KR20120128634A - 통증에 관여하는 화합물의 식별과 관련된 방법 및 용도，및 통각과민증의 진단 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 통증에 관여하는 화합물의 식별 방법, 통증에 관여하는 화합물을 식별하기 위한 Il2rg 핵산 또는 Il2rg 단백질의 용도 및 이와 관련된 통각과민증의 진단 방법에 관한 것이다.

Description

통증에 관여하는 화합물의 식별과 관련된 방법 및 용도，및 통각과민증의 진단 방법{METHODS AND USES RELATING TO THE IDENTIFICATION OF COMPOUND INVOLVED IN PAIN AS WELL AS METHODS OF DIAGNOSING ALGESIA}

본 발명은 통증에 관여하는 화합물을 식별하는 방법, 통증에 관여하는 화합물을 식별하기 위한 Il2rg 핵산 또는 Il2rg 단백질의 용도 및 이와 관련된 통각과민증의 진단 방법에 관한 것이다.

신체적 통증은 유해자극 또는 신체위해의 불쾌한 자각으로서 설명될 수 있는 통상적인 감각 경험이다. 각 개인은 다양한 일상의 아픔과 고통에 의해 통증을 경험하고 때로는 보다 더 심각한 상해 또는 질병을 통해 통증을 경험한다. 과학적이고 임상적인 목적을 위해 국제통증연구학회(IASP)는 통증을 "실질적이거나 잠재적인 조직 손상과 연관되거나 이와 같은 손상의 관점에서 설명된 감각적이고 감정적인 경험"으로서 규정한다.

미국에서 의사에게 진료를 받는 가장 흔한 이유는 임의의 유형에 따른 통증에서 비롯되며 이로 인해 미국민 전체의 절반은 매년 병원을 찾는다. 통증은 많은 의학적 상태에서 주된 증상이며 개인의 삶의 질과 일상적 생활을 상당부분 저해한다. 진단은 신체에서의 통증 기간, 세기, 유형(무지근하게 아픈 둔통, 화끈거리며 따가운 통증, 욱신거리는 통증 또는 찌르는 듯한 통증), 원인 또는 부위에 따라 다양한 방식으로 통증을 특성화하는 것을 기초로한다. 보통 통증은 치료하지 않고서 멈추거나 휴식 또는 진통제 처방과 같은 단순 조치에 반응하며, 이와 같은 통증은 "급성" 통증이라고 한다. 그러나, 통증은 다루기가 쉽지 않을 수 있고, 만성 통증이라고 하는 상태로 발전할 수 있는데, 이러한 만성 통증은 더 이상 증상으로 간주하기보다는 그 자체로 질병으로 고려된다. 최근 몇년 동안에 통증 연구가 약물학, 신경생물학, 간호학, 치과의학, 물리치료학 및 심리학과 같은 많은 다른 분야에서 관심의 대상이 되었다.

통증은 신체 방어체계의 일부로서 아픈 자극에 위축하는 반사적인 반응이고 장래에 그러한 특정 유해한 상황에 대하여 더욱 더 회피할 수 있도록 행동을 조절하는데 기여한다.

의학적 통증 관리는 급성 통증과 만성 통증으로 구분하여 이루어진다. 급성 통증은 발가락을 다쳤거나, 뼈가 부러졌거나, 치통을 앓고 있거나, 확대 외과적 수술후 걸을때 느끼는 경우와 같은 "정상적인" 통증이다. 만성 통증은 매일 또는 매달 느끼며 치료가 불가능할 것 같은 "통증 질환"이다.

일반적으로, 의사들은 보통 다른 원인 가운데 연조직 손상, 감염 및/또는 염증에 의한 급성 통증을 치료하는 것을 보다 수월하게 생각한다. 보통 급성 통증은 흔히 진통제와 같은 약물이나 통증 원인을 제거하고 통증 감각을 조절하는데 적절한 기술에 의해 자발적으로 치료된다. 급성 통증을 적절히 치료하지 못한 경우는 일부 경우에 만성 통증을 유발할 수 있다.

통증의 치료를 위한 일련의 약물이 알려져 있다. 그러나, 알려져 있는 진통제와 연관된 흔한 문제점은 부작용과 내성이다. 따라서, 미국인의 성인을 대상으로 조사한 결과 보완적 대체 약물을 사용하는 가장 흔한 이유가 통증으로 밝혀진 것은 놀라운 사실이 아니다.

이것은 통증 치료를 위한 새로운 방법 및 표적이 여전히 필요하다는 것을 입증한다.

놀랍게도, 본 발명자들에 의해 Il2rg가 통증에 연루되어 있음이 발견되었다. 통증에 관여하는 유전자들의 식별을 위한 선별 검정에서 통증 감각이 다른 3개의 스트레인(strain)의 상이한 근교배 마우스 스트레인이 검사되었다. 여러 유전자의 발현이 마우스 스트레인의 통증 감각과 상관성이 있었다. 통증 감각 및 유전자 발현간의 최상의 상관성을 보인 유전자는 Il2rg이었다(실시예 참조). 따라서, Il2rg는 통증에 관여하는 화합물의 식별 및 통각과민증의 진단을 위한 관심 대상이다.

따라서, 본 발명은 첫번째 및 두번째 측면으로서 통증에 관여하는 화합물을 식별하는 방법을 제공하며, 본 발명의 방법은

a) Il2rg 핵산 또는 Il2rg 단백질 또는 이의 기능상 활성 변이체를 포함하는 시험 시스템을 제공하는 단계,

b) 상기 시험 시스템을 시험 화합물과 접촉시키는 단계 및

c) 상기 시험 시스템에 대한 상기 시험 화합물의 효과를 측정하는 단계

를 포함하며,

여기에서, 대조군과 비교하여 상기 시험 시스템에 대한 상기 시험 화합물의 유의적인 효과가 검출되는 경우, 상기 시험 화합물이 통증에 관여하는 화합물로서 식별된다.

본 발명의 첫번째 측면은 Il2rg 핵산을 포함하는 시험 시스템에 관한 것이며, 본 발명의 두번째 측면은 Il2rg 단백질 또는 이의 기능상 활성 변이체를 포함하는 시험 시스템에 관한 것이다.

본 발명의 시험 시스템은 통증에 관여하는 기전을 밝히는데 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 시험 시스템은 Il2rg 핵산 또는 단백질과 상호작용하는, 특히 Il2rg 핵산 또는 단백질을 활성화하거나 불활성화시키는 통증 연루 물질을 개발, 식별 및/또는 확인하는데 사용될 수 있다. 식별된 물질은 통증 치료, 특히 신경질환 통증 치료에 사용될 수 있는 치료 약물의 후보일 수 있다. 또한, Il2rg는 통각과민증의 진단에 사용될 수 있다.

당해 분야에는 본 발명의 시험 시스템이 응용될 수 있는 다양한 시험 디자인이 알려져 있다. 시험 예에 대한 세부 내용은 본 발명의 방법에서 제시된다. 본 발명의 시험 시스템은 이와 같은 시험 시스템에 대한 시험 화합물의 효과를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 숙련가는 예를 들면 널리 이용되고 있는 방법에서 필요로 하는 물질을 추가로 첨가함으로써 특정 시험 방법에 적합한 시험 시스템을 디자인할 수 있을 것이다.

Il2rg 핵산 또는 단백질 또는 이의 기능상 활성 변이체 이외에, 본 발명의 시험 시스템은 한 가지 이상의 추가 성분을 포함할 수 있다. 시험 디자인 및 검출 방법에 따라서 본 발명의 시험 시스템은 예를 들면 공지된 Il2rg 리간드, Il2rg 신호 전달의 성분, 검출 수단 등을 포함할 수 있다. 숙련가는 본 발명의 시험 시스템을 연구 디자인에 채용할 수 있다. 즉, 적합한 완충제, 보조인자, 기질, 한 가지 이상의 다른 항체, 마커, 효소 또는 기타 필요한 임의의 물질이 선택될 수 있다. 시험 시스템은 널리 이용되고 있는 조건에 맞게 세포 시스템 또는 무세포 시스템일 수 있다.

본 발명에 따른 방법의 제1 단계에서 Il2rg 핵산 (예, Il2rg 유전자 또는 Il2rg cDNA 또는 Il2rg mRNA 또는 Il2rg 프로모터) 또는 단백질을 포함한 시험 시스템이 제공된다.

Il2rg 유전자는 다양한 인터루킨의 수용체의 공통 아단위를 암호화한다. 바람직한 명칭은 인터루킨 2 수용체 감마 쇄 또는 짧은 IL-2R 감마 쇄이다. 다른 명칭은 인터루킨 2 수용체, 감마 (중증복합면역결핍증), 감마 C 수용체, 공통 감마 쇄, 공통 사이토킨 수용체 감마 쇄, 사이토킨 수용체 공통 감마 쇄 또는 짧은 감마-C, p64 또는 CD132 항원이다.

Il2rg 단백질은 적어도 6 가지의 상이한 인터루킨 수용체(IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, IL-21 및 아마도 또한 IL13 수용체)의 수용체 복합체에 공통적인 사이토킨 수용체 아단위이다. Il2rg 단백질은 I형 사이토킨 수용체 계열 (5형 아계열)의 일원이다. 이 단백질은 대부분의 림프구(백혈구) 군에서 발현된다. Il2rg 단백질은 세포외, 경막 및 세포질 도메인을 갖는 통합성 단일통과 I형 막 단백질이다. Il2rg 단백질은 II2ra 및 II2rb 쇄와 고 친화성 II-2 수용체를 형성하고 II2rb 쇄와 중간 친화성 II-2 수용체를 형성한다. b와 g 쇄의 헤테로이량체화는 II-2 신호 전달을 위해 필요하고 g 쇄는 호르몬 수용체 복합체의 내재화를 위해 필요하다. Il2rg 단백질을 발현하는 림프구는 한 세포에서 다른 세포로 신호를 전송하고 세포 분화의 프로그램을 감독하는 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-21을 포함한 사이토킨 수용체에 대한 기능성 수용체를 형성할 수 있다. Il2rg 단백질은 인터루킨 자극에 의해 SHB와 상호작용하고 HTLV-1 악세서리 단백질 p12I와 상호작용한다.

Il2rg 단백질의 결손은 X-연관된 중증복합면역결핍증 (X-연관된 T-세포-음성/B-세포-양성/NK-세포-음성; XSCID)의 주원인이며, 이 질환은 체액성과 세포매개성 면역 모두의 이상, 백혈구 감소증 및 항체 저수준 또는 무항체에 의해 특징적으로 나타나는 사람의 희귀 선천질환의 유전학적 및 임상학적 이종 군인 무감마글로불린혈증 스위스형으로도 알려져 있다. 환자들은 면역 기능이 전혀 없고 유아에게 기회성 유기체에 의한 감염이 지속적 재발하여 나타난다. Il2rg 단백질의 무생성을 초래하거나 신호 전달 세포질 도메인의 결실을 유도하는 돌연변이가 그러한 장애를 유발한다. 모든 유형의 SCID의 공통된 특징은 T-세포 발생의 결함에 기인하는 T-세포-매개된 세포성 면역이 없다는 점이다. IL-7 및 IL-15로부터 중요한 발생 신호가 없으면 T-세포 및 NK 세포 군이 각각 발생하지 못한다. 덜 불행한 경우인 Il2rg 유전자의 결손은 X-연관된 복합 면역결핍증(X-CID)을 초래할 수 있으며, 이 질환은 XSCID에서 나타나는 경우보다 세포성 및 체액성 면역의 결핍 정도가 덜 심해서 면역결핍증세가 덜 심각하다.

사람 Il2rg 단백질은 369개의 아미노산으로 구성된다(참조: UniProtKB/Swiss-Prot P31785 (IL2RG_HUMNA; 서열번호 1)). 아미노산 1-22는 신호 펩타이드이고, 아미노산 23-369는 Il2rg 단백질의 성숙 형태이다. 아미노산 23-262는 세포외 영역을 형성하고, 아미노산 263-283은 경막 영역을 형성하며, 아미노산 284-369는 세포질 도메인을 형성한다. 피브로넥틴 III형 도메인은 아미노산 154-241을 포함한다. 아미노산 237-241은 WSXWS 모티프를 구성하고 아미노산 286-294는 박스 1 모티프를 구성한다. 발현된 서열은 성숙 형태로 추가로 처리된다. WSXWS 모티프는 적절한 단백질 폴딩을 위해 필요하며, 이에 따라 효율적인 세포내 수송 및 세포-표면 수용체 결합을 가능케 한다. 박스 1 모티프는 JAK 상호작용 및/또는 활성화를 위해 필요하다.

10 20 30 40 50 60

MLKPSLPFTS LLFLQLPLLG VGLNTTILTP NGNEDTTADF FLTTMPTDSL SVSTLPLPEV

70 80 90 100 110 120

QCFVFNVEYM NCTWNSSSEP QPTNLTLHYW YKNSDNDKVQ KCSHYLFSEE ITSGCQLQKK

130 140 150 160 170 180

EIHLYQTFVV QLQDPREPRR QATQMLKLQN LVIPWAPENL TLHKLSESQL ELNWNNRFLN

190 200 210 220 230 240

HCLEHLVQYR TDWDHSWTEQ SVDYRHKFSL PSVDGQKRYT FRVRSRFNPL CGSAQHWSEW

250 260 270 280 290 300

SHPIHWGSNT SKENPFLFAL EAVVISVGSM GLIISLLCVY FWLERTMPRI PTLKNLEDLV

310 320 330 340 350 360

TEYHGNFSAW SGVSKGLAES LQPDYSERLC LVSEIPPKGG ALGEGPGASP CNQHSPYWAP

PCYTLKPET (서열번호 1).

일련의 아미노산 변형이 존재한다: 아미노산 161 및/또는 292는 포스포트레오닌 잔기일 수 있고, 아미노산 325는 포스포티로신 잔기일 수 있다. 당화가 아미노산 24, 71, 75, 84, 159 및 249에서 발생할 수 있다 (모두 N-연결). 디설파이드 결합이 아미노산 62와 72, 102와 115 및 182와 231 사이에서 발생할 수 있다.

일련의 천연 변이체가 보고되었고 다음을 포함한다:

39 D → N (VAR_002668) (XSCID에서), 44 T → S (VAR_059301), dbSNP, 62 C → G (VAR_002669) (XSCID에서), 68 E → G (VAR_002670) (XSCID에서), 68 E → K (VAR_002671) (XSCID에서), 84 N → K (VAR_002672) (XSCID에서), 89 Y → C (VAR_002673) (XSCID에서), 105 Y → C (VAR_002674) (XSCID에서), 109 E → K (VAR_020611), dbSNP, 114 G → D (VAR_002675) (XSCID에서), 115 C → F (VAR_002676) (XSCID에서), 115 C → R (VAR_002677) (XSCID에서), 123 H → P (VAR_002678) (XSCID에서), 125 Y → N (VAR_002679) (XSCID에서), 144 Q → P (VAR_002680) (XSCID에서), 153 I → N (VAR_002681) (XSCID에서), 156 A → V (VAR_002682) (XSCID에서), 162 L → H (VAR_002683) (XSCID에서), 172 L → P (VAR_002684) (XSCID에서), 172 L → Q (VAR_002685) (XSCID에서), 182 C → R (VAR_002686) (XSCID에서), 183 L → S (VAR_002687) (XSCID에서), 222 R → C (VAR_002688) (XSCID에서), 224 R → W (VAR_002689) (XSCID에서), 226 R → C (VAR_002690) (XSCID에서), 226 R → H (VAR_002691) (XSCID에서), 227 F → C (VAR_002692) (XSCID에서), 230 L → P (VAR_002693) (XSCID에서), 231 C → Y (VAR_002694) (XSCID에서), 232 G → R (VAR_002695) (XSCID에서), 237 W → WQHW (VAR_002696) (XSCID에서), 240 W → C (VAR_002697) (XSCID에서), 241 S → I (VAR_002698) (XSCID에서), 270 M → R (VAR_002699) (XSCID에서), 285 R → Q (VAR_002701) (XSCID에서) 및 293 L → Q (VAR_002702) (XSCID에서).

