KR20120104646A

KR20120104646A - Ｇｌａ-도메인 응고 단백질 정제 방법

Info

Publication number: KR20120104646A
Application number: KR1020127005512A
Authority: KR
Inventors: 제랄드 페렛; 사미 슈토루; 니콜라스 바이호류
Original assignee: 엘에프비 바이오테크놀로지스
Priority date: 2009-07-31
Filing date: 2010-07-30
Publication date: 2012-09-21
Also published as: WO2011012830A1; US9359610B2; US20130143302A1; EP2459718A1; EP2459718B1; CA2771835A1; CA2771835C; FR2948664B1; FR2948664A1; IL218260A0; AU2010277420A1; AU2010277420B2; CN102639701A

Abstract

본 발명은 a) (i) 핵산 압타머와 (ii) GLA-도메인 응고 단백질(들) 사이의 복합체를 형성하기 위하여, 하나 이상의 GLA-도메인 응고 단백질을 함유하는 샘플을 다수의 GLA-도메인 응고 단백질에 특이적으로 결합하는 핵산 압타머(nucleic aptamers)가 고정화된 친화성 지지체와 접촉하게 하는 단계, b) 단계 a)에서 형성된 복합체로부터 GLA-도메인 응고 단백질(들)을 방출시키는 단계, 및 c) 상기 GLA-도메인 응고 단백질(들)을 정제된 형태로 회수하는 단계를 포함하는, GLA-도메인 응고 단백질을 정제하기 위한 방법에 관한 것이다.

Description

ＧＬＡ-도메인 응고 단백질 정제 방법{Method for purifying GLA-domain coagulation proteins}

본 발명은 단백질 정제 분야, 특히 GLA-도메인 응고 단백질의 정제 분야에 관한 것이다.

일반적으로, GLA-도메인은 단백질의 N-말단 쪽에 위치한 영역으로 구성되고, 특히 카르복실화 되어 카르복시글루탐산 또는 "GLA" 잔기를 제공하는 다수의 글루타민 잔기를 포함하는, 공통 구조인 GLA 도메인을 갖는 단백질의 계(family)를 형성한다. GLA-도메인 단백질은 일반적으로 비타민 K-의존성 카르복실라제에 의해 인식되는 프로펩타이드(propetide)라 불리는 N- 말단 부분을 포함한다. GLA 도메인의 글루타민 잔기를 카르복실화 한 후, 프로펩타이드는 단백질 분해에 의해 절단되어 성숙하고 활성적인 GLA-도메인 단백질이 방출된다. 고려중인 단백질에 따라, GLA 도메인은 보통 카르복실화되어 Gla를 제공하는 9 내지 12개의 글루타민 잔기를 포함하는 대략 45개 아미노산으로 구성된다.

GLA-도메인 단백질은 "비타민 K-의존성" 단백질로 구성된다. GLA-도메인 단백질은 응고 인자, 골격 조직 단백질 및 코노펩타이드를 포함한다. GLA-도메인 응고 인자는 프로트롬빈(인자 II), 인자 Ⅶ, 인자 IX, 인자 Ⅹ, 단백질 C 및 단백질 S를 포함한다. 비타민 K-의존성 GLA-도메인 응고 단백질을 포함하는, GLA-도메인 단백질은 특히 퓨리등(Furie et al.)의 문헌[1999, Blood, Vol. 93: 1798-1808]에 의해 제공된다.

비타민 K-의존성 GLA-도메인 응고 단백질은 치료적 관심이 있는 단백질로 구성된다. 상기 단백질에서, 인자 II, 인자 VII, 인자 IX 및 인자 X가 수많은 항상성 질환을 예방하거나 치료하기 위해 투여되는 치료적으로 매우 관심이 있는 단백질이다. 인간 GLA-도메인 응고 단백질은 일반적으로 인간 혈액 혈장으로부터의 천연적 인간 유체로부터 정제될 수 있다. 더구나, 수많은 연구가 재조합 인간 GlA-도메인 응고 단백질을 생성하고 정제하기 위한 방법을 개발하기 위하여 행해졌다. 언급될 수 있는 것이 예를 들어 약제로서 이미 시판되는 재조합 인간 인자 VII이다.

이들 단백질이 천연적으로 또는 그밖에 재조합 단백질 형태로 생성될 수 있는 생물학적 유체로부터 정제된 GLA-도메인 단백질을 얻기 위한, 적절한 정제 방법이 이미 선행 기술에서 알려져 있다. 이들 방법은 일반적으로 단백질 침전 및 크로마토그래피로의 옮김 단계, 이어서 순차적인-용출 단계, 딥-여과(deep-filtration) 단계, 한외 여과, 또는 그 밖의 농축 단계들에 기초한, 연속적인 선택적 분리 단계를 포함한다. 오늘날 약제를 제조하기 위하여 사용되는 GLA-도메인 응고(coagulation) 단백질을 정제하기 위한 방법은 친화성 클로마토그래피 단계를 포함하지 않는다. 이러한 기술적 선택에 대한 한 이유는 크로마토그래피 용출물(elute)의 부피 중의 정제된 치료 단백질과 결합된 것으로 발견되는, 친화성 지지체에 그라프트된 리간드 분자들의 일부의 탈착에 기인한 결점에 있다. 예시적으로, 언급될 수 있는 것이 마우스 항-FIX 모노클로날 항체들이 고정화된 면역친화성(immunoaffinity) 지지체를 사용한 방법에 의해 얻어진 정제된 인간 인자 IX에 기초한 약제학적 조성물인, 제품 모노닌(Mononine)® 이다. 그러나, 모노닌® 제품의 모노그래프는 최종 제품 중의 쥣과(murine) 항-인간 FIX 모노클로날 항체의 잔량의 존재를 특정화하고 있으며, 이는 처리된 환자가 "여과물(leachables)"(쥣과 항체 및 항체 단편)에 대해 면역화되기 때문에 처리된 환자에서 면역원성 문제를 일으킬 수 있다. 모노닌® 제품의 모노그래프는 쥐과 단백질에 대해 알레르기성인 환자에 대해 금기사항을 특정화한다.

일반적으로, 선행 기술에 비타민 K-의존성 GLA-도메인 응고 단백질을 정제하기 위한 개선된 또는 대안적인 방법에 대한 필요가 있다. 이는 예를 들어 인자 VII 또는 인자 IX와 같은 단일 정제된 단백질을 포함하는 조성물을 얻기 위한 대안적인 또는 개선된 방법, 및 GLA-도메인 단백질의 조합물을 포함하는 조성물, 예를 들어 인자 II, 인자 VII, 인자 IX 및 인자 X의 조합물을 포함하는 조성물을 얻기 위한 대안적 또는 개선된 방법에 대한 필요를 포함한다. 이는 비재조합 GLA-도메인 단백질 또는 재조합 GLA-도메인 단백질을 정제하기 위한 대안적인 또는 개선된 방법에 대한 필요를 포함한다.

본 발명은

a) (i) 핵산 압타머와 (ii) GLA-도메인 응고 단백질(들) 사이의 복합체를 형성하기 위하여, 하나 이상의 GLA-도메인 응고 단백질을 함유하는 샘플을 GLA-도메인 응고 단백질에 특이적으로 결합하는 핵산 압타머(nucleic aptamers)가 고정화된 친화성 지지체와 접촉하게 하는 단계,

b) 단계 a)에서 형성된 복합체로부터 GLA-도메인 응고 단백질(들)을 방출시키는 단계, 및

c) 상기 생물학적 GLA-도메인 응고 단백질(들)을 정제된 형태로 회수하는 단계를 포함하는, GLA-도메인 응고 단백질을 정제하기 위한 방법에 관한 것이다.

상기 방법들에서, 상기 압타머는 바람직하게는 데옥시리보핵산 압타머(deoxyribonucleic aptamers)이다.

상기 방법들에서, 상기 GLA-도메인 단백질은 예를 들어, 인자 II, 인자 Ⅶ, 인자 IX 및 인자 X로부터 선택된 비타민 K-의존성 응고 인자일 수 있다.

이들 방법의 특정 실시 형태에서, 상기 핵산 압타머는 서열 번호 4의 압타머들로 구성된다.

도 1은 Mapt-1 항-GLA 압타머가 고정화된 친화성 지지체를 갖는 크로마토그래피에 의해 혈장 인자 IX의 정제 동안 얻어진 연속적인 분획 중에서 얻어진 단백질의 SDS-PAGE 전기 영동 겔의 이미지이다. 레인 1: 출발 물질; 레인 2: 보유되지 않는 분획(NR); 레인 3: 용출 분획(E1); 레인 4: 재생성(regeneration) 분획(E2); 레인 5: 정제된 인자 IX 참조 대조군; 레인 6: 공지된 분자의 참조 단백질.
도 2는 다양한 조성물 중에 존재하는 (i) 인자 VII, 인자 IX 또는 인자 X가 각각 표면 플라즈몬 공명 기술에 따른 분석에서 지지체에 고정화된 GLA-도메인 단백질에 특이한 압타머(ii)에의 결합 곡선을 나타낸다. x-축을 따라: 초로 표현된 시간; y 축을 따라, 인위적 공명 단위로 표현된 공명 시그날. 곡선 번호 1: 인간 재조합 인자 IX (BeneFIX®의 제조); 곡선 번호 2: 인간 혈장 인자 VII의 제조; 곡선 번호 3: 인간 혈장 인자 X의 제조; 곡선 번호 4: 음성 대조군 제조.
도 3은 표면 플라즈몬 공명 기술에 따른 분석에서 지지체에 고정화된 재조합 인간 인자 IX에 본 발명의 다양한 핵산의 결합 곡선을 보여준다. x 축을 따라: 초로 표현된 시간; y 축을 따라: 인위적 공명 단위로 표현된 공명 시그날. 곡선 "1"은 저-친화성 핵산; 곡선 "2"는 중간-친화성 핵산; 곡선 "3"은 고-친화성 핵산; 곡선 "4"는 매우 고-친화성의 핵산.
도 4는 표면 플라즈몬 공명 기술에 따른 분석에서 지지체에 고정화된 재조합 인간 인자 IX에 핵산 압타머 "Mapt-1.2.-CS" 및 "Mapt-1.2.-CSO"의 결합 곡선을 보여준다. x 축을 따라: 초로 표현된 시간; y 축을 따라: 인위적 공명 단위로 표현된 공명 시그날. 곡선 "1"은 Mapt-1.2.-CS 압타머로 얻어진 결합 곡선. 곡선 "2"는 Mapt-1.2.-CSO 압타머로 얻어진 결합 곡선.
도 5는 항-GLA 핵산 압타머가 고정화된 친화성 지지체로 생성된, 인간 혈장 인자 IX를 정제하기 위한 방법을 수행했을 때 얻어진 크로마토그래피 프로파일을 보여준다. x 축을 따라: 시간; y 축을 따라 254 나노미터에서의 흡광도(O.D). (1) 인간 플라스마 인자 FIX 농축물을 주입시; (2): 비보유된 단편 제거 피크; (3): 정제된 FIX 용출 피크; (4): 크로마토그래피 지지체 재생 단계 동안 생성된 피크.
도 6은 GLA-도메인 단백질에 특이적인 핵산 압타머가 그라프트된 친화성 지지체 상에서 크로마토그래피를 겪은, 인간 혈장 인자 IX의 정제된 분획 중에 함유된 단백질의, 환원제 없이 4 내지 12%의 비스아크릴아미드의 구배로, SDS-PAGE 전기 영동 겔의 이미지이다. SDS-PAGE 겔을 쿠마시 블루(Coomassie blue)로 처리했다. 좌측에서 우측으로: 레인 1("SM"): 출발 조성물, 인간 혈장 인자 IX 농축물; 레인 2("NR"): 친화성 지지체 상에 보유되지 않은 분획 중에 함유된 단백질; 레인 3("E1"): 용출 분획 E1에 함유된 단백질; 레인 4("E2"): 재생성 버퍼 중에서 친화성 지지체로부터의 유출물에 함유된 단백질; 레인 5("E3"): 재생산 버퍼 중에서 친화성 지지체로부터의 유출물에 함유된 단백질; 레인 6("T FIX"): 인간 혈장 인자 IX의 정제된 분획.
도 7은 항-GLA 핵산 압타머가 고정화된 친화성 지지체로 생성된, 인간 혈장 인자 IX를 정제하기 방법을 수행할 때 얻어진 크로마토그래피 프로파일을 보여준다: x-축을 따라:시간; y축을 따라 :254 나노미터에서의 흡광도(O.D). (1): 비보유된(nonretained) 분획; (2) 정제된 인간 FIX 용출 피크; (3) 크로마토그패피 지지체 재생성 피크.
도 8은 GLA-도메인 단백질에 특이적인 핵산 압타머가 그래프트된 친화성 지지체 상에서 크로마토그래피를 겪은, 인간 혈장 인자 IX의 정제된 분획 중에 함유된 단백질의, 환원제 없이 4 내지 12%의 비스아크릴아미드의 구배에서, SDS-PAGE 전기 영동 겔의 이미지이다. SDS-PAGE 겔을 쿠마씨 블루로 처리하였다. 좌측에서 우측으로: 레인 ("출발(start)"): 출발 조성물, 인간 플라스마 인자 IX 농축물; 레인 2("비보유된"): 친화성 지지체에 보유되지 않은 분획 중에 함유된 단백질; 레인 3('용출물"): 용출 분획 중에 함유된 단백질.
도 9는 항-GLA 핵산 압타머가 고정화된 친화성 지지체로, 형질전환(transgenic) 암퇘지의 우유에서 생성된, 형질전환 인간 인자 IX를 정제하기 위한 방법을 수행했을 때 얻어진 크로마토그래피 프로파일을 보여준다: x-축을 따라: 시간; y-축을 따라: 254 나노미터에서의 흡광도(O.D.). (1): 형질전환 FIX의 주입시, (2): 비보유된 분획; (3) 용출 분획.
도 10은 GLA-도메인 단백질에 특이적인 핵산 압타머가 그래프트된 친화성 지지체 상에서 크로마토그래피를 겪은, 형질전환 암퇘지의 우유에서 생성된 재조합 인간 인자 IX의 미리 정제된 분획 중에 함유된 단백질의 SDS-PAGE 전기 영동 겔의 이미지이다. SDS-PAGE 겔을 쿠마시 블루로 처리하였다. 좌측에서 우측으로: 레인 1("E5", "출발"): 출발 조성물, MEP HyperCel®에서 예비정제된 형질전환 인간 인자 IX; 레인 2("E6", "비보유된"): 친화성 지지체 상에 보유되지 않은 분획 중에 함유된 단백질; 레인 3 ("E7", "용출"): 용출 분획에 함유된 단백질; 레인 4("E8", 재생성): 재생성 분획중에 함유된 단백질; 레인 5 ("T FIX", "순수 FIX 대조군"): 정제된 FIX 대조군. 화살표: FIX의 이동 위치.
도 11은 표면 플라즈몬 공명에 따른 분석에서 지지체에 고정화된 재조합 인간 인자 IX에 대한 본 발명의 다양한 핵산의 결합 곡선을 보여준다. x-축을 따라: 초로 표현된, 시간; y-축을 따라, 인위적 공명 단위로 표현된, 공명 시그날. 곡선 "1"은 저친화성 핵산; 곡선 "2": 중간-친화성 핵산; 곡선 "3": 고-친화성 핵산; 곡선 "4": 매우 고 친화성의 핵산.
도 12는 항-GLA 핵산 압타머가 고정된 친화성 지지체로 생성된, 형질전환 인간 인자 VII를 정제하기 위한 방법을 수행할 대 얻어진 크로마토그래피 프로파일을 보여준다. x-축을 따라: 시간; y-축을 따라: 254 나노미터에의 흡광도(O.D.). (1): 주입시; (2): 비보유된 분획; (3): 용출 버퍼의 주입시; (4): 용출 분획.
도 13은 GLA-도메인 단백질에 특이적인 핵산 압타머가 그라프트된 친화성 지지체 상에서 크로마토그래피를 겪은, 인간 혈장 인자 VII의 예비 정제된 분획 중에 함유된 단백질의 SDS-PAGE 전기 영동 겔의 이미지이다. SDS-PAGE 겔을 쿠마시 블루로 처리하였다. 좌측에서 우측으로: (1) ("출발"): 출발 조성물, 인간 혈장 유전자 VII; (2): 레인 2("용출물"): 용출 분획 중에 함유된 단백질; (3): Des-Gla FVII: FVII의 빈약하게 글리코실화된 형태; (4): FVII의 다른 빈약하게 동정된 형태.
도 14는 항-GLA 핵산 압타머가 고정화된 친화성 지지체로 생성된, 형질전환 인간 인자 VII를 정제하기 위한 방법을 수행할 때 얻어진 크로마토그래피를 보여준다. x-축을 따라: 시간; y-축을 따라: 254 나노미터에서 흡광도. (1): 비보유된 분획; (2) 용출 분획; (3): 재생 분획.
도 15는 GLA-도메인 단백질에 특이적인 핵산 압타머가 그라프트된 친화성 지지체 상에서 크로마토그래피를 겪은, 인간 혈장 인자 VII의 예비 정제된 분획 중에 함유된 단백질의 SDS-PAGE 전기 영동 겔의 이미지이다. SDS-PAGE 겔을 쿠마시 블루로 처리하였다. 좌측에서 우측으로: (1) 레인 1("출발"): 출발 조성물, 인간 혈장 유전자 VII; (2): 레인 2("NR"): 비보유된 단백질의 분획; (3): 레인 3("용출액"): 용출 분획 중에 함유된 단백질; (4): Des-Gla FVII, : FVII의 빈약하게 글리코실화된 형태.
도 16은 표면 플라즈몬 공명 기술에 따른 분석에서, 인간 혈장 인자 VII에 대해 지지체 상에 고정화된 Mapt-2 압타머의 결합 곡선을 보여준다. 곡선은 도 16의 하부부터 상부까지 각각 다양한 사용(running) 버퍼를 사용하는 동안 혈장 FVII 결합 동역학에 상응한다: T3: 버퍼 3, T2: 버퍼 2, T1: 버퍼 1, T4: 버퍼 4 및 T5: 버퍼 5. x-축을 따라: 초로 표현된 시간; y-축을 따라 인위적 공명 단위로 표현된 공명 시그날. 도의 하부부터 상부까지:증가하는 친화성의 상호 작용을 예시하는 곡선.
도 17은 표면 플라스몬 공명 기술에 따른 분석에서, 인간 혈장 인자 VII에 대한, 지지체에 고정화된 Mapt-2 압타머의 결합 곡선을 보여준다. 곡선은 버퍼 1(50 mM Tris, 50 mM NaCl, 10 mM CaCl₂, 4 mM MgCl₂, pH 7.5)의 사용 동안 혈장 FVII 결합 동역학의 파라미터를 결정하는 것을 가능하게 한다. x-축을 따라: 초로 표현된 시간; y-축을 따라 인위적 공명 단위로 표현된 공명 시그날.
도 18은 표면 플라즈몬 공명 기술에 따른 분석에서, 인간 혈장 인자 VII에 대한, 지지체에 고정화된 Mapt-2 압타머의 결합 곡선을 보여준다. 곡선은 버퍼 5(50 mM Tris, 10 mM CaCl₂, pH 7.5)의 사용 동안 혈장 FVII 결합 동역학에 상응한다. x-축을 따라: 초로 표현된 시간; y-축을 따라, 인위적 공명 단위로 표현된 공명 시그날.
도 19는 표면 플라즈몬 공명 기술에 따른 분석에서, 인간 혈장 인자 VII에 대한, 지지체에 고정화된 Mapt-2 압타머의 결합 곡선을 보여준다. 곡선은 다양한 세척 버퍼가 사용되는 동안, Mapt-2에 대한 혈장 FVII의 결합 저항성에 상응한다: (1): FVII의 주입; (2): 1M NaCl, 10　mM CaCl₂, 4　mM MgCl₂을 함유하는 50　mM 트리스 버퍼, pH　7.5, (3): 2M NaCl, 10　mM CaCl₂, 4　mM MgCl₂를 함유하는 50 mM 트리스 버퍼, pH　7.5, (4): 3M NaCl, 10　mM CaCl₂, 4　mM MgCl₂를 함유하는 50 mM 트리스 버퍼, pH　7.5 및 (5): 10　mM EDTA를 함유하는 50　mM 트리스 버퍼. x-축을 따라: 초로 표현된 시간; y-축을 따라: 인위적 공명 단위로 표현된 공명 시그날.
도 20은 표면 플라즈몬 공명 기술에 따른 분석에서, 인간 혈장 인자 VII에 대한, 지지체에 고정화된 Mapt-2 압타머의 결합 곡선을 보여준다. 곡선은 다양한 세척 버퍼가 사용된 때, Mapt-2에 대한 혈장 FVII의 결합 저항성에 상응한다: (1): FVII의 주입; (2): 10　mM CaCl₂, 4　mM MgCl₂,을 함유하는 50　mM 트리스 버퍼, pH　7.5, (3): 10　mM CaCl₂, 4　mM MgCl₂, 1M NaCl을 함유하는 50 mM 트리스 버퍼, pH　7.5, (4): 10　mM CaCl₂, 4　mM MgCl₂, 2M NaCl을 함유하는 50 mM 트리스 버퍼, pH　7.5 및 (5): 10　mM CaCl₂, 4　mM MgCl₂, 3M NaCl을 함유하는 50 mM 트리스 버퍼, pH　7.5 및 (6): 10　mM EDTA를 함유하는 50　mM 트리스 버퍼. x-축을 따라: 초로 표현된 시간; y-축을 따라: 인위적 공명 단위로 표현된 공명 시그날.
도 21은 표면 플라즈몬 공명 기술에 따른 분석에서, 인간 혈장 인자 VII에 대한, 지지체에 고정화된 Mapt-2 압타머의 결합 곡선을 보여준다. 곡선은 다양한 세척 버퍼가 사용된 때, Mapt-2에 대한 혈장 FVII의 결합 저항성에 상응한다: (1): FVII의 주입; (2): 10% 에탄올 버퍼 (3): 10　mM CaCl₂, 4　mM MgCl₂, 1M NaCl을 함유하는 50 mM 트리스 버퍼, pH　7.5, (4): 10　mM CaCl₂, 4　mM MgCl₂, 2M NaCl을 함유하는 50 mM 트리스 버퍼, pH　7.5 및 (5): 10　mM CaCl₂, 4　mM MgCl₂, 3M NaCl을 함유하는 50 mM 트리스 버퍼, pH　7.5 및 (6): 10　mM EDTA를 함유하는 50　mM 트리스 버퍼. x-축을 따라: 초로 표현된 시간; y-축을 따라: 인위적 공명 단위로 표현된 공명 시그날.
도 22는 표면 플라즈몬 공명 기술에 따른 분석에서, 재조합 인간 인자 VII에 대한, 지지체에 고정화된 Mapt-1 압타머의 결합 곡선을 보여준다. 곡선은 다양한 세척 버퍼가 사용된 때, Mapt-1에 대한 재조합 FIX의 결합 저항성에 상응한다: (1): 재조합 FVII의 주입; (2): 10　mM CaCl₂, 4　mM MgCl₂, 1M NaCl을 함유하는 50 mM 트리스 버퍼, pH　7.5, (3): 10　mM CaCl₂, 4　mM MgCl₂, 2M NaCl을 함유하는 50 mM 트리스 버퍼, pH　7.5 및 (4): 10　mM CaCl₂, 4　mM MgCl₂, 3M NaCl을 함유하는 50 mM 트리스 버퍼, pH　7.5 및 (5): 10　mM EDTA를 함유하는 50　mM 트리스 버퍼. x-축을 따라: 초로 표현된 시간; y-축을 따라: 인위적 공명 단위로 표현된 공명 시그날.
도 23은 표면 플라즈몬 공명 기술에 따른 분석에서, 인간 혈장 인자 VII에 대한, 지지체에 고정화된 Mapt-2 압타머의 결합 곡선을 보여준다. 곡선은 다음 세척 버퍼가 사용된 때, Mapt-1에 대한 재조합 FIX의 결합 저항성에 상응한다: 50 mM Tris, 10　mM CaCl₂, 50% 프로필렌 글리콜, pH　7.5. x-축을 따라: 초로 표현된 시간; y-축을 따라: 인위적 공명 단위로 표현된 공명 시그날. (1): 버퍼 5 중의 50% 프로필렌 글리콜의 주입.

