KR20120130606A - 제 ⅰ형 당뇨병 치료를 위한 분비 신호 펩타이드가 연결된 엑센딘-4를 도입한 췌장소도세포 클러스터 - Google Patents

제 ⅰ형 당뇨병 치료를 위한 분비 신호 펩타이드가 연결된 엑센딘-4를 도입한 췌장소도세포 클러스터 Download PDF

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Abstract

본 발명은 분비 신호 펩타이드가 연결된 엑센딘-4를 도입한 췌장소도세포 클러스터 및 이를 이용한 당뇨병 치료방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인슐린 분비능이 향상되고 이식 시 세포의 괴사율을 감소시키고 면역 억제성을 향상시키는 분비 신호 펩타이드가 연결된 엑센딘-4를 도입한 췌장소도세포 클러스터에 관한 것이다.
본 발명은 췌장소도 단일세포에 렌티바이러스(Lentivirus) 벡터를 이용하여 분비 신호 펩타이드(secretion signal peptide)가 연결된 엑센딘-4 유전자(Exendin-4)를 도입함으로써, 유전자의 전달 효율을 높여 인슐린 분비능의 향상을가져오고, 세포의 크기를 조절하여 이식 시 발생할 수 있는 세포의 괴사율을 감소시키고 최종적으로 생체적합성 고분자 물질을 이용한 표면 개질을 통해 면역 억제성까지 향상 효과를 가지므로 당뇨병 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

제 Ⅰ형 당뇨병 치료를 위한 분비 신호 펩타이드가 연결된 엑센딘-4를 도입한 췌장소도세포 클러스터{Secretion signal peptide linked Exendin-4 gene transduced pancreatic islet cluster for treatment of type Ⅰ diabetes}
본 발명은 분비 신호 펩타이드가 연결된 엑센딘-4를 도입한 췌장소도세포 클러스터에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 인슐린 분비능이 향상되고 이식 시 세포의 괴사율을 감소시키고 면역 억제성을 향상시키는 분비 신호 펩타이드가 연결된 엑센딘-4를 도입한 췌장소도세포 클러스터에 관한 것이다.
엑센딘(exendin)은 독도마뱀 또는 구슬도마뱀의 독에서 발견되며, 엑센딘-3은 멕시코 구슬도마뱀인 헬로더마 호리덤(Heloderma suspectum)의 독에 존재한다. 엑센딘-4는 2번 및 3번 위치에서만 엑센딘-3과 상이하며, 포유동물류에서 DPP-IV에 의한 분해에 대해 저항성을 가지며 DPP-IV에 대해 2분 이하의 반감기를 갖는 GLP-1 보다 더 긴 반감기를 갖고 있다(Kieffer TJ et al.,1995). 또한, 생체 내(in vivo) 실험에서 2 ~ 4시간의 반감기를 나타내며, 1일 2 ~ 3회 복강투여로 충분한 혈중 농도에 도달할 수 있음이 밝혀진 바 있다(Finemam MS et al.,2003). 또한, 엑센딘-4는 위장관 운동성을 조절하고 음식섭취를 감소시켜주며 혈장 글루카곤을 억제한다고 알려져 있는데(미국 등록특허 제 6,858,575호, 제 6,956,026호, 제 6,872,700호), 엑센딘-4의 혈당조절작용은 엑센딘-4 단일요법뿐만 아니라 설포닐우레아 및/또는 메트포민 등의 항당뇨병 치료제와의 병용요법 모두에서 28일간의 투여 후 HbAlc 수치를 1 % 범위 내에서 낮추었다고 보고 되었다(Egan JM et al.,2003). 최근에는 ByettaTM 라는 상표로 합성 엑센딘-4가 미국 식품의약품안정청(US Food and Drug Administration)으로부터 시판 허가되었다.
제 1 형 당뇨병 치료에 있어서 일반적이 치료 방법은 인슐린(insulin) 주사를 이용하는 것이다. 하지만 인슐린 주사에 의한 저혈당 쇼크(hypoglycemia)가 일어나는 치명적인 부작용이 있고, 인슐린 주사의 경우 매일 주사를 맞아야하는 불편함과 통증을 느낄 수 있으며, 식사조절과 함께 주사를 해야 함으로써 삶의 질이 떨어질 수 있다.