또한, 41개의 추가의 SNP가 보고되었다.

이 유전자는 포유동물의 X-염색체에 위치한다.

또한, 아래의 종들에서 변이체들이 예시된다:

따라서, 용어 Il2rg는 또한 천연 변이체도 포함한다.

비천연 변이체가 한정된 수의 아미노산 결실, 삽입 및/또는 치환, 특히 대략 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 아미노산의 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 수득될 수 있다.

본 발명의 Il2rg 변이체는 이 변이체가 생물학적 기능, 예를 들면 통증과의 연관성(예: 통증 표현형 "기계적 통각과민증과민증"의 표출) 또는 고전보체경로를 유지한다는 점에서 기능적 활성 변이체임을 주지해야 한다. 바람직하게는, 생물학적 기능의 유지는 천연 Il2rg의 활성의 50% 이상, 바람직하게는 60% 이상, 더 바람직하게는 70%, 80% 또는 90% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 95% 이상을 나타내는 것으로 정의된다. 생물학적 활성은 숙련가에게 알려져 있는 바와 같이 결정할 수 있다. 예를 들면, 통증 표현형 "기계적 통각과민증과민증"의 증세는 실시예 및 문헌[참조: Persson et al., 2009, Molecular Pain 5:7]에 자세히 설명된 바와 같이 결정할 수 있다.

변이체는 추가의 성분을 포함하기 위해 변형될 수 있다. 따라서, 변이체는 본원에 상세히 기술된 천연 Il2rg 단백질 또는 이의 변이체와 한 가지 이상의 추가 성분으로 구성된 도메인을 갖는 분자일 수 있다. 한 가지 바람직한 양태로서 변이체는 (i) Il2rg 단백질 또는 기능적 활성 변이체 및 (ii) 추가의 단백질 성분을 포함한 융합 단백질일 수 있다. 예를 들면, 단백질은 정제 목적으로 사용된 태그(예: 6 His(또는 헥사히스) 태그, Strep 태그, HA 태그, c-myc 태그 또는 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST) 태그)와 같은 마커에 커플링될 수 있다. 만일 예를 들면 고도로 정제된 Il2rg 단백질 또는 변이체가 필요한 경우, 이중 또는 다중 마커(예: 상기 마커 또는 태그의 조합)가 사용될 수 있다. 이 경우에 단백질은 제1 태그의 친화성에 이어서 제2 태그의 친화성을 각각 사용하는 둘 또는 그 이상의 분리 크로마토그래피 단계로 정제된다. 이와 같은 이중 또는 다중 태그의 예는 GST-His-태그(폴리히스티딘-태그에 융합된 글루타티온-S-트랜스퍼라제), 6xHis-Strep-태그(Strep-태그에 융합된 6개 히스티딘 잔기), 6xHis-태그 100-태그(포유류 MAP-키나제 2의 12-아미노산 단백질에 융합된 6개 히스티딘 잔기), 8xHis-HA-태그(해마글루티닌-에피토프-태그에 융합된 8개 히스티딘 잔기), His-MBP(말토즈-결합 단백질에 융합된 His-태그), FLAG-HA-태그(해마글루티닌-에피토프-태그에 융합된 FLAG-태그) 및 FLAG-Strep-태그를 포함한다. 마커는 태그된 단백질을 검출하기 위해 사용될 수 있고, 특정 항체들이 사용될 수 있다. 적합한 항체는 항-HA(예: 12CA5 또는 3F10), 항-6 His, 항-c-myc 및 항-GST를 포함한다. 또한, Il2rg 단백질은 다른 부류의 마커, 예를 들면 Il2rg의 검출을 가능케 하는 형광 마커 또는 방사성 마커에 연결될 수 있다. 추가의 양태로서, Il2rg는 융합 단백질의 일부일 수 있으며 여기서 제2 부분은 예를 들면 효소 활성을 갖는 단백질 성분으로서 검출을 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 양태로서, Il2rg 변이체는 여전히 기능적으로 활성을 나타내는 Il2rg 단편일 수 있다. 이것은 짧은 내부 및/또는 C- 및/또는 N-말단 결실(예: 대략 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 아미노산의 결실)을 갖는 Il2rg 단백질을 포함할 수 있다. 추가로, Il2rg 단편은 Il2rg 단백질에 대해 위에서 상세히 설명한 바와 같이 추가로 변형될 수 있다.

다른 방법으로 또는 추가의 방법으로, 상기 Il2rg 단백질 또는 이의 변이체는 한 가지 이상의 아미노산 치환(들)을 포함할 수 있다. 그러나, 아미노산이 화학적으로 연관된 아미노산으로 치환되는 반보존적 및 특히 보존적 아미노산 치환이 바람직하다. 통상적인 치환은 지방족 아미노산, 지방족 하이드록실 측쇄를 갖는 아미노산, 산성 잔기를 갖는 아미노산, 아미드 유도체, 염기성 잔기를 갖는 아미노산 또는 방향족 잔기를 갖는 아미노산 중에서 이루어진다. 통상적인 반보존적 및 보존적 치환은 다음과 같다:

A, F, H, I, L, M, P, V, W 또는 Y가 C로 변형되는 것은 새로운 시스테인이 유리된 티올을 갖는 경우 반보존적이다. 또한, 숙련가는 입체적 요구성 위치의 글리신이 치환되서는 않되며 P는 알파-나선 또는 베타-시트 구조를 갖는 단백질의 부분내로 도입되서는 않된다는 것을 이해할 것이다.

치환을 갖는 Il2rg 단백질 또는 단편 또는 변이체는 위에서 Il2rg 단백질 또는 단편 또는 변이체에 대해 상세히 기술한 바와 같이 변형될 수 있다. 본 발명의 아래 설명에서 Il2rg 단백질에 관한 모든 상세한 내용은 또한 달리 언급되지 않는 한 이의 기능적 활성 변이체에 관한 것이다.

Il2rg 단백질의 상기 변형들은 조합될 수 있음을 주지해야 한다. 본 발명의 변이체는 예를 들면 마커가 융합된 Il2rg의 단편 또는 한 가지 이상의 아미노산 치환을 포함하는 Il2rg 단백질 단편일 수 있다.

그러나, 가장 바람직한 Il2rg 단백질은 앞서 상세히 설명한 천연 Il2rg 단백질이며, 훨씬 더 바람직한 Il2rg 단백질은 천연 사람 Il2rg 단백질(서열번호 1)이다.

용어 Il2rg 핵산은 상기 Il2rg 단백질뿐만 아니라 (본원에 기술된) 이의 천연 및 비천연 변이체를 암호화하는 핵산을 포함한다. 바람직하게는, 상기 용어는, Il2rg 유전자에 대해 특이적이 되도록 적절한 크기를 갖는 부분에 해당하는 Il2rg 유전자의 암호 영역 또는 비암호 영역을 내포한다. 이들 영역의 예는 인트론, 엑손 또는 조절요소(예: Il2rg 프로모터)이다.

가장 바람직한 Il2rg 핵산은 앞서 상세히 설명된 천연 Il2rg 단백질을 암호화한 것이고, 훨씬 더 바람직한 Il2rg 핵산은 천연 사람 Il2rg 단백질(서열번호 1)을 암호화하는 것이다. 핵산은 유전 정보를 보유한 단량체 뉴클레오타이드의 쇄로 구성된 임의의 거대분자일 수 있거나 세포내에서 구조체를 형성할 수 있다. 가장 흔한 (이에 따라 바람직한) 핵산은 데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)이다. 가장 바람직하게는, 용어 Il2rg 핵산은 Il2rg 유전자, 프로모터, DNA, cDNA 또는 mRNA을 내포한다.

합성된 핵산은 펩타이드 핵산(PNA), 모르폴리노 및 잠긴 핵산(LNA)뿐만 아니라 글리콜 핵산(GNA) 및 트레오즈 핵산(TNA)를 포함한다. 이들 각각은 천연 DNA 또는 RNA와 분자 골격의 변화에 의해 구분된다.

본 발명의 방법의 제2 단계에서 Il2rg 핵산 또는 단백질 또는 이의 기능적 활성 변이체를 포함하는 시험 시스템은 물질 또는 시험 화합물과 시험 시스템에 영향을 미치고 그 물질 또는 시험 화합물을 검출하기에 적합한 시간 동안 및 조건하에서 접촉된다.

적합한 조건은 예를 들면 관여하는 단백질의 변성을 피하거나 존재하는 경우 생존 세포를 유지하는데 적절한 온도 및 용액을 포함한다. 적합한 조건은 선택된 특정 시험 시스템에 의해 좌우되며 숙련가는 자신의 일반적인 지식을 바탕으로 특정 시험 시스템을 선택할 수 있다. 배양 단계는 약 5초 내지 수 시간, 바람직하게는 약 5분 내지 약 24시간의 범위에서 다양할 수 있다. 그러나, 배양 시간은 검정 방식, 마커, 용액 용적, 농도 등에 의해 좌우된다. 검정은 예를 들면 10℃ 내지 40℃의 온도 범위에서 수행될 수 있으나 보통은 주변 온도에서 수행한다.

본 발명의 시험 시스템에서 시험되는 물질은 어떠한 화학적 성질을 가진 어떠한 시험 물질 또는 시험 화합물도 가능할 수 있다. 피검 물질은 이미 질병 치료 약물 또는 약제로 알려진 것일 수 있다. 또한, 피검 물질은 다른 양태로서 치료 효과가 아직 밝혀지지 않은 공지 화합물일 수 있거나 신규한 또는 지금까지 알려지지 않은 화합물일 수 있다. 피검 물질은 또한 시험 물질 또는 시험 화합물의 혼합물일 수 있다.

본 발명에 따른 선별 방법의 한 가지 양태로서, 피검 물질은 화합물 라이브러리의 형태로 제공된다. 화합물 라이브러리는 다수의 화합물을 포함하며 화학적 합성 분자 또는 천연 생성물을 포함한 다수의 임의 출처로부터 집합되거나 화학 기술의 조합에 의해 생성된다. 이들은 고처리량 선별(high-throughput screening)에 특히 적합하고 특정 구조의 화합물 또는 식물과 같은 특정 유기체의 화합물로 구성될 수 있다. 본 발명과 관련하여 바람직한 화합물 라이브러리는 단백질 및 폴리펩타이드 또는 유기 소분자를 포함한 라이브러리이다. 바람직한 유기 소분자는 500 달톤 미만의 크기이며, 특히 가용성 비-올리고머 유기 화합물이다.

본 발명에 따른 방법의 제3 단계에서, 시험 시스템에 대한 시험 화합물의 효과가 검출된다. 일련의 상이한 검출 시스템이 아래에서 보다 상세히 설명될 것이다. 그러나, 이들은 예시적인 것이며 다른 시험 시스템 및 방법이 또한 적절할 수 있음을 이해하여야 한다.

만일 시험 화합물이 시험 시스템에 특정적이고 유의적인 효과를 나타내는 경우, 이 시험 화합물은 통증에 관여하는 화합물로서 식별된다. 이를 위해, 시험 화합물의 효과는 대조군, 특히 음성 대조군과 비교된다.

대조군은 의도하지 않은 효과(예: 배경 신호)를 제거하거나 최소화할 수 있기 때문에 시험 방법의 일부이다. 조절된 실험은 특정 시스템에 대한 변수의 효과를 연구하기 위해 사용된다. 조절된 실험에서 한 세트의 시료는 변형되었거나 변형된 것으로 확신되는 것이고 다른 세트의 시료는 변화가 없을 것으로 예상되거나(음성 대조군) 뚜렷한 변화를 보일 것으로 예상된다(양성 대조군). 대조군은 피검 물질과 함께 수행되는 한 시험에서 결정될 수 있다. 대조군은 시험 화합물의 효과를 측정하기 전 또는 후에 측정될 수 있거나 이미 알고 있는 값일 수 있다.

시험 시스템에 영향을 미치는 시험 화합물은 시험 시스템의 신호를 변경시키거나, 증가시키거나 감소시키는 결과를 제공할 수 있다. 본 발명과 관련하여, 시험 화합물과 접촉된 시험 시스템이 대조군(시험 화합물과 접촉되지 않은 시험 시스템)의 신호보다 유의적으로 낮거나 높은 신호를 발생하는 경우 그 시험 화합물은 대조군과 비교하여 효과를 나타낸 것이다. 당업자는 양쪽 값들이 서로 유의적으로 다른 것인지를 평가하는 통계적 절차(예: 스튜던츠 티-검정 또는 카이제곱 검정)를 알고 있다. 또한 숙련가는 적절한 대조군을 선정하는 방법을 알고 있다.

바람직한 양태로서, 시험 시스템의 신호는 시험 화합물에 의해 양성이든 또는 음성이든 대조군의 10% 이상, 바람직하게는 25% 이상, 더욱 바람직하게는 50% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 75% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상까지 변경된다.

본 발명의 방법을 위해 어떠한 적합한 검출 방법도 사용될 수 있다. 적합한 방법의 선택은 시험 시스템의 특징 및 피검 물질에 의해 좌우될 수 있다.

상기 방법은 이종 또는 동종 검정일 수 있다. 본원에서 사용된 이종 검정은 한 가지 이상의 세척 단계를 포함하는 검정인 반면 동종 검정은 그러한 세척 단계가 필요하지 않다. 시약 및 화합물이 단지 혼합되고 측정된다.

