KR20120107782A - Biomolecule analyzer having nano-size cavity with v shaped groove array - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 기저부분에 초미세 구멍이 형성된 화산형 홈 어레이를 포함하는 생체분자 분석기 및 생체분자 분석방법에 관한 것이다.The present invention relates to a biomolecule analyzer and a biomolecule analysis method including a volcanic groove array having an ultra-fine hole formed at its base.
미량의 생체 물질을 검출, 분석하는 것은 생명공학 및 의학 분야에 있어서 매우 중요한 일이다. 특히, 암이나 급성 질병 등으로부터 환자의 생명을 구하고 질병의 전파를 막기 위해서는, 질병의 원인 및 발병 가능성을 파악하는 시점이 빠를수록 좋다. 따라서, 질병의 진전 정도 및 발병 가능성을 파악하기 위한 미량의 생체 물질의 검출, 분석을 위한 기술들이 개발되어 왔다.Detecting and analyzing traces of biological material is very important for biotechnology and medicine. In particular, in order to save the patient's life from cancer or acute disease and to prevent the spread of the disease, the earlier the time for identifying the cause and possibility of the disease is better. Therefore, techniques have been developed for the detection and analysis of trace biomaterials to determine the extent of disease progression and the likelihood of onset.
현재 화합물 또는 생체분자를 선별하고 분석하는 기술로는 크게 1) 형광 물질을 이용하는 방법, 2) 마이크로 어레이 칩을 이용하는 것, 3) ELISA, 및 가장 최근 들어 개발된 4) 라만 표지 나노입자 프로브를 이용한 검색 방법 등이 알려져 있다.Current techniques for screening and analyzing compounds or biomolecules are largely 1) using fluorescent materials, 2) using microarray chips, 3) ELISA, and 4) using Raman-labeled nanoparticle probes. Search methods and the like are known.
형광 물질을 이용한 검색 방법은 오랜 기간 동안 이용되어 온 전통적인 방법으로서, 다중 비드 에세이(multiplexed beadbasedassay), 광섬유 마이크로 비드 어레이(fiber-optic micro-bead array), 양자점으로 표지된 비드 에세이(quantumdot encoded beads assay) 등이 있다. Conventional methods using fluorescent materials have been used for a long time, and include multiple bead based assays, fiber-optic micro-bead arrays, and quantum dot encoded beads assays. ).
다중 비드 에세이는 96-웰 플레이트 각각의 웰(well)에서 100가지의 생물학적 물질을 동시에 분석할 수 있는 다중분석 장비이다. 두 종류의 레이저 감지기(laser detector)를 사용하여 실시간으로 신호전달을 진행시키며, 100개의 다른 색깔군 폴리스티렌 비드를 구별하여 정량할 수 있다. Multiple bead assays are multiplex assay equipment capable of simultaneously analyzing 100 biological substances in the wells of each 96-well plate. Two types of laser detectors are used to drive the signal in real time, and 100 different color polystyrene beads can be distinguished and quantified.
루미넥스 시스템에서는, 담체로서 직경 5.6m의 폴리스티렌(polystyrene)계 마이크로 비드를 사용하여 다양한 농도의 2색의 형광 색소로 염색하여, 각 형광 색소의 함유량을 식별 코드로서 이용하고 있다. 적색 레이저와 APD 센서(automatic power down sensor)로 비드의 직경과 색을 측정하고, 녹색 레이저와 광전자 증배관에서 샘플의 결합 양을 측정한다. In the LUMINEX system, a polystyrene-based microbead having a diameter of 5.6 m is used as a carrier and dyed with two colors of fluorescent dyes of various concentrations, and the content of each fluorescent dye is used as an identification code. The diameter and color of the beads are measured with a red laser and an automatic power down sensor, and the amount of binding of the sample is measured in the green laser and the photomultiplier tube.
그러나, 이러한 방법은 i) 형광 색소 함유량을 조절하여 비드를 암호화하기 어렵고, ii) 형광 색소 물질의 수가 극히 제한되어 있으며, iii) 목표 물질 검색 후 수합이 불가능하며 차후 다른 장비로 분석이 불가능하고, iv) 형광 물질로 표지된 이차 항체(second antibody)를 사용해야 하기 때문에 분석이 좀 더 복잡해지고, 분석 비용이 증가하게 된다는 문제점이 있다.However, this method is i) difficult to encode the beads by controlling the content of the fluorescent dye, ii) the number of fluorescent dye substances is extremely limited, iii) it is impossible to collect after searching for the target substance and is not possible to analyze with other equipment later, iv) As a result of using a second antibody labeled with fluorescent material, the analysis is more complicated and the cost of the analysis is increased.