위와 같은 단점을 극복할 수 있는 이상적인 치료법의 하나로 췌장소도세포의 이식이 있다. 췌장소도세포는 인슐린을 분비하는 세포가 포함되어 있는 세포 클러스터로 혈중의 포도당 농도에 따라 생물학적으로 자발적인 분비능을 조절할 수 있기 때문에, 이식 후에 인슐린의 주사 없이 당뇨를 치료할 수 있게 된다. 하지만, 이러한 췌장소도세포 이식의 경우에도 몇 가지 풀어야한 문제점이 있다. 그 중 하나는 췌장소도세포를 초기에 이식할 경우 혈관 생성이 원활히 일어나지 않기 때문에 이식 직후 발생하는 저산소 상태(hypoxia)에 의해서 많은 췌장소도세포가 손상(apoptosis)을 받게 된다. 이러한 문제점들을 해결하기 위해서 혈관생성을 촉진하는 유전자의 전달이나 저산소 상태 조건을 견딜 수 있는 유전자 및 단백질의 전달을 하는 연구가 진행되었다. 또한 다른 연구에서는 작은 췌장소도세포를 이식하면, 산소의 공급 및 영양분의 공급이 췌장소도세포의 가운데 부위까지 확산되어 공급될 수 있기 때문에, 크기가 큰 췌장소도세포를 이식하는 경우보다 더 효과적으로 당뇨를 치료하는 실험 결과를 얻었고, 세포의 생존율 및 인슐린 분비능이 향상된다는 연구 결과가 있는 것으로 알려져 있다.
이에 본 발명자들은 췌장소도세포의 세포괴사 및 사멸을 막기 위해서, 췌장소도 단일 세포에 인슐린의 분비능 및 항세포괴사 인자인 엑센딘-4 유전자를 전달하고 일정 기간 배양하여 췌장소도세포 클러스터를 만들고 상기 췌장소도세포 클러스터의 외부 세포막에 PEG-지질을 이용하여 표면 개질한 췌장소도세포 클러스터를 제조하였다. 상기 제조된 췌장소도세포 클러스터가 인슐린의 분비기능은 향상되고 산소 및 영양분의 공급이 원할 하게 이뤄져서 이식 후 세포의 괴사율을 감소시킬 수 있으며 췌장소도세포 이식의 문제점인 면역 반응을 감소시킬 수 있음을 확인함으로 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 인슐린의 분비기능이 향상되고 췌장소도세포의 세포괴사 및 사멸을 막을 수 있는 췌장소도세포 클러스터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 인슐린의 분비기능이 향상되고 췌장소도세포의 세포괴사 및 사멸을 막을 수 있는 췌장소도세포 클러스터를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 췌장소도세포의 이식을 통한 당뇨병 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 분비신호 펩타이드(secretion signal peptide)를 암호화하는 유전자 및 엑센딘-4(Exendin-4)를 암호화하는 유전자가 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 벡터를 도입한 췌장소도세포 클러스터를 제공한다.
또한, 본 발명은,
1) 분비신호 펩타이드(secretion signal peptide)를 암호화하는 유전자 및 엑센딘-4(Exendin-4)를 암호화하는 유전자가 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 벡터를 췌장소도 단일세포에 도입하는 단계; 및
2) 단계 1)의 췌장소도 단일세포를 배양하는 단계를 포함하는 췌장소도세포 클러스터의 제조 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 본 발명에 따른 췌장소도세포 클러스터를 유효성분으로 함유하는 당뇨병 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 췌장소도 단일세포에 렌티바이러스(Lentivirus) 벡터를 이용하여 분비 신호 펩타이드(secretion signal peptide)가 연결된 엑센딘-4 유전자(Exendin-4)를 도입함으로써, 유전자의 전달 효율을 높여 인슐린 분비능의 향상을 가져오고, 세포의 크기를 조절하여 이식 시 발생할 수 있는 세포의 괴사율을 감소시키고 최종적으로 생체적합성 고분자 물질을 이용한 표면 개질을 통해 면역 억제성까지 향상 효과를 가지므로 당뇨병 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 렌티바이러스(Lentivirus) 구조를 나타낸 도이다.
