KR20120098381A - Reversible fluorescence photoswitch based on dye-crosslinked dendritic nanoclusters for high-contrast imaging of living biological systems - Google Patents

Reversible fluorescence photoswitch based on dye-crosslinked dendritic nanoclusters for high-contrast imaging of living biological systems Download PDF

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Abstract

PURPOSE: A reversible fluorescence photoswitch for high-contrast imaging based on a dendrimer nanocluster structure crosslinked by photochromic compounds is provided to improve detection sensitivity and to ensure high safety. CONSTITUTION: A reversible fluorescence photoswitch for high-contrast imaging based on dendrimer nanocluster structure crosslinked by photochromic compounds has a plurality dendrimers surrounding a dendrimer at the center. Each dendrimer is connected to the end of adjacent drimers by one or more crosslinking agent. The photochromic material is an azobenzene derivative, spiropyran derivative, diarylethene derivative, or fulgide derivative. The dendrimer is polyamidoamine(PAMAM) dendrimer, polylysine dendrimer, polypropylene imine(PPI) dendrimer, polyester dendrimer, polyglutamic acid dendrimer, polyaspartic acid dendrimer, or polymelamin dendrimer.

Description

광변색화합물로 가교된 덴드리머 나노클러스터 구조에 기반한 고대비 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치{Reversible fluorescence photoswitch based on dye-crosslinked dendritic nanoclusters for high-contrast imaging of living biological systems}Reversible fluorescence photoswitch based on dye-crosslinked dendritic nanoclusters for high-contrast imaging of living biological systems

본 발명은 광변색화합물로 가교된 덴드리머 나노클러스터 구조에 기반한 고대비 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치에 관한 것이다.
The present invention relates to a reversible fluorescence switch for high contrast biological imaging based on dendrimer nanocluster structures crosslinked with photochromic compounds.

덴드리머는 1970년대 후반 Denkewalter에 의해 합성된 폴리라이신(polylysine) 덴드리머로 처음 등장한 이래, 새로운 덴드리머의 분자설계와 이의 합성법, 이의 물리화학적 특성 연구와 이를 토대로 한 기초적 응용사례(예를 들어, 자기조립, 생체모방 시스템 등), 이의 소재와 의료 분야에의 응용에 대한 연구가 활발히 진행되어 왔다. Denkewalter에 의해 합성된 폴리라이신 덴드리머 구조의 예는 아래와 같다[특허문헌 US 4,410,688].Dendrimers were first introduced as polylysine dendrimers synthesized by Denkewalter in the late 1970s, and their molecular design and synthesis, their physical and chemical properties, and their basic applications (eg, self-assembly, Biomimetic systems, etc.), its materials and applications in the medical field have been actively studied. Examples of the polylysine dendrimer structure synthesized by Denkewalter are as follows (Patent Document US 4,410,688).

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덴드리머는 대개 지름 10 nm이하의 비교적 작은 방사형(treelike 또는 radial-shape) 고분자로서, 한 층(layer)씩 단계별로(stepwise) 반복적인(iterative) 유기합성과 정제를 통해 얻어지는 순수 단일분자(unimolecule)이다. 대부분의 다른 전형적인 고분자(다분산(polydisperse) 혼합물)와는 달리 덴드리머는 특정 환경(용매, pH, 온도 등)에서의 크기가 항상 일정하고 어느 정도 예측이 가능하여, 특히 고분자기반 입자들의 용액 내 크기(hydrodynamic diameter)에 민감한 다양한 응용연구 분야에 선택적으로 맞춤 적용할 수 있어 매우 유리하다. 구체적인 덴드리머의 장점으로는 화학구조상의 온전함(integrity), 적용하는 유기합성법에 따라 얼마든지 덴드리머를 구성하는 작용기와 이에 수반된 물리화학적 성질의 변형이 가능함, 여러가지 기능 단위 물질(functional unit)(예를 들어, 저분자 약물, 표적 물질, 표면 개질제 등)들을 덴드리머의 내부와 표면에 용이하게 치환할 수 있음, 그리고 생물분야에 응용될 경우 중요한 생체 내 효소에 의한 파괴(enzymatic degradation) 가능성이 거의 없음 등을 들 수 있다.Dendrimers are relatively small, treelike or radial-shape polymers, typically 10 nm or less in diameter, that are purely monomolecules obtained through stepwise, iterative organic synthesis and purification. to be. Unlike most other typical polymers (polydisperse mixtures), dendrimers are always constant and somewhat predictable in certain environments (solvent, pH, temperature, etc.), especially in solution size of polymer-based particles ( It is very advantageous as it can be selectively adapted to various application researches that are sensitive to hydrodynamic diameter. Specific advantages of dendrimers include the integrity of the chemical structure, the functional constituents of the dendrimers and the modification of the accompanying physicochemical properties depending on the organic synthesis method applied, and various functional units (e.g., For example, low molecular weight drugs, target materials, surface modifiers, etc.) can be easily substituted inside and the surface of the dendrimer, and there is little possibility of enzymatic degradation by enzymes in vivo which is important for biological applications. Can be mentioned.

덴드리머가 바이오의약분야에 적용된 예로는, 다가양이온성(polycationic) 덴드리머를 이용하여 음이온성의 유전자와 전하복합체(charge complex)를 이루어 효과적으로 세포내로 운반(gene transfection)하는 예; 약물전달 매개체(carrier)로 사용된 덴드리머가 약물을 운반하는 방식에 있어서, 특정 자극(pH, light, enzyme 등)에 의해 환부에서만 약물이 방출되도록 약물분자를 덴드리머내 투과성(porous) 공간에 물리적으로 함유(physical encapsulation)하거나 전구약물(prodrug)의 형태로 덴드리머에 공유결합으로 치환하는 예; 덴드리머 운송체(carrier)의 구조 변형을 통해 약물을 표적 지향 또는 제어된 방출 속도로 전달하는 예; 다중치환 효과(multivalent effect)를 이용하여 단백질(lectin)과 탄수화물 리간드간 세포외벽(extracellular membrane)에서 상호작용(interaction)시 결합력(binding affinity)을 대폭 증대시키는 예; 저분자 화합물 기반 이미징 제제를 덴드리머 골격에 다중치환하여 신호를 증폭(signal amplification)시킴으로써 보다 효과적인 의학적 진단을 가능하게 하는 예; 생체적합성(biocompatible) 및 생분해성(biodegradable) 덴드리머 골격에 기반한 인공조직을 제조(artificial tissue engineering)하고 적용한 예 등을 들 수 있다.Examples of the application of the dendrimer to the biopharmaceutical field include the use of polycationic dendrimers to form charge complexes with anionic genes and efficiently transfect them into cells; In the manner in which a dendrimer used as a drug delivery carrier carries a drug, the drug molecule is physically stored in a porous space in the dendrimer such that the drug is released only in the affected area by a specific stimulus (pH, light, enzyme, etc.). Covalent substitution of dendrimers in the form of physical encapsulation or prodrugs; Delivery of the drug at a targeted or controlled release rate through structural modification of the dendrimer carrier; Using a multivalent effect to significantly increase binding affinity in interactions between the protein and carbohydrate ligands in the extracellular membrane; Examples of polysubstituting a small molecule compound based imaging agent into a dendrimer backbone to amplify the signal to enable a more effective medical diagnosis; Examples of the manufacture and application of artificial tissue engineering based on biocompatible and biodegradable dendrimer skeletons are given.

덴드리머의 종류 중 폴리아미도아민(poly(amidoamine), 이하, "PAMAM") 덴드리머는 Dr. Donald A. Tomalia가 1980년대 다우케미컬사에 재직할 당시 개발한 물질로서, 내부 구조는 지방족 아민(amine)기 또는 지방족 아미드(amide)기로 구성되어 있으며, 이의 표면은 아민기, 카르복실기, 히드록시기 등 여러가지 작용기로 되어 있다. 예로서, 코어(core)가 에틸렌디아민이고, 표면이 아민기로 이루어진 PAMAM 덴드리머의 구조는 하기와 같다(A: G2 PAMAM 덴드리머, B: G3 PAMAM 덴드리머).Among the types of dendrimers, poly (amidoamine), hereinafter referred to as "PAMAM" dendrimer, It was developed by Donald A. Tomalia at Dow Chemical Company in the 1980s, and its internal structure is composed of aliphatic amine groups or aliphatic amide groups, and its surface includes amine groups, carboxyl groups, and hydroxyl groups. It is a functional group. For example, the structure of the PAMAM dendrimer whose core is ethylenediamine and whose surface is composed of amine groups is as follows (A: G2 PAMAM dendrimer, B: G3 PAMAM dendrimer).

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광변색 현상은 자외선 혹은 가시광선에 노출될 경우, 색이 변하는 화합물 또는 이러한 화합물을 함유한 시스템의 색상이 빛에 의해 가역적으로 변하는 현상을 지칭한다. 광변색 화합물은 흡수 특성, 굴절성 등과 같은 서로 다른 물리적인 성질을 가지는 적어도 두개의 이성질체형(isomeric forms)을 가지는 화합물이며, 각 이성질체의 흡수파장영역에서의 광조사(light irradiation)에 의해 한 형태에서 다른 형태로 변화될 수 있는 화합물이다.Photochromic phenomenon refers to a compound that changes color when exposed to ultraviolet or visible light, or that the color of a system containing such a compound is reversibly changed by light. Photochromic compounds are compounds having at least two isomeric forms having different physical properties such as absorption characteristics, refractive properties, etc., and formed by light irradiation in the absorption wavelength region of each isomer. Is a compound that can be transformed into other forms.

광에 의한 색의 변화가 가역적으로 일어날 수 있는 광변색 소재는 광기록, 광스위치, 모듈레이터 등 다양한 분야에 응용성을 가진다. 그 예로 디아릴에텐계 화합물은 자외선에 노출시 색이 변하고, 이어서 다른 가시광 영역의 파장의 광을 조사하면 화합물의 본래의 색으로 되돌아오는 광변색 화합물로서, 1985년에 처음으로 합성된 이래 광조사 후 열에 의한 변색이 일어나지 않는 안정한 광변색성 화합물로 알려져 왔다. 아울러 다양한 유도체들이 합성되었고, 그 중 불소로 치환된 디아릴에텐화합물은 안정성이 더욱 높을 뿐만 아니라, 광변색 속도가 비교적 빠른 것으로 알려져 있다[M. Irie, Chem. Rev. 2000, 100, 1685-1716; S. Nakamura, et al., J. Photochem. Photobiol. A: Chem. 2008, 200, 10-18].Photochromic materials, which can be reversibly changed color due to light, have applicability in various fields such as optical recording, optical switches, and modulators. For example, the diarylethene compound is a photochromic compound that changes color when exposed to ultraviolet light and then returns to the original color of the compound when irradiated with light of a wavelength in another visible light region. It has been known as a stable photochromic compound which does not cause discoloration by heat. In addition, various derivatives have been synthesized, among which the aryl substituted diaryl ethene compounds are known to have higher stability and relatively faster photochromic speed [M. Irie, Chem. Rev. 2000, 100, 1685-1716; S. Nakamura, et al., J. Photochem. Photobiol. A: Chem. 2008, 200, 10-18.

