KR20120125709A - Arabidopsis transgenic plant harboring AtPP5 mutated gene construct for enhancing thermotolerance - Google Patents

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Abstract

PURPOSE: A transgenic Arabidopsis plant containing AtPP5 mutant gene construct is provided to enhance heat shock resistance and to enhance phosphatase activity. CONSTITUTION: A serine/threonine protein phosphatase 5(AtPP5) protein contains: three tetratricopeptide repeat(TPR) domain at amino acid residue 13-110 regions; a helix at amino acid 114-150 regions; a phosphatase active region at amino acid 190-459 regions; and a nuclear localization signal(NLS) region at amino acid 459-484 regions. The AtPP5 is denoted by sequence number 1. A method for producing a transgenic Arabidopsis plant which overexpresses AtPP5 protein or mutant thereof comprises: a step of assembling cDNA encoding serine/threonine protein phosphatase 5(AtPP5) or cDNA construct encoding a mutant of the protein; a step of inserting the cDNA into T-plasmid expression vector and co-culturing the vector with Argobacterium strain and Arabidopsis callus; a step of transducing the cDNA construct into Arabidopsis plant cells and transforming; and a step of growing the transformed plant cells. [Reference numerals] (AA, BB) Phosphatase

Description

ＡｔＰＰ５ 변이 유전자 컨스트럭트를 지닌 열 완충성이 증진된 형질전환 아라비돕시스 식물체 {Arabidopsis transgenic plant harboring AtPP5 mutated gene construct for enhancing thermotolerance}Arabidopsis transgenic plant harboring AtPP5 mutated gene construct for enhancing thermotolerance

본 발명은 AtPP5 변이 유전자 컨스트럭트를 지닌 열 완충성이 증진된 형질전환 아라비돕시스 식물체에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 세린/트레오닌 단백질 포스파타아제 5(AtPP5) (AGI Code : At2G42810)의 변이체의 과발현을 통해 열 완충성이 증진되고 분자 샤페론 활성이 유지된 아라비돕시스 형질전환 식물체에 관한 것이다. 또한 상기 아라비돕시스 형질전환 식물체는 고온 충격시 아라비돕시스 탈리아나에서 분리된 세린/트레오닌 단백질 포스파타아제 5(AtPP5) 변이체가 모노머 또는 올리고머 형태의 저분자량 형태에서 고분자량 콤플렉스로 변환되며, 저분자량 형태인 경우 AtPP5는 폴다아제(foldase) 샤페론 및 탈인산화효소 활성을 나타내고 고분자량 콤플렉스 형태인 경우 AtPP5 콤플렉스는 홀다아제(holdase) 샤페론 활성을 나타내어 열 완충성이 증진된 아라비돕시스 형질전환 식물체에 관한 것이다.
The present invention relates to a transgenic Arabidopsis plant with enhanced heat buffering properties with an AtPP5 mutant gene construct. More specifically, Arabidopsis has enhanced heat buffering and maintains molecular chaperone activity through overexpression of a variant of serine / threonine protein phosphatase 5 (AtPP5) (AGI Code: At2G42810). It relates to a transgenic plant. Also said Arabidopsis The transgenic plant converts the serine / threonine protein phosphatase 5 (AtPP5) variant isolated from Arabidopsis thaliana at low temperature to a high molecular weight complex from a low molecular weight form in monomeric or oligomeric form, and AtPP5 in the low molecular weight form. In the case of foldase chaperone and dephosphatase activity and in the form of a high molecular weight complex, the AtPP5 complex relates to Arabidopsis transgenic plants exhibiting holdase chaperone activity to enhance heat buffering.

식물은 에너지원으로서 태양광을 이용하는 독립영양 고착 생물(sessile organism)이다. 태양광은 그들의 성장과 발달에 영향을 미치는 중요한 환경인자이다. 식물은 고정된 상태이기 때문에 이들은 종종 고온 스트레스를 받으며, 이는 비가역적 손상을 일으킬 수 있다. 증가된 온도에 의해 야기된 막 유동성과 투과성의 변화는 막-연결된 과정에 음성적 영향을 미칠 수 있다. 또한 효소의 기능은 열 충격 스트레스에 의해 손상될 수 있다. 효소의 고온-유도 변성은 완전한 효소 불활성화를 야기할 수 있다. 막과 단백질의 손상은 활성산소(ROS) 생성을 초래하며, 이는 아폽토시스와 관련되어 있다. 상기 고온-매개 효과는 지구온난화에 대한 미래 예측을 감안시 특히 중요하다.
Plants are autotrophic sessile organisms that use sunlight as their energy source. Solar is an important environmental factor that affects their growth and development. Because plants are stationary, they are often subject to high temperature stresses, which can cause irreversible damage. Changes in membrane fluidity and permeability caused by increased temperature can have a negative effect on the membrane-linked process. Enzyme function can also be impaired by heat shock stress. Hot-induced denaturation of enzymes can lead to complete enzyme inactivation. Damage to membranes and proteins results in free radicals (ROS) production, which are associated with apoptosis. The high temperature-mediated effect is particularly important given the future predictions of global warming.

식물은 고온 스트레스 극복에 관한 정교한 생리학적 및 생화학적 메커니즘을 지니고 있다. 이 메커니즘은 출엽 방향의 변화, 지질 조성의 변경 및 발산 냉각(transpiration cooling)을 통한 단기 회피 또는 순응을 포함한다. 잠재적인 치사 온도에서 생존하기 위해서 식물은 기초 열 완충성과 고온에서 생존하는 능력인 획득된 열 완충성 모두를 발달시켰으며, 이는 상이한 환경 조건 하에서 막 유동성과 효소 능력 유지를 위한 더욱 일반화된 메커니즘을 나타낸다. 예를 들면 심지어 식물이 서식지에서 성장하고 정상 온도 범위에서 이들은 순응이 없어 치명적일 수 있는 고온과 상온의 주요한 일주 변동에 노출될 수 있다. 열 충격 단백질(HSPs)의 생성은 획득된 열 완충성의 가장 잘-특성화된 측면이다.
Plants have sophisticated physiological and biochemical mechanisms for overcoming high temperature stress. This mechanism includes short term avoidance or compliance through changes in leaf orientation, changes in lipid composition, and transpiration cooling. To survive at potential lethal temperatures, plants developed both basal heat buffers and the obtained heat buffers, the ability to survive at high temperatures, indicating a more generalized mechanism for maintaining membrane fluidity and enzyme capacity under different environmental conditions. . For example, even when plants grow in their habitats and in the normal temperature range, they may be exposed to major diurnal fluctuations in high and ambient temperatures that can be fatal due to lack of compliance. The production of heat shock proteins (HSPs) is the best-characterized aspect of the heat buffer obtained.

매우-보존된 열 충격 단백질(HSPs)이 모든 살아있는 유기체에서 발견되었다. 대부분의 열 충격 단백질은 세포의 샤페론 활성과 연결되어 있었으며, 이는 목적 단백질의 열 스트레스-유도 변성 및 응집 방지에 책임이 있다. 분자 샤페론은 다른 단백질의 비-천연 상태와 상호작용하는 단백질로서 광범위하게 정의될 수 있다. 이 활성은 새로-합성된 폴리펩티드의 폴딩, 멀티-서브 유니트 구조의 조립, 막을 가로질러 트랜스로케인션에 적절한 폴드되지 않은 상태에서 단백질의 유지, 세포의 신호에 의해 턴 온되는 단백질 불활성 형태의 안정화 및 세포 스트레스 동안 폴드되지 않은 상태인 단백질의 안정화에 중요하다.
Highly-conserved heat shock proteins (HSPs) have been found in all living organisms. Most heat shock proteins have been linked to the chaperone activity of the cell, which is responsible for the heat stress-induced denaturation and prevention of aggregation of the protein of interest. Molecular chaperones can be broadly defined as proteins that interact with the non-natural state of other proteins. This activity involves the folding of newly-synthesized polypeptides, the assembly of multi-subunit structures, the maintenance of proteins in the unfolded state appropriate for translocation across the membrane, and the stabilization of protein inactive forms that are turned on by cellular signals. And stabilization of proteins that are unfolded during cellular stress.

식물에서 많은 세포의 기능은 목표 단백질의 인산화 및 탈인산화에 의해 조절된다. 아라비돕시스 단백질 포스파타아제 5(AtPP5)는 세린/트레오닌-특이적 단백질 포스파타아제 군의 일종이며, 이는 광범위하게 분포되며 진핵생물 중에서 매우 보존된다. 서브 세포의 국소화(localization) 연구는 PP5가 핵과 세포질 모두에 존재한다는 것을 나타낸다. 흥미롭게도 PP5는 PP1 및 PP2A를 포함하는 다른 단백질 포스파타아제와 비교시 특이하게 낮은 포스파타아제 활성을 나타낸다.
The function of many cells in plants is regulated by phosphorylation and dephosphorylation of target proteins. Arabidopsis protein phosphatase 5 (AtPP5) is a family of serine / threonine-specific protein phosphatase families, which is widely distributed and highly conserved among eukaryotes. Localization studies of subcells indicate that PP5 is present in both the nucleus and cytoplasm. Interestingly, PP5 exhibits a particularly low phosphatase activity as compared to other protein phosphatase including PP1 and PP2A.

패밀리 내의 다른 단백질과는 달리 AtPP5는 C-말단 포스파타아제 도메인과 융합된 N-말단 3개의 테트라트리코펩티드 리피트(TPR) 도메인을 포함한다. 시험관에서 TPR 도메인의 단백질 가수분해의 제거는 포스파타아제 효소 활성의 뚜렷한 증가를 나타나게 하며, 이는 N-말단 영역이 자동-억제 기능을 수행한다는 것을 제안한다. TPR 도메인은 34개의 아미노산 반복체를 포함하며, 이는 단백질-단백질 상호작용에 참여한다. 이 성분(element)의 기능은 명확하지는 않으며, 이는 세포 내에서 특정 지역으로 타겟팅 PP5에 대한 방법(means)을 제공하거나 이는 기질과의 상호작용을 가능케 한다.
Unlike other proteins in the family, AtPP5 comprises three N-terminal tetratripeptide repeat (TPR) domains fused with a C-terminal phosphatase domain. Removal of proteolytic hydrolysis of the TPR domain in vitro results in a marked increase in phosphatase enzyme activity, suggesting that the N-terminal region performs an auto-suppressive function. The TPR domain contains 34 amino acid repeats, which participate in protein-protein interactions. The function of this element is not clear, which provides a means for targeting PP5 to specific regions within the cell or allows interaction with the substrate.

TPR 도메인을 포함하는 단백질은 여러 가지 세포 주기 조절, 전사 조절, 미토콘드리아와 퍼옥시좀 단백질 이송 및 신호전달(signal transduction)과 같은 생물학적 과정과 관련이 있다. 최근에 PP5가 헬라 세포에서 DNA 손상에 반응한다는 것을 보고되었다. TPR-포함 단백질은 이를 선택적으로 인식하는 것과 비-천연 단백질과 결합하는 것을 가능케 하는 내인성 샤페론 활성을 지닌다. 이 TPR 단백질은 Tom20, p23, SGT1, 40 kDa 이뮤노필린 시클로스포린 A- (CsA) 결합 단백질 (Cyp40), 52 kDa FK506-결합 단백질 (FKBP52), 51 kDa FK506-결합 단백질 (FKBP51) 및 Hsc70-상호작용 단백질 카복실 말단(CHIP)을 포함한다. 최고도-특성화된 TPR 도메인-포함 단백질은 열 충격 단백질(Hsp90) 콤플렉스의 성숙과 관련이 있으며, Hop, p23, SGT1, Cyp40, FKBP52 및 FKBP51를 포함한다. 또한 PP5는 Hsp90과 복합체를 형성하며, 포유류 및 식물 세포에서 FKBP52 및 FKBP51과 유사한 특성을 나타낸다. 따라서 이는 PP5가 분자 샤페론으로서 작용한다는 것을 가능케 한다.
Proteins containing TPR domains are involved in biological processes such as cell cycle regulation, transcriptional regulation, mitochondrial and peroxysome protein transport and signal transduction. Recently it has been reported that PP5 responds to DNA damage in HeLa cells. TPR-comprising proteins have endogenous chaperone activity that enables them to selectively recognize and bind to non-natural proteins. These TPR proteins include Tom20, p23, SGT1, 40 kDa immunophilin cyclosporine A- (CsA) binding protein (Cyp40), 52 kDa FK506-binding protein (FKBP52), 51 kDa FK506-binding protein (FKBP51) and Hsc70- Interacting protein carboxyl termini (CHIP). Highest-characterized TPR domain-containing proteins are involved in the maturation of heat shock protein (Hsp90) complexes and include Hop, p23, SGT1, Cyp40, FKBP52 and FKBP51. PP5 also complexes with Hsp90 and exhibits similar characteristics to FKBP52 and FKBP51 in mammalian and plant cells. This thus makes it possible that PP5 acts as a molecular chaperone.

본 발명자는 이미 AtPP5가 홀다아제와 폴다아제 활성을 지닌 단백질 포스파타아제와 샤페론으로 작용하는 다기능 단백질이라는 것을 분리 확인하였다. 이 기능은 열 충격-의존 분자량 형태 변화와 밀접하게 관련되어 있다. 열 충격 스트레스를 받으면 아라비돕시스 AtPP5는 저분자량 구조에서부터 고분자량 형태까지 전환되며 홀다아제 샤페론 기능은 상당히 증가되며 열 충격 완충성이 달성된다. 이와 같은 아라비돕시스 AtPP5 단백질의 열 충격-의존 분자량 형태의 변화와 분자 사페론 기능은 본 발명자 중 1인인 박진호의 박사학위논문 'Dual functions of Arabidopsis Ser/Thr protein phosphatase 5 as a protein phosphatase and a molecular chaperone'(2008년 간행)에 이미 개시되어있다.
The inventors have already confirmed that AtPP5 is a multifunctional protein that acts as a protein phosphatase and chaperone having a holdase and polase activity. This function is closely related to heat shock-dependent molecular weight morphology changes. Under heat shock stress, Arabidopsis AtPP5 converts from a low molecular weight structure to a high molecular weight form, with a significant increase in holdase chaperone function and heat shock buffering. The change of molecular weight and heat shock-dependent molecular weight of the Arabidopsis AtPP5 protein was investigated by Park Jin-Ho, a doctoral dissertation of 'Dual functions of Arabidopsis Ser / Thr protein phosphatase 5 as a protein phosphatase and a molecular chaperone'. (2008 publication).

따라서 본 발명은 상기 AtPP5 단백질의 구조 분석을 통해 열 충격 저항성을 증진시키고 홀다아제(holdase) 사페론 및 폴다아제(foldase) 샤페론 기능과 포스파타아제로서 탈인산화효소 활성을 최대로 증진시킨 형질전환 AtPP5 단백질 변이체를 개발하고 상기 단백질을 암호화시킨 cDNA 컨스트럭트를 조립한 후 T-플라스미드 발현 벡터에 삽입하고 이를 아그로박테리움 균주 및 아라비돕시스 캘러스와 동시 배양하여 아라비돕시스 식물 세포에 상기 AtPP5 단백질 변이체 cDNA 컨스트럭트를 도입하여 형질전환 시킨 후 상기 형질전환된 식물 세포를 성장시켜 제조된 형질전환 아라비돕시스 식물체를 제조함으로써 본 발명을 완성하게 된 것이다.
Therefore, the present invention is a transgenic AtPP5 which enhances heat shock resistance through the structural analysis of the AtPP5 protein and maximizes the dephosphatase activity as holdase and foldase chaperone function and phosphatase. After developing the protein variant and assembling the cDNA construct encoding the protein, it was inserted into a T-plasmid expression vector and co-cultured with the Agrobacterium strain and Arabidopsis callus, and the AtPP5 protein variant cDNA construct in Arabidopsis plant cells. The present invention was completed by preparing a transformed Arabidopsis plant prepared by introducing and transforming the transformed plant cells.