본 출원인은 GLA-도메인 응고 단백질을 정제하기 위한 신규의 방법, 즉, GLA-도메인 응고 단백질 또는 다수의 GLA-도메인 응고 단백질을 포함하는 출발 샘플로부터 얻기에 적절한 신규의 방법을 설계하려고 노력하였다. 달리 말하면, 본 출원인은 GLA-도메인 응고 단백질에는 선택적이고, 특정 GLA-도메인 응고 단백질에는 비선택적인 풍부하게 하는 또는 정제하는 방법을 개발하고자 하였다.

이들 정제 방법을 개발하기 위하여, 본 출원인은 (i) GLA-도메인 응고 단백질에 특이적으로 결합하는 능력을 갖고, (ii) 특히 한 개의 GLA-도메인 응고 단백질에는 비특이적인 신규의 리간드를 단리하고 특성화하였다.

특성이 발명의 상세한 설명에서 나중에 기술되는 이들 신규의 리간드는 GLA-도메인 응고 단백질에 결합되고, 특정 GLA-도메인 응고 단백질에 특이적이 아닌, 또한 "핵산 압타머"라 불리는 핵산으로 구성된다.

본 발명은 GLA-도메인 응고 단백질을 정제하기 위한 방법을 제공하며, 여기에서, 핵산 형의 이들 신규의 리간드의 결합 성질이 이용된다.

본 출원인은 또한 정제 방법에서 상기 핵산 압타머를 이용할 목적으로, GLA-도메인 응고 단백질에 특이적으로 결합하는 핵산 압타머를 얻기 위한 방법을 개발하고자 노력하였다.

본 발명에 따르면, GLA-도메인 응고 단백질에 특이적으로 결합하는 핵산 압타머(nucleic aptamers)가 얻어졌다. 보다 특히, 본 출원인은 다양한 GLA-도메인 응고 단백질, 즉 GLA 도메인의 글루타민 잔기 특성이 감마-카르복실화일 수 있는 GLA 도메인을 갖는 다양한 응고 단백질에 전적으로 결합하는 핵산 압타머를 얻고 특성화하였다.

실시예들에 나타난 바와 같이, GLA-도메인 응고 단백질에 특이적인 본 발명의 핵산 압타머는 GLA 도메인인 보존된 공동 특성을 갖는 다양한 비타민 K-의존성 응고 단백질에 구별 없이 결합할 수 있다.

특히, GLA-도메인 응고 단백질에 특이적인 압타머는 다수의 단백질, 예를 들어 인자 IX, 인자 VII 및 인자 X와 결합할 수 있다는 것이 실시예들에서 나타났다.

특이적으로 및 개별적으로 GLA-도메인 응고 단백질, 예를 들어 인자 II, 인자 VII, 인자 IX 또는 인자 X를 인식하는 핵산 압타머는 선행 기술에서 이미 알려져 있고, 트롬빈에 결합하는 압타머(Zhao et al. 2008, Anal Chem, Vol 80(19): 7586-7593), 인자 IX/IXa에 결합하는 압타머 (Subash et al., 2006, Thromb Haemost, Vol. 95: 767-771; Howard et al., 2007, Atherioscl Thromb Vasc Biol, Vol. 27: 722-727; PCT 출원 No. WO　2002/096926; United States 특허 No. US　7　312　325), 인자 X/Xa에 결합하는 압타머 (PCT 출원 No. WO 2002/096926; United States 특허 No. US　7　312　325) 또는 인간 인자 VII/VIIa에 결합하는 그 밖의 압타머 (Rusconi et al., 2000, Thromb Haemost, Vol. 84(5): 841-848; Layzer et al., 2007, Spring, Vol. 17: 1-11)를 포함한다.

상기 압타머의 어느 것도 그것이 결합하는 표적 단백질을 정제하기 위한 그의 용도에 대해 기술하고 있지 않다는 것이 명백하다. 더구나, 상기 압타머는 또 다른 GLA-도메인 응고 단백질과 가교 없이 단일 GLA-도메인 응고 단백질에 전적으로 결합한다.

소정의 GLA-도메인 응고 단백질에 특이하고, 그리고 또하나의 GLA-도메인 응고 단백질를 포함하여 또 하나의 단백질에 결합하는 능력을 갖지않는 이러한 압타머 형이 예를 들어 라이저 등(Layzer et al.)에 의해 문헌[2007, Oligonucleotides, Vol. 17: 1-11)에 기술되어 있다.

그러나, 출원인이 알기로는 결합 특이성이 단백질의 GLA-도메인이고, 다수의 특징적인 GLA-도메인 응고 단백질에 결합하는 능력을 갖는 핵산 압타머가 선행 기술에서는 기술되지 않았다.

GLA-도메인 응고 단백질에 특이적으로 결합하는 핵산 압타머의 이용성은, 특히 약제의 활성 성분으로서 사용될 수 있는 정제된 최종 생성물을 얻기 위한 목적으로, 이들 단백질을 정제하는 방법을 개발하는 것을 가능하게 만들었다.

본 발명은

a) (i) 핵산 압타머와 (ii) GLA-도메인 응고 단백질(들) 사이의 복합체를 형성하기 위하여, 하나 이상의 GLA-도메인 응고 단백질을 함유하는 샘플을 다수의 GLA-도메인 응고 단백질에 특이적으로 결합하는 핵산 압타머(nucleic aptamers)가 고정화된 친화성 지지체와 접촉하게 하는 단계,

c) 상기 GLA-도메인 응고 단백질(들)을 정제된 형태로 회수하는 단계를 포함하는, GLA-도메인 응고 단백질을 정제하기 위한 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한

용어 "GLA-도메인 응고 단백질"은 단백질 합성 동안 감마-카르복실화되는 다수의 글루타민 잔기를 포함하는, GLA 도메인이라 언급되는 영역을 포함하는 임의의 응고 단백질을 포함한다. GLA-도메인 응고 단백질은 N-말단 쪽에 GLA 도메인을 GLA 도메인을 갖는 응고 단백질을 포함하고, 상기 GLA 도메인은 일반적으로 합성 동안 자연적으로 가수분해되는 프로펩타이드의 하류, 즉 C-말단 상에 위치한다. GLA-도메인 응고 단백질은, GLA 도메인이, 세포에서 단백질 합성과정 동안 적어도 일부가 정상적으로 카르복실화되어 GLA 잔기를 제공하는, 9 내지 12개의 글루타민 잔기를 포함하는 대략 45개 아미노산의 영역으로 구성되는, 응고 단백질을 포함한다. 비타민 K-의존성 단백질로 구성되는 GLA-도메인 응고 인자는 프로트롬빈(인자 II), 인자 VII, 인자 IX, 인자 X, 단백질 C 및 단백질 S를 포함한다. GLA-도메인 응고 단백질은 천연 공급원, 예를 들어, 혈장으로부터 기원하는 비재조합 단백질, 및 또한 상기 응고 단백질을 인코딩하는 DNA로 트랜스펙션(transfected) 또는 형질변환된(transformed) 세포에 의해 시험관 내에서 생산될 수 있는 또는 상기 응고 단백질을 인코딩하는 전이유전자가 도입된 동물에 의해 생체 내에서 생산될 수 있는 재조합 단백질을 포함한다. 유전자 이식 동물에 의해 생산되는 GLA-도메인 응고 단백질은 또한 본 상세한 설명에서 "유전자 이식"이라고 불릴 수도 있다.

본 발명에 따르면, 용어 "핵산 압타머(nucleic aptamer)"는 다수의 GLA-도메인 단백질에 특이적으로 결합하는 핵산을 포함하는, GLA-도메인 응고 단백질에 특이적으로 결합하는 단일-가닥 핵산을 의미하고자 하며, 이는 또한 본 상세한 설명에서 "항-GLA 압타머"라고 언급될 수 있다. 그러므로, 본 발명의 압타머는 각각의 핵산 및 단백질 파트너가 접촉하게 하는 선행 단계 후에 다양한 소정의 GLA-도메인 응고 단백질과 복합체를 형성하는 것이 가능한 것을 포함한다.

본 발명에 따른 항-GLA 압타머와 GLA-도메인 응고 단백질 사이에 형성된 복합체의 검출은 본 분야에 숙련된 자에 의해 예를 들어 실시예들에서 예시되는 바와 같이 Biacore® 기술을 포함하는 표면 플라즈몬 공명 검출 기술을 수행하여 쉽게 실시될 수 있다. 본 분야에 숙련된 자는 또한 본 발명에 따른 항-GLA 압타머와 GLA-도메인 응고 단백질 사이의 복합체의 형성을 본 분야에 숙련된 자에 의해 알려진 바와같이 ELISA 형의 통상적인 기술에 의해 쉽게 검출할 수 있다.

실시예들에서, 본 발명에 따른 항-GLA 압타머는 다수의 특징적인 GLA-도메인응고 단백질, 특히 다수의 인간 GLA-도메인 인간 응고 단백질에 각각 결합할 수 있다는 것이 나타난다. 특히, 본 발명에 따른 소정의 항-GLA 압타머는 인간 인자 VII, 인간 인자 IX 및 인간 인자 X에 각각 결합할 수 있다는 것이 나타난다.

특정 실시 형태에서, 상기 정제 방법은 GLA-도메인 응고 단백질이 비타민 K-의존성 응고 인자들로부터 선택된다는 것을 특징으로 한다.

특정 실시 형태에서, 상기 정제 방법은 GLA-도메인 응고 단백질이 인자 II, 인자 VII, 인자 IX, 인자 X, 단백질 C 및 단백질 S로부터 선택된다는 것이 특징이다.

특정 실시 형태에서, 상기 정제 방법은 인자 II, 인자 VII, 인자 IX, 인자 X, 단백질 C 및 단백질 S로부터 선택된 적어도 두 개의 GLA-도메인 응고 단백질을 동시에 정제하는데에 적합하다는 것이다.

특정 실시 형태에서, 상기 정제 방법은 인자 II, 인자 VII, 인자 IX, 인자 X, 단백질 C 및 단백질 S로부터 선택된 적어도 세 개의 GLA-도메인 응고 단백질을 동시에 정제하는데에 적합하다는 것이다.

특정 실시 형태에서, 상기 정제 방법은 인자 II, 인자 VII, 인자 IX, 인자 X, 단백질 C 및 단백질 S를 동시에 정제하는데에 적합하다는 것이다.

특정 실시 형태에서, 상기 정제 방법은 인자 II, 인자 VII, 인자 IX, 및 인자 X 단백질을 동시에 정제하는데에 적합하다는 것이다.

특정 실시 형태에서, 상기 정제 방법은 인자 VII, 인자 IX, 및 인자 X를 동시에 정제하는데에 적합하다는 것이다.

하나 이상의 GLA-도메인 응고 단백질의 동시적인 정제는 특히 정제 방법을 수행하기 위하여 사용되는 출발 샘플의 타입에 의존한다. 특히, 방법의 종료시 정제된 형태로 얻어지는 GLA-도메인 응고 단백질의 수 및 식별(identity)은 논리적으로 출발 샘플에 초기에 존재하는 GLA-도메인 응고 단백질의 수 및 식별에 의해 제한된다.

일반적으로, 항-GLA 압타머는 DNA(데옥시리보핵산) 또는 RNA(리보핵산) 분자로 구성될 수 있고, GLA-도메인 단백질에 결합하는 능력을 가지며, 이는 어느 GLA 도메인을 포함하지 않는 단백질에 결합하는 능력보다 크다.

항-GLA 압타머는 본 발명에 대한 필요에 의해 특별히 개발된 방법에 의해 얻어질 수 있고, 이는 후에 본 상세한 설명에서 기술된다.

특정 실시 형태에서, 본 발명에 따른 항-GLA 압타머는 다양한 공통적 구조 특성을 가지며, 5' 말단으로부터 3' 말단으로, 연속적으로 (i) 길이가 대략 20개 뉴클레오타이드인 비가변성 특정 뉴클레오타이드 서열, 이어지는 (ii) 길이가 대략 40 내지 50개 뉴클레오타이드인 가변성 뉴클레오타이드 서열, 이어지는 (iii) 길이가 대략 20개 뉴클레오타이드인 비가변성 특정 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 가변성 뉴클레오타이드 서열(ii)은 서로에 대해 매우 강력한 뉴클레오타이드 서열 동일성을 가질 수 있다는 것이 명시된다.

본 상세한 설명에서 특정화된 항-GLA 압타머를 선택하기 위한 방법은 다수의 GLA-도메인 응고 단백질, 특히 인간 GLA-도메인 응고 단백질을 인식할 수 있는 항-GLA 압타머의 계를 얻는 것을 가능하게 하는 형이다.

구조적 측면으로 볼 때, 본 발명에 따라 얻어질 수 있고, GLA-도메인 응고 단백질에 특이적으로 결합하는 핵산 또는 핵산 압타머의 계의 각 요소는 하기 식(I)의 핵산과 적어도 40% 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드의 적어도 15개의 연속적 뉴클레오타이드를 포함한다:

5'-[서열 번호 1]x -[서열 번호 X]-[서열 번호 2]y-3' (I)

상기 식에서,

- "서열 번호 x"는 서열 번호 3의 염기서열의 핵산으로 구성되고,

- "x"는 0 또는 1의 정수이며,

- "y"는 0 또는 1의 정수이다.

특정 실시 형태에서, 서열 번호 x의 염기서열의 산은 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50 개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는다.

다른 실시 형태에서, 서열 번호 x의 산은 43, 44, 45, 46, 47, 48 또는 49 개 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다.

특정의 다른 바람직한 실시 형태에서, 서열 번호 x의 염기서열의 핵산은 43, 44 또는 45개 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다.

이미 앞서 언급된 바와 같이, 식(I)의 핵산은 길이가 적어도 15개 뉴클레오타이드이다.

특정 실시 형태에서, 식(I)의 핵산은 길이가 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80 또는 81개의 뉴클레오타이드이고, 이에 의해 각 특정화된 길이를 정확히 갖는 핵산을 포함한다.

정수 "x"가 0이고, 정수 "y"가 1일 때, 본 발명의 핵산 압타머는 하기 식(I-1)의 핵산과 적어도 40%의 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드의 적어도 15개의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산을 포함한다:

5'-[서열 번호 X]-[서열 번호 2]-3' (I-1).

정수 "x"가 1이고, 정수 "y"가 0 일 때, 본 발명의 핵산 압타머는 하기 식(I-2)의 핵산과 적어도 40%의 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드의 적어도 15개의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산을 포함한다:

5'-[서열 번호 1]-[서열 번호 X]-3' (I-2).

정수 "x"가 0이고, 정수 "y"가 0 일 때, 본 발명의 핵산 압타머는 하기 식(I-3)의 핵산과 적어도 40%의 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드의 적어도 15개의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산을 포함한다:

5'-[서열 번호 X]-3' (I-3).

그러므로, 상기 핵산 압타머는 서열 번호 3의 핵산과 적어도 40%의 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드의 적어도 15개의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산을 포함한다.

일반적으로, 제 2 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산과 적어도 40%의 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 제 1 폴리뉴클레오타이드는 상기 제 2 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산과 적어도 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 100%의 뉴클레오타이드 동일성을 갖는다.

서열 번호 X를 포함하는 본 발명의 핵산의 특정한 실시 형태에서, 상기 서열 번호 X는 서열 번호 3, 6 내지 35, 37 및 38로부터 선택된 서열과 적어도 40%의 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 서열의 적어도 15 개의 연속적인 뉴클레오타이드를 갖는 핵산으로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.

서열 번호 X를 포함하는 본 발명의 핵산의 특정한 실시 형태에서, 상기 서열 번호 X는 서열 번호 3, 6 내지 35, 37 및 38로부터 선택된 염기서열과 적어도 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 100%의 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 핵산으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

본 발명의 핵산 압타머의 특정한 실시 형태에서, 상기 압타머는 서열 번호 3, 4 및 6 내지 39로부터 선택된 서열과 적어도 40%의 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 서열의 적어도 15개의 연속적인 뉴클레오타이드의 서열을 포함하는 핵산으로부터 선택된다.

본 발명의 핵산 압타머의 특정한 실시 형태에서, 상기 압타머는 서열 번호 3, 4 및 6 내지 39로부터 선택된 염기서열의 적어도 15개의 연속적인 뉴클레오타이드의 염기서열을 포함하는 핵산으로부터 선택된다.

본 발명의 핵산 압타머의 특정한 실시 형태에서, 상기 압타머는 서열 번호 3, 4 및 6 내지 39로부터 선택된 염기서열과 적어도 40%의 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 염기서열을 포함하는 핵산으로부터 선택된다.

본 발명의 핵산 압타머의 특정한 실시 형태에서, 상기 압타머는 서열 번호 3, 4 및 6 내지 39로부터 선택된 염기서열을 포함하는 핵산으로부터 선택된다.

본 발명의 핵산 압타머의 특정한 실시 형태에서, 상기 압타머는 서열 번호 3, 4 및 6 내지 39로부터 선택된 염기서열로 구성되는 핵산으로부터 선택된다.

상기 언급된 바로부터, 본 발명은 상기 정의된 일련의 식(I)의 적어도 15개의 연속적인 뉴클레오타이드를 갖는 단일 가닥 핵산의 계를 포함한다는 결과가 나온다.

본 발명에 있어서, 두 개의 핵산 사이의 "동일성 퍼센트"는 비교 창(comparison window)을 통해 두 개의 최적으로 배열된 서열들을 비교하여 결정된다.

비교 창에서의 뉴클레오타이드 서열의 부분은 두 개 서열 사이의 최적의 배열을 얻기 위하여 참조 서열(첨가 또는 결실을 포함하지 않는)과 비교하여 첨가 또는 결실(예를 들어 갭)을 포함할 수 있다.

동일성 퍼센트는 동일한 핵산 염기가 비교되는 두 개 서열에 대해 관찰되는 위치들의 수를 결정하고, 두 개 핵산 염기 사이에서 동일성이 있는 위치들의 수를 비교 창에서의 위치들의 총 수로 나누며, 서로에 대한 두 개 서열의 뉴클레오타이드 동일성 퍼센트를 얻기 위하여 결과에 100을 곱하여 계산한다.

비교를 위한 서열들의 최적의 배열은 공지된 알고리즘을 사용하는 컴퓨터에의해 수행될 수 있다.

완전히 바람직하게는, 서열 동일성 퍼센트는 CLUSTAL W 소프트웨어를 사용하여 결정하고, 파라미터는 다음과 같다: (1) CPU MODE = ClustalW mp; (2) ALIGNMENT = "full" (3) OUTPUT FORMAT = "aln w/numbers" (4) OUTPUT ORDER = "배열된" (5) COLOR ALIGNMENT = "없음" (6) KTUP (word size) = "자동 선택" (7) WINDOW LENGTH = "자동 선택" (8) SCORE TYPE = '퍼센트" (9) TOPDIAG = '자동 선택" (10) PAIRGAP = "자동 선택" (11) PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE = '없음" (12) MATRIX = "자동 선택" (13) GAP OPEN = "자동 선택" (14) END GAPS = "자동 선택" (15) GAP EXTENSION = "자동 선택" (16) GAP DISTANCES = "자동 선택" (17) TREE TYPE = "분기도" 및 (18) TREE GRAPH DISTANCES = "hide".

예시로서 및 본 발명의 핵산 압타머의 특정한 실시 형태 경우, 본 분야에 숙련된 자는 식(I)의 핵산 압타머의 상기 구조적 정의에 기초하여, 예를들어 메모리가 적절한 세트의 지시로 적재된 디지털 컴퓨터에 의해 모든 가능한 서열 번호 X를 자동적으로 쉽게 생성할 수 있을 것이다. 적절한 경우, 이어서 본 분야에 숙련된 자는 상기 디지털 컴퓨터에 의해 각각 (i) 공간적 구조 모델이 서열 번호 4를 갖는 항-GLA 핵산 압타머의 것과 유사하거나 동일한 서열, 및 (ii) 핵산 압타머의 구조가 서열 번호 4를 갖는 항-GLA 핵산 압타머의 것과 다른 서열을 자동적으로 결정할 수 있을 것이다.

서열 번호 4를 갖는 항-GLA 핵산 압타머의 것과 유사하거나 동일한 공간 구조를 갖는 핵산 압타머는 그에 유사하거나 동일한 일련의 루프 및 스템(stems)을 포함하는 것을 포함한다.

식(I)의 핵산의 2차 공간 구조를 결정하기 위하여, 본 분야에 숙련된 자는,뉴클레오타이드 서열의 기술에 기초해서, 주커(Zuker)(2003, Nucleic Acids Research, Vol. 231(13): 3406-3413)에 의해 기술된, 그리고 또한 다음 웹 주소:http://mfold.bioinfo.rpi.edu/에서 사용될 수 있는 mFold® 컴퓨터 프로그램을 사용하는 모델링을 만들 수 있다.

바람직하게는, mFold 컴퓨터 프로그램은 다음 파라미터에 따라 사용된다: (i) 선형 서열을 갖는 DNA, (ii) 접힘 온도: 25℃, (iii) 이온 조건: [Na⁺]: 150 mM, [Mg⁺⁺]: 4 mM, (iv) 교정 타입: 올리고머, (v) 부차 최적수 퍼센트:2, (vi) 계산된 접힘 수의 상한: 50, (vii) 두 염기 쌍 사이의 최대 거리: 제한 없음, 및 (viii) 다른 파라미터에 대해서는 자동 선택 값들의 사용.

이어서, 본 분야에 숙련된 자는 (i) 상기 압타머 구조의 모델과 (ii) 막 작성된 식(I)의 압타머 구조의 모델 사이의 비교 단계를 수행하여 구조적 모델이 서열 번호 4를 갖는 항-GLA 압타머의 것과 동일하거나 유사하다면 막 작성된 식(I)의 압타머를 적극적으로 선택한다.

어떤 경우든, 식(I)의 새로이 작성된 압타머의 적극적인 선택을 확인하기 위하여, 본 분야에 숙련된 자는 예를 들어 본 상세한 설명에서, 특히 실시예에서 특정화된 방법의 하나에 따라 인간 인자 VII/VIIa 및 인간 인자 IX/Ixa 및 인간 인자 X/Xa로부터 선택된 GLA-도메인 응고 단백질에의 결합 성질을 입증할 수 있을 것이다.

본 발명의 항-GLA 핵산 압타머의 특정한 바람직한 실시 형태에서, 상기 핵산 압타머는 식(I)의 핵산과 적어도 80%의 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드의 적어도 15개 연속적인 뉴클레오타이드를 포함하고, 이에 의해 식(I)의 상기 핵산과 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 100%의 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드의 15개 연속적 뉴클레오타이드를 포함하는 압타머를 포함한다.

