KR20120116421A

KR20120116421A - 성장 호르몬을 포함하는 흡입형 분말 제제의 ｎｍｄａ 수용체 기능저하-관련 질환을 예방 또는 치료하기 위한 용도

Info

Publication number: KR20120116421A
Application number: KR1020127016508A
Authority: KR
Inventors: 이성열; 박성익
Original assignee: 주식회사 메디진바이오
Priority date: 2009-11-25
Filing date: 2009-11-25
Publication date: 2012-10-22
Also published as: US9795653B2; US20140162953A1; US20120289465A1; WO2011065600A1

Abstract

NMDA 수용체 기능저하-관련 질환을 예방 또는 치료하기 위한 흡입형 분말 제제의 용도; 성장 호르몬(GH)을 포함하는 치료학적으로 유효한 양의 흡입형 분말 제제를 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상에서 NMDA 수용체 기능저하-관련 질환을 예방 또는 치료하는 방법; 및 활성성분으로서 GH를 포함하는 NMDA 수용체 기능저하-관련 질환의 예방 또는 치료용 흡입형 분말 제제를 제공한다.

Description

성장 호르몬을 포함하는 흡입형 분말 제제의 ＮＭＤＡ 수용체 기능저하-관련 질환을 예방 또는 치료하기 위한 용도{USE OF INHALABLE POWDER FORMULATION COMPRISING GROWTH HORMONE FOR PREVENTING OR TREATING NMDA RECEPTOR HYPOFUNCTION-RELATED DISEASES}

본 발명은 성장 호르몬을 포함하는 흡입형 분말 제제의 NMDA 수용체 기능저하-관련 질환들을 예방 또는 치료하기 위한 용도에 관한 것이다.

성장 호르몬(GH) 대체의 적응증(indication)이 성장 호르몬 결핍에 대한 원래 적응증을 넘어서 점차 확장되어 가고 있다. 현재의 GH 대체 적응증의 리스트는 저신장증으로 특징되어지는 몇 개의 유전학적 질병, 예컨대 터너 증후군, 프라더-윌리(Prader-Willi) 증후군 및 누난 증후군(Noonan syndrome)을 포함한다. 프라더-윌리 증후군에서, GH는 신체 길이성장 뿐만 아니라 체성분 개선에도 효과적인 것으로 예상하고 있다(see, Mogul, H.R. et al., J Clin Endocrinol Metab 93 (4), 1238-1245 (2008)). 무작위적인 연구들에서의 효능 결과에 근거하여 GH는 성인이 된 후에 예상되는 키가 2.25 SDS(standard deviation score) 미만인 아이들에서의 특발성 저신장증의 치료용으로 미국 식약청(U.S. Food and Drug Administration)에 의해 승인받았다(see, Leschek, E.W. et al., J Clin Endocrinol Metab, 89 (7), 3140-3148 (2004); 및 Wit, J.M. et al., J Pediatr 146 (1), 45-53 (2005)). GH의 기타 적응증은 AIDS로부터의 소모 증후군(wasting syndrome)을 포함한다(Storer TW, W.L., et al., J Clin Endocrinol Metab. 90 (8), 4474-4482. (2005)). GH의 넓은 범위의 생물학적 이점을 고려해 볼 때, GH 적응증의 확장은 지속될 것으로 예상하고 있다.

한편, GH 적용에 있어 한 가지 과제는 순응도 문제(compliance issue)이다. GH의 임상적 효능을 유지하기 위해서는 매일 피하 주사가 필요한데, 이는 환자, 특히 소아 환자들에게 선호되기 어려워 조기 치료종료를 유발한다(Coste, J. et al., BMJ 315 (7110), 708-713 (1997)). 이러한 관점에서, GH의 흡입형 제제를 잠재적인 대안으로 고려해볼 수 있다. 폐는 약물 흡수를 위한 큰 표면적(성인에서 ~100 m²)(Patton, J.S., Advanced Drug Delivery Reviews 19 (1), 3(1996)), 우수한 상피 투과성, 및 풍부한 혈액 공급과 같은 이유로 인해 전신성 약물 전달을 위한 독특한 관문으로 알려져 있다(Schanker, L.L.S., Biochemical pharmacology, 27 (4), 381-385 (1978) 및 Patton, J.S., Proc Am Thorac Soc 1 (4), 338-344 (2004)).

또한, 폐에 축적된 약물은 경구로 전달시킨 것보다 상대적으로 낮은 농도의 약물-대사효소에 직면하게 된다(Patton, J.S., Advanced Drug Delivery Reviews 19 (1), 3 (1996); 및 Ann, T. et al., Journal of pharmaceutical sciences, 92 (6), 1216-1233 (2003)). 이러한 특성은 현재 투여방식이 비경구 경로에 한정되어 있는 GH와 같은 단백질 약물의 전달에 있어 특히 유용하다. 따라서, 폐는 낮은 경구 생체이용률을 갖는 약물의 전신성 전달에 가능성이 있는 부위로서 주목받고 있으며, 이는 최근 흡입형 인슐린의 개발로부터 볼 때 명백하다(See, Patton, J.S. & Byron, Nature Reviews Drug Discovery 6, 67-74 (2007); White, S.S. et al., Diabetes technology & therapeutics 7 (6), 896-906 (2005); 및 Pearson, J., Drug Delivery Report Spring/Summer, 19-21 (2006)). 흡입형 인슐린은 론칭 후 1년 만에 제조자가 자발적으로 시장으로부터 철회하였으나, 흡입형 인슐린에 대한 환자 만족도는 주사와 비교하여 특히 바늘 공포증이 있는 환자들 사이에서 꽤 높았다(Brunton, S., Am J Med , 121 (6 Suppl), S35-41 (2008)).

GH 결핍증 아이들에게서 흡입형 GH 및 피하 주사형 GH의 효과를 비교하는 최근의 연구가 장려되었으며 유망하였다. 상기 연구는 흡입형 GH가 잘 용인되었으며 혈청 GH 및 IGF-I 농도의 용량-의존적인 증가를 나타냈다고 보고하였다. 폐 기능(pulmonary function)에서도 유의한 변화는 관찰되지 않았다. 그러나, 흡입형 GH에 대한 평균 상대 생체이용률은 3.5%에 불과하였고, IGF-I 반응에 근거한 평균 상대 생물학적 역량은 5.5%이었다(Walvoord, E.C. et al., J Clin Endocrinol Metab, 94 (6), 2052-2059 (2009)). 이러한 결과는 피하 주사시킨 GH와 동일한 임상 효과를 달성하기 위해서는 다량의 GH가 필요할 것임을 시사한다.