광섬유 마이크로 비드 어레이(Fiber-optic micro-bead array)에서는 마이크로 비드를 cy5, TAMRA(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine), 플루오르세인(fluorescein)과 같은 형광 물질로 암호화한 후 각각의 암호화된 비드에 목표 물질을 인식할 수 있는 다양한 리간드를 도입한다. 목표 물질과 반응시킨 후 광섬유(fiber-optic)를 이용하여 목표 물질의 유무를 검출한다(Anal. Chem., 2000, 72:5618). In fiber-optic micro-bead arrays, microbeads are encoded with fluorescent materials such as cy5, 6-carboxy-tetramethyl-rhodamine (TAMRA), and fluorescein and then targeted to each encoded bead. Various ligands that can recognize the substance are introduced. After reacting with the target material, the presence or absence of the target material is detected using a fiber-optic (Anal. Chem., 2000, 72: 5618).
그러나, 이러한 방법은 i) 역시 암호화할 수 있는 형광 물질의 수가 제한되어 있고, ii) 형광 물질이 자가-켄칭(self-quenching)되어 민감도가 감소한다는 문제점이 있다.However, this method has a problem in that i) the number of fluorescent materials which can also be encoded is limited, and ii) the fluorescent materials are self-quenched to reduce sensitivity.
양자점으로 표지된 비드 에세이(Quantum-dot encoded bead assay)에서는 반도체 물질인 양자점이 사이즈에 따라서 다양한 색을 나타낸다. 따라서, 유기 형광 물질보다 수가 많으며, 보다 많은 물질을 암호화할 수 있는 장점이 있으며, 마이크로 비드를 다양한 색을 갖는 양자점으로 암호화시킨 후, 각각 다른 색을 갖는 비드에 특정 리간드를 고정화한다. 그리고, 유기 형광 물질로 표지된 목표 물질과 반응 후 검출하게 된다(Nature Biotech., 2001, 631). In a quantum-dot encoded bead assay, a quantum dot, which is a semiconductor material, shows various colors depending on the size. Therefore, there are many more than organic fluorescent materials, and there is an advantage that can encode more materials. After encoding microbeads with quantum dots having various colors, specific ligands are immobilized on beads having different colors. Then, the reaction is detected after reaction with a target substance labeled with an organic fluorescent substance (Nature Biotech., 2001, 631).
그러나, 이러한 방법은 i) 양자점을 대량으로 만들기 어렵고, ii) 양자점이 너무 고가이며, iii) 독성이 있다는 문제점이 있다.However, this method has a problem that i) it is difficult to make a large quantity of quantum dots, ii) quantum dots are too expensive, and iii) toxic.
생체 내 미량의 단백질, 일례로서 정상적인 생물 유체 내에 존재하는 자유 사이토카인(cytokine) 또는 케모카인(kemokine)의 농도를 분석하는 방법 중 가장 광범위 하게 사용되는 효소결합면역흡착분석법(Enzyme LinkedImmunoSorbent Assay, ELISA)의 경우, 항원과 1차 항체는 동일 몰 비로 결합하며, 검출 한계가 약 6 피코몰(picomole)인 것으로 알려져 있다. Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA), the most widely used method of analyzing the concentration of free cytokines or kemokines present in normal biological fluids, for example in vivo biological fluids In this case, the antigen and the primary antibody bind in the same molar ratio, and the detection limit is known to be about 6 picomoles.
따라서, 통상적인 ELISA으로는 정상적인 인간 혈장 내의 인터루킨-8(IL-8)을 검출할 수 없다고 알려져 있다. Therefore, it is known that conventional ELISA cannot detect interleukin-8 (IL-8) in normal human plasma.