본 발명이 해결하려는 과제는 열 충격 저항성을 증진시키고 홀다아제(holdase) 사페론 및 폴다아제(foldase) 샤페론 기능과 포스파타아제로서 탈인산화효소 활성을 최대로 증진시킨 형질전환 AtPP5 단백질 변이체를 개발하고 상기 단백질 변이체를 과발현시키는 아라비돕시스 형질전환 식물체를 개발코자 한 것이다.
The problem to be solved by the present invention is to develop a transformed AtPP5 protein variant that enhances heat shock resistance and maximizes the dephosphatase activity as holdase and foldase chaperone function and phosphatase To develop an Arabidopsis transformed plant that overexpresses the protein variant.

본 발명의 목적은 세린/트레오닌 단백질 포스파타아제 5(AtPP5) 단백질은 ⅰ) 아미노산 잔기 13?110 영역에 3개의 테트라트리코펩티드 리피트(TPR) 도메인; ⅱ) 아미노산 잔기 114?150 영역에 헬릭스; ⅲ) 아미노산 잔기 190?459 영역에 포스파타아제 효소 활성 영역; 및 ⅳ) 아미노산 잔기 459?484 영역에 핵 국소화 시그널(NLS) 영역;을 포함함을 특징으로 하는 서열번호: 1로 표시되는 세린/트레오닌 단백질 포스파타아제 5(AtPP5)에 있어서, 상기 AtPP5 단백질은 고온 충격시 모노머 또는 올리고머 형태의 저분자량 형태에서 고분자량 콤플렉스로 변환되며, 저분자량 형태인 경우 AtPP5는 폴다아제(foldase) 샤페론 및 탈인산화효소 활성을 나타내고 고분자량 콤플렉스 형태인 경우 AtPP5 콤플렉스는 홀다아제(holdase) 샤페론 활성을 나타내어 열 완충성을 지님을 특징으로 하는 AtPP5 단백질을 제공하는 것이다.
It is an object of the present invention to provide a serine / threonine protein phosphatase 5 (AtPP5) protein comprising iii) three tetratricopeptiptite (TPR) domains in the amino acid residues 13-110 region; Ii) helix at the amino acid residues 114-150 region; Iii) a phosphatase enzyme active region in the amino acid residues 190-459 region; And iii) a nuclear localization signal (NLS) region in the amino acid residues 459-484 region. In Serine / threonine protein phosphatase 5 (AtPP5) represented by SEQ ID NO: 1, the AtPP5 protein is At high temperature impact, low molecular weight in monomeric or oligomeric form is converted into high molecular weight complex, AtPP5 exhibits foldase chaperone and dephosphatase activity in low molecular weight form and AtPP5 complex in high molecular weight complex form (holdase) chaperon activity to provide an AtPP5 protein characterized by having a heat buffer.

본 발명의 또다른 목적은 서열번호: 1의 세린/트레오닌 단백질 포스파타아제 5(AtPP5)를 암호화한 cDNA 또는 그의 변이체를 암호화한 cDNA 컨스트럭트를 조립한 후 T-플라스미드 발현 벡터에 삽입하고 이를 아그로박테리움 균주 및 아라비돕시스 캘러스와 동시 배양하여 아라비돕시스 식물 세포에 상기 AtPP5 단백질 또는 그의 변이체 cDNA 컨스트럭트를 도입하여 형질전환 시킨 후 상기 형질전환된 식물 세포를 성장시켜 제조된 AtPP5 단백질 또는 그의 변이체를 과발현하는 형질전환 아라비돕시스 식물체에 있어서, 상기 형질전환 아라비돕시스 식물체는 외부 열 충격 완충성을 증진시키고 홀다아제(holdase) 사페론 및 폴다아제(foldase) 샤페론 기능 및 포스파타아제로서 탈인산화효소 활성을 최대로 증진시킨 AtPP5 단백질 또는 그의 변이체를 과발현하는 형질전환 아라비돕시스 식물체를 제공하는 것이다.
Another object of the present invention is to assemble a cDNA encoding a serine / threonine protein phosphatase 5 (AtPP5) of SEQ ID NO: 1 or a cDNA construct encoding a variant thereof and insert it into a T-plasmid expression vector Incubate with Agrobacterium strain and Arabidopsis callus to introduce the AtPP5 protein or its variant cDNA construct into Arabidopsis plant cells to transform and then overexpress the AtPP5 protein or variant thereof prepared by growing the transformed plant cell In a transgenic Arabidopsis plant, the transgenic Arabidopsis plant enhances external heat shock buffering properties and maximizes dephosphoryase activity as holdase and foldase chaperone functions and phosphatase. Transforming overexpressed AtPP5 protein or variant thereof Ravi help system to provide a plant.

이때 AtPP5 단백질의 변이체는 서열번호: 1의 AtPP5 단백질 아미노산 서열 중 아미노산 잔기 110?484로 구성된 단백질 변이체 또는 서열번호: 1의 AtPP5 단백질 아미노산 서열 중 290번 위치의 아미노산 잔기를 히스티딘(H)에서 아스파라긴(N)으로 치환시킨 변이체임을 특징으로 한다.
The variant of the AtPP5 protein is a protein variant consisting of amino acid residues 110-484 of the AtPP5 protein amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an amino acid residue of position 290 of the AtPP5 protein amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 from histidine (H) to asparagine ( It is characterized by a variant substituted with N).

또한 상기 외부 열 충격 완충성은 25℃?55℃의 열 충격에 대한 완충성임을 특징으로 한다.
In addition, the external thermal shock buffer is characterized in that the buffer against the thermal shock of 25 ℃ ~ 55 ℃.

본 발명의 효과는 열 충격 저항성을 증진시키고 홀다아제(holdase) 사페론 및 폴다아제(foldase) 샤페론 기능과 포스파타아제로서 탈인산화효소 활성을 최대로 증진시킨 형질전환 AtPP5 단백질 변이체를 개발하고 상기 단백질 변이체를 과발현시키는 아라비돕시스 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.
The effect of the present invention is to develop a transformed AtPP5 protein variant which enhances heat shock resistance and maximizes dephosphoryase activity as holdase safone and foldase chaperone function and phosphatase. It is to provide an Arabidopsis transformed plant that overexpresses the variant.