도 2는 췌장소도 단일세포 및 췌장소도세포 클러스터형성 후 찍은 사진이다.
도 3은 췌장소도세포 클러스터 형성 후 크기의 분포를 나타낸 도표이다.
도 4는 췌장소도세포 클러스터에서 분비되는 엑센딘-4 단백질양을 나타낸 도이다.
도 5는 췌장소도 및, 엑센딘-4 유전자를 도입하지 않은 췌장소도세포 클러스터, 그리고 엑센딘-4 유전자를 도입한 췌장소도세포 클러스터의 인슐린 분비량을 측정한 도이다.
도 6은 25일 동안 in vitro에서의 세포의 생존율을 평가 한 도이다. 췌장소도세포 클러스터 (○), 췌장소도세포 (●), 엑센딘-4 췌장소도세포 클러스터 (▼).
도 7은 날짜 별로, Live/dead cells imaging assay kit을 이용해서 세포의 생존 정도를 정성적으로 나타낸 도이다. 생존한 세포 (녹색형광), 죽은 세포 (적색형광)
도 8은 세포 클러스터, 췌장소도세포, 엑센딘-4 췌장소도세포 클러스터의 저 산소 상태 (hypoxia)에서의 생존율의 변화.
도 9은 24시간 저 산소 상태 (hypoxia condition)에서 배양 후 세포 클러스터, 췌장소도세포, 엑센딘-4 췌장소도세포 클러스터의 caspase-3 발현 양을 나타낸 도이다.
도 10은 바이러스를 처리하지 않은 췌장소도세포 클러스터 500 IEQ를 누드 마우스에 이식한 그림이다.
도 11는 바이러스를 처리하지 않은 바이러스를 처리한 췌장소도세포 클러스터 1000 IEQ를 누드 마우스에 이식한 그림이다.
도 12은 바이러스를 처리한 췌장소도세포 클러스터 500 IEQ를 누드 마우스에 이식한 그림이다.
도 13는 이식 한 췌장소도세포 클러스터의 생존율을 나타낸 도이다.
도 14는 췌장소도세포의 신장의 HE 염색결과, 인슐린, 엑센딘-4 단백질을 나타낸 그림이다.
도 15은 PEG에 연결된 C18의 화학구조 및 FITC가 연결되어 있는 PEG-C18를 이용하여 개질된 췌장소도세포 클러스터를 공초점 형광 현미경으로 찍은 사진이다.
도 16은 CCK-8 분석을 통한 세포 생존율을 측정한 그림이다.
도 17은 바이러스를 처리하지 않은 췌장소도세포 클러스터 500 IEQ를 C57BL/6 마우스에 이식한 그림이다.
도 18는 바이러스를 처리한 췌장소도세포 클러스터 500 IEQ를 C57BL/6 마우스에 이식한 그림이다.
도 19는 바이러스를 처리하고 PEG로 표면개질한 췌장소도세포 클러스터 500 IEQ를 C57BL/6 마우스에 이식한 그림이다.
도 20는 바이러스를 처리한 췌장소도세포 클러스터 500 IEQ를 C57BL/6 마우스에 이식하고 항-CD154 와 타크로리무스(tacrolimus)를 주사 한 후 혈당조절 그림이다.
도 21는 바이러스를 처리하고 PEG로 표면 개질한 췌장소도세포 클러스터 500 IEQ를 C57BL/6 마우스에 이식하고 항-CD154와 타크로리무스를 주사한 후 혈당조절 그림이다.
도 22는 췌장소도세포 클러스터, 유전자가 유입되노 췌장소도세포 클러스터, 그리고 유전자가 도입되고 표면개질한 췌장소도세포 클러스터의 이식 후 anti-CD154 와 타크로리무스를 주사하거나 주사하지 않은 췌장소도세포 클러스터의 생존율을 나타낸 도이다.
도 23는 췌장소도세포를 이식받은 C57BL/6 마우스의 신장에서의 HE 염색결과, 인슐린, 엑센딘-4, 단백질 그리고 CD4+, CD8+, CD20+을 나타낸 그림이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 분비 신호 펩타이드(secretion signal peptide)를 암호화하는 유전자 및 엑센딘-4(Exendin-4)를 암호화하는 유전자가 작동 가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 벡터를 도입한 췌장소도세포 클러스터를 제공한다.
