KR20120134981A - 고효율 입자 분리 장치 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 멀티오리피스 세그먼트를 갖는 MOFF 채널을 이용해 유체 수력학법으로 표적 입자를 분리 후, 유전 영동법으로 재차 분리하는 입자 분리 장치 및 방법에 관한 것으로, 보다 상세히는, 혈액과 같은 유체 샘플이 필터를 통해 이물질이 제거된 후 특정 세포, 예를들면 암세포와 같은 표적 입자를 MOFF 채널을 이용해 분리하고나서, 유전 영동법으로 재차 분리하는 고효율 세포 분리 장치 및 방법에 관한 것이다.
본 발명의 입자 분리 장치는, 유체 샘플이 통과되는 멀티오리피스 세그먼트를 구비하여, 유체 샘플 내의 표적 입자를 분리한 1차 분리물을, 중앙부 통로를 통해, 배출하는 MOFF(Multi Orifice Flow Fractionation)채널; 교류가 인가되는 전극의 쌍을 구비하며, 상기 MOFF채널의 중앙부 통로와 연결된 유로 채널에 전기장을 형성하여, 상기 MOFF채널의 중앙부 통로에서 배출되는 1차 분리물을 다시 유전영동에 의해 표적 입자를 분리하는 유전영동 채널;을 포함하여 이루어진 것을 특징으로 한다.
상기 유전 영동 채널은, 교류가 인가되는 하나 이상의 제1 전극의 쌍을 구비하며, 상기 MOFF채널에서 분리된 유체 샘플의 표적 세포가 유로 채널의 중앙으로 집중되도록 이루어진 포커싱부; 교류가 인가되는 하나 이상의 제2 전극의 쌍을 구비하되, 상기 제2 전극의 쌍은 제1 전극의 쌍과 대칭을 이루며, 전기장에 의해 표적세포를 분리하는 제2분리부;를 포함하여 이루어진다.
본 발명의 입자 분리 장치는, 유체 샘플이 통과되는 멀티오리피스 세그먼트를 구비하여, 유체 샘플 내의 표적 입자를 분리한 1차 분리물을, 중앙부 통로를 통해, 배출하는 MOFF(Multi Orifice Flow Fractionation)채널; 교류가 인가되는 전극의 쌍을 구비하며, 상기 MOFF채널의 중앙부 통로와 연결된 유로 채널에 전기장을 형성하여, 상기 MOFF채널의 중앙부 통로에서 배출되는 1차 분리물을 다시 유전영동에 의해 표적 입자를 분리하는 유전영동 채널;을 포함하여 이루어진 것을 특징으로 한다.
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Description
본 발명은 멀티오리피스 세그먼트를 갖는 MOFF 채널을 이용해 유체 수력학법으로 표적 입자를 분리 후, 유전 영동법으로 재차 분리하는 입자 분리 장치 및 방법에 관한 것으로, 보다 상세히는, 혈액과 같은 유체 샘플이 필터를 통해 이물질이 제거된 후 특정 세포, 예를들면 암세포와 같은 표적 입자를 MOFF 채널을 이용해 분리하고나서, 유전 영동법으로 재차 분리하는 고효율 입자 분리 장치 및 방법에 관한 것이다.
최근들어 멀티오리피스 세그먼트를 갖는 MOFF(Multi Orifice Flow Fractionation) 채널에 대한 연구들이 보고되고 있다.
그러나 국내외적으로 이들 연구들은 아직 시작단계에 불과하며, 특히, MOFF 채널을 의학계에의 적용은 극히 미미한 상태에 있다.
유방암은 미국뿐 아니라 최근에는 한국에서도 여성 발병율 1위의 암이다. 평생 유병율 (lifetime incidence)이란, 평생 동안 특정 질병이 발생할 가능성을 의미하는데, 미국에서는 현재 유방암의 평생 유병율이 1/6로서 평생에 걸쳐서 6명 중 한 명은 유방암이 발생한다.
한국에서는 10년 전 10만 명당 약 20명 정도 발생하던 유방암의 발병 빈도가 2008년에는 10만 명당 50명이상이 발병하여 매우 급속히 유방암 환자가 늘고 있다. 더욱이, 원인은 명확하지 않지만 미국에서는 나이가 많아질수록 유방암 발생이 늘어 60~70대가 가장 유방암이 많이 발병하지만 한국에서는 40대에서 가장 많이 발생하고 있다. 급격한 발병율의 증가와 40대에 가장 발병이 많다는 것은 개인과 가정적으로, 또한 국가 경제적으로도 커다란 사회 문제가 아닐 수 없다.
특히, 유방암은 역시 여성에 많은 갑상선암과는 달리 수술만으로 치료가 종료되지 않고 수술 후에도 항암제 치료, 호르몬 치료, 방사선 치료, 표적치료 등의 치료를 6개월~1년 이상을 받아야하는, 치료과정이 매우 복잡한 암이다. 하지만, 이러한 다양한 그리고 오랜 기간의 치료에도 불구하고 전체 유방암 환자의 30~40%는 재발 및 전이로 인해서 다시 약물치료를 받아야 하고 그럼에도 불구하고 재발된 대부분의 환자들은 사망에 이르고 있다.
암환자의 경우, 사망률에 지대한 영향을 미치는 것은 전이성 암세포의 존재유무에 달려있다. 즉, 혈액내 적혈구 109개중에 한 개로 존재하는 순환종양세포(CTC: Circulating Tumor Cell)를 세포 손실 없이 매우 정확하게 찾아내야 하는 기술은 환자의 암치료 전후에 생존율을 향상시키기 위해서 매우 필요한 기술이다.
유방암의 경우 혈액 약 7.5 ml에서 5개미만, 대장암의 경우 3개미만, 전립선암의 경우 5개미만으로 찾아내야만 하고 1) 처리능 (throughput, 단위시간당 분리할 수 있는 세포수), 2) 세포회수율 (recovery, 주입된 타겟 세포수와 분리회수된 타겟 세포수의 비율), 3) 분리효율 (purity, 분리회수된 타겟 세포의 순도)등 3가지 기본 조건을 충족하는 마이크로 세포 분리기술이 요구된다.
지금까지 발표된 CTC검침 방법들을 살펴보면 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 이용한 유전자 검침법과 원심분리, 자기영동을 이용한 검침법 그리고 형광염색법이나 필터를 이용한 방법 등으로 분류할 수 있다. 대부분의 방법들은 CTC를 검출하기 위해서 혈액에 포함된 많은 수의 혈구세포를 제거하는 전처리 과정을 거치면서 타겟 세포의 손실을 초래하게 되어 진단의 신뢰성이 떨어지는 단점을 가지고 있다.