시험 방법은 연속 검정 또는 불연속 검정일 수 있다. 연속 검정은 별도의 작업을 필요로 하지 않고서 반응 속도를 제공한다. 연속 검정은 다른 많은 유형이 있다. 분광광도계 검정에서, 흡광도의 변화를 측정함으로써 반응 과정을 추적한다. 형광은 분자가 다른 파장의 빛을 흡수한 후 한 가지 파장의 빛을 방출할때 발생한다. 형광 검정은 효소 반응을 측정하기 위해 생성물로부터 기질의 형광차를 이용한다. 이들 검정은 일반적으로 분광광도 검정에 비해 훨씬 더 민감하지만 불순물에 의해 발생되는 간섭 및 많은 형광 화합물이 빛에 노출될때의 불안정성을 겪을 수 있다. 열량측정법은 화학 반응에 의해 방출되거나 흡수되는 열을 측정하는 것이다. 이들 검정은 많은 반응에서 열의 일부 변화가 발생하고 마이크로열량계의 사용으로 많은 효소 또는 기질이 필요하지 않기 때문에 아주 범용적이다. 이들 검정은 임의의 다른 방법으로 검정하는 것이 불가능한 반응을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 화학발광은 화학 반응에 의한 빛의 방출이다. 일부 효소 반응은 빛을 발생하고 이러한 빛의 발생은 생성물의 형성을 검출하기 위해 측정될 수 있다. 이러한 유형의 검정은 발생된 빛이 수일 또는 수주에 걸쳐 사진필름에 의해 포착될 수 있어 상당히 민감할 수 있으나, 반응에 의해 방출된 모든 빛이 검출되지 않기 때문에 정량하는 것이 곤란할 수 있다. 정적 광산란법은 용액 중의 거대분자의 중량 평균 몰 질량 및 농도의 생성물을 측정한다. 측정 시간 내내 한 종 이상의 고정된 총 농도하에 산란 신호는 복합체 형태 또는 해리 형태로서 다양할 수 있는 용액의 중량 평균 몰 질량의 직접적인 측정이다. 따라서, 이러한 측정은 복합체의 화학양론뿐만 아니라 역학을 정량한다. 단백질 역학의 빛 산란 검정은 효소를 필요로 하지 않는 아주 일반적인 기술이다.

불연속 검정은 시간 간격을 두고 효소 반응으로부터 시료를 채취하고 이들 시료에서 생성물의 생성량 또는 기질의 소모량을 측정하는 것이다. 방사검정은 기질 내로 방사성이 혼입되거나 기질로부터 방사성이 방출되는 것을 측정한다. 이들 분석에서 가장 흔히 사용되는 방사성 동위원소는 ¹⁴C, ³²P, ³⁵S 및 ¹²⁵I이다. 방사성 동위원소는 기질의 단일 원자의 특정 표지를 가능하게 할 수 있기 때문에 이들 검정은 아주 민감하고 특이적이다. 이들은 빈번히 생화학에서 사용되며 흔히 조 추출물에서의 특이적 반응을 측정하는 유일한 방법이다. 크로마토그래피 검정은 반응 혼합물을 크로마토그래피에 의해 그의 성분들로 분리함으로써 생성물 형성을 측정한다. 이것은 보통 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 수행되지만, 또한 박층 크로마토그래피의 단순한 기술도 사용할 수 있다. 비록 이 방법은 많은 물질을 필요로 할 수 있지만, 민감성은 기질/생성물을 방사성 태그 또는 형광 태그로 표지하여 증가될 수 있다.

본 발명에 따르면 시험 화합물의 효과는 Il2rg 핵산 또는 단백질과의 상호작용에 의한 것일 수 있다. 따라서, Il2rg 핵산 또는 단백질에 시험 화합물의 상호작용/결합은 (i) Il2rg 핵산 또는 단백질과 (ii) 시험 화합물의 복합체를 검출함으로써 측정할 수 있다. 두 가지 이상의 성분들의 복합체를 검출하는 적합한 방법은 아래에서 상세히 설명된다.

다른 방법으로서, 시험 화합물의 효과(예: 결합) 및 Il2rg 핵산 또는 단백질의 효과는 간접적으로 검출될 수 있다. 이를 위해서, Il2rg 핵산 또는 단백질의 하류 효과를 검출할 수 있다. 예를 들면, Il2rg과 연관된 전사 및 해독에 미치는 효과를 측정할 수 있다. 한 가지 양태로서, Il2rg mRNA 또는 Il2rg 단백질의 양이 검출된다.

특정 단백질 또는 다른 핵산의 존재 또는 양을 측정하기 위해 고안된 많은 공지된 검출 방법은 태그, 마커 또는 표지의 사용에 의해 좌우된다. 시험 시스템 또는 시험 화합물의 성분은 충분한 검출 또는 정제를 가능케 하는 다양한 방법으로 표지될 수 있다. 한 가지 바람직한 양태로서, 검출가능한 마커는 시험 시스템에 미치는 효과를 검출하기 위해 사용된다. 이를 위해서, (i) 핵산 또는 Il2rg 단백질, (ii) 시험 화합물 및/또는 (iii) 시험 시스템의 추가의 성분이 한 가지 이상의 검출 마커로 표지될 수 있다.

성분의 작용기들 중 하나 이상을 표지하기 위해 흔한 표지 방법을 사용할 수 있다. 단백질의 경우, 작용기는 예를 들면 각각의 폴리펩타이드 쇄의 N-말단 및 라이신 잔기의 측쇄에 존재하는 일차 아미노기; 환원제로 디설파이드 결합을 처리함으로써 또는 석신이미딜-S-아세틸티오아세테이트(SATA)와 같은 시약으로 라이신 잔기를 변형시킴으로써 사용가능하게 되는 시스테인 잔기에 존재하는 설프하이드릴 기; 또는 보통 항체의 Fc 영역에 존재하는 것으로 산화하여 커플링을 위한 활성 알데하이드를 생성할 수 있는 카보하이드레이트 기일 수 있다. 성분 또는 화합물은 일련의 상이한 물질, 예를 들면 바이오틴(아비딘-바이오틴 화학의 경우), 효소, 아민, 설프하이드릴 또는 다른 작용기를 예를 들면 FITC, 플루오레세인, 로다민, Cy 염료 또는 알렉사 플루오스로 표지하기 위한 활성화 형광염료로 표지될 수 있다. 또한, ³H, ³²P, ³⁵S, ¹²⁵I 또는 ¹⁴C와 같은 방사성 표지뿐만 아니라 페니실리나제, 서양고추냉이 퍼옥시다제 및 알칼리성 포스파타제를 포함한 흔한 효소 표지들이 사용될 수 있다.

본 발명의 한 가지 양태로서, 마커는 방사성표지, 특히 ³H, ³²P, ³³P, ³⁵S, ¹²⁵I 또는 ¹⁴C이다.

다른 양태로서, 마커는 한 가지 이상의 형광 마커(들)이다. 적합한 형광 마커들이 본 발명의 방법과 관련하여 기술된다.

이들 방법에서 특히 유용한 것은 화학적 태그, 마커 또는 표지를 통해 검출가능한 표적-특이적 프로브의 사용이다. 항체는 가장 흔한 유형의 프로브이다. 특정 항원에 대한 항체의 결합 친화성은 복합 시료에서 표적의 추적 및 검출을 가능케한다. 그러나, 항체 자체가 단백질이고, 이들이 가시화를 위해 표지되지 않거나, 표지되는 다른 분자로 이차적으로 프로빙되지 않는 한 검정 시스템에서 특이적으로 검출될 수 없다.

마커(또는 태그 또는 표지)는 다른 물질 또는 물질의 복합체의 존재를 지시할 수 있는 임의의 종류의 물질이다. 마커는 검출될 물질에 연결되거나 도입되는 물질일 수 있다. 검출 마커는 분자 생물 및 바이오기술에서 예를 들면 단백질, 효소 반응 생성물, 이차 메신저, DNA, 분자들의 상호작용 등을 검출하는데 사용되는 것이다. 적합한 마커 또는 표지의 예는 형광단, 발색단, 방사성표지, 금속 콜로이드, 효소 또는 화학발광 또는 생발광 분자를 포함한다. 형광단의 예는 플루오레세인, 로다민 및 설포인도시아닌 염료 Cy5를 포함한다. 방사성표지의 예는 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³³P, ³⁵S, ^{99 m}Tc 또는 ¹²⁵I를 포함한다. 효소의 예는 서양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 글루코즈 옥시다제 및 우레아제를 포함한다. 추가적인 예 및 바람직한 양태가 본원에 상세히 기술되어 있다.

상이한 유형의 화학적 표지 또는 태그들이 이차 또는 일차 항체 및 다른 분자들에 컨쥬게이팅되어 다양한 방법에 의한 가시화(즉, 검출 및 측정)를 촉진할 수 있다. 과거에는 방사성동위원소들이 광범위하게 사용되었으나 이들은 값이 비싸고, 저장수명이 짧으며, 신호:노이즈 비율이 개선되지 않고, 특별한 조작 및 처리가 요구된다. 효소 및 형광단이 검정시 검출 태그로서 방사성 동위원소를 주로 대체한다. 시약 및 기기에서의 많은 발전으로 인해 좀더 새로운 기술들이 더욱 다양하고 강력하게 이용되고 있다. 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)와 같은 효소 태그는 블로팅, 면역검정 및 면역조직화학 방법에서 가장 흔히 사용되고 있다. 형광 태그는 세포 이미징, 핵산 증폭 및 서열분석 및 마이크로어레이에서 주로 사용되고 있다. 그러나, 형광 기술이 모든 유형의 검정에서 급속히 응용 개발되고 있다.

단백질의 검출은 흔히 특이적 항체의 사용을 포함한다. 따라서, Il2rg 단백질 또는 이의 변이체의 검출은 특이적 Il2rg 항체를 포함할 수 있다. Il2rg에 대한 항체는 상업적 공급자로부터 입수가능하다(예: 미국 캘리포니아주 산타 크루즈 소재 Santa Cruz Biotechnology의 카달로그 번호: sc-74192, sc-74193, sc-667, sc-670, sc-20751; 또는 미국 캘리포니아주 산호세 소재 BD Biosciences의 카달로그 번호: 555896). 다른 방법으로서, 항체는 동물을 항원의 제조된 형태로 면역화하는 잘 정립된 기술로 생성할 수 있다. 항체 생성 및 정제를 보조하기 위한 여러 가지의 시약들이 사용되고 있으며 다양한 회사들이 항체 생성을 전문적으로 서비스하고 있다. 수행될 용도에 따라 공급된 일차 항체에 다른 수준의 순도 및 특이성 유형이 필요하다. 두 서너 가지 변수를 들자면 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있고, 항혈청 또는 친화성-정제된 용액으로 공급될 수 있으며, 천연 단백질 또는 변성 단백질 검출에 대해 검증(validation)될 수 있다.

표적 항원(본원에서 Il2rg 또는 이의 단편)을 인지하는 항체는 "일차 항체"라고 한다. 만일 이 항체가 태그로 표지된 경우, 항원의 직접적인 검출이 가능하다. 그러나, 보통 일차 항체는 직접적인 검출을 위해 표지되지 않는다. 대신에, 검출 태그로 표지된 "이차 항체"가 표적 항원에 결합되는 일차 항체를 탐지하는 제2 단계로서 사용된다. 따라서, 항원은 간접적으로 검출된다. 간접 검출의 다른 형태는 바이오틴과 같은 친화성 태그로 표지되는 일차 또는 이차 항체를 사용한다. 이 경우는 검출 효소 또는 형광단 태그로 표지되는 스트렙타비딘과 같은 이차(또는 삼차) 프로브를 사용하여 검출 신호를 발생함으로써 바이오틴 태그를 탐지할 수 있다. 이러한 프로브 및 검출 전략은 몇 가지 변형된 것들이 있다. 그러나, 각각의 변형 방법은 그 존재가 측정가능한 태그(예: 기질과 반응했을 때 발색물을 생성할 수 있는 활성을 갖는 효소)와 어느 정도 직간접적으로 연관이 있는 특정 프로브(예: 일차 항체)에 의해 좌우된다.

보통, 검출 표지가 없는 일차 항체 및 어느 정도의 이차(간접) 검출 방법이 검정 방법에서 요구된다. 그럼에도 불구하고 거의 모든 항체는 필요한 경우 바이오틴, HRP 효소 또는 몇 종의 형광단 중 한 종으로 표지될 수 있다. 대부분의 일차 항체는 마우스, 토끼 또는 몇몇 다른 종들 중 한 종에서 생성된다. 이렇게 생성된 거의 모든 항체는 IgG 부류의 항체이다. 따라서, 즉시 사용가능한 표지된 이차 항체를 대부분의 용처 및 검출 시스템을 위해 제조업체에서 생산하고 공급하는 것은 비교적 간단하고 경제적이다. 그러나, 여기에는 수 백가지의 옵션이 사용되고 있으며 순도 수준, IgG- 및 종-특이성 및 검출 수준에서 차이를 보인다. 이차 항체의 선택은 일차 항체를 생성한 동물의 종(숙주 종)에 의해 좌우된다. 예를 들면, 일차 항체가 마우스 모노클로날 항체인 경우 이차 항체는 마우스가 아닌 다른 숙주로부터 수득한 항-마우스 항체이어야 한다.

프로브로서 바이오틴-결합 단백질을 사용하는 경우 바이오틴과 아비딘 또는 스트렙타비딘 단백질 사이의 고도의 특이적 친화성 상호작용은 많은 종류의 검출 및 친화성-정제 방법에서 기초가 된다. 바이오틴은 아주 작은 분자이며(244 달톤) 이에 따라 바이오틴이 항체 또는 다른 프로브와 공유 결합하는 것은 항체나 다른 프로브의 기능을 거의 방해하지 않는다. 프로브 상에 표지로서 바이오틴이 존재하는 것이 아비딘이나 스트렙타비딘 어떠한 것과도 효율적이고 특이적인 이차 검출을 제공한다. 이들 두 종류의 바이오틴-결합 단백질은 많은 종류의 검정 시스템에서 검출을 가능케 하는 효소 태그 또는 형광 태그로 표지된 정제 형태로 사용되고 있다.

효소 표지가 블롯팅 및 면역검정에서 검출용 이차 항체(또는 스트렙타비딘) 태그로서 가장 흔히 사용된다. 효소는 이들의 활성을 통해 검출 신호를 제공한다. 특이적 기질과의 반응은 발색, 발광 또는 형광 생성물을 제공한다. 베타-갈락토시다제 및 루시퍼라제와 같은 리포터 효소가 프로브 제조에 성공적으로 사용되온 한편, 알칼리성 포스파타제(AP) 및 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)가 단백질 검출용 표지로서 가장 널리 사용되고 있는 2개의 효소들이다. 이들 두 효소 중 어느 하나와 함께 일련의 발색, 형광 및 화학발광 기질이 사용되고 있다.

보통 소 내장으로부터 분리되는 알칼리성 포스파타제는 기질 분자로부터 포스테이트 기의 가수분해를 촉매하여 발색물 또는 형광물을 생성하거나 반응의 부산물로서 빛을 방출하는 커다란(140 kDa) 단백질이다. 알칼리성 포스파타제는 염기성 pH(pH 8-10)에서 최적의 효소 활성을 나타내며 시안화물, 비산염, 무기 인산염 및 이가 양이온 킬레이트제(예: EDTA)에 의해 억제될 수 있다. 웨스턴 블롯팅을 위한 표지로서, 알칼리성 포스파타제는 다른 효소에 비하여 명백한 이점을 제공한다. 알칼리성 포스파타제의 반응 속도는 직선으로 나타나기 때문에 간단히 반응을 좀 더 장기간 진행되도록 함으로써 검출 민감도를 개선시킬 수 있다.