당뇨병을 치료하기 위하여 인슐린을 지속적으로 분비하도록 췌장소도세포 이식하는 치료법이 이식 후에 인슐린의 주사 없이 당뇨를 치료할 수 있으나, 췌장소도세포를 초기에 이식할 경우 혈관 생성이 원활히 일어나지 않기 때문에 이식 직후 발생하는 저산소 상태(hypoxia)에 의해서 많은 췌장소도세포가 손상(apoptosis)을 받게 되는 문제점이 있다. 본 발명은 엑센딘-4 유전자를 렌티 바이러스를 이용하여 췌장소도세포에 도입하여 췌장소도세포가 지속적으로 엑센딘-4를 분비하여 인슐린 분비 능력을 향상시키고, 동시에 췌장소도 단일세포를 일정 기간 배양한 세포췌장소도세포의 클러스터를 제공하여 이식시 산소 및 영양분의 공급이 원할 하게 이뤄져서 이식 후 췌장소도세포의 세포괴사 및 사멸을 효과적으로 감소시키며 결국 췌장 소도세포를 이식하는 경우보다 더 효과적으로 당뇨를 치료할 수 있다.
상기 췌장소도세포 클러스터는 분비 신호 펩타이드를 암호화하는 유전자 및 엑센딘-4를 암호화하는 유전자가 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 벡터를 도입한 췌장소도 단일세포를 3 일 내지 9 일 동안 배양한 것이 바람직하고, 6 일 동안 배양하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 분비 신호 펩타이드를 암호화하는 유전자는 서열번호 1로 기재되는 염기서열인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
또한 상기 엑센딘-4를 암호화하는 유전자는 서열번호 2로 기재되는 염기서열인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 아울러 상기 벡터는 렌티 바이러스(Lentivirus) 벡터, 레트로 바이러스(Retrovirus) 벡터, 아데노 바이러스(Adenovirus) 벡터, 아데노-어소시에티드 바이러스(Adeno-associated virus) 벡터 및 비-바이러스성 벡터(Non-viral vector)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고, 렌티 바이러스 벡터인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 췌장소도세포 클러스터는 생체 적합성 고분자로 표면 개질하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 표면 개질은 췌장소도세포 이식의 문제점인 면역 반응을 감소시키는 효과가 있다. 상기 생체 적합성 고분자는 PEG(Polyethylene glycol) 또는 PEG 유도체인 것이 바람직하고, PEG-C18인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. PEG는 탄화수소 글리콜이나 물의 탄화수소 산화물의 반응에 의해 얻어질 수 있는 고분자량 중합체이다. 일반적으로 친수성 고분자인 PEG는 폴리에틸렌옥사이드로서도 잘 알려져 있으며, 분자나 표면에 대한 화학적 결합은 생명 공학적으로 매우 유용하다. PEG의 가장 일반적인 형태는 양쪽 끝부분에 하이드록실 기를 갖는 선형 고분자로서 그 구조식은 HO-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH로 표현된다. 이와 같은 구조식의 고분자, 즉 알파, 오메가-디하이드록실 폴리에틸렌글리콜은 HO-PEG-OH로 요약 표기할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, SD 래트에서 뽑은 췌장소도세포를 0.25 %의 트립신-EDTA를 이용하여 단일 세포를 제조하였다. 그리고 단일 세포에 MOI를 12.5로 맞춰서 엑센딘-4 바이러스를 처리해주고 5시간 이후에 세척을 해주고 다시 배양 접시에 담았다. 그리고 12 웰 플레이트에 6 × 105 단일 세포를 담고 6 일 동안 클러스터를 형성할 수 있도록 배양하였다. 본 발명의 분비 신호 펩타이드가 연결된 엑센딘-4 유전자가 도입된 췌장소도세포 클러스터를 EIA 방법을 통해 엑센딘-4 단백질 분비량을 측정한 결과, 췌장소도세포 자체에 유전자를 전달한 것에 비해 엑센딘-4 단백질 분비가 향상되는 것을 확인하였다(도 4).
