KR20120116766A

KR20120116766A - Ａｄｅｎｉｎｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒ２ 발현 또는 활성 억제제를 이용한 간암 치료 방법

Info

Publication number: KR20120116766A
Application number: KR1020110034403A
Authority: KR
Inventors: 김철우; 장지영
Original assignee: 주식회사 바이오인프라
Priority date: 2011-04-13
Filing date: 2011-04-13
Publication date: 2012-10-23

Abstract

본 발명은 adenine nucleotide translocator 2(ANT2) 발현 또는 활성 억제제를 이용하여 간암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 Adenine nucleotide translocator 2 small interfering RNA (ANT2 siRNA) 또는 ANT2 short hairpin RNA (shRNA) 를 유효성분으로 함유하는 간암 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 ANT2 siRNA 또는 ANT2 shRNA를 환자에게 투여하여 간암을 치료하는 방법을 제공한다.
궁극적으로, 본 발명은 간암 세포 성장 억제 효과 및 우수한 치료 효능을 가지는 간암 치료제를 제공할 수 있을 것이며, 간암 치료제 개발에 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

Ａｄｅｎｉｎｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒ２ 발현 또는 활성 억제제를 이용한 간암 치료 방법{Method for treating liver cancer using expression or activity inhibitors of Adenine nucleotide translocator 2}

본 발명은 adenine nucleotide translocator 2(ANT2) 발현 또는 활성 억제제를 이용하여 간암을 치료하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 ANT2 siRNA (small interfering RNA) 또는 ANT2 shRNA (short hairpin RNA) 를 이용하여 간암을 치료하는 방법 등에 관한 것이다.

간암은 세계적으로 가장 흔한 종양 중의 하나로써, 일 년에 50만 명 이상의 환자가 발생하고 있으며 우리나라에서는 폐암, 위암에 이어 세 번째로 발생 빈도가 높은 악성 종양으로 남성 암 사망 원인 중 두 번째, 여성 암 사망 원인 중 세 번째를 차지하고 있다. 간암의 발생과 관련된 위험 인자로는 B 및 C형 간염 바이러스 감염, 알코올 유전 질환에 의한 간질환, 아플라톡신 B1 섭취, 비알콜성 지방 간 질환 및 흡연 등이 알려져 있다. 이 중 B형 간염 바이러스에 의한 간암은 우리나라뿐만 아니라 전 세계적으로도 70% 이상을 차지하고 있다.

또한, 다른 암과 마찬가지로 간암은 암 유전자의 과 발현 혹은 종양 억제 유전자의 발현 억제와 같은 여러 가지 유전자의 변화가 종양의 발생, 진행 및 전이에 지대한 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 특히, 대부분의 종양 억제유전자의 5’-CpG 섬 (CpG islands) 부위의 과메틸화 (hypermethylation)는 유전자의 결손이나 점 돌연 변이(point mutation) 등에 의한 구조적 변화에 기인한다. 이는 염기 서열의 변화 없이도 유전자의 전사 기능을 억제 (silencing) 함으로써 종양 억제 능력을 감소시키는 것으로 후성학적(epigenetic)변화이며, 암 발생과 연관된 유전자의 메틸화는 주로 CpG 섬 (islands)의 시토신 (cytosine)에서 발생하고 이들의 50-60%는 유전자의 촉진자에 위치하고 있다. 이러한 메틸화는 DNA methyltransferases (DNMTs)에 의해서 매개되며 세포의 비정상적인 증식과 종양 발생 진행 정도에 영향이 있는 것으로 잘 알려져 있다. 과메틸화에 의해 유전자의 발현을 억제하는 대표적인 예로 GSTP1, SOCS-1 (suppressor of cytokine signaling-1), DLC-1 (deleted in liver cancer-1), pl6INK4A, APC, RASSF1A, E-cadherin 등이 알려져 있다. 이러한 유전자의 과메틸화는 간암 환자의 많은 수에서 발견되며 전 암 병변인 간경변증에서 시작되는 것으로 알려져 있다.