본 발명에 따른 핵산 압타머는 서열 번호 4의 핵산 압타머를 포함한다. 서열 서열 번호 4의 압타머는 서열 번호 X가 서열 번호 3으로 구성된 식(I)의 압타머로 구성된다는 것이 상기된다(recalled). 또한, 서열 번호 1 및 서열 번호 2가 결여된 식(I-3)의 압타머로 구성된다는 것이 상기된다. 서열 번호 3의 압타머는 서열 번호 1 및 서열 번호 2가 결여된 식(I-3)의 압타머로 구성된다.

본 출원인은 서열 번호 3의 압타머가 서열 번호 4의 압타머의 것과 유사한 활성 GLA-도메인 응고 단백질에 선택적으로 결합하는 능력을 갖는다. 이들 결과는 서열 번호 4의 압타머의 특이적 결합 성질에서 서열 번호 3의 핵산의 존재의 본질적 성질을 보여준다. 일반적으로, 식(I)의 압타머에서 서열 번호 X의 핵산의 본질적 성질을 보여주고, 서열 번호 X의 핵산은 식(I)의 압타머에 활성 GLA-도메인 응고 단백질에 선택적으로 결합하는 능력을 부여한다.

본 발명의 핵산 압타머는 그러므로 또한 서열 번호 3의 압타머를 포함한다.

실시예들에서, 서열 번호 6 내지 35의 압타머를 포함하는 매우 다양한 압타머가 적절한 경우 뚜렷한 친화성 수준을 가지며, GLA-도메인 응고 단백질에 선택적으로 결합하는 능력을 갖는다. 예시로서, 서열 번호 6 내지 35의 압타머 중에서, 인간 인자 IX에 가장 큰 결합 능력을 갖는 압타머는 "Mapt-1.2-CS"로 또한 표시될 수 있는 서열 번호 35의 압타머이다.

상기 Map-1.2-CS 압타머보다 큰 GLA-도메인 응고 단백질에 결합하는 능력을 갖는 압타머가 또한 실시예들에서 확인되었다. 이러한 압타머의 예는 또한 "Mapt-1.2-CSO"로 표시될 수 있는 서열 번호 36의 압타머이다.

서열 번호 36의 Mapt-1.2-CSO 압타머는 하기 식(I)의, 길이가 62개 뉴클레오타이드인 핵산과 적어도 40% 뉴클레오타이드 동일성을 갖고, 아래 식(I)의 핵산의 위치 10의 뉴클레오타이드로부터 위치 49의 뉴클레오타이드로 가는 핵산으로 구성되는 폴리뉴클레오타이드의 적어도 15개 연속적 뉴클레오타이드를 포함하는 압타머이다:

5'-[서열 번호 1]-[서열 번호 35]-3'.

실시예들에서 서열 번호 37 내지 39의 핵산의 각각이 GLA-도메인 응고 단백질에 결합하는 능력을 갖는다는 것이 또한 나타난다. 서열 번호 39의 압타머는 또한 "Mapt-2" 라고 표시될 수 있다. 서열 번호 37의 압타머는 또한 "Mapt-2-CS"로 표시될 수 있다.서열 번호 38은 또한 "Mapt-2.2.-CS라고 표시될 수 있다. Mapt-2-CS 압타머의 서열은 Mapt-2 압타머의 서열에 포함된다고 특정된다: 이는 Mapt-2 압타머의 "코어(core) 서열" 서열 번호 X이다.

실시예들에서 본 발명의 항-GLA 압타머는 다른 단백질의 샘플로부터 GLA-도메인 응고 단백질을 분리하는데 유용한, 친화성 크로마토그래피 지지체를 제조하는데에 성공적으로 사용될 수 있다는 것이 나타난다.

특히, 친화성 크로마토그래피 지지체를 제조하기 위하여, 본 발명의 항-GLA 핵산 압타머는 본 상세한 설명에서 또한 "화합물"이라고 언급되는 화학적 구조에 바람직하게는 포함되고, 이 화학적 구조는 특히 스페이서 수단 및, 적절한 경우 고체 지지체 상에 고정화하기 위한 수단을 포함한다.

특정 실시 형태에서, 핵산 압타머(nucleic aptamer)는 하기 식(II)의 화합물의 구조에 포함된다:

[IMM]_x-[SPAC]_y-[APT] (II)

여기에서,

- [IMM]은 지지체 상에 고정화하기 위한 화합물을 의미하고,

- [SPAC]는 스페이서 쇄를 의미하며,

- [APT]는 본 상세한 설명에서 정의된 바와 같은 항-GLA 압타머를 의미하고,

- x는 0 또는 1의 정수이고,

- y는 0 또는 1의 정수이다.

식(II)의 화합물의 특정한 실시 형태에서, [APT]는 서열이 서열 번호 3, 4 및 6 내지 39로부터 선택된 데옥시리보핵산으로 구성된다.

식(II)의 화합물에서 [SPAC]로 표현된 "스페이서 쇄"는 임의의 알려진 형일 수 있다. 상기 스페이서 쇄의 기능은 상기 화합물이 고정화된 고체 지지체의 표면으로부터 핵산을 물리적으로 떼어놓고, 상기 화합물이 고정화될 수 있는 고체 지지체의 표면에 대해 핵산의 상대적 이동성을 허용하는 것이다. 스페이서 쇄는 고체 지지체와 핵산 사이의 심한 근접성에 기인하여 입체 장애가 상기 핵산과 그오 접촉할 수 있는 응고 단백질 분자 사이의 결합 사건에 손상을 주는 것을 제한 및 방지한다.

식(II)의 화합물에서, 스페이서 쇄는 핵산 압타머의 5' 말단 또는 3' 말단에 바람직하게는 연결된다.

유리하게는, 스페이서 쇄는 압타머의 한 말단에 그리고 고체 지지체에 모두 연결된다. 스페이서를 갖는 이 구조는 고체 지지체 상에서 압타머를 직접적으로 움직이지 않는 이 점을 갖는다. 바람직하게는, 스페이소 쇄는 비특이적 올리고-뉴클레오타이드 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 또 다른 친수성 탄화수소-계 쇄이다. 스페이서 쇄가 비특이적 올리고뉴클레오타이드로 구성될 때, 상기 올리고뉴클레오타이드는 유리하게는 길이가 적어도 5개 뉴클레오타이드, 바람직하게는 5 내지15개 뉴클레오타이드를 포함한다.

스페이서 쇄가 폴리에틸렌 글리콜로 구성되는 식(II)의 화합물의 실시 형태에서, 상기 스페이서 쇄는 예를 들어 Sigma Aldrich 회사에 의해 판매되는 PEG (C18) 형 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.

실시예들에서 예시된 바와 같이, GLA-도메인 응고 단백질은 스페이서 쇄[SPAC]를 포함하는 식(II)의 화합물 및 스페이서 쇄[SPAC]를 갖지 않는 식(II)의 화합물 모두와 함께 수행된다.

스페이서 쇄 상에 압타머를 고정화시키기 위하여, 핵산은 다양한 화학적 그룹, 예를 들어 이 핵산을 공유 결합적으로 고정화시키는 것을 가능하게 하는 그룹, 예를 들어 티올, 아민 또는 고체 지지체 상에 존재하는 화학적 그룹과 반응할 수 있는 어떤 다른 그룹으로 화학적으로 개질시킬 수 있다.

식(II)의 화합물에서, 화합물 [IMM]은 (i) 고체 지지체 물질과 하나 이상의 공유 결합(들)을 형성할 수 있는 화합물 및 (ii) 수소 결합, 정전기 힘 또는 반델바우스 힘을 포함하는 약한 비공유결합에 의해 고체 지지체 상에 특이적으로 결합할 수 있는 화합물로부터 선택된 화합물로 구성된다.

특정한 경우에, 화합물 [IMM]은 이것이 공유 결합을 통해 서로에 연결된 원자들의 쇄로 구성되어 있기 때문에 스페이서 쇄처럼 행동할 수 있다. 그러나, 정의로, 화합물 [IMM]은 본 발명에 따라 식(II)의 화합물에서 [SPAC} 쇄를 결코 의미하지 않는다. 달리 말하면, 식(II)의 화합물에서, [SPAC] 쇄는 존재할 때 공유 결합을 통해서나 또는 약한 비공유 결합을 통해서이든지 크로마토그래피 지지체에 직접적으로 연결될 수 없다.

화합물 [IMM]의 제 1 타입은 이작용성 연결제, 예를 들어 글루타르알데하이드, SIAB 또는 그 밖에 SMCC를 포함한다.

지.티. 헤르만슨(G.T. Hermanson)에 의해 문헌[1996, Bioconjugates, San Die해:Academic Press, pp 239-242]에 기술된 SIAB 화합물은 하기 식(A)의 화합물이다:

SIAB 화합물은 두 개의 반응성 그룹, 각각 요오도아세테이트 그룹 및 설포-NHS 에스테르 그룹을 포함하고, 이들 그룹은 각각 아미노 및 설피드릴 그룹과 반응한다.

엠.케이. 사모주크 등(M.K. Samozuku et al.)에 의해 문헌[1989, Antibody, Immunoconjugates Radiopharm., 2(1):37-46]에 기술된 SMCC 화합물은 하기 식(B)의 화합물이다:

SMCC 화합물은 두 개의 반응성 그룹, 각각 설포-NHS 에스테르 그룹 및 말레이미드 그룹을 포함하고, 이들은 각각 아미노 그룹 및 설피드릴 그룹과 반응한다.

화합물 [IMM]의 제 2 타입은 고체 지지체 상에 존재하는 아비딘 또는 스트렙타비딘 분자에 특이적으로 비공유결합 방법으로 결합할 수 있는 비오틴을 포함한다.

스페이서를 통해 고체 지지체 상에 일단 고정화되면, 항-GLA 압타머는 유리하게는 그의 유리 단부(스페이서에 결합되지 않은)에서 제한됨이 없이 화학적으로 개질된 뉴클레오타이드(예를 들어 2'-O-메틸- 또는 2- 플루오로-피리미딘, 2'-리보퓨린, 포스포라미티드), 역전된(inverted) 뉴클레오타이드 또는 화학적 그룹(PEG, 다양이온(polycations), 콜레스테롤)에 의해 개질된다. 이 개질은 항-GLA 압타머를 효소적 분해에 대해 보호하는 것을 가능하게 한다.

고체 지지체는 아가로즈 또는 셀룰로스로부터 유래된 겔 또는 아크릴아마이드, 메타크릴레이트 또는 폴리스티렌 유도체와 같은 합성 겔로 구성된 친화성 크로마토그래피, 칩, 예를 들어 표면 플라즈몬 공명에 적절한 칩, 폴리아미드, 폴리아크릴로니트릴 또는 폴리에스테르 막과 같은 막, 또는 자성 또는 상자성 비드일 수 있다.

본 발명은 또한

(i) 식(I)의 핵산, 및 식(II)의 화합물로부터 선택된 핵산 압타머와

(ii) GLA-도메인 응고 단백질 사이의 복합체에 관한 것이다.

본 발명의 대상은 또한 정확하게 감마-카르복실화된 GLA 도메인을 갖는 응고 단백질을 포함하는 GLA-도메인 응고 단백질을 고정화하기 위한 지지체로서, 각각 핵산 압타머로 구성되거나, 각각 이를 포함하는 다수의 분자가 그라프트된 고체 지지체 물질을 포함하고, 상기 분자는 (a) 식(I)의 핵산, 및 (b) 식(II)의 화합물로 부터 선택된 것을 특징으로 하는 GLA-도메인 응고 단백질을 고정화하기 위한 지지체이다.

상기 지지체는 인간 GLA-도메인 응고 단백질을 포함하는, GLA-도메인 응고 단백질을 고정화시키고자 하는 모든 적용에서 실제적으로 사용될 수 있고, 이 적용은 상기 GLA-도메인 응고 단백질을 정제하기 위한 목적을 위한 적용 및 상기 GLA-도메인 응고 단백질을 검출할 목적의 적용을 포함한다.

GLA-도메인 응고 단백질에 특이적으로 결합하는 본 발명의 핵산 압타머가 고정화된 지지체의 제조는 실시예들에서 널리 예시되어 있고, 여기에서, 본 발명의 압타머는 특히 GLA-도메인 응고 단백질, 예를 들어 샘플 중 인간 GLA-도메인 응고 단백질을 정제하거나 검출하기 위하여 사용될 수 있는 포획 시약(capture agents)으로서 사용된다.

본 발명은 그러므로 또한 단계 동안 적어도 하나의 GLA-도메인 응고 단백질을 포함하는 샘플을 식(I)의 핵산 및, 식(II)의 화합물로부터 선택된 물질이 미리 고정화된 고체 지지체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 지지체 상에 GLA-도메인 응고 단백질을 고정화시키기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 추구하는 기술 대상에 의존하여, 식(I)의 핵산 분자와 복합체화된, 고정화된 GLA-도메인 응고 단백질 분자(들)을 회수하는 추가의 단계를 포함할 수 있다. GLA-도메인 응고 단백질, 또는 GLA-도메인 단백질을 회수하는 추가의 단계는 바람직하게는 GLA-도메인 응고 단백질(들)과 식(I)의 핵산과의 복합체를 금속-양이온 시약, 예를 들어 EDTA와 접촉시키는 단계로 구성된다.

관심의 대상인 압타머가 고정화된 고체 지지체를 사용하는 친화성 크로마토그래피 단백질 정제 방법을 수행하기 위하여, 본 분야에 숙련된 자는 로미그 등(Romig et al.)에 의해 문헌[1999, J Chromatogr B Biomed Sci Apl, Vol. 731(2): 275-284]에 기술된 작업을 참조할 수 있다.

또한, 본 발명의 핵산 압타머를 포함하는 친화성 지지체의 생산 및 상기 친화성 지지체로 인간 인자 IX를 정제하는 방법이 실시예들에서 예시되어 있다.

일반적으로, 본 발명의 압타머가 고정화될 수 있는 고체 지지체는 필터 지지체용으로 흔히 발견되는 구조 및 조성을 갖는 지지체, 칩용 실리콘 지지체, 막 등의 어떤 타입을 포함한다. 고체 지지체는 특히 수지, 친화성 크로마토그래피 컬럼용 수지, 중합체 비드, 자기 비드 등을 포함한다. 고체 지지체는 또한 특히 유리-계 또는 금속-계 물질, 예를 들어 스틸(steel), 금, 은, 알루미늄, 구리, 실리콘, 유리 또는 세라믹을 포함한다. 고체 지지체는 또한 특히 중합체 물질, 예를 들어 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아미드, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 및 이들의 조합물을 포함한다.

고체 지지체는 부착, 결합, 복합체 형서, 고정화 또는 압타머와의 상호작용을 용이하게 하는 물질로 코팅될 수 있다.

특정 실시 형태에서, 고체 지지체는 표면이 금 층, 카르복시메틸화에 의한 처리를 받은 층, 덱스트란, 콜라겐, 아비딘, 스트렙타비딘 등의 층으로 코팅된다.

이 방법에서, 본 발명에 따른 압타머는 상기 기술된 경우 부착 코팅에 의해, 또는 공유결합 생성과 함께 화학 반응에 의해, 또는 수소 결합, 정전기 힘, 반데르발스 힘 등과 같은 비공유성 결합을 통한 결합에 의해 고체 지지체에 고정화될 수 있다.

실시예들은 본 발명의 압타머가 비공유 결합을 통해 고정화된 고체 지지체의 실시 형태를 기술하고 있다.

실시예들에서, 스트렙타비딘 분자 층으로 코팅된 유리 슬라이드로 구성된 고체 지지체와, 비공유 비오틴/스트렙타비딘 결합에 의해 지지체에 고정화된, 비오틴분자에 콘쥬게이트된 본 발명의 압타머가 특히 기술된다.

실시예들에서, 스트렙타비딘 분자 층으로 코팅된 폴리스티렌 물질로 구성된 고체 지지체와, 비공유 비오틴/스트렙타비딘 결합에 의해 지지체에 고정화된, 비오틴 분자에 콘쥬게이트된 본 발명의 압타머가 또한 기술된다.

특정 실시 형태에서, 본 발명의 압타머는 예를 들어 Ravelet 등에 의해 문헌[2006, J Chromatogr A, Vol. 117(1): 1-10], Connor 등에 의해 문헌[2006, J Chromatogr A, Vol. 111(2): 115-119], Cho 등에 의해 문헌[2004, Electrophoresis, Vol. 25 (21-22): 3730-3739] 또는 Zhao 등에 의해 문헌[2008, Anal Chem, Vol. 80(10): 3915-3920]에서 기술된 바와 같이 친화성 크로마토그래피, 전자 크로마토그래피 및 캐필러리 전기 영동에 적절한 고체 지지체 위에 고정화될 수 있다.

GLA-도메인 응고 단백질에 특이적으로 결합하는 길이가 적어도 15개의 뉴클레오타이드인 식(I)의 압타머, 또는 식(II)의 화합물은 검출 또는 진단 방법 및 장치에서 GLA-도메인 응고 단백질(들)을 포획하기 위한 제제로서 유리하게 사용될 수 있다.

또 다른 면에 따르면, 본 발명은 또한 다음 단계를 포함하는 샘플 중의 하나 이상의 GLA-도메인 단백질(들)의 존재를 검출하기 위한 방법에 관한 것이다:

a) 식(I)의 핵산, 또는 식(II)의 화합물 또는 상기 핵산 또는 상기 화합물의 다수의 분자가 고정화된 고체 지지체를 (ii) 상기 샘플과 접촉시키는 단계; 및

b) 식(I)의 상기 핵산, 또는 식(II)의 상기 화합물 또는 상기 지지체와 (ii) GLA-도메인 응고 단백질(들) 사이의 복합체의 형성을 검출하는 단계.

본 특허 출원의 실시예들은 고체 지지체 위에 앞서 고정화된 본 발명의 압타머와 함께 있는 인간 FIX/FIXa를 검출하기 위한 방법의 다양한 실시 형태를 제공한다.

본 발명에 따른 검출 방법을 수행하기 위하여, 사용된 고체 지지체는 GLA-도메인 응고 단백질을 정제하기 위한 방법과 관련하여 이미 기술된 고체 지지체들로부터 선택된 고체 지지체일 수 있다.

GLA-도메인 응고 단백질을 검출하기 위한 방법을 수행하거나 장치를 제조하기 위하여, 본 분야에 숙련된 자는 특히 유럽 특허출원 No. EP　1　972　693, PCT 출원 No. WO　2008/038696, PCT 출원 No. WO　2008/025830, 또는 그 밖에 PCT 출원 No. WO　2007/0322359를 참조할 수 있다.

특정 실시 형태에서, (i) 상기 핵산 또는 상기 고체 지지체와 (ii) 활성 GLA-도메인 응고 단백질(들) 사이의 복합체의 형성을 검출하는 단계 b)는 실시예들에서 기술된 바와 같이 표면 플라즈몬 공명 시그날을 측정하여 수행할 수 있다.

다른 특정한 실시 형태에서, (i) 상기 핵산 또는 상기 고체 지지체와 (ii) GLA-도메인 응고 단백질(들) 사이의 복합체의 형성을 검출하는 단계 b)는 임의로 형성된 상기 복합체를 GLA-도메인 응고 단백질에 특이적인 검출가능한 리간드와 접촉시켜 수행될 수 있다. 실시예들은, GLA-도메인 응고 단백질의 검출가능한 리간드로서, ELISA 타입의 시험에서 통상적으로 사용되는 바와 같이 적절한 양 고추냉이 퍼옥시다제의 경우에 효소로 표지된 항-GLA-도메인 응고 단백질 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 사용한 이들 실시 형태를 기술하고 있다. GLA-도메인 응고 단백질에 특이한 항체로서, 추구되는 목적에 따라 (i) 미리결정된 GLA-도메인 응고 단백질에 대해 특이적으로 방향성인(directed) 항체, 예를 들어 항-인간 FII, 항-인간 FVII, 항-인간 FIX, 항-인간 FX, 항-인간 단백질 C 또는 항-인간 S 항체 또는 (ii) 예를 들어 미국 특허 No. US 7 439 025에 기술된 바와 같이, 다수의 GLA-도메인 응고 단백질을 인식할 수 있는 GLA-도메인 응고 단백질의 GLA-도메인에 방향성인 항체를 이용하는 것이 가능하다.

놀랍게도, 본 발명에 따르면, 항-GLA 핵산 압타머로서 선행 기술에서는 그럼에도 불구하고 사용하기에 사용하기에 어렵고 표적 단백질에 대한 특이성이 대응하는 서열의 RNA 분자의 특이성 보다 낮은 핵산 리간드라고 여겨졌던 DNA 압타머를 사용하여 본 상세한 설명에서 정의된 대로 친화성 지지체를 생산 가능하다는 것이 보여졌다. 특히, 선행 기술에서는 DNA 리간드가 대응하는 RNA 보다 적은 유연성을 갖고, 결과적으로 RNA 리간드보다 배좌(conformational) 변화를 덜 겪을 수 있다는 것이 받아들여지고 있다. 핵산 압타머가 표적 단백질에 결합할 때, 배좌 변화가 일어난다는 것이 상기된다. 핵산 압타머의 배좌 변화가 빠를수록 표적 단백질에 대한 상기 핵산 압타머의 친화성도 높다는 것이 기술되어 있다(Michaud et al., 2003, Anal Chem, Vol. 76: 1015-1020); Brumbt et al., 2005, Anal Chem, Vol. 77: 1993-1998).

따라서, 본 발명에 따른 친화성 지지체의 특정한 실시 형태에서, 항-GLA 압타머는 DNA 압타머로 구성된다.

결과적으로, 본 발명에 따른 친화성 지지체의 특정한 실시 형태에서, 적절한 경우 식(I)의 화합물의 구조에 포함되는, 상기 고정화된 핵산 압타머는 데옥시리보핵산으로 구성된다.

본 발명의 따른 친화성 지지체의 특정한 다른 실시 형태에서, 상기 핵산의 첫 부분은 데옥시리보핵산으로 구성되고, 나머지는 리보핵산으로 구성된다.

상기 핵산 압타머의 또 다른 이 점은 RNA 압타머를 합성할 때에 어려움에 비교하여 그들이 생산되는 손쉬움, 및 또한 가격에 관한 것이고, 이 가격은 RNA 압타머의 가격보다 상당히 낮다.

이들의 상세한 실시형태들은 실시예에서 설명된다.

본 발명의 대상은, 또한 본 명세서에서 정의되고 있는 친화성 지지체의 적절한 양이 놓여진 용기를 포함하는, GLA-도메인 응고 단백질을 정화하기 위한 친화성 크로마토그래피 장치이다.

크로마토그래피 지지체를 위한 용기의 다양한 형태는 선행기술에 의해 공지되어 있고, 상기의 용어 "용기"의 의미에 포함된다. 상기 용기의 중요한 특성은 친화성 크로마토그래피 장치에 출발 샘플을 공급하는 수단 및 용기가 친화성 지지체와 접촉하게 된 후 떠나기 위한 액체를 위한 수단의 존재를 포함한다.

본 발명의 대상은 또한 상기 응고 단백질을 포함하는 샘플이 상기에 정의된 것처럼 친화성 지지체와 접촉하게 되는 단계를 포함하는 지지체에 응고 단백질을 고정하기 위한 방법이다.

본 발명에 따르면 하나 이상의 GLA-도메인 응고 단백질들이 친화성 지지체에 의해 정제된 출발 샘플들은 상기 GLA-도메인 응고 단백질(들)이 현탁액(suspension)으로 또는 가용성화된 어느 유형의 액체 용액을 포함한다. 상기 샘플들의 상세한 실시형태는, 특히, 이하에 기술된 정제 방법에 관련된, 다음의 본 명세서에서 명확히 설명할 것이다.

