisoning is increasing every year, and measures for securing food safety are urgently required. In addition, the inspection of food hazardous substances by conventional methods is still a high cost and long time labor-intensive method is often used, the urgent need for rapid and accurate inspection method.
유아와 성인에게 발생하는 병원성 대장균 식중독은 각종 외래성 대장균이 오염 및 증식된 식품을 섭취함으로써 일어난다. 이러한 병원성 대장균(pathogenic E.coli)은 비병원성대장균(non-pathogenic E.coli)의 형태와 생화학적 성상이 유사하다. 이들 병원성 대장균은 장내세균과에 속하는 0.4-0.7 × 1-30 ㎛ 크기로 비포자이고 그람 음성의 간균이며 주모성 편모가 있어서 운동성이 있으나, 편모가 없고 비운동성인 것도 있다. 또한, 보통배지에서 쉽게 배양이 가능하며 적정 온도는 37℃로 중온균으로 구분된다. 이들 대장균이 가진 항원은 somatic(O) 항원 180종, capsular(K) 항원 100종, flagella(H) 항원 56여종 등 3종류로 분류되어 있으며, 또한 serotype, biotype, phase type, enterotoxin 생성에 따라 세분화되어 장출혈성 대장균 O157:H7의 특이적인 검출에는 어려움이 있었다.Pathogenic E. coli food poisoning in infants and adults occurs by eating foods contaminated and multiplied by various foreign E. coli. This Escherichia coli (E.coli pathogenic) is similar to the shape and biochemical properties of non-pathogenic E. coli (non-pathogenic E.coli). These Escherichia coli are 0.4-0.7 × 1-30 μm in size, belonging to the Enterobacteriaceae, and are nonspores, Gram-negative bacilli, and have a main flagella flagella. In addition, it can be easily cultured in normal medium and the appropriate temperature is divided into mesophilic bacteria at 37 ℃. These E. coli antigens are classified into three types: 180 somatic (O) antigens, 100 capsular (K) antigens, and 56 flagella (H) antigens.They are further subdivided according to serotype, biotype, phase type, and enterotoxin production. As a result, specific detection of intestinal hemorrhagic E. coli O157: H7 was difficult.
우리나라의 식중독 발생현황을 살펴보면, 원인식품으로는 육류 및 식육가공품이 약 50% 이상을 차지하고 있다. 정확한 원인균의 동정을 위해서 오염된 가검물이나 식품을 배양하여 생화학적 테스트를 수행하는 것을 원칙으로 하는데, 이는 최소 3일에서 수 주일이 소요된다. 이와 같은 배지법이나 생화학적 테스트는 공인검사법으로 널리 사용되고 있기는 하지만 원인병원체를 파악하고 역학조사를 완료하기 전에 이미 식중독이 집단적으로 확산될 가능성이 매우 높다. 따라서, 추가적으로 유전자 스크리닝 검사법을 확보함으로써, 식중독 원인 병원체에 대한 조기진단을 가능하게 할 수 있다. 유전자검사법으로 처음 등장한 PCR법은 각 균에 대한 특이적 독소유전자(toxin gene)를 증폭시킴으로써 병원체의 유전자를 신속하고 정확하게 검출할 수 있어 PCR법이 임상진단에 널리 보급되고 있으나, 독소유전자만을 증폭시킴으로써 비독소 유전자(non-toxin gene)를 가진 병원균에서 발생하는 식중독은 검출하지 못하는 한계가 있다.Looking at the status of food poisoning in Korea, meat and processed meat products account for more than 50% of the cause food. In order to correctly identify the causative organisms, biochemical tests should be carried out by culturing contaminated specimens or foods, which should take at least three to several weeks. Although such media and biochemical tests are widely used as accredited tests, there is a high probability of food poisoning already spreading before the causative agent is identified and epidemiological studies are completed. Therefore, by additionally securing the genetic screening test, it is possible to enable early diagnosis of the pathogen causing food poisoning. PCR method, which first appeared as a genetic test method, can rapidly and accurately detect genes of pathogens by amplifying specific toxin genes for each bacterium. PCR methods are widely used in clinical diagnosis. Food poisoning that occurs in pathogens with non-toxin genes is not detectable.
상술한 바와 같이, PCR법과 같은 다양한 기술을 이용하여 신속하고 정확하며, 식중독 원인균의 배양과정이 생략된 식중독 원인균의 검출 및 이로부터 식품의 오염 정도를 검출할 수 있는 검출 방법의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
As described above, there is an urgent need for the detection of food poisoning causative organisms, which are quick and accurate, using a variety of techniques such as PCR, and eliminating the food poisoning causative process, and the development of a detection method capable of detecting food contamination therefrom. There is a situation.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
Numerous papers and patent documents are referenced and cited throughout this specification. The disclosures of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to better understand the state of the art to which the present invention pertains and the content of the present invention.