한편, 디아릴에텐계 화합물은 대부분 유기용매에서는 용해되나, 물에서는 용해가 잘 되지 않아 수용액 상을 기반으로 하는 바이오 분야에는 극히 제한적으로 적용되어있다. 다만, 최근 디아릴에텐계 화합물에 올리고 에틸렌글리콜을 도입함으로써 수용성 물질로 전환이 가능하다는 보고가 있었다[T. Hirose, et al., J. Org. Chem. 2006, 71, 7499-7508]. 아울러 일본공개특허공보 제2003-246776호에서는 생체기능성 분자를 가역적으로 구조변화시킨 가교성 광변색성 분자와 기계적 에너지를 생산할 수 있는 생체기능성 분자 유도화합물을 제공하기 위해, 광변색성 분자와 티올기를 가지는 생체분자를 말레이미드기로 가교 결합시키는 방법을 개시하고 있으나, 수용성 광변색성 분자를 이용한 것이 아니므로, 바이오 분야의 적용은 어려웠다. On the other hand, most of the diaryl ethene-based compound is dissolved in an organic solvent, but insoluble in water is very limited in the bio-based field of the aqueous phase. However, recently, there have been reports of conversion to water-soluble substances by introducing oligo ethylene glycol into the diaryl ethene compound [T. Hirose, et al., J. Org. Chem. 2006, 71, 7499-7508. In addition, Japanese Laid-Open Patent Publication No. 2003-246776 discloses a photochromic molecule and a thiol group in order to provide a crosslinkable photochromic molecule having a reversible structural change in the biofunctional molecule and a biofunctional molecular derivative compound capable of producing mechanical energy. Eggplants disclose a method of crosslinking a biomolecule with a maleimide group, but since the water-soluble photochromic molecule is not used, application of the biofield is difficult.

따라서, 특정 파장의 빛에 의해 그 색상이 가역적으로 변하는 광변색 화합물을 이용하여 UV-Vis 분광기 등으로 쉽게 신호를 검출하고, 원치않는 배경신호를 감소시켜 검출감도를 크게 향상시킬 수 있는 생체분자 검출기술의 개발이 시급한 실정이다.
Therefore, using a photochromic compound whose color is reversibly changed by light of a specific wavelength, it is easy to detect signals with a UV-Vis spectrometer, etc., and detects biomolecules which can greatly improve detection sensitivity by reducing unwanted background signals. The development of technology is urgent.

pcFRET(photochromic FRET)은 아조벤젠(azobenzene), 디아릴에텐(diarylethene), 스파이로파이란(spiropyran), 펄가이드(fulgide) 등의 광변색 화합물을 스위치분자로 사용하여 형광공명에너지전이(fluorescence resonance energy transfer, FRET)에 의해 인근(FRET 반응이 가능한 거리 이내) 형광물질의 형광을 가역적으로 온-오프(on-off)하는 것을 의미한다[M. Irie et al., Nature 2002, 420, 759-760; L. Giordano, et al., J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 7481-7489; N. Soh, et al., Chem. Commun. 2007, 5206-5208]. 최근 이러한 pcFRET원리에 기반한 시스템을 살아있는 생물체에 적용하여 가역적 형광이미징을 시행한 예가 등장하였다[Y. Zou, et al., J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 15750-15751; U. Al-Atar, et al., J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 15966-15967; A. A. Beharry, et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 1325-1327]. 이러한 pcFRET을 가장 효과적으로 수행하기에 적합한 광변색 화합물은 디아릴에텐인데, 그 이유는 이 계열의 물질이 일반적으로 높은 열안정성, 높은 내구성, 높은 감도 및 빠른 감응속도의 성질을 갖기 때문이다.
pcFRET (photochromic FRET) is a fluorescence resonance energy using photochromic compounds such as azobenzene, diarylethene, spiropyran, and fulgide as switch molecules. transfer, FRET) means reversible on-off of the fluorescence of nearby phosphors (within the distance at which the FRET reaction is possible) [M. Irie et al., Nature 2002, 420, 759-760; L. Giordano, et al., J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 7481-7489; N. Soh, et al., Chem. Commun. 2007, 5206-5208. Recently, reversible fluorescence imaging has been introduced by applying the system based on the pcFRET principle to living organisms [Y. Zou, et al., J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 15750-15751; U. Al-Atar, et al., J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 15966-15967; AA Beharry, et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 1325-1327]. The photochromic compound suitable for performing this pcFRET most effectively is diarylethene, because this series of materials generally have the properties of high thermal stability, high durability, high sensitivity and fast response speed.

본 발명자는 광변색 분자 유도체를 가교제로 사용하여 이의 양말단과 덴드리머 표면 작용기가 공유결합을 형성하도록 하여 덴드리머를 올리고머화하고, 이어서 덴드리머 표면 잔여기에 형광 물질과 과량의 생체적합성 표면 개질제를 첨부하여 덴드리머 나노클러스터 구조를 개발하였으며, 이러한 덴드리머 나노클러스터가 생체 내 형광 검출감도를 더욱 향상시킬 뿐만 아니라 생체적합성이 우수함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
The present inventors use a photochromic molecular derivative as a crosslinking agent so that its sock end and the dendrimer surface functional group form a covalent bond to oligomerize the dendrimer, and then attach the fluorescent material and the excess biocompatible surface modifier to the dendrimer surface residue to attach the dendrimer nano The cluster structure was developed, and the dendrimer nanocluster not only improves the fluorescence detection sensitivity in vivo but also confirms the excellent biocompatibility and completed the present invention.

본 발명의 목적은 광변색화합물로 가교된 덴드리머 나노클러스터 구조에 기반한 고대비 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치를 제공하는데 있다. An object of the present invention is to provide a reversible fluorescent switch for high-contrast biological imaging based on dendrimer nanocluster structure crosslinked with a photochromic compound.

본 발명의 다른 목적은 상기 광변색화합물로 가교된 덴드리머 나노클러스터 구조에 기반한 고대비 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치의 제조방법을 제공하는데 있다.
It is another object of the present invention to provide a method of manufacturing a reversible fluorescent switch for high contrast biological imaging based on the dendrimer nanocluster structure crosslinked with the photochromic compound.

상기 목적을 해결하기 위하여, 본 발명은 광변색화합물로 가교된 덴드리머 나노클러스터 구조에 기반한 고대비 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치를 제공한다.In order to solve the above object, the present invention provides a reversible fluorescent switch for high contrast biological imaging based on the dendrimer nanocluster structure cross-linked with a photochromic compound.

또한, 본 발명은 상기 광변색화합물로 가교된 덴드리머 나노클러스터 구조에 기반한 고대비 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치의 제조방법을 제공한다.
In addition, the present invention provides a method of manufacturing a reversible fluorescent switch for high-contrast biological imaging based on the dendrimer nanocluster structure cross-linked with the photochromic compound.

본 발명에 따른 덴드리머 나노클러스터는 복수개의 덴드리머를 방사상으로 연결시킨 구조로서 단일 덴드리머보다 형광신호가 증폭되어 검출감도가 향상되고, 인간과 유사한 유전자 서열을 가진 지브라 피쉬의 경우 체내 주사(microinjection) 방법 뿐만 아니라, 피부흡수를 통한 생체 내로의 주입이 가능하고, 높은 안전성을 가져 생체 내 및 생체 외 영상화 또는 탈체(ex vivo) 세포 추적(cell tracking)에 유용하게 사용될 수 있다.
The dendrimer nanoclusters according to the present invention have a structure in which a plurality of dendrimers are connected in a radial manner. As a result, the detection sensitivity is improved by amplifying a fluorescence signal than a single dendrimer. In addition, injection into the living body through skin absorption is possible, and has high safety and can be usefully used for in vivo and ex vivo imaging or ex vivo cell tracking.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 광변색 화합물(3)에 대해 차례로 각 UV와 Vis 광을 교대로 조사 시 분포하는 3가지 이성질체(즉, oa: ring-open form의 antiparallel conformation, op: ring-open form의 parallel conformation, 및 c: ring-closed form)의 상대적 양을 1H NMR로 측정한 도면이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 광변색 물질 3(a), 덴드리머 나노클러스터 4(b), 1a(c) 및 1b(d)의 화합물의 1H NMR 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 덴드리머 나노클러스터(1a)의 COSY 결과(a: 전체, b,c:확대)를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 덴드리머 나노클러스터(1a)의 NOESY 결과(a: 전체, b,c:확대)를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 덴드리머 나노클러스터(1b)의 COSY 결과(a: 전체, b,c:확대)를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 G5 PAMAM 덴드리머 2(a), 4(b), 1a(c) 및 1b(d)의 덴드리머 나노클러스터의 MALDI-TOF MS 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 광변색 물질(3, 10 μM)에 대한 가역적 포토스위칭 실험 결과를 UV/Vis(a,b) 및 형광(c,d) 스펙트럼으로 나타낸 도면이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 형광물질인 Cy3(1 μM)에 대한 가역적 포토스위칭 실험 결과를 UV/Vis(a,b) 및 형광(c,d) 스펙트럼으로 나타낸 도면이다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 덴드리머 나노클러스터(1a)(10, 100 μg/mL)에 대한 가역적 포토스위칭 실험 결과를 UV/Vis(a,b) 및 형광(c,d) 스펙트럼으로 나타낸 도면이다.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 덴드리머 나노클러스터(1b)(10, 100 μg/mL)에 대한 가역적 포토스위칭 실험 결과를 UV/Vis(a,b) 및 형광(c,d) 스펙트럼으로 나타낸 도면이다.
도 11은 본 발명의 일실시예에 따른 광변색 물질(3)(1 μM) 및 형광물질 Cy3(0.4 μM)의 혼합물에 대한 가역적 포토스위칭 실험 결과를 UV/Vis(a,b) 및 형광(c,d) 스펙트럼으로 나타낸 도면이다.
도 12는 본 발명의 일실시예에 따른 광변색 물질(3)(2.5 μM) 및 형광물질 Cy3(1 μM)의 혼합물에 대한 가역적 포토스위칭 실험 결과를 UV/Vis(a,b) 및 형광(c,d) 스펙트럼으로 나타낸 도면이다.
도 13은 본 발명의 일실시예에 따른 덴드리머 나노클러스터 1a(a) 및 1b(b)의 독성 실험결과를 나타낸 도면이다.
도 14는 본 발명의 일실시예에 따른 덴드리머 나노클러스터(1a)를 가한 HeLa 세포를 각 시간만큼 씩 배양한 뒤 형광 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도면(최종농도 a: 10 μg/mL, b: 100 μg/mL)이다(Scale bars: 20 μm).
도 15는 본 발명의 일실시예에 따른 덴드리머 나노클러스터(1b)를 가한 HeLa 세포를 각 시간만큼 씩 배양한 뒤 형광 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도면(최종농도 a: 10 μg/mL, b: 100 μg/mL)이다(Scale bars: 20 μm).
도 16은 본 발명의 일실시예에 따른 덴드리머 나노클러스터 1a(a,b) 및 1b(c,d)를 살아있는 세포에 적용하여 포토스위칭 실험한 결과를 나타낸 도면이다.
도 17은 본 발명의 일실시예에 따른 덴드리머 나노클러스터 1a(a) 및 1b(b)를 살아있는 HeLa 세포에 배양하여 8번째 포토스위칭 사이클에서 UV 및 Vis에서의 형광 강도를 측정한 실험결과를 나타낸 도면이다(Scale bars: 20 μm).
도 18은 본 발명의 일실시예에 따른 덴드리머 나노클러스터(1b)가 각각 배양흡수법(a,b) 또는 혈관내 주입법(c,d)에 의해 함유된 살아있는 지브라피쉬에 대하여 가역적 포토스위칭 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 19는 본 발명의 일실시예에 따른 덴드리머 나노클러스터(1b) 100 μg/mL로 처리하여 배양된 살아있는 지브라피쉬에 대한 절단부위별 형광 이미지를 본 결과를 나타낸 도면이다(Scale bars: 200 μm).
도 20은 본 발명의 일실시예에 따른 덴드리머 나노클러스터(1b) 100 μg/mL로 처리하여 배양된 살아있는 지브라피쉬에 대한 절단부위별 형광 이미지를 본 결과를 나타낸 도면이다(Scale bars: 200 μm).1 is three isomers (ie, oa: ring-open form antiparallel conformation, op: isotopically distributed to each of the UV and Vis light in turn with respect to the photochromic compound (3) according to an embodiment of the present invention) The parallel conformation of the ring-open form and the relative amount of c: ring-closed form) were measured by 1 H NMR.
FIG. 2 is a diagram showing 1 H NMR results of compounds of photochromic material 3 (a), dendrimer nanoclusters 4 (b), 1a (c), and 1b (d) according to one embodiment of the present invention.
3 is a view showing a COSY result (a: total, b, c: enlarged) of the dendrimer nanoclusters 1a according to an embodiment of the present invention.
4 is a view showing a NOESY result (a: total, b, c: magnification) of the dendrimer nanocluster 1a according to an embodiment of the present invention.
5 is a view showing a COSY result (a: total, b, c: magnification) of the dendrimer nanocluster 1b according to an embodiment of the present invention.
FIG. 6 is a diagram illustrating MALDI-TOF MS results of dendrimer nanoclusters of G5 PAMAM dendrimers 2 (a), 4 (b), 1a (c), and 1b (d) according to an embodiment of the present invention.
7 is a diagram showing the results of the reversible photo-switching experiments for the photochromic material (3, 10 μM) according to an embodiment of the present invention in the UV / Vis (a, b) and fluorescence (c, d) spectrum.
8 is a diagram showing the results of the reversible photo-switching experiments for the fluorescent material Cy3 (1 μM) according to an embodiment of the present invention in the UV / Vis (a, b) and fluorescence (c, d) spectrum.
FIG. 9 shows reversible photoswitching test results of the dendrimer nanoclusters 1a (10, 100 μg / mL) according to an embodiment of the present invention in UV / Vis (a, b) and fluorescence (c, d) spectra. The figure shown.
10 is a reversible photoswitching test results for the dendrimer nanoclusters 1b (10, 100 μg / mL) according to an embodiment of the present invention in UV / Vis (a, b) and fluorescence (c, d) spectrum The figure shown.
FIG. 11 shows the results of a reversible photoswitching experiment for a mixture of photochromic material (3) (1 μM) and phosphor Cy3 (0.4 μM) according to an embodiment of the present invention. c, d) Spectral diagram.
12 shows the results of a reversible photoswitching experiment for a mixture of photochromic material (3) (2.5 μM) and phosphor Cy3 (1 μM) according to an embodiment of the invention UV / Vis (a, b) and fluorescence ( c, d) Spectral diagram.
Figure 13 is a view showing the results of toxicity experiments dendrimer nanoclusters 1a (a) and 1b (b) according to an embodiment of the present invention.
14 is a view showing the results of observing with a fluorescence microscope after incubating the HeLa cells to which the dendrimer nanocluster 1a according to an embodiment of the present invention for each hour (final concentration a: 10 μg / mL, b: 100 μg / mL) (Scale bars: 20 μm).
15 is a view showing the result of observing with a fluorescence microscope after culturing HeLa cells to which the dendrimer nanocluster 1b according to an embodiment of the present invention was applied for each hour (final concentration a: 10 μg / mL, b: 100 μg / mL) (Scale bars: 20 μm).
16 is a diagram showing the results of photoswitching experiments by applying the dendrimer nanoclusters 1a (a, b) and 1b (c, d) according to an embodiment of the present invention to living cells.
FIG. 17 shows experimental results of measuring fluorescence intensities in UV and Vis in an eighth photoswitching cycle by incubating dendrimer nanoclusters 1a (a) and 1b (b) in living HeLa cells according to an embodiment of the present invention. Figure (Scale bars: 20 μm).
FIG. 18 shows reversible photoswitching test results for live zebrafish containing dendrimer nanoclusters 1b according to one embodiment of the present invention, respectively, by culture absorption method (a, b) or intravascular injection method (c, d). The figure which shows.
19 is a view showing the results of fluorescence image for each cutting site for the cultured zebrafish cultured by treatment with dendrimer nanocluster (1b) 100 μg / mL according to an embodiment of the present invention (Scale bars: 200 μm) .
20 is a view showing the results of the fluorescence image of the cut region for the living zebrafish cultured by treatment with the dendrimer nanocluster (1b) 100 μg / mL according to an embodiment of the present invention (Scale bars: 200 μm) .