서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)는 과산화수소에 의한 기질의 산화를 촉매함으로써 발색물 또는 형광물을 생성하거나 반응의 부산물로서 빛의 발생하는 40 kDa 단백질이다. 서양고추냉이 퍼옥시다제는 중성 pH 근처에서 최적으로 기능하며 시안화물, 황화물 및 아자이드화물에 의해 억제될 수 있다. 항체-HRP 접합체는 항체-AP 접합체에 비하여 효소와 항체 둘다의 특이적 활성의 측면에서 우수하다. 또한, HRP는 높은 전환율, 양호한 안정성, 낮은 비용 및 광범위한 기질 이용성으로 인해 대부분의 용처에서 선택되는 효소이다. HRP 효소는 작은 크기로 인해 다수-HRP 접합된 이차 항체를 사용함으로써 추가의 민감성 증가를 달성할 수 있고 이러한 민감성 증가로 인해 일부 연구자들의 경우에서 ABC 형 증폭 시스템의 사용 필요성을 배제할 수 있다.

검출용 형광 표지는 오래전부터 소수의 세포 생물학 응용분야에서, 예를 들면 형광현미경을 사용한 유세포분석(FC), 형광-활성화 세포분류(FACS) 및 면역조직화학(IHC)에서 사용되었다. 최근까지 프로브 표지를 위해 가장 흔히 사용된 형광단은 플루오레세인(플루오레세인 이소티오시아네이트, FITC) 및 로다민(테트라메틸 로다민 이소티오시아네이트, TRITC)이었다. 다른 표지로는 여러 유형의 녹색 형광 단백질(GFP) 및 피코빌리단백질(알로피코시아닌, 피코시아닌, 피코에리쓰린 및 피코에리쓰로시아닌)과 같은 형광 단백질이 포함된다. 형광 단백질은 검출을 위해 강력한 형광 신호를 발생하는 능력을 나타내는 한편 최적의 접합 목적을 위해 어려움이 있을 수 있고 결합 검정에서 입체 장애 또는 배경 신호 문제점을 야기할 수 있다.

블롯팅 및 면역검정에 형광단-접합된 프로브의 사용은 기질 전개 단계가 진행될 필요가 없기 때문에 효소 표지의 사용에 비하여 보다 적은 단계를 필요로 한다. 형광 검출은 프로토콜이 보다 짧은 한편 특별한 장비를 필요로 하며 민감성은 효소 화학발광 시스템으로 얻을 수 있는 민감성만큼 크지 않다. 비록 형광 검출 방법이 효소 검출만큼 민감성을 제공하지 못하나 화학적 폐기물을 줄여 주고(동일한 실험에서 한 가지 이상의 형광단을 사용하여) 다중 상용성의 추가 이점을 제공한다.

다른 방법으로써 또는 추가적인 방법으로서, 두 물질(예: 시험 화합물 또는 공지된 Il2rg 리간드 및 Il2rg 단백질)의 근접성을 검출하기 위해 두 마커를 사용할 수 있다. 마커는 예를 들면 방사성 또는 형광 마커 하나와 신틸레이터 하나(예: 섬광근접검정용)일 수 있거나 두 가지 형광 마커가 사용될 수 있다(예: FRET용). 한 가지 예로서, Il2rg 단백질 및 피검 물질이 제1 마커와 제2 마커로 표지될 수 있다. 피검 물질이 단백질에 결합되고 이에 따라 표지가 인접해 있는 경우 에너지는 제1 표지로부터 제2 표지로 전달되고 그럼으로써 Il2rg 단백질과 시험 화합물의 상호작용을 검출할 수 있다. 이 시험은 공지된 Il2rg 리간드가 표지중 하나를 보유하는 경쟁 결합 시험으로서 고안될 수 있다.

적합한 마커 조합의 예는 다음을 포함한다:

- 예를 들면 마이크로입자에 격리된 신틸레이터(예: 이트륨 실리케이트 또는 폴리비닐-톨루엔)와 함께 조합된 방사성표지 ³H, ³³P, ³⁵S, ¹⁴C 또는 ¹²⁵I 또는

- LC-레드 610, LC-레드 640, LC-레드 670, LC-레드 705, Cy5, Cy5.5, 리스아민 로다민 B 설포닐 클로라이드, 테트라메틸 로다민 이소티오시아네이트, 로다민 x 이소티오시아네이트, 에리쓰로신 이소티오시아네이트, 플루오레세인, 디에틸렌트리아민 펜타아세테이트 또는 다른 란탄족 이온(예: 유로퓸 또는 테르븀)의 킬레이트와 같은 수용체 형광 마커와 조합된 플루오레세인, 루시퍼 옐로우, B-피코에리트린, 9-아크리딘이소티오시아네이트, 루시퍼 옐로우 VS, 4-아세트아미도-4'-이소티오시아네이토스틸벤-2,2'-디설폰산, 7-디에틸아미노-3-(4'-이소티오시아네이토페닐)-4-메틸쿠마린, 석신이미딜 1-파이렌부티레이트 및 4-아세트아미도-4'-이소티오시아네이토스틸벤-2,2'-디설폰산 유도체와 같은 공여체 형광 마커.

항체에 의한 검출 방법의 대안으로서, 본 발명의 방법은 경쟁 결합 실험으로서 설계될 수 있고, 이 실험에서 피검 물질에 의해 Il2rg로부터 공지된 Il2rg 리간드의 결합이 치환되는 것이 연구된다. 단백질로부터 공지된 리간드의 성공적인 치환이 단백질에 피검 물질의 결합을 지시한다. 이 방법에서, 다수의 시험 화합물(예: 라이브러리)을 편리하게 시험할 수 있도록 해줌으로써 시험 화합물 각각을 표지할 필요가 없는 공지된 Il2rg 리간드를 표지하는 것이 유리하다.

리간드는 바이오분자(본원에서 예를 들면 Il2rg 단백질 또는 핵산)와 결합하고 복합체를 형성할 수 있는 물질이다. 리간드는 바이오분자상의 부위에 이온 결합, 수소 결합 및 반데르발스 힘과 같은 분자간 힘에 의해 결합하는 분자이다. 도킹(연합)은 보통 가역적(해리)이다. 리간드와 이의 표적 분자간에 실질적인 비가역적 공유결합은 생물계에서 흔치않다. 바이오분자에 결합하는 리간드는 바이오분자의 활성, 예를 들면 하류 신호 전달을 활성화하는 바이오분자의 능력에 변화를 줄 수 있다. 리간드는 억제제 및 활성화제를 포함한다. 적합한 리간드는 문헌[참조: Johnson et al., 1994, Eur Cytokine Netw 5: 23-34]을 참조한다.

억제제는 효소와 결합하여 효소의 활성을 감소시키는 분자이다. 효소 활성의 차단은 대사 불균형을 바로잡아 줄 수 있기 때문에 많은 약물은 효소 억제제이다. 효소와 결합하는 모든 분자들이 억제제는 아니다. 효소 활성화제는 효소와 결합하여 효소의 활성을 증가시켜 준다.

억제제의 결합은 결합 파트너가 바이오분자와 상호작용하는 것을 정지시키고/시키거나 바이오분자가 활성을 나타내거나 활성화되는 것을 방해할 수 있다. 억제제 결합은 가역적이거나 비가역적이다. 비가역적 억제제는 보통 바이오분자와 반응하여 바이오분자를 화학적으로 변형시킨다. 이들 억제제는 예를 들면 활성에 필요한 핵심 아미노산 잔기에 변형을 일으킬 수 있다. 대조적으로, 가역적 억제제는 비공유적으로 결합하여 이들 억제제가 바이오분자와 결합하는지의 여부에 따라 다른 유형의 억제를 제공한다.

선택적 리간드는 효소와 같은 극히 한정된 유형의 표적(바이오분자)와 결합하는 성향을 갖는 한편, 비선택적 리간드는 수 가지 유형의 표적과 결합한다. 이것은 비선택적 약물이 목적하는 효과를 나타내는 한 가지 바이오분자 외에 다른 수 가지의 바이오분자와 결합하기 때문에 부작용을 더 나타내는 경향이 있는 약물학에서 중요한 역할을 한다.

경쟁 결합 실험에서 공지된 리간드는 한 가지 이상의 검출 마커로 표지되고 b)의 배양 단계에 첨가된다. 단계 b) 후에 결합된 표지된 리간드는 비결합된 리간드와 분리된다. 이러한 분리는 여과, 원심분리, 고정화, 상분리 및 액체 제거 등과 같은 흔한 분리 단계로 수행될 수 있다. 표지에 의해 제공된 신호 양은 리간드와 시험 화합물이 바이오분자와의 결합을 위해 경쟁하기 때문에 결합된 리간드 양을 지시하며, 이에 따라 또한 바이오분자에 결합된 시험 화합물의 양을 지시한다.

한 가지 양태로서, 시험 화합물의 효과에 대한 검출 검정은 SPA(섬광근접검정법), FRET(형광공명에너지전이) 검정법, TR-FRET(시간분해 형광공명 에너지 전달) 검정법 또는 FP(형광 편광) 검정법이다.

SPA(섬광근접검정법)은 균일계에서 생물학적으로 광범위한 과정의 신속하고 민감한 측정을 가능케 하는 생화학적 선별을 위해 사용되는 기술 유형이다. SPA에 연관된 비드의 유형은 크기가 미세하고 비드 자체 내에 섬광체가 있어 이것이 자극받을 때 빛을 방출한다. 섬광은 방사성 표지된 분자가 비드와 상호작용할 때 발생한다. 이러한 상호작용은 비드가 빛을 방출하도록 유도하며 이때의 빛은 섬광 계수기에 의해 검출될 수 있다.

보다 자세하게는, 방사성 표지된 분자가 비드에 결합되거나 비드에 인접할 때 빛의 방출이 촉진된다. 그러나, 만일 비드가 방사성 표지된 분자에 의해 결합되지 않는 경우 비드는 빛을 발생하도록 자극받지 않는다. 이것은 미결합된 방사성으로부터 방출된 에너지가 SPA 비드로부터 너무 멀리있는 경우 분산되어 비드가 자극받지 않아 신호를 발생하지 못하기 때문이다.

SPA에 가장 적합한 것으로 권장되는 것은 트리튬이다. 트리튬은 물을 통과하는 경로 길이가 1.5 ㎛로 아주 짧기 때문이다. 따라서, β-입자가 섬광 비드와 함께 1.5 ㎛의 특정 범위 내에 있을 때 섬광제 비드를 자극하여 빛을 방출하기에 충분한 에너지가 있다. 만일 둘 사이의 거리가 1.5 ㎛보다 큰 경우 β-입자는 충분한 에너지가 없기 때문에 비드를 자극하는데 필요한 거리를 이동할 수 없다. 또한 여러 가지의 비드 피복이 사용되는데 이러한 피복은 이 방법을 효소 검정 및 방사성 면역 검정법과 같은 광범위한 용처에 응용될 수 있도록 한다.

형광공명에너지전이(FRET)는 두 발색단들 사이의 무방사성 에너지 전이를 제공한다. 여기 상태의 공여체 발색단은 비방사성 원거리 이중극자-이중극자 커플링 기전에 의해 에너지를 근접한(통상적으로 <10 nm) 수용체 발색단으로 전달할 수 있다. 비록 에너지가 형광에 의해 실질적으로 전이되는 것은 아니지만 두 분자가 형광체임에 따라 에너지 전이를 흔히 "형광공명에너지전이"라고 한다. FRET는 단백질-물질 상호작용, 단백질-단백질 상호작용, 단백질-DNA 상호작용 및 단백질-형태 변화를 검출하고 정량하는데 유용한 도구이다. 물질에 단백질의 결합, 한 단백질에 다른 단백질의 결합 또는 DNA에 단백질의 결합을 모니터링하기 위해, 분자들 중 하나는 공여체로 표지되고 다른 하나는 수용체로 표지되어 이들 형광단-표지된 분자들은 혼합된다. 이들이 비결합 상태로 존재할 때 공여체 여기시 공여체 방출이 검출된다. 분자들이 결합한 경우 공여체와 수용체는 근접한 상태에 있고 공여체로부터 수용체로의 분자간 FRET로 인해 수용체 방출이 주로 관찰된다. FRET를 위해 적합한 분자들은 당해 분야에 공지되어 있고 숙련가들은 두 항체들을 위해 적합한 표지 조합을 선택할 수 있다. 공여체와 상응하는 수용체과 관련하여 본원에서 사용된 "상응하는"은 공여체의 여기 스펙트럼과 중첩하는 방출 스펙트럼을 갖는 수용체 형광 모이어티(moiety)를 가리킨다. 그러나, 두 신호들은 서로 분리되어야 한다. 따라서, 수용체의 방출 스펙트럼의 최대 파장은 공여체의 여기 스펙트럼의 최대 파장보다 큰 30 nm 이상이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 50 nm 이상(예: 80 nm 이상, 100 nm 이상 또는 150 nm 이상)이어야 한다.

FRET 기술에서 다양한 수용체 형광 모이어티와 사용될 수 있는 대표적인 공여체 형광 모이어티는 플루오레세인, 루시퍼 예로우, B-피코에리트린, 9-아크리딘이소티오시아네이트, 루시퍼 옐로우 VS, 4-아세트아미도-4'-이소티오시아네이토스틸벤-2,2'-디설폰산, 7-디에틸아미노-3-(4'-이소티오시아네이토페닐)-4-메틸쿠마린, 석신이미딜 1-파이렌부티레이트 및 4-아세트아미도-4-'-이소티오시아네이토스틸벤-2,2'-디설폰산 유도체를 포함한다. 사용된 공여체 형광 모이어티에 따라 대표적인 수용체 형광 모이어티는 LC-레드 610, LC-레드 640, LC-레드 670, LC-레드 705, Cy5, Cy5.5, 리사민 로다민 B-설포닐 클로라이드, 테트라메틸 로다민 이소티오시아네이트, 로다민 x 이소티오시아네이트, 에리트로신 이소티오시아네이트, 플루오레세인, 디에틸렌트리아민 펜타아세테이트 또는 다른 란탄족 이온(예: 유로퓸 또는 테르븀)의 킬레이트를 포함한다. 공여체 및 수용체 형광 모이어티는 예를 들면 Molecular Probes(미국 오래곤주 정션 시티 소재) 또는 Sigma Chemical Co.(미국 미주리주 세인트 루이스 소재)로부터 입수할 수 있다.

다른 방법으로서, 본 발명의 시험 시스템을 위해 시간분해 형광공명에너지전이(TR-FRET)가 사용될 수 있다. TR-FRET는 TRF(시간분해 형광) 및 FRET 원리를 이용한다. 이것은 TRF의 낮은 배경 이점과 FRET의 균일한 검정 포맷을 조합한 것이다. FRET는 이미 앞에서 설명된 한편, TRF는 란탄족 또는 반감기가 긴 다른 임의의 공여체의 독특한 특성을 사용한다. TR-FRET를 위해 적합한 공여체는 무엇보다도 마이크로초 내지 밀리초 시간 범위의 형광 반감기를 나타낼 수 있고 이에 따라 에너지 전이가 마이크로초 내지 밀리초 측정이 가능하도록 하는 란탄족 킬레이트(크립테이트) 및 일부 다른 금속 리간드 착화물을 포함한다. 형광 란탄족 킬레이트는 70년대 말에 에너지 공여체로 사용되었다. 흔히 사용된 란탄족은 사마륨(Sm), 유로퓸(Eu), 테르븀(Tb) 및 다이스프로슘(Dy)을 포함한다. 란탄족의 착화물은 특정 광물리학 및 스펙트럼 특성으로 인해 생물학에서 형광 응용 분야에서 주요 관심 대상이다. 특징적으로, 이들은 더 전통적인 형광단과 비교했을 때 큰 스트로크스 전이(stroke's shift) 및 아주 긴 방출 반감기(마이크로초 내지 밀리초)를 갖는다.