본 발명자들은 식품 위해 장출혈성 대장균 O157:H7 균주를 효과적으로 검출할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 식품 위해 장출혈성 대장균 O157:H7을 정확하게 검출할 수 있는 프라이머 쌍을 디자인하고 이를 이용한 증폭을 통해 장출혈성 대장균 O157:H7을 효과적으로 검출할 수 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors sought to develop a method that can effectively detect the enteric hemorrhagic E. coli O157: H7 strain for food. As a result, the present inventors completed the present invention by designing a pair of primers capable of accurately detecting enterohemorrhagic E. coli O157: H7 for food, and confirming that it is possible to effectively detect enteric hemorrhagic E. coli O157: H7 through amplification using the same. Was done.
따라서, 본 발명의 목적은 장출혈성 대장균 O157:H7(Escherichia coli O157:H7)의 검출방법을 제공한다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for detecting Escherichia coli O157: H7.
본 발명의 다른 목적은 장출혈성 대장균 O157:H7 검출용 프라이머 쌍을 제공하는 데 있다.Another object of the present invention to provide a primer pair for detecting hemorrhagic E. coli O157: H7.
본 발명의 또 다른 목적은 장출혈성 대장균 O157:H7-유발 질환 진단용 키트를 제공하는 데 있다.
Still another object of the present invention is to provide a kit for diagnosing enterohemostatic E. coli O157: H7-induced disease.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 장출혈성 대장균 O157:H7(Escherichia coli O157:H7)의 검출방법을 제공한다:According to an aspect of the present invention, the present invention provides a method for detecting Escherichia coli O157: H7 comprising the following steps:
(a) 시료를 준비하는 단계; (a) preparing a sample;
(b) 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열의 프라이머를 이용하여 상기 시료 내의 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 단계; 및 (b) amplifying the nucleotide sequence in the sample using primers of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2; And
(c) 상기 증폭 결과물을 확인하는 단계.(c) identifying the amplification result.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열의 프라이머로 이루어진 장출혈성 대장균 O157:H7(Escherichia coli O157:H7) 검출용 프라이머 쌍을 제공한다.
According to another aspect of the present invention, the present invention provides a primer pair for detecting Escherichia coli O157: H7 consisting of primers of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
본 발명자들은 식품 위해 장출혈성 대장균 O157:H7 균주를 효과적으로 검출할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 식품 위해 장출혈성 대장균 O157:H7을 정확하게 검출할 수 있는 프라이머 쌍을 디자인하고 이를 이용한 증폭을 통해 장출혈성 대장균 O157:H7을 효과적으로 검출할 수 있다는 것을 확인하였다.The present inventors sought to develop a method that can effectively detect the enteric hemorrhagic E. coli O157: H7 strain for food. As a result, the present inventors have designed a primer pair that can accurately detect enterohemorrhagic E. coli O157: H7 for food, and confirmed that it is possible to effectively detect enteric hemorrhagic E. coli O157: H7 through amplification using the same.
대장균 혈청형 O157:H7는 막대형 그람-음성 박테리아로, “O”는 세포벽(체세포의) O 항원의 수를 나타내고 “H”는 편모 항원을 의미한다. 대부분의 대장균은 무해하여 포유동물의 장에서 일반적으로 발견되지만, 대장균 O157:H7는 시가-유사 독소(shiga-like toxins)을 생산하여 심각한 질병을 야기하는 병원성 대장균[장출혈성 대장균(enterohemorrhagic Escherichia coli)으로 알려짐]의 한 클래스로, 때때로 베로사이토톡신-생산 대장균(verocytotoxin-producing E. coli, VTEC) 또는 시가-유사 독소-생산 대장균(shiga-like Toxin-producing E. coli, STEC)으로도 불린다.E. coli serotype O157: H7 is a rod gram-negative bacterium, where "O" represents the number of O wall antigens in the cell wall and "H" means flagella antigens. Most Escherichia coli are harmless and are commonly found in mammalian intestines, but Escherichia coli O157: H7 produces shiga-like toxins that cause serious illnesses (e.g. enterrohemorrhagic Escherichia coli ). And sometimes referred to as verocytotoxin-producing E. coli (VTEC) or shiga-like toxin-producing E. coli (STEC).
병원성 대장균은 독성형질, 일상 역학, 임상 형질 및 병리생리학적 작용기전에 따라 장출혈성 대장균(Enterohemorrhagic E. coli: EHEC), 장독소 대장균 (Enterotoxigenic E. coli: ETEC), 장병원성 대장균(Enteropathogenic E. coli: EPEC) 및 장침입성 대장균(Enteroin vasive E. coli: EIEC)의 4 그룹으로 분류된다. 특히, 장출혈성 대장균은 출혈성대장염(hemorrhagic colitis: HC)의 원인균으로서 장관에 장착 후 베로독소를 생산하여 장관 상피세포에 손상을 준다(Morrison DM, Am. J. Clin. Pathol 86, 108-112 (1985)). 장출혈성 대장균 O157:H7은 특히 어린이와 노인에게 있어서 용혈성 요독 증후군(HUS : hemolytic Uremic Syndrom)을 일으킬 수 있는 대장균으로, 모든 연령에서의 감염이 보고되어 있다.Escherichia coli is characterized by Enterohemorrhagic E. coli (EHEC), Enterotoxigenic E. coli (ETEC), Enteropathogenic E. coli according to virulence traits, routine epidemiology, clinical traits and pathophysiological mechanisms . : EPEC) and enteroinvasive E. coli (EIEC). In particular, intestinal hemorrhagic E. coli is a causative agent of hemorrhagic colitis (HC), which produces vero toxin and damages the intestinal epithelial cells after mounting in the intestine (Morrison DM, Am. 1985)). E. coli O157: H7 is an E. coli that can cause hemolytic uremic syndrome (HUS), especially in children and the elderly, and infections have been reported at all ages.