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 하나의 덴드리머를 중심으로 복수개의 덴드리머가 중심부의 덴드리머를 둘러싸고있고, 상기 각각의 덴드리머는 광변색 물질 역할 또는 광스위칭이 가능한 적어도 하나의 가교제에 의해 이웃하는 적어도 하나의 덴드리머 말단에 연결되며, 상기 각각의 덴드리머 표면에는 상기 광변색 물질과 형광공명 에너지 전달(FRET) 반응을 수행할 수 있는 거리 이내에 위치하는 적어도 하나의 형광물질이 덴드리머 말단에 결합되어 있는 광변색화합물로 가교된 덴드리머 나노클러스터 구조에 기반한 고대비 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치를 제공한다.
According to the present invention, a plurality of dendrimers surround a central dendrimer around a single dendrimer, and each of the dendrimers is connected to at least one dendrimer end neighboring by at least one crosslinking agent capable of acting as a photochromic material or photoswitching. The dendrimer nanocluster cross-linked with a photochromic compound having at least one fluorescent material located at a distance within which a photochromic material and a fluorescence resonance energy transfer (FRET) reaction can be performed on each dendrimer surface is bound to a dendrimer end. Provided are reversible fluorescent switches for structure based high contrast biometric imaging.

상기 광변색 물질은 아조벤젠(azobenzene) 유도체, 스파이로파이란(spiropyran) 유도체, 디아릴에텐(diarylethene) 유도체, 펄가이드(fulgide) 유도체 등을 사용할 수 있다.As the photochromic material, an azobenzene derivative, a spiropyran derivative, a diarylethene derivative, a pearlide derivative and the like can be used.

바람직하게는, 상기 광변색 물질은 하기 화합물 군으로부터 선택되는 어느 하나의 디아릴에텐 유도체일 수 있다:Preferably, the photochromic material may be any one of the diarylethene derivatives selected from the group of compounds:

Figure pat00003
,
Figure pat00004
,
Figure pat00005
,
Figure pat00006
,
Figure pat00007
,
Figure pat00008
,
Figure pat00009
,
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,
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,
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또는
Figure pat00013
Figure pat00003
,
Figure pat00004
,
Figure pat00005
,
Figure pat00006
,
Figure pat00007
,
Figure pat00008
,
Figure pat00009
,
Figure pat00010
,
Figure pat00011
,
Figure pat00012
or
Figure pat00013

(여기서, 상기 R1은 수소 또는 메틸이고; R2 및 R3는 수소, C1~C6의 직쇄 또는 측쇄 알킬 또는 비치환 또는 치환된 C5~C7의 아릴 또는 헤테로 아릴이고, 상기 R2 및 R3는 서로 동일 또는 상이할 수 있다.).
Wherein R 1 is hydrogen or methyl; R 2 and R 3 are Hydrogen, C 1 -C 6 straight or branched chain alkyl or unsubstituted or substituted C 5 -C 7 aryl or hetero aryl, wherein R 2 and R 3 may be the same or different from each other.).

상기 디아릴에텐 유도체는 하기 화학식 3a인 것이 바람직하고, 하기 화학식 3인 것이 더욱 바람직하다. It is preferable that the said diaryl ethene derivative is a following formula (3a), It is more preferable that it is a following formula (3).

[화학식 3a][Chemical Formula 3]

Figure pat00014
Figure pat00014

(여기서, 상기 R1은 상기에서 정의한 바와 같고;Wherein R 1 is as defined above;

R4는 -OR5 또는 -NHR5이고;R 4 is -OR 5 or -NHR 5 ;

R5는 수소 또는 C1~C6 직쇄 또는 측쇄 알킬 또는 비치환 또는 치환된 C5~C7의 아릴 또는 헤테로 아릴이다.).
R 5 is hydrogen or C 1 -C 6 straight or branched alkyl or unsubstituted or substituted C 5 -C 7 aryl or hetero aryl).

[화학식 3](3)

Figure pat00015
Figure pat00015

또한, 상기 덴드리머는 폴리아미도아민(PAMAM) 덴드리머, 폴리라이신 덴드리머, 폴리프로필렌이민(PPI) 덴드리머, 폴리에스터 덴드리머, 폴리그루타민산 덴드리머, 폴리아스파르트산 덴드리머, 폴리멜라민 덴드리머 등일 수 있고, 바람직하게는 이들 중 5세대 폴리아미도아민 덴드리머인 G5 PAMAM 덴드리머를 사용할 수 있다.
In addition, the dendrimer may be a polyamidoamine (PAMAM) dendrimer, polylysine dendrimer, polypropyleneimine (PPI) dendrimer, polyester dendrimer, polyglutamic acid dendrimer, polyaspartic acid dendrimer, polymelamine dendrimer, and the like. Among these, G5 PAMAM dendrimer which is a fifth generation polyamidoamine dendrimer can be used.

나아가, 본 발명에 따른 G5 PAMAM 덴드리머 나노클러스터의 표면은 카르복실레이트 또는 메톡시폴리(에틸렌)글리콜기(mPEG) 또는 메톡시올리고(에틸렌)글리콜기(mOEG)를 갖도록 개질될 수 있다. 이때, 상기 카르복실레이트는 G5 PAMAM 덴드리머 나노클러스터 표면을 음이온성 표면으로 만드는 역할을 하고, 상기 메톡시폴리(에틸렌)글리콜 또는 메톡시올리고(에틸렌)글리콜은 G5 PAMAM 덴드리머 나노클러스터 표면을 중성(neutral) 표면으로 만드는 역할을 한다. 음이온성 및 중성의 표면 전하를 가진 G5 PAMAM 덴드리머 나노클러스터는 생체적합성 실험을 위해 설계되었으며 이 중 메톡시폴리(에틸렌)글리콜 또는 메톡시올리고(에틸렌)글리콜기를 표면에 가지는 중성 표면의 G5 PAMAM 덴드리머 나노클러스터가 생체적합성이 더욱 뛰어남을 확인하였다(도 16 참조).
Furthermore, the surface of the G5 PAMAM dendrimer nanoclusters according to the present invention may be modified to have a carboxylate or methoxypoly (ethylene) glycol group (mPEG) or methoxyoligo (ethylene) glycol group (mOEG). In this case, the carboxylate serves to make the G5 PAMAM dendrimer nanocluster surface an anionic surface, and the methoxypoly (ethylene) glycol or methoxyoligo (ethylene) glycol neutralizes the G5 PAMAM dendrimer nanocluster surface. ) It makes a surface. G5 PAMAM dendrimer nanoclusters with anionic and neutral surface charges are designed for biocompatibility experiments, including neutral surface G5 PAMAM dendrimer nanos with methoxypoly (ethylene) glycol or methoxyoligo (ethylene) glycol groups on the surface The cluster was confirmed to be more biocompatible (see FIG. 16).

또한, 상기 형광물질은 시아닌(Cyanine, 이하 "Cy") 시리즈, 알렉사플루오르(Alexa Fluor) 시리즈, 보디피(BODIPY) 시리즈, DY 시리즈, 로다민 유도체(rhodamine derivatives), 플루오레신 유도체(fluorescein derivatives), 쿠마린 유도체(coumarin derivatives) 등이 될 수 있고, Cy 시리즈인 것이 바람직하며 Cy 시리즈 중 Cy3인 것이 더욱 바람직하다. 여기서 광스위치 역할을 하는 상기 광변색 물질인 디아릴에텐 유도체에 의해 Cy3의 형광이 켜지고 꺼지게 된다. In addition, the fluorescent material is Cyanine (hereinafter referred to as "Cy") series, Alexa Fluor series, BODIPY series, DY series, rhodamine derivatives, fluorescein derivatives ), Coumarin derivatives, and the like, preferably in the Cy series, and more preferably in the Cy series. Here, the fluorescence of Cy3 is turned on and off by the diarylethene derivative which is a photochromic material serving as an optical switch.