특히 SOCS1의 경우, 사이토카인 신호를 억제하는 단백질로써 Jak-STAT (signal transducers and activators of transcription) 신호전달 체계를 음성적으로 조절하는 인자 (negative feedback regulator) 로 잘 알려져 있으며, 특히 B형 간염 바이러스 간염에 의한 간암의 경우, STAT3과 STAT5가 활성화하여 세포 주기 진행과 세포의 형질전환 (celluar transformation)을 촉진하고 세포 자살을 억제하여 발암을 유도하는 것으로 알려져 있다. 참고로, 활성화된 단백질들은 세포질에서는 신호 전달 단백질로 작용하고, 핵 내로 이동한 후에는 전사 인자 (transcriptional factor)로 작용한다. 현재까지 모두 6종류의 STAT 유전자가 보고되었으며 STAT 단백질은 세포질 내에 불활성 상태로 존재하다가 JAK를 통한 tyrosine 인산화에 의해 활성화 된다. 인산화 된 STAT 단백질들은 동일 혹은 이종형 이량체 (homodimer or heterodimer)를 형성하여 핵 내로 이동하고 표적 유전자의 촉진자 부위에 결합함으로써 그 유전자의 전사를 촉진시킨다.

간암 세포에서 활성화된 STAT에 의해 암세포의 증식과 생존에 관여하는 유전자 (mRNA)의 전사가 촉진되고 특정 microRNAs(miRNAs)의 전사도 유도된다고 알려져 있다. MicroRNAs는 작은 조각의 non-protein-coding RNAs로써 mRNA의 발현을 음성적으로 조절한다고 알려져 있다. 특히, 암에 있어 miRNA의 기능은 종양억제 (tumor suppressor) 또는 암 유발인자 (oncogene)로 알려져 있으며 최근 miRNA의 발현이 암 진단의 마커로써 사용될 수 있을 뿐 아니라 치료의 예후와도 깊은 연관성이 있다는 많은 보고들이 나오고 있다. 특히 암과 연관된 miRNA 가운데 miR-21의 경우, 많은 종류의 암에서 높은 발현을 보이며 종양억제 유전자 또는 세포 사멸유전자의 발현을 조절하고 암의 유발 및 전이와 깊은 연관성이 있다는 많은 보고들이 있다.

이러한 배경에 기초하여, 본 발명자들은 ANT2 mRNA 발현의 감소가 간암 세포의 유전자 발현 및 신호전달체계에 미치는 영향을 고찰하고, 나아가 ANT2 발현 또는 활성 억제제의 간암 치료제로써의 가능성을 알아보고자 하였다.

본 발명자들은 ANT2 mRNA 발현 수준을 특이적으로 감소시킬 수 있는 ANT2 siRNA 또는 ANT2 shRNA가 간암 세포의 사멸을 유도하여 간암 세포를 효과적으로 치료할 수 있음을 발견하여 본 발명에 이르게 되었다. 따라서 본 발명의 목적은 ANT2 siRNA 또는 ANT2 shRNA를 이용한 간암 치료용 조성물 및 간암 치료 방법 등을 제공하는 것이다.