이에, 본 발명자들은 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 blastn 프로그램을 이용하여 장출혈성 대장균 O157:H7을 특이적으로 검출할 수 있는 뉴클레오타이드 서열 정보를 탐색한 결과, 장출혈성 대장균 O157:H7을 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 쌍을 디자인하였으며, 이는 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열로 예시되어 있다(참고: 표 2).Therefore, the present inventors searched for nucleotide sequence information capable of specifically detecting intestinal hemorrhagic E. coli O157: H7 using GenBank and blastn programs of the National Center for Biotechnology Information (NCBI). A specifically detectable primer pair was designed, which is illustrated by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 (see Table 2).
본 발명에 따르면, 본 발명은 시료에서 매우 효과적이고 간편하게 장출혈성 대장균 O157:H7을 검출할 수 있다.According to the present invention, the present invention is very effective and simple to detect intestinal hemorrhagic E. coli O157: H7 in the sample.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 프라이머는 유전자 증폭 반응(amplification reactions)에 이용된다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 증폭은 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 실시된다.According to a preferred embodiment of the present invention, the primers of the present invention are used for gene amplification reactions. According to a preferred embodiment of the present invention, the amplification of the present invention is carried out according to a polymerase chain reaction (PCR).
본 명세서에 기재된 용어“증폭 반응”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고 되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(19) (WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다. The term " amplification reaction " as used herein refers to a reaction to amplify a nucleic acid molecule. Various amplification reactions are reported in the art, which include polymerase chain reaction (PCR) (US Pat. Nos. 4,683,195, 4,683,202, and 4,800,159), reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) (Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual , 3rd ed.Cold Spring Harbor Press (2001)), Miller, HI (WO 89/06700) and Davey, C. et al. (EP 329,822), ligase chain reaction (LCR) ( 17, 18), Gap-LCR (WO 90/01069), repair chain reaction (EP 439,182), transcription-mediated amplification (TMA) (19) (WO 88/10315), autologous Self sustained sequence replication (20) (WO 90/06995), selective amplification of target polynucleotide sequences (US Pat. No. 6,410,276), consensus sequence priming polymerase chain Consensus sequence primed polymerase chain reaction (CP-PCR) (US Pat. No. 4,437,975), optionally Arbitrarily primed polymerase chain reaction (AP-PCR) (US Pat. Nos. 5,413,909 and 5,861,245), nucleic acid sequence based amplification (NASBA) (US Pat. No. 5,130,238, 5,409,818, 5,554,517, and 6,063,603), strand displacement amplification (21, 22) and loop-mediated isothermal amplification; LAMP) 23, but is not limited thereto. Other amplification methods that can be used are described in US Pat. Nos. 5,242,794, 5,494,810, 4,988,617 and US Pat. No. 09 / 854,317.
본 발명의 가장 바람직한 구현예에서, 증폭 과정은 미국특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 개시된 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 실시된다.In the most preferred embodiment of the invention, the amplification process is carried out according to the polymerase chain reaction (PCR) disclosed in US Pat. Nos. 4,683,195, 4,683,202 and 4,800,159.
본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.As used herein, the term “primer” refers to an oligonucleotide, which is a condition in which the synthesis of a primer extension product complementary to a nucleic acid chain (template) is induced, i.e., the presence of a polymerizer such as nucleotide and DNA polymerase, and It can serve as a starting point for the synthesis at conditions of suitable temperature and pH. Preferably, the primer is a deoxyribonucleotide and is a single strand. Primers used in the present invention may comprise naturally occurring dNMP (ie, dAMP, dGMP, dCMP and dTMP), modified nucleotides or non-natural nucleotides. In addition, the primer may also include ribonucleotides.
프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정된다. 용어 “어닐링” 또는 “프라이밍”은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.The primer should be long enough to be able to prime the synthesis of the extension product in the presence of the polymerizing agent. Suitable lengths of the primers depend on a number of factors, such as temperature, application and source of the primer. The term “annealing” or “priming” refers to the placement of an oligodioxynucleotide or nucleic acid into a template nucleic acid, where the polymerase polymerizes the nucleotide to form a nucleic acid molecule that is complementary to the template nucleic acid or portion thereof. Let's do it.