특정한 바람직한 실시형태에서, 상기 샘플은 인간 GLA-도메인 응고 단백질을 함유한다. 이롭게는, 이러한 실시예에서, 관심의 GLA-도메인 응고 단백질을 함유하는 샘플은, 상기 GLA-도메인 응고 단백질로 구성되어 있는 액체 샘플을 포함하는 상기 관심의 단백질을 함유하고 비인간 포유동물의 상응하는 GLA-도메인 응고 단백질의 분자들 또한 함유할 수 있는 액체 샘플로 구성되어 있다. 상기 정제 방법의 특정 실시형태에서, 상기 샘플은 체액, 세포, 갈아진 세포 물질, 조직, 갈아진 조직 물질, 기관 또는 전체 유기체와 같은 생물학적 용액으로 이루어진다.

상기 정제 방법의 특정 실시예에서, 상기 샘플은 혈액, 혈액 유도체, 포유류 우유 또는 포유류 우유 파생물과 같은 동물에서 발생하는 액체 생물학적 용액으로 이루어진다. 상기 샘플은 플라스마, 플라스마 동결 침전물, 정화된 우유 또는 그것의 유도체로 이루어질 수 있다고 말했다.

상기 정제 방법의 특히 바람직한 실시형태에서, 상기 샘플은 관심의 인간 GLA-도메인 응고 단백질을 위한 형질전환 동물(an animal transgenic)에서 발생한다. 이롭게는, 상기 용액은 포유동물로부터의 우유 또는 상기 관심의 인간 단백질을 위한 형질전환 포유동물(a mammal transgenic)로부터의 우유의 유도체이다. 본 발명의 목적을 위해하여, 형질전환된 동물은 (i) 암소, 염소, 토끼, 돼지, 원숭이, 생쥐 또는 들쥐와 같은 비인간 포유동물, (ii) 조류, 또는 그밖의 (iii) 모기, 파리 또는 누에와 같은 곤충을 포함한다. 특정한 바람직한 실시형태에서, 관심의 인간 단백질을 위한 형질전환 동물은 비인간 형질전환 포유동물이고, 전적으로 바람직하게는 상기 관심의 인간 단백질을 위한 형질전환 암컷 토끼이다. 이롭게는, 형질전환 포유동물은, 상기 형질전환 포유동물의 우유에서 형질전환 단백질의 발현을 허용하는, 특정한 프로모터의 조절하에 놓여진 상기 관심의 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 카트리지(expression cassette)를 그들의 게놈에 삽입함으로써 그들의 젓샘에서 상기 관심의 재조합 인간 단백질을 생산한다.

형질전환 동물의 우유에서 상기 인간 GLA-도메인 응고 단백질을 생산하기 위한 방법은 다음과 같은 단계를 포함할 수 있다: 관심의 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 분자, (카세인 프로모터, 베타-카세인 프로모터, 락트알부민 프로모터, 베타-락토글로불린 프로모터 또는 WAP 프로모터와 같은) 자연적으로 우유에 분비된 단백질의 프로모터의 조절하에 있는 상기 유전자가, 비인간 포유동물의 배아에 통합된다. 그리고나서 배아는 같은 종의 암컷 포유동물에 위치된다. 일단 배아에서 발생하는 포유동물이 충분히 발달되었으면, 젖의 분비가 포유동물에서 유도되고, 그리고 나서 우유가 수집된다. 상기 우유는 관심의 재조합 인간 단백질을 함유한다.

인간과 다른 포유동물의 암컷의 우유에서 단백질을 준비하기 위한 방법의 실시예는 본 발명의 단백질을 생산하는 것을 재현할 수 있도록 가르쳐주고 있는 문서 EP 0 527 063에 제시되어 있다. WAP (Whey Acidic Protein) 프로모터를 포함하는 플라스미드는 WAP 유전자의 프로모터를 포함하는 서열을 도입함으로써 생산되고, 그러한 방법에서 생산되는 이러한 플라스미드는 WAP 프로모터의 조절에 의해서 위치된 외래 유전자를 수신할 수 있다. 본 발명의 단백질을 인코딩하여 프로모터 및 유전자를 포함하는 플라스미드는 암컷 토끼의 태아의 웅성 전핵으로의 미세주입법으로 형질전환 암컷 토끼를 얻는데 사용된다. 그리고 나서 태아는 호르몬적으로 준비된 암컷의 수란관으로 전달된다. 이식유전자의 존재는 얻어진 어린 형질전환 토끼로부터 추출된 DNA를 이용하는 남쪽의 기술에 의해 밝혀진다. 동물의 우유의 농도는 특정한 방사선 면역 테스트(radioimmunological tests)에 의하여 평가받는다.

또 다른 문헌에서는 인간과 다른 포유동물의 암컷의 우유에서 단백질을 준비하기 위한 방법을 설명하고 있다. 문헌 US 7 045 676 (형질전환 생쥐) 및 EP 1 739 170 (형질전환 포유동물의 폰빌레브란트인자(von Willebrand factor)의 생산)의 기재로 만들어질 수 있고, 그것에 제한되지 않는다.

본 발명의 정제 방법은 또한 인간 혈장의 동결침전물 분획 같은 인간 혈장의 샘플 또는 인간 혈장의 분획으로부터 정제된 GLA-도메인 응고 단백질을 획득하는데 적합하다.

상기 정제 방법의 특정 실시형태에서 표적 GLA-도메인 응고 단백질은 인간의 것이다.

상기 정제 방법의 특정 실시형태에서 샘플은 적어도 하나의 비인간 GLA-도메인 응고 단백질을 포함한다.

상기 정제 방법의 특정 실시형태에서, 상기 인간 GLA-도메인 응고 단백질은 상기 비인간 GLA-도메인 응고 단백질과 상응한다.

상기 정제 방법의 특정 실시형태에서, 상기 인간 GLA-도메인 응고 단백질은 상기 비인간 GLA-도메인 응고 단백질의 동족체이다.

상기 정제 방법의 특정 실시형태에서, 출발 샘플은 미정제 물질로 이루어질 수 있으며, 이것은 인간 혈장 또는 인간 혈장의 분획 또는 관심의 GLA-도메인 응고 단백질을 위한 비인간 형질전환 포유동물의 체액의 샘플이고, 정제시킨 관심의 GLA-도메인 응고 단백질을 포함한다. 형질전환 비인간 포유동물의 체액은, 예를 들면, 우유의 지방을 뺀 부분 또는 카세인 미셀(micelles)이 감소된 분획 같은 우유 또는 우유의 탈지된 분획을 포함한다.

그러나, 상기 실시형태는, 특히 미정제 출발 샘플에 존재하는 수많은 단백질에 의하여 친화성 지지체가 막히는 위험 때문에, 본 발명의 정제 방법의 바람직한 실시형태가 아니다.

바람직한 실시형태에서, 상기 출발 샘플은 상기 용액의 현탁액에 관심의 GLA-도메인 응고 단백질을 포함하는 액체 용액으로 이루어지고, 중간 생성물로 이루어진 상기 액체 용액은 응고 단백질 같은 GLA-도메인 응고 단백질을 다단계 정제하는 방법으로 생성한다.

실례로서, 상기 단백질을 위한 비인간 형질전환 포유동물의 체액으로부터 GLA-도메인 응고 단백질을 정제하기 위한 방법을 위하여, 출발 샘플은 MEP HyperCel® 유형의 크로마토그래피 지지체가 사용되는 크로마토그래피 단계와 같은 소수성 결합 크로마토그래피 단계로부터 용출액으로 이루어질 수 있다. 본 발명에 따른 이러한 정제 방법의 구체적인 실시형태는 실시예에서 설명된다.

동일한 방법으로, 인간 혈장으로부터 관심의 GLA-도메인 응고 단백질을 정제하는 방법을 위하여, 출발 샘플은 인간 혈장의 동결침전물 분획에서 수행한 딥-여과 단계로부터의 여과액으로 이루어질 수 있다.

전형적으로, 본 발명의 정제 방법을 수행하기 위하여 친화성 지지체를 이용하기 위한 조건은, 예를 들면, 리간드 항체가 고정된 면역 친화성 지지체 같은, 종래의 크로마토그래피 지지체를 이용하기 위한 종래의 조건과 매우 유사하다. 당업자들은, 예를 들어, Bailon 등등에 의한 핸드북을 참조할 수 있다. (Pascal Bailon, George K. Ehrlich, Wen-Jian Fung and Wolfgang Berthold, An Overview of Affinity Chromatography, Humana Press, 2000)

그러나, 뒤따르는 설명에서 기재되는 것처럼, 본 발명의 방법의 용출 단계 c)의 조건은 GLA-도메인 응고 단백질의 정제에 매우 유리하다.

단계 a)에서, 정제되기 위한 샘플의 적절한 부피는 친화성 지지체와의 접촉을 가져온다. 복합체는 (i) 친화성 지지체에 고정된 항-GLA 압타머와 (ii) 정제되기 위한 샘플에 포함된 관심의 GLA-도메인 응고 사이에서 형성된다.

항- GLA 압타머를 GLA-도메인 응고 단백질에 결합하기 위한 조건은, 예를들면, 염화 칼슘의 형태의 칼슘 같은 칼슘의 존재 하에 촉진된다는 것이 실시예에서 보여진다.

그러므로, 단계 a)의 특정 실시예에서, 적어도 1 mM의 CaCl₂의 최종 농도를 포함하는 버퍼 용액이 사용되며, 이것은 적어도 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM과 15 mM을 포함한다. 단계 a) 동안, 적어도 50 mM의 CaCl₂ 최종 농도를 포함하는 버퍼 용액이 바람직하게 사용된다.

항-GLA 압타머를 GLA-도메인 응고 단백질에 결합하기 위한 조건은, 염화마그네슘의 존재하에 촉진된다는 것이 실시예에서 보여진다.

그러므로, 단계 a)의 특정 실시예에서, 염화마그네슘을 포함하지 않는 버퍼 용액이 사용된다.

실례로서, 본 발명에 따른 항-GLA 압타머가 고정된 크로마토그래피 지지체를 위하여, 친화성의 GLA-도메인 응고 단백질을 위한 상기 지지체는, pH 7.5에서 50 mM 트리스-HCl 및 CaCl₂의 버퍼 용액의 경우에 동일하지만 염화마그네슘을 포함하는 버퍼 용액과 비교하여 염화마그네슘이 없는 버퍼 용액이 단계 a)에 사용될 때 실직적으로 10배가 증가된다.

방법의 바람직한 실시형태에서, 단계 a)의 마지막 및 아래에 상세히 기술된 단계 b) 전에, 예를 들면, 상기 지지체에 단순히 흡착된 물질 같은 특히 함유되지 않은 물질을 제거하기 위하여, 친화성 지지체를 세정하는 하나 이상의 단계가 수행된다. 당업자들에게 잘 알려진 종래 세척 버퍼가 사용될 수 있다.

그러나, 세척 단계(들)의 특정 실시형태에서, NaCl 및/또는 에틸렌 글리콜 및/또는 프로필렌 글리콜 및/또는 에탄올을 포함하는 세척 버퍼가 사용될 수 있다.

NaCl을 포함하는 세척액의 사용은 GLA-도메인 응고 단백질이 고정된 항-GLA 압타머에 특정한 결합을 할 때 어떠한 변형도 초래하지 않는다는 것이 실시예에서 보여진다. 3M 용량의 최종 NaCl 농도가 상기 특정한 결합을 방해하지 않았다는 것이 특히 보여졌다.

그러므로, 단계 b) 이전의 세척 단계(들)의 특정 실시형태에서, 적어도 1M, 1.5M, 2M, 2.5M 및 3.0M을 포함하여 적어도 0.5M의 최종 NaCl 농도를 가지는 세척 용액이 사용된다. 최종 NaCl 농도는 이롭게는 최대 4M이다.

실시예의 결과는, GLA-도메인 응고 단백질을 결합하기 위한 본 발명의 항-GLA 압타머의 능력이 고정된 압타머와 GLA-도메인 단백질(들) 사이에 형성된 복합체가 전적으로 예상하지 못한 결과인 높은 이온 강도의 환경에 있을 때 변형되지 않는다는 것을 보여준다. 고정된 압타머를 포함하는 친화성 지지체를 포함하며, 친화성 지지체의 고정된 리간드에서 미리 복합된 물질을 용출하기 위한 버퍼로서 높은 이온 강도에서 버퍼의 도움을 받는 것은 일반적으로 생각하는 사실이다.

실시예의 결과는, 본 발명에 따른 항-GLA 압타머가 GLA-도메인 응고 단백질을 결합시키는 그들의 능력으로 높은 이온 강도의 효과가 결여되는 독특하고 예상하지 못한 특성을 가지고 있다는 것을 보여준다.

어떠한 이론에 구속되기를 바라지 않고, 출원인은 본 발명의 항-GLA 압타머의 이러한 예상하지 못한 특성은 GLA-도메인 응고 단백질과 공통인 GLA 도메인에 특정하게 결합하는 상기 항-GLA 압타머의 능력의 결과라고 생각한다. 특히, 출원인은 본 발명의 항-GLA 압타머가 단지 GLA 도메인의 수준에서 생성될 수 있는 2가 비공유결합의 교상결합(divalent noncovalent bridges)으로 표적 단백질과 결합하고, 그리고 비공유결합의 교상결합의 생성은 GLA 도메인의 NaCl에서 발생하는 이온의 연속적인 결합을 보호한다고 생각한다.

알킬렌 글리콜을 포함하는 세척 용액의 사용은 고정된 항-GLA 압타머에 GLA-도메인 응고 단백질의 특정한 결합에서 어떠한 변형도 일어나지 않는다는 것 또한 실시예에서 보여진다.

에틸렌 글리콜을 포함하는 세척 용액의 사용은 고정된 항-GLA 압타머에 GLA-도메인 응고 단백질의 특정한 결합에서 어떠한 변형도 일어나지 않는다는 것 또한 실시예에서 보여진다. 1.5 M의 최종 에틸렌 글리콜 농도가 상기 특이적 결합을 방해하지 않았다는 것이 특히 보여졌다.

그러므로, 단계 b) 이전의 세척 단계(들)의 특정 실시형태에서, 적어도 1M 및 1.5M을 포함하며, 적어도 0.5M의 최종 에틸렌 글리콜 농도를 가지는 세척 용액이 사용된다.

프로필렌 글리콜을 포함하는 세척 용액의 사용은 고정된 항-GLA 압타머에 GLA-도메인 응고 단백질의 특정한 결합에서 어떠한 변형도 일어나지 않는다는 것 또한 실시예에서 보여진다. 50% (v/v) 의 최종 프로필렌 글리콜 농도가 상기 특이적 결합을 방해하지 않았다는 것이 특히 보여졌다.

그러므로, 단계 b) 이전의 세척 단계(들)의 특정 실시형태에서, 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 및 50%을 포함하며, 적어도 10% (v/v)의 최종 프로필렌 글리콜 농도를 가지는 세척 용액이 사용된다.

에탄올을 포함하는 세척 용액의 사용은 고정된 항-GLA 압타머에 GLA-도메인 응고 단백질의 특정한 결합에서 어떠한 변형도 일어나지 않는다는 것 또한 실시예에서 보여진다. 10% (v/v) 의 최종 에탄올 농도가 상기 특정한 결합을 방해하지 않았다는 것이 특히 보여졌다.

그러므로, 단계 b) 이전의 세척 단계(들)의 특정 실시형태에서, 적어도 1.5%, 2.0%, 2.5%, 3.0%, 3.5%, 4.0%, 4.5%, 5.0%, 5.5%, 6.0%, 6.5%, 7.0%, 7.5%, 8.0%, 9.0%, 9.5% 및 10.0%을 포함하며, 적어도 1% (v/v)의 최종 에탄올 농도를 가지는 세척 용액이 사용된다.

상기 세척 버퍼는, 친화성 지지체 위에 고정된 압타머에 GLA-도메인 응고 단백질의 분자의 특정한 결합을 보존하는 동시에, 특히 압타머상에 유지되지 않는 물질을 제거하기 위하여 격렬한 조건으로 이끈다는 것이 보여졌다. 친화성 지지체 위에 고정된 리간드와 특정하게 결합되어 있지 않은 물질의 배타적 또는 사실상 배타적 독점적 제거와 연결되는 상기 기술적 이점은 항체가 고정된 친화성 지지체에서 쉽게 실현될 수 없는 것이라고 생각된다.

단계 b)는 단계 a) 동안 항-GLA nucleic 압타머와 형성된 복합체를 가지는 관심의 GLA-도메인 응고 단백질의 분자를 용출하는 단계로 이루어진다.

실시예에 설명된 것처럼, 상기 정제 방법의 구체적인 이점은, (i) 상기 친화성 지지체에 고정된 항-GLA 핵산 압타머와 (ii) EDTA와 같은 2가-이온-킬레이트 시약과 상기GLA-도메인 응고 단백질 사이에 형성된 복합체를 가져옴으로써 용출 단계를 시행하는 가능성이다.

본 발명의 친화성 지지체의 특징에 의해서 가능하게 된 이러한 기술적인 이점은, 적어도 부분적으로 관심의 GLA-도메인 응고 단백질의 특성을 변형시킬 수도 있는 격렬한 용출 조건을 사용하는 어떠한 수단도 요구하지 않고 GLA-도메인 응고 단백질을 용출하는 것을 가능하게 한다는 것이다. 회피된 상기 격렬한 조건은, 알려진 친화성 지지체 및 대부분 특히 고정된 항체를 포함하는 친화성 지지체의 단백질을 정제하기 위한 방법이 일반적으로 수행되는 용출 단계를 위한 산성 pH의 사용을 포함한다.

그러므로, 상기 정제 방법의 특정 실시형태에서, 단계 b)는 2가-이온-킬레이트 시약, 바람직하게는 EDTA를 포함하는 용출 버퍼와 접촉된 친화성 지지체를 가져옴으로써 수행된다.

실례로서, 용출 버퍼는 적어도 1 mM 및 최대 100 mM의 최종 EDTA 농도를 함유할 수 있다.

표현 "적어도 1 mM"은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 mM을 포함한다.

표현 "최대 100 mM"은 최대 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12 또는 11 mM을 포함한다.

단계 c)에서, 단계 b)의 마지막에 얻어진 용출액을 수집함으로써 정제된 관심의 GLA-도메인 응고 단백질은 회수된다.

단계 c)의 마지막에, 관심의 응고 단백질의 정제된 액체 조성이 얻어진다. 상기 정제된 액체 조성은, 그리고 나서 적절한 용액를 바로 채워 넣거나 또는 희석한 뒤에 채워 넣거나, 그렇지 않으면 바람직하게는 균이 없고 비발열성(apyrogenic) 상태에서 동결-건조시키는 것을 포함하는 단백질을 조절(conditioning)하고 저장하기 위한 어떠한 알려진 기술에 따라서 적절하게 처리되고, 그리고 나서 조절하는 유형에 따라 상온, -4°C 또는 낮은 온도로 적절한 조건하에 있는 저장소를 선택한다.

이미 본 명세서에서 미리 언급된 것처럼, 관심의 GLA-도메인 응고 단백질을 정화하기 위한 사용의 연속적인 사이클로, 예를 들면, 용출 단계 c)는 질서 정연하게 응고 단백질의 모든 분자를 풀어놓는 것이 가능하지 않아, 그로 인해 후속 정제 사이클을 위한 프리 압타머 사이트의 수가 감소하는 사실 때문에, 본 발명의 친화성 지지체는 그 흡수 용량의 감소를 경험할 수 있다.

모든 알려진 크로마토그래피 지지체로서, 상기 지지체로부터 GLA-도메인 응고 단백질의 모든 분자를 방출하기 위하여 친화성 지지체를 재생하는 단계를 수행하고, 일반적으로 비특정하게 결합으로, 친화성 지지체의 고체 물질이 결합될 수 있는 어떠한 물질을 제거하는 것은, 그러므로 적절한 순간에 필요하다.

그러므로, 특정 실시형태에서 본 발명의 정제 방법은 재생 용액과 접촉한 상기 친화성 지지체를 가져옴으로써 친화성 지지체를 재생하는 추가적 단계 d)를 포함한다.

재생하는 크로마토그래피 지지체, 특히 친화성 크로마토그래피 지지체를 위한 다양한 버퍼는 ,당 업자들에게 잘 알려져 있고, 상기 방법의 단계 d)에 사용될 수 있다. 당업자들은 예를 들어 Mohr 등에 의한 핸드북을 참조할 수 있다. (Affinity Chromatography: Practical and Theoretical Aspects, Peter Mohr, Klaus Pommerening, Edition: illustrated, CRC Press, 1985).

실례로서, 친화성 지지체를 재생하는 단계 d)는 실시예에 설명된 것처럼, 예를 들면 pH 7.5에, 20 mM 트리스, 5% 폴리에틸렌 글리콜 및 1M NaCl의 버퍼 용액과 상기 지지체를 접촉함으로써 수행될 수 있다.

상기 정제 방법은 정제된 최종 생성물에 포함된 단백질의 전체 중량에 대하여, 선택적으로 99.95중량%보다 더 높은 순도, 매우 높은 순도의 GLA-도메인 응고 단백질을 얻는 것을 가능하게 한다.

상기 정제 방법의 또 다른 이점은, 특히 출발 샘플이 비인간 형질전환 포유동물에 의해 자연적으로 생산된 단백질을 가진 혼합물로서 재조합 형태의 관심의 인간 GLA-도메인 응고 단백질을 포함하는 샘플로 이루어진 실시형태에서, 고순도의 관심의 재조합 인간 단백질을 포함하는 최종 조성은 상기 형질전환 포유동물로부터 발생하는 단백질에 실질적으로 고정되어 있지 않고, 특히 상기 재조합 인간 GLA-도메인 응고 단백질의 동족체인 상기 포유동물의 단백질에 실질적으로 고정되어 있지 않다.

본 발명은 또한 GLA-도메인 단백질에 특정하게 결합한 핵산 압타머와 관련된 것이며, 표적 GLA-도메인 단백질을 결합하는 능력은 높은 이온 강도의 환경에 의해 개질되지 않다.

본 발명은 특히 GLA-도메인 단백질에 특정하게 결합한 핵산 압타머와 관련된 것이며, 표적 GLA-도메인 단백질을 결합하는 능력은 적어도 0.5M의 최종 NaCl 농도를 가지는 높은 이온 강도의 환경에 의해 개질되지 않는다.

GLA-도메인 단백질은 GLA-도메인 응고 단백질을 포함한다.

높은 이온 강도에서의 상기 "환경"은 높은 이온 강도에서의 버퍼 용액을 포함한다.

높은 이온 강도의 환경은 적어도 1M, 1.5M, 2M, 2.5M 및 3M의 최종 NaCl 농도를 가지고 있는 환경을 포함한다. 최종 NaCl 농도는 이롭게는 최대 4M이다.

표현 “개질되지 않은”은 표적 GLA-도메인 단백질과 GLA-도메인 단백질에 특정하게 결합하는 핵산 압타머 사이의 결합이 높은 이온 강도의 환경을 이겨낸다는 의미이다. 예를 들어, GLA-도메인 단백질의 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%는 높은 이온 강도의 환경에서 GLA-도메인 단백질에 특정하게 결합하는 핵산 압타머에 결합하여 남아있다. 특히, 이것은 높은 이온 강도의 환경의 세척 단계에서 GLA-도메인 단백질에 특정하게 결합하는 핵산 압타머에 결합된 GLA-도메인 단백질의 20%, 바람직하게는 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%가 넘는 용출이 일어나지 않는다는 것을 의미한다.