보통, 유기 발색단이 수용체로서 사용된다. 이들은 알로피코시아닌(APC)을 포함한다. TR-FRET 및 수용체에 대한 적합한 설명은 WO 98/15830에 기술되어 있다.

형광 편광(FP)-기초 검정은 편광광을 사용하여 용액중의 형광 기질을 여기하는 검정법이다. 이들 형광 기질은 용액중에서 자유롭게 텀블링함으로써 방출된 빛의 편광이 소멸되도록 한다. 기질이 보다 큰 분자(즉, 아실기)와 결합하 경우 이의 텀블링율은 상당히 감소하며 방출된 빛은 높게 편광된다.

다른 방법으로서, 질량분석법이 사용될 수 있다. 용어 "질량분석법"은 이온화 공급원을 이용하여 표면위에 시료로부터 가스상 이온을 발생시키고 생성된 가스상 이온을 질량분석기로 검출하는 것을 가리킨다. 용어 "레이저 탈착 질량분석법"은 이온화 공급원으로서 레이저를 사용하여 표면상에 시료로부터 가스상 이온을 발생시키고 생성된 가스상 이온을 질량분석기로 검출하는 것을 가리킨다. 아실화 아실 수용체와 같은 바이오분자에 대해 바람직한 질량분석법은 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 질량분석법 또는 MALDI이다. MALDI에서 분석물은 통상적으로 매트릭스 물질과 혼합되는데 매트릭스 물질은 건조시 분석물과 함께 공결정화된다. 매트릭스 물질은 에너지 공급원으로부터 에너지를 흡수하면서 또한 불안정한 바이오분자 또는 분석물을 절단한다. 다른 바람직한 방법은 표면 강화된 레이저 탈착/이온화 질량분석법 또는 SELDI이다. SELDI에서 분석물이 적용되는 표면은 분석물 포획 및/또는 탈착에서 활발한 역할을 한다. 본 발명과 관련하여 시료는 크로마토그래피 또는 기타 화학적 처리 과정을 겪을 수 있는 생물학적 시료 및 적합 매트릭스 기질을 포함한다.

질량분석법에서 "겉보기 분자량"은 검출된 이온의 분자량(달톤) 대 전하 값(m/z)를 가리킨다. 겉보기 분자량의 유도 방법은 사용된 질량분석기의 유형에 의해 좌우된다. 비행시간 질량분석기에서 겉보기 분자량은 이온화에서 검출까지의 시간 함수이다. 용어 "신호"는 연구중에 바이오분자에 의해 발생된 임의의 반응을 가리킨다. 예를 들면 용어 신호는 질량분석기의 검출기에 충돌하는 바이오분자에 의해 발생된 반응을 가리킨다. 신호세기는 바이오분자의 양 또는 농도와 상관관계가 있다. 신호는 두 가지 값에 의해 정의된다: 상기된 바와 같이 생성된 겉보기 분자량 값 및 신호 강도 값. 분자량 값은 바이오분자의 원소적 특징인 반면, 신호 강도 값은 상응하는 겉보기 분자량 값을 갖는 바이오분자의 특정 양 또는 농도에 따른다. 따라서, "신호"는 항상 바이오분자의 특성을 가리킨다.

상술된 바와 같이 첫번째 측면으로서 통증에 관여하는 화합물을 식별하는 방법은

a) Il2rg 핵산을 포함하는 시험 시스템을 제공하고,

b) 상기 시험 시스템을 시험 화합물과 접촉시키며,

c) 상기 시험 시스템에 대한 상기 시험 화합물의 효과를 측정하는 단계

를 포함하고,

여기에서, 대조군과 비교하여 상기 시험 시스템에 대한 상기 시험 화합물의 유의적인 효과가 검출되는 경우, 상기 시험 화합물이 통증에 관여하는 화합물로서 식별된다.

핵산에 미치는 시험 화합물의 효과는 다양한 발현 또는 신호 전달 수준으로 측정될 수 있다.

시험 화합물은 Il2rg 유전자의 조절 서열 또는 Il2rg 유전자 자체와 결합하도록 고안될 수 있다. 따라서 시험 화합물은 유전자의 발현에 영향을 미칠 수 있다.

따라서, 조절 서열에 시험 화합물의 결합은 (i) 조절 서열 또는 유전자와 (ii) 시험 화합물의 복합체를 검출함으로써 측정될 수 있다. 두 가지 이상의 성분의 복합체를 검출하는 적합한 방법은 본원에 상세히 설명되어 있다.

조절 서열은 전사 인자와 같은 조절 단백질이 우선적으로 결합하는 DNA의 단편이다. 이들 조절 단백질은 조절 영역이라고 하는 짧은 DNA 서열에 결합하는데, 이러한 DNA 서열은 게놈내에 적절히 위치해 있고 보통은 조절되는 유전자의 "상향"으로 짧은 거리에 위치한다. 이들 조절 단백질은 그렇게 결합함으로써 RNA 폴리머라제라고 하는 다른 단백질 복합체를 소집할 수 있다. 이러한 방식으로 이들은 유전자 발현을 조절한다. 조절 서열은 프로모터 영역을 포함하는데 이러한 프로모터 영역은 보통 다른 조절 영역(인핸서, 촉진유전자억제유전자, 경계 요소/인슐레이터)과 조화를 이루어 작동하여 해당 유전자의 전사 수준을 유도한다.

다른 방법으로서, 시험 화합물의 효과(예: 결합) 및 유전자 전사에 미치는 효과는 간접적으로 검출될 수 있다. 이 경우 Il2rg 유전자의 하류 효과가 검출될 수 있다. 예를 들면, Il2rg과 연관된 전사 및 해독에 미치는 효과가 측정될 수 있다. 한 가지 양태로서, Il2rg mRNA 또는 Il2rg 단백질의 양이 검출된다. 다른 방법으로서, IL2RG가 Janus 키나제 3과 상호작용하는 것으로 공개되었기 때문에 Janus 키나제 3에 대한 효과를 측정할 수 있다. 또 다른 방법으로서, 상기된 인터루킨의 신호 전달 하류가 연구될 수 있다.

mRNA를 검출하는 적합한 방법은 본원에 기술되어 있고 예를 들면 노던 블롯 분석, 뉴클레아제 보호 검정(NPA), 현장하이브리드화 및 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 포함한다.

노던 블롯팅 방법의 경우, 일차적으로 RNA 시료를 변성 조건하에서 아가로즈 겔로 전기영동하여 크기별로 분리할 수 있다. 그런 후 RNA는 막으로 옮겨져 가교되고 표지된 프로브와 하이브리드화한다. 비동위원소 또는 고특이적 활성 방사성표지된 프로브가 사용될 수 있고 무작위-프라이밍되거나 틈-해독되거나 PCR-생성된 DNA 프로브, 시험관내 전사된 RNA 프로브 및 올리고뉴클레오타이드가 포함된다. 추가로, 단지 부분적인 상동성만 갖는 서열(예: 다른 종의 cDNA 또는 엑손을 함유할 수 있는 게놈 DNA 단편)이 프로브로서 사용될 수 있다.

뉴클레아제 보호 검정(NPA)은 특정 mRNA의 검출 및 정량을 위해 극히 민감한 방법이다. NPA의 기본은 RNA 시료에 대한 안티센스 프로브(방사성표지되거나 비동위원소)의 용액내 하이브리드화이다. 하이브리드화 후 일본쇄 비하이브리드화 프로브 및 RNA는 뉴클레아제에 의해 분해된다. 남은 보호된 단편은 예를 들면 아크릴아미드 겔에서 분리된다. 통상적으로 용액내 하이브리드화는 막-기초 하이브리드화보다 더 효율적이고 최대 20-30 ㎍의 블롯 하이브리드화에 비하여 RNA 시료를 100 ㎍까지 수용할 수 있다. 또한 NPA는 분해가 단지 프로브(보통 프로브의 길이는 약 100-400개 염기이다)와의 중첩 영역에서만 검출되기 때문에 노던 분석보다 RNA 시료 분해에 덜 민감하다.

RT-PCR에서, RNA 주형은 레트로바이러스 역전사효소에 의해 상보적인 DNA(cDNA)로 복사된다. 그런 다음 cDNA는 PCR에 의해 지수적으로 증폭된다. 상대정량 RT-PCR은 해당 유전자와 동시에 내부 대조군을 증폭시킨다. 내부 대조군은 시료를 정규화하는데 사용된다. 일단 정규화되면 시료를 따라 특정 mRNA의 상대 존재를 직접 비교할 수 있다. 경쟁적 RT-PCR은 절대 정량을 위해 사용된다. 이 기술은 내인성 표적과 크기 또는 서열에서 작은 차이에 의해 구분될 수 있는 경쟁 RNA를 설계, 합성 또는 정밀 정량하는 것을 포함한다. 경쟁 RNA의 공지량이 실험 시료에 첨가되고 RT-PCR이 수행된다. 내인성 표적으로부터의 신호는 경쟁 RNA로부터의 신호와 비교되어 시료에 존재하는 표적의 양을 측정한다.

상기 방법들은 핵산 표지를 포함할 수 있다. DNA, RNA 또는 올리고뉴클레오타이드의 표지를 위한 일련의 기술들이 숙련가에게 알려져 있다. 이들의 예로는 틈-해독 표지, 무작위-프라이밍 DNA 표지, DNA 프로브 및 올리고뉴클레오타이드 3'/5' 말단의 PCR 표지, RNA 프로브 및 올리고뉴클레오타이드 3'/5' 말단의 전사 표지 및 올리고뉴클레오타이드 테일링이 포함된다.

틈-해독 방법은 DNase I이 무작위로 분포된 틈을 DNA 내로 도입하는 능력에 기초를 두고 있다. DNA 폴리머라제 I은 프라이머로서 틈의 3'-OH 말단을 사용하여 5'→3' 방향으로 완전한 가닥에 상보적인 DNA를 합성한다. DNA 폴리머라제 I의 5'→3' 엑소뉴클레오타이드분해 활성은 동시에 뉴클레오타이드를 합성 방향으로 제거한다. 폴리머라제 활성은 순차적으로 제거된 뉴클레오타이드를 동위원소-표지된 또는 합텐-표지된 데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트로 치환시킨다. 따라서 낮은 온도(15℃)에서 반응중에 비표지된 DNA는 새롭게 합성된 표지된 DNA로 치환된다. 흔히 사용되는 표지는 디곡시게닌-, 바이오틴- 또는 형광색소(예: 플루오레세인 또는 테트라메틸로다민)를 포함한다.

"무작위 프라이밍" DNA 표지 방법은 표지될 DNA에 모든 가능한 헥사뉴클레오타이드의 혼합물의 하이브리드화에 기초를 두고 있다. 모든 서열 조합은 헥사뉴클레오타이드 프라이머 혼합물에서 나타나며, 이러한 혼합물은 주형 DNA에 프라이머의 결합을 통계 방식으로 유도한다. 따라서 주형 DNA의 전체 길이를 따른 동일한 표지 정도가 보장된다. 상보 가닥은 표지 등급의 클레노브 효소를 사용하여 무작위 헥사뉴클레오타이드 프라이머의 3'OH 말단으로부터 합성된다. 이 반응에 존재하는 변형된 데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트(예: [³²P]-, [³⁵S]-, [³H]-, [¹²⁵I]-, 디곡시게닌- 또는 바이오틴-표지된)가 새로 합성된 상보 DNA 가닥내로 도입된다.

중합효소연쇄반응(PCR)은 미량의 DNA를 증폭시켜 준다. 유일한 전제조건은 적절한 프라이머를 합성하는데 표적 서열의 일부 서열 정보를 알고 있어야 한다는 점이다. PCR에 의한 표지의 조합은 PCR 생성물의 분석 및 또한 소량의 개별 표적 서열로부터 표지된 프로브의 제조를 위한 강력한 도구이다. 예를 들면, 스테로이드 합텐인 디곡시게닌이 하이브리드화 및 후속으로 발색 또는 발광 검출을 위해 DNA, RNA 또는 올리고뉴클레오타이드를 표지하는데 사용할 수 있다. 보통, 디곡시게닌은 알카리-불안정성 에스테르 결합을 통해 dUTP에 커플링된다. 표지된 dUTP는 DNA 폴리머라제를 사용하여 효소적 핵산 합성에 의해 쉽게 도입할 수 있다.

올리고뉴클레오타이드는 단일 디곡시게닌-표지된 디데옥시우리딘트리포스페이트(DIG-ddUTP)와 같은 표지를 도입함으로써 또는 좀더 긴 뉴클레오타이드 테일을 부가함으로써 이의 3'-말단에서 터미날 트랜스퍼라제로 효소적으로 표지할 수 있다. 터미날 트랜스퍼라제는 이중 및 단일 가닥 DNA 단편 및 올리고뉴클레오타이드의 3'OH 말단에 데옥시- 및 디데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트의 주형 독립적 부가를 촉매한다. 터미날 트랜스퍼라제는 디곡시게닌-, 바이오틴- 및 형광색소-표지된 데옥시- 및 디데옥시뉴클레오타이드뿐만 아니라 방사성 표지된 데옥시- 및 디데옥시뉴클레오타이드를 도입한다. 다른 방법으로서 또는 추가의 방법으로서, 올리고뉴클레오타이드를 예를 들면 고전적인 고체상 포스포라미디트 합성법에 따라 최종 단계에서 포스포라미디트와 반응시킴으로써 5'-말단에 표지할 수 있다. 이 방법에 의해 5'-말단 아미노기가 생성된다. 암모니아로의 처리로 지지체에서 올리고뉴클레오타이드가 방출되고 보호기가 절단된다. 후속 단계에서 디곡시게닌 모이어티가 5'-위치에 도입된다.

상기 표지 방법에 사용될 수 있는 다른 표지들이 공지되어 있다. 이들의 검출을 포함하여 이들 중 일부가 아래에 예시적으로 설명된다:

바이오틴-표지된 화합물은 예를 들면 항-바이오틴 항체 또는 스트렙타비딘 접합체에 의해 검출될 수 있다. 항-바이오틴 항체(예: 알칼리성 포스파타제와 접합된 모노클로날 항-바이오틴 항체 또는 Fab-단편)는 나일론 막상에서 발광하여 효소 면역검정에 의해 바이오틴-표지된 핵산을 검출하는데 사용할 수 있다. 이러한 검출 방법은 막 상에서(예: 써던 블롯, 도트 블롯), 세포 및 조직 내에서(예: 현장하이브리드화), 면역블롯팅, 면역조직화학법 또는 ELISA에서 바이오틴 표지된 핵산을 검출하는데 사용할 수 있다. 스트렙타비딘 접합체가 몇 가지 면역학적 검출 시스템을 위해 사용될 수 있는 바이오틴-표지된 물질(예: 바이오티닐화 항체)을 검출하는데 사용된다. 이 경우 스트렙타비딘(예: 스트렙토마이세스 아비디니로부터 유래된 스트렙타비딘)은 알칼리성 포스파타제 또는 β-퍼옥시다제에 커플링될 수 있다. 이와 같은 검출 방법은 면역블롯팅, 면역조직화학법 또는 ELISA와 더불어 사용할 수 있다.