본 발명은 ANT2 siRNA 또는 ANT2 shRNA 를 유효성분으로 함유하는 간암 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 간암 세포의 성장 억제 또는 사멸을 유도하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 ANT2 siRNA 또는 ANT2 shRNA 는 서열번호 3으로 기재된 안티센스(anti-sense)서열이 서열번호 1로 기재된 센스(sense)서열과 결합하여 ANT2 mRNA의 분해를 유도하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 조성물은 종양 억제 인자 (tumor suppressor gene)인 SOCS1 (suppressor of cytokine signaling 1)의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 DNA methyltransferases (메틸전이효소) 활성을 저하 시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 SOCS1프로모터 (promoter)의 CpG 섬 (islands)의 과메틸화 (hypermethylation)를 감소시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 STAT3 (Signal transducer and activator of transcription) 의 활성을 감소시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 암 발생 및 성장에 관여하는 oncogenic miRNA(onco-miR)인 miR-21의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 간암 세포의 성장억제 또는 사멸을 유도하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 ANT2 siRNA 또는 ANT2 shRNA 를 환자에게 투여하여 간암을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 ANT2 siRNA 또는 ANT2 shRNA 는 간암 세포의 ANT2 유전자 발현을 감소시켜 효과적으로 간암 세포의 성장 억제 및 세포 사멸을 유도한다는 장점을 가지고 있다. 특히 본 발명의 ANT2 siRNA 또는 ANT2 shRNA 는 종양억제인자인 SOCS1의 발현 증가와 간암 세포의 증식 및 생존에 관여하는 Jak-STAT 신호전달체계를 억제하는 효과를 나타낸다. 이에 더하여 간암의 발생 및 성장에 관여하는 onco-miR-21의 억제 효과가 확인되었기에, 이로 인해 간암 세포의 효과적인 치료제로써의 가능성이 기대된다. 궁극적으로, 본 발명은 간암 세포 성장 억제 효과 및 우수한 치료 효능을 가지는 간암 치료제를 제공할 수 있을 것이며, 간암 치료제 개발에 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1A는 간암 세포주인 Hep3B에 ANT2 shRNA를 도입하면 SOCS1의 발현이 증가되는 것을 보여주는 Micro array analysis 결과이다.
도 1B는 간암 세포주인 Hep3B에 ANT2 shRNA를 도입하면 SOCS1의 발현이 증가되는 것을 보여주는 Real time-PCR 결과이다.
도 2A는 간암 세포주인 Hep3B에 ANT2 shRNA를 도입하면 DNA 과메틸화를 유도하는 DNMTs (DNA methyltransferase)의 활성이 감소되는 것을 보여주는 DNMTs 활성도 분석 (activity assay) 결과이다.
도 2B는 간암 세포주인 Hep3B에 ANT2 shRNA를 도입하면 SOCS1 프로모터의 과메틸화가 감소된다는 것을 보여주는 methylation specific PCR 결과이다.
도 3A는 간암 세포주인 Hep3B에 ANT2 shRNA를 도입하면 STAT3의 활성이 감소된다는 것을 보여주는 Western-blot (웨스턴 블롯) 결과이다.
도 3B는 간암 세포주인 Hep3B에 ANT2 shRNA를 도입하면 STAT3의 DNA 결합능력이 감소된다는 것을 보여주는 EMSA 결과이다.
도 4는 간암 세포주인 Hep3B에 ANT2 shRNA를 도입하면 SOCS1의 발현 증가를 통해서 STAT3의 활성이 감소된다는 것을 보여주는 Western-blot (웨스턴 블롯) 결과이다.
도 5는 간암 세포주인 Hep3B에 ANT2 shRNA를 도입하면 miR-21의 발현이 감소된다는 것을 보여주는 real-time PCR 결과이다.
도 6는 간암 세포주인 Hep3B에 ANT2 shRNA를 도입하면 세포증식이 억제된다는 것을 보여주는 MTT assay 결과이다.

본 발명은 ANT2 발현 또는 활성 억제제를 이용하여 간암을 치료하는 방법 등을 제공한다. 본 발명자들은 ANT2 siRNA 또는 ANT2 shRNA 가 간암 세포의 증식 속도를 저하시키는 것을 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 따라서 본 발명은 Adenine nucleotide translocator 2 small interfering RNA (ANT2 siRNA) 또는 ANT2 short hairpin RNA (shRNA) 를 유효성분으로 함유하는 간암 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 간암 세포의 성장 억제 또는 사멸을 유도하는 것을 특징으로 한다.