대표적으로 CTC진단 도구로 유일하게 FDA승인을 받은 CellSearch의 경우를 보면 크게 샘플의 전처리 과정과 정제된 샘플의 분석과정으로 이루어져 있다. 전처리 과정에서는 Anti-EpCAM을 자성입자에 처리를 하여 환자의 혈액과 섞은 후 자력을 이용하여 분리해 내는 과정과 함께 여러번의 단계가 포함되어 있어서 전처리 단계에서 CTC를 놓칠 수 있다는 큰 단점을 안고 있다. 109개의 세포들 중 1개의 농도로 존재한다고 알려진 CTC를 검출하는데 샘플의 손실은 진단의 정확도와 직결되는 중요한 문제이다.
따라서, CTC 자체가 가지는 물리적 특성인 크기, 밀도, 변형 등을 이용한 방법으로 CTC를 전처리 과정에서 최종 진단까지 연속적이고 통합된 마이크로 유체시스템이 필요하다. 또한 미세유체 시스템으로 분리된 CTC를 광학장비를 통해서 실시간으로 분석해야만 하며 이렇게 검증된 CTC는 임상의에 의해서 분자적 분석이 수행되어야 한다.
현재의 항암보조요법은 이러한 CTC의 존재 유무의 확인 없이 거의 대부분의 환자들에게 시행되고 있고 또한 이런 항암제 치료가 환자 개별적으로 도움이 되는지 여부를 확인할 방법이 없어서 임상시험 결과에 의존하여 일률적으로 항암제가 투여되고 있다. 실제, 항암제를 투여하지 않아도 재발되지 않을 환자는 전체 유방암 환자의 절반이 넘지만 어느 환자가 재발할 지 알 수가 없기 때문에 이러한 환자들을 포함한 거의 대부분이 항암제 치료를 받게 된다.
이러한 CTC의 발견(detection) 및 분석(analysis) 연구를 통해 재발할 가능성이 적은 환자들을 선별하여 불필요한 항암제 치료를 줄일 수 있다는 연구적 가설이 가능하다. 또한, 수술 및 항암보조요법에도 불구하고 전체 환자의 30~40%의 환자가 궁극적으로 재발한다는 점을 고려하면 재발의 궁극적인 원인인 CTC에 효과 있는 항암제가 사용되어야 더욱 수월성 있는 항암치료효과가 있을 것으로 판단되어 CTC의 발견이나 분석에 대한 연구는 향후 더욱 효과 있는 항암제의 개발에도 중요한 초석이 될 것으로 사료된다.
최근에 다양한 분자생물학적 기술은 혈액검사로써 광범위한 종류의 암 세포를 검사할 수 있다. 특히, 암 세포 중 혈액으로 유입되어 몸속을 순환하는 세포들로 알려진 혈액내 순환종양세포(CTC, Circulating Tumor Cell)을 찾아 진단하는 방법은 암환자의 조기진단/치료후 예후판단에 매우 필요한 기술이지만 아직까지 성공적인 사례는 드문 상황이다.
최근 들어 암 환자의 molecular staging, 예후 예측, 재발의 조기 발견 등에 이용될 수 있는 임상적 근거가 마련되고 있는 것은 민감도 높은 분자생물학적 진단법의 발달에 기인한다. PCR을 기본으로 하는 각종 분자생물학적 기법들이 자동화되면서 검사의 민감도를 향상시키는 동시에 분석 과정을 간편화하고 분석 시간을 단축하였다.
따라서 암 환자에게서 채취된 혈액 시료를 바로 사용하여 CTC를 분리 및 검침할 수 있는 시스템의 개발이 필요하다. 이러한 시스템의 개발은 또한 CTC 연구를 통하여 암을 확인하는데 필요한 세포의 분자 구조를 더욱 잘 이해할 수 있게 하고 암 세포의 특성 및 전이 과정도 규명할 수 있게 할 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 멀티오리피스 세그먼트를 갖는 MOFF(Multi Orifice Flow Fractionation) 채널을 이용해 유체 수력학법으로 표적 입자를 분리 후, 유전 영동법(DEP: Dielectrophoresis)으로 재차 분리하는 입자 분리 장치 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 또 다른 과제는, 혈액과 같은 유체 샘플로부터 암세포, 즉, 혈액내 순환종양세포(CTC: Circulating Tumor Cell)(예를 들어, 유방암, 대장암의 CTC나 HT-29, MCF-7과 같은 암세포주)와 같은 표적 입자(표적 세포)를 더욱 효율적으로 분리하기 위하여, MOFF 채널 및 유전 영동 채널을 이용하여, 보다 적은 시간내에 보다 많은 량을 효율적으로 분리될 수 있도록 한 입자(세포) 분리 장치 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는, MOFF 채널 및 유전 영동 채널을 이용하여 표적 입자를 분리하되, 상기 MOFF 채널은 유체 샘플을 필터를 통해 이물질이 제거된 후 멀티오리피스 세그먼트를 통과하도록 이루어진 고효율 입자 분리 장치 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일면에 따른 입자 분리 장치는, 유체 샘플이 통과되는 멀티오리피스 세그먼트를 구비하여, 유체 샘플 내의 표적 입자를 분리한 1차 분리물을, 중앙부 통로를 통해, 배출하는 MOFF(Multi Orifice Flow Fractionation)채널; 교류가 인가되는 전극의 쌍을 구비하며, 상기 MOFF채널의 중앙부 통로와 연결된 유로 채널에 전기장을 형성하여, 상기 MOFF채널의 중앙부 통로에서 배출되는 1차 분리물을 다시 유전영동에 의해 표적 입자를 분리하는 유전영동 채널;을 포함하여 이루어진 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에서, 멀티오리피스 세그먼트를 갖는 MOFF 채널을 이용해 표적 입자를 분리 후, 유전 영동 채널에서 표적입자를 재차 분리하는 입자 분리 장치는, 상기 MOFF채널이, 유입구에 투입된 유체 샘플에서 이물질을 제거하는 필터; 상기 필터를 통과한 유체 샘플이 멀티오리피스 세그먼트를 통과한 후, 표적 입자를 다수 포함하는 유체 샘플을 중앙부 통로로 배출하며, 표적입자 이외의 입자를 다수 포함하는 유체 샘플을 양측면 통로로 배출하는 제1분리부;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에서, 멀티오리피스 세그먼트를 갖는 MOFF 채널을 이용해 표적 입자를 분리 후, 유전 영동 채널에서 표적입자를 재차 분리하는 입자 분리 장치는, 교류가 인가되는 하나 이상의 제1 전극의 쌍을 구비하며, 상기 MOFF채널에서 분리된 유체 샘플의 표적 입자가 유로 채널의 중앙으로 집중되도록 이루어진 포커싱부;교류가 인가되는 하나 이상의 제2 전극의 쌍을 구비하되, 상기 제2 전극의 쌍은 제1 전극의 쌍과 대칭을 이루며, 전기장에 의해 표적 입자를 분리하는 제2분리부;를 포함하여 이루어진 것을 특징으로 한다.