한편, 글루타메이트 수용체의 N-메틸-D-아스파테이트(N-methyl-D-aspartate, NMDA)류는 시냅스 가소성(synaptic plasticity), 허혈(ischemia), 뇌신경계 퇴행기전(neurodegeneration) 및 경련을 포함하는 일부 생리학적 및 병리생리학적 과정과 연관되어 있다(Furukawa, H. et al. 2005, Nature 438: 185??192). NMDA 수용체는 시냅스 수준에서 기억력을 발전시키는 데 요구되는 기작 중 한가지로 여겨지는 장기간 강화작용(long-term potentiation, LTP)을 유도하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 생각되어 진다. NMDA 수용체 아형 NR1 및 NR-D는 뇌 가소성 및 행동에 중요한 역할을 한다. NR1, NR2A 및 NR2B는 해마 시냅스 가소성 및 학습 변수와 특별히 연관되어 있다. 이러한 NMDA 수용체-PSD 95 복합체는 LTP의 유도 및 해마 치상회(dentate gyrus area) 부분에서의 시냅스 가소성과 관련이 있다.

또한, NMDA 수용체 기능저하는 동물 및 인간의 다양한 인지 및 행동 기능과 연관되어 있다(see, Cao, X. et al., Eur J Neurosci, 25 (6), 1815-1822 (2007); 및 Ng D, P.G., PLoS Biol 7 (2), 41 (2009)). NMDA 수용체가 장기 기억 저장으로의 암호화 및 통합(consolidation) 효율을 조절하는 신경 기작들에 우선적으로 영향을 미치는 것을 보여주는 강력한 증거가 있다(Clark, R.E., Hippocampus, 15 (2), 260-272 (2005)). 심각한 NMDA 수용체 기능저하는 해리장애(dissociation) 뿐만 아니라, 정신병, 정신분열증의 핵심적 특징을 포함하는 임상적 증후군을 초래할 수 있다(Li F, T.J., N Engl J Med, 361 (3), 302-303 (2009)).

본 발명자들은 성장 호르몬을 포함하는 안전하고 효과적인 흡입형 제제를 개발하기 위해 예의 연구하였으며, 상기 제제가 NMDA 기능저하-관련 질환의 치료에 효과적으로 사용될 수 있음을 발견하였다.

따라서, 본 발명의 목적은, 성장 호르몬(GH)을 포함하는 흡입형 분말 제제의 NMDA 수용체 기능저하-관련 질환을 예방 또는 치료하기 위한 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 흡입형 분말 제제를 이용하여 NMDA 수용체 기능저하-관련 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 활성성분으로서 성장 호르몬(GH)을 포함하는 NMDA 수용체 기능저하-관련 질환의 예방 또는 치료용 흡입형 분말 제제를 제공하는 것이다.

본 발명의 한 태양에 따라, 활성성분으로서 성장 호르몬(GH)을 포함하는 흡입형 분말 제제의 NMDA 수용체 기능저하-관련 질환을 예방 또는 치료하기 위한 용도를 제공한다.

본 발명의 다른 태양에 따라, 성장 호르몬(GH)을 포함하는 치료학적으로 유효한 양의 흡입형 분말 제제를 이를 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상에서 NMDA 수용체 기능저하-관련 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 태양에 따라, 활성성분으로서 성장 호르몬(GH)을 포함하는, NMDA 수용체 기능저하-관련 질환의 예방 또는 치료용 흡입형 분말 제제를 제공한다.

성장 호르몬의 흡입 형태는 동량의 복용량으로도 성장 촉진을 위해 주사 형태만큼 효과적이고 안전하며, 뇌에서의 NR1 및 NR2B 수용체의 발현에 있어서는 보다 효율적이다. 성장 호르몬의 흡입 형태는 성장 촉진용으로 뿐만 아니라, NMDA 수용체의 발현이 감소되는 몇몇 질병에서의 임상 적용을 위해서도 유망한 투여형태이다.

본 발명의 상기 다른 목적 및 특징들은 첨부하는 도면과 함께 하기 본 발명의 설명에 의해 명확하게 될 것이다:
도 1a는 분무-건조시킨 분말 입자의 주사전자현미경 사진이고(5000x. 스케일 바= 10μm);
도 1b는 분무-건조 전의 원래 GH(좌) 및 상기 분말로부터 회수한 GH(우)의 SEC-HPLC 분석 결과이고;
도 2a 및 2b는 뇌하수체 적출한(HYPOX) 수컷 래트의 체중에 대한 GH의 효과이고(도 2a (^*: p=0.017, Anova 시험; 및 ^**(SC vs. INH 600): P=0.017, post hoc LSD 시험); 및 도 2b (#(SC vs INH 200): P=0.068; 및 ^*(SC vs INH 600): P=0.005(Anova 시험 및 post hoc LSD 시험));
도 2c는 처리 15일 후 뇌하수체 적출한 수컷 래트의 경골 성장판의 넓이이고(#: P =0.247 ^*: P <0.001 및 ^**: P< 0.001);
도 2d 내지 2f는 각각 뇌하수체 적출한 수컷 래트의 폐 수분량 측정; 분리된 폐에서의 폐 손상 점수(부종 형성 및 염증성 세포 침윤); 및 동맥혈 가스 분석 결과이고(도 2d (^*: P = <0.001; # P = 0.958; ^**: P = 0.004; ##: P=0.056 ^***: P < 0.001) 및 도 2e (#: P = 0.569, 크러스칼-왈리스 시험법 이용));
도 3a는 실험일 11일 내지 15일의 MWM 실험에서의 수행에 대한 HYPOX 래트의 GH 처리의 효과이고(^*: P = 0.033);
도 3b는 처리 15일 후에 측정된 NMDA 수용체 발현 수준이고 (#: P = 0.437; ^*: P <0.001; ^**: P <0.001; ##: P = 0.592; ^***: P <0.001; 및 ^****: P <0.001);
도 4a는 MWM 실험에서의 HYPOX 래트의 수행에 대한 상이한 경로에 의해 전달시킨 GH의 효과를 나타낸 것이고(상위 패널(^* P = 0.031) 및 하위 패널(^* P =0.086; ^** P=0.325, 및 ^*** P=0.011);
도 4b는 NMDA 수용체 및 AMPA 수용체의 발현량이고(^*: P =0.03; ^**: P =0.027 #: P =0.027; 및 ##: P =0.027 스튜던트 t-검정법); 및
도 4c는 IV 주사, SC 주사, 및 GH 건조 분말인 INH 200의 기관내 흡입에 따른 GH 혈장 농도-시간 곡선이다.

본 발명은 활성성분으로서 성장 호르몬을 포함하는 흡입형 분말 제제의 NMDA 수용체 기능저하-관련 질환을 예방 또는 치료하기 위한 용도를 제공한다.

또한, 성장 호르몬(GH)을 포함하는 치료학적으로 유효한 양의 흡입형 분말 제제를 이를 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상에서 NMDA 수용체 기능저하-관련 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

아울러, 활성성분으로서 성장 호르몬(GH)을 포함하는, NMDA 수용체 기능저하-관련 질환의 예방 또는 치료용 흡입형 분말 제제를 제공한다.