도 1은 시험관 내에서 AtPP5의 열 충격-의존적 올리고머화를 나타낸 것이다.
(A) 자연-PAGE (상부 패널) 및 SDS-PAGE (하부 패널)은 42℃에서 열 충격 전 또는 후에 아라비돕시스 세포 현탁액을 분해하기 위해 사용되었다. 열 충격은 나타낸 시간 동안 수행되었다. AtPP5는 항-AtPP5 항체를 사용하여 면역 블로팅 분석에 의해 검출되었다.
(B) 아라비돕시스 세포 현탁액은 나타낸 시간에서 20분 동안 처리되었다. 글루타르알데히드는 상청액 프랙션(최종 농도의 0.05%)으로 첨가되었으며 샘플은 30℃에서 10분 동안 배양되었다. 교차 반응은 샘플 완충용액의 첨가에 의해 중단되었다. 샘플은 13% SDS-PAGE으로 분리되었으며 AtPP5는 항-AtPP5 항체를 사용하여 면역 블로팅 분석이 검출되었다.
(C)는 PP5를 인코딩하는 아라비돕시스 게놈 영역으로 T-DNA 삽입을 나타내는 물리적 지도를 나타낸 것이다. 뉴클레오티드 넘버링은 ATG 개시 코돈으로부터 시작된다. 검은색 박스, 흰색 박스 및 수평선은 각각 엑손, UTR 및 인트론을 나타낸다. UTR 위에 나타낸 T-DNA 삽입의 방향은 왼쪽(LB) 및 오른쪽(RB) 경계(border)로 나타내었다.
(D)는 WT, Atpp5, Atpp5 OEPP5 및 Atpp5 OEH290N (왼쪽)으로부터의 단백질 추출물에서 풍부한 AtPP5를 나타내는 면역 블로팅 분석을 나타낸 것이다. 면역 블로팅은 항-AtPP5 항체를 사용하여 수행되었다. 쿠마시 블루 염색은 각각의 레인에서 로딩되는 동일한 단백질을 확인하기 위해서 사용되었다.
도 2는 크로마토그래피, 전기영동 및 현미경 기술을 사용하여 AtPP5의 올리고머 구조의 분석을 나타낸 것이다.
(A) 크로마토그래피는 Superdex 200 HR 컬럼을 사용하여 실시되었다. 중요한 프랙션은 2개의 그룹으로 나누어졌다(F-I 및 F-Ⅱ).
(B) (A)에서 각각의 크로마토그래피는 10% 자연-(위의 이미지) 또는 SDS-PAGE(아래의 이미지)에 의해 분리되었으며, 뒤이어 은 염색되었다.
(C), (D)는 AtPP5의 전자 현미경 분석을 나타낸 것이다. (A)에서 F-I 및 F-Ⅱ는 1% 우라닐 아세테이트로 음성 염색됨으로써 분석되었다. (C)에서 검은색 화살표 및 흰색 화살표는 각각 작은 올리고머 및 구형태의 올리고머를 나타낸다. (D)에서 흰색 및 검은색 화살표는 프랙션 Ⅱ에서 각각 선형 및 환형 올리고머를 나타낸다. 각각의 클래스를 구성하는 입자의 수는 각 패널의 바닥에 나타내었다. 200 nm 스케일바는 필드에 적용되었고 100 nm 및 20 nm 스케일 바는 각각 평균 이미지(각 필드의 아래에 있는 이미지)에 적용되었다.
(E) 및 (F)는 정제된 재조합 AtPP5 단백질의 동질성(homogeneity)이 전기영동 및 MALDI-TOF 질량 분석기에 의해 확인되었음을 나타낸 것이다.
(E)는 재조합 AtPP5 단백질이 E. coli로부터 분리(isolate)되었으며 13% (w/v) SDS-PAGE에 의해 분리(separate)되었음을 나타낸 것이다. 단백질 존재비(abundance)는 쿠마시 블루 염색(왼쪽) 또는 항-AtPP5 항체를 사용하여 면역 블로팅 분석(오른쪽)에 의해 실험되었다.
(F)는 A로부터의 3개의 단백질 밴드가 MALDI-TOF 분석되었음을 나타낸 것이다.
도 3은 재조합 AtPP5는 포스파타아제, 홀다아제 샤페론 및 폴다아제 샤페론으로 작용하는 다기능을 수행하는 것을 나타낸 것이다.
(A) AtPP5 및 GST의 포스파타아제 활성은 100 μM 아라키돈산이 있거나(+AA, ■) 없을시(-AA, □) 기질로서 300 mM 파라-니트로페닐포스페이트(pNPP)를 사용하여 측정되었다.
(B)는 AtPP5의 홀다아제 샤페론 활성을 나타낸 것이다. 1.8 μM MDH를 포함하는 샘플은 15분 동안 42℃에서 배양되었다. AtPP5가 상이한 농도로 존재할 때 MDH의 열 응집은 340 nm에서 혼탁도를 측정함으로써 모니터링되었다. AtPP5 대 MDH의 몰 비율은 1: 0.5 (●), 1:1 (◆), 1:2 (▲) 및 1:3 (■)이었다. 음성대조군으로서, 20 μM GST (△)는 AtPP5 대신에 첨가되었다.
(C)는 AtPP5의 폴다아제 샤페론 활성에 관한 것이다. 리폴딩은 다양한 농도의 AtPP5를 포함하는 복원 완충용액에서 변성된 G6PDH (10 μM)를 희석함으로써 개시되었다. 1 μM AtPP5 (○), 3 μM AtPP5 (▲), 5 μM AtPP5 (◆) 및 자발적 리폴딩 (■). 음성대조군으로, 30 μM 오브알부민 (○)은 AtPP5 대신에 첨가되었다. 천연 G6PDH의 활성은 100%로 고정되었다.
(D) 및 (E)는 AtPP5 샤페론 활성이 기질로서 시트르산 합성효소(CS) 또는 MDH를 사용하여 측정되었음을 나타낸 것이다.
(D)는 1.6 μM CS의 열 응집은 20분 동안 45℃에서 유도되었음을 나타낸 것이다. 나타낸 응집 커브는 CS 단독 (○), 1:0.25 몰비의 CS:AtPP5 (●), 1:0.5 몰비의 CS:AtPP5 (◆), 1:1 몰비의 CS:AtPP5 (▲) 및 1:2 몰비의 MDH:AtPP5 (■)이다.
(E)는 MDH가 본 명세서에 기술된 바와 같이 6 M 우레아에서 변성되었음을 나타낸 것이다. 리폴딩은 100 mM 포스페이트 완충용액(pH 7.2) 및 다양한 단백질을 포함하는 복원 완충용액에서 MDH를 희석함으로써 개시되었다. AtPP5 (○), E. coli Trx (●), 오브알부민 (▲) 및 자발적 리폴딩 (■). 천연 MDH의 활성은 100%으로 고정되었다.
도 4는 AtPP5의 상이한 기능이 AtPP5의 올리고머 상태와 관련되어 있다는 것을 나타낸 것이다.
(A) 박테리아에 의해-발현된 AtPP5는 나타낸 온도에서 20분 동안 배양되었다. 처리된 단백질은 크로마토그래피에 의해 분리되었다.
(B) (A)로부터의 단백질 프랙션은 천연- (위의 이미지) 또는 SDS-PAGE (아래의 이미지)에 의해 분리되었고, 뒤이어 은 염색되었다.
(C) AtPP5 소수성에 있어 열 충격-의존적 변화는 비스-ANS 결합을 사용하여 측정되었다. 단백질 샘플은 25℃, 45℃ 및 55℃에서 10 μM 비스-ANS로 열-처리되었다. 비스-ANS 형광의 강도가 측정되었다.
(D) 열-처리 AtPP5의 포스파타아제 (□), 홀다아제 샤페론 (■) 및 폴다아제 샤페론 (■) 활성이 25℃에서 배양된 AtPP5의 활성과 비교되었다.
도 5는 획득한 열 완충성에 대한 AtPP5의 과발현 효과를 나타낸 것이다. 열 충격 처리 후 5일에 식물의 사진을 찍었다. 각각의 값 아래의 패널은 각각의 열 완충성 테스트에 관한 실험 조건을 나타낸 것이다. 화살표는 침종(seed imbibition)의 끝을 나타낸다.
(A)는 정상 성장 조건을 나타낸 것이다.
(B)는 37℃에서 60분 동안 순응기 후 45℃에서 160분 동안 열 충격 처리된 3일 된 Col-0, Atpp5 및 hot1 묘목의 생존을 나타낸 것이다. 열 충격 처리 후 5일에 식물의 사진을 촬영하였다.
(C) 및 (D)는 AtPP5에 부분적으로 획득된 열 완충성이 변이주를 녹 아웃(knock out) 시켰음을 나타낸 것이다. 열 충격 처리에 대응하는 WT, Atpp5 및 hot1 식물의 표현형. 실험 조건은 아래 각 섹션에 도식적으로 나타내었다.
(C)는 정상 성장 조건을 나타낸 것이다.
(D)는 획득된 열 완충성을 나타낸 것이다. 화살표는 침종(seed imbibition)의 끝을 나타낸다,
도 6은 AtPP5의 다양한 형태의 기능적 분석을 나타낸 것이다.
(A)는 재조합 AtPP5의 절단된 버전을 나타내는 개략도이다. 변이주의 이름은 왼쪽에 나타내었다.
(B) (A)에서 묘사된 컨스트럭트는 E. coli에서 발현되었으며 친화크로마토그래피에 의해 정제되었다. H290N은 점 치환 변이주를 나타내며 His 잔기는 Asn으로 대체된다. 정제된 AtPP5 단백질은 13% SDS-PAGE에 의해 분리되며 그 다음에 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색되었다. M은 분자 마커를 나타낸다.(첫번째 레인).
(C) 다양한 단백질 컨스트럭트의 포스파타아제 (□), 홀다아제 샤페론 (■) 및 폴다아제 샤페론 (■) 활성은 야생형 AtPP5와 비교되었으며, 이는 100% 활성으로 고정되었다.
도 7은 아라비돕시스 탈리아나 WT(야생형), Atpp5, hot1, AtPP5 OEPP5 및 AtPP5 OEH290N의 열 스트레스 대응을 나타낸 것이다. 각각의 값의 아래 패널은 각각의 열 완충성 테스트를 위해 사용된 실험 조건을 나타낸 것이다. 화살표는 침종의 끝을 나타낸다.
(A)는 WT 및 형질전환체 식물에서 기초 열 완충성의 비교를 나타낸 것이다. 왼쪽은 정상 성장 조건을 나타낸 것이다. 오른쪽은 55℃에서 20분 동안 열 충격 처리된 7일 된 묘목의 생존을 나타낸 것이다. 열 충격 처리 후 9일에 식물의 사진을 찍었다.
(B) 토양에서 성장된 식물이 열 충격을 받았다. 왼쪽은 정상 성장 조건을 나타낸 것이다. 오른쪽은 55℃에서 5일 동안 열 충격 처리된 2주 된 식물의 생존을 나타낸 것이다. 열 충격 처리 후 5일에 식물의 사진을 찍었다.
도 8은 AtPP5의 열-유도 구조 및 기능적 변화에 관한 종합적 모델을 나타낸 것이다. 정상 조건 하에서 AtPP5는 저분자량 단백질류로서 대부분 존재하며 포스파타아제 및 폴다아제 샤페론으로서 작용한다. 그러나 식물이 열 스트레스에 노출되었을 때, AtPP5는 고분자량 콤플렉스로 전환되고 포스파타아제 및 폴다아제 샤페론에서부터 홀다아제 샤페론까지로 AtPP5의 기능을 변화시킨다.1 shows heat shock-dependent oligomerization of AtPP5 in vitro.
(A) Natural-PAGE (top panel) and SDS-PAGE (bottom panel) were used to degrade Arabidopsis cell suspension before or after heat shock at 42 ° C. Thermal shock was performed for the time indicated. AtPP5 was detected by immunoblotting assay using anti-AtPP5 antibody.
(B) Arabidopsis cell suspension was treated for 20 minutes at the indicated time. Glutaraldehyde was added as a supernatant fraction (0.05% of final concentration) and the sample was incubated at 30 ° C. for 10 minutes. Cross reaction was stopped by the addition of sample buffer. Samples were separated by 13% SDS-PAGE and AtPP5 was detected with an immunoblotting assay using anti-AtPP5 antibodies.
(C) shows a physical map showing T-DNA insertion into the Arabidopsis genomic region encoding PP5. Nucleotide numbering starts with the ATG start codon. Black boxes, white boxes and horizontal lines represent exons, UTRs and introns, respectively. The direction of T-DNA insertion shown above the UTR is indicated by the left (LB) and right (RB) borders.
(D) shows an immunoblotting assay showing AtPP5 enriched in protein extracts from WT, Atpp5 , Atpp5 OEPP5 and Atpp5 OEH290N (left). Immunoblotting was performed using anti-AtPP5 antibodies. Coomassie blue staining was used to identify the same protein loaded in each lane.
Figure 2 shows the analysis of oligomer structure of AtPP5 using chromatography, electrophoresis and microscopic techniques.
(A) Chromatography was performed using a Superdex 200 HR column. Important fractions were divided into two groups (FI and F-II).
(B) Each chromatography in (A) was separated by 10% natural- (image above) or SDS-PAGE (image below) followed by silver staining.
(C) and (D) show electron microscopic analysis of AtPP5. In (A) FI and F-II were analyzed by negative staining with 1% uranyl acetate. Black arrows and white arrows in (C) represent small oligomers and spherical oligomers, respectively. The white and black arrows in (D) indicate linear and cyclic oligomers in fraction II, respectively. The number of particles that make up each class is shown at the bottom of each panel. 200 nm scale bars were applied to the field and 100 nm and 20 nm scale bars were applied to the average image (image below each field), respectively.
(E) and (F) show that the homogeneity of the purified recombinant AtPP5 protein was confirmed by electrophoresis and MALDI-TOF mass spectrometry.
(E) shows that the recombinant AtPP5 protein was isolated from E. coli and separated by 13% (w / v) SDS-PAGE. Protein abundance was tested by immunoblotting analysis (right) using Coomassie blue staining (left) or anti-AtPP5 antibodies.
(F) shows that three protein bands from A were analyzed by MALDI-TOF.
3 shows that recombinant AtPP5 performs multifunction acting as phosphatase, holdase chaperone and polase chaperone.
(A) The phosphatase activity of AtPP5 and GST was measured using 300 mM para-nitrophenylphosphate ( p NPP) as substrate with or without 100 μM arachidonic acid (+ AA, ■) (-AA, □).
(B) shows the holdase chaperone activity of AtPP5. Samples containing 1.8 μM MDH were incubated at 42 ° C. for 15 minutes. Thermal aggregation of MDH when AtPP5 was present at different concentrations was monitored by measuring turbidity at 340 nm. The molar ratios of AtPP5 to MDH were 1: 0.5 (•), 1: 1 (◆), 1: 2 (▲) and 1: 3 (■). As a negative control, 20 μM GST (Δ) was added in place of AtPP5.
(C) relates to the polase chaperone activity of AtPP5. Refolding was initiated by diluting denatured G6PDH (10 μM) in recovery buffer containing various concentrations of AtPP5. 1 μM AtPP5 (○), 3 μM AtPP5 (▲), 5 μM AtPP5 (◆) and spontaneous refolding (■). As a negative control, 30 μM ovalbumin (o) was added in place of AtPP5. The activity of native G6PDH was fixed at 100%.
(D) and (E) show that AtPP5 chaperone activity was measured using citric acid synthase (CS) or MDH as substrate.
(D) shows that thermal aggregation of 1.6 μM CS was induced at 45 ° C. for 20 minutes. The coagulation curves shown are CS alone (○), CS: AtPP5 (•) at 1: 0.2 molar ratio, CS: AtPP5 (◆) at 1: 0.5 molar ratio, CS: AtPP5 (▲) at 1: 1 molar ratio, and 1: 2 molar ratio. MDH: AtPP5 (■).
(E) shows that MDH was denatured in 6 M urea as described herein. Refolding was initiated by diluting MDH in 100 mM phosphate buffer (pH 7.2) and restoration buffer containing various proteins. AtPP5 (○), E. coli Trx (●), Ovalbumin (▲) and Spontaneous Refolding (■). The activity of native MDH was fixed at 100%.
4 shows that different functions of AtPP5 are associated with the oligomer state of AtPP5.
(A) Bacteria-expressed AtPP5 was incubated for 20 minutes at the indicated temperature. Treated proteins were separated by chromatography.
(B) The protein fractions from (A) were separated by native- (image above) or SDS-PAGE (image below) followed by silver staining.
(C) Heat shock-dependent changes in AtPP5 hydrophobicity were measured using bis-ANS binding. Protein samples were heat-treated with 10 μΜ Bis-ANS at 25 ° C, 45 ° C and 55 ° C. The intensity of Bis-ANS fluorescence was measured.
(D) The phosphatase (□), holdase chaperone (■) and polase chaperone (■) activities of heat-treated AtPP5 were compared with that of AtPP5 incubated at 25 ° C.
5 shows the overexpression effect of AtPP5 on the obtained heat buffer. The plants were photographed 5 days after heat shock treatment. The panel below each value shows the experimental conditions for each thermal buffer test. Arrows indicate the end of seed imbibition.
(A) shows normal growth conditions.
(B) shows the survival of 3-day old Col-0, Atpp5 and hot1 seedlings heat-treated at 45 ° C. for 160 minutes after compliance at 37 ° C. for 60 minutes. The plants were photographed 5 days after heat shock treatment.
(C) and (D) show that the heat buffer partially obtained in AtPP5 knocked out the mutant strain. Phenotypes of WT, Atpp5 and hot1 plants corresponding to heat shock treatment. Experimental conditions are shown graphically in each section below.
(C) shows normal growth conditions.
(D) shows the heat buffer obtained. Arrows indicate the end of seed imbibition,
6 illustrates various forms of functional analysis of AtPP5.
(A) is a schematic showing a truncated version of recombinant AtPP5. The name of the variant is shown on the left.
(B) The construct depicted in (A) was expressed in E. coli and purified by affinity chromatography. H290N represents a point substitution mutant and His residues are replaced with Asn. Purified AtPP5 protein was isolated by 13% SDS-PAGE and then stained with Coomassie Brilliant Blue. M represents the molecular marker (first lane).
(C) The phosphatase (□), holdase chaperone (■) and polase chaperone (■) activities of various protein constructs were compared with wild type AtPP5, which was fixed at 100% activity.
7 Arabidopsis The thermal stress response of Thaliana WT (wild type), Atpp5 , hot1 , AtPP5 OEPP5 and AtPP5 OEH290N is shown. The lower panel of each value shows the experimental conditions used for each thermal buffer test. Arrows indicate the end of invasion.
(A) shows a comparison of basal heat buffer in WT and transformant plants. The left side shows normal growth conditions. The right side shows the survival of 7 days old seedlings heat treated at 55 ° C. for 20 minutes. Plants were photographed 9 days after heat shock treatment.
(B) The plants grown in the soil were thermally shocked. The left side shows normal growth conditions. The right side shows the survival of 2 week old plants heat treated at 55 ° C. for 5 days. The plants were photographed 5 days after heat shock treatment.
8 shows a comprehensive model of the heat-induced structure and functional change of AtPP5. Under normal conditions AtPP5 is mostly present as a low molecular weight protein and acts as a phosphatase and polase chaperone. However, when plants are exposed to heat stress, AtPP5 is converted to high molecular weight complexes and alters the function of AtPP5 from phosphatase and polase chaperones to holdase chaperones.

고온 스트레스는 식물의 모든 성장 단계에 영향을 미치며, 이는 항상성을 유지하고 온도 범위 내에서 생존하는 광범위한 세포 반응과 관련되어 있다. 본 발명은 아라비돕시스 단백질 세린/트레오닌 포스파타아제 5(AtPP5)가 열 스트레스 에 대한 저항시 두 가지 가역적 역할을 한다는 것이다.
High temperature stress affects all growth stages of the plant, which is associated with a wide range of cellular responses that maintain homeostasis and survive within the temperature range. The present invention is that the Arabidopsis protein serine / threonine phosphatase 5 (AtPP5) plays two reversible roles in resistance to heat stress.

AtPP5의 고분자량 형태가 열-처리된 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 현탁 세포로부터 분리되었다. AtPP5는 다양한 기능을 나타내며, 단백질 포스파타아제, 폴다아제(foldase) 샤페론 및 홀다아제 샤페론으로 작용한다. 이 다용도 단백질의 효소 활성은 낮은 올리고머 단백질류에서부터 고분자량 콤플렉스까지의 범위에 있는 올리고머 상태와 밀접하게 관련되어 있다.
High molecular weight forms of AtPP5 were isolated from heat-treated Arabidopsis thaliana suspension cells. AtPP5 exhibits a variety of functions and acts as protein phosphatase, foldase chaperone and holdase chaperone. The enzymatic activity of this versatile protein is closely related to oligomeric states ranging from low oligomeric proteins to high molecular weight complexes.

AtPP5의 포스파타아제 및 폴다아제 샤페론 기능은 저분자량 형태에서 나타나며, 반면에 고분자량 형태에서는 홀다아제 샤페론 활성을 나타낸다. AtPP5의 형질전환체 과발현은 야생형 아라비돕시스에 증진된 열 충격 저항성을 부여하였으며, T-DNA 삽입 녹-아웃 변이체는 요구되는 열 완충성에 대해 결함이 있었다.
The phosphatase and polase chaperone function of AtPP5 is shown in the low molecular weight form, while in the high molecular weight form it exhibits the holdase chaperone activity. Transformant overexpression of AtPP5 conferred enhanced heat shock resistance on wild type arabidopsis, and T-DNA insert knock-out variants were defective for the required heat buffer.

재조합 포스파타아제 변이체(H290N)는 현저하게 증가된 홀다아제 샤페론 활성을 나타냈다. 더욱이 증진된 열 저항성은 형질전환체 식물 과발현 H290N에서 관찰되었으며, 이는 AtPP5의 홀다아제 샤페론 활성이 AtPP5-매개 열 완충성에 대해 기인한다는 것을 제안한다.
Recombinant phosphatase variant (H290N) showed markedly increased holdase chaperone activity. Furthermore, enhanced heat resistance was observed in transformant plant overexpressing H290N, suggesting that the holdase chaperone activity of AtPP5 is due to AtPP5-mediated heat buffering.

따라서 본 발명은 열 충격 저항성을 증진시키고 홀다아제(holdase) 사페론 및 폴다아제(foldase) 샤페론 기능과 포스파타아제로서 탈인산화효소 활성을 최대로 증진시킨 형질전환 AtPP5 단백질 변이체를 개발하고 상기 단백질 변이체를 과발현시키는 아라비돕시스 형질전환 식물체를 개발한 것이다.
Accordingly, the present invention has developed a transformed AtPP5 protein variant that enhances heat shock resistance and maximizes dephosphoryase activity as a phosphase and holdase saperon and foldase chaperone function and the protein variant thereof. It has developed arabidopsis transgenic plants that overexpress.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

올리고머Oligomer 상태에서  In the state AtPP5AtPP5 의 분리 및 열 충격 처리의 효과Effect of Separation and Thermal Shock Treatment

이 시험의 목적은 열 충격 스트레스 후에 분자량 형태 변화를 통해 식물에 열 완충성을 부여하는 단백질을 분리하고 특성화하는 것이다. 열-처리 아라비돕시스 세포 배양 현탁액은 크기배제크로마토그래피(SEC) 및 매트릭스-관련 레이저 이탈 이온화 타임-오프-플라이트(MALDI-TOF) 분석을 이용하여 조사되었다. 후보 단백질 세린/트레오닌 단백질 포스파타아제 5(AtPP5)가 확인되었다. AtPP5의 올리고머화 상태가 열-유도 입체형태의 변화를 겪는지 확인하기 위해서 조사되었다(도 1).
The purpose of this test is to isolate and characterize proteins that give heat buffer to plants through molecular weight morphology after heat shock stress. Heat-treated Arabidopsis cell culture suspensions were investigated using size exclusion chromatography (SEC) and matrix-related laser escape ionization time-off-flight (MALDI-TOF) analysis. Candidate protein serine / threonine protein phosphatase 5 (AtPP5) was identified. The oligomerization state of AtPP5 was investigated to see if it undergoes a change in heat-induced conformation (FIG. 1).