상기 제1 전극은 '＜'형으로 이루어지며, 상기 제2 전극은 '＞'형으로 이루어진다.
상기 MOFF 채널의 중앙부 통로는, 입구에서 출구로 갈수록 통로 내 구경이 넓어지도록 이루어진다.
상기 교류 전원은, 전압 크기가 10 내지 100볼트 범위에서, 주파수 100 내지 900kHz 범위로 선택적으로 인가된다.
상기 표적 입자는 세포일 수 있으며, 상기 세포는 순환종양세포(CTC: Circulating Tumor Cell)일 수 있으며, 상기 순환종양세포는 유방암 또는 대장암의 순환종양세포이거나, HT-29, MCF-7의 암세포주 일 수 있다.
상기 표적 입자는 적혈구, 유액적혈구, 다발성 골수암 세포 중 어느 하나일 수 있다.
상기 표적 입자는 줄기세포이며, 상기 입자 분리 장치는 줄기세포와 정상세포가 혼재된 유체로부터 줄기세포를 분리하도록 이루어질 수 있다.
상기 표적 입자는 세균이며, 상기 입자 분리 장치는 먼지와 세균이 혼재된 유체로부터 세균을 분리하도록 이루어질 수 있다.
또한, 본 발명의 입자 분리 장치는, 유체 샘플이 통과되는 멀티오리피스 세그먼트의 끝에 중앙부 통로와 양측면 통로를 포함하는 제1분리부가 형성된 MOFF(Multi Orifice Flow Fractionation) 채널; 및 상기 중앙부 통로에 결합되는 유전 영동 채널을 포함하고, 상기 유전 영동 채널은, 오드 전극들과 이븐 전극들 사이에 전원이 인가되는 꺽임형 제1금속 전극들이 일정 간격으로 이격되어 배치된 포커싱부; 및 상기 제1금속 전극들과 대칭적으로 배치되며, 오드 전극들과 이븐 전극들 사이에 전원이 인가되는 꺽임형 제2금속 전극들을 갖는 제2분리부를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 중앙부 통로를 통해 상기 유전 영동 채널로 유입된 유체의 입자들이, 상기 포커싱부에서 양측면으로 이동하여 흐르며, 표적 입자가 상기 제2분리부의 중앙으로 유출된다.
상기 제1금속 전극들의 상기 오드 전극들과 상기 이븐 전극들 사이에 교류 전원이 인가되며, 상기 제2금속 전극들의 상기 오드 전극들과 상기 이븐 전극들 사이에 교류 전원이 인가된다.
상기 교류 전원은 전압 크기 10~100볼트 범위에서 주파수 100~900kHz 범위일 수 있다.
상기 입자 분리 장치는, 혈액 샘플로부터 표적 입자 MCF-7등을 분리하는 데 이용될 수 있다.
상기 멀티오리피스 세그먼트의 각 세그먼트는 넓은 부분의 진행방향가로길이, 세로길이, 및 높이가 300×300×60(㎛)로 이루어지고, 좁은 부분의 진행방향가로길이, 세로길이, 및 높이가 150×60×60(㎛)로 이루어질 수 있다.
상기 MOFF 채널은, 상기 멀티오리피스 세그먼트와 유입구 사이에 이물질 제거를 위한 필터를 포함한다.
상기 필터는 격자들 사이로 상기 유체 샘플이 통과하는 일정 폭의 유로가 형성되며, 상기 격자들은 직각으로 꺽인 하나 이상의 격자를 포함한다.
상기 MOFF 채널은, 하나의 유입구에서 분지되는 유체 샘플을 각각 처리하기 위한 병렬 연결된 복수의 MOFF 채널을 포함하고, 상기 복수의 MOFF 채널의 중앙부 통로들이 하나의 통로로 연결되어 상기 유전 영동 채널에 결합될 수 있다.
상기 유체 샘플은 적혈구 용혈제를 사용하여 전처리한 혈액 샘플일 수 있다.
그리고, 본 발명의 다른 일면에 따른, 입자 분리 방법은, MOFF(Multi Orifice Flow Fractionation) 채널의 멀티오리피스 세그먼트에 유체 샘플을 통과시키고 상기 멀티오리피스 세그먼트의 끝에 중앙부 통로와 양측면 통로를 포함하는 제1분리부의 상기 중앙부 통로로 배출하는 단계; 및 상기 제1분리부의 상기 중앙부 통로로 배출된 유체를 상기 중앙부 통로에 결합되는 유전 영동 채널의 포커싱부와 제2분리부에 통과시켜 표적 입자를 유출하는 단계를 포함하고, 상기 포커싱부에 일정 간격으로 이격되어 배치된 꺽임형 제1금속 전극들의 오드 전극들과 이븐 전극들 사이에 전원이 인가되고, 상기 제2분리부에 상기 제1금속 전극들과 대칭적으로 일정 간격으로 이격되어 배치된 꺽임형 제2금속 전극들의 오드 전극들과 이븐 전극들 사이에 전원이 인가되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 고효율 세포 분리 장치 및 방법에 따르면, 멀티오리피스 세그먼트를 갖는 MOFF(Multi Orifice Flow Fractionation) 채널을 이용해 유체 수력학법으로 분리후 유전 영동(DEP: Dielectrophoresis)법으로 재차 분리함으로써, 혈액과 같은 유체 샘플로부터 암세포, 즉, 혈액내 순환종양세포(CTC: Circulating Tumor Cell) (예를 들어, 유방암, 대장암의 CTC나 HT-29, MCF-7과 같은 암세포주)와 같은 표적 세포를 더욱 효율적으로 분리할 수 있다.
또한 본 발명의 고효율 세포 분리 장치 및 방법은 적혈구, 유액적혈구, 다발성 골수암을 효율적으로 분리할 수 있으며, 줄기세포와 정상세포를 분리할 수 있으며, 먼지와 세균을 분리할 수 있다.