하나의 특정 실시형태에서, 본 발명에 따른 핵산 압타머는, 10% 에탄올 또는 50% 프로필렌 글리콜 용액과 같은 소수성 환경에 의해 개질되는 것 없이 표적 GLA-도메인 단백질을 결합할 수 있는 능력 또한 가진다.

이러한 특성은 본 발명에 따른 핵산 압타머가 고정된 친화성 지지체를 매우 효율적으로 세정하는데 이용될 수 있으며, 그로 인해 컬럼에 비특정하게 결합된 오염물질의 더 좋은 제거를 얻는 것을 가능하게 한다. 세척 효율의 향상은, 정제를 시도하는 GLA-도메인 단백질의 순도를 증가시키는 것을 가능하게 한다.

본 명세서에서 미리 기술되었고, 또한 실시예에 설명된 것처럼, 본 발명의 핵산 압타머와 표적 GLA-도메인 단백질 사이에 형성된 복합체는, 예를 들면, EDTA같은 2가-이온-킬레이트 시약을 포함하는 용액과 접촉한 상기 복합체를 가져옴으로써 분리될 수 있다. 그러므로, 그들의 또 다른 특성에 따르면, 본 발명의 핵산 압타머는 표적 GLA-도메인을 가진 복합체의 형성을 허락하는 핵산 압타머로 이루어지고, EDTA같은 2가-이온-킬레이트 시약을 포함하는 매개물과 접촉한 상기 복합체를 가져옴으로써, 표적 GLA-도메인을 방출하면서 상기 복합체가 분리되는 것을 가능하게 한다.

이전에 이미 설명한 것처럼, 본 발명의 핵산 압타머와 표적 GLA-도메인 단백질 사이의 복합체는, 적어도 1 mM 및 최대 100 mM의 최종 EDTA 농도를 포함하는, 버퍼 용액을 포함하는 매개물과 접촉한 상기 복합체를 가져옴으로써 분리될 수 있다.

실시예에서 설명된 것처럼, 이점은, 단 하나의 친화성 크로마토그래피 지지체를 이용하면서 출발 샘플에서 함유될 수 있는 다수의 GLA-도메인 응고 단백질을 동시에 정화하기 위하여, 여러 가지 GLA-도메인 응고 단백질을 결합하는 본 발명의 항-GLA 압타머의 능력으로부터 온다. 예를 들면, 사용은, 출발 샘플에서 함유하는 여러 GLA-도메인 응고 인자를 동시에 정제하는 ,예를 들어 인간 혈장의 동결 침전 부분을 함유하는 인자 VII, IX 및 X를 동시에 정제하는, 상기 GLA-도메인 단백질을 정제하는 공정이 만들어질 수 있다.

본 발명의 대상은 또한 비인간 단백질이 실질적으로 고정되어 있지 않은 상기 재조합 인간 GLA-도메인 응고 단백질을 적어도 99.9중량% 포함하는 재조합 인간 GLA-도메인 응고 단백질의 정제된 조성물이다.

본 발명은 또한 상기 재조합 인간 GLA-도메인 응고 단백질을 적어도 99.9중량% 및 비인간 단백질을 최대 0.1중량% 포함하는 재조합 인간 GLA-도메인 응고 단백질의 정제된 조성물에 관한 것이고, 여기에서, 중량%는 단백질의 전체 중량에 대한 상기 정제된 조성물의 중량에 대한 표현이다.

상기 정제된 조성물에서, "적어도 99.9%"는 적어도 99.91%, 99.92%, 99.93%, 99.94%, 99.95%, 99.96%, 99.97%, 99.98% 및 99.99%를 포함한다.

상기 정제된 조성물에서, "최대 0.1%"는 최대 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02% 및 0.01%을 포함한다.

본 발명은 또한 상기 정의된 것처럼 약제로서 이용될 수 있는 정제된 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 조제학적으로 허용가능한 하나 이상의 첨가제와 결합하여, 상기에 정의된 것처럼 재조합 인간 GLA-도메인 응고 단백질의 정제된 조성물을 포함하는 약제 조성물과 관한 것이다.

본 발명은 또한 응고 질환을 치료하기 위하여 상기에 정의된 것처럼 정제된 조성물과 관한 것이다.

본 발명은 또한 응고 질환을 치료하기 위한 약제를 생산하기 위하여 상기에 정의된 것처럼 정제된 조성물의 용도에 관한 것이다.

항- GLA 압타머를 얻기 위한 방법

일반적으로, 본 발명에 따른 항-압타머는 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment, 이것은 처음에 특히 PCT 출원 No. WO　1991/019813에 기재되어 있었다)로 알려진 기술의 총체적인 원리들에 기초한 방법에 따라 얻어질 수 있다. 압타머를 선택하는 SELEX 방법은 DNA 또는 RNA(일반적으로 10¹⁵ 분자들)의 핵산들의 조합 라이브러리와 단백질을 접촉시키는 데에 있다; 타겟과 결합하지 않는 핵산들은 제거되고, 타겟과 결합하는 핵산들은 분리되어 PCR에 의해 증폭된다. 그 방법은, 용액이 관심의 단백질에 대한 우수한 친화성을 갖는 핵산들로 충분히 부유될 때까지, 반복된다((Tuerk and Gold, "ystematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase" (1990) Science, 249(4968): 505-10 and Ellington and Szostak, "In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands", (1990) Nature Aug 30; 346(6287): 818-22). 다른 SELEX 방법 예들은 문헌들 EP　0　786　469, EP　668　931, EP　1　695　978 및 EP　1　493　825에 주어지며, 그것들의 교시들(teachings)은 본 발명에 따라 사용된 핵산 압타머를 선택하는 방법을 실시할 때에 구현될 수 있다. SELEX 방법의 일부 변형예들은 관심의 타겟 단백질에 결합시킴으로써 앞서 선택된 압타머들의 역선택(counterselection)의 단계들을 포함한다. 역선택의 단계(들)은, 무-타겟 분자들에 결합된 압타머들을 압타머들의 출발 집합으로부터 제거하기 위하여, 관심의 타겟 단백질을 갖는 앞서 선택되었던 압타머들의 집합을 무-타겟 분자들과 접촉시키는 단계로 이루어질 수 있다. 핵산 압타머를 얻는 방법에서 이러한 역선택 단계를 실시함으로써 방법의 끝에서 선택된 압타머의 특이성 또는 친화성을 증가시킬 수 있다.

항-GLA 압타머를 얻는 제 1 방법은 다음 단계들을 포함할 수 있다:

a) 별개의 서열들을 가진 핵산들의 "집합"이라고 불리는 핵산의 혼합물을 제공하는 단계,

b) 단계 a)에서 제공된 핵산들의 혼합물, 또는 단계 b)가 반복될 때 단계 d)의 끝에서 얻어진 핵산들의 혼합물을 제 1 표적 GLA-도메인 응고 단백질과, 상기 혼합물의 핵산들과 상기 제 1 표적 GLA-도메인 응고 단백질 사이에 복합체들을 형성할 수 있는 조건하에서 접촉시키는 단계,

c)(i) 상기 제 1 표적 GLA-도메인 응고 단백질을 갖는 복합체들을 형성하였던 핵산(들)과 (ii) 상기 제 1 표적 GLA-도메인 응고 단백질을 갖는 복합체들을 형성하지 않았던 핵산들 사이를 분리시키는 단계,

d) 상기 제 1 표적 GLA-도메인 응고 단백질과 결합하는 핵산들의 혼합물 또는 집합을 얻기 위하여, 상기 제 1 표적 GLA-도메인 응고 단백질을 갖는 복합체들을 형성하였던 핵산들을 증폭시키는 단계,

e) 상기 제 1 표적 GLA-도메인 응고 단백질과의 원하는 결합능을 가진 핵산들의 집합을 얻기 위하여 충분한 횟수로 단계들 b)내지 d)을 반복하는 단계,

f) 단계 e)에서 제공된 핵산들의 혼합물, 또는 단계 f)가 반복될 때 단계 h)의 끝에서 얻어진 핵산들의 혼합물을 제 2 표적 GLA-도메인 응고 단백질과, 상기 혼합물의 핵산들과 상기 제 2 표적 GLA-도메인 응고 단백질 사이에 복합체들의 형성을 가능케하는 조건들하에서, 접촉시키는 단계,

g)(i) 상기 제 2 표적 GLA-도메인 응고 단백질을 갖는 복합체들을 형성하였던 핵산(들)과 (ii) 상기 제 2 표적 GLA-도메인 응고 단백질을 갖는 복합체들을 형성하지 않았던 핵산들 사이를 분리시키는 단계,

h) 상기 제 2 표적 GLA-도메인 응고 단백질과 결합하는 핵산들의 혼합물 또는 집합을 얻기 위하여, 상기 제 2 표적 GLA-도메인 응고 단백질을 갖는 복합체들을 형성하였던 핵산들을 증폭시키는 단계,

i) 상기 제 2 표적 GLA-도메인 응고 단백질과의 원하는 결합능을 가진 핵산들의 집합을 얻기 위하여 충분한 횟수로 단계들 f)내지 h)을 반복하는 단계, (여기서 상기 핵산들은 상기 제 1 표적 GLA-도메인 응고 단백질과 제 2 표적 GLA-도메인 응고 단백질 모두와의 결합능을 갖는다)

j) 선택적으로, 방법의 끝에서, GLA-도메인 응고 단백질들과의 결합능을 갖는 "항-GLA 압타머"라 불리우는 핵산들의 혼합물 또는 집합을 얻기 위하여, 하나 또는 그 이상의 다른 별개의 표적 GLA-도메인 응고 단백질을 가지고 단계들 f) 내지 단계 i)을 반복하는 단계.

일반적으로, 위의 방법의 단계들을 구현하기 위한 상세한 프로토콜은 본 발명에서 앞서 인용한 참고문헌들을 포함하여, SELEX 기법과 관련한 다수의 공개물에서 당업자들에 의해 발견될 수 있다.

상기 항-GLA 압타머를 얻기 위한 방법의 일부 실시예들에서, 2 내지 6 표적 GLA-도메인 응고 단백질들은 항-GLA 압타머, 즉 GLA-도메인 응고 단백질에 특이하지만 주어진 GLA-도메인 응고 단백질에 특이하지 않은 핵산 압타머를 선택하는 데 연속적으로 사용된다. 실제로, 위의 방법에서 두 별개의 표적 GLA-도메인 응고 단백질들의 연속적인 사용에 의해 항-GLA 압타머를 얻을 수 있게 된다.

상기 항-GLA 압타머를 얻기 위한 방법을 구현하기 위하여, 표적 GLA-도메인 응고 단백질들은 인자 II, 인자 VII, 인자 IX, 인자 X, 단백질 C 및 단백질 S로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 표적 단백질이 사용되는 순서는 위의 방법의 절대적인 특성은 아니다.

변형예에 따라, 항-GLA 핵산 압타머는 다음 단계들로 이루어진 제 2 방법에 따라 얻어질 수 있다:

a) 별개의 서열들을 가진 핵산들의 "집합"이라도 불리우는 핵산의 혼합물을 제공하는 단계,

b) 단계 a)에서 제공된 핵산들의 혼합물, 또는 단계 b)가 반복될 때 단계 d)의 끝에서 얻어진 핵산들의 혼합물을 [제 1 표적 GLA-도메인 응고 단백질의 GLA 도메인]과, 상기 혼합물의 핵산들과 [상기 제 1 표적 GLA-도메인 응고 단백질의 GLA 도메인] 사이에 복합체들을 형성할 수 있는 조건들하에서, 접촉시키는 단계,

c)(i) 상기 제 1 표적 GLA-도메인 응고 단백질의 GLA도메인을 갖는 복합체들을 형성하였던 핵산(들)과 (ii) 상기 제 1 표적 GLA-도메인 응고 단백질의 GLA도메인을 갖는 복합체들을 형성하지 않았던 핵산들 사이를 분리시키는 단계,

d) 상기 제 1 표적 GLA-도메인 응고 단백질의 GLA도메인과 결합하는 핵산들의 혼합물 또는 집합을 얻기 위하여, 상기 제 1 표적 GLA-도메인 응고 단백질의 GLA도메인을 갖는 복합체들을 형성하였던 핵산들을 증폭시키는 단계,

e) 상기 제 1 표적 GLA-도메인 응고 단백질의 GLA도메인과의 원하는 결합능을 가진 핵산들의 집합을 얻기 위하여 충분한 횟수로 단계 b) 내지 단계 d)을 반복하는 단계,

f) 단계 e)에서 제공된 핵산들의 혼합물, 또는 단계 f)가 반복될 때 단계 h)의 끝에서 얻어진 핵산들의 혼합물을 제 2 표적 GLA-도메인 응고 단백질의 GLA도메인과, 상기 혼합물의 핵산들과 상기 제 2 표적 GLA-도메인 응고 단백질의 GLA도메인 사이에 복합체들의 형성을 가능케하는 조건들하에서, 접촉시키는 단계,

g)(i) 상기 제 2 표적 GLA-도메인 응고 단백질의 GLA도메인을 갖는 복합체들을 형성하였던 핵산(들)과 (ii) 상기 제 2 표적 GLA-도메인 응고 단백질의 GLA도메인을 갖는 복합체들을 형성하지 않았던 핵산들 사이를 분리시키는 단계,

h) 상기 제 2 표적 GLA-도메인 응고 단백질의 GLA도메인과 결합하는 핵산들의 혼합물 또는 집합을 얻기 위하여, 상기 제 2 표적 GLA-도메인 응고 단백질의 GLA도메인을 갖는 복합체들을 형성하였던 핵산들을 증폭시키는 단계,

i) 상기 제 2 표적 GLA-도메인 응고 단백질의 GLA도메인과의 원하는 결합능을 가진 핵산들의 집합을 얻기 위하여 충분한 횟수로 단계들 f)내지 h)을 반복하는 단계, (여기서 상기 핵산들은 상기 제 1 표적 GLA-도메인 응고 단백질의 GLA도메인과 제 2 표적 GLA-도메인 응고 단백질의 GLA도메인 모두와의 결합능을 갖는다)

j) 선택적으로, 방법의 끝에서, GLA-도메인 응고 단백질들과의 결합능을 갖는 "항-GLA 압타머"라 불리우는 핵산들의 혼합물 또는 집합을 얻기 위하여, 하나 또는 그 이상의 다른 별개의 표적 GLA-도메인 응고 단백질들의 GLA 도메인을 가지고 단계 f) 내지 단계 i)을 반복하는 단계.

상기 항-GLA 압타머를 얻는 제 2 방법의 일부 실시예들에서, 2 내지 6 표적 GLA-도메인 응고 단백질들로부터 얻어진 GLA 도메인들은 항-GLA 압타머를 선택하는데 연속적으로 사용된다.

상기 항-GLA 압타머를 얻기 위한 제 2 방법을 구현하기 위해, 사용된 GLA 도메인의 기원이 되는 표적 GLA-도메인 응고 단백질은 인자 II, 인자 VII, 인자 IX, 인자 X, 단백질 C and 단백질 S로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있다. 표적 GLA 도메인들이 사용되는 순서는 위의 방법의 절대적인 특징이 아니다.

상기 항-GLA 압타머를 얻기 위한 제 2 방법과 앞서 기술한 항-GLA 압타머를 얻기 위한 제 1 방법 사이의 필수적인 차이는 표적에 있으며, 이 표적은 제 1 방법에서는 연속의 표적 GLA-도메인 응고 단백질들로 구성되고 제 2 방법에서는 GLA 도메인 응고 단백질의 연속의 GLA 도메인들로 구성된다.

본 발명에 의하면, 다수의 GLA-도메인 응고 단백질들과 결합하는 항-GLA 압타머는 제 3 방법에 의해 얻어질 수 있으며, 그의 윈리들은 위에 기술된 제 1 및 제 2 방법들과 동일하지만 그의 방법에서 표적 물질들은 변형예로서 GLA-도메인 응고 단백질들 및 GLA-도메인 응고 단백질들의 GLA-도메인들이다. GLA-도메인 응고 단백질들 및 GLA-도메인 응고 단백질들의 GLA 도메인들이 사용되는 순서는 당업자에 의해 특히 당업자가 접근할 수 있는 표적 물질들에 따라 쉽게 결정된다.

상기 제 2 방법 및 제 3 방법의 각각에서 사용되는 표적 GLA 도메인들은 당업자에 의해 특히, 모(parent) GLA-도메인 응고 단백질의 아미노산 서열 및 그러므로 또한 고려되는 GLA 도메인의 아미노산 서열이 공지되어 있는 상황들에서 용이하게 얻어질 수 있다.

일부 실시예들에서, GLA 도메인은 공지의 분할 특이성의 하나 또는 그 이상의 적합한 단백질 분해효소들을 사용하여 상기 GLA-도메인 응고 단백질의 단백질 가수분해을 통해 모 GLA-도메인 응고 단백질로부터 얻어진다.

다른 실시예들에 따르면,GLA 도메인은 그 자체가 알려진 펩티드 합성 기술들을 통해 그것들의 공지 아미노산 서열을 기본으로 하여, 그리고 그후 당업자에게 잘 알려진 기술들에 따라 카르복실라아제를 사용하여, GLA 도메인의 글루타민 잔류물의 감마-카르복시화에 의해 얻어진다. 예시를 통하여, GLA-도메인 응고 단백질의 GLA 도메인으로 이루어진 펩티드는 Milligen® 9050 Plus type (Perkin Elmer, Stockholm, Sweden)의 펩티드 합성기 장치에서 예를 들면 주식회사 PerSeptive Biosystems®(Framingham, Massachusets, United States)에서 판매된 DPfp Fmoc 아미노산들을 사용하여, 합성될 수 있다. 신합성된 GLA 도메인의 효소의 감마-카르복시화의 단계를 위하여, 예를 들면 Wu 등에 의해 기재된 기법(1990, J Biol Chem, Vol. 265(22) : 13124-13129)에 따라 Soute 등 (1987, Thromb Haemostasis, Vol. 57 : 77-81)에 의해 기재된 반-정제된 카르복실라아제가 사용될 수 있다.

또 다른 실시예들에 따라, 항-GLA 압타머를 얻기 위한 방법은, 압타머들 중에서 표적 단백질과 결합할 수 있는 능력이 높은 이온강도의 환경, 예를 들면 적어도 0.5 M(그것은 적어도 1 M, 1.5 M, 2 M, 2.5 M 및 3 M를 포함한다)의 최종농도의 NaCl로 이루어진 완충용액에 의해 개질되지 않는 것들을 선택하는 단계가 부가될 수 있는, 위에 기재된 방법들 중의 임의 방법의 타입에 속할 수 있다.

또 하나의 다른 실시예들에 따르면, 항-GLA 압타머를 얻는 방법은 압타머들 중에서 표적 GLA-도메인 단백질들과 복합체들을 형성할 수 있는 것들을 선택하는 단계가 부가될 수 있는, 위에 설명된 방법들 중 임의의 것의 타입에 속할 수 있으며, 상기 복합체들은, 그것들을 2가 이온-킬레이트제, 예를 들면 EDTA로 이루어진 매질과 접촉시킴으로써, 표적 GLA-도메인 단백질들을 방출하면서 분해될 수 있다. 이들 압타머를 선택하는 단계는 적어도 1 Mm 및 최대로 100 Mm의 최종 EDTA 농도로 이루어진,완충용액을 포함하는 매질로 수행될 수 있다.

또 하나의 실시예들에 따르면, 항-GLA 압타머를 얻는 방법은, 압타머들 중에서 표적 단백질과 결합할 수 있는 능력이 알킬렌 글리콜, 또는 폴리알킬렌 글리콜의 존재에 의해 개질되지 않는 것들을 선택하는 단계가 부가될 수 있는, 위에 기재된 방법들 중의 임의의 것의 타입에 속할 수 있다.

또 하나의 실시예들에 따르면, 항-GLA 압타머를 얻는 방법은, 압타머들 중에서 표적 단백질과 결합할 수 있는 능력이 에틸렌 글리콜의 존재에 의해 개질되지 않는 것들을 선택하는 단계가 부가될 수 있는, 위에 기재된 방법들 중의 임의의 것의 타입에 속할 수 있다. 이들 압타머를 선택하는 단계는 적어도 0.5 M(이것은 적어도 1M 및 1.5M를 포함한다)의 최종 에틸렌 글리콜로 이루어진,완충용액을 포함하는 매질로 수행될 수 있다.

또 하나의 실시예들에 따르면, 항-GLA 압타머를 얻는 방법은, 압타머들 중에서 표적 단백질과 결합할 수 있는 능력이 프로필렌 글리콜의 존재에 의해 개질되지 않는 것들을 선택하는 단계가 부가될 수 있는, 위에 기재된 방법들 중의 임의의 것의 타입에 속할 수 있다. 이들 압타머를 선택하는 단계는 적어도 10%(v/v)(이것은 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 및 50%을 포함한다)의 최종 프로필렌 글리콜로 이루어진, 완충용액을 포함하는 매질로 수행될 수 있다.

또 하나의 실시예들에 따르면, 항-GLA 압타머를 얻는 방법은, 압타머들 중에서 표적 단백질과 결합할 수 있는 능력이 에탄올의 존재에 의해 개질되지 않는 것들을 선택하는 단계가 부가될 수 있는, 위에 기재된 방법들 중의 임의의 것의 타입에 속할 수 있다. 이들 압타머를 선택하는 단계는 적어도 1%(v/v)(이것은 적어도 1.5%, 2.0%, 2.5%, 3.0%, 3.5%, 4.0%, 4.5%, 5.0%, 5.5%, 6.0%, 6.5%, 7.0%, 7.5%, 8.0%, 9.0%, 9.5% 및 10.0%을 포함한다)의 최종 에탄올로 이루어진, 완충용액을 포함하는 매질로 수행될 수 있다.

서열표

본 발명은 하기의 실시예들에 의해 또한 예시된다.

실시예

실시예 1: 친화성 지지체의 제조

친화성 지지체는 스트렙타비딘렙타비딘-아가로스 - Novagen^®)이 이식되어 있는 매트릭스로 이루어진 고체 지지체 물질로 만들어진다.

1 ml 용량의 겔은 칼럼(i.d. 11　mm)으로 이루어진 용기로 도입되었다. 겔은 저장용매를 제거하기 위해서 정제수로 세척되었다.

겔 특성치들은 다음과 같다:

- 비오틴 흡착능: ≥85 겔의 나노몰/ml

- 기능성 시험: 포착(포획) > AT에서 30내의 비오틴화토롬빈 99%

- 기타 시험들: 무-프로타아제, 무-내부(endo)/외부핵산가수분해효소, RNase-프리

- 보존제: 100mM 인산 나트륨, pH 7.5, +NaN₃ 0.02.

- 칼럼: IBF 1.1, 0.9　cm 높이

충전칼럼(겔 층 높이=1　cm)의 출력이 254 nm에서의 UV 흡수도의 검출기 및 기록장치에 연결된다.

본 발명의 상세한 설명에서 “Mapt-1” 압타머라 또한 불리우는 서열 SEQ ID No. 4의 비오틴화 항-GLA 핵산 압타머는 0.5 mg/0.187 ml의 최종농도, 즉 0.1 mM의 최종 몰농도에서 정제수로 가용화된다. 핵산 압타머의 용액은 압타머를 고체지지체물질에 고정시키기 위하여 표준 사이클에 따라 95°C에서 활성화되었다.