식물 세포는 다양한 시간 동안 42℃에서 열 충격을 받았으며, AtPP5의 올리고머 상태는 천연 및 SDS-PAGE 겔에서 AtPP5와 특이적으로 반응하는 항-AtPP5 항체와 면역 블로팅에 의해 분석되었다(도 1D). 자연-PAGE 겔 상에서, 대부분의 처리되지 않은 AtPP5는 모노머로서 관찰되었다; 그러나 열 처리 10부 후, AtPP5의 관찰된 분자량은 AtPP5 트리머 형태와 일치하였다(도1A, 상부 패널).
Plant cells were heat shocked at 42 ° C. for various times, and the oligomer status of AtPP5 was analyzed by immunoblotting with anti-AtPP5 antibodies that specifically reacted with AtPP5 in natural and SDS-PAGE gels (FIG. 1D). On natural-PAGE gels, most of the untreated AtPP5 was observed as monomers; However, after 10 parts of heat treatment, the observed molecular weight of AtPP5 was consistent with the AtPP5 trimer morphology (FIG. 1A, top panel).

시간이 경과하면 AtPP5는 계속해서 고분자량 콤플렉스를 형성할 것이며 열 처리 한 시간 후, 단백질 대부분은 150 kDa 이상의 콤플렉스로 존재할 것이다. SDS-PAGE 겔 상에서 AtPP5는 예상되는 분자량 즉 AtPP5 모노머(54 kDa)로 이동되었다(도 1B, 하부 패널). AtPP5의 열-유도 구조적 이동은 글루타르알데히드 가교(cross-linking)를 사용하여 증명되었고, 뒤이어 항-AtPP5 항체로 SDS-PAGE 및 면역 블로팅이 실시되었다(도 1B). 정상 조건(25℃) 하에서 AtPP5는 모노머 및 트리머 형태로 대부분 발견되었다. 이 단백질의 배열 프로파일의 중요한 차이점이 정상 조건에서 성장된 세포 추출물과 40℃까지 열 처리된 세포 추출물 사이에서 관찰되지는 않았다(자료에 나타내지는 않았음).
Over time, AtPP5 will continue to form high molecular weight complexes, and after an hour of heat treatment, most of the protein will be present in complexes of 150 kDa or more. AtPP5 was transferred to the expected molecular weight, namely AtPP5 monomer (54 kDa), on an SDS-PAGE gel (FIG. 1B, bottom panel). Heat-induced structural shift of AtPP5 was demonstrated using glutaraldehyde cross-linking followed by SDS-PAGE and immunoblotting with anti-AtPP5 antibodies (FIG. 1B). AtPP5 was found mostly in monomeric and trimer form under normal conditions (25 ° C). No significant difference in the alignment profile of this protein was observed between cell extracts grown at normal conditions and cell extracts heat treated up to 40 ° C. (not shown).

그러나 AtPP5의 고분자량 형태는 열 충격 조건에 노출된 세포로부터의 단백질 추출물에서 검출되었다(즉 20분 동안 45, 50 또는 55℃). 이는 홀다아제 샤페론 활성이 일반적으로 42℃에서 측정된다는 사실과 일치한다. 증가된 온도에서 관찰된 고분자량 형태의 증가에 비례하는 모노머 AtPP5의 수반되는 감소가 있다.
However, high molecular weight forms of AtPP5 were detected in protein extracts from cells exposed to heat shock conditions (ie 45, 50 or 55 ° C. for 20 minutes). This is consistent with the fact that holdase chaperone activity is generally measured at 42 ° C. There is a concomitant decrease in the monomer AtPP5 which is proportional to the increase in the high molecular weight morphology observed at the increased temperature.

재조합 Recombination AtPP5AtPP5 은 명백한 Is obvious 올리고머화Oligomerization 형태를 생성한다. Create a form.

열-처리 아라비돕시스 세포 배양 현탁액에서 호모-폴리머 형태가 열 충격을 받았을 때 AtPP5의 고분자량 형태는 입체 형태의 변화를 통해 일어날 것 같다. 하지만 열 충격은 변성된 단백질을 포함하는 추가 세포 단백질을 포함하는 큰 단백질 콤플렉스의 형성을 유도한다. AtPP5의 호모-폴리머 형성 여부를 측정하기 위해서, 재조합 AtPP5가 박테리아에서 발현되었으며 그 다음에 균질하게 정제되었다(도 2E, 및 F). SEC는 모노머, 다이머, 올리고머 및 고분자량 콤플렉스를 포함하는 프랙션으로 AtPP5을 분리하기 위해서 사용되었다(도 2A). 올리고머화 상태는 자연 PAGE를 사용하여 조사되었으며, 뒤이어 은 염색이 실시되었다(도 2B, 상부 패널). 자연 PAGE 상에서 재조합 AtPP5가 100 및 700 kDa 사이에서 관찰되었으며, 반면에 SDS-PAGE 상에서 프랙션이 54 kDa 분자량을 지닌 단일 단백질 밴드로서 이동했다(도 2B, 하부 패널).
High molecular weight forms of AtPP5 are likely to occur through conformational changes when homo-polymeric forms are subjected to heat shock in heat-treated Arabidopsis cell culture suspensions. However, heat shock induces the formation of large protein complexes that include additional cellular proteins, including denatured proteins. To determine whether AtPP5 formed homo-polymers, recombinant AtPP5 was expressed in bacteria and then homogeneously purified (FIGS. 2E, and F). SEC was used to separate AtPP5 into fractions containing monomers, dimers, oligomers and high molecular weight complexes (FIG. 2A). The oligomerization state was investigated using natural PAGE followed by silver staining (FIG. 2B, top panel). Recombinant AtPP5 was observed between 100 and 700 kDa on natural PAGE, while fractions migrated as single protein bands with 54 kDa molecular weight on SDS-PAGE (FIG. 2B, bottom panel).

투과전자현미경은 SEC에 의해 분리된 피크 프랙션에서 올리고머 구조를 분석하기 위해 사용되었다(도 2C, 2D). 음성 염색에 뒤이어 단일 입자 이미지 프로세싱(single particle image processing)으로 AtPP5의 다르게 올리고머화된 형태의 존재를 확인하였다(도 2C). 회전 및 병진 정렬은 F-I에서 관찰된 공 모양의 고분자량 콤플레스가 고유벡터-고유치 자료를 기초로 하여 6 그룹으로 분류될 수 있다는 것을 나타낸다(도 2C, 하부 패널). 이 올리고머에 대해 처리된 이미지는 36?75 nm의 범위에 있는 평균 직경을 나타낸다(도 2C, 상부 패널). 도 2C의 검은색 화살표는 올리고머 AtPP5를 나타낸다.
Transmission electron microscopy was used to analyze the oligomer structure at the peak fraction separated by SEC (FIGS. 2C, 2D). Negative staining followed by single particle image processing confirmed the presence of different oligomerized forms of AtPP5 (FIG. 2C). Rotational and translational alignments indicate that the high molecular weight complexes observed in FI can be grouped into six groups based on eigenvector-intrinsic data (FIG. 2C, bottom panel). The processed image for this oligomer shows an average diameter in the range of 36-75 nm (FIG. 2C, top panel). Black arrows in FIG. 2C represent oligomer AtPP5.

선형 및 환형(각각 흰색 및 검은색 화살표)의 두 개의 단백질 구조는 F-Ⅱ 프랙션에서 획득되었다. 단일 입자 이미지 프로세싱은 환형 분자의 구조적 특성을 측정하였다(도 2D, 하부 패널). 다양한 올리고머는 헵타머릭 상태로 다이머에 존재하며 전반적으로 구조 및 중심강(central cavity)의 크기는 더 많은 분자 연결부위(join) 집합체를 증가시킨다. 헵타머 상태에서 전반적으로 구조 및 중심강은 각각 직경이 약 16 및 6 nm 이다. 헵타머 올리고머의 직경은 선형 올리고머의 폭과 비슷하게 보인다(도 2D, 흰색 화살표). 이 발견은 선형 올리고머가 환형 올리고머로부터 연장된다는 것을 제안한다.
Two protein structures, linear and circular (white and black arrows, respectively), were obtained in the F-II fraction. Single particle image processing measured the structural properties of the circular molecules (FIG. 2D, bottom panel). The various oligomers are present in the dimer in the heptameric state and overall the structure and size of the central cavity increase more molecular joining aggregates. In the heptamer state, the overall structure and central cavity are about 16 and 6 nm in diameter, respectively. The diameter of the heptamer oligomer looks similar to the width of the linear oligomer (FIG. 2D, white arrow). This finding suggests that linear oligomers extend from cyclic oligomers.

종합해 보면 크로마토그래피 (도 2A) 및 자연-PAGE (도 2B)의 결과는 AtPP5가 다양한 분자 크기의 올리고머를 형성한다는 것을 증명하며 이 발견은 구조 분석에 의해 확인되었으며, 이는 다양한 올리고머 형태의 존재를 나타낸다.
Taken together, the results of chromatography (FIG. 2A) and natural-PAGE (FIG. 2B) demonstrate that AtPP5 forms oligomers of various molecular sizes and this finding was confirmed by structural analysis, which indicated the presence of various oligomeric forms. Indicates.

AtPP5AtPP5 는 단백질 포스파타아제 및 분자 Protein phosphatase and molecules 샤페론으로With chaperone 작용하는 다양한 기능을 지닌다. It has a variety of functions that work.

단백질 포스파타아제로 작용하는 AtPP5의 능력은 기질로서 p-니트로페닐포스페이트(pNPP)를 사용하여 조사되었다. 예상된 바와 같이 AtPP5의 포스파타아제 활성은 글루타치온- S-트랜스퍼라아제(GST)인 대조군 단백질의 활성보다 상당히 더 높았다(도 3A). PP5 동족체의 흥미로운 효소 특성은 이 단백질이 고도불포화된 긴사슬 지방산 또는 아라키돈산에 의해 활성화된다는 것이다 (Chen and Cohen, 1997; Sinclair et al., 1999; Chinkers, 2001). 예상된 바와 같이 AtPP5 활성은 100 μM 아라키돈산의 첨가에 의해 2.5?3 배정도 활성화되었다.
AtPP5's ability to act as protein phosphatase was investigated using p-nitrophenylphosphate (pNPP) as a substrate. As expected, the phosphatase activity of AtPP5 was significantly higher than that of the control protein, glutathione-S-transferase (GST) (FIG. 3A). An interesting enzymatic property of the PP5 homologue is that this protein is activated by polyunsaturated long chain fatty acids or arachidonic acids (Chen and Cohen, 1997; Sinclair et al., 1999; Chinkers, 2001). As expected, AtPP5 activity was activated by 2.5-3 fold by the addition of 100 μM arachidonic acid.

이전에 본 발명자들은 cPrxI 단백질의 올리고머화가 증진된 홀다아제 샤페론 활성을 초래한다는 것과 열-안정 고분자량 콤플렉스 형성이 홀다아제 샤페론의 잘-보존된 특징이라는 것을 보고하였다. PP5는 FKBP52, FKBP52 및 Cyp40과 같은 결합 TPR-포함 단백질로 알려진 분자 샤페론인 Hsp90과 상호작용한다. Hsp-관련된 TPR-포함 단백질은 FKBP52, p23, Cyp40 및 CHIP을 포함하며, 이들 모두는 선택적인 인식과 비-천연 단백질의 결합이 가능한 고유한 샤페론 활성을 지닌다. 더욱이 PP5는 포유류, 효모 및 식물 세포에서 FKBP52 및 FKBP51과 유사한 특성을 나타낸다.
Previously we reported that oligomerization of cPrxI protein results in enhanced holdase chaperone activity and that heat-stable high molecular weight complex formation is a well-preserved feature of holdase chaperone. PP5 interacts with Hsp90, a molecular chaperone known as binding TPR-containing proteins such as FKBP52, FKBP52 and Cyp40. Hsp-related TPR-containing proteins include FKBP52, p23, Cyp40 and CHIP, all of which have unique chaperone activity that allows selective recognition and binding of non-natural proteins. Furthermore, PP5 exhibits similar properties to FKBP52 and FKBP51 in mammalian, yeast and plant cells.

AtPP5가 샤페론 활성을 지니는지 여부를 측정하기 위해서, 본 발명자들은 기질, 말산탈수소효소(MDH)의 열 응집을 억제하는 AtPP5의 능력을 조사하였다(도 3B). 반응은 기질의 응집 동안 광 산란 측정에 의해 모니터링되었다. MDH는 AtPP5의 각각 다른 농도의 존재시 42℃에서 배양되었다. 기질의 열 응집은 AtPP5의 증가한 농도와 함께 감소되었으며, 응집은 MDH 대 AtPP5의 1:3 몰비율에서 완전히 방지되었다. 홀다아제 샤페론 활성은 AtPP5 대신에 GST가 음성 대조군으로서 반응 매트릭스에 첨가되었을 때는 검출되지 않았다.
To determine whether AtPP5 has chaperone activity, we investigated the ability of AtPP5 to inhibit thermal aggregation of the substrate, malic dehydrogenase (MDH) (FIG. 3B). The reaction was monitored by light scattering measurement during aggregation of the substrate. MDH was incubated at 42 ° C. in the presence of different concentrations of AtPP5. Thermal coagulation of the substrate decreased with increasing concentration of AtPP5, and aggregation was completely prevented at a 1: 3 molar ratio of MDH to AtPP5. Holdase chaperone activity was not detected when GST instead of AtPP5 was added to the reaction matrix as a negative control.

리폴딩 에세이는 AtPP5가 폴다아제 샤페론으로서 작용할 수 있는지 여부를 측정하기 위해 우레아-변성된 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소(G6PDH)를 사용하여 수행되었다(도 3C). 처리되지 않은 대조군 조건 하에서, 자발적인 리폴딩은 약 8%의 G6PDH에서 일어났으며 반면에 리폴딩 효율은 AtPP5의 농도가 증가하였을 때 매우 증가하였다. 중요한 리폴딩은 GroEL의 존재시 관찰되었으며, 이는 양성 대조군으로서 사용되었다. 폴다아제 샤페론 활성은 AtPP5 대신에 오브알부민이 음성 대조군으로서 반응 매트릭스에 첨가되었을 때는 검출되지 않았다. 이 발견은 AtPP5가 다 효소 기능을 수행한다는 것을 제안한다.
Refolding assays were performed using urea-modified glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) to determine whether AtPP5 could act as a polase chaperone (FIG. 3C). Under untreated control conditions, spontaneous refolding occurred at about 8% of G6PDH, while refolding efficiency increased significantly with increasing concentrations of AtPP5. Significant refolding was observed in the presence of GroEL, which was used as a positive control. Foldase chaperone activity was not detected when ovalbumin instead of AtPP5 was added to the reaction matrix as a negative control. This finding suggests that AtPP5 performs a multi-enzyme function.