그리고, MOFF 채널 다수를 병렬 연결해 처리량을 극대화하여 처리능 (throughput)을 향상시키며, 필터를 통해 이물질이 제거된 후 유체 샘플에서 분리함으로써 표적 세포의 순도, 즉, 분리효율(purity)을 향상시킬 수 있고, 멀티오리피스 세그먼트들은 최적으로 디자인됨으로써 표적 세포가 효율적으로 분리되어 세포회수율 (recovery)을 증가시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 세포 분리 장치를 설명하기 위한 도면이다.
도 2는 도 1의 MOFF 채널의 분리부의 확대도이다.
도 3은 도 1의 유전 영동 채널의 확대도이다.
도 4는 도 1의 MOFF 채널의 멀티오리피스 세그먼트의 각 세그먼트를 설명하기 위한 도면이다.
도 5는 도 4의 w 길이에 따른 혈구세포와 MCF-7의 분리가 가능한 유속 영역을 설명하기 위한 임계 레이놀즈수를 설명하기 위한 그래프이다.
도 6은 도 4의 w=60㎛에서의 세포회수율 (recovery)을 나타내는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 MOFF 채널의 유입구에 형성한 필터를 설명하기 위한 도면이다.
도 8은 도 7의 필터를 사용할 때의 유체의 유속을 나타내는 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 병렬 MOFF 채널을 설명하기 위한 도면이다.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 병렬 MOFF 채널을 사용할 때의 동일 유동 조건을 설명하기 위한 유체의 유속을 나타내는 그래프이다.
도 11은 적혈구 용혈제를 사용하는 경우의 처리능 (throughput)을 설명하기 위한 도면이다.
도 12는 염색법을 이용해 CTC 분리를 확인한 사진의 예이다.
도 2는 도 1의 MOFF 채널의 분리부의 확대도이다.
도 3은 도 1의 유전 영동 채널의 확대도이다.
도 4는 도 1의 MOFF 채널의 멀티오리피스 세그먼트의 각 세그먼트를 설명하기 위한 도면이다.
도 5는 도 4의 w 길이에 따른 혈구세포와 MCF-7의 분리가 가능한 유속 영역을 설명하기 위한 임계 레이놀즈수를 설명하기 위한 그래프이다.
도 6은 도 4의 w=60㎛에서의 세포회수율 (recovery)을 나타내는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 MOFF 채널의 유입구에 형성한 필터를 설명하기 위한 도면이다.
도 8은 도 7의 필터를 사용할 때의 유체의 유속을 나타내는 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 병렬 MOFF 채널을 설명하기 위한 도면이다.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 병렬 MOFF 채널을 사용할 때의 동일 유동 조건을 설명하기 위한 유체의 유속을 나타내는 그래프이다.
도 11은 적혈구 용혈제를 사용하는 경우의 처리능 (throughput)을 설명하기 위한 도면이다.
도 12는 염색법을 이용해 CTC 분리를 확인한 사진의 예이다.
이하 첨부 도면들 및 첨부 도면들에 기재된 내용들을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명하지만, 본 발명이 실시예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다.
이하에서 혈액 샘플에서 암세포, 즉, 혈액내 순환종양세포(CTC: Circulating Tumor Cell) (예를 들어, 유방암, 대장암의 CTC나 HT-29, MCF-7과 같은 암세포주)와 같은 표적 입자를 분리해 내는 기술을 설명하지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 일실시예에 따른 입자 분리 장치 및 방법은 다른 병원균의 검출, 신약 개발, 약물 검사 및 세포 대체치료법 등의 분야에서, 병원균 세포 등의 다른 표적 입자를 분리하기 위해서도 유사하게 적용하여 다양한 실시가 가능함을 밝혀 둔다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 입자 분리 장치(세포 분리 장치)(100)를 설명하기 위한 도면이다. 도 1의 MOFF 채널(110)의 분리부(114)의 확대도를 나타내는 도 2와 도 1의 유전 영동 채널(120)의 확대도를 나타내는 도 3이 참조된다.
도 1에서, 본 발명의 일실시예에 따른 입자 분리 장치(100)는 MOFF(Multi Orifice Flow Fractionation) 채널(110) 및 유전 영동(DEP: Dielectrophoresis) 채널(120)을 포함한다.
MOFF 채널(110)의 유입구(111)로 유체 샘플(혈액 샘플)이 투입되고, 유체 샘플은 필터(112)에서 이물질이 제거된 후, 멀티오리피스 세그먼트(113)를 통과해 그 끝에 형성된 분리부(114)에서 분리된다. 도 2와 같이 분리부(114)의 중앙부 통로로는 표적 입자, 즉, 표적 세포(예, MCF-7)가 다량 포함된 혈액이 배출되며 분리부(114)의 양측면 통로로는 혈구 세포(적혈구/백혈구)가 다량 포함된 혈액이 배출된다. 분리부(114)의 중앙부 통로에는 유전 영동 채널(120)이 결합되어 있으며, 분리부(114)의 양측면 통로로 배출된 혈액은 유출구(115)를 통해 배출되어 폐기될 수 있다.
분리부(114)의 중앙부 통로로 배출된 혈액은 유전 영동 채널(120)의 포커싱부(121)와 분리부(122)를 통과하면서 2차적으로 분리되어, 분리부(122) 끝의 중앙 유출구(123)에서 표적 입자, 즉, 표적 세포, 예를 들어, MCF-7가 유출될 수 있으며, 분리부(122) 끝의 양측면 통로로 배출된 혈액은 유출구(124)를 통해 배출되어 폐기될 수 있다.
도 3과 같이, 포커싱부(121)는 일정 간격으로 이격되어 배치된 '<'형태로 꺽인 꺽임형 금속 전극들을 포함하고, 홀수번째에 배치된 오드(odd) 전극들과 짝수번째에 배치된 이븐(even) 전극들은 전기적으로 분리되어 오드(odd) 전극들과 이븐(even) 전극들 사이에는 전극 패드들(10,11)을 통해 교류 전원이 인가된다. 분리부(122)도 역시 일정 간격으로 이격되어 배치된 '>'형태로 꺽인 꺽임형 금속 전극들을 포함하고, 분리부(122)의 꺽임형 금속 전극들은 포커싱부(121)의 꺽임형 금속 전극들과 대칭적으로 배치되며, 여기서도 홀수번째에 배치된 오드(odd) 전극들과 짝수번째에 배치된 이븐(even) 전극들은 전기적으로 분리되어 오드(odd) 전극들과 이븐(even) 전극들 사이에는 전극 패드들(12,13)을 통해 교류 전원이 인가된다. 여기서 포커싱부(121)와 분리부(122)의 오드(odd) 전극들과 이븐(even) 전극들 사이에 인가되는 교류 전원은, 표적 입자(세포)의 종류에 따라 전압 크기(peak-peak) 10~100볼트 범위에서 주파수 100~900kHz 범위로 선택되어 인가될 수 있다.