또한, 상기 ELISA는 항원 및 1차 항체의 결합 여부를, 서양고추냉이 퍼옥시다제(Horse Radish Peroxidase, HRP) 등과 같은 별도의 효소 또는 발광 물질등을 표지(labeling)한 2차 항체를 사용하여, 전기적인 신호나 광신호를 획득하여 분석한다. In addition, the ELISA uses a secondary antibody labeled with an enzyme or a luminescent substance such as horseradish peroxidase (HRP), etc., for binding of the antigen and the primary antibody, Acquire and analyze electrical or optical signals.
그러나, 상기와 같은 2차 항체 및 별도의 효소를 사용하는 경우, 분석에 필요한 시간 및 비용이 상승하고, 사용하는 물질들이 생체 물질들이기 때문에 보관 시간 및 방법에 따라 분석 결과가 다르게 나타나는 단점이 존재한다. 또한, 단백질이 극미량(일반적으로 femto mole/ml 미만) 존재하는 경우는 직접적인 분석이 불가능하므로 추가적으로 시료를 더 많이 확보하고, 크로마토그래피(chromatography) 방법 등을 사용하여 시료의 농도를 높여 분석하고 있으며, 이를 위해 인력 및 시간 등이 소요되는 단점이 있다.However, when using the secondary antibody and a separate enzyme as described above, there is a disadvantage that the analysis time varies depending on the storage time and method because the time and cost required for the analysis increases, and the materials used are biological materials. . In addition, if there is a very small amount of protein (generally less than femto mole / ml), it is impossible to directly analyze, so additional samples are secured and the concentration of the sample is increased by using a chromatography method. There is a disadvantage in that manpower and time are required for this.
상기와 같은 검출 한계의 극복을 위한 시도의 일례로서, 나노입자 기재의 바이오-바코드(bio-barcode) DNA를 이용하여 증폭된 신호를 확보하고자 한 바가 개시된 바 있다 (Nam JM et al., Science, 2003; 301: 1884). As an example of an attempt to overcome the above detection limit, it has been disclosed to secure an amplified signal using bio-barcode DNA based on nanoparticles (Nam JM et al., Science, 2003; 301: 1884.
그러나, 상기 선행기술은 바이오-바코드 DNA의 분리를 위해 융점(Tm)까지 온도를 상승시켜야 하므로 시스템 전체의 온도를 변화시켜야 하는 필요가 발생하며, 이로 인해 항원-항체 반응에 의한 결합이 붕괴될 수 있다. 또한, 금 자성입자에 결합하는 분자는 설프하이드릴기(-SH)를 갖는 물질에 한정되므로, 유연한 운용이 어렵다. 또한, 단백질의 분석을 위해 표적물질의 다른 부위를 인식하는 이차 항체가 반드시 필요한 단점이 있다.However, since the prior art has to raise the temperature to the melting point (Tm) for the separation of the bio-barcode DNA, there is a need to change the temperature of the entire system, which can disrupt the binding by the antigen-antibody reaction have. In addition, since the molecule that binds to the gold magnetic particles is limited to a substance having a sulfhydryl group (-SH), flexible operation is difficult. In addition, there is a disadvantage that a secondary antibody that recognizes other sites of the target material is necessary for the analysis of the protein.
이에, 본 발명자들은 취급이 쉽고, 빠른 시간 내에, DNA, RNA, PNA, 단백질, 당 또는 당단백을 망라하는 생체분자를 분석할 수 있는 분석기를 발명하게 되었다.Accordingly, the present inventors have invented an analyzer that is easy to handle and can analyze biomolecules including DNA, RNA, PNA, protein, sugar or glycoprotein in a short time.
본 발명의 목적은 기저부분에 초미세 구멍이 형성된 화산형 홈 어레이를 포함하는 생체분자 분석기 및 생체분자 분석방법을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a biomolecule analyzer and biomolecule analysis method comprising a volcanic groove array having ultra-fine holes formed at the base.
본 발명은 기저부분에 초미세 구멍이 형성된 화산형 홈 어레이(groove cavity array)를 포함하는 생체분자 분석기를 제공한다. The present invention provides a biomolecule analyzer including a grooved cavity array having an ultra-fine hole formed at its base.
또, 본 발명은 청구항 1의 생체분자 분석기에 생체분자를 도입하는 단계, 전류를 발생시키는 단계, 광압력을 가하는 단계 및 광도를 측정하는 단계를 포함하는 생체분자 분석방법을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a biomolecule analysis method comprising the step of introducing the biomolecule into the biomolecule analyzer of claim 1, generating a current, applying a light pressure and measuring the intensity.