나아가, 본 발명에 따른 광변색화합물로 가교된 덴드리머 나노클러스터 구조에 기반한 고대비 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치는 단일 덴드리머 상태가 아닌 광변색 물질인 디아릴에텐을 가교제로 사용하여 복수개의 덴드리머를 방사상으로 연결시킨 나노클러스터 형태로 존재한다. 덴드리머 나노클러스터의 상태는 형광이 켜졌을 때의 강도가 단일 덴드리머일 때보다 더 세어지므로 형광이 꺼졌을 때와의 대비가 더욱 뚜렷해지는 이점이 있다.
Furthermore, the reversible fluorescent switch for high-contrast biological imaging based on the dendrimer nanocluster structure crosslinked with the photochromic compound according to the present invention uses a plurality of dendrimers by using diarylethene, a photochromic material as a crosslinking agent, rather than a single dendrimer state. It exists in the form of radially linked nanoclusters. The state of the dendrimer nanocluster has the advantage that the intensity when the fluorescence is turned on is stronger than that of the single dendrimer, so that the contrast with the fluorescence is turned off becomes more pronounced.

또한, 본 발명에 따른 광변색화합물로 가교된 덴드리머 나노클러스터 구조에 기반한 고대비 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치는 FRET 원리에 따라 가역적 형광 스위칭이 수행될 수 있다. 이때, 상기 광변색 물질인 디아릴에텐의 고리 닫힘 형태(ring-closed form)일 때 FRET 받개(acceptor)로 사용되고 형광물질이 FRET 주개(donor)로 사용되어 가시광 영역의 빛이 조사되었을 때 형광이 켜지고, 자외선 영역의 빛이 조사되었을 때 형광이 꺼져 가역적 스위칭을 가능하게 한다.
In addition, the reversible fluorescence switch for high contrast biological imaging based on the dendrimer nanocluster structure crosslinked with the photochromic compound according to the present invention can be performed in accordance with the FRET principle. In this case, when the ring-closed form of the diaryl ethene, the photochromic material, is used as an FRET acceptor and the fluorescent material is used as a FRET donor, the fluorescent material is irradiated with light in the visible region. Is turned on and the fluorescence is turned off when light in the ultraviolet region is irradiated to enable reversible switching.

나아가, 본 발명에 따른 광변색화합물로 가교된 덴드리머 나노클러스터 구조에 기반한 고대비 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치는 인간과 유사한 유전자 서열을 가진 지브라 피쉬의 경우 피부투과(permeation)를 통해 생체 내 주입될 수 있다. 일반적으로 특히, 나노물질의 경우 체내 주사(microinjection) 방법을 통해 생체 내 주입이 가능한데 반해, 본 발명에 따른 가역성 형광 스위치는 체내 주사 뿐만 아니라, 배양을 통한 피부투과로 주입이 가능하여 생체 내 및 생체 외 영상화 또는 탈체(ex vivo) 세포 추적(cell tracking)에 유용하게 사용될 수 있다.
Furthermore, the reversible fluorescent switch for high contrast bioimaging based on the dendrimer nanocluster structure cross-linked with the photochromic compound according to the present invention is injected in vivo through skin permeation in the case of zebrafish with a gene sequence similar to humans. Can be. In general, in particular, in the case of nanomaterials can be injected in vivo through a microinjection method, the reversible fluorescent switch according to the present invention can be injected into the skin through the culture as well as in vivo injection, and thus in vivo and in vivo It can be usefully used for external imaging or ex vivo cell tracking.

또한, 본 발명에 따른 광변색화합물로 가교된 덴드리머 나노클러스터 구조에 기반한 고대비 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치는 고대비 영상(high-contrast imaging)이 유리한 기타의 생체 내 질병진단 영상화 방법과 결합하여 복합모드 영상을 얻을 목적으로 사용될 수 있고, 상기 기타의 생체 내 질병진단 영상화 방법은 자기공명영상화 방법(MRI), 컴퓨터 단층촬영 방법(CT), 양전자 방출 단층촬영 방법(PET), 단일 광자 방출 전산화 단층촬영 방법(SPECT) 등일 수 있으며 이를 이용한 약물 표적화를 통해 질병진단 및 치료에 적용할 수도 있다.
In addition, a reversible fluorescence switch for high contrast bioimaging based on a dendrimer nanocluster structure crosslinked with a photochromic compound according to the present invention is combined with other in vivo disease diagnostic imaging methods where high-contrast imaging is advantageous. It can be used for the purpose of obtaining a composite mode image, the other disease diagnosis imaging method in vivo, magnetic resonance imaging (MRI), computed tomography (CT), positron emission tomography (PET), single photon emission computerization It may be tomography method (SPECT) and the like and may be applied to diagnosis and treatment of diseases through drug targeting using the same.

또한, 본 발명은 상기 광변색화합물로 가교된 덴드리머 나노클러스터 구조에 기반한 고대비 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치의 제조방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method of manufacturing a reversible fluorescent switch for high-contrast biological imaging based on the dendrimer nanocluster structure cross-linked with the photochromic compound.

본 발명에 따른 광변색화합물로 가교된 덴드리머 나노클러스터 구조에 기반한 고대비 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치는 나노클러스터를 형성할 복수개의 적절한 덴드리머와 각각의 덴드리머를 서로 연결시키면서 FRET 반응시 FRET 받개 역할을 수행하는 광변색 물질을 반응시킨 후 얻어진 덴드리머 나노클러스터를 다시 FRET 반응시 FRET 주개 역할을 수행하는 다양한 종류의 형광물질과 반응시켜 얻어질 수 있다. A reversible fluorescent switch for high contrast bioimaging based on a dendrimer nanocluster structure crosslinked with a photochromic compound according to the present invention serves as a FRET acceptor during FRET reaction by connecting a plurality of suitable dendrimers and respective dendrimers to form nanoclusters with each other. The dendrimer nanoclusters obtained after reacting the photochromic material to be carried out may be obtained by reacting with various kinds of fluorescent materials which play a role of FRET donor during FRET reaction.

상기 제조방법을 폴리아미도아민 덴드리머 나노클러스터 제조방법을 예로 하여 구체적으로 설명한다.
The production method will be described in detail using the polyamidoamine dendrimer nanocluster production method as an example.

본 발명의 일실시형태에 따른 폴리아미도아민 덴드리머(PAMAM) 나노클러스터는 하기 반응식 1에 나타난 바와 같이,Polyamidoamine dendrimer (PAMAM) nanoclusters according to one embodiment of the present invention, as shown in Scheme 1 below,

제5세대 PAMAM 덴드리머(2)와 광변색 물질인 디아릴에텐(3)을 반응시켜 덴드리머 나노클러스터(4)를 제조하는 단계(단계 1); 및Preparing a dendrimer nanocluster (4) by reacting a fifth generation PAMAM dendrimer (2) with a diarylethene (3) which is a photochromic material (step 1); And

상기 단계 1에서 얻어진 덴드리머 나노클러스터(4)를 Cy3-NHS(N-hydroxysuccinimide, 이하 "NHS")(5)와 반응시켜 덴드리머 표면에 형광물질 Cy3가 결합된 덴드리머 나노클러스터(6)를 제조하는 단계(단계 2)를 포함하여 이루어지는 제조방법에 의해 제조될 수 있다. Reacting the dendrimer nanocluster (4) obtained in step 1 with Cy3-NHS (N-hydroxysuccinimide, hereinafter "NHS") (5) to prepare a dendrimer nanocluster 6 bonded to the fluorescent material Cy3 on the dendrimer surface It can be manufactured by a manufacturing method comprising (step 2).

[반응식 1][Reaction Scheme 1]

Figure pat00016
Figure pat00016

이하, 본 발명의 일실시형태에 따른 상기 PAMAM 덴드리머 나노클러스터의 제조방법을 단계별로 상세히 설명한다. Hereinafter, a method of manufacturing the PAMAM dendrimer nanocluster according to an embodiment of the present invention will be described in detail step by step.

단계 1:Step 1:

상기 단계 1은 제5세대 PAMAM 덴드리머(2)와 광변색 물질인 디아릴에텐(3)을 반응시켜 덴드리머 나노클러스터(4)를 제조하는 단계이다.Step 1 is a step of preparing a dendrimer nanocluster (4) by reacting the fifth generation PAMAM dendrimer (2) and the photochromic material diarylethene (3).

구체적으로, 상기 반응은 상기 제5세대 PAMAM 덴드리머(2) 표면의 아민기와 광변색 물질인 디아릴에텐(3)의 말단기인 카르복실산을 결합시키는 단계로 벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오르포스페이트(benzotriazol-1-yl-oxy tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate, 이하 "PyBOP")을 사용하여 디메틸설폭사이드(DMSO) 용매하에서 수행하여 상기 덴드리머 나노클러스터(4)를 수득한다.
Specifically, the reaction is a step of combining amine group on the surface of the fifth generation PAMAM dendrimer (2) with carboxylic acid, which is a terminal group of the diarylethene (3), a photochromic material, and benzotriazol-1-yl-oxy The dendrimer nanocluster 4 is obtained by performing in dimethylsulfoxide (DMSO) solvent using tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (benzotriazol-1-yl-oxy tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate, hereinafter "PyBOP").

단계 2:Step 2:

본 발명에 따른 상기 단계 2는 단계 1에서 제조된 덴드리머 나노클러스터(4) 표면에 Cy3-NHS(5)를 결합시켜 표면에 형광물질이 도입된 덴드리머 나노클러스터(6)를 제조하는 단계이다.Step 2 according to the present invention is a step of preparing a dendrimer nanocluster 6 in which a fluorescent material is introduced to the surface by combining Cy3-NHS (5) to the dendrimer nanocluster (4) surface prepared in step 1.

구체적으로, 상기 덴드리머 나노클러스터(4)를 물과 메탄올의 혼합용매에 녹인 후 상온에서 Cy3-NHS(5)와 14시간 동안 반응시켜 덴드리머 나노클러스터(6)를 수득한다.
Specifically, the dendrimer nanocluster 4 is dissolved in a mixed solvent of water and methanol, and then reacted with Cy3-NHS (5) at room temperature for 14 hours to obtain a dendrimer nanocluster 6.

또한, 본 발명의 일실시형태에 있어서, 하기 반응식 2에 나타난 바와 같이, 형광물질인 Cy3가 결합된 덴드리머 나노클러스터(6)에 숙신산 무수물(7)을 반응시키는 단계(단계 A) 또는 비교적 짧은 mOEG의 일종인 mTEG(tetra(ethylene glycol)methyl ether)가 결합되도록 mTEG-NHS(8)와 반응시키는 단계(단계 B)를 더 포함하여 각각 음이온 표면을 갖는 덴드리머 나노클러스터(1a) 또는 중성 표면을 갖는 덴드리머 나노클러스터(1b)를 제조할 수 있다.Further, in one embodiment of the present invention, as shown in Scheme 2 below, reacting the succinic anhydride (7) to the dendrimer nanocluster 6 to which the fluorescent substance Cy3 is bound (step A) or a relatively short mOEG It further comprises the step (step B) of reacting with mTEG-NHS (8) to bind mTEG (tetra (ethylene glycol) methyl ether) is a kind of dendrimer nanoclusters (1a) having an anionic surface or a neutral surface The dendrimer nanocluster 1b can be manufactured.

[반응식 2]Scheme 2

Figure pat00017
Figure pat00017

이하, 상기 단계 A 및 단계 B를 더욱 상세히 설명한다.Hereinafter, step A and step B will be described in more detail.

단계 A:Step A:

상기 단계 A는 상기 단계 2에서 제조된 덴드리머 나노클러스터(6)를 숙신산 무수물(7)과 반응시켜 음이온성 표면을 갖는 덴드리머 나노클러스터(1a)를 제조하는 단계이다.Step A is a step of preparing the dendrimer nanoclusters 1a having an anionic surface by reacting the dendrimer nanoclusters 6 prepared in step 2 with succinic anhydride 7.

구체적으로, 상기 덴드리머 나노클러스터(6)가 담긴 용액에 숙신산 무수물(7)을 첨가하여 상온에서 3일 정도 교반시켜 표면 전하가 카르복실레이트 음이온에 의해 음이온성으로 개질된 덴드리머 나노클러스터(1a)를 수득할 수 있다.
Specifically, the succinic anhydride (7) is added to the solution containing the dendrimer nanocluster (6) and stirred for about three days at room temperature to obtain a dendrimer nanocluster (1a) whose surface charge is anionic modified by a carboxylate anion. Can be obtained.