본 발명에서 이용되는 프라이머는 타겟 핵산에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 용어 “상보적”은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다.Primers used in the present invention include hybridizing nucleotide sequences complementary to the target nucleic acid. The term “complementary” means that the primer or probe is sufficiently complementary to selectively hybridize to a target nucleic acid sequence under certain annealing or hybridization conditions, and is substantially complementary and perfectly complementary. It has the meaning encompassing all, and preferably means completely complementary.
본 명세서 용어 “혼성화(hybridization)" 는 2개의 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열들의 페어링(pairing)에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 단일 가닥 핵산 서열 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 반응 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다. 용어“어닐링”과 “혼성화”는 차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용된다.As used herein, the term “hybridization” means that two single-stranded nucleic acids form a duplex structure by pairing complementary base sequences. Hybridization refers to complete complementarity between single-stranded nucleic acid sequences. This may occur in perfect match or in the presence of some mismatch base The degree of complementarity required for hybridization may vary depending on the hybridization reaction conditions, and in particular, may be controlled by temperature. Annealing ”and“ hybridization ”do not differ, and are used interchangeably herein.
본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.Primers used in the present invention are hybridized or annealed to one site of the template to form a double chain structure. Conditions for nucleic acid hybridization suitable for forming such double chain structures are described by Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001) and Haymes, BD, et al., Nucleic Acid Hybridization , A Practical Approach , IRL Press, Washington, DC (1985).
다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.Various DNA polymerases can be used for amplification of the present invention and include “Clenow” fragments of E. coli DNA polymerase I, thermostable DNA polymerase and bacteriophage T7 DNA polymerase. Preferably, the polymerase is a thermostable DNA polymerase obtainable from various bacterial species, which include Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis , Thermis flavus , Thermococcus literalis , and Pyrococcus furiosus (Pfu). Include.
중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 소망된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서, 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.When performing the polymerization reaction, it is preferable to provide the reaction vessel with an excessive amount of the components necessary for the reaction. The excess amount of the components required for the amplification reaction means an amount such that the amplification reaction is not substantially restricted to the concentration of the component. It is desired to provide cofactors such as Mg 2+ , dATP, dCTP, dGTP and dTTP to the reaction mixture such that the desired degree of amplification can be achieved. All enzymes used in the amplification reaction may be active under the same reaction conditions. In fact, the buffer ensures that all enzymes are close to optimal reaction conditions. Thus, the amplification process of the present invention can be carried out in a single reactant without changing conditions such as addition of reactants.
본 발명에 있어서 어닐링은 타겟 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다. 이렇게 증폭된 타겟 유전자를 적합한 방법으로 분석하여 장출혈성 대장균 O157:H7을 검출하는 것이다. 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 장출혈성 대장균 O157:H7을 검출할 수 있다.Annealing in the present invention is carried out under stringent conditions allowing specific binding between the target nucleotide sequence and the primer. Stringent conditions for annealing are sequence-dependent and vary depending on the surrounding environmental variables. The amplified target gene is analyzed by a suitable method to detect enterohemorrhagic E. coli O157: H7. For example, enteral hemorrhagic E. coli O157: H7 can be detected by gel electrophoresis of the amplification reaction product described above and observing and analyzing the resulting band.
PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.PCR is the best known nucleic acid amplification method, and many modifications and applications thereof have been developed. For example, touchdown PCR, hot start PCR, nested PCR, and booster PCR have been developed by modifying traditional PCR procedures to enhance the specificity or sensitivity of PCR. In addition, real-time PCR, differential display PCR (DD-PCR), rapid amplification of cDNA ends (RACE), multiplex PCR, inverse polymerase chain reaction chain reaction (IPCR), vectorette PCR and thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL-PCR) have been developed for specific applications. For more information on PCR, see McPherson, MJ, and Moller, SG PCR . BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin, Heidelberg, NY (2000), the teachings of which are incorporated herein by reference.
본 발명의 방법을 프라이머를 이용하여 실시하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 분석 대상의 시료(예컨대, 식품)에서 대장균 O157:H7(바람직하게는, 장출혈성 대장균 O157:H7)을 검출하는 것이다. 즉, 본 발명의 방법은 시료 내 장출혈성 대장균 O157:H7의 게놈 DNA에 결합하는 프라이머 쌍을 이용한 유전자 증폭 반응을 이용한다.When the method of the present invention is carried out using a primer, a gene amplification reaction is performed to detect Escherichia coli O157: H7 (preferably, hemorrhagic E. coli O157: H7) in a sample (for example, a food) to be analyzed. . In other words, the method of the present invention utilizes a gene amplification reaction using a primer pair that binds to genomic DNA of enterohemostatic E. coli O157: H7 in a sample.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 식품 검체로부터 DNA를 추출한 후, 본 발명의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 증폭하고 이의 결과물을 확인한다. 그 결과, 예상 크기의 PCR 증폭산물이 검출되면 상기 식품 검체에 장출혈성 대장균 O157:H7이 포함된 것으로 판단(/진단)할 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, after extracting DNA from the food sample, PCR amplification using the primer pair of the present invention and confirms the result. As a result, when the PCR amplification product of the expected size is detected, it can be determined (/ diagnosed) that the food sample contains enterohemostatic E. coli O157: H7.