간암의 발생과 관련된 위험인자들 중, B형 간염 바이러스에 의한 간암은 우리나라뿐만 아니라 전 세계적으로도 70% 이상을 차지하고 있다. B형 바이러스성 간염 환자의 다단계 간암 발생 과정에는 암 억제 유전자의 과메틸화가 현저히 증가하며, 특히 조기 간암에서 과메틸화의 빈도가 가장 높다고 알려져 있다. 이러한 과메틸화와 같은 유전자의 후생적 조절은 간암 발생 중 초기 단계에서 주로 크게 작용한다고 알려져 있으며, 특히 암 억제 유전자 가운데 SOCS1 유전자의 과메틸화가 다단계 간암 발생 과정을 따라 현저히 증가하며 간암 발생에 있어 결정적인 역할을 한다고 잘 알려져 있다.

따라서 본 발명자들은 ANT2 shRNA의 도입이 SOCS1의 과메틸화에 미치는 영향을 확인하기 위해 간암 세포주인 Hep3B에 ANT2 shRNA를 도입하여 SOCS1의 발현이 증가되는 것을 확인하였다 (도 1A 및 도 1B 참조). 또한, ANT2 shRNA의 도입으로 DNMTs (DNA methyltransferases)의 활성이 감소되는 것을 확인하였고 (도 2A 참조), 이로 인해 SOCS1의 과메틸화가 감소되어 간암 세포 내 SOCS1의 발현이 증가되는 것을 확인 하였다 (도 2B 참조). 이에 더하여 과메틸화의 감소로 인해 증가한 SOCS1은, STAT3의 활성을 저하시킨다는 것을 확인하였다 (도 4 참조).

한편, 암과 연관된 miRNA 가운데 miR-21의 경우, 많은 종류의 암에서 높은 발현을 보이며 종양억제 유전자 또는 세포 사멸유전자의 발현을 조절하고 암의 유발 및 전이와 깊은 연관성이 있다는 많은 보고들이 있다. 따라서, 본 발명자들은 STAT3의 활성 저하가 miR-21의 발현에 미치는 효과를 살펴본 결과, STAT3의 활성을 저하시키면 miR-21의 발현이 억제되는 것을 확인하였다 (도 5 참조).

결론적으로 ANT2 유전자 발현 저하에 의한 mR-21의 발현 억제는 간암 세포의 증식을 효과적으로 억제시킬 뿐만 아니라 사멸 시킨다는 결과를 얻었다(도 6 참조). 이를 통하여 ANT2 유전자의 발현억제는 간암 치료에 효과적으로 활용될 수 있을 것이라 판단된다.

상기 본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 및 에탄올 등을 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물은 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있으며, 제제화할 경우에는 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 부형제 등을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 ANT2 siRNA 또는 ANT2 shRNA 를 환자에게 투여하여 간암을 치료하는 방법을 제공한다.

상기 투여 방법에는 제한이 없다. 예를 들면, 경구 투여, 동맥 주사, 정맥 주사, 경피 주사, 비강 내 투여, 경기관지 투여 또는 근육 내 투여 등이 포함된다. 또한 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하게 조절될 수 있음은 당업자에게 명백하다. 일일 투여량은 0.001 내지 100mg/kg이며, 투여량과 횟수는 경우에 따라 조절 될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

ANT2 shRNA 의 발현벡터 제작

미국 국립생명공학정보센터(Nationanl Center for Biotechnology Information, NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)로부터 입수한 ANT2 mRNA 염기서열은 Genebank Accession No. NM_001152이다. 이 염기서열을 siRNA 예측 프로그램(http://www.ambion.com/technical, resources/siRNA target finder)에 대입하여 적합한 ANT2 siRNA 후보 염기서열을 확보하였고, 여러 후보 염기서열 가운데 ANT2 mRNA의 두 번째 엑손에 해당하는 염기서열인 5' GCAGAUCACUGCAGAUAAG 3'에 결합하는 siRNA를 제작하여 ANT2 siRNA에 의한 ANT2 mRNA의 감소 (silencing)효과를 세포 수준에서 (in vitro) 확인하였다 [이 때 ANT2 siRNA 제작은 Bioneer(한국)에 의뢰하였다].