본 발명의 생체분자 분석기는 사용이 쉽고, 초소형으로 제작할 수 있으므로 빠른 시간 내에 많은 생체분자를 분석할 수 있으며, 생체분자에 특이적으로 결합하는 리간드를 더 포함할 수 도 있으므로 선택적으로 생체분자를 분석할 수 있다. Since the biomolecule analyzer of the present invention is easy to use and can be manufactured in a very small size, it can analyze many biomolecules in a short time and may further include a ligand that specifically binds to a biomolecule. can do.
도 1의 (A)는 본 발명의 기저부분에 초미세 구멍이 형성된 화산형 홈 어레이(groove cavity array)의 상면도이고, (B)는 기저부분에 초미세 구멍이 형성된 화산형 홈 어레이(groove cavity array)를 경사면에서 본 것을 나타낸 도이다.
도 2의 (a) 내지 (g)는 본 발명에 따른 기저부분에 초미세 구멍이 형성된 화산형 홈 어레이(groove cavity array)를 포함하는 생체분자 분석기의 제조방법의 일 실시상태의 개략적인 공정을 나타낸 것이다. (a)는 열산화막 형성과정, (b)는 패턴잉 (patterning), (c)는 화산형 홈 어레이의 형성, (d)는 산화막의 형성, (e)는 화산형 산화막 구조 표출 공정 및 홈의 기저부의 구멍 제작공정을 각각 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 생체분자 분석기의 초미세 구멍을 통하여 DNA가 홈 안쪽에서 바깥쪽으로 돌출하는 현상을 나타내는 도이다.
도 4는 입사광의 압력(input photonic pressure)에 의하여 본 발명의 생체분자 분석기의 초미세 구멍을 통과하는 DNA에 분석광을 조사하여 발생하는 Raman signal을 나타내는 도이다. 빨간 부분은 전기장의 세기가 약 백만 배로 증가된 plasmonic hot spot을 나타낸다
도 5는 생체분자 분석기에서 in-situ로 반응을 실시하여 유리된 사이토카인을 생체분자 분석기에서 측정하는 것을 나타내는 도이다. Figure 1 (A) is a top view of a grooved groove array (groove cavity array) is formed in the base of the ultra-fine holes, (B) is a top view of the volcanic groove array (groove) is formed in the base of the ultra-fine holes A diagram showing a cavity array viewed from an inclined plane.
Figure 2 (a) to (g) is a schematic process of one embodiment of a method for manufacturing a biomolecule analyzer comprising a grooved cavity array (groove cavity array) in which the ultra-fine hole is formed in the base portion according to the present invention It is shown. (a) is a process of forming a thermal oxide film, (b) is patterning, (c) is a formation of a volcanic groove array, (d) is an oxide film formation, Fig. 5 is a view showing a hole making step of the base portion of Fig.
Figure 3 is a diagram showing the phenomenon that the DNA protrudes from the inside of the groove through the ultra-fine hole of the biomolecule analyzer of the present invention.
FIG. 4 is a diagram illustrating a Raman signal generated by irradiating an analysis light to DNA passing through an ultrafine hole of the biomolecule analyzer of the present invention by an input photonic pressure. The red part shows the plasmonic hot spot, which increases the intensity of the electric field by about one million times.
FIG. 5 is a diagram illustrating measurement of free cytokines in a biomolecule analyzer by in-situ reaction in the biomolecule analyzer.
이하 본 발명을 구체적으로 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 기저부분에 초미세 구멍이 형성된 화산형 홈 어레이(groove cavity array)를 포함하는 생체분자 분석기를 제공한다. The present invention provides a biomolecule analyzer including a grooved cavity array having an ultra-fine hole formed at its base.
상기 화산형은 피라미드형 또는 원뿔형 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. The volcano may be pyramidal or conical, but is not limited thereto.
또한, 이에 제한되는 것은 아니지만, 그 구체적인 모양은 도 1을 참조할 수 있다.In addition, although not limited thereto, the specific shape may refer to FIG. 1.