핵산 압타머의 용액은 다음의 제제형: 50　mM 트리스, 50　mM NaCl, 4　mM MgCl₂, 10　mM CaCl₂, pH　7.5을 얻기 위하여, 먼저 4.8 ml의 정제수로 다음에 1.5 ml의 농축 버퍼로 희석되었다.

흡수도 검출기는 1　AUFS (흡수도 Unit Full Scale)로 조정되고 이 용액의 254nm에서 OD가 0.575 AU₂₅₄에서 기록된다.

비오틴화 핵산 압타머의 용액은 미리 포장된 스트렙타아비딘-아가로스 겔에 주입되고 연동식 펌프로 2.5　ml/분, 즉 24 초의 겔상의 접촉시간(input/output I/O)으로 재순환된다. 이들 조건하에서, 254 nm에서의 OD는 0.05 AU₂₅₄, 에서 신속하게 안정화되고, 이것은 이론적 커플링의 91%, 즉 겔의 밀리리터당 핵산 압타머 0.455　mg이다.

고체지지체 물질에 이식된 스트렙타아비딘 분자들에 특이적으로 결합되지 않았던 핵산 압타머핵산 압타머기 위하여 2 M NaCl 버퍼으로 세척이 행해진다.

실시예2 : 플라스마 GLA -도메인 응고 단백질 (인간 플라스마 인자 IX )의 정제

실시예1에 기재된 타입의 친화성 지지체가 인간 플라스마 인자 IX을 정제하는 데 사용되었다.

A. 크로마토그래피 공정

A.1.-원료 물질(RM)의 특성치

인자 IX: C: 204 IU/ml

전체 단백질: 0.5 g/l.

A.2.-출발 물질 (SM)의 제조

- 5ml의 평형 버퍼로 희석된 0.920 ml RM/

- 인자 IX: C: 37.5 IU/ml

- 전체 단백질: 0.092 g/l

- pH: 7.43

- 오스몰 농도(삼투압): H₂O 231 mOsmol/kg.

A.3.-적재

- FⅨ 중의 1 IU = 4.4 μg.

- 주입된 체적 - 2 g

- FⅨ 적재, 겔의 ml당 IU 단위로: 75 IU/ml of 겔

- FⅨ 적재, 겔의 ml당 μg 단위로: 300 μg/ml of 겔.

A.4.-크로마토그래피 버퍼의 특성치

- 평형 버퍼: 50 mM 트리스, 50 mM NaCl, 10　mM CaCl₂, 4 mM MgCl₂, pH 7.5, 218 mOsmol/kg

- 용출 버퍼 1: 20 mM 트리스, 10 mM EDTA, pH 7.5, 47　mOsmol/kg

- 용출 버퍼 2 (재생): 20 mM 트리스, 1　m NaCl, 50% 프로필렌 글리콜, pH 7.5.

A.5.-크로마토그래피 단계들의 모니터링

B. 정제된 생성물들의 특성화

B.1.-SDS-PAGE 전기영동

SDS-PAGE 겔상의 전기영동의 결과들을 도 1에 나타내었다.

레인 3에서, 용출 분획(E1)은 정제된 인간 플라스마 인자 IX의 단일 밴드를 함유한다는 것이 관측된다.

B.2.-전체 단백질에서의 결과들, FⅨ에서: C, FⅨ: Ag 및 FⅨ: Am

전체 단백질의 분석이 Tebu Bio 시험소에 의하여 행해졌다.

FⅨ: C 레벌들은 LBA에 의해서 결정되었고 FⅨ: Ag and FⅨ: Am 레벨들은 LIB에 의해서 결정되었다.

B.3.-결론

Mapt-1 압타머(SEQ ID NO.　4)에 대한 이 친화성 크로마토그래피 시험이, 친화성 지지체의 무결성(integrity) 및 리간드의 인자 IX와의 결합 능력을 확인하기 위하여, 행해졌다.

Superdex 75상에서 예비정제된 인자　IX의 샘플을 사용하여 동일한 크로마토그래피 조건들에서 제 2 시험이 행해진다.

인자 IX의 레벨 : 용출액의C/Ag의 비는 약 1 이고; 크로마토그래피 동안에 적용된 동작 조건들은 FⅨ 분자의 어떠한 열화도 초래하지 않았다.

아마 겔의 포화 및 친화성 지지체의 적재를 위한 출발 샘플의 양을 감소시키는 효용을 나타내는 인자 IX의 20%의 양이 겔로부터 비흡착 분획에서 회수된다.??

트리스 의 20 mM 와 10 mM EDTA를 갖는 용출은 FⅨ의 44% 수율을 주며 출발 물질에 대한 약 1.4의 순도의 증가를 나타낸다.

기타 시험들에서, 1%의 수율이 얻어졌다(결과들은 제시되지 아니함).

실시예 3: 재조합형 GLA -도메인 응고 단백질 (형질전환 인간 인자 IX )의 정제

실시예 1에 기재된 타입의 친화성 지지체가 인간 인자 IX에 대한 돼지 형질변환의 우유에서 생성된 재조합형 인간 인자 IX를 정제하기 위하여 사용되었다.

A. 친화력 크로마토그래피에 의한 정제를 위한 프로토콜

Mapt-1 항-GLA 압타머들이 고정된 친화성 지지체상에 있는 출발 샘플의 친화성 크로마토그래피의 단계를 구현하기 위한 특성치가 아래의 표들에 기재되어 있다.

단계 1: 청정화

pH　7.5에서 0.25 M 시트르산염 버퍼의 최종농도에서 청정우유를 얻기 위한 시트르산염에 의한 청정화.

단계 2: MEP 하이퍼셀

SM: 청정우유(IBF 25 - 10　ml 겔)

FⅨ 적재: 243　IU/ml 겔

평형 버퍼: 0.25M 시트르산염, pH　7.5

용출 버퍼: 물

단계 3: 투석

SM: MEP 용출액

투석 버퍼: 50　mM 트리스 - 50　mM NaCl, pH　7.5

단계 4: MAPT -1 (3 run )

SM: 투석된 MEP 용출액 (IBF 1.1 - 1　ml of 겔)

FⅨ 적재: 230　IU/ml 겔

평형 버퍼: 50　mM 트리스 - 50　mM NaCl - 4　mM MgCl₂ - 10　mM CaCl₂, pH　7.5

용출 버퍼: 20　mM 트리스 - 10 mM EDTA, pH　7.5

재생 버퍼: 20　mM 트리스 - 1M NaCl - 5% PG, pH　7.5

B. 원 물질(RM)의 특성치

사용된 원 물질은 인간 인자 IX로 형질전환된 돼지로부터의 미처리 우유로 이루어진다.

C. 공정의 모니터링

C.1. 단계 1: 청정화

C.1.1.-청정화의 모니터링

- 37°C에서의 E0의 융해

- 아주 유백색의 외관을 갖는 혼합물: 45　g (2/3) 돼지의 우유 + 0.75 M로 농축된 25　g (1/3) 구연산 버퍼

- 실온에서 30 분 동안 부드러운 교반

- 15°C, 5000　g 30 분 동안 원심분리

- 펠렛: 돼지 머리카락 및 불순물을 함유하는 소량의 흰 펠렛

- 상층액: 두개의 상, 지방질을 구성하는 크림상의 흰 상부의 고체상 및 청정우유(E1)을 나타내는 노란색 상.

- 펌프로 회수된 청정우유

- 청정우유의 Cuno BioCap 25 필터를 사용한 강한 여과

- 청정의 여과된 우유(E2)의 -80°C에서의 동결.

C.1.2.-전체 단백질에서, FⅨ:C, FⅨ: Ag 및 FⅨ: Am 에서의 결과들

결과들이 아래의 표 4 및 5에 나타난다.

[표 4]

[표 5]

C.2. 단계 2: MEP 하이퍼셀

C.2.1.-크로마토그래피 지지체의 특성치

- 칼럼: IBF 25, 2.5　cm 높이

- 겔: MEP 10　ml 겔, 배치 200920/G206-04

- 사용 No.: 2^nd 사용

- 사용전의 겔의 재생: 1CV 1M NaOH; 2CV 2M NaCl; 4CV 수

C.3.2.-출발 물질 ( SM )의 제조

- 37°C에서 E2의 융해

- 기준(Reference): 1IU of FⅨ = 4　μg/ml

- 주입된 체적 (g): 63.81

- FⅨ 적재 in IU per ml of 겔 (IU/ml 겔): 243　IU/ml of 겔

- FⅨ 적재 in μg per ml of 겔 (μg/ml 겔): 972　μg/ml of 겔

C.2.3.- 특성치 of 크로마토그래피 버퍼

- 평형 버퍼: 0.25M 시트르산염, pH　7.5, 612　mOsmol/kg, 31.9　mS/cm

MEP 용출 버퍼: 수

C.2.4.-크로마토그래피 단계들의 모니터링

[표 6]

재생 of the 겔 before use: 10CV 1M NaOH; 4CV 2M NaCl; 10CV water; 10CV 20% 에탄올.

C.2.5. 전체 단백질에서의 결과들

[표 7]

[표 8]

C.3. 단계 3: 투석

1L의 두 배치에서 E 4 *50g )의 투석, 4℃에서 하루 밤 교반.

[표 9]

C.4.: 항- GLA 압타머들 ( Mapt -1)을 갖는 친화성 지지체상에서의 크로마토그래피

위에 기재된 바와 같이 예비-정제된 형질전환 인간 인자 IX에 대한 세 개의 독립된 정체 시험들이 행해졌다. 각 시험의 작동 조건들과 결과들이 아래에 상세하게 기재된다.

C.4.1.-크로마토그래피 지지체

- 칼럼: IBF 1.1, 0.9　cm 높이

- 겔: MAPT-1, 겔의 1　ml

- 사용 No. : 2^nd 사용

C.4.2.-출발 물질 ( SM )의 제조

- pH 조절 및 E5에 4　mM MgCl₂ 및 10　mM CaCl₂ 최종 농도물의 첨가

- E5 (48.17　g)의 분취, 3×6　g로서 분취되고 , 그 중의 두개는 다음의 시험들을 위하여 -80°C 에서 저장된다.

- 기준: 1 IU FⅨ = 4　μg/ml

- 주입된 체적 (g): 16.14

- 겔 ml 당 IU 의 단위(IU/ml 겔)로 FⅨ 적재: 234　IU/겔의 ml

- 겔 ml 당 μg 의 단위(μg/ml 겔)로 FⅨ 적재: 936　μg/겔의 ml

C.4.3. 크로마토그래피 버퍼의 특성치

- 평형 버퍼: 50　mM 트리스, 50　mM NaCl, 10　mM CaCl₂, 4　mM MgCl₂, pH　7.51, 218　mOsmol/kg, 10.77　mS/cm

- 용출 버퍼 1: 20　mM 트리스, 10　mM EDTA, pH　7.53, 56　mOsmol/kg, 2.64　mS/cm

- 용출 버퍼 2 (재생 버퍼) : 20 mM 트리스, 1M NaCl, 50% 프로필렌 글리콜, pH　7.52, 18.27　mS/cm.

C.4.4. 크로마토그래피 단계들의 모니터링

시험 1

- pH　7.34 and 211　mOsm/kg에서 평형된 칼럼

- FⅨ 적재: 234 IU/겔의 ml.

[표 10]

시험 2

- pH　7.39 및 220 mOsm/kg에서 평형된 칼럼, 겔의 3^rd 사용

- FⅨ 적재: 236 IU/겔의 ml.

[표 11]

실험 3

- pH　7.45 및 219　mOsm/kg에서 평형된 칼럼, 겔의 5^th 사용

- FⅨ 적재: 210　IU/겔의 ml

[표 12]

C.4.5. 전체 단백질에서의 결과들, in FⅨ:C, FⅨ: Ag and FⅨ: Am

전체 단백질의 분석이 Tebu Bio laboratory에 의해 행해졌다. FⅨ:C 레벨들은 LBA에 의해 결정되었다 그리고 FⅨ:Ag 및 FⅨ:Am 레벨들은 LIB에 의해 결정되었다.

C.4.5.1 친화성 크로마토그래피 결과들, 시험 1

[표 13]

[표 14]

C.4.5.2. 친화성 크로마토그래피 결과들, 표 2

[표 15]

[표 16]

C.4.5.3. 친화성 크로마토그래피 결과들, 표 3

[표 17]

[표 18]

실시예 4: 항- GLA 압타머가 고정된 친화성 지지체를 가진 다양한 GLA -도메인 단백질의 정제

실시예 4에서, 항-GLA 압타머가 고정되어 있는 친화성 지지체가 다양한 GLA-도메인 응고 단백질을 정제하는데 성공적으로 사용되었음을 보여준다.

보다 특별하게는, 실시예 4에서 Mapt-1 항-GLA 압타머가 고정되어 있는 친화성 지지체가 인자 Ⅶ, 인자 Ⅸ 및 인자 Ⅹ을 선택적으로 보유하고 있다는 것을 보여준다.

5.1.1. 실험 조건

결합 측정: Biacore T100 장치

- 칩: Mapt-1는 활성 플로우 셀 No. 2(FC2) 상에 3596 RU 로 스트렙타비딘 표면 위에 고정되었다(Chip SA, GE). 사용되고 희석된 샘플을 위한 버퍼:50　mM ㅌ트리스/ 50　mM NaCl/10　mM CaCl₂/4　mM MgCl₂/pH　= 7.4

-유속(flow rate): 30μl/min로 60초간 주입됨, 120초간 해리됨

-신호: 블랭크인 플로우 셀 No. 1 신호로 정정된 FC2 신호

-재생: 50mM 트리스에서 10mM EDTA, pH=7.4

5.1.2. 결과

결과는 도 2에 도시되었다.

도 6은 Mapt-1 친화성 지지체가, 인자 Ⅶ, 인자 Ⅸ 및 인자 Ⅹ과 같은 다양한 GLA-도메인 응고 단백질 위치에서, 다양한 GLA-도메인 단백질을 선택적으로 보유하고 있다는 것을 보여준다.

실시예 5: 지지체 상에 고정된 인간 인자 Ⅸ에 의해 본 발명에 따른 핵산 압 타머의 포획

정제된 재조합 인간 인자 Ⅸ 분자가 고정된 고체 지지체가 제조되었다. Wyeth 사의 Benefix® 이름으로 판매되는 재조합 인간 인자 Ⅸ의 정제 제조물이 사용되었다.

인간 인자 Ⅸ는 NHS-EDC로 활성화된 카르복시메틸 덱스트란 위에 고정되었고, FⅨ에 존재하는 자유 아민과 결합한다.

그러므로 인간 재조합 인자 Ⅸ는 3153 RU의 고정속도(1RU는 mm² 당 고정된 약 1pg의 산물에 상응함)로 고정되었다.

본 발명의 핵산 압타머(순도:99%)로서, 각각 서열번호 3 및 6 내지 35의 염기서열을 가진 압타머들은, 시험되는 개별 압타머와 동일한 수의 많은 압타머 샘플을 얻기 위하여 사용 버퍼(50 mM Tirs, 10 mM CaCl₂, 4 mM MgCl₂, pH 7.5)에 희석시켰다.

각 샘플은 고정된 인간 재조합 FⅨ를 포함하는 동일한 칩(고상 지지체) 위에 연속해서 주입되었다. 대조군은 사용 버퍼만을 포함하는 블랭크를 주입하여 얻어졌다. 모든 주입은 30μl/min의 유속으로 60초 동안 실시되었다; 주입 후, 사용 버퍼는 120초 동안 동일한 유속으로 칩 위에 주입되었다.

다음으로 용출 버퍼 (10 mM EDTA)가 30μl/min의 유속으로 60초 동안 주입되어 고정된 인간 FⅨ로부터 압타머를 분리시켰다.

칩은 고정된 인간 재조합 FⅨ와 각 압타머 사이의 상호작용의 형성 및 붕괴를 실시간으로 관찰할 수 있게 하고, 각 압타머는 서열번호 3 및 6 내지 35의 염기서열을 가지고 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR)을 통해 시험되었다. 고정된 재조합 인간 FⅨ와 결합하는 것은 상기 장치에 의해 기록되는 공명 단위 (RU)에서 나타나는 신호의 증가를 발생시킨다(도 3). 이들 분석은 Biacore T100 SPR 장치(GE)를 이용하여 실시된다. 기록된 상호 작용의 모델링은 Biaevaluate 소프트웨어 (GE)에 의하여 실시되었다.

얻어진 결과들은 시험된 모든 핵산 압타머들이 재조합 인간 플라즈마 인자 Ⅸ와 유의적인 친화성(affinity)을 가지고 결합된다는 것을 보여준다.

도 3의 결과들은 또한 시험된 30개의 압타머들이, 그들의 인간 인자 Ⅸ에 대한 친화성 수준(level)에 따라 4개의 주요 그룹으로 분류될 수 있다는 것을 보여준다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 그룹 4로 분류된 압타머들의 인간 인자 Ⅸ에 대한 매우 높은 친화성은 특히 주목할 만 한다. 시험된 30개의 압타머들에서, Mapt-1.2로 표시된, 인간 인자 Ⅸ에 대한 가장 높은 친화성을 가진 압타머는, 서열번호 35의 염기서열을 가진 압타머[Mapt-1.2-CS]로 이루어진다.

실시예 6: 지지체 상에 고정된 인간 인자 Ⅸ에 의해 본 발명에 따른 핵산 압 타머의 포획

정제된 재조합 인간 인자 Ⅸ가 고정되어 있는 고체 지지체를 제조하였다. Wyeth 사의 Benefix® 이름으로 판매되는 재조합 인간 인자 Ⅸ의 정제 제조물이 사용되었다.

인간 인자 Ⅸ는 NHS-EDC로 활성화된 카르복시메틸 덱스트란 상에 고정되었고, FⅨ 상에 존재하는 자유 아민과 결합된다.

본 발명의 핵산 압타머(순도:99%)로서, 각각 서열번호 35의 염기서열[Mapt-1.2-CS] 및 서열번호 36의 염기서열[Mapt-1.2-CSO]을 가진 압타머들은, 시험되는 개별 압타머와 동일한 수의 많은 압타머 샘플을 얻기 위하여, 사용 버퍼(50mM Tirs, 10 mM CaCl₂, 4mM MgCl₂, pH 7.5)에 희석시켰다.

서열번호 36의 염기서열을 가진 Mapt-1.2-CSO 압타머는 다음 구조를 갖는 핵산으로부터 유래되었다: 80 뉴클레오타이드 길이인 5'-서열번호 1-서열번호 35-서열번호 2. 보다 구체적으로는, 다음 구조를 갖는 핵산의 위치 10의 뉴클레오타이드에서 위치 49의 뉴클레오타이드에서 종결되는 뉴클레오타이드 범위의 핵산으로 이루어진 서열번호 36의 염기서열을 갖는 Mapt-1.2-CSO 압타머:5'-서열번호 1-서열번호 35-서열번호 2.

각 샘플은 연속적으로 고정된 인간 재조합 FⅨ를 포함하는 동일한 칩(고체 지지체) 위에 주입되었다. 대조군은 사용 버퍼만을 포함하는 블랭크를 주입하여 얻어졌다. 모든 주입은 30μl/min의 유속으로 60초 동안 실시되었다; 주입후, 사용 버퍼는 120초 동안 동일한 유속으로 칩 위에 주입되었다.

칩은 고정된 인간 재조합 FⅨ와 각 압타머 사이의 상호작용의 형성 및 붕괴를 실시간으로 관찰할 수 있게 하고, 각 압타머는 서열번호 35의 염기서열[Mapt-1.2-CS] 및 서열번호 36의 염기서열[Mapt-1.2-CSO]을 가지고, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR)을 통해, 시험되었다. 고정된 재조합 인간 FⅨ와 결합하는 것은 상기 장치에 의해 기록되는 공명 단위 (RU)에서 나타나는 신호의 증가를 발생시킨다(도 4). 이들 분석은 Biacore T100 SPR 장치(GE)를 이용하여 실시된다. 기록된 상호 작용의 모델링은 Biaevaluate 소프트웨어 (GE)에 의하여 실시되었다.

얻어진 결과들은 시험된 두 개의 핵산 압타머들이 재조합 인간 플라즈마 인자 Ⅸ와 유의적인 친화성(affinity)을 가지고 결합된다는 것을 보여준다.

도 4의 결과들은 또한 시험된 2개의 압타머들에서, Mapt-1.2.-CSO (서열번호 36)이 인간 인자 Ⅸ에 대한 친화성 수준(level)을 나타내며, 이것은 Mapt-1.2.-CS 압타머(서열번호 35)의 친화성 수준보다 유의적으로 더 높다는 것을 보여준다.

도 4의 결과들은 또한 Mapt-1.2.-CSO 압타머(서열번호 36)가 인자 Ⅸ에 우수한 안정성을 가지고 결합된다는 것을 보여준다.

Mapt-1.2.-CS 압타머(서열번호 35)는 실시예 5에서 시험된 30개 압타머들에서 가장 높은 수준의 친화성을 나타내는 압타머라는 것을 상기시켜 준다.

실시예 7: 친화성 지지체의 제조

친화성 지지체는 스트렙타비딘(streptavidin-agarose-novagen®)이 그래프트되어 있는 매트릭스로 이루어진 고체 지지체 물질에서 만들어진다.

1ml의 겔 부피가 컬럼으로 이루어진 용기 내로 도입되었다(i.d.11 mm). 겔은 저장 용매를 제거하기 위하여 정제수로 세척되었다.

겔 특성은:

- 비오틴 흡착 용량: ≥ 85 nanomol/ml의 겔

- 기능 테스트: 포획 > AT에서 30분 동안 비오틴 부착된 트롬빈(biotinylated thrombin) 99%

- 기타 테스트: 프로테아제-프리, 엔도/엑소뉴클레아제-프리, RNase-프리

- 보존제: 100 mM 인산 나트륨, pH 7.5, + NaN₃ 0.02.

팩트 컬럼(packed column, 겔 베드 높이 = 1 cm)의 유출구는 254 nm에서의 UV 필터가 장착된 흡광 탐지기 및 기록 장치와 연결되어 있다.

서열번호 4의 염기서열[Mapt-1-WS]을 가진 핵산을 포함하는 비오틴 부착된 항-인간 FⅨ 핵산 압타머는 0.5 mg/0.187 ml 의 최종 농도, 즉, 0.1 mM의 최종 몰 농도로 정제수에 용해되었다. 핵산 압타머 용액은, 고체 지지체 물질에 압타머를 고정하기 위하여, 표준 싸이클에 의해서 95℃에서 활성화되었다.

핵산 압타머 용액은 4.8 ml의 정제수로 미리 희석된 1.5 ml의 Mg⁺⁺버퍼 (5배 농축)로 희석되었다.

흡광 탐지기는 1 AUFS (풀 스케일 흡광 단위)로 조정되었고 이 용액의 254 nm에서의 OD는 0.575 AU₂₅₄로 기록되었다.

핵산 압타머 용액은 프리팩트 스트렙타비딘-아가로스 겔(prepacked streptavidin-agarose gel)로 주입되고 연동 펌프에 의해 2.5 ml/min의 유속, 즉, 겔의 접촉 시간이 24초(유입/유출 I/O)의 유속으로 재순환되었다. 이 조건들 하에서, 254 nm에서의 OD는 0.05 AU₂₅₄, 91%의 이론적 결합 지수, 즉 겔 밀리리터 당 0.455 mg의 핵산 압타머에서 급격하게 안정화된다.