시트르산 합성효소(CS) 및 MDH가 각각 홀다아제 및 폴다아제 샤페론 활성을 위해 기질로서 사용될 때 비슷한 결과가 관찰되기 때문에 AtPP5가 다양한 단백질을 보호하는 것 같다(도 3D, E). 따라서 단백질 포스파타아제로서 작용하는 것에 더하여, AtPP5는 기질 단백질의 열 응집을 방지하기 위해서 홀다아제 샤페론으로서 작용할 수 있고 화학적 변성 후에 단백질 리폴딩을 증가시키기 위해서 폴다아제 샤페론으로서 작용할 수 있다.
AtPP5 seems to protect various proteins because similar results were observed when citric acid synthase (CS) and MDH were used as substrates for holdase and polase chaperone activity, respectively (FIG. 3D, E). Thus, in addition to acting as protein phosphatase, AtPP5 can act as a holdase chaperone to prevent thermal aggregation of matrix proteins and as a foldase chaperone to increase protein refolding after chemical denaturation.

AtPP5AtPP5 의 효소 활성은 특이적 Enzyme activity is specific 올리고머Oligomer 상태와 관련된다. It is related to the state.

재조합 AtPP5는 올리고머 구조와 이 다목적 단백질의 기능 사이의 관계를 분석하기 위해 균질하게 정제되었다. sHSP 및 cPrxI와 비슷하게 재조합 AtPP5에 의해 형성된 단백질 구조는 열 충격에 대응하여 매우 변하였다. SEC-분리 프랙션에서 풍부한 AtPP5는 증가한 배양 온도를 지닌 증가된 고분자량 단백질 콤플렉스에서 존재하며, 저분자량 단백질 콤플렉스에서는 수반되는 감소가 관찰되었다(도 4A). 자연-PAGE 분리의 은 염색은 열 충격이 고분자량 콤플렉스에 입체형태의 변화를 촉발시킨다는 것을 확인하였다(도 4B). 예상된 바와 같이 SDS-PAGE은 모든 프랙션에서 54 kDa 분자량을 지니는 단일 단백질 밴드를 밝혔다(도 4B, 하부 패널).
Recombinant AtPP5 was homogeneously purified to analyze the relationship between oligomeric structure and the function of this multipurpose protein. Similar to sHSP and cPrxI, the protein structure formed by recombinant AtPP5 was highly changed in response to heat shock. AtPP5, enriched in the SEC-separation fraction, is present in increased high molecular weight protein complexes with increased incubation temperature, with a concomitant decrease observed in low molecular weight protein complexes (FIG. 4A). Silver staining of the spontaneous-PAGE separation confirmed that heat shock triggered a change in conformation to the high molecular weight complex (FIG. 4B). As expected, SDS-PAGE revealed a single protein band with 54 kDa molecular weight at all fractions (FIG. 4B, bottom panel).

이 결과는 열 충격 처리가 고분자량 콤플렉스로 저분자량 AtPP5 단백질의 조립을 유도한다는 것을 제안한다. 이 입체형태의 변화는 4,4'-디아닐리노-1,1'-비나프틸-5,5'-디술폰산 (비스-ANS) 및 AtPP5 사이의 결합 친화력을 사용하여 조사되었다(도 4C). 비스-ANS 형광의 강도는 증가된 온도에서 증가되었으며, 이는 이 온도가 AtPP5에서 소수성 패치의 증가된 노출을 야기시킨다는 것을 나타낸다.
These results suggest that heat shock treatment induces the assembly of low molecular weight AtPP5 proteins into high molecular weight complexes. This conformation change was investigated using the binding affinity between 4,4'-dianilin-1,1'-binafyl-5,5'-disulfonic acid (bis-ANS) and AtPP5 (FIG. 4C). ). The intensity of bis-ANS fluorescence was increased at increased temperatures, indicating that this temperature caused increased exposure of the hydrophobic patch at AtPP5.

구조적 변화에 더하여, 열 충격은 AtPP5의 홀다아제 샤페론 활성을 매우 증가시켰다(도 4D). 25℃?55℃로의 배양 온도의 변화는 AtPP5 홀다아제 샤페론 활성의 3배 정도의 증가를 야기시켰다. 대조적으로 AtPP5의 포스파타아제 및 폴다아제 활성은 증가한 온도에서 급격하게 감소하였다. 25℃에서 처리된 프랙션과 비교하면, 45℃ 및 55℃에서 처리된 프랙션은 각각 50% 및 30%의 포스파타아제 활성을 나타내었다. 무시해도 될 정도의 폴다아제 샤페론 활성이 55℃에서 처리된 프랙션에서 검출되었다. 저분자량 AtPP5가 25℃ 처리에서 관찰된 지배적인 형태이며, 고분자량 단백질 콤플렉스는 45 및 55℃ 처리에서 가장 풍부하다는 점에서, AtPP5의 상이한 기능은 시험관에서 열-유도 구조적 변화와 밀접하게 관련되어 있다고 예상된다.
In addition to the structural changes, heat shock greatly increased the holdase chaperone activity of AtPP5 (FIG. 4D). Changes in culture temperature from 25 ° C. to 55 ° C. resulted in a threefold increase in AtPP5 holdase chaperone activity. In contrast, the phosphatase and polase activity of AtPP5 sharply decreased at increased temperatures. Compared with the fractions treated at 25 ° C., the fractions treated at 45 ° C. and 55 ° C. showed 50% and 30% phosphatase activity, respectively. Negligible polase chaperone activity was detected in the fractions treated at 55 ° C. The different functions of AtPP5 are closely related to heat-induced structural changes in vitro, in that low molecular weight AtPP5 is the dominant form observed at 25 ° C. treatment, and high molecular weight protein complexes are most abundant at 45 and 55 ° C. treatment. It is expected.

AtPP5AtPP5 는 The 아라비돕시스에서In Arabidopsis 획득한 열  Heat gained 완충성에Buffering 있어 중요한 역할을 한다. Play an important role.

AtPP5가 열 충격 스트레스 동안 역할을 하는 생물학적 역할을 연구하기 위해서, 본 발명자들은 AtPP5의 UTR 지역(At2g42820)에서 T-DNA 삽입을 운반하는 아라비돕시스 동형접합 돌연변인 라인(SALK-021153)을 분리하고 특성화하였다.
To study the biological role that AtPP5 plays during heat shock stress, we isolated and characterized the Arabidopsis homozygous mutant line (SALK-021153) that carries T-DNA insertion in the UTR region of AtPP5 (At2g42820). .

이 AtPP5 null 변이주는 AtPP5 단백질을 합성하지는 않는다. 열 완충성 에세이는 AtPP5가 열 충격 조건 하에서 묘목(seedling) 생존을 위해 요구되는지 여부를 알아내기 위하여 실시되었다. 양성 대조군으로서, 본 발명자들은 아라비돕시스 HSP101, hot1의 T-DNA 녹-아웃 변이주를 사용하였으며, 이는 기저 및 획득한 열 완충성 모두를 위해 요구된다. HSP101 발현의 랙(lack)은 중요한 열 충격-유도 손상을 일으킬 수 있으며, 이는 단기 및 장기 회복기동안 관찰될 수 있다. 고체 한천 배지에서 성장한 3일 된 아라비돕시스 묘목은 60분 동안 37℃에서 배양되었으며, 22℃에서 120분 동안 회복되었으며 그 다음에 상이한 시간 동안 45℃에서 열 충격을 받았다. 순응 처리는 WT, AtPP5 및 hot1 라인에서 증진된 저항성을 비슷한 수준으로 이끌었다. 그러나 140분까지 열 처리 후 WT, AtPP5의 그 다음 성장률과 hot1 사이에 거의 차이가 없을지라도 AtPP5는 WT 식물보다 열 스트레스에 더욱 민감하였다(도 5C, D). 더욱이 열 충격기가 160분으로 연장되었을 때 AtPP5 및 hot1 변이주 라인은 획득한 열 완충성을 완전히 잃었다(도 5). 대부분의 변이주 묘목은 표백되었고 그 다음에 5일 이내에 죽었다. 대조적으로 대부분의 WT 식물은 녹색으로 남았고 실험 내내 계속 성장하였다. 종합해 보면, 이 관찰은 AtPP5가 획득한 열 완충성에 있어 중요한 역할을 한다는 것을 제안한다.
This AtPP5 null mutant does not synthesize AtPP5 protein. Heat buffer assays were conducted to determine whether AtPP5 was required for seedling survival under heat shock conditions. As a positive control, we used Arabidopsis HSP101, hot1 's T-DNA knock-out mutant, which is required for both basal and acquired heat buffers. Lack of HSP101 expression can cause significant heat shock-induced damage, which can be observed during short and long recovery periods. Three-day old Arabidopsis seedlings grown in solid agar medium were incubated at 37 ° C. for 60 minutes, recovered for 120 minutes at 22 ° C. and then thermally shocked at 45 ° C. for different hours. Compliance treatment led to similar levels of enhanced resistance in the WT, AtPP5 and hot1 lines. However, although almost no difference between 140 minutes to heat-treated WT, then the growth rate and hot1 AtPP5 AtPP5 was more sensitive to thermal stresses than WT plants (Fig. 5C, D). Moreover, AtPP5 and hot1 when the thermal bomber was extended to 160 minutes Variant lines completely lost the heat buffer obtained (FIG. 5). Most mutant seedlings were bleached and then died within 5 days. In contrast, most WT plants remained green and continued to grow throughout the experiment. Taken together, this observation suggests that AtPP5 plays an important role in the thermal buffer obtained.

AtPP5AtPP5 의 of 샤페론Chaperone 기능은  Function 아라비돕시스에서In Arabidopsis 열  Heat 완충성을Cushioning 증진시킨다.  Promote.

다양한 컨스트럭트가 AtPP5의 효소 활성을 담당하는 기능적 도메인을 연구하기 위해 사용되었다(도 6A). E. coli의 재조합 단백질의 발현 후(도 6B), 각 변이주의 효소 활성이 측정되었다(도 6C).
Various constructs were used to study the functional domain responsible for the enzymatic activity of AtPP5 (FIG. 6A). After expression of the recombinant protein of E. coli (FIG. 6B), the enzyme activity of each mutant strain was measured (FIG. 6C).

아미노산 1-114 및 1-150을 포함하는 변이주 단백질은 포스파타아제 도메인이 없었으며 WT 단백질과 비교시 ~30% 감소된 홀다아제 샤페론 활성을 나타냈다. 더욱이 포스파타아제 및 폴다아제 샤페론 활성을 완전히 잃었다. 이 발견은 포스파타아제 도메인이 AtPP5의 포스파타아제 및 폴다아제 샤페론 활성 모두를 담당한다는 것을 제안한다. 또한 이것은 이 도메인의 존재는 완전히 활성화된 AtPP5의 홀다아제 샤페론 기능을 요구로 한다는 것을 나타낸다.
Mutant proteins comprising amino acids 1-114 and 1-150 lacked the phosphatase domain and exhibited a ˜30% reduced holdase chaperone activity compared to the WT protein. Moreover, phosphatase and polase chaperone activity were completely lost. This finding suggests that the phosphatase domain is responsible for both phosphatase and polase chaperone activity of AtPP5. This also indicates that the presence of this domain requires fully activated AtPP5's holdase chaperone function.

TPR 도메인(110-484)의 제거는 WT 단백질과 비교시 포스파타아제 및 홀다아제 샤페론 활성을 각각 50% 및 20% 정도 증가시킨다. 따라서 포스파타아제 도메인은 AtPP5의 홀다아제 샤페론 기능에 중요한 역할을 하며 TPR-도메인은 포스파타아제 활성에 대하여 자동-억제 역할을 수행한다. 이 발견은 포스파타아제 도메인이 TPR 도메인보다 상대적으로 높은 소수성을 나타낸다는 사실을 따른다(자료에 나타내지는 않았음).
Removal of the TPR domains 110-484 increases phosphatase and holdase chaperone activity by 50% and 20%, respectively, compared to the WT protein. The phosphatase domain thus plays an important role in the holdase chaperone function of AtPP5 and the TPR-domain plays an auto-suppressive role for phosphatase activity. This finding follows the fact that phosphatase domains exhibit relatively higher hydrophobicity than TPR domains (not shown).

포스파타아제 변이주 H290N이 AtPP5의 샤페론 기능에 관한 포스파타아제 활성의 효과를 테스트하기 위해서 제조되었다. H290N은 His 290는 Ans에 의해 대체된 변이주이며, AtPP5의 촉매 영역의 이 돌연변이는 매우 감소된 포스파타아제 활성을 초래한다. H290N 변이주는 WT 보다 3배정도 더 높은 홀다아제 샤페론 활성을 나타냈으며, 이는 홀다아제 샤페론 활성이 AtPP5의 포스파타아제 활성의 제거에 의해 높아질 수 있다는 것을 나타낸다. 예상된 바와 같이 H290N는 검출 가능한 포스파타아제 활성을 나타내지 않는다.
Phosphatase Variant H290N was prepared to test the effect of phosphatase activity on the chaperone function of AtPP5. H290N is a mutant whose His 290 is replaced by Ans, and this mutation in the catalytic region of AtPP5 results in very reduced phosphatase activity. The H290N mutant showed a threefold higher holdase chaperone activity than WT, indicating that the holdase chaperone activity can be enhanced by elimination of the phosphatase activity of AtPP5. As expected, H290N does not exhibit detectable phosphatase activity.

AtPP5가 열 충격 저항성의 역할을 하는 생리학적 역할을 조사하기 위해서, 본 발명자들은 과발현된 WT(Atpp5OEPP5)의 형질전환 Atpp5 식물체 또는 AtPP5의 H290N 변이주(Atpp5OEH290N) 형질전환 Atpp5 식물체를 만들었다. 면역 블로팅 분석이 WT, AtPP5 및 2개의 형질전환체 과발현 라인에서 AtPP5 발현을 연구하기 위해서 사용되었다. 정상 조건에서 성장되었을 때, 발아시간 및 성장률에 있어서 확실한 표현형 차이는 WT, AtPP5, AtPP5OEPP5, AtPP5OEH290N 또는 hot1 사이에서 검출되지는 않았다(도 7A 및 자료에는 나타내지 않음). 이 발견은 AtPP5가 정상 성장 및 발달과 관련되어 있지 않다는 것을 제안한다. AtPP5는 장일 조건 하에서 초기 개화 표현형을 나타낸다; 하지만 이 표현형은 다른 곳에서 기술될 것이다.
In order to investigate the physiological role of AtPP5 in the role of heat shock resistance, we created a transgenic Atpp5 plant of overexpressed WT (Atpp5 OEPP5 ) or an H290N mutant strain of AtPP5 (Atpp5 OEH290N ) transformed Atpp5 plant. Immunoblotting assays were used to study AtPP5 expression in WT, AtPP5 and two transformant overexpression lines. When grown under normal conditions, no clear phenotypic difference in germination time and growth rate was detected between WT, AtPP5, AtPP5 OEPP5 , AtPP5 OEH290N or hot1 (not shown in Figure 7A and data). This finding suggests that AtPP5 is not related to normal growth and development. AtPP5 exhibits an early flowering phenotype under long day conditions; But this phenotype will be described elsewhere.