이 결과를 토대로 shRNA를 제작하기 위하여 다음과 같은 염기서열의 올리고머 두 가닥을 합성하고[이 때 ANT2 siRNA 제작은 Bioneer(한국)에 의뢰하였다],

상기 두 가닥의 올리고머를 결합 (annealing) 시킨 후, pSilencer 3.1-H1 puro 플라스미드 벡터(Ambion사)의 MCS(multi-cloning site)내 BamH I과 Hind III 부위에 클로닝하여 제작하였다. 이 때 상기 센스서열에 이어 siRNA 발현유도의 효율을 증가시키도록 TT를 첨가하였다. 또한, ANT2 shRNA의 효과를 확인하기 위해 진행한 모든 실험에는 ANT2 발현을 차단하지 못하면서, 세포 내 특정 mRNA의 발현에는 영향을 끼치지 않는 스크램블(scrambled) shRNA를 음성 대조군으로 사용하였으며, 이는 동일한 조건을 제공해주는 역할을 하는 것으로 Ambion사에서 구입하여 사용하였다.

상기 벡터로부터 발현이 되는 shRNA의 염기서열은 서열번호 1 내지 3으로 서열목록에 별도로 기재하였다.

실시예 1. 간암 세포의 mRNAs 발현에 미치는 ANT2 shRNA 도입의 효과

본 발명자들은 간암 세포주인 Hep3B에 ANT2 shRNA를 도입하여, 이로 인한 mRNAs 발현의 변화를 microarray 분석법을 통해 확인 하였다.

이 때 ANT2 shRNA를 간암 세포주인 Hep3B에 도입하기 위해 사용된 방법은 비바이러스성 전달체인 Lipofectamine^TM2000(Invitrogen 제품)이라는 물질을 사용한 방법이며, Lipofectamine^TM2000의 positive charge를 띄는 hydrophilic한 부분과 shRNA의 negative charge가 서로 interaction에 의해 복합체 (complex)를 만들고 Lipofectamine^TM2000이 세포막과 융합되는 원리를 이용하여 shRNA가 세포 안으로 들어가게 된다.

구체적으로, 간암 세포주인 Hep3B를 배양접시 (culture dish)에 60~70% 밀도로 (confluency) 하루 전에 준비 한 뒤, ANT2 shRNA 1ug 과 Lipofectamine^TM2000 6ul를 잘 섞어 10분간 보관 후 (incubation) 준비된 간암 세포주에 골고루 뿌려 주었다. 이 때, ANT2 shRNA 1ug 과 Lipofectamine^TM2000 복합체 (complex)가 형성과 세포로의 도입을 최대화 하기 위해서 사용되는 세포 배양액은 10% FBS가 포함 된 10% FBS와 antibiotics가 포함된 complete DMEM media 가 아닌 opti-MEM를 사용하였다.

Microarray 분석은 Agilent사의 chip (Agilent Biothechnology, CA, USA)을 이용하였으며, 이는 ㈜이바이오젠에 서비스를 의뢰 하여 진행하였다.

구체적으로 total RNAs를 분리하여 100ng를 형광으로 label 한 후 microarray와 결합 (hybridization) 시키고 RNAs profile을 분석하였다.

그 결과 유의한 수준으로 증가 또는 감소하는 수 십 가지 후보 물질들을 확보하였고, 그 가운데 ANT2 shRNA의 도입으로 인해 현저히 증가하는 SOCS1을 구체적인 연구 대상으로 선정하였다 (도 1A 참조).

또한 본 발명자들은 실시간 역전사 중합효소 증폭법 [real-time reverse transcription- polymerase chain reaction : RT-qPCR]을 이용하여 도 1A의 결과를 재확인하였다.