본 발명의 구체적인 실시예에서, 세포 생존율을 측정한 결과, 유전자를 전달한 것이 월등히 저 산소 상태에서 생존율이 높음을 확인하였다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 대조군은 저, 고 농도의 포도당에 대한 반응성이 상당히 낮았지만, 엑센딘-4 유전자가 도입된 췌장소도세포 클러스터의 경우 반응성은 상당히 향상되었다. 아울러 유전자가 도입된 췌장소도세포 클러스터의 경우에 저 산소 상태에서의 세포 생존율이 대조군에 비해서 훨씬 높게 나타났다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 스트렙토조신(Streptozocin)을 이용하여 유도된 제 1형 C57BL/6 마우스에 500 IEQ의 유전자를 도입하고 PEG로 표면 개질한 췌장소도세포 클러스터를 이식하였다. 분비 신호펩타이드가 연결된 엑센딘-4 유전자가 도입된 췌장소도세포를 췌장에 이식할 경우, 대조군인 췌장소도세포를 이식한 경우보다 췌장소도세포의 개수를 약 1/2로 줄여서 이식하여도 혈당 조절이 일어나는 것을 확인하였다. 그리고 표면 개질을 하고 면역 억제제를 동시에 투여할 경우 이식 후 50 일까지 모든 마우스의 혈당이 200 ㎎/㎗ 이하의 정상치를 유지하고 있었다(도 20 및 도 21).
본 발명의 구체적인 실시예에서, 50 일 이후에 복강으로 포도당 용액을 투입하여 이식받은 췌장소도세포 클러스터의 반응성을 확인해 본 결과 분비 신호펩타이드가 연결된 엑센딘-4 유전자가 도입된 췌장소도세포 클러스터를 이식받은 마우스의 경우 정상 쥐와 유사한 반응을 나타내었다. 즉 이식된 췌장소도세포 클러스터가 50 일까지 혈중 포도당 농도를 조절하고 있음을 확인하였다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 엑센딘-4 유전자가 도입된 췌장소도세포를 이식한 실험동물과 대조군의 엑센딘-4 유전자를 도입하지 않은 췌장소도세포를 이식한 실험동물의 신장을 적출한 후 신장과 이식한 췌장소도세포의 면역 조직 검사를 실시한 결과 30 일이 지나도 지속적으로 엑센딘-4의 분비가 나오는 것을 확인하였고, 인슐린의 분비도 지속적으로 나오는 것을 확인하였다(도 23).
또한 본 발명은,
1) 분비신호 펩타이드(secretion signal peptide)를 암호화하는 유전자 및 엑센딘-4(Exendin-4)를 암호화하는 유전자가 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 벡터를 췌장소도 단일세포에 도입하는 단계; 및
2) 단계 1)의 췌장소도 단일세포를 배양하는 단계를 포함하는 췌장소도세포 클러스터의 제조 방법을 제공한다.
상기 단계 2)의 췌장소도 단일세포 배양은 3일 내지 9일 동안 배양하는 것이 바람직하고, 6일 동안 배양하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에서 췌장소도세포 클러스터를 생체 적합성 고분자로 표면 개질하는 단계를 추가로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 생체 적합성 고분자는 PEG(Polyethylene glycol)인 것이 바람직하고 PEG-C18인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
아울러 본 발명은 본 발명에 따른 췌장소도세포 클러스터를 유효성분으로 함유하는 당뇨병 치료용 조성물을 제공한다.
상기 당뇨병은 제 Ⅰ형 당뇨병 또는 인슐린 의존성 당뇨병인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
당뇨병에 걸린 개체의 췌장에 상기 당뇨병 치료용 조성물을 이식하여 당뇨병을 치료할 수 있고, 상기 당뇨병은 제 Ⅰ형 당뇨병 또는 인슐린 의존성 당뇨병인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 개체는 인간을 포함하는 포유동물, 마우스, 랫드, 돼지, 토끼, 기니아 피그, 햄스터, 개, 고양이, 소 및 염소로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명의 분비 신호 펩타이드가 연결된 엑센딘-4 유전자가 도입된 췌장소도세포는 형광현미경을 통해 엑센딘-4의 발현 여부를 확인하였고, 세포 독성이 없으며, 엑센딘-4 단백질 분비효과가 높을 것을 입증함으로써, 당뇨병 치료용 조성물로 유용하게 이용될 수 있으며, 본 발명의 췌장소도세포를 당뇨병에 걸린 개체의 췌장에 이식한 결과, 포도당에 대한 반응성이 정상 쥐와 유사한 프로파일을 확인하였고, 30일이 지나도 엑센딘-4 및 인슐린의 분비가 지속됨을 확인하였으므로, 당뇨병 치료방법으로 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 췌장소도세포 클러스터의 이식 양은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하다.