고체 지지체 물질에 그래프트된 스트렙타비딘과 특이적으로 결합하지 않은 핵산 압타머를 제거하기 위하여, 10 mM CaCl₂ + 4 mM MgCl₂ 버퍼로 세척한 후, 2 M NaCl로 세척하였다.

실시예 8: 재조합 인간 인자 Ⅸ를 정제하는 방법

A. 고정된 Mapt -1 WS 압타머를 포함하는 친화성 지지체의 사용

압타머 친화성 지지체는 인간 플라스마 FⅨ의 정제된 조제물을 사용하여 테스트되었다. 인간 플라스마 FⅨ의 정제된 조제물은 Laboratoire Francais du Fractionnement et des Biotechnologies(LFB) 사의 Betafact® 이름으로 판매되는 60% 순수 FⅨ 농축물로 이루어진다.

친화성 지지체는 실시예 7에 기술된 방법으로 제조되었다. 압타머는 스페이서 쇄를 포함하지 않고 Mapt-1으로 알려진 비오틴 부착된 항-GLA 압타머로 이루어지고, 이것은 서열번호 4의 염기서열을 가진 핵산을 포함한다.

실시예 8에서 사용된 친화성 지지체는 0.46 mg/ml의 이론적 리간드 밀도를 가진다. 1 ml의 겔 부피가 사용되었다.

친화성 지지체는 pH 7.5에서 0.05 M 트리스-HCl, 0.01 M CaCl₂ 버퍼로 평형을 유지시킨다.

친화성 지지체 밀리리터당 200 IU (즉, 800μg)의 양으로 적재된, 정제된 인간 플라스마 FⅨ는 인간 FⅨ 정제 단계에서 사용된다.

정제된 인간 플라스마 FⅨ 용액은, pH 7.5에서 50 mM 트리스 + 50 mM NaCl + 4 mM MgCl₂ + 10 mM CaCl₂로 미리 조정되어, 0.1 ml/min의 유속, 즉 친화성 지지체에 10 분간 접촉하는 시간(I/O)에서 연동 펌프에 의해 압타머-아가로스 겔 (친화성 지지체)로 주입된다.

주입 후에, 겔은 pH 7.5에서 50 mM 트리스 + 50 mM NaCl + 4 mM MgCl₂ + 10 mM CaCl₂ 버퍼로 세척되었다.

용액의 비흡착된 10 ml 부피가 수집되었다.

FⅨ는 pH 7.5에서 20 mM 트리스-HCl + 10 mM EDTA 버퍼로 용출되었다. 용출 피크는 OD 프로파일에 따라 수집되었다.

친화성 지지체를 재생하기 위하여, pH 7.5에서 20 mM 트리스-HCl, 1 M NaCl, 50% 프로필렌 글리콜 버퍼가 사용된다.

도 5는 254 나노미터에서 흡광도 (OD) 지수를 연속적으로 모니터링한, 인간 플라스마 FⅨ의 크로마토그래피 프로파일을 도시한 것이다.

도 5에서, 인간 플라스마 FⅨ 농축물의 주입 (1)은, 신속하게 친화성 지지체 상에 보유되지 않은 분획물의 소실 피크(elimination peak)(2)를 가져온다. 친화성 지지체는 연속적으로 관심의 응고 단백질로 포화된다: (ⅰ) 친화성 지지체의 항- GLA 핵산 압타머와 (ⅱ) 정제된 조성물에 최초 함유된 인간 플라스마 FⅨ 분자들의 복합체(complexes)가 형성되었다. 정제될 조성물이 컬럼에 옮겨진 후에, 상기 명시된 세척 버퍼로 컬럼을 세척하는 단계가 실행되었다. 그 후, 10 mM의 최종 EDTA 농도를 포함하는 용출 버퍼 용액을 주입함으로써, 용출 단계가 실행된다.

도 5의 흡수 피크(3)는, 용출 단계에서 핵산 압타머/재조합 FⅨ 복합체에서 인간 플라스마 FⅨ의 방출을 보여준다.

인간 플라스마 FⅨ 분자가 신속하게 방출된 후, 적은 용량이 된다는 것에 주목해야 한다. 계속해서 본 발명의 친화성 지지체에 의하여, 고농도의 인간 플라스마 FⅨ 단백질의 용출 용액이 획득된다.

용출 후에, pH 7.5에서 20 mM 트리스-HCl, 1 M NaCl, 50% 프로필렌 글리콜 버퍼를 사용하여 친화성 지지체 재생 단계가 실시되었다.

크로마토그램은 생산되었고, 또한 SDS-PAGE 겔 전기 영동이 환원제 없이 4-12% 비사크릴아미드 그래디언트(bisacrylamide gradient)로 쿠마씨 블루 염색(Coomassie blue staining)으로 실시되었다. 결과는 도 6에 도시하였다.

도 6의 크로마토그램 분석은 용출액이 양호한 크로마토그래픽 순도를 나타내는 것과 생물학적 활성 데이터가 인자 Ⅸ의 기능성(functionality) 유지에 의해 특성화 된다는 것을 보여준다.

이 분석들은 용출 분획에서 발견되는 "FⅨ 활성"/"인자 Ⅸ 양"의 비율 값이, 출발 물질에서 발견되는 "FⅨ 활성"/"인자 Ⅸ 양"의 비율 값과 거의 동일하다는 것을 보여주었다:이 값은 1.2 이다. 이 결과들은 FⅨ이 친화성 크로마토그래피에 의해 정제되는 방법 동안 변경되지 않았다는 것을 보여준다.

실시예 8-A의 결과들은 스페이서 쇄의 부재시에, 예를 들면, 폴리에텔린 글리콜 쇄의 부재시에, 다수의 플라스마-유래 불순물을 함유하는 복합체 출발 배지로부터 인간 인자 Ⅸ를 정제하기 위한, 친화성 지지체에 고정된 Mapt-1WS 압타머의 능력을 보여준다.

B. 고정된 Mapt -1.2.- CSO 압타머를 포함하는 친화성 지지체의 사용

PEG (C18)를 포함하는 비오틴 부착된 Mapt-1.2.-CSO 압타머의 분사가 고정된 친화성 지지체가 사용되었다.

Mapt-1.2.-CSO 압타머는 서열번호 36의 염기서열을 갖는 핵산을 포함한다.

이 친화성 지지체로, 인간 플라스마 인자 Ⅸ가 정제되었다.

친화성 지지체는 실시예 7에 기술된 프로토콜에 따라 제조되었다.

실시예 Ⅹ4를 실시하기 위하여 사용된 친화성 지지체는 이론적 리간드 밀도가 0.25 mg/ml를 가진다. 1 ml의 겔 용량이 사용되었다.

친화성 지지체는 pH 7에서 0.05 M 트리스-HCl, 0.01 M CaCl₂ 버퍼로 평형되었다.

친화성 지지체(겔) 밀리리터당 207 μg의 양으로 50 %-순수 인간 플라스마 FⅨ 적재되어 인간 FⅨ 정제 단계 동안 사용된다.

정제된 인간 플라스마 FⅨ 용액은, pH 7.5에서 50 mM 트리스 + 10 mM CaCl₂로 미리 조정되어, 0.05 ml/min의 유속, 즉 친화성 지지체에 20 분간 접촉하는 시간(I/O)에서, 연동 펌프에 의해 압타머-아가로스 겔 (친화성 지지체)로 주입된다.

용액의 비흡착된 10 ml 부피가 수집되었다.

FⅨ는 pH 7.5에서 50 mM 트리스-HCl + 10 mM EDTA 버퍼로 용출되었다. 용출 피크는 OD 프로파일에 따라 수집되었다.

친화성 지지체를 재생하기 위하여, pH 7.5에서 1 M NaCl, 50% 프로필렌 글리콜 재생 버퍼가 사용되었다.

도 7은 크로마토그래피 프로파일을 도시한 것이다.

도 7에서, 인간 플라스마 FⅨ 농축물의 주입은, 친화성 지지체 상에 보유되지 않은 분획물의 소실 피크(elimination peak)(1)를 가져온다. 친화성 지지체는 연속적으로 관심의 응고 단백질로 포화된다: (ⅰ) 친화성 지지체의 항-GLA 핵산 압타머와 (ⅱ) 정제된 조성물에 최초 함유된 인간 플라스마 FⅨ 분자들의 복합체(complexes)가 형성되었다. 정제될 조성물이 컬럼에 옮겨진 후에, 상기 명시된 세척 버퍼로 컬럼을 세척하는 단계가 실행되었다. 그 후, 10 mM의 최종 EDTA 농도를 포함하는 용출 버퍼 용액을 주입함으로써, 용출 단계가 실행된다.

비보유된 분획이 출발 샘플에 함유된 단백질의 57 중량%로 함유되고, 용출물 분획이 출발 샘플에 함유된 단백질의 40 중량%를 나타내고, 재생 분획이 출발 샘플에 함유된 단백질의 3 중량%로 나타낸다.

도 7의 흡수 피크(3)는 용출단계 동안, 핵산 압타머/재조합 FⅨ 복합체에서 인간 플라스마 FⅨ가 방출되는 것을 나타낸다.

또한, 도 8은 인간 인자 Ⅸ를 정제하기 위한, Mapt-1.2.-CSO 압타머 분자가 고정된 친화성 지지체의 우수한 능력을 나타낸다.

도 8의 결과들은 용출물 분획들이 양호한 전기영동 순도를 나타낸다.

실시예 8-B의 결과들은 친화성 지지체 위에 고정된 Mapt-1.2.-CSO 압타머가, 다수의 플라스마-유래 불순물을 포함하는 복합체 출발 배지에서 인간 인자 FⅨ를 정제하기 위한 능력을 가진다는 것을 보여준다.

이들 결과들은, Mapt-1.2.-CSO 압타머가 Mapt-1.2.-CS 압타머의 "핵심 염기서열" 의 일부만을 포함하고, 컨센서스 프라이머에 의해 인식되도록 의도된 영역의 3' 부분으로 이루어진 5' 영역을 포함하기 때문에 특히 예측되지 않는다. 보다 구체적으로는, Mapt-1.2.-CSO 압타머는 80개의 서열길이를 갖는 5'-서열번호 1-서열번호 3-서열번호 2-3'의 염기서열을 가진 핵산의 40개의 뉴클레오타이드 nt10-nt49 영역을 포함한다.

실시예 9. 재조합 인간 인자 Ⅶ의 정제 방법

인간 인자 Ⅸ를 위한 형질전환 돼지의 우유에서 생산된 재조합 인자 Ⅸ의 정제 시험이 실시되었다. 형질전환 돼지의 우유는 (ⅰ) 올바르게 감마-카르복실화된 GLA 도메인을 가진 활성 형질전환 재조합 인간 인자 Ⅸ 및 (ⅱ) 올바르지 않게 감마-카르복실화된 GLA 도메인을 가진 비활성화된 형질전환 재조합 인간 인자 Ⅸ의 혼합물을 포함한다.

돼지에서 생산되고 MEP HyperCel® 지지체 상에서 크로마토그래피에 의해 사전 정제된 형질전환 재조합 인간 FⅨ는 구연산 나트륨(sodium citrate)을 제거하기 위하여 크로마토그래피 지지체의 평형화에 사용된 버퍼에 대하여 투석되었다. MEP HyperCel 상에서의 사전 정제 단계는 1.8%의 순도로 인간 인자 Ⅸ을 함유하는 조성물을 제조하였다.

실시예 9를 실시하기 위하여 사용된 스페이서 쇄가 없는 Mapt-1WS 친화성 지지체는 0.46 mg/ml의 이론적 리간드 밀도를 가진다. 1ml의 겔 부피가 사용되었다. Mapt-1WS 압타머는 서열번호 4의 염기서열을 가진 핵산을 포함한다.

친화성 지지체는 pH 7.5에서 0.05 M 트리스-HCl, 0.01 M CaCl₂ 버퍼를 사용하여 평형화되었다.

형질전환된 암퇘지의 우유에서 유래된 사전 정제된 재조합 인간 FⅨ를 친화성 지지체(겔) 밀리리터당, 302 IU (즉, 1200μg)로 적재하여, 인간 FⅨ 정제단계에서 사용하였다.

정제된 인간 플라스마 FⅨ 용액은, pH 7.5에서 50 mM 트리스 + 10 mM CaCl₂로 미리 조정되어, 0.1 ml/min의 유속, 즉 친화성 지지체에 10 분간 접촉하는 시간(I/O)에서, 연동 펌프에 의해 압타머-아가로스 겔 (친화성 지지체)로 주입된다.

염화칼슘이 첨가될 때 출발 물질의 명확한 변화는 없었다.

용액의 비흡착된 10 ml 부피가 수집되었다.

도 9는 254 나노미터에서 흡광도 (OD) 지수를 연속적으로 모니터링한, 인간 플라스마 FⅨ의 크로마토그래피 프로파일을 도시한 것이다.

도 9에서, 인간 플라스마 FⅨ 농축물의 주입 (1)은, 신속하게 친화성 지지체 상에 보유되지 않은 분획물의 소실 피크(elimination peak)(2)를 가져온다. 친화성 지지체는 연속적으로 관심의 응고 단백질로 포화된다: (ⅰ) 친화성 지지체의 항- GLA 핵산 압타머와 (ⅱ) 정제된 조성물에 최초 함유된 형질전환 인간 FⅨ 분자들의 복합체(complexes)가 형성되었다. 정제될 조성물이 컬럼에 옮겨진 후에, 상기 명시된 세척 버퍼로 컬럼을 세척하는 단계가 실행되었다. 그 후, 10 mM의 최종 EDTA 농도를 포함하는 용출 버퍼 용액을 주입함으로써, 용출 단계가 실행된다.

도 9의 흡수 피크(3)는, 용출 단계에서 핵산 압타머/재조합 FⅨ 복합체에서 인간 형질전환 FⅨ의 방출을 보여준다.

형질전환 인간 FⅨ 분자가 신속하게 방출된 후 적은 용량이 된다는 것에 주목해야 한다. 계속해서 본 발명의 친화성 지지체에 의하여, 고농도의 형질전환 인간 FⅨ 단백질의 용출 용액이 획득된다.

용출 후에, pH 7.5에서 20 mM 트리스-HCl, 10 mM EDTA 버퍼를 사용하여 친화성 지지체를 재생하는 단계가 실시된다.

크로마토그램이 생산되었고, SDS-PAGE 겔 전기 영동이 쿠마씨 블루 염색(Coomassie blue staining)로 실시되었다. 결과는 도 10에 도시하였다.

도 10의 크로마토그램 분석은 용출액이 양호한 크로마토그래픽 순도를 나타내는 것과 인자 FⅨ의 기능성(functionality)이 유지된다는 사실에 의해 특성화 된다는 것을 보여준다.

실시예 9의 결과들은, Mapt-1WS 압타머가, 스페이서 쇄의 부재, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 쇄의 부재시 친화성 지지체에 고정된 스페이서 쇄 없이도, 다수의 플라스마 유래 불순물을 함유하는 복합체 출발 배지에서 인간 인자 Ⅸ를 정제하는 능력을 보여준다.

크로마토그래피에 의한 정제 단계의 결과들은 또한 아래 표 T1에 나타내었다.

[표 T1]

표 T1에 나타난 결과들은 실시예 9에서 제조된 친화성 지지체가 인간 인자 Ⅸ를 정제하는 우수한 능력을 보여주고, 보다 구체적으로는 재조합 인간 인자 Ⅸ가 인간 인자 Ⅸ를 위한 형질전환 암퇘지의 우유에서 생산된다는 것을 보여준다. 특히, 표 T1의 결과들은 적어도 26배의 순도 증가가 얻어졌다는 것을 보여준다.

실시예 10. 지지체 상에 고정된 인간 인자 Ⅶ에 의한 본 발명에 따른 핵산 압타머의 포획

정제된 재조합 인간 인자 Ⅶ 분자가 고정되어 있는 고체 지지체를 제조하였다. Laboratoires Francais du Fractionnement et des Biotechnologies (LFB) 사의 Novoseven® 이름으로 판매되는 재조합 인간 인자 Ⅶ의 정제된 제조물이 사용되었다.

인간 인자 Ⅶ는 NHS-EDC로 활성화된 카르복시메틸 덱스트란 상에 고정되었고, FⅨ 상에 존재하는 자유 아민과 결합된다.

그러므로 인간 재조합 인자 Ⅶ는 2525 RU의 고정속도(1RU는 mm² 당 고정된 약 1pg의 산물에 상응함)로 고정되었다.

본 발명의 핵산 압타머(순도:99%)로서, 시험되는 개별 압타머와 동일한 수의 많은 압타머 샘플을 얻기 위하여 사용 버퍼(50mM 트리스, 10 mM CaCl₂, 4mM MgCl₂, pH 7.5)에 희석시켰다.

각 샘플은 고정된 인간 재조합 FⅦ을 함유하는 동일한 칩(고체 지지체) 위에 연속적으로 주입되었다. 대조군은 사용 버퍼만을 포함하는 블랭크를 주입하여 얻어졌다. 모든 주입은 30μl/min의 유속으로 60초 동안 실시되었다; 주입후, 사용 버퍼는 120초 동안 동일한 유속으로 칩 위에 주입되었다.

다음으로 용출 버퍼 (5 mM EDTA)가 30μl/min의 유속으로 60초 동안 주입되어 고정된 인간 FⅦ로부터 압타머를 회복시켰다. 칩은 고정된 인간 재조합 FⅦ와 시험되는 각 압타머 사이의 상호작용의 형성 및 붕괴를, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR)을 통해, 실시간으로 연구할 수 있게 한다. 고정된 재조합 인간 FⅦ와 결합하는 것은 상기 장치에 의해 기록되는 공명 단위 (RU)에서 나타나는 신호의 증가를 발생시킨다(도 11). 이들 분석은 Biacore T100 SPR 장치(GE)로 실시되었다. 기록된 상호 작용의 모델링은 Biaevaluate 소프트웨어 (GE)에 의하여 실시되었다.

도 11의 결과들은 또한 시험된 27개의 압타머들이, 인간 인자 Ⅶ에 대한 친화성 정도에 따라, 4개의 주요 그룹으로 분류될 있다는 것을 보여준다.

도 14에 나타낸 것처럼, 그룹 4로 분류된 압타머들의 인간 인자 Ⅶ에 대한 매우 높은 친화성은 특히 주목할 만하다. 시험된 27개의 압타머들 중에서, 인간 인자 Ⅸ에 가장 높은 친화성을 가진 압타머가 Mapt-2.2로 명명되고, 이것은 서열번호 38의 염기서열을 가진 압타머, Mapt-2.2-CS로 이루어진다.

실시예 11: 인간 플라스마 인자 Ⅶ의 정제 방법

A. 고정된 Mapt -2- CS 압타머를 포함하는 친화성 지지체의 사용

압타머 친화성 지지체는 인간 플라스마 FⅦ의 정제된 조제물을 사용하여 테스트되었다. 인간 플라스마 FⅦ의 정제된 조제물은 Laboratoire Francais du Fractionnement et des Biotechnologies(LFB) 사의 ACSET® 이름으로 판매되는 98% 순수 FⅦ 농축물로 이루어진다.

친화성 지지체는 실시예 7에 기술된 프로토콜을 따라 제조되었다. 실시예 11-A의 친화성 지지체는 Mapt-2-CS 압타머를 포함하는데, 이것은 고정되어 있는 서열번호 37의 염기서열을 가진 핵산을 포함한다.

실시예 11-A에서 사용된 친화성 지지체는 0.40 mg/ml의 이론적 리간드 밀도를 가진다. 1 ml의 겔 부피가 사용되었다.

친화성 지지체는 pH 7.5에서, 0.05 M 트리스-HCl, 0.01 M CaCl₂, 0.05 mM MgCl₂ 버퍼로 평형을 유지시킨다.

정제된 인간 플라스마 FⅦ 적재가 인간 FⅦ 정제 단계 동안 사용된다.

정제된 인간 플라스마 FⅦ 용액은, 미리 pH 7.5에서 4 mM MgCl₂ 및 10 mM CaCl₂로 조정되어, 0.1 ml/min의 유속, 즉 친화성 지지체에 10 분간 접촉하는 시간(I/O)에서 연동 펌프에 의해 압타머-아가로스 겔 (친화성 지지체)로 주입된다.

용액의 비흡착된 10 ml 부피가 수집되었다.

FⅦ는 pH 7.5에서 20 mM 트리스-HCl + 10 mM EDTA 버퍼로 용출되었다. 용출 피크는 OD 프로파일에 따라 수집되었다.

도 12는 254 나노미터에서 흡광도 (OD) 지수를 연속적으로 모니터링한, 인간 플라스마 FⅦ의 크로마토그래피 프로파일을 도시한 것이다.

도 12에서, 인간 플라스마 FⅨ 농축물의 주입 (1)은, 신속하게 친화성 지지체 상에 보유되지 않은 분획물의 소실 피크(elimination peak)(2)를 가져온다. 친화성 지지체는 연속적으로 관심의 응고 단백질로 포화된다: (ⅰ) 친화성 지지체의 항-GLA 핵산 압타머와 (ⅱ) 정제된 조성물에 최초 함유된 인간 플라스마 FⅦ 분자들의 복합체(complexes)가 형성되었다. 정제될 조성물이 컬럼에 옮겨진 후에, 상기 명시된 세척 버퍼로 컬럼을 세척하는 단계가 실행되었다. 그 후, 10 mM의 최종 EDTA 농도를 포함하는 용출 버퍼 용액을 주입함으로써, 용출 단계가 실행된다.

도 12의 흡수 피크(3)는, 용출 단계에서 핵산 압타머/재조합 FⅨ 복합체에서 인간 플라스마 FⅨ의 방출을 보여준다.

용출 후에, 20 mM 트리스 버퍼를 사용하여 친화성 지지체 재생 단계가 실시되었다.

크로마토그램은 생산되었고, 또한 SDS-PAGE 겔 전기 영동이 쿠마씨 블루 염색으로 실시되었다. 결과는 도 13에 도시하였다.

도 13의 크로마토그램 분석은 용출액이 양호한 크로마토그래픽 순도를 나타내는 것과 인자 FⅦ의 기능성(functionality)이 유지되는 사실에 의해 특성화되는 것을 보여준다.

도 13에서 크로마토그램 분석은 출발 정제 인간 플라스마 FⅦ의 활성 형태들만이 친화성 지지체 상에 보유된다는 것을 보여준다. FⅦ의 나쁘게 글리코실화된 형태 및 FⅦ의 Des-Gla 형태를 포함하는, 출발 정제 조성물에 존재하는 비활성 형태들은 친화성 지지체 상에 보유되지 않았다.

실시예 11-4의 결과들은 스페이서 쇄의 부재시에, 예를 들면, 폴리에텔린 글리콜 스페이서 쇄의 부재시에, 다수의 플라스마-유래 불순물을 함유하는 복합체 출발 배지로부터 인간 인자 Ⅶ을 정제하기 위한, 친화성 지지체에 고정된 Mapt-2-CS 압타머의 능력을 보여준다.

B. 고정된 Mapt -2.2- CS 압타머를 포함하는 친화성 지지체의 사용

PEG (C18) 스페이서 쇄를 포함하는 비오틴 부착된 Mapt-2.2.-CS 압타머의 분가가 고정된 친화성 지지체가 사용되었다.

상기 친화성 지지체로, 인간 플라스마 인자 Ⅶ이 98% 순도로 정제되었다(ACSET®).

친화성 지지체는 실시예 7에 기술된 프로토콜에 따라 제조되었다. 실시예 11-B의 친화성 지지체는 고정된 서열번호 37의 염기서열을 가진 핵산을 포함하는 Mapt-2.2.-CS 압타머를 포함한다.