실제 혈액 샘플에서 암세포의 비율은 백혈암의 경우에는 매우 높은 농도로 존재하지만 기타 암세포(예를 들어, MCF-7)는 109개 중에 1개의 비율로 매우 극소수가 존재한다. 이런 샘플을 분리하기 위해서는 처리량도 높고 분리 효율도 좋은 디바이스가 필수적이다. 세포 분리기의 효율을 더욱 높일 수 있는 방법으로 본 발명에서는 위와 같이 MOFF 채널(110)에 의한 유체수력학과 유전 영동 채널(120)에 의한 유전 영동법을 접목하였다.
유체 수력학에 근거한 분리는 빠른 처리 속도를 갖지만 실제 세포 크기가 동일하지 않아 소수의 혈구세포(예를 들어, 적혈구/백혈구)가 암세포(예를 들어, MCF-7)와 함께 분리부(114)의 중앙부 통로로 흘러들어가게 되고 이때 유로 설계를 통해 샘플의 이동 속도를 줄여 유전 영동시 유리한 조건이 형성되게 한 것이다.
분리부(114)의 중앙부 통로를 통해 유전 영동 채널(120)로 흘러들어온 유체 샘플은 세포들의 유전체적 특성(유전율의 차이 등)에 따라 정밀하게 분리될 수 있다. 대부분의 혈구 세포는 MOFF 채널(110)에서 1차적으로 분리 제거가 되었기 때문에 2차적으로 유전 영동 채널(120)에서 유전 영동법으로 정밀하게 분리하면 높은 순도의 암세포를 분리 할 수 있다.
위와 같이 포커싱부(121)와 분리부(122)의 오드(odd) 전극들과 이븐(even) 전극들 사이에 특정 주파수(예를 들어, 100~900kHz)의 전기장이 형성되도록 교류 전원을 인가하면 혈구 세포는 거르지 않고 암세포만을 선택적으로 걸러낼 수 있다. 도 3과 같이, 분리부(114)의 중앙부 통로를 통해 유입된 유체의 세포들은, 포커싱부(121)의 전극들에 의한 미세유로에 형성된 바닥부위의 전기장으로 인해 진행 방향에 대해 양측면으로 이동하여 흐를 수 있고, 분리부(122)의 전극들에 의한 미세유로에 형성된 바닥부위의 전기장으로 인해 암세포(예를 들어, MCF-7)만을 당기는 힘(positive dielectrophotrtic force)을 발생시켜서 혈구 세포는 이 힘을 받지 않아 그대로 양측면으로 이동하여 흘러가 측면 유출구(124)를 통해 배출되어 폐기될 수 있으며, 전기장에 의해 분리부(114)의 중앙으로 당겨진 표적 입자(세포), 예를 들어, MCF-7는 분리부(122) 끝의 중앙 유출구(123)를 통해서 유출될 수 있다.
이와 같이 MOFF 채널(110)을 이용해 유체 수력학법으로 분리후 유전 영동 채널(120)을 통해 유전 영동(DEP)법으로 재차 분리함으로써, 혈액과 같은 유체 샘플로부터 암세포, 즉, 혈액내 순환종양세포(CTC: Circulating Tumor Cell)(예를 들어, MCF-7)와 같은 표적 입자(세포)를 더욱 효율적으로 분리할 수 있다. 이와 같은 두 번의 분리 과정을 통해 아래 [표 1]과 같이 99%의 혈구 세포들을 제거하고 혈액내 암세포만을 선택적으로 분리해 162.4배 농축(enrichment)효과를 얻는데 성공하였다. [표 1]에서 Outlet I은 MOFF 채널(110)의 유출구(115)이고, Outlet II, III는 유전 영동 채널(120)의 유출구(123)과 유출구(124)에 해당한다.
이와 같은 방법에 따라 항체를 이용한 유출 방식보다 세포회수율 (recovery)을 훨씬 높일 수 있고, 기존 미세유체 시스템에서보다 빠른 속도로 암세포를 획득할 수 있다. 이와 같이 수력학(Hydrodynamic)과 미세유체(Microfluidics)를 이용해 비표지 방식(Label-free)으로 혈액과 암세포를 분리하는 방법은 기존에 없었던 획기적인 기술에 해당한다.
[표 1]
한편, 도 1의 MOFF 채널(110)의 멀티오리피스 세그먼트(113)의 각 세그먼트는 도 4와 같이 설계될 수 있다. MOFF 채널(110)의 멀티오리피스 세그먼트(113)의 각 세그먼트에는 넓은 부분과 좁은 부분이 복수회 반복되어 연결되어 있으며, 그 넓은 부분은 진행방향가로길이, 세로길이, 및 높이 300*300*w(㎛)과 좁은 부분은 진행방향가로길이, 세로길이, 및 높이 150*w*w(㎛)에 대하여 w를 변화시키며 실험하였다.
혈구 세포 중 가장 많은 비율을 차지하는 세포는 적혈구(RBC)이고 적혈구는 원반 모양으로 두께가 2~3 μm 이며, 직경은 약 7~8 μm 이다. 백혈구(WBC)는 종류가 다양하며 크기 분포가 적혈구에 비해 고르지는 않지만, 백혈구 중에서 대부분의 비율을 차지하는 Neutrophil(중성구)과 Lymphocyte(림프구)는 그 크기가 약 7~12 μm 의 분포를 가지고 있다. 그에 반해 분리해 내고자 하는 표적 입자(세포)인 암세포의 모델로 선정한 MCF-7 세포는 평균 크기 약 20 μm로 혈구 세포보다는 더 큰 크기 분포를 가지고 있다.
MOFF 채널(110)을 이러한 세포들이 가장 잘 분리가 될 수 있도록 채널 크기의 수정이 필요했으며 이때 채널내에서 입자의 거동과 밀접한 관련이 있는 particle Reynolds 수를 기준으로 형상을 결정 하였다. 혈구세포의 대표 크기로 8 ㎛ (도 5의 점선)를 설정하고 MCF-7 세포는 평균 크기인 20 ㎛ (도 5의 실선)를 채널 디자인 변경 기준으로 이용하였다.