본 발명의 생체분자 분석기는 화산형을 취하고 있으므로, 홈 구멍에 생체분자 시료가 투입되면, 홈의 기저부 방향으로 압력이 가해질 수 있다. 또한, 화산형은 전류를 발생시켜 전기장을 형성하면, 약 100만배까지 전기장이 증폭될 수 있는 장점이 있다. Since the biomolecule analyzer of the present invention has a volcanic shape, when the biomolecule sample is introduced into the groove hole, pressure may be applied toward the base of the groove. In addition, the volcanic type has the advantage that the electric field can be amplified up to about 1 million times to generate an electric field by generating a current.
본 발명의 생체분자라고 함은, DNA, RNA, PNA, 단백질, 당 또는 당단백을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.Biomolecules of the present invention include, but are not limited to, DNA, RNA, PNA, protein, sugar or glycoprotein.
본 발명의 생체분자 분석기는 홈 기저부에 1 내지 100 nm, 바람직하게는 1 내지 10 nm의 초미세 구멍을 가진다. 상기 초미세 구멍의 크기 조절을 통해 1차적으로 크기에 따른 분리를 할 수 있다. The biomolecule analyzer of the present invention has an ultrafine pore of 1 to 100 nm, preferably 1 to 10 nm at the base of the groove. By controlling the size of the ultra-fine hole can be separated primarily according to the size.
본 발명의 생체분자 분석기는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 금, 은, 동, 알루미늄, 백금, 실리콘, 이들의 혼합물로 표면을 코팅할 수 있다. 이 경우, 상기 코팅 기재에 부착이 용이한 링커나 리간드를 쉽게 부착시킬 수 있는 장점이 있다.The biomolecule analyzer of the present invention may be coated with a surface with, but not limited to, gold, silver, copper, aluminum, platinum, silicon, and mixtures thereof. In this case, there is an advantage that can easily attach a linker or ligand easily attached to the coating substrate.
본 발명의 생체분자 분석기는 전류발생기를 더 포함할 수 있다. 상기 전류발생기를 이용하여 전류를 발생시키면 홈 구멍 쪽은 마이너스 (-) 전하를, 반대편은 플러스 (+)를 띄게 되므로, 인위적 혹은 자연적으로 (-) 전하를 띄는 생체분자를 좀 더 빠르고 용이하게 초미세 구멍 밖으로 밀어낼 수 있으므로 분석시간을 단축시킬 수 있다.The biomolecule analyzer of the present invention may further include a current generator. When the current is generated using the current generator, the negative side of the groove hole has a negative (-) charge and the opposite side has a positive (-) charge. The analysis time can be shortened because it can be pushed out of the micro holes.
본 발명의 생체분자 분석기는 광발생기를 더 포함할 수 있다. 상기 광발생기를 이용하여 광에너지를 가하면 입사광의 압력 (input photonic pressure)에 의하여 생체분자가 더욱 빠른 속도로 초미세 구멍을 통과할 수 있다. 초미세 구멍을 통과한 생체분자에는 분석광을 조사하여 이때 발생되는 Raman signal을 광도 측정기로 측정하여 생체분자를 분석할 수 있다.The biomolecule analyzer of the present invention may further include a photogenerator. When the light energy is applied using the light generator, the biomolecule may pass through the ultra-fine hole at a higher speed by the input photonic pressure. The biomolecules that have passed through the ultra-fine pores can be irradiated with analysis light and analyzed by measuring the Raman signal generated by the photometer.
또한, 본 발명은 청구항 1의 생체분자 분석기에 생체분자를 도입하는 단계, 전류를 발생시키는 단계, 광압력을 가하는 단계 및 광도를 측정하는 단계를 포함하는 생체분자 분석방법을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a biomolecule analysis method comprising the step of introducing the biomolecule into the biomolecule analyzer of claim 1, generating a current, applying a light pressure and measuring the intensity.
상기 분석방법에 있어서는, DNA와 같이 자연적으로 마이너스 (-)전하를 띄는 생체분자를 분석하는 경우에는, 그 자체로 생체분자 분석기에 도입하면 되고, 그렇지 않은 경우, 생체분자 분석기에 도입 전, 인위적으로, 마이너스 (-)전하로 대전시키는 단계를 더 포함할 수도 있다.In the above analysis method, when analyzing a biomolecule that naturally has a negative (-) charge, such as DNA, it may be introduced into the biomolecule analyzer itself, otherwise, artificially, before introduction into the biomolecule analyzer In addition, the method may further include charging with negative (-) charge.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명한다.