본 명세서의 용어 “식품 검체”는 장출혈성 대장균 O157:H7의 존재 여부를 확인하기 위해 필요한 DNA를 추출하는 미지의 물질을 의미하며, 예를 들어 장출혈성 대장균 O157:H7에 오염된 식품, 천연물(예컨대, 물) 및 생물학적 시료(예컨대, 혈액, 혈장 또는 혈청)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.As used herein, the term “food sample” refers to an unknown substance that extracts DNA necessary for confirming the presence of enterocoliform E. coli O157: H7, for example, food, natural products ( Water) and biological samples (eg, blood, plasma or serum), but are not limited thereto.
식품 검체로부터 DNA를 추출하는 방법은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있으며, 이는 당업자에게 자명하다.Methods for extracting DNA from food specimens can be performed by conventional methods known in the art, which will be apparent to those skilled in the art.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 프라이머 쌍(E157F 및 E157R)을 이용한 증폭산물은 장출혈성 대장균 O157:H7을 포함하는 시료에서 179 bp의 증폭산물을 생산한다.
According to a preferred embodiment of the present invention, the amplification products using the primer pairs (E157F and E157R) of the present invention produce an amplification product of 179 bp in a sample containing E. coli O157: H7.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 장출혈성 대장균 O157:H7-유발 질환 진단용 키트를 제공한다.According to another aspect of the invention, the present invention provides a kit for diagnosing hemorrhagic E. coli O157: H7-induced disease comprising a primer pair consisting of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 sequence.
본 발명의 키트는 상술한 본 발명의 프라이머 쌍을 이용하기 때문에, 그 발명들 사이의 공통 사항은 본 명세서의 복잡성을 야기하는 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.Since the kit of the present invention utilizes the primer pairs of the present invention described above, commonalities between the inventions omit their description in order to avoid excessive duplication which causes the complexity of the present specification.
인간에서 식중독을 유발하는 주요 균들은 대장균 O157:H7(Escherichia coli O157:H7), 살모넬라 종(Salmonella spp.), 쉬겔라 종(Shigella spp.), 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejunii), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 비브리오 파라헤몰리티커스(Vibrio parahaemolyticus), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia Enterocolitica), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus), 클로스트리듐 퍼프린젠스(Clostridium perfringens) 및 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae)를 포함한다.The main causes of food poisoning in humans are Escherichia coli O157: H7, Salmonella spp., Shigella spp., Campylobacter jejunii , and Staphylococcus aureus. Reus ( Staphylococcus aureus ), Bacillus cereus , Vibrio parahaemolyticus , Listeria monocytogenes , Yersinia Enterocolitica , Vibrio bulnipicus ( Vibrio vulnificus ), Clostridium perfringens and Vibrio cholerae .
본 발명에 따른 프라이머 쌍은 장출혈성 대장균 O157:H7을 특이적으로 검출할 수 있으므로, 이를 이용하면 진단하고자 하는 시료(예컨대, 식품 검체) 내 대장균 O157:H7(바람직하게는, 장출혈성 대장균 O157:H7)을 신속하고 정확하게 검출할 수 있다. 즉, 본 발명의 프라이머 쌍에 의해 증폭된 산물은 장출혈성 대장균 O157:H7의 존재에 대한 지표가 될 수 있으며, 장출혈성 대장균 O157:H7-유발 질환의 진단에 이용될 수 있다.Since the primer pair according to the present invention can specifically detect E. coli O157: H7, E. coli O157: H7 (preferably, hemorrhagic E. coli O157 :) in the sample to be diagnosed (e.g., a food sample) can be used. H7) can be detected quickly and accurately. In other words, the product amplified by the primer pair of the present invention may be an indicator for the presence of enterohemorrhagic E. coli O157: H7, and may be used for the diagnosis of enterohemostatic E. coli O157: H7-induced disease.
본 명세서의 용어 “장출혈성 대장균 O157:H7-유발 질환”은 대장균 O157:H7에 의해 유발되는 질환을 의미하며, 특히 장출혈성 대장균 O157:H7에 오염된 식품이나 천연물(예컨대, 소고기, 물)을 섭취하거나 장출혈성 대장균 O157:H7에 감염된 대상(예컨대, 인간)과 접촉함으로써 유발되는 질환으로 설사, 탈수, 구토, 발열, 구역질, 두통 및 심한 복통의 증상을 나타낸다.As used herein, the term “intestinal hemorrhagic E. coli O157: H7-induced disease” refers to a disease caused by E. coli O157: H7, and particularly a food or natural product (eg, beef, water) contaminated with enterocoliform E. coli O157: H7. A disease caused by ingestion or contact with a subject (eg, a human) infected with E. coli O157: H7, exhibits symptoms of diarrhea, dehydration, vomiting, fever, nausea, headache and severe abdominal pain.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 장출혈성 대장균 O157:H7-유발 질환은 식중독, 출혈성대장염(hemorrhagic colitis: HC), 용혈성 요독 증후군(HUS : hemolytic Uremic Syndrom), 비염증 또는 염증을 동반한 분비성 설사 및 박테리아-유발 위장관염(gastroenteritis)을 포함하며, 가장 바람직하게는 식중독이다.According to a preferred embodiment of the present invention, enterohemorrhagic E. coli O157: H7-induced disease of the present invention is accompanied by food poisoning, hemorrhagic colitis (HC), hemolytic Uremic Syndrome (HUS), rhinitis or inflammation One is secretory diarrhea and bacteria-induced gastroenteritis, most preferably food poisoning.