도 5는 일정 점성을 갖는 혈액 샘플에 대하여w 길이에 따른 혈구세포와 MCF-7의 분리가 가능한 유속 영역을 설명하기 위한 임계 레이놀즈수(Rec)를 설명하기 위한 그래프이다. Rep와 Rec는 [수학식 1]과 같은 관계이며, MCF-7 세포에 대하여는 레이놀즈수 Rep 4.43~10.1에 대한 임계 레이놀즈수(Rec)를 나타내며, 혈구세포에 대하여는 레이놀즈수 Rep 0.55~1.38에 대한 임계 레이놀즈수(Rec)를 나타내었다. 여기서, Dh는 채널의 세그먼트의 디자인에 의해 결정되는 수력학 지름(hydraulic diameter), d는 전체 채널 길이, Um은 최대 유속, ρ는 유체밀도, μ 는 유체 동점성(dynamic viscosity)이다.
[수학식 1]
분리 영역이 넓을수록 특정 유속에서 안정적인 분리 조건을 보장해 줄 수 있기 때문에 도 5에서 (A)(w=45 ㎛ 인 경우) 경우보다는 (B) (w=60 ㎛ 인 경우) 또는 (C) (w=75 ㎛ 인 경우)의 디자인이 분리가 더 안정적이라고 할 수 있다. 그러나 이 분리 구간은 채널의 넓이가 넓어질 수록 더 늘어나는데, 동시에 분리 가능한 유속 조건도 고유량으로 변이되는 것을 확인 할 수 있다. 작동 유량이 높아지면 세포에 작용하는 share stress 도 높아지기 때문에 세포의 영향을 최소화 하는 조건에서 디자인이 결정되어야 한다. 따라서 본 발명에서는 최적 디자인을 contraction channel에서 w=60 ㎛ 로 결정 하였다.
건강한 사람의 정맥혈액에 대한 실험 결과, RBC와 WBC는 크기 분포가 유사한 만큼 유속의 변화에 따라 거동의 양상도 유사하게 변화하는 것을 확인할 수 있었다. 느린 유속에서는 RBC와 WBC가 방향성 없이 MOFF 채널(110)(세그먼트)을 흐르다가 유속이 점차 빨라져서 channel Reynolds 수(Rec)가 70에 가까워 지면 채널의 양 측면(Outside)으로 벌어져서 흐르게된다. 그러나 이 보다 크기가 큰 MCF-7은 동일한 유속에서 채널의 분리부(114)의 중앙부 통로(Inside)로 모여서 흘러가 혈구세포와 MCF-7가 명확하게 분리가 되는 것을 확인하였다. 이와 같은 실험에서 도 6과 같이 MOFF 채널(110)의 멀티오리피스 세그먼트(113)의 각 세그먼트에서 w=60㎛일때, MCF-7세포가 혈액 샘플(좌측 그래프)에서 88.8 % 의 세포회수율 (recovery)로 획득됨을 확인 할 수 있었으며 혼합 샘플의 결과(우측 그래프)에서도 유사한 결과를 확인하였다. 그러나 혈구세포는 샘플을 혼합하여 실험하였을 때 WBC의 분리 효율이 약간 감소하였는데 이는 고농도의 샘플에서 세포간에 발생하는 상호작용의 영향으로 판단된다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 MOFF 채널(110)의 유입구(111)과 멀티오리피스 세그먼트(113) 사이에 형성한 필터(112)를 설명하기 위한 도면이다. 혈액 샘플에 포함된 부유 먼지 등의 이물질을 자동으로 제거하여 별도로 샘플을 준비하는 시간을 절약하기 위한 필터(112)는 일정 간격으로 일렬로 배치된 격자들을 포함하며, 격자들 사이로 혈액(유체) 샘플이 통과하는 일정 폭의 유로가 형성되고, 격자들 중에는 직각으로 꺽인 하나 이상의 격자가 포함되어 있어서, 꺽인 채널을 통과하면서 혈액의 부유 먼지 등의 이물질이 걸려 손쉽게 제거함으로써 MOFF 채널(110)의 멀티오리피스 세그먼트(113)로 유입되어 채널을 막는 문제를 해결할 수 있다. 격자들 중 십자형, 'ㄷ'자 형 등의 직각으로 한번 이상 꺽인 격자를 최대한 많이 배치하여 필터(112)를 통과할 때 세포가 받는 영향을 최소화할 수 있다. 시뮬레이션 결과 도 8과 같이 전체적으로 느린 속도로 세포가 필터(112)를 통과해 감을 알 수 있다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 병렬 MOFF 채널(200)을 설명하기 위한 도면이다. 도 1의 MOFF 채널(110)은 도 9와 같이 병렬 연결된 MOFF 채널(200)로 대체될 수 있다. 예를 들어, 하나의 유입구(210)에서 분지되는 유체(혈액) 샘플을 각각 처리하기 위한 병렬 연결된 복수의 MOFF 채널(200)이 사용될 수 있으며, 이때, 복수의 MOFF 채널(200)의 각 분리부(230)에 구비된 중앙부 통로들이 하나의 통로(240)로 연결되어 도 1의 유전 영동 채널(120)에 결합될 수 있다. 복수의 MOFF 채널(200)의 각 분리부(230) 끝의 양측면 통로로 배출된 혈액은 다른 유출구를 통해 배출되어 폐기(waste)될 수 있다.
MOFF 채널(110)은 채널 하나당 약 126 ㎕/min의 처리량을 가지고 있어서 많은 환자의 시료를 처리하기에는 문제가 있다. 병렬 MOFF 채널(200)는 이 문제를 해결하기 위해 도 9와 같이 복수의 MOFF 채널을 병렬로 연결하여 하나의 칩에 여러개의 MOFF 채널이 집적되도록 하여 고용량 분리가 가능하도록 한 것이고, 병렬 MOFF 채널(200)의 중앙부 통로들이 하나의 통로(240)로 연결되어 도 1의 유전 영동 채널(120)에 결합될 수도 있다.
다만 병렬 MOFF 채널(200)은 각각의 채널이 독립적으로 작동할 때와 동일하게 예를 들어 4개의 채널에 같은 유동조건이 적용되어야 한다. 우선 채널의 유입구(210)(Inlet)에서 4개의 MOFF 채널로 분지되는 연결 채널을 대칭적으로 배치함으로써 쉽게 설계가 가능하다. 그러나 MOFF 채널로 분리가 되고 난 다음 샘플이 빠져나가는 유출부의 설계는 더 복잡해진다. 도 10의 시뮬레이션 결과와 같이 Outlet(240)과 연결된 각 연결 채널들(200)의 유체 저항을 조절하기 전의 유속(좌측 그래프)은 좌우 2개의 하위 채널의 유속이 비대칭인 반면 조절하고 난 후의 유속(우측 그래프)은 좌우 유속이 대칭적으로 안정된 것을 알 수 있다.