단계 B:Step B:

상기 단계 B는 상기 단계 2에서 제조된 덴드리머 나노클러스터(6)를 mTEG-NHS(8)와 반응시켜 중성 표면을 갖는 덴드리머 나노클러스터(1b)를 제조하는 단계이다.Step B is a step of preparing the dendrimer nanoclusters 1b having a neutral surface by reacting the dendrimer nanoclusters 6 prepared in step 2 with mTEG-NHS (8).

구체적으로, 상기 덴드리머 나노클러스터(6)가 담긴 용액에 mTEG-NHS(8)를 첨가하여 상온에서 3시간 정도 교반시켜 표면 전하가 중성인 덴드리머 나노클러스터(1b)를 수득할 수 있다.
Specifically, mTEG-NHS (8) is added to the solution containing the dendrimer nanoclusters 6 and stirred at room temperature for about 3 hours to obtain a dendrimer nanoclusters 1b having a neutral surface charge.

상기 단계 A 또는 단계 B는 덴드리머 나노클러스터의 표면 전하를 각각 음이온 또는 중성으로 만들기 위해 수행하는 단계이다. 주의할 점은 상기 단계 B에서 사용되는 mTEG 대신에 폴리에틸렌 글라이콜 분자량이 비교적 큰 (예, 2000이상) 사슬 길이가 긴 mPEG을 사용하면 일반적으로 서로 응집하는 경향이 있어 독성이 오히려 증가하므로 특히 여기에서와 같이 대부분의 표면에 mPEG을 치환하게 되는 경우, 상대적으로 짧은 4개 정도의 폴리에틸렌 글라이콜 즉, 올리고에틸렌글라이콜 반복단위(repeat unit)를 포함하는 mTEG가 사용되는 것이 바람직하다.
Step A or Step B is performed to make the surface charge of the dendrimer nanocluster anion or neutral, respectively. Note that instead of mTEG used in step B, when mPEG having a relatively high molecular weight of polyethylene glycol (e.g., more than 2000) and having a long chain length generally tends to agglomerate with each other, the toxicity is rather increased. When mPEG is substituted on most surfaces as in the case, it is preferable that mTEG including four relatively short polyethylene glycols, that is, oligoethylene glycol repeat units, is used.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples and Experimental Examples.

단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
However, the following examples are merely to illustrate the present invention, but the content of the present invention is not limited to the following examples.

<제조예 1> 광변색 물질 DAE(3)의 제조Preparation Example 1 Preparation of Photochromic Substance DAE (3)

단계 1: 중간체 화합물(11)의 제조Step 1: Preparation of Intermediate Compound (11)

Figure pat00018
Figure pat00018

DMF(40 mL)에 화학식 9의 디아릴에텐 디페놀(500 mg, 0.905 mmol) 및 화학식 10의 링커(761 mg, 1.81 mmol)를 녹이고 여기에 오븐에서 건조된 K2CO3(376 mg, 2.72 mmol)를 가하였다. 상기 반응 혼합물을 90 ℃에서 10시간 동안 교반한 후, 상온으로 식히고 감압조건에서 농축하였다. 상기 잔여물은 메틸렌클로라이드(CH2Cl2)(100 mL)에 용해시키고, 물(50 mL × 3)로 씻어낸 후 유기층을 MgSO4로 건조시켰다. 감압하에서 용매를 제거한 후, 크루드 생성물을 실리카겔 크로마토그래피(ethyl acetate (EtOAc))하여 750 mg의 목적물인 화학식 11의 화합물을 얻었다(0.715 mmol, 79%).In DMF (40 mL) was dissolved diarylethene diphenol of formula 9 (500 mg, 0.905 mmol) and linker of formula 10 (761 mg, 1.81 mmol) and dried in an oven in K 2 CO 3 (376 mg, 2.72 mmol) was added. The reaction mixture was stirred at 90 ° C. for 10 hours, then cooled to room temperature and concentrated under reduced pressure. The residue was dissolved in methylene chloride (CH 2 Cl 2 ) (100 mL), washed with water (50 mL × 3) and the organic layer was dried over MgSO 4 . After removing the solvent under reduced pressure, the crude product was subjected to silica gel chromatography (ethyl acetate (EtOAc)) to obtain 750 mg of the target compound of formula 11 (0.715 mmol, 79%).

Rf: 0.60 [실리카겔, 15:1 CH2Cl2/메탄올(MeOH)]; R f : 0.60 [silica gel, 15: 1 CH 2 Cl 2 / methanol (MeOH)];

1H NMR (500 MHz, DMSO-d6; ring-open isomer) δ 7.54 (d, 4H, J = 8.6 Hz, H3o), 7.35 (s, 2H, H2o), 6.99 (d, 4H, J = 9.0 Hz, H4o), 4.12 (4.123) (s, 4H, H13), 4.12 (4.117) (t, 4H, J = 4.6 Hz, H5), 3.75 (t, 4H, J = 4.7 Hz, H6), 3.63 (s, 6H, H14), 3.60-3.51 (m, 24H, H7, H8, H9, H10, H11, 및 H12), 1.96 (s, 6H, H1o); 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ; ring-open isomer) δ 7.54 (d, 4H, J = 8.6 Hz, H 3o ), 7.35 (s, 2H, H 2o ), 6.99 (d, 4H, J = 9.0 Hz, H 4o ), 4.12 (4.123) (s, 4H, H 13 ), 4.12 (4.117) (t, 4H, J = 4.6 Hz, H 5 ), 3.75 (t, 4H, J = 4.7 Hz, H 6 ), 3.63 (s, 6H, H 14 ), 3.60-3.51 (m, 24H, H 7 , H 8 , H 9 , H 10 , H 11 , and H 12 ), 1.96 (s, 6H, H 1o );

13C NMR (100 MHz, DMSO-d6; ring-open isomer) δ 170.6, 158.5, 141.7, 140.0, 126.7, 125.2, 124.9, 121.1, 115.1, 70.0, 69.9, 69.8, 69.7 (69.709), 69.7 (69.683), 68.8, 67.6, 67.3, 51.3, 14.0; 13 C NMR (100 MHz, DMSO-d 6 ; ring-open isomer) δ 170.6, 158.5, 141.7, 140.0, 126.7, 125.2, 124.9, 121.1, 115.1, 70.0, 69.9, 69.8, 69.7 (69.709), 69.7 (69.683 ), 68.8, 67.6, 67.3, 51.3, 14.0;

HRMS (ESI) Calcd for C49H58F6O14S2Na (M + Na)+: 1071.3064, Found: 1071.3063.
HRMS (ESI) Calcd for C 49 H 58 F 6 O 14 S 2 Na (M + Na) + : 1071.3064, Found: 1071.3063.

단계 2: Step 2: DAEDAE (3)의 제조(3) Preparation

Figure pat00019

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상기 단계 1에서 얻은 화학식 11의 중간체 화합물(341 mg, 0.325 mmol)을 THF(5.2 mL)에 녹이고, 1N LiOH 수용액(1.30 mL)을 0 ℃에서 천천히 가하였다. 상기 반응 혼합물에 메탄올(1.3 mL)을 가하여 균일상을 만들고 이를 50 ℃에서 1시간 30분 동안 환류시킨 후 상온에서 밤새도록 교반하였다. 0 ℃에서 2N의 KHSO4 수용액을 가하여 pH 4-5의 중성 반응물을 만들고 상기 혼합물을 3시간 동안 교반하며 상온까지 천천히 온도를 상승시켰다. 상기 크루드 혼합물을 DMF에서 짧은 SEC(size exclusion chromatography) 컬럼(Bio-Beads S-X1, H 6 cm × O.D. 0.7 cm)으로 여과하여 염을 제거하고, SEC 컬럼(Sephadex LH-20, H 37 cm × O.D. 3.0 cm)에 로딩하여 메탄올로 정제하였다. 상기 푸르스름한 컬럼 프랙션을 모아 감압하에서 농축하고 진공상태에서 건조시켜 345 mg의 화학식 3의 화합물을 코발트 색깔의 고체로 얻었다(0.337 mmol, 100%).The intermediate compound of formula 11 (341 mg, 0.325 mmol) obtained in step 1 was dissolved in THF (5.2 mL), and a 1N LiOH aqueous solution (1.30 mL) was slowly added at 0 ° C. Methanol (1.3 mL) was added to the reaction mixture to make a homogeneous phase, which was refluxed at 50 ° C. for 1 hour 30 minutes and stirred overnight at room temperature. 2N aqueous KHSO 4 solution was added at 0 ° C. to form a neutral reaction product having a pH of 4-5. The mixture was stirred for 3 hours and slowly raised to room temperature. The crude mixture was filtered over a short size exclusion chromatography (SEC) column (Bio-Beads S-X1, H 6 cm × OD 0.7 cm) in DMF to remove salts, and SEC column (Sephadex LH-20, H 37 cm). OD 3.0 cm) and purified with methanol. The bluish column fractions were combined, concentrated under reduced pressure and dried in vacuo to yield 345 mg of the compound of formula 3 as a cobalt colored solid (0.337 mmol, 100%).

1H NMR (500 MHz, DMSO-d6; ring-open isomer) δ 7.53 (d, 4H, J = 8.5 Hz, H3o), 7.32 (s, 2H, H2o), 6.99 (d, 4H, J = 8.7 Hz, H4o), 4.12 (t, 4H, J = 4.6 Hz, H5), 3.75 (t, 4H, J = 4.5 Hz, H6), 3.68 (s, 4H, H13), 3.60-3.50 (m, 24H, H7, H8, H9, H10, H11, 및 H12), 1.98 (s, 6H, H1o); 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ; ring-open isomer) δ 7.53 (d, 4H, J = 8.5 Hz, H 3o ), 7.32 (s, 2H, H 2o ), 6.99 (d, 4H, J = 8.7 Hz, H 4o ), 4.12 (t, 4H, J = 4.6 Hz, H 5 ), 3.75 (t, 4H, J = 4.5 Hz, H 6 ), 3.68 (s, 4H, H 13 ), 3.60- 3.50 (m, 24H, H 7 , H 8 , H 9 , H 10 , H 11 , and H 12 ), 1.98 (s, 6H, H 1o );

13C NMR (100 MHz, DMSO-d6; ring-open isomer) δ 172.0, 158.5, 140.0, 126.7, 125.2, 124.9, 121.3, 115.2, 70.1, 69.9, 69.7 (69.740), 69.7 (69.686), 69.6, 69.1, 68.9, 67.3, 14.0; 13 C NMR (100 MHz, DMSO-d 6 ; ring-open isomer) δ 172.0, 158.5, 140.0, 126.7, 125.2, 124.9, 121.3, 115.2, 70.1, 69.9, 69.7 (69.740), 69.7 (69.686), 69.6, 69.1, 68.9, 67.3, 14.0;

HRMS (ESI) Calcd for C47H53F6O14S2 (M - H)-: 1019.2786, Found: 1019.2781.
HRMS (ESI) Calcd for C 47 H 53 F 6 O 14 S 2 (M-H) - : 1019.2786, Found: 1019.2781.