실시예 11-B를 실시하는 데 사용된 친화성 지지체는 0.50 mg/ml 이론적 리간드 밀도를 가진다. 1 ml의 겔 용량이 사용되었다.

친화성 지지체는 pH 7.5에서 0.05 M 트리스-HCl, 0.05 M NaCl, 0.01 M CaCl₂, 0.004 M MgCl₂ 버퍼로 평형이 유지되었다.

친화성 지지체(겔) 밀리리터당 115 μg의 양으로 98 %로 정제된 인간 플라스마 FⅦ이 적재되어 인간 FⅦ 정제 단계 동안 사용된다.

정제된 인간 플라스마 FⅦ 용액은, pH 7.5에서 4 mM MgCl₂ 및 10 mM CaCl₂로 미리 조정되어, 0.05 ml/min의 유속, 즉 친화성 지지체에 20 분간 접촉하는 시간(I/O)에서, 연동 펌프에 의해 압타머-아가로스 겔 (친화성 지지체)로 주입된다.

용액의 비흡착된 10 ml 부피가 수집되었다.

FⅦ은 pH 7.5에서 50 mM 트리스-HCl + 10 mM EDTA 버퍼로 용출되었다. 용출 피크는 OD 프로파일에 따라 수집되었다.

친화성 지지체를 재생하기 위하여, pH 7.5에서 1 M NaCl, 50% 프로필렌 글리콜 버퍼가 사용되었다.

도 14은 크로마토그래피 프로파일을 도시한 것이다. 도 17에서, 인간 플라스마 FⅦ 농축물의 주입은, 친화성 지지체 상에 보유되지 않은 분획물의 소실 피크(elimination peak)(1)를 가져온다. 친화성 지지체는 연속적으로 관심의 응고 단백질로 포화된다: (ⅰ) 친화성 지지체의 항-GLA 핵산 압타머와 (ⅱ) 정제된 조성물에 최초 함유된 인간 플라스마 FⅨ 분자들의 복합체(complexes)가 형성되었다. 정제될 조성물이 컬럼에 옮겨진 후에, 상기 명시된 세척 버퍼로 컬럼을 세척하는 단계가 실행되었다. 그 후, 10 mM의 최종 EDTA 농도를 포함하는 용출 버퍼 용액을 주입함으로써, 용출 단계가 실행된다.

도 14에서 흡수 피크(3)는 용출단계 동안, 핵산 압타머/재조합 FⅦ 복합체에서 인간 플라스마 FⅦ가 방출되는 것을 나타낸다.

비보유된 분획은 출발 샘플에 함유된 단백질의 9중량%로 함유되고, 용출 분획은 출발 샘플에 함유된 단백질의 78중량%를 나타내고, 재생 분획은 출발 샘플에 함유된 단백질의 13 중량%를 나타낸다.

더욱이, 도 15는 Mapt-2.2.-CS 압타머 분자가 고정되어 있는 친화성 지지체가 인간 인자 Ⅶ을 정제하는 우수한 능력을 보여준다.

도 15의 결과들은 용출액 분획이 양호한 전기영동 순도를 나타내는 것을 보여준다.

도 15에서 크로마토그램 분석은 출발 정제 인간 플라스마 FⅦ의 활성 형태만이 친화성 지지체에 보유된다는 것을 보여준다. 비활성 형태는 출발 정제 조성물에 존재하고, FⅦ의 나쁘게 글리코실화된 형태와 FⅦ의 Des-Gla 형태를 포함하고, 친화성 지지체 상에는 보유되지 않는다.

실시예 11-B의 결과들은 친화성 지지체 위에 고정된 Mapt-2.2.-CS 압타머가, 다수의 플라스마-유래 불순물을 포함하는 복합체 출발 배지에서 인간 인자 Ⅸ를 정제하는 능력을 가진다는 것을 보여준다.

실시예 12: 친화성 지지체 상에서 압타머를 포획하기 위한 조건의 최적화

고체 지지체는 80개의 뉴클레오타이드를 가지고, 또한 여기에서 "Mapt2"로 명명된, 본 발명의 핵산 압타머의 분자들이 고정되어 생산된다. 고체 지지체에 결합되기 전에, Mapt2 압타머의 5'말단은 PEG (C18)의 5개 분자로 이루어진 스페이서 쇄와 화학적으로 결합된다. 그 후, 압타머와 결합된 말단의 반대쪽의, 스페이서 쇄의 자유 말단이 비오틴 분자와 결합된다.

스트렙타비딘의 고정된 분자를 포함하는 고체 지지체가 유용하게 사용된다(series S sensor Chip SA, GE). 그 후, 상기 고체 지지체는, 서열번호 39의 염기서열을 가진 핵산을 고정시키기 위하여, 지지체의 스트렙타비딘 분자들과 압타머 화합물의 비오틴 분자들 사이의 비공유성 연관(noncovalent association)에 의해 상기 압타머 화합물과 접촉되었다.

그러므로, Mapt2 압타머는 4900 RU (1RU는 mm² 당 고정된 약 1pg의 산물에 상응함)의 고정 속도로 고정되었다.

플라스마에서 정제된 인간 FⅦ (FⅦ HP, 순도:99%)는 각각, 아래의 다양한 사용 버퍼로 희석되었다:

-버퍼 1: 50　mM Tris, 50　mM NaCl, 10　mM CaCl₂, 4　mM MgCl₂, pH　7.5;

-버퍼 2: 50　mM Tris, 50　mM NaCl, 10　mM CaCl₂, 10　mM MgCl₂, pH　7.5;

-버퍼 3: 50　mM Tris, 50　mM NaCl, 20　mM MgCl₂, pH　7.5;

-버퍼 4: 50　mM Tris, 10　mM CaCl₂, 4　mM MgCl₂, pH　7.5; 및

-버퍼 5: 50　mM Tris, 10　mM CaCl₂, pH　7.5.

각 샘플은 비오틴-스트렙타비딘 상호작용에 의해 고정된 Mapt2 압타머를 함유하는 동일 칩 (고체 지지체) 상에 연속적으로 주입되었다. 대조군은 사용 버퍼만을 함유하는 블랭크를 주입하여 얻었다. 모든 주입은 60초 동안 30 μl/min의 유속으로 실시되었다; 주입 후, 사용 버퍼는 120초 동안 동일한 유속으로 칩 위에 주입되었다.

다음으로 용출 버퍼 (5 mM EDTA)는 30초 동안 30 μl/min의 유속으로 주입되어 압타머로부터 FⅦ HP를 해리시켰다.

칩은 FⅦ HP와 고정된 압타머 사이의 상호작용의 형성 및 붕괴를, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR)을 통해, 실시간으로 연구할 수 있게 한다. 고정된 압타머와 결합하는 상기 장치에 의해 기록되는 공명 단위 (RU)에서 나타나는 신호의 증가를 발생시킨다. 이들 분석은 Biacore T100 SPR 장치(GE)로 실시되었다. 기록된 상호 작용의 모델링은 Biaevaluate 소프트웨어 (GE)에 의하여 실시되었다.

결과를 도 16에 나타내었다.

도 16의 결과들은 최적의 포획 조건이 NaCl이나 MgCl₂를 포함하지 않는, 버퍼 5를 사용한 경우라는 것을 보여준다.

도 16의 결과들은 MaCl₂의 존재가 고정된 압타머 분자에 의한 최적의 FⅦ 포획에 필수적이 아니라는 것을 보여준다. 결과들은 MaCl₂의 존재가 심지어 FⅦ의 최적 결합에 불리하다는 것을 보여준다.

더욱이, 도 16의 결과들은 사용 버퍼에서 NaCl의 존재가 친화성 지지체에 고정된 압타머 분자에 FⅦ을 최적으로 결합시키는데 불리하다는 것을 보여준다.

도 17 및 도 18은, 각각 버퍼 1 (도 17) 및 버퍼 5 (도 18)에서, 친화성 지지체 상에 고정된 Mapt-2 압타머에 대한 인간 플라스마 FⅦ의 결합의 동적 분석(kinetic analysis)을 보여준다.

도 17의 결과들은, 버퍼 1에서, 압타머가 148 nM의 인간 FⅦ에 대한 친화성 (Kd 값), 3.3 × 10³ M^-1S^-1의 ka 값, 및 4.8 × 10^-4S^-1의 kd 값을 나타낸다.

도 18의 결과들은, 버퍼 5에서, 압타머가 13 nM의 인간 FⅦ에 대한 친화성 (Kd 값), 4.7 × 10⁴ M^-1S^-1의 ka 값, 및 6 × 10^-4S^-1의 kd 값을 나타낸다.

실시예 13: 친화성 지지체 상의 압타머를 세척하기 위한 조건의 최적화

상기 실시예 X8에서 기술된 친화성 지지체가 사용되었다.

도 19는 친화성 지지체 상에 고정된 Mapt-2 압타머들 상의 인간 FⅦ의 보유에서 다양한 세척 조건들의 가능한 효과들에 관한 결과들을 보여준다. 다음의 세척 버퍼들이 테스트되었다: (1) 50　mM 트리스, 1M NaCl, 10　mM CaCl₂, 4　mM MgCl₂ 버퍼, pH　7.5, (2) 50　mM 트리스, 2M NaCl, 10　mM CaCl₂, 4　mM MgCl₂ 버퍼, pH　7.5, (3) 50　mM 트리스, 3M NaCl, 10　mM CaCl₂, 4　mM MgCl₂ 버퍼, pH　7.5, 및 (4) 50　mM Tris, 10　mM EDTA 버퍼.

결과들은 NaCl 양이 증가하는 농도를 사용하는 것이 Mapt-2 압타머에 대한 인간 FⅦ의 결합에 어떠한 변화도 야기하지 못한다는 것을 보여준다.

도 19의 결과들은 심지어 친화성 지지체를 세척하는 단계가 높은 이온 강도 버퍼에서 실시되는 경우에도, FⅦ이 Mapt-2 압타머에 결합을 유지한다는 것을 보여준다.

도 19의 결과들은 FⅦ이 EDTA로 용출된다는 것도 보여준다.

도 20은 친화성 지지체에 고정된 Mapt-2 압타머들 위의 인간 FⅦ의 보유를 위한 다양한 세척 조건들의 가능한 효과들과 관련된 결과들을 보여준다. 다음의 세척 버퍼들이 테스트되었다: (1) 50　mM 트리스, 10　mM CaCl₂, 4　mM MgCl₂ 버퍼, pH　7.5, (2) 50　mM 트리스, 10　mM CaCl₂, 4　mM MgCl₂, 1M NaCl 버퍼, pH　7.5, (3) 50　mM 트리스, 10　mM CaCl₂, 4　mM MgCl₂, 2M NaCl 버퍼, pH　7.5, (4) 50　mM 트리스, 10　mM CaCl₂, 4　mM MgCl₂, 3M NaCl 버퍼, pH　7.5, 및 (5) 50　mM 트리스, 10　mM EDTA 버퍼.

결과들은 NaCl 양의 증가하는 농도를 사용하는 것이 Mapt-2 압타머에 대한 인간 FⅦ의 결합에 어떠한 변화도 야기하지 못한다는 것을 보여준다.

도 20의 결과들은, 심지어 친화성 지지체를 세척하는 단계가 높은 이온 강도 버퍼에서 실시되는 경우에도, FⅦ이 Mapt-2 압타머에 결합을 유지한다는 것을 보여준다.

도 20의 결과들은 FⅦ이 EDTA로 용출된다는 것도 보여준다.

도 21은 친화성 지지체에 고정된 Mapt-2 압타머들 위의 인간 FⅦ의 보유를 위한 다양한 세척 조건들의 가능한 효과들과 관련된 결과들을 보여준다. 다음의 세척 버퍼들이 테스트되었다: (1) 10% 에탄올 버퍼, (2) 50　mM 트리스, 10　mM CaCl₂, 4　mM MgCl₂, 1M NaCl 버퍼, pH　7.5, (3) 50　mM 트리스, 10　mM CaCl₂, 4　mM MgCl₂, 2M NaCl 버퍼, pH　7.5, (4) 50　mM 트리스, 10　mM CaCl₂, 4　mM MgCl₂, 3M NaCl 버퍼, pH　7.5, 및 (5) 50　mM 트리스, 10　mM EDTA 버퍼.

도 21의 결과들은 세척 단계에서 에탄올을 사용하는 것이 Mapt-2 압타머에 대한 인간 FⅦ의 결합에 어떠한 변형도 야기하지 못한다는 것을 보여준다.

결과들은 세척 단계에서 증가된 NaCl의 농도가 Mapt-2 압타머에 대한 인간 FⅦ의 결합에 어떠한 변형도 야기하지 못한다는 것을 보여준다.

도 21의 결과들은, 심지어 친화성 지지체를 세척하는 단계가 높은 이온 강도 버퍼에서 실시되는 경우에도, FⅦ이 Mapt-2 압타머에 결합을 유지한다는 것을 보여준다.

도 21의 결과들은 FⅦ이 EDTA로 용출된다는 것도 보여준다.

실시예 14: 친화성 지지체 상의 압타머를 세척하기 위한 조건의 최적화

고체 지지체는 서열번호 4의 염기서열을 가지고, "Mapt1"으로 명명된, 본 발명의 Mapt-1 핵산 압타머의 분자들이 고정되어 생산되었다. 고체 지지체에 결합되기 전에, Mapt2 압타머의 5'말단은 PEG (C18)의 5개 분자로 이루어진 스페이서 쇄와 화학적으로 결합된다. 그 후, 압타머와 결합된 말단의 반대쪽의, 스페이서 쇄의 자유 말단이 비오틴 분자와 결합된다.

고정된 스트렙타비딘 분자를 포함하는 고체 지지체가 유용하게 사용된다(series S sensor Chip SA, GE).

그 후, 상기 고체 지지체는, 서열번호 4의 염기서열을 가진 핵산을 고정시키기 위하여, 지지체의 스트렙타비딘 분자들과 압타머 화합물의 비오틴 분자들 사이의 비공유성 연관(association)에 의해, 상기 압타머 화합물과 접촉되었다.

그러므로 Mapt1 압타머는 4900 RU (1RU는 mm² 당 고정된 약 1pg의 산물에 상당함)의 고정 속도로 고정되었다.

각 샘플은 비오틴-스트렙타비딘 상호작용에 의해 고정된 Mapt1 압타머를 함유하는 동일한 칩 (고체 지지체) 상에 연속적으로 주입되었다. 대조군은 사용 버퍼만을 함유하는 블랭크를 주입하여 얻어진다. 모든 주입들은 60초 동안 30 μg/min의 유속으로 실시되었고; 주입 후, 사용 버퍼가 120초 동안 동일한 속도로 칩 상에 주입되었다.

용출 버퍼 (5 mM EDTA)는 그 후 30초 동안 30 μg/min의 속도로 주입되어 압타마로부터 FⅦ의 해리시켰다.

칩은 FⅨ와 고정된 압타머 사이의 상호작용의 형성 및 붕괴를, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR)을 통해, 실시간으로 연구할 수 있게 한다. 고정된 압타머와 결합하는 것은 상기 장치에 의해 기록되는 공명 단위 (RU)로 표현되는 신호의 증가를 발생시킨다. 이들 분석은 Biacore T100 SPR 장치(GE)로 실시되었다. 기록된 상호 작용의 모델링은 Biaevaluate 소프트웨어 (GE)에 의하여 실시되었다.

도 22는 친화성 지지체 상에 고정된 Mapt-1 압타머 상의 인간 FⅨ 보유에 대한 다양한 세척 조건들의 가능한 효과들과 관련된 결과들을 보여준다. 다음의 세척 버퍼들이 테스트되었다: (1) 50　mM 트리스, 10　mM CaCl₂, 4　mM MgCl₂, 1M NaCl 버퍼, pH　7.5, (2) 50　mM 트리스, 10　mM CaCl₂, 4　mM MgCl₂, 2M NaCl 버퍼, pH　7.5, (3) 50　mM 트리스, 10　mM CaCl₂, 4　mM MgCl₂, 3M NaCl 버퍼, pH　7.5, 및 (5) 50　mM 트리스, 10　mM EDTA 버퍼.

결과들은 세척 단계에서 증가된 농도의 NaCl을 사용하는 것이 Mapt-1 압타머에 대한 인간 FⅨ의 결합에 어떠한 변화도 야기하지 않는다는 것을 보여준다.

도 22의 결과들은, 친화성 지지체를 세척하는 단계가 높은 이온 강도 버퍼에서 수행되는 경우에도, FⅨ가 Mapt-1 압타머에의 결합을 유지한다는 것을 보여준다.

도 22의 결과들은 또한 FⅨ이 EDTA로 용출된다는 것도 보여준다.

도 23은 친화성 지지체 상에 고정된 Mapt-1 압타머 상의 인간 FⅨ 의 보유에 대한 프로필렌 글리콜 (50%에서)의 가능한 효과와 관련된 결과들을 보여준다. 50　mM 트리스, 10　mM CaCl₂, 50% 프로필렌 글리콜 버퍼, pH　7.5가 테스트되었다.

도 23의 결과들은 세척 단계에서 프로필렌 글리콜을 사용하는 것이 Mapt-1 압타머에의 인간 FⅨ의 결합에 어떠한 변화도 야기하지 못한다는 것을 보여준다.

SEQUENCE LISTING <110> LFB-BIOTECHNOLOGIES <120> Method for purifying GLA-Domain coagulation proteins <130> IP-2012-0011 <150> FR0955406 <151> 2009-07-31 <160> 39 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 5' region of aptamer <400> 1 gggagatagc cacgacct 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 3' region of aptamer <400> 2 tccaggctgt gcgaaagc 18 <210> 3 <211> 44 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> central part of aptamer <400> 3 cgcacatgac ttgaagttaa acgcgaatta caaacccagc cccc 44 <210> 4 <211> 80 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> aptamer <400> 4 gggagatagc cacgacctcg cacatgactt gaagttaaac gcgaattaca aacccagccc 60 cctccaggct gtgcgaaagc 80 <210> 5 <211> 79 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> aptamer <400> 5 gctttcgcac agcctggaca cttcccatta gggggcattc agctaaatac gcagcggctt 60 gaggtcgtgg ctatctccc 79 <210> 6 <211> 43 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> aptamer <400> 6 cgcacacgac ttgaagttaa acgcgaatta cagaccatgc cca 43 <210> 7 <211> 43 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> aptamer <400> 7 cgcacacgac ttgaagttaa acgcgaatta cggaccaatc cca 43 <210> 8 <211> 43 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> aptamer <400> 8 cgcacacgac ttgaagttaa acgcgaacta cagaccaagc cca 43 <210> 9 <211> 43 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> aptamer <400> 9 cgcacatgac ttgaagttaa acgcgaacta cataccaagc cca 43 <210> 10 <211> 44 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> aptamer <400> 10 cgcacatgac ttgaagttaa acgcgaatta caaacccagc cccc 44 <210> 11 <211> 44 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> aptamer <400> 11 cgcacaagac ttgaagttaa acgcgaatta caaacccagc cccc 44 <210> 12 <211> 45 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> aptamer <400> 12 tcgcacatga catgaagtta aacgcgaatt acaaacccag ccccc 45 <210> 13 <211> 43 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> aptamer <400> 13 cgcacatgac tcgaaataaa cgcgaattac aaacccagcc ccc 43 <210> 14 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<400> 21 cgcacatgac ttgaagttaa acgcgaatta cgaaccagac ccc 43 <210> 22 <211> 42 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> aptamer <400> 22 cgcacatgac ttgaagttaa cgcgaattac gaaccagacc ca 42 <210> 23 <211> 43 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> aptamer <400> 23 cgcacatgac ttgaagttaa acgcgaatta caaaccagac cca 43 <210> 24 <211> 43 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> aptamer <400> 24 cgcacatgac ttgaagttaa acgcgaatta caaaccaaac cca 43 <210> 25 <211> 43 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> aptamer <400> 25 cgcacatgac ttgaagttaa acgcgaatta caaaccaaac ccg 43 <210> 26 <211> 42 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> aptamer <400> 26 cgcacatgac ttgaagttaa cgcgaattac aaaccaaccc cc 42 <210> 27 <211> 43 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> aptamer <400> 27 cgcacatgac ttgaagttaa cgcgaataac aacccatccc ccc 43 <210> 28 <211> 44 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> aptamer <400> 28 cgcacaatga cttgaagtga aacgcgaata acaaaccagg cccc 44 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Claims

GLA-도메인 응고 단백질을 정제하기 위한 방법으로서,
a) (i) 핵산 압타머와 (ii) GLA-도메인 응고 단백질(들) 사이의 복합체를 형성하기 위하여, 하나 이상의 GLA-도메인 응고 단백질을 함유하는 샘플을 다수의 GLA-도메인 응고 단백질에 특이적으로 결합하는 핵산 압타머(nucleic aptamers)가 고정화된 친화성 지지체와 접촉하게 하는 단계,
b) 단계 a)에서 형성된 복합체로부터 GLA-도메인 응고 단백질(들)을 방출시키는 단계, 및
c) 상기 GLA-도메인 응고 단백질(들)을 정제된 형태로 회수하는 단계를 포함하는, GLA-도메인 응고 단백질을 정제하기 위한 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 핵산 압타머가 데옥시리보핵산 압타머로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 압타머가 아래 식(I)의 화합물의 구조에 포함되는 것을 특징으로 하는 방법:
[IMM]_x-[SPAC]_y-[APT] (I)
여기에서,
- [IMM]은 지지체 상에 고정화하기 위한 화합물을 의미하고,
- [SPAC]는 스페이서 쇄를 의미하며,
- [APT]는 GLA-도메인 단백질과 특이적으로 결합하는 핵산을 의미하고,
- x는 0 또는 1의 정수이고,
- y는 0 또는 1의 정수이다.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GLA-도메인 응고 단백질은 비타민 K-의존성 응고 인자인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GLA-도메인 응고 단백질은 인자 II, 인자 VII, 인자 IX, 인자 X, 단백질 C 및 단백질 S로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 인자 II, 인자 VII, 인자 IX, 인자 X, 단백질 C 및 단백질 S로부터 선택된 적어도 두 개의 GLA-도메인 응고 단백질을 동시에 정제하기 위한 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 인자 II, 인자 VII, 인자 IX, 인자 X, 단백질 C 및 단백질 S로부터 선택된 적어도 세 개의 GLA-도메인 응고 단백질을 동시에 정제하기 위한 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 인자 II, 인자 VII, 인자 IX, 및 인자 X를 동시에 정제하기 위한 방법.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 압타머는 서열 번호 3, 4 및 6 내지 39로부터 선택된 염기서열을 갖는 압타머로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
표적 GLA-도메인 단백질에 결합하는 능력이 고 이온 강도의 환경에 의해 변형되지 않는 하나 이상의 GLA-도메인 응고 단백질(들)에 특이적으로 결합하는 핵산 압타머.
제 10 항에 있어서, 표적 GLA-도메인 단백질에 결합하는 능력이 적어도 0.5M의 최종 NaCl 농도를 갖는 고 이온 강도의 환경에 의해 변형되지 않는 것을 특징으로 하는 핵산 압타머.
서열 번호 3, 4 및 6 내지 39의 염기서열을 갖는 핵산으로부터 선택된 핵산을 포함하는, GLA-도메인 단백질에 특이적으로 결합하는 핵산 압타머.
제 10 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 데옥시리보핵산으로 구성되는 것을 특징으로 하는 핵산 압타머.
제 10 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 핵산 압타머가 고정된 친화성 지지체.