구체적으로 간암 세포 주인 Hep3B 세포 주에 스크램블 shRNA 또는 ANT2 shRNA를 도입 한 후 24시간 배양 한 다음 total RNAs를 분리하여 oligo-dT를 이용하여 역전사 반응을 수행 하였다. 역전사 반응으로부터 얻어진 cDNA를 가지고 SOCS1의 프라이머와 SYBR mixture를 이용하여 중합효소 증폭법을 수행하였다. 이 때, 음성 대조군으로 어떤 유전자의 발현에도 영향을 끼치지 않은 스크램블 (scrambled) shRNA를 사용하였으며, 동일한 양의 RNA가 사용되었음을 확인하기 위해서 house keeping 유전자인 GAPDH의 발현 양으로 결과 값을 보정하였다. 그 결과 도 1B에 나타난 바와 같이, 도 1의 microarray 결과와 동일하게, ANT2 shRNA의 도입으로 SOCS1이 3배 이상 유의한 수준으로 증가됨을 확인하였다 (도 1B 참조).

실시예 2. SOCS1 프로모터의 과메틸화에 미치는 ANT2 shRNA 도입의 효과

종양 억제 인자인 SOCS1은 프로모터의 CpG 섬의 과메틸화에 의해서 간암 세포 주인 Hep3B에서 낮게 발현되며, 이러한 SOCS1의 낮은 발현으로 인해 Jak-STAT 신호 전달 체계의 negative 조절이 이루어지지 않아, 궁극적으로 간암 세포의 활발한 증식이 유도된다.

본 발명자들은 인간 간암 세포주인 Hep3B에 ANT2 shRNA를 도입시켜, 활성화된 SOCS1 프로모터의 과메틸화에 미치는 영향을 확인해 보았다.

먼저, DNA의 과메틸화에 관여하는 효소인 DNMTs (DNA methylatransferase)의 활성을 감소시킨 후 (도 2A 참조), 인간 간암 세포주인 Hep3B에 ANT2 shRNA를 도입한 결과, 평소에 높은 과메틸화를 나타내던 SOCS1 프로모터가 ANT2 shRNA의 도입으로 감소되는 것을 확인 할 수 있었다(도 2B 참조).

구체적으로, 간암 세포 주인 Hep3B 세포 주에 스크램블 shRNA 또는 ANT2 shRNA를 도입 한 후 24시간 배양 한 다음 total genomic DNAs를 분리한 뒤 메틸화가 일어나지 않은 C (cytosine)을 T (thymine)으로 전환시킨 후 SOCS1의 프로모터에서 과메틸화가 일어나는 CpGs 섬 (islands) 부위를 증폭시켜 증폭된 정도를 비교하였다. 이 때 메틸화가 일어나서 C (cytosine)으로 존재하는 genomic DNAs에 결합하는 프라이머와 메틸화가 일어나지 않아 T (thymine)으로 전환 된 genomic DNAs에 결합하는 프라이머를 각각 사용하였다. 그 결과, 도 2B에 나타난 바와 같이, ANT2 shRNA의 도입으로 인해, 메틸화 된 SOCS1의 발현은 감소되는 반면, 비메틸화 된 SOCS1의 발현이 증가되는 것을 확인 하였다.

실시예 3. STAT3 활성화에 미치는 ANT2 shRNA 도입의 효과

본 발명자들은 인간 간암 세포주인 hep3B에 ANT2 shRNA를 도입시키면 SOCS1의 발현이 증가되고 궁극적으로 증가된 SOCS1에 의해 STAT3의 활성을 저하시킴을 확인하였다.