<< 실시예Example 1>  1> 덴드리머Dendrimer 나노클러스터(1a)의 제조 Preparation of Nanocluster 1a

단계 1: Step 1: 덴드리머Dendrimer 나노클러스터(4)의 제조 Preparation of Nanocluster 4

DMSO-d6에 녹인 제조예 1에서 제조된 화합물(3) 90.76 mM 용액(120.0 μL, 10.89 μmol)을 건조된 덴드리머 2(215.0 mg)에 가하고, 상기 혼합물을 무수 DMSO(20 mL)에서 격렬하게 초음파처리하여 완전히 용해시켰다. 상기 용액에 DIEA(N,N-디이소프로필에틸아민, N,N-Diisopropylethylamine)(10.0 μL, 57.4 μmol)를 추가한 후, 준비해 놓은 DMSO에 새로 녹인 20.0 mg/mL의 PyBOP 용액(500 μL, 19.2 μmol)을 가하였다. 반응 용기에 아르곤 기체를 채운 후 상온에서 22시간 동안 교반시켰다. 그 후, 상기 반응 혼합물을 교반하며 이소프로판올(24 시간) 및 메탄올(× 2, 각각 24 시간)상에서 투석(Spectra/Por Biotech Regenerated Cellulose (RC) membrane, MWCO 3500, Spectrum Laboratories)하였다. 감압하에서 용매를 제거한 후, 상기 크루드 생성물을 짧은 SEC 컬럼(Sephadex LH-20, H 6 cm × O.D. 0.7 cm)으로 첫 번째 여과를 한 후, SEC(Sephadex LH-20, H 40 cm × O.D. 3.0 cm)로 모두 메탄올을 사용하여 정제하였다. 닌하이드린에 의해 스테인이 된 첫번째로 나온 푸르스름한 밴드가 원하는 생성물임을 1H NMR으로 확인하였다. 상기 SEC 부분을 합치고(이때, 가장 처음과 마지막 부분은 분산도를 줄이기 위하여 합치지 않았다) 진공하에서 건조시켜 덴드리머 나노클러스터(4)를 푸른색 고체로 143.2 mg만큼 얻었다.90.76 mM solution (120.0 μL, 10.89 μmol) of compound (3) prepared in Preparation Example 1 dissolved in DMSO-d 6 was added to dried dendrimer 2 (215.0 mg), and the mixture was violated in anhydrous DMSO (20 mL). Sonicate to dissolve completely. DIEA (N, N-diisopropylethylamine, N, N-Diisopropylethylamine) (10.0 μL, 57.4 μmol) was added to the solution, and then 20.0 mg / mL PyBOP solution (500 μL, freshly dissolved in prepared DMSO) was added. 19.2 μmol) was added. After filling the reaction vessel with argon gas, the mixture was stirred at room temperature for 22 hours. The reaction mixture was then stirred with dialysis (Spectra / Por Biotech Regenerated Cellulose (RC) membrane, MWCO 3500, Spectrum Laboratories) on isopropanol (24 hours) and methanol (× 2, 24 hours each). After removing the solvent under reduced pressure, the crude product was first filtered through a short SEC column (Sephadex LH-20, H 6 cm × OD 0.7 cm), followed by SEC (Sephadex LH-20, H 40 cm × OD 3.0). cm) were all purified using methanol. 1 H NMR confirmed that the first bluish band stained with ninhydrin was the desired product. The SEC portions were combined (where the first and last portions were not combined to reduce dispersion) and dried under vacuum to give 143.2 mg of dendrimer nanocluster 4 as a blue solid.

1H NMR (600 MHz, 1:1 CD3OD/DMSO-d6) δ 8.16-7.94 (m, 9.39H, NHG5, NHG4, NHG3, NHG2, NHG1, NHG0, 및 NHDAE), 7.46 (m, 1.48H, H3), 7.20 (s, 0.67H, H2), 6.92 (m, 1.53H, H4), 4.08 (m, 2.20H, H5), 3.86 (s, 1.38H, H13), 3.73 (m, 2.44H, H6), 3.59-3.52 (m, 9.87H, H7, H8, H9, H10, H11, 및 H12), 3.12 (m, Hd, Hf, HfDAE, 및 HgDAE), 2.67 (m, 99.77H, Hb), 2.61 (m, 47.96H, Hg), 2.45 (m, 51.14H, He 및 Ha), 2.23 (m, 100H, Hc), 1.92 (s, 2.07H, H1).
 1 H NMR (600 MHz, 1: 1 CD 3 OD / DMSO-d 6 ) δ 8.16-7.94 (m, 9.39H, NH G5 , NH G4 , NH G3 , NH G2 , NH G1 , NH G0 , and NH DAE ), 7.46 (m, 1.48H, H 3 ), 7.20 (s, 0.67H, H 2 ), 6.92 (m, 1.53H, H 4 ), 4.08 (m, 2.20H, H 5 ), 3.86 (s, 1.38H, H 13 ), 3.73 (m, 2.44H, H 6 ), 3.59-3.52 (m, 9.87H, H 7 , H 8 , H 9 , H 10 , H 11 , and H 12 ), 3.12 (m , H d , H f , H fDAE , and H gDAE ), 2.67 (m, 99.77H, H b ), 2.61 (m, 47.96H, H g ), 2.45 (m, 51.14H, H e and H a ) , 2.23 (m, 100H, H c ), 1.92 (s, 2.07 H, H 1 ).

단계 2: Step 2: 덴드리머Dendrimer 나노클러스터(6)의 제조 Fabrication of Nanoclusters 6

상기 단계 1에서 제조한 덴드리머 나노클러스터(4)(48.4 mg)를 격렬하게 초음파 처리하여 메탄올(1 mL) 및 물(2 mL)의 혼합물에 용해시키고 DIEA (30.0 μL, 172 μmol)를 가하였다. 교반을 계속하며, 100 μL의 DMSO-d6에 녹인 Cy3 모노 NHS 에스터(1.0 mg, 75.87% reactive chromophore content, 0.991 μmol)를 상기 혼합물에 1분에 걸쳐 방울방울 모두 가하였다. 상기 반응은 빛이 차단된 상태에서 상온에서 14시간 동안 교반하였다. 상기 크루드(crude) 생성물은 별도의 정제없이 다음 단계에서 사용되었다.
The dendrimer nanocluster 4 (48.4 mg) prepared in step 1 above was violently sonicated, dissolved in a mixture of methanol (1 mL) and water (2 mL) and DIEA (30.0 μL, 172 μmol) was added. Stirring was continued, and all of the drops of Cy3 mono NHS ester (1.0 mg, 75.87% reactive chromophore content, 0.991 μmol) dissolved in 100 μL of DMSO-d 6 were added dropwise to the mixture over 1 minute. The reaction was stirred at room temperature for 14 hours while the light was blocked. The crude product was used in the next step without further purification.

단계 3: Step 3: 음이온성Anionic 표면을 갖는  Having a surface 덴드리머Dendrimer 나노클러스터(1a)의 제조 Preparation of Nanocluster 1a

상기 단계 2에서 얻은 덴드리머 나노클러스터(6)의 크루드 생성물(1.63 mL)에 DMSO-d6 (500 μL)에 녹인 숙신산 무수물(succinic anhydride) (91.1 mg, 910 μmol)을 가하였다. 본 반응은 빛이 차단된 상태에서 상온에서 3일 동안 격렬하게 교반시켰다. 빛이 차단된 상태에서, 상기 크루드 혼합물을 먼저 정제수를 이용하여 짧은 SEC 컬럼(Sephadex G-25, H 4 cm × O.D. 1.7 cm)으로 여과하고, 추가로 정제수를 이용하여 SEC 컬럼(Sephadex G-25, H 37 cm × O.D. 4.5 cm)으로 정제하였다. 첫번째로 나온 강한 핑크색 밴드에 원하는 화합물이 포함되어 있는 것을 1H NMR로 확인하고 그 SEC 부분을 모은 후, 감압하에서 물을 제거하고 잔여물을 건조시켜 31.7 mg의 목적 화합물(1a)을 핑크색 고체로 얻었다.To the crude product (1.63 mL) of the dendrimer nanocluster 6 obtained in step 2 was added succinic anhydride (91.1 mg, 910 μmol) dissolved in DMSO-d 6 (500 μL). The reaction was vigorously stirred for 3 days at room temperature in the state of blocking light. In the light-blocked state, the crude mixture is first filtered through a purified SEC water (Sephadex G-25, H 4 cm × OD 1.7 cm) using purified water, and further purified SEC water (Sephadex G- 25, H 37 cm x OD 4.5 cm). Confirm by 1 H NMR that the first strong pink band contains the desired compound, collect the SEC portion, remove the water under reduced pressure and dry the residue to convert 31.7 mg of the target compound (1a) into a pink solid. Got it.

1H NMR (600 MHz, D2O) δ 8.61 (t, 0.22H, J = 13.2 Hz, H8 ′), 7.95 (m, 0.35H, H5 ′ 및 H11 ′), 7.91-7.89 (m, 0.55H, H4 ′및 H12 ′), 7.63 (m, 0.54H, H3), 7.46-7.44 (m, 0.61H, H3 ′및 H13 ′), 7.39 (m, H2), 7.09 (m, 0.69H, H4), 6.43 (m, 0.45H, H7 ′ 및 H9 ′), 4.27 (m, H5), 4.20 (m, H2 ′), 4.16 (m, H14 ′), 3.57-3.49 (m, 82.66H, Hd, HfDAE, HgDAE, HfCy3, HgCy3, HfSA, 및 HgSA), 3.34 (m, Hb), 3.18 (m, He 및 Ha), 2.69 (m, 145.59H, Hc 및 H1SA), 2.48 (m, 122.35H, H2SA), 1.90 (m, H15 ′), 1.80 (m, 2.14H, H6 ′ 및 H10 ′), 1.44 (m, 1.44H, H1 ′).
 1 H NMR (600 MHz, D 2 O) δ 8.61 (t, 0.22H, J = 13.2 Hz, H 8 ′ ), 7.95 (m, 0.35H, H 5 ′ and H 11 ′ ), 7.91-7.89 (m , 0.55H, H 4 ′ and H 12 ′ ), 7.63 (m, 0.54H, H 3 ), 7.46-7.44 (m, 0.61H, H 3 ′ and H 13 ′ ), 7.39 (m, H 2 ), 7.09 (m, 0.69H, H 4 ), 6.43 (m, 0.45H, H 7 ′ and H 9 ′ ), 4.27 (m, H 5 ), 4.20 (m, H 2 ′ ), 4.16 (m, H 14 ′ ), 3.57-3.49 (m, 82.66H, H d , H fDAE , H gDAE , H fCy3 , H gCy3 , H fSA , and H gSA ), 3.34 (m, H b ), 3.18 (m, H e and H a), 2.69 (m, 145.59H, H c , and H 1SA), 2.48 (m, 122.35H, H 2SA), 1.90 (m, H 15 '), 1.80 (m, 2.14H, H 6' and H 10 ′ ), 1.44 (m, 1.44 H, H 1 ′ ).

<< 실시예Example 2> 중성 표면을 갖는  2> having a neutral surface 덴드리머Dendrimer 나노클러스터(1b)의 제조 Preparation of Nanocluster 1b

상기 실시예 1의 단계 1 및 단계 2와 동일한 방법으로 수행하여 얻은 화학식 6의 덴드리머 나노클러스터의 크루드 생성물(1.50 mL)을 따로 다른 플라스크에 옮겨 담고 DMSO-d6(500 μL)에 녹인 mTEG-NHS(8)(146 mg, 439 μmol)를 상기 혼합물에 가하였다. 본 반응은 빛이 차단된 상태에서 상온에서 3일 동안 격렬하게 교반시켰다. 빛이 차단된 상태에서, 상기 크루드 생성물을 먼저 정제수를 이용하여 짧은 SEC 컬럼(Sephadex G-25, H 4 cm × O.D. 1.7 cm)으로 여과하고, 정제수를 이용하여 SEC 컬럼(Sephadex G-25, H 37 cm × O.D. 4.5 cm)으로 정제하였다. 첫번째로 나온 강한 핑크색 밴드에 원하는 화합물이 포함되어 있는 것을 1H NMR로 확인하고 그 SEC 부분을 모은 후, 감압하에서 물을 제거하고 잔여물을 건조시켜 30.5 mg의 목적 화합물(1b)을 핑크색 고체로 얻었다.The crude product (1.50 mL) of the dendrimer nanocluster of Chemical Formula 6 obtained by performing the same method as in Step 1 and Step 2 of Example 1 was transferred to another flask and mTEG- dissolved in DMSO-d 6 (500 μL). NHS (8) (146 mg, 439 μmol) was added to the mixture. The reaction was vigorously stirred for 3 days at room temperature in the state of blocking light. In the light-blocked state, the crude product is first filtered through a short SEC column (Sephadex G-25, H 4 cm × OD 1.7 cm) using purified water, and a SEC column (Sephadex G-25, H 37 cm x OD 4.5 cm). 1 H NMR confirmed that the first strong pink band contained the desired compound, collected the SEC portion, removed water under reduced pressure and dried the residue to convert 30.5 mg of the target compound (1b) into a pink solid. Got it.