프로브-표적 하이브리드는 효소-연결된 면역검정으로 검출할 수 있다. 이러한 면역화학 검출 단계는 보통 방사성 검출 방법보다 더 민감하다. 이 검정에서 막은 필터와 항체의 비-특이적 상호작용을 방지하기 위해 차단할 수 있다. 디곡시게닌에 대해 특이적인 알칼리성 포스파타제-접합된 항체는 표지된 하이브리드 상의 디곡시게네인 분자를 인식한다. 알칼리성 포스파타제 기질의 추가는 하이브리드가 가시화되도록 해 준다.

화학발광 검출의 경우 알칼리성 포스파타제에 적합한 기질(예: 이나트륨 3-(4-메톡시스피로 {1,2-디옥세탄-3,2-(5-클로로)트리사이클로 [3.3.1.1^3,7]데칸}-4-일)페닐 포스페이트 또는 이나트륨 4-클로로-3-(메톡시스피로 {1,2-디옥세탄-3,2-(5-클로로)트리사이클로 [3.3.1.1^3,7]데칸}-4-일)페닐 포스페이트)은 디옥세탄 페닐 포스페이트의 그룹에 속한다. 알칼리성 포스파타제에 의해 탈인산화될 때 중간체가 형성되는데 이것이 분해되어 빛을 방출하며 이 빛은 예를 들면 X-선 필름상에 기록될 수 있다.

DIG-표지된 프로브의 비색 검출은 보통 산화환원계를 형성하는 무색 기질로 수행한다. 예로는 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-포스페이트와 4-니트로-블루-테트라졸륨-클로라이드와 같은 것을 들 수 있다. 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-포스페이트는 알칼리성 포스파타제에 의해 인디고로 산화되면서 포스페이트 기를 방출한다. 동시에, 4-니트로-블루-테트라졸륨-클로라이드가 디포르마잔으로 환원된다. 반응 생성물은 막의 종류에 따라 수불용성 암청색 내지 갈색 침전물을 형성한다.

여러 가지 리포터 분자가 검출 항체에 커플링되어 특이적 프로브-표적 하이브리드화를 가시화할 수 있으며 이로써 한정되는 것은 아니지만 효소-커플링된 항체, 형광색소-표지된 항체(형광염료에 의해 방출된 파장의 가시화를 허용하는 형광 현미경 및 특정 필터에 의한 검출) 및 금 콜로이드에 결합된 항체(동결절편 상에서의 전자현미경에 의한 검출)가 포함된다.

디곡시게닌-, 바이오틴- 및 형광색소-표지된 프로브의 조합을 사용하여 한 제제 내에서 상이한 염색체 영역 또는 상이한 RNA 서열의 위치를 파악함으로써 복수의 동시 하이브리드화를 수행할 수 있다. 이러한 복수프로브 실험은 항체에 커플링된 상이한 형광 염료를 사용함으로써 가능하다. 이러한 것으로 플루오레세인 또는 FITC(플루오레세인 이소티오시아네이트; 황색), 로다민 또는 TRITC(테트라메틸로다민 이소티오시아네이트; 적색) 및 AMCA(아미노-메틸쿠마린 아세트산; 청색)이 포함된다.

조절 서열에 대한 효과는 또한 조절 서열을 리포터 유전자에 부착시키고 생성된 DNA 작제물을 세포 또는 유기체 내로 도입함으로써 검출할 수 있다. 이것은 보통 세균 또는 배양물 내의 진핵 세포에서 플라스미드라고 하는 원형 DNA 분자 형태이다. 리포터 유전자의 발현은 해당 유전자의 성공적인 도입을 위한 마커로서 사용되고 있기 때문에, 연구중에 세포 또는 유기체에서 천연적으로 발현되지 않는 리포터 유전자를 사용하는 것이 중요하다. 시각적으로 식별가능한 특징을 유도하는 것으로 흔히 사용되는 리포터 유전자는 보통 형광 및 발광 단백질을 포함한다. 이의 예로는 이를 발현하는 세포가 청색광하에서 녹색을 발산하도록 하는 해파리 녹색 형광 단백질(GFP), 루시페린과의 반응을 촉매하여 발광을 유도하는 효소 루시페라제 및 유전자 dsRed로부터의 적색 형광 단백질을 암호화하는 유전자가 포함된다. 세균 유래의 또 다른 흔한 리포터는 단백질 β-갈락토시다제를 암호화하는 lacZ 유전자이다. 이 효소는 이 유전자를 발현하는 세균이 기질 유사체 X-gal을 함유하는 배지에서 성장될 때 청색을 발산하도록 한다(IPTG와 같은 유도 분자가 또한 천연 프로모터 하에서 필요하다). 세균 유래의 선별 마커 리포터의 예로는 항생제 클로람페니콜에 내성을 제공하는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 유전자이다. 시험 화합물의 효과는 대조군과 비교하여 상기 신호의 양을 측정함으로써 검출할 수 있다.

위에서 상세히 설명된 바와 같이 두번째 측면으로서 통증에 관여하는 화합물을 식별하는 방법은

a) Il2rg 단백질 또는 이의 작용성 활성 변이체를 포함하는 시험 시스템을 제공하고,

b) 상기 시험 시스템을 시험 화합물과 접촉시키며,

c) 상기 시험 시스템에 대한 상기 시험 화합물의 효과를 측정하는 단계

를 포함하고,

여기에서, 대조군과 비교하여 상기 시험 시스템에 대한 상기 시험 화합물의 유의적인 효과가 검출되는 경우, 상기 시험 화합물이 통증에 관여하는 화합물로서 식별된다.

따라서, Il2rg 단백질 또는 이의 변이체에 시험 화합물의 결합은 (i) Il2rg 단백질 또는 이의 변이체와 (ii) 시험 화합물의 복합체를 검출함으로써 결정할 수 있다. 두 가지 이상의 성분의 복합체를 검출하는데 적합한 방법은 위에서 및 아래에서 상세히 설명된다.

단백질을 검출하기 위한 적합한 방법은 본원에 기술되어 있고 예를 들면 표지된 단백질(예: 검출 마커, 태그 또는 효소 성분을 포함한 융합 단백질)의 검출, 단백질 면역염색, 단백질 면역침전, 면역전기영동, 면역블롯팅, 웨스턴 블롯팅, 분광광도법, 효소 검정 등이 포함된다. 이 방법은 검출 이전에 (예를 들면 크로마토그래피 방법, 단백질 추출, 단백질 가용화, 겔 전기영동 및 등전점전기영동에 의한) 단백질 분리를 포함한 단백질 정제를 요구할 수 있다.

단백질 면역염색은 시료 중의 특정 단백질을 검출하는 항체-기초 방법이다. 용어 면역염색은 처음엔 조직 절편의 면역조직화학 염색을 가리키기 위해 사용되었다. 그러나, 현재 면역염색은 항체-기초 염색 방법, 고정에 의해 보존되는 조직 절편 또는 세포의 면역조직화학 또는 면역세포화학을 사용하는 조직학, 세포 생물학 및 분자 생물학에서 사용되고 있는 광범위한 기술을 내포한다.

IHC 염색의 경우 처음에는 형광 염료를 사용한 한편, 현재는 퍼옥시다제 및 알칼리성 포스파타제와 같은 효소를 사용하는 비-형광 방법이 더 흔히 사용되고 있다. 이들 효소는 광현미경에 의해 쉽게 검출가능한 발색물을 제공하는 반응을 촉매할 수 있다. 다른 방법으로서, 방사성 원소가 표지로서 사용될 수 있으며, 면역반응은 자기방사법에 의해 가시화될 수 있다. 조직 제조 또는 고정은 세포 형태학 및 조직 구조의 보존을 위해 필수적이다. 부적절한 또는 지연된 고정은 항체 결합능을 상당히 감소시킬 수 있다. 많은 항원은 포르말린-고정된 파라핀-함입된 조직 절편에서 성공적으로 입증될 수 있다. 고정 방법 및 횟수의 최적화, 차단제로의 전처리, 고염과의 항체 배양 및 후-항체 세척 완충액 및 세척 횟수의 최적화는 고 품질의 면역염색을 얻는데 중요할 수 있다.

웨스턴 블롯팅은 임의의 정제 단계들 이전 또는 이후에 세포 또는 조직으로부터 생성된 추출물로부터 특정 단백질(천연 또는 변성)을 검출해 준다. 일반적으로 단백질은 건식, 반건식 또는 습식 블롯팅 방법을 통해 합성막(통상적으로 니트로셀룰로즈 또는 PVDE)으로 옮기기 전에 겔 전기영동에 의해 크기별로 분리된다. 이어서, 막은 고정할 필요없이 면역조직화학법과 유사한 방법을 사용하여 항체에 의해 프로빙될 수 있다. 통상적으로 검출은 화학발광 반응을 촉매하는 퍼옥시다제 연결된 항체를 사용하여 수행한다. 웨스턴 블롯팅은 추출물간의 단백질 수준을 반정량적으로 또는 정량적으로 비교하기 위해 사용될 수 있는 통상적인 분자 생물학 방법이다. 블롯팅 이전의 크기별 분리는 단백질 분자량을 공지된 분자량 마커와 비교하여 측정될 수 있도록 해 준다. 웨스턴 블롯팅은 조직 분쇄액 또는 추출물의 해당 시료에서 특정 단백질을 검출하는데 사용되는 분석 기술이다. 웨스턴 블롯팅은 겔 전기영동을 사용하여 단백질들을 폴리펩타이드의 길이별로 분리하거나(변성 조건) 단백질의 3-D 구조로 분리한다(천연/비변성 조건).

효소-연결된 면역흡착 검정 또는 ELISA는 멀티-웰 평판 포맷(보통 평판당 96웰)에서 혈장, 혈청 또는 세포/조직 추출물로부터 단백질 농도를 정량적으로 또는 반정량적으로 측정하는 진단 방법이다. 대략적으로는, 용액 중의 단백질이 ELISA 평판에 흡착된다. 해당 단백질에 대해 특이적인 항체가 평판을 탐지하기 위해 사용된다. 배경은 차단 및 세척 방법(IHC의 경우)을 최적화함으로써 최소화되며 특이성은 양성 및 음성 대조군의 존재를 통해 보장된다. 검출 방법은 보통 비색 또는 화학발광을 기초로 한다.

전자현미경 또는 EM은 조직 또는 세포의 세밀한 미세구조를 연구하는데 사용될 수 있다. 면역-EM은 초박(ultrathin) 조직 단편에서 특정 단백질의 검출을 가능하게 한다. 투과 전자현미경을 사용하여 중금속 입자(예: 금)로 표지된 항체를 직접 가시화할 수 있다. 면역-EM은 세포하 단백질 위치를 검출하는데 강력한 한편 기술적으로 어려움이 있고, 값이 비싸며, 조직 고정 및 처리 방법을 최적화하는 것이 까다로울 수 있다.

다른 방법으로서, 시험 화합물의 효과(예: 결합) 및 Il2rg 단백질에 대한 효과는 간접적으로 검출될 수 있다. 이 경우 Il2rg 단백질의 하류 효과를 검출할 수 있다. 예를 들면, 표현형에 대한 효과, 예를 들면 통각과민증 표현형의 증상이 결정될 수 있다.

본 발명의 바람직한 양태로서, 통증에 관여하는 화합물은 Il2rg 유전자 및/또는 Il2rg 단백질의 신호 전달 경로에 천연적으로 참여하는 세포 화합물이다.

앞에서 상세히 설명된 바와 같이, Il2rg는 적어도 6가지의 상이한 인터루킨 수용체(IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, IL-21 및 아마도 또한 IL-13 수용체)의 수용체 복합체에 공통적인 사이토킨 수용체 아단위이다.

그러나, 통증에서 Il2rg의 신호 전달 경로는 자세히 알려진 것이 거의 없다. 따라서, 신호 전달 경로의 성분들을 식별하는 것이 필요하다. 이를 위해 임의로 Il2rg의 신호 전달에 연루되어 있는 것으로 예상되는 세포 성분들이 검출될 수 있다. 이들은 통증에 관여하는 약제로서의 추가 표적일 수 있다.

본 발명의 바람직한 양태로서, 통증에 관여하는 화합물은 Il2rg 단백질의 상류 또는 하류의 신호 전달을 변경시킨다. 추가로 또는 다른 방법으로서, 통증에 관여하는 화합물은 Il2rg 유전자의 상류 또는 하류의 신호 전달을 변경시키며, 특히 이 화합물은 Il2rg 유전자의 발현을 변경시킨다.

앞서 상세히 설명한 바와 같이, 효과는 Il2rg 단백질 또는 유전자의 수준으로 측정될 수 있을뿐만 아니라 상류 또는 하류의 신호 전달 또는 발현 수준으로 측정될 수 있다. 예로는 Il2rg 유전자 수준(Il2rg 단백질의 상류), mRNA 수준(Il2rg 단백질의 상류 및 Il2rg 유전자의 하류), 단백질 수준(Il2rg 유전자의 하류) 및 표현형 수준(Il2rg 유전자 및 단백질의 하류)이 포함된다.

본 발명의 바람직한 양태로서, 통증에 관여하는 화합물은 Il2rg 유전자 및/또는 Il2rg 단백질의 신호 전달 경로에 천연적으로 참여하는 세포 화합물과 결합하며, 특히 통증에 관여하는 화합물은 Il2rg 유전자 또는 Il2rg 단백질에 결합하고, 특히 Il2rg 단백질에 결합한다.

명백하게는, Il2rg 유전자 및/또는 Il2rg 단백질의 신호 전달 경로에 천연적으로 참여하는 세포 화합물에 통증에 관여하는 화합물의 결합은 신호 전달에 필시 영향을 미친다는 것이다. 흔히, 신호 전달 경로에 천연적으로 참여하는 세포 화합물에 인공 화합물의 결합은 그 경로의 억제를 유도한다. 그러나, 인공 화합물은 그 경로를 활성화시키기 위해 설계될 수 있다. 양쪽 경우에서 그러한 결합은 경로에 영향을 미치는 것이므로 통증 민감성에 변화가 일어날 것이다.

본 발명의 바람직한 양태로서, 통증에 관여하는 화합물은 Il2rg 유전자의 상류 또는 하류의 신호 전달을 억제하며, 특히 이 화합물은 Il2rg 유전자의 발현을 억제한다. 본 발명의 바람직한 양태로서, 통증에 관여하는 화합물은 Il2rg 단백질의 상류 또는 하류의 신호 전달을 억제하며, 특히 이 화합물은 Il2rg 단백질에 결합한다. 실시예의 결과를 근거로 하여, 이들 화합물은 통증을 억제 또는 경감시킬 수 있으로 것으로 예상된다. 따라서, 이들 화합물은 바람직한 것이다.

본 발명의 다른 바람직한 양태로서, 시험 시스템은 세포 내, 예를 들면 동물 세포 내, 특히 포유동물 세포 내, 특히 사람 세포 내이다.