본 발명에 따른 췌장소도세포 클러스터는 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제와 병용하여 사용할 수 있다.
이하 실시예를 통해 본 발명의 내용을 보다 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
엑센딘 -4 유전자가 도입된 췌장소도세포 클러스터의 제조
<1-1> 분비신호펩타이드 ( secretion signal peptide ) 및 엑센딘 -4( Exendin -4)를 포함하는 렌티바이러스의 제조
엑센딘-4 cDNA(서열번호 2)를 화학적으로 합성을 하고 pβ 벡터의 EcoRI 및 XbaI 위치에 넣은 후, 분비 신호 펩타이드(서열번호 1)를 pβ-Ex-4의 KpnI 과 EcoRi 위에서 넣어서 pβ-SP-Ex-4를 만들었다. 그리고 퓨린 전달 자리(furin cleavage site; RGRR)를 SP 및 엑센딘-4 cDNA사이에 넣어준 후, SP-Ex-4 단편(fragment)은 pβ-SP-Ex-4를 PCR방법을 이용하여 증폭을 시켰다. 그리고 PCR 유전자 단편(gene fragment)을 pHR’pgk-eGFP 벡터의 EcoRI 위치에 넣어주었다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 재조합된 렌티바이러스는 전이 벡터(transfer vector), pHR’CMV-SP-Ex-4-pgk-eGFP ,및 gag, Pol, Tat와 Rev 단백질을 암호화한 플라스미드(plasmid) pCMV8.91을 1:1:1의 비율로 구성이 되었다(도 1).
<1-2> 분비신호펩타이드가 연결된 엑센딘 -4 유전자를 렌티 바이러스 벡터를 이용하여 췌장소도 단일세포에 도입 및 췌장소도세포 클러스터의 제조
분비 신호펩타이드를 암호화하는 유전자 및 엑센딘-4 유전자(도 1)를 도입한 췌장소도 단일세포를 작은 크기의 췌장소도세포 클러스터를 만들기 위하여 일정기간 배양하였다.
SD rat에서 뽑은 췌장소도세포를 0.25 %의 트립신-EDTA를 이용하여 단일 세포를 제조한다. 그리고 단일 세포에 MOI를 12.5로 맞춰서 엑센딘-4 바이러스를 처리해주고 5시간 이후에 세척을 해주고 다시 배양 접시에 담는다. 그리고 12 웰 플레이트에 6 × 105 단일 세포를 담고 6 일 동안 클러스터를 형성할 수 있도록 배양한다(도 2 및 도 3). 배양 이후 GFP의 발현을 형광 현미경으로 확인했고, 효율을 FACS를 이용하여 측정하였다. 그리고 유전자가 전달된 췌장소도세포 클러스터로부터 분비되는 엑센딘-4양을 EIA 키트를 이용하여 측정해 보았다.
본 발명의 분비 신호 펩타이드가 연결된 엑센딘-4 유전자가 도입된 췌장소도세포 클러스터를 EIA 방법을 통해 엑센딘-4 단백질 분비량을 측정한 결과, 췌장소도세포 자체에 유전자를 전달한 것에 비해 엑센딘-4 단백질 분비가 향상되는 것을 확인하였다(도 4).