본원에서 사용된 용어 "NMDA 수용체 기능저하-관련 질환"은 노화 과정(age related process)으로 인한 NDMA 수용체, 예를 들어, NMDA 수용체 1(NR1), NMDA 수용체 2A(NR2A) 및 NMDA 수용체 2B(NR2B)의 기능저하에 의해 유발되는 임의의 질병 또는 질환을 지칭하며, 또는 인간 또는 동물 뇌에서 NMDA 길항제 약물에 의해 유도되는 상태(condition)가 정신분열증의 증상 및 자연적인 과정을 설명할 수 있는 질병 기작의 모델로 보여질 수 있다. 상기 질병 기작 자체는 NMDA 수용체의 기능 장애(dysfunction) 또는 NMDA 수용체를 차단하여 모델화될 수 있는 하류 효과를 포함할 것이다. NMDA 수용체를 차단함에 따른 전형적인 결과는 대뇌피질에서의 Glu 및 아세틸콜린의 과도한 방출이다. 이러한 흥분성 신경전달물질의 과도한 방출 및 그 결과로 일어나는 시냅스 후 뉴런의 과자극은 NMDA 수용체 기능저하 상태와 연관된 인지 및 행동 장애를 설명할 수 있을 것으로 제안되어 왔다. 유전적 및 비유전적 요소 둘다가 NMDA 수용체 기능저하 상태의 원인이 될 수 있고, 이러한 상태는 보통 청소년기(pre-adult life)가 아니라 성인기에 정신병적 징후들을 분출 및 촉발시킬 가능성을 안고 인생 초기에 뇌에 잠재 상태로 스며든 것으로 가정한다.

이와 같은 질병들은 정신분열증; 인지 장애를 포함하는 정신분열증 유사 증상; 알츠하이머 질환; 노화-관련된 기억 및 학습력 감소; 약물-유도된 NMDA 수용체 기능저하; NMDA 길항제-유도된 정신병 증상 또는 인지장애; 헌팅턴 질환; 및 만성 알콜중독을 포함할 수 있다.

용어 "분말" 또는 "분말화"는 잘 분산된 고체 입자로 구성된 제제를 지칭하며, 상기 입자들은 폐포 내로 침투되어 폐에 도착하기 위하여 흡입 장치 내에서 상대적으로 자유롭게 유동하고 분산될 수 있고 그 후에 대상에 의해 흡입된다.

용어 "분산성"은 분산된 입자들이 대상의 폐로 호흡되거나 또는 흡입될 수 있도록 분말 제제가 공기의 흐름 내에 분산(즉, 현탁)될 수 있는 정도를 의미한다. 예를 들어, 10%의 분산성을 갖는 분말 제제는 상기 제제를 구성하는 잘-분배된(finely-divided) 입자의 질량 중 10%만이 폐로 경구 흡입되게 현탁될 수 있음을 의미하고; 50% 분산성은 질량 중 50%가 현탁될 수 있음을 의미한다.

용어 "치료학적으로 유효한 양"은 치료되는 대상에게 예상되는 치료학적 반응을 제공하기 위하여 목적하는 수준의 성장 호르몬을 제공하도록 요구되는 분말 제제 내에 존재하는 성장 호르몬의 양이다.

용어 "약학적으로 허용가능한"은 상기 제제에 사용되는 부형제, 담체 또는 기타 첨가제가 폐에 대해 유의적인 독물학상 부작용 없이 폐로 들어갈 수 있음을 지칭한다.

상기 제제에서 사용되는 성장 호르몬은 임의의 포유동물의 성장 호르몬일 수 있으며, 인간 성장 호르몬이 바람직하다. 상기 성장 호르몬은 천연형 또는 유전적 재조합 산물일 수 있다.

상기 제제는 성장호르몬을 복용량 당 0.01 내지 10 mg/kg 체중, 바람직하게는 0.05 내지 0.5 mg/kg 체중으로 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 흡입형 분말 제제는 치료학적으로 유효한 양의 성장 호르몬에 추가로 적당한 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있다. 이러한 부형제는 기도(aerial pathways)를 통한 투여에 사용할 때 생리학적으로 허용가능해야 한다.

이러한 요건을 만족시키는 부형제들은 글로코스 및 아라비노스와 같은 단당류; 락토스, 사카로스 및 말토스와 같은 이당류; 솔비톨, 만니톨 및 자일리톨과 같은 다당류; 염화나트륨 및 탄산칼슘과 같은 염; 중탄산나트륨; 아미노산; 펩타이드; 중합체(polymers); 지질; 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택할 것이다.

바람직하게는, 상기 부형제는 단당류, 이당류 또는 다당류이며, 이중에서 락토스가 가장 바람직하다.

상기 제제는 부형제를 복용량 당 0.005 내지 15 mg/kg 체중, 바람직하게는 0.025 내지 1.5 mg/kg 체중으로 포함할 수 있다.

계면활성제, 예컨대 디팔미토일 포스파티딜콜린(dipalmitoyl phosphatidylcholine, DPPC)은 분말 유동성, 에어로졸 분산 및 폐 축적을 더 향상시키기 위하여 상기 제제에 포함시킬 수 있다.

상기 제제는 계면활성제를 복용량 당 0.01 내지 5 mg/kg 체중, 바람직하게는 0.05 내지 2.5 mg/kg 체중으로 포함할 수 있다.

선택적으로, 흡입 치료에 적합한 추가의 미립자 활성성분, 예컨대 코르티코스테로이드(예를 들면, 플루티카손 프로피오네이트) 또는 기관지 확장제(예를 들면, 살메테롤(salmeterol) 또는 알부테롤(albuterol) 또는 이의 염)을 상기 제제에 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 제제들은 소량의 기타 첨가제, 예를 들면 맛 차폐제(taste masking agent) 또는 감미제를 포함할 수 있음을 인식할 수 있다.

또한, 본 발명의 제제는 환자에게 투여한 후 활성 성분의 속방출, 서방출 또는 지연 방출을 제공하기 위하여 당업계에 공지된 임의의 과정을 통해 제제화시킬 수 있다.

흡입형 분말 제제의 일례는 인간 성장 호르몬(hGH), 락토스 및 디팔미토일 포스파티딜콜린(DPPC)을 1: 0.5-1.5: 1.0-5.0의 중량비, 바람직하게는 1:1:3의 중량비로 포함할 수 있다.

흡입형 분말 제제는 문헌(Bosquillon et al., J. Control. Rel. 96 (2004): 233-244)에 기재된 분무-건조 방법에 의해 제조할 수 있다.

예를 들면, 성장 호르몬, DPPC 및 락토스를 포함하는 흡입형 분말 제제는, (1) 용매(예를 들면, 에탄올) 중에 분산된 DPPC를 GH 및 락토스를 포함하는 수성 용액과 결합시켜 수성 혼합물을 수득하는 단계; 및 (2) 상기 수성 혼합물을 분무 건조하여 흡입형 분말 제제를 수득하는 단계에 의해 제조할 수 있다.

상기 흡입형 분말 제제는 건조 분말 흡입기 또는 정량흡입기(metered dose inhaler)에 의해 용이하게 전달시킬 수 있다. 건조 흡입형 분말을 전달하기 위해서는 성장 호르몬을 분쇄, 침전, 분무 건조하거나, 또는 그렇지 않으면 약 1 내지 10μm, 바람직하게는 약 1 내지 5μm의 입자 크기(질량 중위 공기역학적 직경(mass median aerodynamic diameter; MMAD))로 가공한다.