세포-기본 시스템은 세포를 증식시킴으로써 시험 시스템의 증폭을 간편하게 할 수 있고 세포 기전(예: 인슐린의 하류 또는 Il2rg 단백질 또는 유전자의 하류 또는 상류의 신호 전달 성분)이 세포의 변화된 당 흡수에 대한 지시 신호를 검출하는데 사용될 수 있기 때문에 유리하다.

본 발명과 관련하여 적합한 세포의 예는 이들로 한정하는 것은 아니지만 L6 세포, 3T3 지방세포, HEK 293, 745-A, A-431, 심방근육세포, BxPC3, C5N, Caco-2, Capan-1, CC531, CFPAC, CHO, CHO K1, COS-1, COS-7, CV-1, EAHY, EAHY 926, F98, GH3, GP&envAM12, H-295 R, H-4-II-E, HACAT, HACAT A131, HEK, HEL, HeLa, Hep G2, High Five, Hs 766T, HT29, HUV-EC R24, HUV-EC-C, IEC 17, IEC 18, Jurkat, K 562, KARPAS-299, L 929, LIN 175, MAt-LYLU, MCF-7, MNEL, MRC-5, MT4, N64, NCTC 2544, NDCK II, Neuro 2A, NIH 3T3, NT2/D1, P19, 1차 신경세포, 1차 수지상 세포, 1차 사람 근모세포, 1차 각질세포, SF9, SK-UT-1, ST, SW 480, SWU-2 OS, U-373, U-937 및 Y-1을 포함한다. 당해 분야의 숙련가는 다른 적합한 세포들을 잘 알고 있다.

동물 또는 사람으로부터 직접 배양되는 세포는 1차 세포로 알려져 있다. 종양으로부터 유래된 일부 세포주를 제외하고, 대부분의 1차 세포 배양물은 수명이 한정된다. 특정 수의 집단 배가 후 세포는 일반적으로 생존력은 유지하면서 노화 과정이 진행되고 분열이 정지된다.

확립 세포주 또는 무한증식 세포주는 무작위 돌연변이 또는 계획된 변형(예: 텔로머라제 유전자의 인공 발현)을 통해 무한히 증식하는 능력을 획득하였다. 특정 세포 유형을 대표하는 많은 확립 세포주가 있으며 적합한 세포주를 선택하는 것은 숙련가의 지식으로 용이하게 이루어질 수 있다.

따라서, 본 발명의 바람직한 양태로서, 세포는 세포주이다. 세포주는 단일 공통 조상 세포로부터 파생된 배양물에서 증식된 세포군체로서 이에 따라 유전학적으로 상기 조상 세포와 동일하다. 바람직한 세포주는 HEK 293 세포(1차 사람 배아 신장), 3T3 세포(쥐 배아 섬유아세포), CHO 세포(차이니즈 햄스터 난소세포), COS-7 세포(아프리카 녹색 원숭이 세포주), HeLa 세포(사람 상피 자궁경부암종 세포), JURKAT 세포(사람 T-세포 백혈병 세포), BHK 21 세포(햄스터 정상 신장, 섬유아세포) 및 MCF-7 세포(사람 유방암 세포)이다.

세포 또는 세포주는 효과의 검출을 위해 필요한 Il2rg 또는 성분들을 포함하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 특히 바람직한 세포주는 공지된 프로모터 시스템의 조절하의 Il2rg 암호화 유전자를 포함한다. 프로모터 시스템은 조절가능할 수 있으며, 예를 들면 화학물질에 의해 유도될 수 있거나 본질적으로 활성을 나타낼 수 있다. 이러한 프로모터 시스템들은 숙련가들에게 잘 알려져 있다.

다른 방법으로서, 세포 용해물(조, 분획된 또는 정제된)이 사용될 수 있다. 이들의 제조 방법에 대한 예는 숙련가에게 알려진 것으로 분쇄, 원심분리 및 재현탁을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 양태로서 이 방법은 고처리량 선별 방법이다.

고처리량 선별(HTS)은 특히 약물 개발에서 사용되고 생물학 및 화학 분야와 관련된 과학적 실험 방법이다. 고처리량 선별 또는 HTS는 예를 들면 로봇공학, 데이터 처리 및 관리 소프트웨어, 액체 조작 장치 및 감응 검출기를 사용하여 연구원들이 수천 또는 수백만의 생화학, 유전학 또는 약리학 시험을 신속하게 수행할 수 있도록 해 준다. 이러한 방법을 통해 연구자들은 특정 생분자 경로를 조절하는 활성 화합물, 항체 또는 유전자들을 빠르게 식별할 수 있다.

보통, HTS는 후보 화합물의 라이브러리에 대한 검정 선별을 가동하는 자동화를 사용한다. 통상적인 HTS 선별 라이브러리 또는 "데크(deck)"는 100,000 내지 2,000,000개 이상의 화합물을 함유할 수 있다.

가장 흔하게 사용되는 HTS의 핵심 시험 용기는 멀티-웰 평판 또는 마이크로평판이다. 현재 사용되는 HTS 마이크로평판은 일반적으로 96, 384, 1536 또는 3456 웰을 갖는다. 이들 모두는 너비 9 mm 웰이 8 x 12개로 배치된 96웰 마이크로평판을 시작으로 이의 배수로 증가된다. 대부분의 웰은 실험적으로 유용한 물질, 흔히 디메틸 설폭사이드(DMSO)와 평판에 따라 각각의 웰에 대해 상이한 일부 다른 화합물의 수용액을 함유한다. 다른 웰들은 임의의 실험 대조군으로 사용할 의도로서 비어 둘 수 있다.

검정을 준비하기 위해 연구자는 평판의 각 웰을 실험하고자 하는 일부 생물학적 물질로 채운다. 본 발명의 경우에 Il2rg 핵산 또는 단백질을 포함하는 시험 시스템이 충진된다. 웰 내의 화합물과 생물학적 물질이 흡착, 결합 또는 반응하도록 배양 시간을 보낸 후 모든 평판의 웰을 수작업으로 또는 기기를 사용하여 측정한다. 자동화 전용 분석 기기는 웰에 대해 많은 실험을 가동할 수 있게 한다(예를 들면, 웰에 편광을 조사하고 반사율을 측정하여 단백질 결합을 파악할 수 있다). 이 경우에서, 기기는 각 실험의 결과를 숫자 값의 격자로 도출할 수 있으며, 각 숫자는 단일 웰로부터 얻은 값을 도식화한 것이다. 고용량 분석기기는 이와 같이 아주 작은 공간에서 수십개의 평판을 측정하여 수천 개의 실험 데이터 점을 아주 신속하게 생성할 수 있다.

본 발명의 바람직한 양태로서 통증은 신경병증 통증이다. 통각과민증 또는 신경병증 통증은 비침해성 통증으로서 정의되거나 다르게는 신체의 임의의 부위에서 통증 수용체 세포의 활성화와 무관한 통증으로서 정의될 수 있다. 통각과민증은 신경 구조 또는 기능의 변화에 의해 발생된 통증으로 알려져 있다. 침해성 통증과 달리 신경통은 계속적인 침해성 입력이 없이 발생한다. 신경통은 2 가지 부류로 나뉜다: 중추 신경통 및 말초 신경통. 이러한 비정상적인 통증은 4가지의 가능한 기전과 연계되어 있는 것으로 여겨진다: 이온 게이트 기능부전; 기계적으로 민감하게되어 이소(ectopic) 신호를 발생하는 신경; 대소 섬유들간의 신호 교차; 및 중추 프로세서의 손상에 의한 기능부전.

신경통은 흔히 진단이 어렵고 대체로 치료 효과가 극히 미미하거나 전혀 없다. 통상적으로 진단은 상실된 감각 또는 운동 기능을 확인함으로써 손상된 신경의 위치를 파악하는 것을 포함한다. 이것은 EMG 시험 또는 신경 전도 시험과 같은 검사를 포함한다. 신경통은 정상적인 통증 약물에 잘 반응하지 않기 때문에 다른 유형의 통증보다 치료가 더 어렵다. 이것은 이와같은 통증을 진단 및 치료하는 새로운 방법이 개발될 필요가 있고 Il2rg 핵산 및 단백질이 흥미로운 표적을 제공한다는 것을 입증한다.

세번째 측면으로서 본 발명은 통증에 관여하는 화합물을 식별하기 위한 Il2rg 핵산의 용도를 제공하며, 네번째 측면으로 본 발명은 통증에 관여하는 화합물을 식별하기 위한 Il2rg 단백질의 용도를 제공한다.

용어 "Il2rg 핵산", "Il2rg 단백질" 및 "통증에 관여하는 화합물의 식별"은 본 발명의 방법과 관련하여 제공된 정의에 따른다. 상기된 방법은 식별을 위해 사용될 수 있음을 주지하여야 한다.

본 발명에 따른 세번째 또는 네번째 측면의 바람직한 양태로서 화합물 및/또는 통증은 본 발명에 따른 방법의 바람직한 양태와 관련하여 위에서 정의한 바와 같다.

본 발명에 따라 식별된 통증에 연루되는 화합물은 약제로서 사용될 수 있다. 약제의 제조를 위해 식별된 표적 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염은 일반적으로 약제학적으로 허용되는 담체 또는 보조제와 같은 성분들이 목적하는 특징을 제공하도록 배합된 혼합물로 이루어진 약제학적 용량형이어야 한다.

제형은 한 가지 이상의 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 또는 보조제를 포함한다. 이와 같은 물질의 예는 탈염수, 등장염수, 링거액, 완충액, 유기 또는 무기 산 및 염기뿐만아니라 이들의 염, 염화나트륨, 탄화수소나트륨, 나트륨 시스레이트 또는 인산이칼슘, 글리콜(예: 프로필렌 글리콜), 에스테르(예: 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트), 당(예: 글루코즈, 수크로즈 및 락토즈), 전분(예: 옥수수 전분 및 감자 전분), 가용화제 및 유화제(예: 에틸 알코올, 이소프로필 알코올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 디메틸 포름아미드), 오일(예: 땅콩유, 면실유, 옥수수유, 대두유, 피마자유), 합성 지방산 에스테르(예: 에틸 올레에이트, 이소프로필 미리스테이트), 고분자 보조제(예: 젤라틴, 덱스트란, 셀룰로즈 및 이의 유도체, 알부민, 유기 용매), 착화제(예: 시트레이트 및 우레아), 안정화제(예: 프로테아제 또는 뉴클레아제 억제제, 바람직하게는 아프로티닌, ε-아미노카프르산 또는 펩스타틴 A), 보존제(예: 벤질 알코올), 산화 억제제(예: 아황산나트륨), 왁스 및 안정화제(예: EDTA)를 들 수 있다. 착색제, 이형제, 피복제, 감미제, 풍미제 및 방향제, 보존제 및 항산화제가 또한 상기 조성물에 존재할 수 있다. 생리학적 완충액은 바람직하게는 약 6.0-8.0의 pH, 특히 6.8-7.8의 pH, 특히 약 7.4의 pH 및/또는 약 200-400 밀리몰/리터의 삼투압, 바람직하게는 약 290-310 밀리몰/리터의 삼투압을 갖는다. 약제의 pH는 일반적으로 적합한 유기 또는 무기 완충액, 바람직한 예로 인산염 완충액, 트리스 완충액(트리스(하이드록시메틸)아미노메탄), HEPES 완충액([4-(2-하이드록시에틸)피페라지노]에탄설폰산) 또는 MOPS 완충액(3-모르폴리노-1-프로판설폰산)으로 조정한다. 일반적으로 각 완충액의 선택은 목적하는 완충액의 몰에 의해 좌우된다. 인산염 완충액이 예를 들면 주사액 및 주입액을 위해 적합하다. 약제뿐만 아니라 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 또는 보조제를 제형하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 약제학적으로 허용되는 담체 및 보조제는 통상적인 용량형 및 사용된 화합물에 의해 적절히 선택된다.

약제학적 조성물은 경구, 비내, 직장, 비경구, 질내, 국소 또는 질 투여용으로 제조될 수 있다. 비경구 투여는 피하, 피내, 근육내, 정맥내 또는 복강내 투여를 포함한다.

약제는 캡슐, 정제, 환제, 산제 및 과립제와 같은 경구 투여용 고상 용량형; 약제학적으로 허용되는 에멀젼, 마이크로에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭서제와 같은 경구 투여용 액상 용량형; 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액과 같은 주사제; 직장 또는 질내 투여용 조성물, 바람직하게는 좌제; 및 연고, 페이스트, 크림, 로션, 젤, 분말, 용액, 분무제, 흡입제 또는 패치와 같은 국소 또는 경피 투여용 용량형을 포함하여 다양한 용량형으로 제형화될 수 있다.

임의의 특정 환자를 위한 특정한 치료 유효량 수준은 식별된 화합물의 활성, 용량형, 환자의 연령, 체중 및 성별, 치료기간 및 기타 의료 분야에서 잘 알려져 있는 요인들을 포함한 다양한 요인들에 의해 좌우된다.

사람 또는 다른 포유동물에게 단일 용량 또는 분할 용량으로 투여되는 본 발명에 따른 화합물의 총 1일 용량은 예를 들면 체중 1kg 당 약 0.01 내지 약 50 mg, 더 바람직하게는 약 0.1 내지 약 25 mg이다. 단일 용량 조성물은 1일 용량을 구성하는 양 또는 분할량을 함유할 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 따른 치료 용법은 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 본 발명에 따른 화합물(들)을 1일 약 10 mg 내지 약 1000 mg씩 단일 용량 또는 수회 용량으로 투여하는 것을 포함한다.

다섯번째 측면에서 본 발명은

a) 대상자의 시료에서 Il2rg 유전자의 발현 수준을 측정하고,

b) Il2rg 유전자의 발현 수준이 대조군과 비교하여 대상자의 시료에서 증가된 경우 그 대상자는 통각과민증으로 식별하는 단계

를 포함하는, 통각과민증 진단 방법을 제공한다.

실시예에 기술된 바와 같이, Il2rg 유전자의 발현 수준은 통각과민증과 상관관계에 있다. 따라서, 이러한 발현 수준은 Il2rg-연관된 통각과민증을 진단하는데 사용될 수 있다. 유전자의 발현 수준은 유전자 수준, mRNA 수준 또는 단백질 수준에서 검출될 수 있다.

증가된 발현 수준은 Il2rg 유전자의 증가된 복제수에 기인할 수 있다. 유전자의 복제수 증가가 원인이 되는 일련의 질병들이 알려져 있다. 예를 들면, 유방암의 한 가지 원인은 HER-2 증폭일 수 있다. 유전자 증폭은 면역조직화학(IHC) 및 은, 발색 또는 형광 현장 하이브리드화(SISH/CISH/FISH)에 의해 측정될 수 있다.