시험관 내에서( in vitro ) 엑 센딘 -4 유전자가 전달된 췌장소도세포 클러스터의 포도당에 대한 반응성 평가
KRBB 용액에 저농도 (2.8 mM) 및 고농도 (28 mM)의 포도당(glucose)를 녹여 놓는다. 그리고 엑센딘-4 유전자가 전달된 췌장소도세포 클러스터와 전달되지 않은 대조군 클러스터를 KRBB 저농도 용액에 먼저 담아 두고, 1 시간을 전-처리 후 배지를 채취한다. 그리고 각각의 시료를 고농도의 KRBB 용액에 다시 2 시간 동안 반응시킨다. 그 후 역시 배지를 채취하고 인슐린 ELISA 분석을 이용하여 분비되는 인슐린의 양을 측정하고 외부에 있는 포도당 농도에 따른 인슐린의 분비 양 및 저농도와 고농도의 포도당에 대한 반응 정도를 측정하였다(도 5).
대조군으로 사용된 췌장소도세포 클러스터의 경우는 저, 고 농도의 포도당에 대한 반응성이 상당히 낮았지만, 엑센딘-4 유전자가 도입된 췌장소도세포 클러스터의 경우 반응성은 상당히 향상되었다.
시험관 내에서( in vitro ) 저 산소상태( hypoxia )에서 엑센딘 -4가 도입된 췌장소도세포의 항괴사능력 평가
100 IEQ의 췌도세포 클러스터와 유전자가 전달된 췌도세포 클러스터를 96 웰 배양 플레이트에 넣고 24 시간 동안 CO2 인큐베이터에서 배양시킨 후 CCK-8 분석을 통해서 생존율을 평가하였고, Living/Dead Viability/Cytotoxicity Kit(Molecular Probe, Invitrogen Co.)를 이용하여 정성적인 생존율을 평가하였다. 유전자가 도입된 췌장소도세포 클러스터의 경우에 저 산소 상태에서의 세포 생존율이 대조군에 비해서 훨씬 높게 나타났다(도 6 내지 도 8).
그리고 저 산소 상태에서의 생존율을 보기 위해서 다시 100 IEQ를 96 웰 배양 플레이트에 담고 24 시간 동안 1 %의 산소 상태의 인큐베이터에서 24 시간 인큐베이션 이후에 caspase-3/7의 양을 확인하였다(도 9).
PEG - C18 을 이용한 유전자가 도입된 췌장소도세포 클러스터의 표면 개질 및 이것의 제 1 형 당뇨 모델에 이식
유전자가 도입된 췌장소도세포 클러스터에 1 %의 농도로 FITC가 연결된 PEG-C18을 배양 접시에 처리를 하고 1 시간 동안 반응시킨 후 세척하였다. 그리고 공초점 레이저 현미경을 이용하여 췌장소도세포 클러스터 주위의 표면의 개질의 정도를 확인해 본 결과, 충분히 전체적으로 표면 개질이 이루어진 것을 확인하였다(도 15).
그리고 스트렙토조신(Streptozocin)을 이용하여 유도된 제 1형 C57BL/6 마우스에 500 IEQ의 유전자를 도입하고 PEG로 표면 개질한 췌장소도세포 클러스터를 이식하였다(도 19). 그리고 항-CD154 mAb(복강주사, 이식 후 0, 2, 4, 그리고 6일 째) 및 면역 억제제인 타클로리무스(FK506, 복강주사, 매일) 약물을 주입하였다.
생체 내에서( in vivo ) 엑센딘 -4 유전자가 전달되고 PEG 를 이용하여 표면 개질된 췌장소도세포 클러스터의 혈당 조절 및 포도당에 대한 반응성 평가
분비 신호펩타이드가 연결된 엑센딘-4 유전자가 도입된 췌장소도세포를 췌장에 이식할 경우, 대조군인 췌장소도세포를 이식한 경우보다 췌장소도세포의 개수를 약 1/2로 줄여서 이식하여도 혈당 조절이 일어나는 것을 확인하였다. 그리고 표면 개질을 하고 면역 억제제를 동시에 투여할 경우 이식 후 50 일까지 모든 마우스의 혈당이 200 ㎎/㎗ 이하의 정상치를 유지하고 있었다(도 20 및 도 21).
50일 이후에 복강으로 포도당 용액을 투입하여 이식받은 췌장소도세포 클러스터의 반응성을 확인해 본 결과 분비 신호 펩타이드가 연결된 엑센딘-4 유전자가 도입된 췌장소도세포 클러스터를 이식받은 마우스의 경우 정상 쥐와 유사한 반응을 나타내었다. 즉 이식된 췌장소도세포 클러스터가 50 일까지 혈중 포도당 농도를 조절하고 있음을 확인하였다.