기초 열 완충성 테스트에 있어서 7일 된 묘목이 20 분 동안 55℃에 노출되었으며, 그 다음에 22℃에서 회복되었다. 도 7A에 나타난바와 같이, AtPP5OEPP5 및 AtPP5OEH290N 과발현 라인은 치명적인 열 스트레스에서 생존했다. 비록 이 라인들이 열 충격 후 약간의 성장 지연을 나타냈다할지라도 대부분의 묘목은 녹색으로 되돌아갔고 회복기 후 성장을 재개하였다. 열 완충성에 있어 AtPP5의 기능성을 확인하기 위해서, 식물은 24일 동안 토양에서 성장되었으며 그 다음에 열 충격 스트레스를 받았다(도 7B). 5일 동안 37℃에서 열 스트레스를 받은 후, 식물은 5일 동안 최적 성장 조건(22℃)으로 되돌아갔다. 예상된 바와 같이 심각한 손상이 WT 및 AtPP5 식물에서 관찰되었으며, 열 처리 후 대부분의 묘목은 죽었다.
In the basal heat buffer test the 7 day old seedlings were exposed to 55 ° C. for 20 minutes and then recovered at 22 ° C. As shown in FIG. 7A, AtPP5 OEPP5 and AtPP5 OEH290N overexpression lines survived fatal heat stress. Although these lines showed some growth delay after heat shock, most seedlings returned to green and resumed growth after recovery. To confirm AtPP5's functionality in heat buffering, the plants were grown in soil for 24 days and then subjected to heat shock stress (FIG. 7B). After 5 days of thermal stress at 37 ° C., the plants returned to optimal growth conditions (22 ° C.) for 5 days. As expected, severe damage was observed in WT and AtPP5 plants, and most of the seedlings died after heat treatment.

대조적으로 AtPP5OEPP5 및 AtPP5OEH290N 라인은 WT보다 더 높은 열 완충성을 나타냈으며 포스파타아제 활성의 존재 또는 부재와 상관없이 대부분의 묘목 생존을 나타냈다(도 7B). 그 외의 확실한 생화학적 차이는 테스트된 식물 중에서는 관찰되지 않았다. 이 결과는 활성 포스파타아제 도메인은 열 완충성을 요구로 하지 않는 반면에 AtPP5의 홀다아제 샤페론 기능은 아라비돕시스의 열 스트레스 저항성에 관해서 중요하다는 것을 제안한다.
In contrast, the AtPP5 OEPP5 and AtPP5 OEH290N lines showed higher heat buffer than WT and showed the most seedling survival regardless of the presence or absence of phosphatase activity (FIG. 7B). No other obvious biochemical differences were observed among the tested plants. This result suggests that the active phosphatase domain does not require heat buffering, while AtPP5's holdase chaperone function is important with regard to the heat stress resistance of Arabidopsis.

식물은 고착 생물이기 때문에, 일주기 온도 변동에 대한 열 완충성 및 빠른 적응은 이들의 생존을 위해 특히 중요한 것 같다. 모든 살아있는 유기체는 분자 샤페론을 이용하며 이들은 열 충격 반응에 있어서 중요한 역할을 한다; 그러나 샤페론이 고등식물에 열 완충성을 부여한다는 메커니즘은 여전히 잘 이해되지 않은 채 남아있다. 따라서 본 연구의 첫 번째 목적은 열 충격 처리에 대응하여 고분자량 콤플렉스를 형성하는 단백질에 관한 아라비돕시스 세포 현탁액을 스크리닝하는 것이었다.
Since plants are fixed organisms, heat buffering and rapid adaptation to circadian temperature fluctuations appear to be particularly important for their survival. All living organisms use molecular chaperones and they play an important role in heat shock reactions; However, the mechanism by which chaperones impart heat buffer to higher plants still remains poorly understood. Therefore, the first objective of this study was to screen Arabidopsis cell suspensions for proteins that form high molecular weight complexes in response to heat shock treatment.

고분자량 콤플렉스 구조를 형성하는 열-안정 단백질로 아라비돕시스 단백질 포스파타아제 5의 확인은 다양한 생화학적 분석에 의해 확인되었다(도 1, 2 및 4). 체내 고분자량 AtPP5 콤플렉스의 형성은 AtPP5-특이적 항체를 이용한 면역 블로팅 분석에 의해 확인되었다(도 1, 2 및 4). 또한 고순도(highly-purified) 재조합 AtPP5 단백질의 SEC 및 EM 분석은 시험관 내 고분자량 콤플렉스 형성을 증명하였다(도 2). 더욱이 AtPP5의 홀다아제 샤페론 활성은 아라비돕시tm의 열 충격 저항성 대응에 있어 중심적 역할을 한다는 것을 나타내었다(도 5 및 7).
The identification of Arabidopsis protein phosphatase 5 as a heat-stable protein forming a high molecular weight complex structure was confirmed by various biochemical assays (FIGS. 1, 2 and 4). Formation of high molecular weight AtPP5 complexes in the body was confirmed by immunoblotting analysis using AtPP5-specific antibodies (FIGS. 1, 2 and 4). In addition, SEC and EM analysis of highly-purified recombinant AtPP5 protein demonstrated the formation of high molecular weight complexes in vitro (FIG. 2). Furthermore, it was shown that the holdase chaperone activity of AtPP5 plays a central role in the heat shock resistance response of Arabidopsis ™ (FIGS. 5 and 7).

AtPP5의 상이한 기능은 저분자량에서부터 고분자량 콤플렉스까지 열 충격-유도 변화 동안 일어나는 분리된-크기(discretely-sized)의 호모-올리고머 상태와 관련되어 있다(도 4). 본 연구의 결과는 AtPP5가 열 스트레스 조건 동안 포스파타아제 및 분자 샤페론으로서 작용할 수 있다는 것을 나타내는 종합적 모델(도 8)로 요약할 수 있다. 정상 조건 하에서, AtPP5는 특이적 기질의 인산화반응 상태를 조절한다. 그러나 열 스트레스에 대응하여, AtPP5는 고분자량 콤플렉스 형성에 의해 홀다아제 샤페론으로서 작용한다. 그 다음에 AtPP5의 폴다아제 샤페론 기능은 후-열 스트레스기 동안 기능상-활성 분자의 재생을 가능하게 한다.
Different functions of AtPP5 are associated with discrete-sized homo-oligomeric states that occur during heat shock-induced changes from low molecular weight to high molecular weight complexes (FIG. 4). The results of this study can be summarized as a comprehensive model (FIG. 8) indicating that AtPP5 can act as phosphatase and molecular chaperone during heat stress conditions. Under normal conditions, AtPP5 regulates the phosphorylation status of specific substrates. However, in response to thermal stress, AtPP5 acts as a holdase chaperone by the formation of a high molecular weight complex. The polase chaperone function of AtPP5 then enables the regeneration of functionally-active molecules during the post-heat stress period.

과거에는 AtPP5가 다른 단백질 포스파타아제와 비교시 낮은 포스파타아제 활성을 나타내기 때문에 AtPP5가 광범위하게 연구되지는 않았다. 비록 TPR 도메인의 결손이 AtPP5의 포스파타아제 활성을 증가시킬지라도(도 6C), 이 낮은 수준의 활성은 고등식물에서 AtPP5에 의해 역할을 하는 생리학적 역할을 명확하게 하는 것을 어렵게 만들었다. AtPP5(PAPP5라고도 불림)는 탈인산 생화학적-활성 Pfr-피토크롬 A(PhyA)를 나타냈고 피토크롬-매개 광응답(photoresponse)을 증진시켰다. 피토크롬 분자는 적외선 및 원적외선 광 정보를 감지하였다. PhyA의 AtPP5-매개 탈인산은 PhyA-안정성 및 다운스트림 신호 변환기(transducer) NDPK2에 관한 친화력을 증가시킨다. 이 결과는 AtPP5가 피토크롬 안정성 조절에 관한 생화학적 조절자로서 작용한다는 것을 제안한다. 그러나 상기의 발견이 본 연구의 문맥 내에서 고려될 때 AtPP5의 샤페론 기능이 PhyA 안정성에 있어서 역할을 하며, 이는 다운스트림 변환기에 관한 증가된 친화력을 초래한다는 가설이 가능하다. 근본적으로 본 연구는 왜 AtPP5가 낮은 포스파타아제 활성을 나타내는지에 관한 이해에 대한 단서를 제공하며 AtPP5가 이 단백질 포스파타아제 군의 다른 많은 막에서는 관찰되지 않는 특이적 기능을 수행하는 것 즉 기능상-중요한 호스트 구성요소를 안정화시킨다는 것을 나타낸다.
In the past, AtPP5 has not been extensively studied because AtPP5 exhibits low phosphatase activity compared to other protein phosphatase. Although deletion of the TPR domain increases the phosphatase activity of AtPP5 (FIG. 6C), this low level of activity has made it difficult to clarify the physiological role played by AtPP5 in higher plants. AtPP5 (also called PAPP5) showed dephosphoric biochemically-active Pfr-Phytochrome A (PhyA) and enhanced phytochrome-mediated photoresponse. Phytochrome molecules detected infrared and far-infrared light information. AtAp5-mediated dephosphoric acid of PhyA increases the affinity for PhyA-stability and downstream signal transducer NDPK2. These results suggest that AtPP5 acts as a biochemical modulator for phytochrome stability regulation. However, it is hypothesized that the chaperone function of AtPP5 plays a role in PhyA stability when this finding is considered within the context of the present study, leading to increased affinity for downstream transducers. Fundamentally, this study provides clues to why AtPP5 exhibits low phosphatase activity, and AtPP5 performs specific functions that are not observed in many other membranes of this protein phosphatase family. Indicates stabilization of important host components.

AtPP5는 sHSP, 2-Cys peroxiredoxins (Prxs) 및 AtTDX에 관한 유사한 구조적 특성을 나타내며, 이는 열 충격에 대응하여 저분자량에서부터 고분자량까지 콤플렉스의 입체형태를 변화시킨다. FKBP52, FKBP51, p23, SGT1 및 CHIP와 같은 몇몇의 TPR 도메인-포함 단백질은 비-천연 단백질과 선택적 결합을 가능케 하는 고유한 샤페론 활성을 지님을 나타낸다. 이 단백질과 PP5 사이의 분명한 유사성이 주어질 때 많은 연구원들은 PP5가 샤페론으로 작용할 것이라는 가설을 세웠다. 그러나 이 활성은 시험관 내 분석 시스템 표준으로는 검출되지 않았다. 망간이 AtPP5-매개 기질 보호를 억제하고 AtPP5 샤페론 활성을 확인하는 이전의 문제점은 재조합 단백질 합성 후 망간의 고 농도 잔기 수준으로부터 일어나는 것이 가능하다.
AtPP5 exhibits similar structural properties for sHSP, 2-Cys peroxiredoxins (Prxs) and AtTDX, which change the complex conformation of the complex from low molecular weight to high molecular weight in response to thermal shock. Several TPR domain-containing proteins such as FKBP52, FKBP51, p23, SGT1 and CHIP have been shown to have inherent chaperon activity that allows for selective binding with non-natural proteins. Given the apparent similarity between this protein and PP5, many researchers hypothesized that PP5 would act as a chaperone. However, this activity was not detected by in vitro assay system standards. The previous problem that manganese inhibits AtPP5-mediated substrate protection and confirms AtPP5 chaperone activity is possible resulting from high concentration residue levels of manganese after recombinant protein synthesis.

회복 단계 동안, 열 충격에 대한 더 우수한 저항성이 WT 또는 Atpp5보다 형질전환체 아라비돕시스 식물 과발현 AtPP5에서 관찰되었다(도 7). 이 증진된 열 충격 저항성은 아마도 AtPP5와 부분적으로-변성된 세포 단백질과 회복기 동안 이러한 구성요소의 리폴딩 사이의 안정한 단백질 콤플렉스의 열 스트레스-유도 형성 때문이다. 비슷한 상황이 효모 HSP104을 이용하여 관찰되었으며 이는 열-불활성, 불용성 단백질 집합체(aggregate)의 매개 재가용화(resolubilization)에 의해 고온에서 세포 생존을 개선시킨다. 샤페론 활성이 다른 유기체로부터 PP5 단백질에 공통인지 여부를 측정하기 위해, 본 발명자들은 ScPPT1, AtPP5의 효모 상동성을 연구하였다. 그러나 ScPPT1는 모델 단백질 기질 MDH의 열 응집을 억제하지 않으며(자료에는 나타내지 않음), 따라서 효모에서 샤페론의 기능과 관련되어 있지 않다. 진화론적 관점으로부터 이 발견은 식물에서의 열 스트레스 대응과 다른 유기체에서의 열 스트레스 대응 사이에는 질적인 차이가 있다는 것을 명확하게 나타낸다 (Waters, 2003).
During the recovery phase, better resistance to heat shock was observed in transforming Arabidopsis plant overexpressing AtPP5 than in WT or Atpp5 (FIG. 7). This enhanced heat shock resistance is probably due to the heat stress-induced formation of a stable protein complex between AtPP5 and partially-denatured cellular proteins and refolding of these components during the recovery phase. A similar situation was observed with yeast HSP104, which improves cell survival at high temperatures by mediated resolubilization of heat-inactive, insoluble protein aggregates. To determine whether chaperone activity is common to PP5 proteins from other organisms, we studied the yeast homology of ScPPT1, AtPP5. However, ScPPT1 does not inhibit thermal aggregation of the model protein substrate MDH (not shown) and thus is not related to the function of chaperone in yeast. From an evolutionary point of view, this finding clearly indicates that there is a qualitative difference between the heat stress response in plants and the heat stress response in other organisms (Waters, 2003).

결론적으로 본 연구는 아라비돕시스 단백질 세린/트레오닌 포스파타아제 AtPP5에 관한 새로운 기능을 밝혀냈으며, 많은 다른 생리학적 역할을 수행한다는 것을 확인하였다. AtPP5의 샤페론 기능은 열 충격에 의해 증가되기 때문에, 이 단백질은 세포 스트레스 동안 부가적인 역할을 하는 것 같다. AtPP5의 샤페론 기능이 열 충격 동안 변성으로부터 중요한 세포 거대분자(macromolecule)를 보호하기 위해 사용된다는 것과 이 활성이 스트레스 조건에 대하여 식물 반응(plant response)을 촉진시킨다는 것을 제안할 수 있다. 다기능 단백질에 의해 수행되는 역할의 이해 증가에 덧붙여, 더욱이 AtPP5의 연구는 AtPP5가 아직 밝혀지지 않은 생물학적 기능을 수행한다는 것을 근본적으로 나타낸다.
In conclusion, this study uncovered a new function for the Arabidopsis protein serine / threonine phosphatase AtPP5 and confirmed that it plays many different physiological roles. Because the chaperone function of AtPP5 is increased by heat shock, this protein seems to play an additional role during cellular stress. It may be suggested that the chaperone function of AtPP5 is used to protect important cell macromolecules from denaturation during heat shock and that this activity promotes plant response to stress conditions. In addition to increased understanding of the role played by multifunctional proteins, further studies of AtPP5 fundamentally indicate that AtPP5 performs biological functions that have not yet been identified.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples.