1H NMR (600 MHz, D2O) δ 7.95 (m, H5 ′ 및 H11 ′), 7.92 (m, H4 ′ 및 H12 ′), 7.62 (m, 0.37H, H3), 7.49-7.46 (m, 0.62H, H3 ′ 및 H13 ′), 7.37 (m, 0.43H, H2), 7.09 (m, 0.42H, H4), 3.80 (m, 50.68H, J = 6.1 Hz, H8PEG), 3.41 (s, 70.15H, H1PEG), 3.35 (m, 132.33H, Hd, HfDAE, HgDAE, HfCy3, HgCy3, HfPEG, 및 HgPEG), 2.84 (m, 100H, Hb), 2.66 (m, 48.17H, He 및 Ha), 2.55 (t, 43.68H, J = 6.1 Hz, H9PEG), 2.50 (t, J = 6.8 Hz, H18 ′), 2.44 (m, 103.74H, Hc), 2.01 (m, 0.75H, H1), 1.81 (m, 0.53H, H6 ′ 및 H10 ′).
 1 H NMR (600 MHz, D 2 O) δ 7.95 (m, H 5 ′ and H 11 ′ ), 7.92 (m, H 4 ′ and H 12 ′ ), 7.62 (m, 0.37 H, H 3 ), 7.49 -7.46 (m, 0.62H, H 3 ′ and H 13 ′ ), 7.37 (m, 0.43H, H 2 ), 7.09 (m, 0.42H, H 4 ), 3.80 (m, 50.68H, J = 6.1 Hz , H 8PEG ), 3.41 (s, 70.15H, H 1PEG ), 3.35 (m, 132.33H, H d , H fDAE , H gDAE , H fCy3 , H gCy3 , H fPEG , and H gPEG ), 2.84 (m, 100H, H b), 2.66 ( m, 48.17H, H e , and H a), 2.55 (t, 43.68H, J = 6.1 Hz, H 9PEG), 2.50 (t, J = 6.8 Hz, H 18 '), 2.44 (m, 103.74 H, H c ), 2.01 (m, 0.75 H, H 1 ), 1.81 (m, 0.53 H, H 6 ′ and H 10 ′ ).

<< 실험예Experimental Example 1> 세포 독성 측정( 1> cytotoxicity measurement ( CytotoxicityCytotoxicity AssaysAssays ))

진공 건조시킨 상기 실시예 1 및 2에서 제조한 덴드리머 나노클러스터 1a 및 1b를 30 mg씩 정제수(Millipore Milli-Q) 3.0 mL에 넣어 10 mg/mL 용액으로 용해시켜 모액을 제조하였다. 각 모액은 초음파 처리하여 완전히 녹였다. 무혈청 DMEM 용액을 사용하여 1, 5, 10, 50, 및 100 μg/mL의 농도로 단계적으로 희석된 샘플을 준비하였다. HeLa 세포는 웰당 1×103의 세포가 존재하는 96-웰 플레이트(Corning Costar, Cambridge, MA)에서 5% CO2 하의 조건하에 37 ℃, 24시간 동안 배양하였다. 세포는 각 웰당 100 μL의 상기 희석액 또는 100 μL의 무혈청 DMEM(대조군)으로 처리하고 37 ℃에서 각각 24, 48 및 72시간 동안 5% CO2 하의 조건하에서 배양하였다. 상기 제제는 5 mg/mL 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT)를 녹인 무혈청 DMEM 용액으로 대체하고 세포를 추가로 4시간 동안 배양하였다. MTT를 흡입제거하고 DMSO(100 μL)를 각 웰에 가하여 포르마잔(formazan) 크리스탈을 용해시켰다. 흡광도는 BioRad microplate reader를 이용하여 570 nm에서 측정하였고 그 결과는 도 13에 나타내었다. 상기 분석은 각각 4번씩 반복측정하였다.The mother liquor was prepared by dissolving the dendrimer nanoclusters 1a and 1b prepared in Examples 1 and 2 in 3.0 ml of purified water (Millipore Milli-Q) in 10 ml / mL solution. Each mother liquor was sonicated and completely dissolved. Serum-diluted samples were prepared using serum-free DMEM solutions at concentrations of 1, 5, 10, 50, and 100 μg / mL. HeLa cells were incubated for 24 hours at 37 ° C. under conditions of 5% CO 2 in 96-well plates (Corning Costar, Cambridge, Mass.) Where 1 × 10 3 cells per well were present. Cells were treated with 100 μL of this dilution or 100 μL of serum free DMEM (control) per well and incubated at 37 ° C. under conditions of 5% CO 2 for 24, 48 and 72 hours, respectively. The formulation was replaced with a serum-free DMEM solution dissolved in 5 mg / mL 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and the cells were further 4 hours Incubated for 2 hours. MTT was aspirated off and DMSO (100 μL) was added to each well to dissolve the formazan crystals. Absorbance was measured at 570 nm using a BioRad microplate reader and the results are shown in FIG. 13. The assays were repeated four times each.

도 13에 나타난 바와 같이, 덴드리머 나노클러스터(1a)는 100 μg/mL의 농도일 때 72시간이 지난 후에도 20% 이상의 세포가 생존하였고 덴드리머 나노클러스터(1b)는 동일한 농도 및 시간에서 40% 이상의 세포가 생존함을 확인할 수 있다. 이를 통해 표면이 중성전하를 가진 덴드리머 나노클러스터(1b)가 표면전하가 음전하인 덴드리머 나노클러스터(1a)보다 독성이 적음을 알 수 있었다.
As shown in FIG. 13, the dendrimer nanocluster 1a survived at least 20% after 72 hours at the concentration of 100 μg / mL, and the dendrimer nanocluster 1b was at least 40% at the same concentration and time. You can see that alive. Through this, it was found that the dendrimer nanoclusters 1b having the neutral charge on the surface were less toxic than the dendrimer nanoclusters 1a having the negative charges.

<< 실험예Experimental Example 2> 세포 흡수 측정( 2> cell uptake measurement ( CellularCellular UptakeUptake StudiesStudies ))

HeLa 세포는 Lab-Tek II 8-웰 현미경 샘플 챔버(Nunc)에서 각 웰당 1×104 세포의 밀도로 키웠다. 상기 실시예 1 및 2에서 제조한 덴드리머 나노클러스터 1a 및 1b의 모액 10 mg/mL씩을 무혈청 DMEM으로 묽혀 각 10 μg/mL 및 100 μg/mL의 농도의 용액을 제조하였다. 세포는 각 웰당 200 μL의 희석액으로 처리하고 37 ℃, 5% CO2 하에서 5, 15, 30, 45, 60, 120 및 180분 동안 배양되었다. 동일한 수의 세포를 가진 200 μL의 무혈청 DMEM을 포함하는 웰을 동시에 대조군으로 준비하였다. 세포는 Dulbecco 포스페이트 버퍼 살린(PBS; 1X, pH 7.4, Gibco)으로 세 번 씻어내고 4%의 파라포름알데하이드(PFA)로 20분 동안 상온에서 처리하여 고정화시켰다. 그 뒤에 PBS로 세 번 씻어내어 PFA를 제거하고, PBS에 녹인 2 mg/mL의 4′,6-디아미노-2-페닐인돌(DAPI)로 10분간 처리한 후, PBS로 세번 씻어내었다. 덴드리머 나노클러스터 1a 및 1b의 HeLa 세포 내로의 삽입 양상(internalization profiles)은 RD-TR-PE (λex 555 nm, λem 617 nm) 및/또는 DAPI (λex 360 nm, λem 457 nm) 필터 세트가 장착된 DeltaVision RT 이미징 시스템(Applied Precision)을 이용하여 얻었고 결과를 도 14 및 15에 나타내었다. HeLa cells were grown to a density of 1 × 10 4 cells per well in a Lab-Tek II 8-well microscope sample chamber (Nunc). 10 mg / mL of the mother liquor of the dendrimer nanoclusters 1a and 1b prepared in Examples 1 and 2 were diluted with serum-free DMEM to prepare solutions of concentrations of 10 μg / mL and 100 μg / mL, respectively. Cells were treated with 200 μL of dilution per well and incubated at 37 ° C., 5% CO 2 for 5, 15, 30, 45, 60, 120 and 180 minutes. Wells containing 200 μL of serum-free DMEM with the same number of cells were simultaneously prepared as controls. The cells were washed three times with Dulbecco phosphate buffered saline (PBS; 1X, pH 7.4, Gibco) and fixed with 4% paraformaldehyde (PFA) for 20 minutes at room temperature. Thereafter, washed three times with PBS to remove the PFA, and treated with 2 mg / mL of 4 ', 6-diamino-2-phenylindole (DAPI) dissolved in PBS for 10 minutes, and then washed three times with PBS. The internalization profiles of dendrimer nanoclusters 1a and 1b into HeLa cells were RD-TR-PE (λ ex 555 nm, λ em 617 nm) and / or DAPI (λ ex 360 nm, λ em 457 nm) filters. The set was obtained using a DeltaVision RT imaging system (Applied Precision) equipped with the results shown in FIGS. 14 and 15.

도 14 및 도 15에 나타난 바와 같이, 덴드리머 나노클러스터 1a 및 1b는 시간이 흐를수록 세포 내에 많이 흡수됨을 확인할 수 있었다.
As shown in FIG. 14 and FIG. 15, it was confirmed that the dendrimer nanoclusters 1a and 1b were absorbed into the cells with time.

<< 실험예Experimental Example 3> 샘플 용액에서의  3> in sample solution 포토스위칭Photo Switching 실험( Experiment( PhotoswitchingPhotoswitching experimentsexperiments ))