이와 같은 병렬 MOFF 채널(200)을 이용하여 유방암, 대장암의 CTC나 HT-29, MCF-7과 같은 암세포주의 분리를 시도한 결과 아래 [표 2]와 같은 결과를 얻었다. 백혈구(WBC)는 90.8%를 제거 가능한 조건에서 MCF-7의 경우 약 89.2%를 분리해 낼수 있었고, HT-29의 경우에는 80.7%의 세포를 분리해 낼 수 있었다. HT-29과 MCF-7은 그 크기에 차이가 있어서 HT-29의 분리 효율이 낮게 나왔지만 암세포의 종류에 맞게 도 4의 w 값을 조절하여 최적의 결과를 얻었다.
[표 2]
또한, 처리능 (throughput)을 향상시키기 위하여 위에서 언급한 유체(혈액) 샘플은 적혈구 용혈제를 사용하여 전처리한 혈액 샘플일 수 있다. MOFF 채널(110)은 일정 농도 이상의 세포는 분리 효율이 떨어지는 한계를 가지고 있다. 따라서 혈액을 분리하기 위해서는 일정 수준이하의 농도로 희석을 하여주어야 하며, 이때 약 100배 이상의 희석이 요구된다. 이렇게 희석한 혈액을 MOFF 채널(110)로 분리하기 위해서는 52시간이상의 분리 시간이 소요되며 최종 분리된 시료도 200ml로 분석이 힘든 양이 된다. 이때 적혈구 용혈제를 사용하여 적혈구를 대부분 제거하게되면 분리 시간은 1.3시간으로 대폭 감소 시킬수 있으며 최종시료의 양도 5ml이하로 Cytospin법을 이용하여 다양한 분석에 활용할 수 있다. 그리고 도 11과 같이 적혈구 용혈제를 사용하여 전처리한 혈액을 병렬 MOFF 채널(200)을 이용해 분리를 할 경우 이 시간은 더 줄어들게 된다. 예를 들어, 병렬로 4개의 MOFF 채널을 연결하여 사용한 경우, 분당 0.5ml의 처리량을 가지도록 할 수 있고, 이에 따라 약 20분만에 환자의 혈액에서 순환종양세포를 분리할 수 있다.
위와 같은 도 11의 혈액 처리 과정을 통해서 유방암 환자의 혈액에서 CTC를 분리한 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 환자 혈액에서 실제 CTC분리에 성공하였다. 환자의 혈액 5~7.5 ml에서 먼저 적혈구(RBC)를 용혈제를 사용하여 1차적으로 제거하고, 적혈구(RBC)가 제거된 혈액을 위와 같은 병렬 MOFF 채널(200)의 Inlet(210)에 약 600 ㎕/min의 유속으로 주입을 하고, 동시에 Outlet(240)의 유속을 조절하여 일정한 비율(예를 들어, Inlet 유속의 35~40%)로 배출 될 수 있도록 하였다. 분리가 끝난 후 마지막으로 모아진 3.5ml의 샘플을 Cytospin으로 슬라이드 글라스에 고정한 후 DAPI, EpCAM, CD45로 염색하여 CTC를 확인한 결과, 도 12와 같이, DAPI에 의해 세포의 핵이 파란색으로 염색되고, EpCAM에 의해 CTC(도면의 우측 세포)가 상피세포에 녹색으로 염색되며, CD45에 의해 백혈구(WBC)(도면의 좌측과 중앙 세포)가 붉은색으로 염색됨을 확인하였다.
이상과 같이 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 상기의 실시예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 그러므로, 본 발명의 범위는 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 아니 되며, 후술하는 특허청구범위뿐 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.
MOFF 채널(110)
유전 영동 채널(120)
병렬 MOFF 채널(200)
유전 영동 채널(120)
병렬 MOFF 채널(200)
Claims (25)
- 유체 샘플이 통과되는 멀티오리피스 세그먼트를 구비하여, 유체 샘플 내의 표적 입자를 분리한 1차 분리물을, 중앙부 통로를 통해, 배출하는 MOFF(Multi Orifice Flow Fractionation)채널;
교류가 인가되는 전극의 쌍을 구비하며, 상기 MOFF채널의 중앙부 통로와 연결된 유로 채널에 전기장을 형성하여, 상기 MOFF채널의 중앙부 통로에서 배출되는 1차 분리물을 다시 유전영동에 의해 표적 입자를 분리하는 유전영동 채널;
을 포함하여 이루어진 것을 특징으로 하는 입자 분리 장치. - 멀티오리피스 세그먼트를 갖는 MOFF 채널을 이용해 표적 입자를 분리 후, 유전 영동 채널에서 표적입자를 재차 분리하는 입자 분리 장치에 있어서,
상기 MOFF채널은
유입구에 투입된 유체 샘플에서 이물질을 제거하는 필터;
상기 필터를 통과한 유체 샘플이 멀티오리피스 세그먼트를 통과한 후, 표적 입자를 다수 포함하는 유체 샘플을 중앙부 통로로 배출하며, 표적입자 이외의 입자를 다수 포함하는 유체 샘플을 양측면 통로로 배출하는 제1분리부;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 입자 분리 장치. - 멀티오리피스 세그먼트를 갖는 MOFF 채널을 이용해 표적 입자를 분리 후, 유전 영동 채널에서 표적입자를 재차 분리하는 입자 분리 장치에 있어서,
교류가 인가되는 하나 이상의 제1 전극의 쌍을 구비하며, 상기 MOFF채널에서 분리된 유체 샘플의 표적 입자가 유로 채널의 중앙으로 집중되도록 이루어진 포커싱부;
교류가 인가되는 하나 이상의 제2 전극의 쌍을 구비하되, 상기 제2 전극의 쌍은 제1 전극의 쌍과 대칭을 이루며, 전기장에 의해 표적 입자를 분리하는 제2분리부;
를 포함하여 이루어진 것을 특징으로 하는 입자 분리 장치. - 제1항에 있어서,
상기 MOFF채널은
유체 샘플이 투입되는 유입구;
상기 유입구에서 투입된 유체 샘플에서 이물질을 제거하는 필터;
상기 필터를 통과한 유체 샘플이 멀티오리피스 세그먼트를 통과한 후, 표적 입자를 다수 포함하는 유체 샘플을 중앙부 통로로 배출하며, 표적입자 이외의 입자를 다수 포함하는 유체 샘플을 양측면 통로로 배출하는 제1분리부;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 입자 분리 장치. - 제1항에 있어서,
상기 유전 영동 채널은,