물질
matter

Porcine heart mitochondrial MDH, 파라-니트로페닐포스페이트(pNPP), CS 및 비스-ANS는 시그마로부터 구입되었다. 음성 전기영동 및 겔 여과, 오브알부민 및 FPLC(fast performance liquid chromatography) 컬럼 Superdex 200HR 10/30에 대한 분자량 마커는 Amersham Biosciences (Uppsala, 스웨덴)로부터 구입하였다. 다영한 제한 효소는 Boehringer Mannheim(Mannheim, 독일)으로부터 구입되었다.
Porcine heart mitochondrial MDH, para-nitrophenylphosphate (pNPP), CS and bis-ANS were purchased from Sigma. Molecular weight markers for negative electrophoresis and gel filtration, ovalbumin and fast performance liquid chromatography (FPLC) columns Superdex 200HR 10/30 were purchased from Amersham Biosciences (Uppsala, Sweden). Excessive restriction enzymes were purchased from Boehringer Mannheim (Mannheim, Germany).

(실시예 1) 아라비돕시스 세포 현탁액으로부터 열 안정 단백질의 고-올리고머 형태의 분리
Example 1 Isolation of High-oligomeric Forms of Heat Stable Proteins from Arabidopsis Cell Suspensions

아라비돕시스 탈리아나 L. Heynh, ecotype 콜롬비아 세포는 현탁액에서 성장되었다. 세포는 30분 동안 50℃에서 열-처리되었으며 그 다음에 시토졸 추출물은 15분 동안 134,600 g에서 초원심분리법에 의해 준비되었다(Beckman, TLS-55 rotor). 상청액은 Superdex 200 HR 10/30 컬럼을 사용하여 SEC되었다. SEC 공극 부피로부터 용출된 고분자량 콤플렉스가 수집되었고 이전에 기술된 바와 같이 2-D PAGE 및 MALDI-TOF 기술에 의해 확인되었다.
Arabidopsis Thaliana L. Heynh, an ecotype Colombian cell, was grown in suspension. The cells were heat-treated at 50 ° C. for 30 minutes and then the cytosol extract was prepared by ultracentrifugation at 134,600 g for 15 minutes (Beckman, TLS-55 rotor). Supernatants were SECed using Superdex 200 HR 10/30 columns. High molecular weight complexes eluted from the SEC pore volume were collected and confirmed by 2-D PAGE and MALDI-TOF techniques as previously described.

(실시예 2) E. coli에서 AtPP5의 클로닝 및 재조합 단백질 발현
Example 2 Cloning of AtPP5 and Recombinant Protein Expression in E. coli

AtPP5를 인코딩하는 DNA 서열은 아라비돕시스 cDNA 라이브러리로부터 PCR에 의해 증폭되었다. AtPP5 F 프라이머는 BamHI 자리와 시작 코돈 모두를 포함하였다. AtPP5 R 프라이머는 SalI 자리와 정지 코돈 모두를 포함하였다. 본 실험에서 사용된 프라이머는 표 1에 실렸다. N- 또는 C- 말단 절단된(truncated) AtPP5 변이주를 인코딩하는 DNA 서열은 pGEX-AtPP5로부터 증폭되었다.
DNA sequences encoding AtPP5 were amplified by PCR from the Arabidopsis cDNA library. AtPP5 F primers included both Bam HI sites and start codons. AtPP5 R primers included both Sal I sites and stop codons. The primers used in this experiment are listed in Table 1. DNA sequences encoding N- or C-terminal truncated AtPP5 mutants were amplified from pGEX-AtPP5.

아미노산 잔기 1?114, 1?150 및 110?484를 인코딩하는 절단된 변이주는 다음의 프라이머를 사용하여 증폭되었다: 각각 AtPP5 F 및 114 R; AtPP5 F 및 150 R; 및 AtPP5 110 F 및 AtPP5 R. 정방향(F) 프라이머는 BamHI 자리 및 개시 코돈을 포함하며, 역방향(R) 프라이머는 SalI 자리 및 정지 코돈을 포함한다. PCR 생성물 모두는 pGEM-T Easy 벡터(Promega Co., Madison, USA)로 서브-클론되었다. 각각의 삽입은 BamHI 및 SalI과 함께 분해(digest)되었으며 그 다음에 E. coli에서 재조합 발현에 대한 pGEX의 상보적 위치로 결찰(ligate)되었다. 과잉 망간은 PD-10(GE Healthcare, Piscataway, NJ)을 사용하여 제거되었으며 완충용액 A (50 mM 포타슘 포스페이트[pH 8.0] 및 300 mM NaCl)를 지닌 컬럼을 탈염시켰다. 모든 컨스트럭트는 뉴클레오티드 시퀀싱에 의해 확인되었다. 표 1은 본 발명에서 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 나타낸 것이다.
Truncated mutants encoding amino acid residues 1-114, 1-150, and 110-484 were amplified using the following primers: AtPP5 F and 114 R, respectively; AtPP5 F and 150 R; And AtPP5 110 F and AtPP5 R. The forward (F) primers include the Bam HI site and the start codon, and the reverse (R) primers include the Sal I site and the stop codon. All of the PCR products were sub-cloned with the pGEM-T Easy vector (Promega Co., Madison, USA). Each insert was digested with Bam HI and Sal I and then ligate to the complementary position of pGEX for recombinant expression in E. coli . Excess manganese was removed using PD-10 (GE Healthcare, Piscataway, NJ) and desalted the column with buffer A (50 mM potassium phosphate [pH 8.0] and 300 mM NaCl). All constructs were confirmed by nucleotide sequencing. Table 1 shows the oligonucleotide primers used in the present invention.

Figure pat00001

Figure pat00001

(실시예 3) 포스파타아제 및 샤페론 활성의 측정
(Example 3) Measurement of phosphatase and chaperone activity

단백질 포스파타아제 활성 분석은 이전에 기술된 바와 같이 아라키돈산의 존재 또는 부재시 기질로서 파라-니트로페닐포스페이트를 사용하여 수행되었다. 기질 및 PP5의 최종 농도는 각각 100 mM 및 1 ㎍이었다. 이전에 기술된 바와 같이, 홀다아제 샤페론 활성은 50 mM HEPES-KOH (pH 8.0) 완충용액에서 다양한 농도의 AtPP5와 말레이트 탈수소효소(MDH)를 결합시킴으로써 측정되었다. 그 다음에 반응은 15분 동안 42℃에서 배양되었으며 기질 응집에 의한 혼탁도 변화가 자동온도 조절 세포 홀더를 지닌 DU800 분광광도계(Beckman, Fullerton, 미국)를 사용하여 모니터링되었다. 폴다아제 샤페론 활성은 이전에 기술된 바와 같이 기질로서 6 M 우레아-변성된 G6PDH을 사용하여 분석되었다. 간단히 변성된 G6PDH (10 μM)은 100 mM 나트륨 포스페이트 완충용액(pH 7.2)에서 100 배 희석되었으며, AtPP5의 리폴딩 활성은 G6PDH 활성을 분석함으로써 모니터링되었다.
Protein phosphatase activity assays were performed using para-nitrophenylphosphate as a substrate in the presence or absence of arachidonic acid as described previously. Final concentrations of substrate and PP5 were 100 mM and 1 μg, respectively. As previously described, holdase chaperone activity was measured by combining various concentrations of AtPP5 and malate dehydrogenase (MDH) in 50 mM HEPES-KOH (pH 8.0) buffer. The reaction was then incubated at 42 ° C. for 15 minutes and the change in turbidity by substrate aggregation was monitored using a DU800 spectrophotometer (Beckman, Fullerton, USA) with a thermostatic cell holder. Polasease chaperone activity was analyzed using 6 M urea-modified G6PDH as substrate as previously described. Briefly denatured G6PDH (10 μM) was diluted 100-fold in 100 mM sodium phosphate buffer (pH 7.2) and the refolding activity of AtPP5 was monitored by analyzing G6PDH activity.

(실시예 4) SEC, PAGE 및 면역 블로팅 분석
Example 4 SEC, PAGE, and Immunoblotting Analysis

SEC는 100 mM NaCl을 포함하는 50 mM HEPES-KOH (pH 8.0) 완충용액으로 평형이 유지된 Superdex 200 HR 컬럼을 사용하여 FPLC에 의해 25℃에서 수행되었다. SDS-PAGE, 자연-PAGEb 및 면역 블로팅은 이전에 기술된 바와 같이(Moon et al., 2005)수행되었다. 도 1B에 관해, 아라비돕시스 세포 현탁액은 20분 동안 25, 45, 50 또는 55℃에서 처리되었다. 세포는 여과에 의해 수집, 액화질소로 동결되고, 그 다음에 모르타르에서 분쇄되었다. 샘플은 추출 완충용액(50 mM Tris-HCl [pH 7.5], 2 mM EDTA, 1 mM PMSF)에서 재 현탁되었으며, 4℃에서 20분 동안 12,000 g로 원심분리되었다. 글루타르알데히드가 상청액 프랙션으로 첨가되었고(최종 농도의 0.05%) 샘플은 30℃에서 10분 동안 배양되었다. 교차 반응은 샘플 완충용액의 첨가에 의해 중단되었다. 샘플은 13% SDS-PAGE를 사용하여 분해되었으며 AtPP5는 항-AtPP5 항체를 지닌 면역 블로팅에 의해 시각화되었다.
SEC was performed at 25 ° C. by FPLC using a Superdex 200 HR column equilibrated with 50 mM HEPES-KOH (pH 8.0) buffer containing 100 mM NaCl. SDS-PAGE, natural-PAGEb and immune blotting were performed as previously described (Moon et al., 2005). With respect to FIG. 1B, the Arabidopsis cell suspension was treated at 25, 45, 50 or 55 ° C. for 20 minutes. Cells were collected by filtration, frozen with liquid nitrogen and then ground in mortar. Samples were resuspended in extraction buffer (50 mM Tris-HCl [pH 7.5], 2 mM EDTA, 1 mM PMSF) and centrifuged at 12,000 g for 20 minutes at 4 ° C. Glutaraldehyde was added to the supernatant fraction (0.05% of final concentration) and the samples were incubated at 30 ° C. for 10 minutes. Cross reaction was stopped by the addition of sample buffer. Samples were digested using 13% SDS-PAGE and AtPP5 was visualized by immunoblotting with anti-AtPP5 antibodies.

(실시예 5) 전자현미경 및 단일 입자 이미지 프로세싱
Example 5 Electron Microscopy and Single Particle Image Processing

정제된 AtPP5는 50 mM HEPES-KOH (pH 8.0)를 포함하는 용액으로 10배 희석되었다. AtPP5의 열-의존적 구조의 변화를 분석하기 위해, 샘플은 그리드(grid) 제조 이전에 30분 동안 수조(55℃)에서 배양되었다. 처리된 단백질 샘플(5 ㎕)은 즉시 대기에서 3분 동안 글로 방전(Harrick Plasma, Ithaca, NY)된탄소-코팅 그리드에 적용되었으며, 그 다음에 그리드는 1% 우라닐 아세테이트를 사용하여 음성적으로 염색되었다. 이 그리드는 120 kV에서 작동하는 항-오염기(contaminator)(FEI, 미국)를 지닌 Technai G2 Spirit Twin 투과 전자 현미경으로 연구되었다. 이미지는 1Kx1K CCD, 45,000 (0.37 nm/pixel)의 배율에서 멀티스캔 카메라 모델 794(Gatan, 미국)로 기록되었다. 단일 입자 이미지 프로세싱은 SPIDER, 'reference free method’ (Frank et al., 1996)를 사용하여 수행되었다.
Purified AtPP5 was diluted 10-fold with a solution containing 50 mM HEPES-KOH (pH 8.0). To analyze changes in the heat-dependent structure of AtPP5, samples were incubated in a water bath (55 ° C.) for 30 minutes prior to grid preparation. Treated protein samples (5 μl) were immediately applied to a carbon-coated grid that had been glow-discharged (Harrick Plasma, Ithaca, NY) for 3 minutes in the atmosphere, after which the grid was negatively stained with 1% uranyl acetate. It became. The grid was studied with a Technai G2 Spirit Twin transmission electron microscope with an anti-contaminator (FEI, USA) operating at 120 kV. Images were recorded with a multiscan camera model 794 (Gatan, USA) at a magnification of 4K (0.37 nm / pixel) with a 1Kx1K CCD. Single particle image processing was performed using SPIDER, the 'reference free method' (Frank et al., 1996).

(실시예 6) 체내 열 충격 후 AtPP5 구조의 변화
Example 6 Change of AtPP5 Structure after Body Thermal Shock

아라비돕시스 세포 현탁액은 JPL 배지를 포함하는 삼각 플라스크에서 성장되었다. 세포는 22℃에서계속 흔들어주면서(120 rpm) 지속적인 백생광(40?100 μE/s/m2) 아래에서 배양되었다. 열 충격 실험을 위해, 4일이 지나 배양은 부드럽게 교반되면서 42℃ 수조로 이동되었으며 그 다음에 열-처리 샘플이 일정한 시간 간격으로 빼내졌다. 세포는 여과에 의해 수집, 액화질소로 동결되고, 그 다음에 모르타르에서 분쇄되었다. 샘플(0.1 g)은 추출 완충용액(50 mM Tris-HCl [pH 7.5], 2 mM EDTA, 1 mM PMSF)에서 재 현탁되었으며, 4℃에서 30분 동안 14,000 g로 원심분리되었다. 상청액 프랙션은 4% CHAPS로 보충된 2x SDS 샘플 완충용액 100 ㎕에서 추출되었다. 그 결과로 생기는 상청액 프랙션은 항-AtPP5 항체를 사용하여 면역 블로팅 분석에 의해 조사되었다.
Arabidopsis cell suspensions were grown in Erlenmeyer flasks containing JPL medium. Cells were incubated under constant white light (40-100 μE / s / m 2 ) with constant shaking at 120 ° C. (120 rpm). For the heat shock experiment, after 4 days the culture was transferred to a 42 ° C. water bath with gentle agitation and then the heat-treated samples were withdrawn at regular time intervals. Cells were collected by filtration, frozen with liquid nitrogen and then ground in mortar. Samples (0.1 g) were resuspended in extraction buffer (50 mM Tris-HCl [pH 7.5], 2 mM EDTA, 1 mM PMSF) and centrifuged at 14,000 g for 30 minutes at 4 ° C. Supernatant fractions were extracted in 100 μl of 2 × SDS sample buffer supplemented with 4% CHAPS. The resulting supernatant fractions were examined by immunoblotting analysis using anti-AtPP5 antibodies.

(실시예 7) 열 완충성 테스트
Example 7 Heat Buffer Test

획득한 열 완충성 테스트를 위해, 아라비돕시스 묘목이 2% (w/v) 수크로오스를 포함하는 25 ml 고체 영양 배지(Larkindale et al., 2005) 상의 페트리 접시(90 x 3 x 15 mm)에서 성장되었다. 성장 조건은 상술한 바와 같다. 3일 된 묘목이 있는 플레이트가 플라스틱 절연 테이프로 봉해졌으며, 수조 속으로 잠기었다. 상이한 배양 온도는 도면에 나타내었다. 열 충격 처리로부터 회복 동안, 플레이트를 수조에서 빼냈고 플레이트는 동일한 명/암 주기를 사용하여 이전의 성장 조건 하에서 유지되었다.
For the heat buffer test obtained, Arabidopsis seedlings were grown in Petri dishes (90 x 3 x 15 mm) on 25 ml solid nutrient medium (Larkindale et al., 2005) containing 2% (w / v) sucrose. . Growth conditions are as described above. Plates with three-day old seedlings were sealed with plastic insulating tape and submerged into the tank. Different incubation temperatures are shown in the figures. During recovery from the heat shock treatment, the plates were removed from the bath and the plates were maintained under previous growth conditions using the same light / dark cycle.