상기 건조 분말 제제는 희석이나 기타 취급을 요구하지 않기 때문에 실용적이고 이동중 사용하기에 편리하며, 상기 제제는 연장된 보존기간 및 저장 안정성을 가지며, 건조 분말 흡입전달 장치는 휴대가 쉽고 에어로졸 분무기가 필요로 하는 공기 압착기를 필요로 하지 않는다.

임의의 건조 분말 흡입기 뿐만 아니라, 건조 흡입형 분말의 제조에 적합한 모든 기술 및 이의 임의의 모든 개량은 본 발명의 범주 내인 것으로 본다.

NMDA 수용체 기능저하-관련 질환을 치료 또는 예방하는 방법에서, 상기 대상은 인간, 마우스, 래트, 양 및 토끼를 포함하는 포유동물일 수 있으며, 바람직하게는 인간이다.

GH를 포함하는 흡입형 제제는 건조 분말의 흡입에 의해 환자의 기도의 기관지내 공간으로 효과적으로 전달시킨다.

본 발명의 제제는 이를 필요로 하는 대상에 의해 흡입될 때 목적하는 생리학적 효과를 제공하기에 충분한 양을 포함하는 단위 복용량 용기(unit dosage receptacle)로부터 전달시킬 수 있다. 상기 양은 상기 단위 복용량 용기로부터 유래하는 실질적으로 모든 분말 분산물을 수용하기에 충분한 내부 부피를 가진 챔버(또는 흡입기)에서 분산시킬 수 있다.

NMDA 수용체 기능저하-관련 질환을 치료하기 위한 성장 호르몬의 일일 유효복용량은, 흡입형 제제 형태로 투여되었을 때 약 0.01 내지 10mg/kg 체중, 바람직하게는 0.05 내지 0.5mg/kg 체중의 범위일 수 있으며, 단독 또는 분할 복용 형태로 투여될 수 있다. 그러나, 실제로 투여되는 활성성분의 양은 치료되는 상태, 개별 환자의 나이 및 체중, 및 환자 증상의 심각도를 포함하는 다양한 관련 인자에 비추어 결정하여야 하므로, 상기 복용량은 본 발명의 범위를 어떤 방식으로든 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 제제의 GH 생물활성은 증체량; 경골 성장판 넓이의 증가; 학습/기억 습득력 개선; 및 NR1, NR2A 및 NR2B 발현량을 측정함으로써 평가하였다.

GH를 포함하는 제제의 경구 흡입은 증체량(도 2a 및 2b), 경골 성장판 넓이의 증가(도 2c) 및 학습/기억 습득력 개선(도 3a 및 4a) 측면에서 현저한 치료 효과를 나타내었으며, 이러한 현저한 효과는 임의의 기타 투여 방식(정맥내(IV) 또는 피하내(SC) 주사)에서 달성될 수 없다. 또한, GH를 포함하는 흡입형 제제를 투여한 실험 동물들의 뇌에서 NR1, NR2A 및 NR2b가 높은 수준으로 발현되었다(도 3b 및 4b).

따라서, 성장 호르몬의 흡입은 적지만 효과량의 성장 호르몬을 폐로 직접 투여하는 것을 가능하게 하며, NMDA 수용체 기능저하-관련된 질환의 치료에 있어 성장 호르몬을 전달하는 데 사용된 이전에 공지된 기타 방법들보다 더 우수한 효과를 나타낸다.

따라서, 본 발명은 NMDA 수용체 기능저하-관련된 질환의 치료에 적합한 효과적이고, 안전하고, 유효하며 생리학적으로 호환되는 흡입형 성장 호르몬 제제를 제공한다.

또한, 본 발명은 활성성분으로서 성장 호르몬(GH)을 포함하는, NMDA 수용체 기능저하-관련 질환의 예방 또는 치료용 흡입형 분말 제제를 제공한다.

하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

실시예 1: 분무-건조 rhGH 분말의 제조

인간 성장 호르몬(hGH; Growtropin^？, 동아제약 (용인시, 대한민국))을 한외여과(MWCO: 10,000)로 1차 정제하여 GH 용액에 포함되어 있는 비활성성분을 제거하였다. GH를 포함하는 건조 분말을 LabPlant SD-05 분무 건조기(Lab-Plant Ltd, 허더스필드, UK)로 제조하였다. 또한, GH 대신 소혈청알부민(BSA, Sigma)을 포함하는 건조 분말을 음성 대조군으로서 제조하였다.

상기 두 가지 경우에서, 단백질(GH 또는 BSA), 락토스(Mallinckrodt (파리, 켄터키, USA)), 및 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC; Lipoid GmbH (루트비히스하펜, 독일))을 70% 에탄올 중에서 1:1:3의 중량비로 용해시켜 2 mg/mL 피드 용액(feed solution)을 제조하였다. 간단하게, DPPC를 먼저 95% 에탄올에 용해시킨 후 GH(또는 BSA) 및 락토스를 포함하는 액상 용액과 결합시켰다. 상기 피드 용액을 40℃에서 유지시키고 분무-건조 공정 동안 계속적으로 교반하였다. 상기 용액을 17 mL/분의 속도로 분무 건조기에 도입시키고, 압착 공기를 이용하여 1-mm 오리피스 노즐(orifice nozzle)을 통해 즉각적으로 원자화시켰다. 생성된 용액을 120 내지 150℃의 주입 온도에서 가열하여, 본 발명의 분무-건조시킨 rhGH 분말(이하, "GH 분말"로 지칭함)을 수득하였다.

실시예 2: 분무-건조된 rhGH 분말의 특성

상기 실시예 1에서 제조된 분무-건조된 rhGH 분말의 특성을 분석하기 위하여, 3가지의 시험을 수행하였다.

2.1 엔더슨 케스케이드 임팩터(Anderson Cascade Impactor, ACI)

공기역학적 입자 크기 분포도를 8단계 Mark II를 이용하여 측정하였다.