본 발명에서 용어 “대장균(Escherichia coli)”은 장출혈성 대장균(enterohemorrhagic E. coli(EHEC)), 장독소원성 대장균(enterotoxigenic E. coli(ETEC)), 장관병원성 대장균(enteropathogenic E. coli(EPEC)), 장관침입성 대장균(enteroinvasive E. coli(EIEC)), 장관집합성 대장균(enteroaggregative E. coli(EAggEC)) 및 요로병원성 대장균(uropathogenic E.coli(UPEC))을 포함하며, 보다 바람직하게는 장출혈성 대장균이고, 보다 더 바람직하게는 장출혈성 대장균 O26, O103, O104, O146 및 O157이며, 가장 바람직하게는 장출혈성 대장균 O157:H7이다.In the present invention, the term “E. coli ( E. coli )” refers to enteroemorrhagic E. coli (EHEC), enterotoxigenic E. coli (ETEC), enteropathogenic E. coli (EPEC) ), Minister invasive E. coli (enteroinvasive E. coli (EIEC)), E. coli secretary aggregation (enteroaggregative E. coli (EAggEC)) and urinary tract pathogenic E. coli and comprises a (uropathogenic E.coli (UPEC)), more preferably at Chapter Hemorrhagic E. coli, even more preferably enteral hemorrhagic E. coli O26, O103, O104, O146 and O157, and most preferably enteral hemorrhagic E. coli O157: H7.
본 명세서에서 용어 “진단”은 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 또는 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것을 포함한다.The term “diagnosis” as used herein includes determining whether an object currently has a particular disease or condition, or determining the prognosis of an object with a particular disease or condition.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 유전자 증폭반응(예컨대, PCR)에 의한 장출혈성 대장균 O157:H7의 검출을 위해 필요한 최소 DNA 양은 1 fg-100 ng이고, 보다 바람직하게는 2 fg-50 ng이며, 보다 더 바람직하게는 5 fg-25 ng이고, 가장 바람직하게는 5 fg-5 ng이다.According to a preferred embodiment of the present invention, the minimum amount of DNA required for the detection of hemorrhagic E. coli O157: H7 by gene amplification reaction (eg PCR) of the present invention is 1 fg-100 ng, more preferably 2 fg- 50 ng, even more preferably 5 fg-25 ng, most preferably 5 fg-5 ng.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 따라 검출될 수 있는 장출혈성 대장균 O157:H7의 시료 내 양은 101-107 세포/g이고, 가장 바람직하게는 102-106 세포/g이다.According to a preferred embodiment of the present invention, the amount in the sample of enterohemostatic E. coli O157: H7 that can be detected according to the method of the present invention is 10 1 -10 7 cells / g, most preferably 10 2 -10 6 cells / g.
본 발명의 키트는 상기한 성분 이외에도, 다른 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우에는, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
The kit of the present invention may further include other components in addition to the above components. For example, when the kit of the present invention is subjected to a PCR amplification process, the kit of the present invention may optionally contain reagents necessary for PCR amplification, such as buffers, DNA polymerases (eg, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus ). (Tth), Thermus filiformis , Thermis flavus , Thermococcus literalis or thermally stable DNA polymerase obtained from Pyrococcus furiosus (Pfu)), DNA polymerase cofactors and dNTPs. The kit of the present invention may be made from a number of separate packaging or compartments containing the above reagent components.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The features and advantages of the present invention are summarized as follows:
(a) 본 발명은 장출혈성 대장균 O157:H7 검출용 프라이머 쌍, 이를 이용한 장출혈성 대장균 O157:H7 검출방법, 그리고 장출혈성 대장균 O157:H7-유발 질환 진단 키트에 관한 것이다.(a) The present invention relates to a primer pair for detecting E. coli O157: H7, a method for detecting E. coli O157: H7 using the same, and a kit for diagnosing E. coli O157: H7-induced disease.
(b) 본 발명의 방법은 인체에 유해한 장출혈성 대장균 O157:H7만을 신속하고 정확하게 검출할 수 있으며, 이를 통해 장출혈성 대장균 O157:H7-유발 질환의 진단에 이용될 수 있다.(b) The method of the present invention can quickly and accurately detect only intestinal hemorrhagic E. coli O157: H7 harmful to the human body, and thus can be used to diagnose intestinal hemorrhagic E. coli O157: H7-induced diseases.