구체적으로, 실시예 1에서와 같이 ANT2 shRNA를 세포에 도입한 후 일정 시간 (24h)배양하고, 전체 단백질을 추출한 뒤 STAT3의 활성도를 인신화 (phosphor-STAT3)를 통해서 확인하였으며 전체 STAT3의 양을 Western-blot으로 확인 하였다. 구체적으로, 스크램블 shRNA와 ANT2 shRNA를 도입한 각각의 세포로부터 추출한 단백질 혼합물을 정량 분석하여 동일 농도의 단백질을 전기영동하였다. 전기영동이 끝난 젤(gel)을 니트로 셀룰로스 membrane으로 이동 (transfer) 시킨 후 phosphor=STAT3와 STAT3의 항체를 이용하여 항원-항체 반응을 유도하였고, 효소-기질 반응을 통해 발색하여 항원-항체 반응이 유도 된 것을 확인하였다.

그 결과 도 3A에 나타난 바와 같이, ANT2 shRNA의 도입이 전체 STAT3 단백질의 발현 양에는 영향을 끼치지 않지만 STAT3의 활성을 감소시킨다는 것을 확인 하였다.

또한, ANT2 shRNA를 간암 세포주인 Hep3B에 도입시키면 STAT3의 DNA 결합능력이 감소함을 EMSA (electrophoretic mobility shift assay)를 통해서 확인 하였다. EMSA는 단백질-DNA interaction 연구에 쓰이는 기술로 단백질이 DNA의 특정 sequence와 binding 할 능력이 있다고 볼 때, 방사능 동위원소로 DNA를 표지하고, 단백질과 반응시킨 뒤, polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동을 하고, gel을 말린 뒤, film에 찍어 눈에 보이는 band를 만들어 단백질이 DNA에 binding 하는지를 알아보는 실험이다. EMSA의 원리는 Non-denaturing polyacrylamide나 agarose gel 전기영동 시, 단백질-DNA complex가 free DNA molecule 보다 이동이 느리다는 점을 이용하는 것이다.

구체적으로, 먼저 스크램블 shRNA와 ANT2 shRNA를 도입한 각각의 세포로부터 추출한 단백질 혼합물과 STAT3가 결합하는 염기 서열을 가진 올리고머를 결합 시켰다. 이 때 STAT3가 결합하는 올리고머를 방사성 동위원소로 label 하여 사용하였으며, 이 때 활성화된 STAT3와 올리고머의 결합이 특이적인 결합이라는 것을 확인하기 위하여 방사성 동위원소로 label 하지 않은 올리고머 (competitor)를 10배 이상 사용하는 샘플도 준비 하였다. 이렇게 준비한 샘플들을 전기영동하고 전기영동이 끝난 젤을 말린 후 x-ray 필름에 감광시켜서 확인 하였다.

도 3B에 나타난 바와 같이, 단백질과 DNA의 결합이 특이적 (specific)으로 유도되었음을 확인하기 위하여 방사능 동위원소로 표지 하지 않은 DNA (competitor)를 과량 넣게 되면 대부분의 단백질이 방사능 동위원소로 표지 하지 않은 DNA에 결합하여 band가 사라지는 것을 확인하였다.

또한 ANT2 shRNA 도입에 의한 STAT3의 활성화가 SOCS1의 증가를 통해서라는 것을 재확인하는 시험을 수행하였다. 구체적으로, 스크램블 shRNA, ANT2 shRNA, SOCS1 shRNA, 또는 ANT2 shRNA와 SOCS1 shRNA를 동시에 도입하여 일정시간 (24h) 동안 세포를 배양한 후 단백질을 추출하여 Western-blot을 실시하고 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이 ANT2 shRNA에 의해 증가한 SOCS1의 발현을 SOCS1 shRNA로 감소시키게 되면 STAT3의 활성이 회복되는 것을 알 수 있다.

실시예 4. ANT2 shRNA 도입에 의한 miR -21 발현 효과

본 발명자들은 인간 간암 세포주인 Hep3B에 ANT2 shRNA를 도입시키면 SOCS1의 발현이 증가하게 되고 이로 인하여 STAT3의 활성이 저하되어 miR-21의 발현이 감소 됨을 확인 하였다.