상기 실시예 1에서 수득한 GH 분말 시료 10mg을 경질 젤라틴 캡슐(크기 3)에 수동으로 적재시키고, 이를 로타흡입기(Rotahaler)에 두고 상기 입자들이 방출되도록 쪼개어 두었다. 입자 바운스(particle bounce) 또는 재비산(re-entrainment)을 방지하기 위하여 유리 섬유 필터를 ACI 스테이지(ACI stage)에 위치시켰다(Vanbever, R. et al., Pharmaceutical research, V16 (11), 1735 (1999)). 각 분말 세트를 인덕션 포트(induction port)를 통해 28.3 L/분의 유속으로 10초 동안 작동되는 ACI 내로 끌어놓았다. 개별 밀착 스테이지(impaction stage)에서 축적된 입자들의 양을 상기 스테이지에 위치한 유리 섬유 필터(필터 단계용, 포어 크기<1μm, ThermoFisher; 기타 모든 스테이지용, 포어 크기 1 μm, Pall Corp.)의 중량의 차이를 측정함으로써 확인하였다. 각 단계의 효과적인 컷오프 공기역학적 직경은 다음과 같다: 스테이지 0(9μm); 스테이지 1(5.8μm); 스테이지 2(4.7μm); 스테이지 3(3.3μm); 스테이지 4(2.1 μm); 스테이지 5(1.1μm); 스테이지 6(0.65μm); 및 스테이지 7(0.43μm). 상기 정밀 입자 분획(fine particle fraction, FPF)은, 로타흡입기에 적재시킨 최초 총 분말(10 mg, nominal dose)에 의해 나눠진 공기역학적 크기 < 4.7 μm(스테이지 3 및 그 이하에서 축적된 입자들)의 분말의 양으로 정의하였다. ACI에서 회수된 총 질량의 백분율로서, 유효 컷오프 직경 미만의 분말의 누적 질량을 유효 컷오프 직경에 대해 그래프로 그렸다. 질량 중위 공기역학적 직경(mass median aerodynamic diameter; MMAD)은 그래프 위에서 선이 50번째 위수(percentile)를 교차하는 지점의 입자 크기로서 정의하였다.

2.2 주사 전자 현미경(Scanning electron microscopy, SEM)

상기 실시예 1에서 제조한 분무-건조된 GH 분말의 형태를 주사 전자 현미경으로 검사하였다. 상기 분무-건조시킨 GH 분말을 양면 테잎을 이용하여 표본 부본에 부착시키고 아르곤 가스의 존재 하에 Hummer I 스퍼터 코팅기(sputter coater) (Anatech Ltd.)를 이용하여 금-팔라듐으로 스퍼터 코팅하였다. GH 분말을 5 kV 가속 전압, 10 mm 작동거리(working distance), 70μm 대물 조리개(objective aperture), 및 프루브 전류 6 × 10^-11 amps를 이용하여 JEOL JSM-840 주사 전자 현미경으로 이미지화하였다.

그 결과(분무-건조된 입자의 주사 전자 현미경 이미지 (5000x. Scale bar = 10 μm))를 도 1a에 나타내었다. 도 1a에서 보는 바와 같이, GH 분말은 구형의 속이 빈 형태였으며, 이는 SEM으로 관찰된 기하학적 직경(~10 μm)보다 MMAD가 더 작음을 설명한다. 대조군 분말(GH 대신 BSA 함유)은 이와 유사한 공기역학적 특성을 나타냈다.

2-3. 건조 분말로부터 회수한 GH의 분석

분무-건조된 GH의 온전함(integrity)을 시험하기 위하여, 상기 분말로부터 단백질을 회수하고 미국 약전(U.S. Pharmacopeia)에 기재된 분석 방법에 따라 크기-배제 HPLC(size-exclusion HPLC)로 분석하였다.

GH 분말 5mg을 정확하게 측정하고, 1 ml 인산완충식염수(PBS, pH 7.4)에 현탁시키고, 계속해서 교반하면서 37℃에서 항온처리하였다. 1, 3 및 24시간 후에, 상기 입자 현탁액을 8000 rpm으로 5분 동안 원심분리하였으며, 0.8 mL의 상층액을 분석용을 위해 샘플링하였다. 각 샘플링 후에, 새로운 PBS로 교체하였다. 상기 상층액 중의 GH의 농도를 고압액체크로마토그래피(HPLC 1100 series, Agilent Technologies, 팔로알토, CA) 및 겔 여과 컬럼(TSK G3000SWXL (300 x 7.8 mm; 입자크기 5 μm))을 이용하여 측정하였다. 이동상은 97:3(v/v) 비의 0.06M 인산 완충액 및 이소프로필 알콜 혼합물이었다. 유속은 0.6 mL/분이었다. 각 시료 5μL을 예비-평형화 컬럼(pre-equilibrated column)에 주입하고 이동상으로 30분간 세척하였다. UV 검출기를 214nm로 세팅하였다. rhGH의 체류 시간은 17.6-17.7분이었다.

그 결과를 도 1b에 나타내었다(분무-건조 전의 원래 GH(좌) vs. 분말로부터 회수한 GH(우)). 이때 원래 GH에서의 부가적인 피크는 분무-건조 전에 한외여과하여 제거된 원래 GH 용액에 포함된 안정화제의 피크에 상응한다는 점을 주의한다.

도 1b에서 보는 바와 같이, 상기 분말로부터 회수한 GH는 원래 GH의 피크와 비슷하며 이는 분무-건조 공정이 GH의 성질을 위해하는 것은 아님을 보여준다. HPLC 분석은 1mg의 분말이 0.128± 0.01 mg의 GH를 포함함을 보여준다. 래트에 대해 바람직한 GH 복용량을 제공하기 위하여 상기 측정내용에 근거하여 상기 분말의 무게를 측정하였다.

시험예: 효능 및 안전성 시험을 위한 시험 동물의 제조 및 GH 투여

모든 동물 실험은 기관 동물 관리 및 사용위원회(Institutional Animal Care and Use Committee), 실험동물 연구센터(Laboratory Animal Research Center), 삼성 생명과학 연구소(Samsung Biomedical Research Institute)(서울, 대한민국)의 승인 하에 수행하였다. 모든 시험과정은 실험 동물의 윤리적인 사용을 위한 국제 지침을 준수하였으며, 사용한 동물의 수를 최소화하고 임의의 불필요한 고통을 피하기 위해 노력하였다.

통계 분석에서, 모든 결과는 평균± 평균의 표준 오차(S.E.M)로 표시하였다. 원-웨이 오차 분석(ANOVA) 시험 및 LSD 시험을 수행하였으며 윈도우용 소프트웨어 시그마-스태트(Sigma-stat)(SPSS Inc., 시카고, IL)를 이용하여 통계학적 차이(p < 0.05)를 입증하였다.

시험예 1 : 증체량

약 80-100 g의 체중을 갖는 5주령의 뇌하수체 적출(hypophysectomized, HYPOX) 수컷 스프래그 다우리 래트(4주째에 뇌하수체 적출)를 일본 SLC사(SLC, Inc)로부터 구입하였다. 상기 래트들을 7일의 기후적응 기간 동안 체중을 재고, 좋은 건강상태 및 동일한 몸무게를 나타내는(몸무게 변화: <10%) 래트만을 선택하여 분석에 이용하였다. 상기 래트들을 표준화 조건(12시간 명 및 12시간 암 사이클; 7:30에 소등; 온도, 21-26℃; 및 습도 40-60% RH) 하에 수용시켰다. 음식 및 식수는 자유롭게(ad libitum) 이용 가능하게 하였다.

래트(그룹당 7개체)를 체중에 따라 하기의 5개의 실험군으로 무작위로 배정하였다. 효능 및 안정성 연구를 위해, SC군의 동물들은 매일 GH 분말(200 μg/kg)을 피하(subcutaneous) 주사하였으며, INH 200군의 동물들은 매일 GH 분말(200 μg/kg)을 정맥내(intravenous) 주사하였으며, INH 600군의 동물들은 매일 GH 분말(600 μg/kg)을 정맥내 주사하였다. 2가지 대조군은 식염수와 함께 SC군의 GH 용액 및 INH 200군의 GH 분말에 각각 상응하는 양의 대조군 분말을 각각 처리하였다.