(c) 따라서, 본 발명의 방법 및 키트는 DNA 수준에서 장출혈성 대장균 O157:H7의 감염 진위 여부를 판별할 수 있어 오염된 식품 및 감염 여부의 예찰 및 방제에 효과적으로 적용될 수 있다.
(c) Therefore, the method and kit of the present invention can determine whether the hemorrhagic E. coli O157: H7 is infected at the DNA level, and thus can be effectively applied to predicting and controlling contaminated food and infection.
도 1은 본 발명에 따른 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 반응을 수행한 결과를 보여주는 사진이다. 약어: M, DNA 사이즈 마커; 1 내지 23, 표 1에 기재된 번호의 균주; 및 24, 음성 대조군.1 is a photograph showing the results of performing a PCR reaction using a primer pair according to the present invention. Abbreviation: M, DNA size marker; 1 to 23, strains of numbers as listed in Table 1; And 24, negative control.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .
실시예Example
실시예 1: 실험균주Example 1: Experimental strain
본 발명에서 사용된 대장균 O157:H7(Escherichia coli O157:H7)을 포함한 기타 미생물은 표 1에 정리하였다.Other microorganisms including Escherichia coli O157: H7 used in the present invention are summarized in Table 1.
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23One
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
Escherichia coli O157:H7
Escherichia coli O157:H7
Escherichia coli O157:H7
Escherichia coli O1:K1:H7T
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli O157:H42
Shigella sonnei T
Shigella flexneri T
Shigella boydii T
Shigella dysenteriae T
Salmonella enterica subsp. enterica Serovar TyphimuriumT
Salmonella enterica subsp. enterica Serovar Paratyphi A
Salmonella enterica subsp. enterica Serovar Paratyphi B
Salmonella enterica subsp. enterica Serovar Typhi
Salmonella enterica subsp. enterica Serovar Kentucky
Salmonella enterica subsp. enterica Serovar Virginia
Salmonella enterica subsp. houtenae T
Salmonella enterica subsp. arizonae
Salmonella enterica subsp. diarizonae
Salmonella enterica subsp. indica
Salmonella bongori Escherichia coli O157: H7
Escherichia coli O157: H7
Escherichia coli O157: H7
Escherichia coli O157: H7
Escherichia coli O1: K1: H7 T
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli O157: H42
Shigella sonnei T
Shigella flexneri T
Shigella boydii T
Shigella dysenteriae T
Salmonella enterica subsp. enterica Serovar Typhimurium T
Salmonella enterica subsp. enterica Serovar Paratyphi A
Salmonella enterica subsp. enterica Serovar Paratyphi B
Salmonella enterica subsp. enterica Serovar Typhi
Salmonella enterica subsp. enterica Serovar Kentucky
Salmonella enterica subsp. enterica Serovar Virginia
Salmonella enterica subsp. houtenae T
Salmonella enterica subsp. arizonae
Salmonella enterica subsp. diarizonae
Salmonella enterica subsp. indica
Salmonella bongori
T; 스트레인형.
T ; Strain type.
사용된 균주들은 영양배지[Nutrient agar; 염화 나트륨 5 g, 펩톤(Difco) 5 g, 이스트 익스트렉트(Difco) 2 g, 미트 익스트렉트(Difco) 1 g, 아가 15 g : 1L]에서 배양하였다.
The strains used were nutrient medium [Nutrient agar; 5 g of sodium chloride, 5 g of peptone (Difco), 2 g of Eastextract (Difco), 1 g of Meat Extract (Difco), 15 g of agar: 1 L].
실시예 2: 프라이머 쌍 제작Example 2: Primer Pair Preparation
실시예 2-1: DNA 추출Example 2-1 DNA Extraction
실시예 1에서 배양된 균주들의 게놈(genomic) DNA는 Qiagen(Hilden, Germany)사의 게놈 DNA 추출 키트(Genomic-tips)를 이용하여 추출하였다.
Genomic DNA of the strains cultured in Example 1 was extracted using genomic DNA extraction kit (Genomic-tips) of Qiagen (Hilden, Germany).
실시예 2-2: 특이 염기서열 정보 탐색Example 2-2: Searching for Specific Sequence Information
대장균 O157:H7을 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 쌍의 제작을 위해, NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 등록된 대장균 O157:H7의 유전체 정보를 blastn 프로그램을 이용한 분석을 통해 제작하였으며, 그 결과 상기 염기서열이 대장균 O157:H7-특이적이라는 것을 확인하였다.
Genome information of E. coli O157: H7 registered in GenBank ( www.ncbi.nlm.nih.gov/ ) of the National Center for Biotechnology Information (NCBI) for the preparation of primer pairs for the specific detection of E. coli O157: H7 Was prepared through an analysis using a blastn program, and as a result, the nucleotide sequence was confirmed to be E. coli O157: H7-specific.