구체적으로, miR-21의 프로모터에 해당하는 염기서열을 http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Location 에서 조사한 후, 이 염기서열 정보를 http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html 프로그램에 입력하여 miR-21 프로모터에 결합하여 miR-21의 발현을 조절하는 전사조절인자를 조사 하였으며, 그 가운데 STAT3가 관여한다는 것을 확인 하였다. 이를 확인하기 위해, ANT2 shRNA를 간암 세포주인 Hep3B에 도입시켰을 때 간암 세포의 생성과 증식에 관여하는 miR-21의 발현이 감소됨을 실시간 역전사 중합효소 증폭 반응 (real-time RT-qPCR) 을 통해 확인하였다 (도 5 참조).

또한, ANT2 shRNA가 miR-21 발현을 저하시킨다는 것을 재확인하기 위해서, ANT2를 과발현하는 벡터를 간암 세포주인 Hep3B에 도입시켜 ANT2 발현을 증가시키면 miR-21의 발현이 회복되는 것을 확인 하였다 (real-time RT-qPCR) (도 5 참조).

실시예 5. 간암 세포주의 성장 능력에 미치는 ANT2 shRNA 또는 miR -21 발현 효과

상기 실시예 4로부터, ANT2 shRNA의 도입으로 miR-21의 발현이 저하 된다는 것을 확인 하였으며, 이에 더하여 실제로 간암 세포의 증식 속도에 ANT2 shRNA가 미치는 영향 및 miR-21 발현과의 상관관계를 확인하기 위한 실험을 수행하였다.

구체적으로, ANT2 shRNA가 간암 세포의 증식 속도를 저하 시킨다는 것을 확인하기 위하여 ANT2 shRNA를 간암 세포주인 Hep3B에 도입 후 간암 세포의 증식을 MTT assay를 통하여 확인 하였다. 이에 대한 양성 대조군으로 miR-21을 억제하는 물질을 (miR-21 inhibitor) 처리하는 경우 ANT2 shRNA 도입한 수준만큼 세포 증식이 저하 됨을 확인하였으며, ANT2 shRNA에 의한 세포 증식의 억제가 miR-21발현 억제를 통한 것이라는 것을 확인하기 위해 miR-21의 과발현을 유도할 수 있는 pre-miR-21을 ANT2 shRNA와 함께 도입하는 경우 세포증식 속도가 회복되는 것을 확인 하였다 (도 6 참조).

<110> BioInfra, INC. <120> Method for treating liver cancer using expression or activity inhibitors of Adenine nucleotide translocator 2 <130> P11-08981 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense sequence of ANT2 shRNA <400> 1 gcagaucacu gcagauaagu u 21 <210> 2 <211> 9 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Loop sequence of ANT2 shRNA <400> 2 uucaagaga 9 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-sense sequence of ANT2 shRNA <400> 3 aacuuaucug cagugaucug c 21

Claims

Adenine nucleotide translocator 2 small interfering RNA (ANT2 siRNA) 또는 ANT2 short hairpin RNA (shRNA) 를 유효성분으로 함유하는 간암 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 ANT2 siRNA 또는 ANT2 shRNA 는 서열번호 3으로 기재된 안티센스 (anti-sense) 서열이 서열번호 1로 기재된 센스 (sense) 서열과 결합하여 ANT2 mRNA의 분해를 유도하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 종양 억제 인자 (tumor suppressor gene)인 SOCS1 (suppressor of cytokine signaling 1)의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 DNA 메틸전이효소 (methyltransferases) 활성을 저하 시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 SOCS1 (suppressor of cytokine signaling 1) 프로모터 (promoter)의 CpG 섬 (islands)의 과메틸화 (hypermethylation)를 감소시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 STAT3 (Signal transducer and activator of transcription) 의 활성을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 microRNA-21 (miR-21) 의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 간암 세포의 성장억제 또는 사멸을 유도하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
Adenine nucleotide translocator 2 small interfering RNA (ANT2 siRNA) 또는 ANT2 short hairpin RNA (shRNA) 를 환자에게 투여하여 간암을 치료하는 방법.