GH 분말을 분말 흡입기(Model DP-4; Penn-Century, 필라델피아, PA)를 통해 기관 내로 직접 전달시켰다. 먼저, 동물들을 케타민(50mg/kg) 및 자일라진(5mg/kg)으로 마취시키고 서가 위에 복부가 위로 가도록 위치시킨 후, 기관 내 튜브(endotracheal tube)로 16-게이지 2-인치 롱 IV 내재 캐뉼라(16-gauge 2-inch long IV indwelling cannula)를 이용하여 관을 삽입하였다. 실시예 1에서 제조한 GH 또는 BSA를 포함하는 건조 분말을 흡입기 내에 적재하였다. 상기 시료를 적재하기 전후의 장치의 무게를 잼으로써 분말 질량을 정량화하였다. 상기 흡입기의 전달 튜브를 캐뉼라 입구에 위치시키고, 상기 장치와 연결된 시린지(syringe)에 포함된 공기 1 mL를 공급함으로써 상기 분말을 폐로 도입시켰다. 이러한 방식으로 상기 동물들을 15일 동안 처리하고, 최초 10일 동안 증체량을 검사하였다. 몸무게는 매일 08:00시에 측정하였다.

이어, 흡입된 GH(INH 200 및 INH 600)의 증체량에 대한 효과를 복용량을 다양하게 하여 조사하였으며, SC군 및 대조군의 결과와 비교하였다. 그 결과를 도 2a 및 2b에 나타내었다.

도 2a는 상이한 처리 군의 몸무게 평균값의 변화를 보여준다. 10일 동안 피하 주사(SC: 200 μg/kg/일) 및 GH 분말 흡입(INH 200 및 INH 600: 각각 200 및 600 μg/kg/일)한 군들 모두에서 유의한 증체량이 관찰되었다. ING 200군 및 SC군 간의 차이는 없었다.

도 2b는 10일 동안 몸무게 변화차이를 보여주며, 흡입된 GH 분말(INH 200 및 INH 600)은 대조군 분말 또는 식염수와 비교하여 빠른 증체를 나타내었다. 흡입된 GH에 의한 증체는 복용-의존적인 반면, INH 200 및 INH 600간의 차이는 통계학적으로 유의적이지 않았다(P=0.068).

시험예 2 : 근위 경골 성장판의 넓이

경골 성장판 넓이 증가에 대한 흡입된 GH(INH 200군 및 INH 600군)의 효과를 복용량을 다양하게 하여 검사하였으며, SC군 및 대조군 결과와 비교하였다.

16일째 되는 날, 상기 동물들을 CO₂로 안락사시켰다. 그리고 이들의 경골을 취하여 10% 중성완충 포르말린으로 고정시켰다. 상기 고정된 경골을 근위단(proximal end)에서 정중면(frontal plane)을 따라 갈랐다. 상기 경골을 파라핀 포매(paraffin embedding), 절편화(section) 및 헤마토톡신 & 에오신(hematoxylin & eosin) 염색하였다. 근위 경골 성장판의 넓이의 측정은 좌측 경골에서 수행되었다. 광학 현미경으로 100× 배율로 절편(내측, 중앙 및 측면)당 3회 측정하였다. 3가지 측정치를 평균화하여 근위 경골 성장판의 넓이를 결정하였으며, 그 결과를 도 2c에 나타내었다.

경골 성장판의 넓이의 증가(도 2c)는 증체와 일치하는 경향을 보여주는데, 즉, 동일한 복용량의 INH 200군 및 SC군 간의 차이는 없으나(P=0.247), INH 600군은 INH 200군 (P <0.001) 또는 SC군 (P<0.001)보다 많은 증체 및 경골 성장판 증가를 나타냈다.

시험예 3: 폐 안전성

안락사 후 바로 대동맥에서 1 ml의 피를 채혈하였다. 혈액 가스 분석기(Rapidlab^？ 865)로 동맥 가스 수준을 즉시 측정하였다(도 2f). 가슴을 열어 심장을 제거하고, 기도를 노출시키고 3-0 봉합선으로 연결시켰다. 폐를 얻어내고 비-폐조직들을 조심스럽게 다듬었다. 이어, 좌폐의 무게를 재고, 95℃에서 48시간 동안 오븐에서 건조시켰다. 체중에 대한 젖은 폐 무게 및 건조한 폐 무게의 차이의 비율을 산출함으로써 폐 수분함량을 측정하였다(도 2d)(Ichinose, M. et al., Intern Med., 34 (1), 18-23 (1995)).

이어, 상기 래트의 폐를 얻어내서 10% 중성완충 포르말린으로 고정시켰다. 상기 폐를 파라핀 포매, 절편화 및 헤마토톡신 & 에오신 염색하였다. 폐 손상 수준을 이전에 보고된 시스템(Chen, H.I., Yeh, et al., Crit Care Med 34 (3), 758-764 (2006); 및 Kao, S.J. et al., Chest 126 (2), 552-558 (2004))을 변형하여 점수화하였다(도 2e). 폐 부종, 및 백혈구 및 기타 세포들의 침윤 정도를 0 (측정되지 않음) 내지 3 (심각함) 범위로 점수화하였다. 이어, 부종 및 세포 침윤 점수를 합하여 0 내지 6 범위의 최종 점수로 산출하였다. 심사는 표본의 정체에 대해서 모르게 수행하였다. 이러한 점수들을 다른 저자들에 의해 보고된 데이터와 비교하였다.

그 결과, 특히 폐로 흡입된 GH의 안전성은 폐 내부의 수분 함유량을 측정함으로써 평가하였다(도 2d). 도 2d에서 보는 바와 같이, 폐 수분 함유량은 hGH 피하내 주사군과 비교하여, 대조군 분말(P<0.001)을 포함하여 흡입형 분말을 전달받은 모든 군에서 증가하였다. 식염수 대조군 및 SC군(p=0.958)간의 차이도 없었다. 폐 수분 함유량은 하기 수학식에 따라 측정하였다.

<수학식 1>

폐 수분 함유량 = (젖은 폐 무게(mg) - 건조 폐 무게(mg))/체중(g) × 100

또한, 분리된 폐에서 폐 손상 점수(부종 형성 및 염증성 세포 침윤) 및 동맥혈가스 분석(pH 분석, pCO₂ (mmHg) 및 sO₂(%))을 각각 크러스칼-왈리스 시험(Kruskal Wallis test) 및 아노바 시험(Anova test)을 이용하여 측정하였다. 그 결과를 도 2e 및 2f에 나타내었으며, 군간 차이는 없었다.

시험예 4 : 학습/기억 습득

상이한 투여 경로를 통해 GH를 전달받은 동물에서의 기억 및 학습력 습득 향상도를 평가하기 위하여, 최초 처리 후 11일째부터 2가지 실험을 수행하였다: (i) 모리스 수 미로(Morris Water Maze, MWM) 공간 참고 기억 작업에서의 탈출 시간; 및 (ii) MWM 시험을 완료한 동물들의 해마에서의 NMDA 수용체 아형의 발현 수준 측정.