실시예 2-3: 프라이머 쌍 제작Example 2-3 Primer Pair Preparation
대장균 O157:H7의 179 bp 크기의 단편을 증폭하는 E157F 프라이머와 E157R 프라이머 쌍을 제작하였다. 프라이머의 서열은 하기 표 2와 같다.E157F primer and E157R primer pairs were constructed to amplify 179 bp fragments of E. coli O157: H7. The primer sequences are shown in Table 2 below.
2One
2
E157RE157F
E157R
AGCGCGACCTGACCATAAGAGGCCGTACATGCTGCTGAGAGT
AGCGCGACCTGACCATAAGAG
상기 프라이머는 GenBank 등록된 각각의 서열정보를 blastn 프로그램을 통해 특이성을 확인한 후 제작하였다.
The primers were prepared after confirming specificity of each sequence registered through GenBank through the blastn program.
실시예 3: 프라이머 쌍의 특이성 확인Example 3: Confirm specificity of primer pair
실시예 3-1: 일반 PCR 증폭 반응Example 3-1: General PCR Amplification Reaction
E157F 및 E157R로 구성된 프라이머 쌍을 사용하여 표 1에 기재된 균주들을 대상으로 PCR 증폭 반응을 실시하였다.PCR amplification reactions were performed on the strains listed in Table 1 using primer pairs consisting of E157F and E157R.
PCR 증폭 반응은 PTC-200TM thermocycler(MJ research, Watertown, mass)를 사용하여 실시하였으며, 각 반응은 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.01% 젤라틴, dNTP(각각 0.2 mM), 10 pM의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머, 1 unit의 Taq 중합효소(Taq polymerase; Promega, Madison, Wis.)를 함유하는 PCR 혼합액으로 총 50 ㎕의 양으로 실시하였다. PCR 혼합액에 첨가한 균주들의 게놈 DNA 양은 약 50 ng이었다.PCR amplification reaction was performed using PTC-200TM thermocycler (MJ research, Watertown, mass), each reaction was 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2 , 0.01% gelatin, dNTP (0.2 mM each) , PCR mixture containing 10 pM forward primer and reverse primer, 1 unit of Taq polymerase (Taq polymerase; Promega, Madison, Wis.) Was carried out in a total amount of 50 μl. The amount of genomic DNA of the strains added to the PCR mixture was about 50 ng.
대장균 O157:H7의 PCR 반응 조건은 다음과 같다: (a) 전변성 단계, 94℃에서 5분; (b) PCR 증폭단계(40 사이클), 1 사이클 당 95℃에서 60초, 53℃에서 30초 및 72℃에서 60초; 및 (c) 최종 연장단계, 72℃에서 10분. 증폭반응 후 10 ㎕의 PCR 증폭산물을 1.5% 농도의 아가로오스 젤에 전기영동한 후 EtBr(Ethidium bromide)로 염색하여 자외선 조사기(UV transilluminator)로 밴드 패턴을 확인하였다(도 1).PCR reaction conditions of Escherichia coli O157: H7 are as follows: (a) a total denaturation step at 94 ° C. for 5 minutes; (b) PCR amplification step (40 cycles), 60 seconds at 95 ° C., 30 seconds at 53 ° C. and 60 seconds at 72 ° C. per cycle; And (c) final extension, 10 minutes at 72 ° C. After the amplification reaction, 10 μl of the PCR amplification product was electrophoresed on 1.5% agarose gel, and then stained with EtBr (Ethidium bromide) to confirm a band pattern with an UV transilluminator (FIG. 1).
도 1을 통해 알 수 있듯이, PCR 증폭 산물은 대장균 O157:H7인 1 내지 4번에서만 확인되었는 바, 본 발명의 프라이머 쌍이 대장균 O157:H7 균주를 특이적으로 검출할 수 있음을 알 수 있다.
As can be seen from Figure 1, the PCR amplification product was confirmed only 1 to 4 times E. coli O157: H7, it can be seen that the primer pair of the present invention can specifically detect the E. coli O157: H7 strain.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명 의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the present invention. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
<110> SmartBioLab. INC.
<120> Methods for Detecting Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7
<130> PN110275
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<220>
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agcgcgacct gaccataaga g 21
<110> SmartBioLab. INC.
<120> Methods for Detecting Enterohemorrhagic Escherichia coli O157: H7
<130> PN110275
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<223> E157F primer
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Claims (7)
(a) 시료를 준비하는 단계;
(b) 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열의 프라이머를 이용하여 상기 시료 내의 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 증폭 결과물을 확인하는 단계.
Method for detecting Escherichia coli O157: H7 ( Escherichia coli O157: H7) comprising the following steps:
(a) preparing a sample;
(b) amplifying the nucleotide sequence in the sample using primers of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2; And
(c) identifying the amplification result.
The method of claim 1 wherein the sample is a food, natural product or biological sample.
The method of claim 1, wherein said detecting is performed through gene amplification.
Kit for diagnosing hemorrhagic E. coli O157: H7-induced disease comprising a primer pair consisting of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
The kit of claim 4, wherein the kit is performed through gene amplification.
The kit according to claim 4, wherein the enterocoliogenic E. coli O157: H7-induced disease is food poisoning.
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