프로브의 현장 하이브리드화(ISH)는 세포 또는 조직 내에서 진행된다. 이 과정 내내 세포 구조가 유지되기 때문에 ISH는 조직 시료 내의 mRNA 위치에 대한 정보를 제공한다. 그 절차는 시료를 예를 들면 중성-완충된 포르말린에 고정하고 조직을 파라핀에 함입함으로써 개시된다. 이어서 시료를 박층으로 절편하고 현미경 슬라이드에 올려놓는다. (다른 방법으로서, 조직을 동결하여 절편한 후 파라포름알데하이드에 후-고정할 수 있다.) 박편을 수회 세척하여 밀랍을 제거하고 재수화시킨 후, 프로테이나제 K 분해를 수행하여 프로브 접근성을 높여주며, 이때 표지된 프로브는 시료 박편에 하이브리드화된다. 방사성표지된 프로브는 슬라이드 상에서 건조되는 액체 필름으로 가시화되는 한편, 비동위원소 표지된 프로브는 편리하게는 비색 또는 형광 시약으로 검출된다.

다른 방법으로서, 유전자 증폭은 가상 핵형 또는 비교 유전체 하이브리드화에 의해 검출될 수 있다. 파괴된 DNA로부터 고해상 핵형을 가상적으로(in silico) 생성하는 플랫폼, 예를 들면 어레이 비교 유전체 하이브리드화(arrayCGH) 및 SNP 어레이가 개발되었다. 개념상 이들 어레이는 유전체 내의 해당 영역에 상보적인 수백 내지 수백만 개의 프로브로 구성된다. 피검 시료로부터 파괴된 DNA는 절편화되고, 표지되어 어레이에 하이브리드화된다. 각 프로브의 하이브리드화 신호 강도는 특정 소프트웨어에 적용되어 어레이 상의 각 프로브에 대해 시험/정상의 log2 비를 생성한다. 소프트웨어에 어레이상의 각 프로브 위치와 유전체 내 각 프로브 위치에 관한 정보가 입력되어 염색체 순서로 프로브를 배열하고 유전체를 가상적으로 재구성한다.

또한 많은 PCR-기본 방법들이 앞에서 기술되었다.

다른 방법으로서 또는 추가의 방법으로서, Il2rg 발현 수준은 mRNA 또는 단백질 수준에서 검출될 수 있다. 이 경우에 mRNA 또는 Il2rg 단백질의 양이 검출된다. mRNA 또는 단백질을 검출하기 위해 적합한 방법은 앞에서 설명된 바 있다.

본 발명은 본원에 기술된 특정 방법, 프로토콜 및 시약에 한정되는 것이 아니며, 그 이유는 이러한 것들이 다양하게 변화될 수 있기 때문이다. 또한, 본원에 사용된 용어는 단지 특정 양태를 기술하기 위한 목적에 있으며 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 의도는 없다. 본원 명세서 및 특허청구범위에 사용되는 "단수 표현들(a, an)" 및 "당해(the)"는 달리 문맥에서 분명히 지시되지 않는 한 복수 표현을 포함한다. 마찬가지로, 용어 "포함하다", "함유하다" 및 "내포하다"는 배타적이 아닌 포괄적으로 해석되어야 한다.

본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어 및 임의의 약어들은 달리 정의되지 않는 한 당업자에 의해 흔히 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다. 비록 본원에 기술된 바와 유사하거나 동일한 임의의 방법 및 물질들은 본 발명을 수행하는데 사용될 수 있지만 본원에서는 바람직한 방법 및 물질이 기술되어 있다.

추가로 본 발명은 아래의 도면 및 실시예에 예시되어 있다. 그러나, 이들 실시예는 단지 예시하는 목적으로 포함된 것이며 달리 구체적으로 지시되지 않는 한 본 발명의 범위를 한정하는 의도가 아님을 이해하여야 한다.

도 1은 모든 개별 마우스에 대해 신경병증 통증 표현형 점수(기계적 과민반응, X-축) 및 L5 DRG에서 Il2rg의 상응하는 유전자 조절(로그비(청(Chung) 대 샴(sham) 대조군), Y-축)을 보여준다. 마우스 데이터는 사용된 마우스 스트레인에 따라 심볼로 구분하여 표시되어 있다. Pearson 상관 분석을 수행한 결과 두 변수인 통증 표현형과 로그비 유전자 조절의 유의적인 양성 상관성이 나타났다. 이것은 개별적인 마우스에 대해서 청-시술된 신경병증 마우스에서의 Il2rg의 L5 DRG 발현이 높을수록 기계적 통각과민증과민이 행동 시험에서 나타난 것처럼 더 현저하게 나타났음을 의미한다.
이러한 유의적인 상관성은 신경병증 통증 표현형의 유도를 위한 Il2rg 유전자 발현의 인과관계를 가리킨다(R(Pearson) = 0.765; p-값 = 5.35*10^-6; FDR = 0.006).
도 2는 L5 DRG의 Il2rg에 대한 대표적인 강도 데이터를 보여준다(3d p.o).

실시예:

통각과민증에 관여하는 단백질로서의 Il2rg의 식별

통증 치료를 위한 신규한 표적을 식별하기 위해, 조절시 만성 신경병증 통증을 유발하는 유전자의 식별을 위한 상관 분석을 수행하였다(참조: Persson et al., 2009, Molecular Pain 5:7). 요약하면, 근친교배 마우스 스트레인 AKR/J(AKR), C57BL/6J(C57/B6) 및 CBA/J(CBA)의 척수신경절(DRG)의 RNA 시료를 검사하였다. 사용된 근친교배 마우스 스트레인은 Jackson Laboratory(미국 메인주 바하버 소재)에서 입수하였다. 청에 의해 시술된 신경병증 통증 모델(참조: Kim and Chung, 1992, Pain 50: 355-363) 및 상응하는 샴-시술된 대조 동물의 L5 위치 척수 신경을 축색절단하였다. 시료를 Affymetrix 마이크로어레이(MOE430 2.0)로 분석하였다. 각 그룹에서 적어도 5 마리 동물을 시험하였다. DRG의 제거 이전에 모든 마우스에 대해 통증 표현형 "기계적 통각과민증과민"의 증상을 결정하였다(상기 Persson et al., 특히 섹션 "Behavioral testing"). 3개의 마우스 스트레인은 표현형이 달랐다. CBA 마우스, C57/B6 마우스 및 AKR 마우스에서 표현형은 각각 저, 중 및 고 수준의 증상으로 나타났다.

유전자 발현 실험을 수행하기 위한 목적으로, 쥐 DRG의 전체 RNA를 분리하는 방법이 개발되었고(상기 Persson et al., 특히 섹션 "RNA extraction for TaqMan and microarray analysis") 이 방법은 RNA를 충분한 양(>300 ng) 및 품질로 제공하였다. 3개의 마우스 스트레인(청-시술된 또는 샴-시술된 대조 동물)의 L5 DRG로부터 RNA를 추출한 후 RNA 프로브를 Affymetrix 마이크로어레이(MOE430 2.0)에 하이브리드화하였다.

Affymetrix 유전자 발현 데이터를 통계적으로 분석하고 상관 분석 이전에 여과하였다. 아래의 필터 기준이 사용되었다:

- 모든 청-시술된 동물들 중 적어도 60%의 Abs. 폴드-체인지(fold-change) 변화 ≥ 1.5 또는

- 모든 청-시술된 동물들 중 적어도 20% ≥ 2.0(각각 모든 샴-시술된 대조 동물의 평균치와 대비) 및

- 적어도 5마리 동물에서의 유전자 발현 강도 > 50(배경 수준).

3개의 마우스 스트레인의 개별 표현형 데이터 및 이들의 유전자 발현 데이터(로그비(청-시술 대 샴-시술)로 표시) 또는 청-시술된 동물의 발현 강도가 상관분석을 위해 사용되었다.

상기 필터 기준을 충족하는 각 유전자의 경우 유전자 발현 데이터 및 표현형 데이터(기계적 과민반응)의 Pearson 상관계수를 계산하였다(상기 Persson et al., 특히 섹션 "Correlational analysis"). 단일 유전자의 상관관계의 유의성을 결정하기 위해 오류발견율(FDR)이 도입되었다(참조: Storey, J.D.(2002) J. R. Statist. Soc. 64, part 3, 479-498). FDR > 0.05인 유전자의 Pearson 상관계수는 유의적인 것으로 간주되었다. 로그비 데이터(청-시술 대 샴-시술) 및 발현 강도를 사용하여 각각 74개 서열과 114개 유전자가 식별되었다. 이들 서열/유전자에 대한 데이터는 유전자 발현과 표현형 데이터(FDR < 0.05)의 유의적 상관성을 나타냈고 통증 및 통각과민증과민에 연루되어 있는 것으로 알려지지 않았다.

발현과 통증 표현형의 최상의 상관성을 갖는 유전자들 중 Il2rg 유전자의 경우 로그비 데이터 및 기계적 과민반응의 상관성 분석 결과 0.765의 Pearson 상관계수 (5.35*10^-6의 p 값) 및 0.006의 FDR로 나타냈다.

<110> Sanofi <120> Methods and uses relating to the identification of compound involved in pain as well as methods of diagnosing algesia <130> DE2010/010 WO <150> EP 10305068.8 <151> 2010-01-21 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 369 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Leu Lys Pro Ser Leu Pro Phe Thr Ser Leu Leu Phe Leu Gln Leu 1 5 10 15 Pro Leu Leu Gly Val Gly Leu Asn Thr Thr Ile Leu Thr Pro Asn Gly 20 25 30 Asn Glu Asp Thr Thr Ala Asp Phe Phe Leu Thr Thr Met Pro Thr Asp 35 40 45 Ser Leu Ser Val Ser Thr Leu Pro Leu Pro Glu Val Gln Cys Phe Val 50 55 60 Phe Asn Val Glu Tyr Met Asn Cys Thr Trp Asn Ser Ser Ser Glu Pro 65 70 75 80 Gln Pro Thr Asn Leu Thr Leu His Tyr Trp Tyr Lys Asn Ser Asp Asn 85 90 95 Asp Lys Val Gln Lys Cys Ser His Tyr Leu Phe Ser Glu Glu Ile Thr 100 105 110 Ser Gly Cys Gln Leu Gln Lys Lys Glu Ile His Leu Tyr Gln Thr Phe 115 120 125 Val Val Gln Leu Gln Asp Pro Arg Glu Pro Arg Arg Gln Ala Thr Gln 130 135 140 Met Leu Lys Leu Gln Asn Leu Val Ile Pro Trp Ala Pro Glu Asn Leu 145 150 155 160 Thr Leu His Lys Leu Ser Glu Ser Gln Leu Glu Leu Asn Trp Asn Asn 165 170 175 Arg Phe Leu Asn His Cys Leu Glu His Leu Val Gln Tyr Arg Thr Asp 180 185 190 Trp Asp His Ser Trp Thr Glu Gln Ser Val Asp Tyr Arg His Lys Phe 195 200 205 Ser Leu Pro Ser Val Asp Gly Gln Lys Arg Tyr Thr Phe Arg Val Arg 210 215 220 Ser Arg Phe Asn Pro Leu Cys Gly Ser Ala Gln His Trp Ser Glu Trp 225 230 235 240 Ser His Pro Ile His Trp Gly Ser Asn Thr Ser Lys Glu Asn Pro Phe 245 250 255 Leu Phe Ala Leu Glu Ala Val Val Ile Ser Val Gly Ser Met Gly Leu 260 265 270 Ile Ile Ser Leu Leu Cys Val Tyr Phe Trp Leu Glu Arg Thr Met Pro 275 280 285 Arg Ile Pro Thr Leu Lys Asn Leu Glu Asp Leu Val Thr Glu Tyr His 290 295 300 Gly Asn Phe Ser Ala Trp Ser Gly Val Ser Lys Gly Leu Ala Glu Ser 305 310 315 320 Leu Gln Pro Asp Tyr Ser Glu Arg Leu Cys Leu Val Ser Glu Ile Pro 325 330 335 Pro Lys Gly Gly Ala Leu Gly Glu Gly Pro Gly Ala Ser Pro Cys Asn 340 345 350 Gln His Ser Pro Tyr Trp Ala Pro Pro Cys Tyr Thr Leu Lys Pro Glu 355 360 365 Thr

Claims (15)

1. 통증에 관여하는 화합물을 식별하는 방법으로서,
   a) Il2rg 핵산을 포함하는 시험 시스템을 제공하는 단계,
   b) 상기 시험 시스템을 시험 화합물과 접촉시키는 단계 및
   c) 상기 시험 시스템에 대한 상기 시험 화합물의 효과를 측정하는 단계
   를 포함하고,
   여기에서, 대조군과 비교하여 상기 시험 시스템에 대한 상기 시험 화합물의 유의적인 효과가 검출되는 경우, 상기 시험 화합물이 통증에 관여하는 화합물로서 식별되는, 통증에 관여하는 화합물을 식별하는 방법.
2. 통증에 관여하는 화합물을 식별하는 방법으로서,
   a) Il2rg 단백질 또는 이의 기능적 활성 변이체를 포함하는 시험 시스템을 제공하는 단계,
   b) 상기 시험 시스템을 시험 화합물과 접촉시키는 단계 및
   c) 상기 시험 시스템에 대한 상기 시험 화합물의 효과를 측정하는 단계
   를 포함하고,
   여기에서, 대조군과 비교하여 상기 시험 시스템에 대한 상기 시험 화합물의 유의적인 효과가 검출되는 경우, 상기 시험 화합물이 통증에 관여하는 화합물로서 식별되는, 통증에 관여하는 화합물을 식별하는 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 통증에 관여하는 화합물이 Il2rg 유전자 및/또는 Il2rg 단백질의 신호 전달 경로에 천연적으로 참여하는 세포 화합물인, 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 통증에 관여하는 화합물이 Il2rg 단백질의 상류 또는 하류의 신호 전달을 변경시키는, 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 통증에 관여하는 화합물이 Il2rg 유전자의 상류 또는 하류의 신호 전달을 변경시키고, 특히 상기 화합물이 Il2rg 유전자의 발현을 변경시키는, 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 통증에 관여하는 화합물이 Il2rg 유전자 및/또는 Il2rg 단백질의 신호 전달 경로에 천연적으로 참여하는 세포 화합물에 결합하고, 특히 상기 통증에 관여하는 화합물이 Il2rg 핵산 또는 Il2rg 단백질에 결합하며, 특히 Il2rg 단백질에 결합하는, 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 통증에 관여하는 화합물이 Il2rg 유전자의 상류 또는 하류의 신호 전달을 억제하고, 특히 상기 화합물이 Il2rg 유전자의 발현을 억제하는, 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 통증에 관여하는 화합물이 Il2rg 단백질의 상류 또는 하류의 신호 전달을 억제하고, 특히 상기 화합물이 Il2rg 단백질과 결합하는, 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시험 시스템이 세포 내에 존재하는, 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 고처리량(high-through-put) 방법인, 방법.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 통증이 신경병증 통증인, 방법.
12. 통증에 관여하는 화합물을 식별하기 위한 Il2rg 핵산의 용도.
13. 통증에 관여하는 화합물을 식별하기 위한 Il2rg 단백질의 용도.
14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 용도가 제3항 내지 제8항 및 제11항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같이 추가로 정의되는, 용도.
15. 통각과민증의 진단 방법으로서,
    a) 대상자의 시료에서 Il2rg 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계, 및
    b) Il2rg 유전자의 발현 수준이 대조군과 비교하여 상기 대상자 시료에서 증가된 경우 상기 대상자를 통각과민증으로 식별하는 단계
    를 포함하는, 통각과민증의 진단 방법.

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