4-1 모리스 수 미로(MWM) 평가 시험(탈출시간)

MWM 평가 시험은 시험일 11일째에 시작하였으며, 상기 시험은 5일 동안 연속적으로 지속하였다. MWM 시험은 수영장 물에서 숨겨진 목표 플랫폼에 도착함으로써 스스로를 구조하는 동물의 능력을 측정하여 공간 학습 및 기억 능력을 평가한다. MWM 시험은 불투명하게 희석된 우유 용액(온도, 24± 1℃)으로 채워진 원형 수 미로 탱크(157cm 직경 x 60cm 높이)에서 수행되었다. 투명한 Plexiglas 플랫폼(10cm 직경 x 47cm 높이)을 물 표면 아래 3cm에 담그고 사분면 중 한면에 위치시켰다. 상기 미로를 침침한 방(well-lit room)의 중앙에 위치시키고 까만 커텐으로 둘러쌌으며(수영장 주변부로부터 50cm 되는 지점에 위치), 상기 미로는 4가지의 별개의 외부 가시 신호를 포함하였다. 각 래트의 수영경로(path)는 개인용 컴퓨터와 연결된 머리 위의 비디오카메라로 모니터하였으며, 자동화된 추적 시스템으로 분석하였다(Smart v.20^？ Panlab SL, 바르셀로나, 스페인).

MWM 시험 동안, 시험 동물들로 하여금 외부 가시신호와 관련된, 동일한 위치에 남아 있는 숨겨진 플랫폼을 찾아내도록 하였다. 3회 시도로 구성되는 1회 시험 세션(session)을 매일 수행시켰다. 각 시도에서, 래트들은 숨겨진 플랫폼을 포함하는 표적 사분면을 제외한 나머지 3곳의 사분면 중 한 곳에서 미로 벽에 직면하도록 물 속에 위치시켰다. 각 사분면으로의 입장은 매일 무작위로 수행하였다. 상기 동물이 플랫폼을 발견하면 각 시도는 종료시켰다. 만일 래트가 90초 이내에 플랫폼을 발견하지 못한다면, 시험자가 이들을 플랫폼 쪽으로 안내하였다. 이들이 플랫폼을 발견하거나 또는 플랫폼 위에 위치하면, 래트를 30초간 머무를 수 있도록 하였다. 이후, 상기 래트들은 타월로 닦아 건조시켰고, 다음번 시도에서는 다른 시작점에 위치시켰다. 세션 마지막에는 상기 래트를 타월로 닦아 건조시키고 홈 케이지로 돌려보냈다. 각 시도에서, 래트들이 플랫폼에 도달하는데 걸린 시간(탈출 시간/초), 수영경로의 길이(거리/cm), 및 수영 속도(cm/초)를 측정하였다. 상기 MWM 시험으로부터의 피로를 회복시키기 위하여, 시험 기간 동안 매일 GH 투여를 지속하였다.

15일 째에, 공간 성향을 시험하기 위하여 최종 MWM 시험을 완료한 지 2시간 후에 프로브 시도(probe trial)를 수행하였다. 상기 래트들을 그들을 위치시키기 위해 사용하였던 표적 플랫폼의 반대쪽 사분면에서 놓아주고, 플랫폼의 부재 하에 60초 동안 수영하게 하였다. 연습 기간 동안 플랫폼이 차지하고 있었던 공간에서 래트가 머무르는 시간의 비율을 측정하였다. 래트들은 야행성 동물이기 때문에, 모든 MWM 시험은 암 사이클동안 수행되었다. 상기 군들 사이에서, 시험 11일 내지 15일의 MWM 시험에서 나타난 행동에 대한 HYPOX 래트의 GH 처리 효과를 Anova 및 LSD post hoc 시험을 이용하여 측정하였다. 데이터는 평균± SEM(n=6)으로 나타내었다. 그 결과를 도 3a에 나타내었다. MWM 시험에서, 2일째에 탈출시간이 감소되었다는 것은 기억력 및 학습력이 더 우수함을 나타낸다. 도 3a에 나타난 바와 같이, INH군은 MWM 시험 시작 후 특히 2일째에 유의적인 탈출 시간의 향상을 보인 반면, SC군은 유의적인 향상을 보여주지 못했다. MWM 시험 5일 후에, 모든 동물들은 결국 이 시험에 적응하였고 탈출 시간은 더 짧아졌다.

4-2 해마 조직에서의 유전자 발현

MWM 시험이 완료되자마자 상기 동물들을 희생시켜 해마를 수득하고, 기억/학습 동안 증가되는 것으로 알려진 NMDA 수용체 1(NR1) 및 NMDA 수용체 2A(NR2A)의 발현량을 측정하였다. NMDA 수용체들의 발현 수준은 처리 후 15일째에 측정하였다.

안락사시킨 후에, 래트의 해마 조직을 분리하여 TRIzol 시약(Invitrogen, 칼스버드, CA)에 담궈두었다. 상기 조직을 균질화시켰으며, 제조사의 매뉴얼에 따라 총 RNA를 분리하였다. cDNA를 SuperSciprt III 역전사효소(Invitrogen)로 합성하였다. NMDA 수용체 아형 및 AMPA의 mRNA 수준을 정량화하기 위하여 ABI PRISM 7900HT 시스템 및 TaqMan 유전자 발현 분석법(Applied Biosystems, Foster City, CA)을 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 수행하였다.

NR1 (Rn01436030_m1), NR2A (Rn00561342_m1), NR2B (RN00561352_m1), AMPA (Rn00691897_g1), 및 GAPDH (Rn01462662_g1, 내생 대조군)을 FAM으로 라벨링하였다. mRNA 수준은 GAPDH의 수준에 비례하여 발현시켰다. 데이터를 분석하기 위해서 SDS2.3 소프트웨어(Applied Biosystems)를 이용하여 2-△△CT 방법을 이용하였다.

도 3b에 나타난 바와 같이, NMDA 수용체의 발현 수준은 특히 INH 600군에서 상당히 증가하였다. 참고로, 안락사에서 사용된 케타민은 기억/학습 과정에 대해 부정적인 효과를 갖는 것으로 공지되어 있다(Thompson, D.M. et al., Pharmacol Biochem Behav 26 (2), 401-405 (1987) 및 Frederick, D.L. et al., Pharmacol Biochem Behav 52 (4), 789-797 (1995)). 그러나, 본 실험에 관련된 모든 동물들을 동일한 방식으로 안락사시켰으므로, MWM 시험에서 케타민 안락사의 영향은 최소로 가정하여야 한다.

4-3 2일 및 5일째에 정맥내 주사군과 비교하여 흡입군에서 향상된 탈출시간 향상 및 NR1 및 NR2B 발현량 증가

기억/학습 과정 및 NMDA 수용체 아형의 보충(recruitment)에 대한 GH의 효과가 투여 경로 및 복용량에 의존적임을 확인하기 위하여, 3가지의 투여 경로, 즉, 정맥내(IV) 주사, SC 주사 및 흡입(모두 200 μg/kg/일 전달)에 따른 MWM 시험에서의 탈출 시간, 및 NMDA 수용체 및 AMPA 수용체의 발현 수준을 검사하였다.