기초 열 완충성 테스트를 위해, 플레이트가 빠른 가열 및 냉각을 위해 25 ml 고체 배지를 포함한다는 것을 제외하고는 묘목은 상술한 것과 유사한 방법으로 성장되고 처리되었다. 플레이트는 20분 동안 55℃의 수조에서 가열되었으며, 그 다음에 팬으로 빠르게 냉각되었다. 기초 열 완충성은 생존율로 측정되었다.For the basal heat buffer test, seedlings were grown and treated in a similar manner as described above except that the plates contained 25 ml solid medium for rapid heating and cooling. The plate was heated in a 55 ° C. water bath for 20 minutes, then quickly cooled to a fan. Basal heat buffering was determined by viability.

<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY <120> Arabidopsis transgenic plant harboring AtPP5 mutated gene construct for enhancing thermotolerance <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 484 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 Met Glu Thr Lys Asn Glu Asn Ser Asp Val Ser Arg Ala Glu Glu Phe 1 5 10 15 Lys Ser Gln Ala Asn Glu Ala Phe Lys Gly His Lys Tyr Ser Ser Ala 20 25 30 Ile Asp Leu Tyr Thr Lys Ala Ile Glu Leu Asn Ser Asn Asn Ala Val 35 40 45 Tyr Trp Ala Asn Arg Ala Phe Ala His Thr Lys Leu Glu Glu Tyr Gly 50 55 60 Ser Ala Ile Gln Asp Ala Ser Lys Ala Ile Glu Val Asp Ser Arg Tyr 65 70 75 80 Ser Lys Gly Tyr Tyr Arg Arg Gly Ala Ala Tyr Leu Ala Met Gly Lys 85 90 95 Phe Lys Asp Ala Leu Lys Asp Phe Gln Gln Val Lys Arg Leu Ser Pro 100 105 110 Asn Asp Pro Asp Ala Thr Arg Lys Leu Lys Glu Cys Glu Lys Ala Val 115 120 125 Met Lys Leu Lys Phe Glu Glu Ala Ile Ser Val Pro Val Ser Glu Arg 130 135 140 Arg Ser Val Ala Glu Ser Ile Asp Phe His Thr Ile Glu Val Glu Pro 145 150 155 160 Gln Tyr Ser Gly Ala Arg Ile Glu Gly Glu Glu Val Thr Leu Asp Phe 165 170 175 Val Lys Thr Met Met Glu Asp Phe Lys Asn Gln Lys Thr Leu His Lys 180 185 190 Arg Tyr Ala Tyr Gln Ile Val Leu Gln Thr Arg Gln Ile Leu Leu Ala 195 200 205 Leu Pro Ser Leu Val Asp Ile Ser Val Pro His Gly Lys His Ile Thr 210 215 220 Val Cys Gly Asp Val His Gly Gln Phe Tyr Asp Leu Leu Asn Ile Phe 225 230 235 240 Glu Leu Asn Gly Leu Pro Ser Glu Glu Asn Pro Tyr Leu Phe Asn Gly 245 250 255 Asp Phe Val Asp Arg Gly Ser Phe Ser Val Glu Ile Ile Leu Thr Leu 260 265 270 Phe Ala Phe Lys Cys Met Cys Pro Ser Ser Ile Tyr Leu Ala Arg Gly 275 280 285 Asn His Glu Ser Lys Ser Met Asn Lys Ile Tyr Gly Phe Glu Gly Glu 290 295 300 Val Arg Ser Lys Leu Ser Glu Lys Phe Val Asp Leu Phe Ala Glu Val 305 310 315 320 Phe Cys Tyr Leu Pro Leu Ala His Val Ile Asn Gly Lys Val Phe Val 325 330 335 Val His Gly Gly Leu Phe Ser Val Asp Gly Val Lys Leu Ser Asp Ile 340 345 350 Arg Ala Ile Asp Arg Phe Cys Glu Pro Pro Glu Glu Gly Leu Met Cys 355 360 365 Glu Leu Leu Trp Ser Asp Pro Gln Pro Leu Pro Gly Arg Gly Pro Ser 370 375 380 Lys Arg Gly Val Gly Leu Ser Phe Gly Gly Asp Val Thr Lys Arg Phe 385 390 395 400 Leu Gln Asp Asn Asn Leu Asp Leu Leu Val Arg Ser His Glu Val Lys 405 410 415 Asp Glu Gly Tyr Glu Val Glu His Asp Gly Lys Leu Ile Thr Val Phe 420 425 430 Ser Ala Pro Asn Tyr Cys Asp Gln Met Gly Asn Lys Gly Ala Phe Ile 435 440 445 Arg Phe Glu Ala Pro Asp Met Lys Pro Asn Ile Val Thr Phe Ser Ala 450 455 460 Val Pro His Pro Asp Val Lys Pro Met Ala Tyr Ala Asn Asn Phe Leu 465 470 475 480 Arg Met Phe Asn <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 ggatccatgg agaccaagaa tgagaattct 30 <210> 3 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 gtcgacttag ttgaacatcc tgagaaagtt gttt 34 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 gtcgacttag ttgaacatcc tgagaaagtt gttt 34 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 gtcgacggac tcagctactg aacgcc 26 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 ggatcccttt ctcctaatga ccctgatg 28 <210> 7 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 aatctaatct agggtttcta gtcacttgaa gcttctctta aa 42 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 ggatccattt attggcctca atgaatt 27 <110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY <120> Arabidopsis transgenic plant harboring AtPP5 mutated gene          construct for enhancing thermotolerance <160> 8 <170> Kopatentin 1.71 <210> 1 <211> 484 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 Met Glu Thr Lys Asn Glu Asn Ser Asp Val Ser Arg Ala Glu Glu Phe   1 5 10 15 Lys Ser Gln Ala Asn Glu Ala Phe Lys Gly His Lys Tyr Ser Ser Ala              20 25 30 Ile Asp Leu Tyr Thr Lys Ala Ile Glu Leu Asn Ser Asn Asn Ala Val          35 40 45 Tyr Trp Ala Asn Arg Ala Phe Ala His Thr Lys Leu Glu Glu Tyr Gly      50 55 60 Ser Ala Ile Gln Asp Ala Ser Lys Ala Ile Glu Val Asp Ser Arg Tyr  65 70 75 80 Ser Lys Gly Tyr Tyr Arg Arg Gly Ala Ala Tyr Leu Ala Met Gly Lys                  85 90 95 Phe Lys Asp Ala Leu Lys Asp Phe Gln Gln Val Lys Arg Leu Ser Pro             100 105 110 Asn Asp Pro Asp Ala Thr Arg Lys Leu Lys Glu Cys Glu Lys Ala Val         115 120 125 Met Lys Leu Lys Phe Glu Glu Ala Ile Ser Val Pro Val Ser Glu Arg     130 135 140 Arg Ser Val Ala Glu Ser Ile Asp Phe His Thr Ile Glu Val Glu Pro 145 150 155 160 Gln Tyr Ser Gly Ala Arg Ile Glu Gly Glu Glu Val Thr Leu Asp Phe                 165 170 175 Val Lys Thr Met Met Glu Asp Phe Lys Asn Gln Lys Thr Leu His Lys             180 185 190 Arg Tyr Ala Tyr Gln Ile Val Leu Gln Thr Arg Gln Ile Leu Leu Ala         195 200 205 Leu Pro Ser Leu Val Asp Ile Ser Val Pro His Gly Lys His Ile Thr     210 215 220 Val Cys Gly Asp Val His Gly Gln Phe Tyr Asp Leu Leu Asn Ile Phe 225 230 235 240 Glu Leu Asn Gly Leu Pro Ser Glu Glu Asn Pro Tyr Leu Phe Asn Gly                 245 250 255 Asp Phe Val Asp Arg Gly Ser Phe Ser Val Glu Ile Ile Leu Thr Leu             260 265 270 Phe Ala Phe Lys Cys Met Cys Pro Ser Ser Ile Tyr Leu Ala Arg Gly         275 280 285 Asn His Glu Ser Lys Ser Met Asn Lys Ile Tyr Gly Phe Glu Gly Glu     290 295 300 Val Arg Ser Lys Leu Ser Glu Lys Phe Val Asp Leu Phe Ala Glu Val 305 310 315 320 Phe Cys Tyr Leu Pro Leu Ala His Val Ile Asn Gly Lys Val Phe Val                 325 330 335 Val His Gly Gly Leu Phe Ser Val Asp Gly Val Lys Leu Ser Asp Ile             340 345 350 Arg Ala Ile Asp Arg Phe Cys Glu Pro Pro Glu Glu Gly Leu Met Cys         355 360 365 Glu Leu Leu Trp Ser Asp Pro Gln Pro Leu Pro Gly Arg Gly Pro Ser     370 375 380 Lys Arg Gly Val Gly Leu Ser Phe Gly Gly Asp Val Thr Lys Arg Phe 385 390 395 400 Leu Gln Asp Asn Asn Leu Asp Leu Leu Val Arg Ser His Glu Val Lys                 405 410 415 Asp Glu Gly Tyr Glu Val Glu His Asp Gly Lys Leu Ile Thr Val Phe             420 425 430 Ser Ala Pro Asn Tyr Cys Asp Gln Met Gly Asn Lys Gly Ala Phe Ile         435 440 445 Arg Phe Glu Ala Pro Asp Met Lys Pro Asn Ile Val Thr Phe Ser Ala     450 455 460 Val Pro His Pro Asp Val Lys Pro Met Ala Tyr Ala Asn Asn Phe Leu 465 470 475 480 Arg Met Phe Asn                 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 ggatccatgg agaccaagaa tgagaattct 30 <210> 3 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 gtcgacttag ttgaacatcc tgagaaagtt gttt 34 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 gtcgacttag ttgaacatcc tgagaaagtt gttt 34 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 gtcgacggac tcagctactg aacgcc 26 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 ggatcccttt ctcctaatga ccctgatg 28 <210> 7 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 aatctaatct agggtttcta gtcacttgaa gcttctctta aa 42 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 ggatccattt attggcctca atgaatt 27

Claims (4)

세린/트레오닌 단백질 포스파타아제 5(AtPP5) 단백질은 ⅰ) 아미노산 잔기 13?110 영역에 3개의 테트라트리코펩티드 리피트(TPR) 도메인; ⅱ) 아미노산 잔기 114?150 영역에 헬릭스; ⅲ) 아미노산 잔기 190?459 영역에 포스파타아제 효소 활성 영역; 및 ⅳ) 아미노산 잔기 459?484 영역에 핵 국소화 시그널(NLS) 영역;을 포함함을 특징으로 하는 서열번호: 1로 표시되는 세린/트레오닌 단백질 포스파타아제 5(AtPP5)에 있어서, 상기 AtPP5 단백질은 고온 충격시 모노머 또는 올리고머 형태의 저분자량 형태에서 고분자량 콤플렉스로 변환되며, 저분자량 형태인 경우 AtPP5는 폴다아제(foldase) 샤페론 및 탈인산화효소 활성을 나타내고 고분자량 콤플렉스 형태인 경우 AtPP5 콤플렉스는 홀다아제(holdase) 샤페론 활성을 나타내어 열 완충성을 지님을 특징으로 하는 AtPP5 단백질
The serine / threonine protein phosphatase 5 (AtPP5) protein comprises iii) three tetratripeptide repeat (TPR) domains in the amino acid residues 13-110 region; Ii) helix at the amino acid residues 114-150 region; Iii) a phosphatase enzyme active region in the amino acid residues 190-459 region; And iii) a nuclear localization signal (NLS) region in the amino acid residues 459-484 region. In Serine / threonine protein phosphatase 5 (AtPP5) represented by SEQ ID NO: 1, the AtPP5 protein is At high temperature impact, low molecular weight in monomeric or oligomeric form is converted into high molecular weight complex, AtPP5 exhibits foldase chaperone and dephosphatase activity in low molecular weight form and AtPP5 complex in high molecular weight complex form AtPP5 protein characterized by a heat buffer with holdase chaperone activity
서열번호: 1의 세린/트레오닌 단백질 포스파타아제 5(AtPP5)를 암호화한 cDNA 또는 그의 변이체를 암호화한 cDNA 컨스트럭트를 조립한 후 T-플라스미드 발현 벡터에 삽입하고 이를 아그로박테리움 균주 및 아라비돕시스 캘러스와 동시 배양하여 아라비돕시스 식물 세포에 상기 AtPP5 단백질 또는 그의 변이체 cDNA 컨스트럭트를 도입하여 형질전환 시킨 후 상기 형질전환된 식물 세포를 성장시켜 제조된 AtPP5 단백질 또는 그의 변이체를 과발현하는 형질전환 아라비돕시스 식물체에 있어서, 상기 형질전환 아라비돕시스 식물체는 외부 열 충격 완충성을 증진시키고 홀다아제(holdase) 사페론 및 폴다아제(foldase) 샤페론 기능 및 포스파타아제로서 탈인산화효소 활성을 최대로 증진시킨 AtPP5 단백질 또는 그의 변이체를 과발현하는 형질전환 아라비돕시스 식물체
CDNA encoding the serine / threonine protein phosphatase 5 (AtPP5) of SEQ ID NO: 1 or a cDNA construct encoding a variant thereof was assembled and inserted into a T-plasmid expression vector, which was then inserted into an Agrobacterium strain and Arabidopsis callus. In the co-culture with the Arabidopsis plant cells transformed by introducing the AtPP5 protein or a variant cDNA construct thereof, and transformed Arabidopsis plants over-expressing the AtPP5 protein or its variants produced by growing the transformed plant cells The transformed Arabidopsis plant can be characterized in that the AtPP5 protein or a variant thereof that enhances external heat shock buffering properties and maximizes dephosphatase activity as holdase and foldase chaperone function and phosphatase. Transgenic Arabidopsis Plant Overexpressed
제 2항에 있어서, 상기 AtPP5 단백질의 변이체는 서열번호: 1의 AtPP5 단백질 아미노산 서열 중 아미노산 잔기 110?484로 구성된 단백질 변이체 또는 서열번호: 1의 AtPP5 단백질 아미노산 서열 중 290번 위치의 아미노산 잔기를 히스티딘(H)에서 아스파라긴(N)으로 치환시킨 변이체임을 특징으로 하는 형질전환 아라비돕시스 식물체
The method of claim 2, wherein the AtPP5 protein variant is a protein variant consisting of amino acid residues 110-484 of the AtPP5 protein amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or the amino acid residue of position 290 of the AtPP5 protein amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 histidine Transgenic Arabidopsis plant characterized by a variant substituted with (A) in (H) asparagine (N)
제 2항 또는 제 3항에 있어서, 상기 외부 열 충격 완충성은 25℃?55℃의 열 충격에 대한 완충성임을 특징으로 하는 형질전환 아라비돕시스 식물체The transgenic Arabidopsis plant according to claim 2 or 3, wherein the external heat shock buffering property is a buffer against heat shock of 25 ° C to 55 ° C.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN103320454A (en) * 2013-04-23 2013-09-25 南京农业大学 Application of wild eggplant 5 type serine/threonine protein phosphatase gene StPP5
CN108676075A (en) * 2018-06-01 2018-10-19 山西省农业科学院果树研究所 A kind of pilot protein molecule enters the method for plant nucleolus

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