췌장 소도세포를 이식받은 신장의 조직 검사
엑센딘-4 유전자가 도입된 췌장소도세포를 이식한 실험동물과 대조군의 엑센딘-4 유전자를 도입하지 않은 췌장소도세포를 이식한 실험동물의 신장을 적출한 후 신장과 이식한 췌장소도세포의 면역 조직 검사를 실시하였다.
적출한 신장을 4 % 포르말린(formalin) 용액으로 고정시키고, 파라핀(parafin)에 조직 시료를 담근 후 마이크로톰(microtome)을 이용하여 4 um의 두께로 잘라서 슬라이드 글래스(Slide glass)에 올려놓았다. 그리고 만들어진 시료를 자일렌(Xylene) 용액에 담가 파라핀을 제거하고 HE 염색을 실시하였다. 그리고 적출한 신장과 이식된 췌장 소도의 인슐린 및 엑센딘-4 단백질의 분비 여부를 면역 염색법을 통하여 확인하였다(도 23).
분비 신호펩타이드가 연결된 엑센딘-4가 도입된 췌장소도세포를 이식한 실험동물의 면역조직 검사를 실시한 결과, 30일이 지나도 지속적으로 엑센딘-4의 분비가 나오는 것을 확인하였고, 인슐린의 분비도 지속적으로 나오는 것을 확인하였다(도 23).
<110> Seoul national university R and DB foundation <120> Secretion signal peptide linked Exendin-4 gene transduced pancreatic islet cluster for treatment of type 1 diabetes <130> 11p-04-31 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> secretion signal peptide sequence <400> 1 atgaagatca tcctgtggct gtgtgtgttc ggcctgttcc tggccaccct gttccccatc 60 agctggcaga tgcccgtgga gtccggcctg tcctccgagg actccgccag ctccgagagc 120 ttcgccg 127 <210> 2 <211> 135 <212> DNA <213> Heloderma suspectum <400> 2 atgcggggac ggcggcatgg tgaaggaaca tttaccagtg acttgtcaaa acagatggaa 60 gaggaggcag tgcggttatt tattgagtgg cttaagaacg gaggaccaag tagcggggca 120 cctccgccat cgtga 135

Claims (12)

  1. 분비 신호 펩타이드(secretion signal peptide)를 암호화하는 유전자 및 엑센딘-4(Exendin-4)를 암호화하는 유전자가 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 벡터를 도입한 췌장소도세포 클러스터.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 췌장소도세포 클러스터는 분비 신호 펩타이드를 암호화하는 유전자 및 엑센딘-4를 암호화하는 유전자가 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 벡터를 도입한 췌장소도 단일세포를 3일 내지 9일 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 췌장소도세포 클러스터.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 췌장소도세포 클러스터는 생체 적합성 고분자로 표면 개질한 것을 특징으로 하는 췌장소도세포 클러스터.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 생체 적합성 고분자는 PEG(Polyethylene glycol)인 것을 특징으로 하는 췌장소도세포 클러스터.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 PEG는 PEG-C18인 것을 특징으로 하는 췌장소도세포 클러스터.
  6. 1) 분비 신호 펩타이드(secretion signal peptide)를 암호화하는 유전자 및 엑센딘-4(Exendin-4)를 암호화하는 유전자가 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 벡터를 췌장소도 단일세포에 도입하는 단계; 및
    2) 단계 1)의 췌장소도 단일세포를 배양하는 단계를 포함하는 췌장소도세포 클러스터의 제조 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 단계 2)의 췌장소도 단일세포의 배양은 3일 내지 9일 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 6항에 있어서, 췌장소도세포 클러스터를 생체 적합성 고분자로 표면 개질하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 생체 적합성 고분자는 PEG(Polyethylene glycol)인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 PEG는 PEG-C18인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1항의 췌장소도세포 클러스터를 유효성분으로 함유하는 당뇨병 치료용 조성물.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 당뇨병은 제 Ⅰ형 당뇨병인 것을 특징으로 하는 방법.
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