그 결과를 Anova 및 LSD post hoc 시험을 이용하여 측정하였으며, 흡입군(INH 200군)에서 탈출 시간 향상이 가장 명백함을 보여주었다(도 4a). 도 4a에서, 상단 패널은 MWM 시험의 HYPOX 래트의 성과에 대한 상이한 경로에 의해 전달된 GH의 효과를 나타내었다. 2일째에, 흡입군의 탈출 시간이 가장 짧았다. 그리고 하단 패널은 MWM 시험 2일째에 향상된 탈출 시간을 보여준다(1-2일째 탈출 시간).

또한, NMDA 수용체 및 AMPA 수용체의 발현량 결과를 도 4b에 나타내었다. 도 4b에 나타난 바와 같이, NR1 및 NR2B의 발현 수준은 탈출 시간 향상 결과와 일치하게 2일(상단 패널) 및 5일(하단 패널)째에 INH 200군이 IV군과 비교하여 상당히 증가하였다.

시험예 5 : 약동학적 연구

상기 동물들을 케타민(70 mg/kg) 및 자일라진(7mg/kg)으로 안락사시키고, 혈액 시료화를 위한 카테터(catheters) 및 정맥내 주사를 래트의 경정맥에 삽입하였다. 이어, 상기 래트들에 대해 GH 분말(INH 200)의 기관내 흡입, 정맥내(IV) 또는 피하내(SC) 주사를 통해 GH를 투여시켰다. 상기 분말 및 용액의 양을 모든 동물에게 GH 200 μg/kg으로 제공하기 위하여 래트의 무게에 따라 조절하였다. GH 분말은 시험예 1에 기재된 바에 따라 분말 흡입기를 통해 기관지 내로 직접 전달되었다.

혈액 시료를 경정맥에서 얻어내고 헤파린-처리시킨 튜브에 위치시켰다. 첫 번째 시료는 GH 투여 바로 전에 수행하였다(시간 "0"). 이어, 12가지의 혈액 시료들(시료당 200 μL)을 4시간(IV 주사; 20분마다), 5시간(분말 흡입; 25분마다) 또는 7시간(SC 주사; 35분마다) 동안 수집하였다. 시험 동물들의 혈액 부피가 감소하는 것을 보충하기 위하여 동량의 염화나트륨 0.9%(w/v)를 주입시켰다. 혈청내 GH 농도를 인간 GH에 특이적이고 래트 GH에는 교차 반응하지 않는 면역방사측정법(ImmunoRadiometric assay, IRMA, DiaSorin, 사루지아, 이탈리아)으로 측정하였다. 면역 분석의 검출 범위는 0.5-50 ng/mL이고, 분석 간 상대적 표준편차(inter-assay relative standard deviation)는 5.2%이었다. 혈청 시료를 적당히 희석한 후 2개씩 분석하였다. 상기 래트들은 유전자 발현 수준 측정용 처리 15일후에 안락사시켰다.

상기 약동학적 데이터를 도 4c에 나타내었다. IV 주사(삼각형; n=8), SC 주사(검은 원; n=7) 및 GH 분말(INH 200)의 기관지내 흡입(흰 원; n=8)에 대한 GH 혈장 농도 vs 시간 곡선을 나타내었다.

본 발명은 GH의 생물학적 반응 및 약동학이 뇌하수체를 절제시킨 래트 모델에서 투여 경로에 따라 다양하다는 것을 보여준다. 흡입시킨 GH가 피하내 전달된 동량의 GH보다 증체량 촉진 및 경골 성장판의 성장에 보다 유용하였다. 폐내 수분함량에서 가장 완만한 증가를 나타낸 것을 제외하고는, 흡입시킨 GH가 피하 주사한 GH와 비슷한 조직학적 반응 및 폐 기능을 나타내었다. 또한, GH 흡입 투여가 뇌하수체 절제된 래트 모델에서 탈출 시간을 감소시키고, NMDA 수용체 아형 발현의 수준을 증가시켰다.

결론적으로, 성장 호르몬의 흡입 형태는 동량의 복용량으로도 성장 촉진을 위해 주사 형태만큼 효과적이고 안전하며, 뇌에서의 NR1 및 NR2B 수용체의 발현에 있어서는 보다 효율적이다. 성장 호르몬의 흡입 형태는 성장 촉진용으로 뿐만 아니라, NMDA 수용체의 발현이 감소되는 몇몇 질병에서의 임상 적용을 위해서도 유망한 투여형태이다.

본 발명은 상기 특정 실시태양과 관련지어 설명하였으나, 첨부된 청구범위에 의해 정의하는 발명의 범주 내에서 당해 분야의 숙련자는 본 발명을 다양하게 변형 및 변화시킬 수 있음을 인지해야 한다.

Claims

활성성분으로서 성장 호르몬(growth hormone, GH)을 포함하는 흡입형 분말 제제의 NMDA 수용체 기능저하-관련 질환(NMDA receptor hypofunction-related disease)을 예방 또는 치료하기 위한 용도.
제 1 항에 있어서,
상기 NMDA 수용체 기능저하-관련 질환이 정신분열증; 인지 장애를 포함하는 정신분열증 유사 증상; 알츠하이머 질환; 기억 및 학습의 노화-관련된 감소; 약물-유도된 NMDA 수용체 기능저하; NMDA 길항제-유도된 정신병 증상 또는 인지장애; 헌팅턴 질환; 및 만성 알콜중독으로 이루어진 군에서 선택되는, 용도.
제 1 항에 있어서,
상기 흡입용 분말 제제가 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함하는, 용도.
제 3 항에 있어서,
상기 약학적으로 혀용가능한 부형제를 글루코스 및 아라비노스와 같은 단당류; 락토스, 사카로스 및 말토스와 같은 이당류; 솔비톨, 만니톨 및 자일리톨과 같은 다당류; 염화나트륨 및 탄산칼슘과 같은 염; 중탄산나트륨; 아미노산; 펩타이드; 중합체(polymers); 지질; 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택하는, 용도.
제 1 항에 있어서,
상기 흡입형 분말 제제가 성장 호르몬, 락토스 및 디팔미토일포스파티딜콜린(dipalmitoyl phosphatidylcholine, DPPC)을 포함하는, 용도.
제 5 항에 있어서,
상기 흡입형 분말 제제가 인간 성장 호르몬(hGH), 락토스 및 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC)을 1: 0.5-1.5: 1.0-5.0의 중량비로 포함하는, 용도.
성장 호르몬(GH)을 포함하는 치료학적으로 유효한 양의 흡입형 분말 제제를 이를 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상에서 NMDA 수용체 기능저하-관련 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
활성성분으로서 성장 호르몬(GH)을 포함하는 NMDA 수용체 기능저하-관련 질환의 예방 또는 치료용 흡입형 분말 제제.