Hereinafter, an Example demonstrates this invention concretely.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 제한되는 것은 아니다. However, the following examples are merely to illustrate the invention, but the content of the present invention is not limited to the following examples.
<실시예> 기저부분에 초미세 구멍이 형성된 화산형 홈 어레이를 포함하는 생체분자 분석기의 제조EXAMPLES Preparation of a Biomolecular Analyzer Comprising Volcanic Groove Array with Ultra-fine Holes at Base
도 2(a)에 도시된 바와 같이, 실리콘 웨이퍼의 앞면 및 뒷면(front and back side)에 열산화(Thermal Oxidation) 방법을 통해 실리콘 산화막(SiO2)을 각각 형성한다. 추가적으로, 상기 형성된 각각의 실리콘 산화막(SiO2) 위에 저압화학기상증착(LPCVD;Low Pressure Chemical Vapor Deposition)을 통해 실리콘 질화막을 각각 형성할 수 있다. As shown in FIG. 2 (a), silicon oxide films SiO 2 are formed on the front and back sides of the silicon wafer through thermal oxidation. In addition, silicon nitride layers may be formed on the silicon oxide layers SiO 2 , respectively, through low pressure chemical vapor deposition (LPCVD).
이어, 도 2(b)에 도시된 바와 같이, 실리콘 웨이퍼의 앞면에 형성된 실리콘 산화막(SiO2) 위에 포토 레지스터(PR)를 이용하여 건식 식각을 통해 식각 마스크를 형성한다. 상기 건식식각용 가스로는 CHF3, CF4, Ar이 사용될 수 있다. Subsequently, as shown in FIG. 2B, an etch mask is formed through dry etching on the silicon oxide layer SiO 2 formed on the front surface of the silicon wafer using the photoresist PR. CHF 3 , CF 4 , Ar may be used as the dry etching gas.
상기 형성된 식각 마스크를 통해 도 2(c)에 도시된 바와 같이, 실리콘 웨이퍼를 속이 비어있는 피라미드 형태의 사면체 구조로 습식식각한다.As illustrated in FIG. 2C, the silicon wafer is wet-etched into a hollow pyramidal tetrahedral structure through the formed etching mask.
상기 습식 식각에는 테트라메틸암모늄히드록사이드 수용액 또는 KOH 수용액과 같은 알카리성 용액이 사용될 수 있다.In the wet etching, an alkaline solution such as tetramethylammonium hydroxide or KOH solution may be used.
이어서, 상기 속이 비어있는 피라미드 형태 사면체를 도 2(d)에 도시된 바와 같은 일정 형상으로 열산화시켜 상기 식각된 실리콘 웨이퍼에 산화막을 형성한다.Subsequently, the hollow pyramidal tetrahedron is thermally oxidized to a predetermined shape as shown in FIG. 2 (d) to form an oxide film on the etched silicon wafer.
이어서, 상기 실리콘 웨이퍼의 뒷면에 형성된 실리콘 산화막(SiO2) 위에 건식식각을 통해 식각 마스크를 형성한다. 상기 건식 식각용 가스로는 CHF3, CF4, Ar이 사용된다. Subsequently, an etch mask is formed through dry etching on the silicon oxide layer SiO 2 formed on the back surface of the silicon wafer. As the dry etching gas, CHF 3 , CF 4 , and Ar are used.
상기 형성된 식각 마스크를 통해 도 2(e)에 도시된 바와 같이, 속이 비어있는 피라미드 형태 사면체를 포함하는 실리콘 웨이퍼의 뒷면을 TMAH 용액과 같은 알카리성 용액을 사용하여 습식 식각을 통해 식각한 후, 도 2(f)에 도시된 바와 같이, 이온 집중빔(Focused ion beam)을 이용하여 사면체의 정점에 나노 크기의 구멍을 생성한다.
As shown in FIG. 2E through the formed etching mask, the back side of the silicon wafer including the hollow pyramidal tetrahedron is etched through wet etching using an alkaline solution such as TMAH solution, and FIG. 2. As shown in (f), a nano-sized hole is created at the apex of a tetrahedron using a focused ion beam.
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