교류가 인가되는 하나 이상의 제1 전극의 쌍을 구비하며, 상기 MOFF채널에서 분리된 유체 샘플의 표적 입자가 유로 채널의 중앙으로 집중되도록 이루어진 포커싱부;
교류가 인가되는 하나 이상의 제2 전극의 쌍을 구비하되, 상기 제2 전극의 쌍은 제1 전극의 쌍과 대칭을 이루며, 전기장에 의해 표적 입자를 분리하는 제2분리부;
를 포함하여 이루어진 것을 특징으로 하는 입자 분리 장치. - 제3항 또는 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 전극은 '＜'형으로 이루어지며,
상기 제2 전극은 '＞'형으로 이루어진 것을 특징으로 하는 입자 분리 장치. - 제1항에 있어서,
상기 중앙부 통로는, 입구에서 출구로 갈수록 통로 내 구경이 넓어지도록 이루어진 것을 특징으로 하는 입자 분리 장치. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 교류 전원은, 전압 크기가 10 내지 100볼트 범위에서, 주파수 100 내지 900kHz 범위로 선택적으로 인가되는 것을 특징으로 하는 입자 분리 장치. - 제8항에 있어서,
상기 표적 입자는 세포인 것을 특징으로 하는 입자 분리 장치. - 제9항에 있어서,
상기 세포는 순환종양세포(CTC: Circulating Tumor Cell)인 것을 특징으로 하는 입자 분리 장치. - 제10항에 있어서,
상기 순환종양세포는 유방암 또는 대장암의 순환종양세포이거나, HT-29, MCF-7의 암세포주인 것을 특징으로 하는 입자 분리 장치. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 표적 입자는 적혈구, 유액적혈구, 다발성 골수암 세포 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 입자 분리 장치. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 표적 입자는 줄기세포이며,
상기 입자 분리 장치는 줄기세포와 정상세포가 혼재된 유체로부터 줄기세포를 분리하는 것을 특징으로 하는 는 입자 분리 장치. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 표적 입자는 세균이며,
상기 입자 분리 장치는 먼지와 세균이 혼재된 유체로부터 세균을 분리하는 것을 특징으로 하는 는 입자 분리 장치. - 유체 샘플이 통과되는 멀티오리피스 세그먼트의 끝에 중앙부 통로와 양측면 통로를 포함하는 제1분리부가 형성된 MOFF(Multi Orifice Flow Fractionation) 채널; 및 상기 중앙부 통로에 결합되는 유전 영동 채널;을 포함하며,
상기 유전 영동 채널은, 오드 전극들과 이븐 전극들 사이에 전원이 인가되는 꺽임형 제1금속 전극들이 일정 간격으로 이격되어 배치된 포커싱부; 및 상기 제1금속 전극들과 대칭적으로 배치되며, 오드 전극들과 이븐 전극들 사이에 전원이 인가되는 꺽임형 제2금속 전극들을 갖는 제2분리부;를 포함하는 것을 특징으로 하는 입자 분리 장치. - 제15항에 있어서,
상기 중앙부 통로를 통해 상기 유전 영동 채널로 유입된 유체의 입자들이, 상기 포커싱부에서 양측면으로 이동하여 흐르며, 표적 입자가 상기 제2분리부의 중앙으로 유출되는 것을 특징으로 하는 입자 분리 장치. - 제15항에 있어서,
상기 제1금속 전극들의 상기 오드 전극들과 상기 이븐 전극들 사이에 교류 전원이 인가되며, 상기 제2금속 전극들의 상기 오드 전극들과 상기 이븐 전극들 사이에 교류 전원이 인가되는 것을 특징으로 하는 입자 분리 장치. - 제17항에 있어서,
상기 교류 전원은 전압 크기 10~100볼트 범위에서 주파수 100~900kHz 범위로 선택되어 인가된 것을 특징으로 하는 입자 분리 장치. - 제15항에 있어서,
혈액 샘플로부터 표적 입자 MCF-7을 분리하기 위한 것을 특징으로 하는 입자 분리 장치. - 제15항에 있어서,
상기 멀티오리피스 세그먼트의 각 세그먼트는 넓은 부분의 진행방향가로길이, 세로길이, 및 높이가 300×300×60(㎛)로 이루어지고, 좁은 부분의 진행방향가로길이, 세로길이, 및 높이가 150×60×60(㎛)로 이루어진 것을 특징으로 하는 입자 분리 장치. - 제15항에 있어서,
상기 MOFF 채널은, 상기 멀티오리피스 세그먼트와 유입구 사이에 이물질 제거를 위한 필터를 포함하는 것을 특징으로 하는 입자 분리 장치. - 제21항에 있어서,
상기 필터는 격자들 사이로 상기 유체 샘플이 통과하는 일정 폭의 유로가 형성되며, 상기 격자들은 직각으로 꺽인 하나 이상의 격자를 포함하는 것을 특징으로 하는 입자 분리 장치. - 제15항에 있어서,
상기 MOFF 채널은, 하나의 유입구에서 분지되는 유체 샘플을 각각 처리하기 위한 병렬 연결된 복수의 MOFF 채널을 포함하고,
상기 복수의 MOFF 채널의 중앙부 통로들이 하나의 통로로 연결되어 상기 유전 영동 채널에 결합된 것을 특징으로 하는 입자 분리 장치. - 제15항에 있어서,
상기 유체 샘플은 적혈구 용혈제를 사용하여 전처리한 혈액 샘플인 것을 특징으로 하는 입자 분리 장치. - MOFF(Multi Orifice Flow Fractionation) 채널의 멀티오리피스 세그먼트에 유체 샘플을 통과시키고 상기 멀티오리피스 세그먼트의 끝에 중앙부 통로와 양측면 통로를 포함하는 제1분리부의 상기 중앙부 통로로 배출하는 단계; 및
상기 제1분리부의 상기 중앙부 통로로 배출된 유체를 상기 중앙부 통로에 결합되는 유전 영동 채널의 포커싱부와 제2분리부에 통과시켜 표적 입자를 유출하는 단계를 포함하고,
상기 포커싱부에 일정 간격으로 이격되어 배치된 꺽임형 제1금속 전극들의 오드 전극들과 이븐 전극들 사이에 전원이 인가되고, 상기 제2분리부에 상기 제1금속 전극들과 대칭적으로 일정 간격으로 이격되어 배치된 꺽임형 제2금속 전극들의 오드 전극들과 이븐 전극들 사이에 전원이 인가되는 것을 특징으로 하는 입자.
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