화학식 3의 디아릴에텐(10 μM), Cy3 화합물(1.0 μM, as a carboxylic acid form of 5), 덴드리머 나노클러스터(1a)(100 μg/mL), 덴드리머 나노클러스터(1b)(100 μg/mL) 및 화학식 3과 Cy3의 혼합물 용액을 각각 정제수 또는 Dulbecco's PBS(1X, pH 7.4, Gibco)에서 1.0 mL 씩 만들어 표준 1회용 큐벳(10 mm path length, 4.5 mL nominal capacity, 4 optical sides, polymethylmethacrylate, Kartell)에 담았다. 샘플 용액을 포함한 상기 큐벳을 샘플 홀더에 고정시키고, 상기 용액을 2분간 UV 램프(365 nm, 115 V, 60 Hz, 0.2 A, 8 W, Spectroline)로 조사하였다. UV 흡광도를 측정하기 위하여, 상기 UV-조사된 샘플 용액을 즉시 세미 마이크로 1회용 큐벳(10 mm path length, 1.6 mL nominal capacity, polymethylmethacrylate, Sarstedt)으로 빛이 차단된 상태에서 옮기고 Beckman Coulter DU 800 스펙트로포토미터를 이용하여 스캔하였다(250-800 nm scan range, 0.5 nm interval, 600 nm/min scan speed). 각각을 UV 스캔하기 전에 블랭크 용액(deionized water/PBS, 1.0 mL)을 레퍼런스로 스캔하였다. 형광 발광을 측정하기 위하여, 상기 UV-조사된 샘플 용액을 즉시 석영 Suprasil 매크로/세미-마이크로 셀(4 mm path length, 0.5 mL nominal capacity, Perkin Elmer)로 빛이 차단된 상태에서 옮기고, Perkin Elmer LS 55 형광 스펙트로미터를 이용하여 스캔하였다(500-700 nm scan range, irradiation at 510 nm, 5 nm excitation slit, 3.5 nm emission slit). 그 후, 상기 샘플 용액을 표준 1회용 큐벳(Kartell)으로 빛이 차단된 상태에서 다시 옮기고 590 nm 레이져 빔(250-255 mW at 590 nm as measured through a magnifier lens at 25 °C, Sail Laser)으로 30분간 조사하였다. 590 nm의 빛으로 조사시, 샘플 용액과 레이져 빔 중간에 확대 렌즈를 두어 샘플 용액의 전 면적에 균일하게 조사되도록 하였다. 590 nm 빛에 의해 조사된 상기 샘플 용액의 흡수 및 방출 스펙트럼은 동일한 방법에 의해 얻어졌다. UV 빛(365 nm)으로 2분 동안 조사된 후 가시광선 빛(590 nm)로 30분간 조사되는 사이클로 이루어지는 단일 포토스위칭 사이클을 5번 반복하여 그 결과를 도 7 내지 12에 나타내었다. Diaryethene of formula 3 (10 μM), Cy3 compound (1.0 μM, as a carboxylic acid form of 5), dendrimer nanocluster (1a) (100 μg / mL), dendrimer nanocluster (1b) (100 μg / mL) and 1.0 mL of a mixture of Formula 3 and Cy3 in purified water or Dulbecco's PBS (1X, pH 7.4, Gibco), respectively, to prepare a standard disposable cuvette (10 mm path length, 4.5 mL nominal capacity, 4 optical sides, polymethylmethacrylate, Kartell). The cuvette containing the sample solution was fixed in a sample holder and the solution was irradiated with a UV lamp (365 nm, 115 V, 60 Hz, 0.2 A, 8 W, Spectroline) for 2 minutes. To measure UV absorbance, the UV-irradiated sample solution was immediately transferred to a semi-micro disposable disposable cuvette (10 mm path length, 1.6 mL nominal capacity, polymethylmethacrylate, Sarstedt) with light blocking and Beckman Coulter DU 800 Spectrophoto Scan using a meter (250-800 nm scan range, 0.5 nm interval, 600 nm / min scan speed). The blank solution (deionized water / PBS, 1.0 mL) was scanned as reference before each UV scan. To measure the fluorescence, the UV-irradiated sample solution was immediately transferred to a quartz Suprasil macro / semi-micro cell (4 mm path length, 0.5 mL nominal capacity, Perkin Elmer) with light blocking and Perkin Elmer LS Scanning was performed using a 55 fluorescence spectrometer (500-700 nm scan range, irradiation at 510 nm, 5 nm excitation slit, 3.5 nm emission slit). The sample solution is then transferred back to a standard disposable cuvette (Kartell) in the light-blocked state and with a 590 nm laser beam (250-255 mW at 590 nm as measured through a magnifier lens at 25 ° C, Sail Laser). Irradiation was made for 30 minutes. When irradiated with light at 590 nm, an enlarged lens was placed in the middle of the sample solution and the laser beam to uniformly irradiate the entire area of the sample solution. The absorption and emission spectra of the sample solution irradiated with 590 nm light were obtained by the same method. A single photoswitching cycle consisting of a cycle irradiated with UV light (365 nm) for 2 minutes and irradiated with visible light (590 nm) for 30 minutes was repeated five times and the results are shown in FIGS. 7 to 12.

도 7 내지 12에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 화합물 및 덴드리머 나노클러스터는 물에서보다 PBS 용액에서 포토스위칭이 더 잘 일어난다는 것을 알 수 있었고, UV를 쬐었을 때는 형광이 나타나지 않고 Vis 광을 쬐었을 때 형광이 켜짐을 확인할 수 있었다. 또한 중성 전하를 가진 덴드리머 나노클러스터 1b의 스위칭시 온-오프(on-off)의 대조가 더 큰 것으로 나타났다.
As shown in Figures 7 to 12, the compounds and dendrimer nanoclusters according to the present invention can be seen that the photoswitching occurs better in PBS solution than in water, and when exposed to UV light does not appear fluorescence and exposed to Vis light When the fluorescence was turned on was confirmed. In addition, the on-off contrast was greater when switching the dendrimer nanoclusters 1b with neutral charge.

<< 실험예Experimental Example 4> 살아있는 세포에서의  4> in living cells 포토스위칭Photo Switching 실험 Experiment

HeLa 세포는 Lab-Tek II 8-웰 현미경 샘플 챔버(Nunc)에서 각 웰당 1×104 세포의 밀도로 키웠다. 덴드리머 나노클러스터 1a 및 1b 모액(10 mg/mL)을 무혈청 DMEM(Gibco)용액으로 희석하여 10 μg/mL의 용액을 제조하였다. PBS로 세번 상기 세포를 씻고 화학식 1a 및 1b의 10 μg/mL 용액(200 μL per well)으로 처리한 후 37 ℃, 5% CO2 하에서 30분 동안 배양되었다. 그 후 상기 제제는 PBS로 세번 씻어내 제거하고 상기 세포는 200 μL의 무혈청 DMEM으로 처리하였다. 살아있는 세포의 형광 이미지는 RD-TR-PE (λex 555 nm, λem 617 nm) 필터세트가 장착된 DeltaVision RT 이미징 시스템(Applied Precision)에 의하여 얻었다. 상기와 같이 처리된 세포를 포함하는 선택된 웰의 전면적에 UV 램프(365 nm, Spectroline)로 2분간 조사한 뒤, DeltaVision RT 시스템으로 형광 이미지를 얻었다. 그리고, 이어서 선택된 웰의 전체 면적에 확대렌즈를 통해 590 nm의 레이져 빔(Sail Laser)을 30분 간 조사하였고 DeltaVision RT 이미징 시스템으로 형광 이미지를 얻었다. 위의 결과는 도 16에 나타내었다. 상기 포토스위칭 실험은 모두 빛이 차단된 곳에서 수행되었다. HeLa cells were grown to a density of 1 × 10 4 cells per well in a Lab-Tek II 8-well microscope sample chamber (Nunc). Dendrimer nanoclusters 1a and 1b mother liquor (10 mg / mL) were diluted with serum free DMEM (Gibco) solution to prepare a solution of 10 μg / mL. The cells were washed three times with PBS and treated with 10 μg / mL solution (200 μL per well) of Formulas 1a and 1b and then incubated for 30 minutes at 37 ° C., 5% CO 2 . The preparation was then washed out three times with PBS and the cells were treated with 200 μL serum free DMEM. Fluorescent images of living cells were obtained by DeltaVision RT imaging system (Applied Precision) equipped with a set of RD-TR-PE (λ ex 555 nm, λ em 617 nm) filters. After irradiating the entire area of the selected wells containing the cells treated as above with a UV lamp (365 nm, Spectroline) for 2 minutes, a fluorescence image was obtained by DeltaVision RT system. Then, the entire area of the selected well was irradiated with a 590 nm laser beam (Sail Laser) for 30 minutes through a magnifying lens, and a fluorescence image was obtained by a DeltaVision RT imaging system. The above results are shown in FIG. 16. The photoswitching experiments were all performed where light was blocked.

도 16에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 덴드리머 나노클러스터 1a 및 1b는 모두 세포 내에 흡수되어 형광을 나타내지만, 표면이 중성전하인 덴드리머 나노클러스터(1b)가 표면이 음전하인 덴드리머 나노클러스터(1a)보다 형광이 켜지고 꺼짐에 대한 대비가 더 크다는 것을 확인할 수 있었다.
As shown in FIG. 16, the dendrimer nanoclusters 1a and 1b according to the present invention are both absorbed into cells and fluoresce, but the dendrimer nanoclusters 1a having a neutral charge on their surface are negatively charged. It turned out that fluorescence turned on and off had greater contrast.

<< 실험예Experimental Example 5> 살아있는  5> live 지브라피쉬에서의Zebrafish 포토스위칭Photo Switching 실험 Experiment

배양에 의해 덴드리머 나노클러스터(1b)를 흡수시키기 위하여, 3일 된 지브라피쉬를 E3 배아용 배지(15 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 1 mM MgSO4, 1 mM CaCl2, 0.15 mM KH2PO4, 0.05 mM Na2HPO4, 0.7 mM NaHCO3, 10-5% methylene blue; pH 7.5)에 넣어두었다. 덴드리머 나노클러스터(1b)의 모액(10 mg/mL)을 E3 배지를 이용하여 100 μg/mL로 희석하였다. 지브라피쉬를 Lab-Tek II 8-well 마이크로스코프 샘플 챔버(Nunc)에 넣고 100 μg/mL의 덴드리머 나노클러스터(1b) 용액(200 μl)으로 처리하여 28 ℃에서 1시간 동안 배양한 후, E3 배지로 세 차례 씻어내었다. 덴드리머 나노클러스터(1b)의 혈관 내 마이크로 주사를 위하여, 2일 된 지브라피쉬를 소금물(0.30 g sea salt and 1.0 mL of 0.1% methylene blue solution in deionized water was diluted to a total volume of 1.0 L using deionized water)에 넣어두었다. 덴드리머 나노클러스터(1b)의 모액(10 mg/mL) 3.2 nL를 해부 현미경 하에서 지브라 피쉬의 심장 부위로 주사하였다. 이때, 유리 바늘이 부착된 PV820 pneumatic picopump (World Precision Instruments)를 이용하였다. 이어 덴드리머 나노클러스터(1b)가 주사된 지브라피쉬를 소금물로 세 차례 씻어내고 10 mL의 소금물로 채운 페트리 디쉬로 옮겨 추가로 3일간 놓아둔 후, Lab-Tek II 8-well 현미경 샘플 챔버(Nunc)로 옮겼다. 그 다음 덴드리머 나노클러스터(1b)가 각각 배양흡수된 지브라피쉬와 주사된 지브라피쉬의 형광 이미지를 RD-TR-PE (λex 555 nm, λem 617 nm) 필터 세트가 장착된 DeltaVision RT 이미징 시스템(Applied Precision)을 사용하여 얻었다. 덴드리머 나노클러스터(1b)가 배양흡수된 지브라피쉬의 포토스위칭은, 상기 3일 된 지브라피쉬를 E3 배지(200 μL)에서 마취없이 수행하였다. 또한, 덴드리머 나노클러스터(1b)가 주입된 지브라피쉬의 포토스위칭은, 소금물(200 μL)에 4.2%(v/v)의 트리카인(stock: 4.0 g of ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate in 1.0 L of deionized water, pH 7.0)이 함유된 용액에서 지브라피쉬가 5일 되었을 때 마취하여 사용하였다. 상기 실험예 4와 동일한 방법에 의하여 살아있는 지브라피쉬의 포토스위칭 실험이 수행하였고 그 결과는 도 18에 나타내었다.
To absorb the dendrimer nanoclusters (1b) by cultivation, three-day-old zebrafish were cultured in E3 embryo medium (15 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 1 mM MgSO 4 , 1 mM CaCl 2 , 0.15 mM KH 2 PO 4 , 0.05 mM Na 2 HPO 4 , 0.7 mM NaHCO 3 , 10 −5 % methylene blue; pH 7.5). The mother liquor (10 mg / mL) of the dendrimer nanoclusters (1b) was diluted to 100 μg / mL using E3 medium. Zebrafish were placed in a Lab-Tek II 8-well microscope sample chamber (Nunc), treated with 100 μg / mL dendrimer nanocluster (1b) solution (200 μl) and incubated at 28 ° C. for 1 hour, followed by E3 medium. Rinse three times. For intravascular micro-injection of the dendrimer nanoclusters (1b), two-day zebrafish were bred (0.30 g sea salt and 1.0 mL of 0.1% methylene blue solution in deionized water was diluted to a total volume of 1.0 L using deionized water ). 3.2 nL of the mother liquor (10 mg / mL) of the dendrimer nanocluster 1b was injected into the heart site of zebrafish under an anatomical microscope. At this time, PV820 pneumatic picopump (World Precision Instruments) with glass needles was used. The zebrafish injected with the dendrimer nanocluster (1b) were then washed three times with brine, transferred to a Petri dish filled with 10 mL of brine, and left for an additional 3 days, followed by a Lab-Tek II 8-well microscope sample chamber (Nunc). Moved to. The dendrimer nanoclusters 1b were then incubated with fluorescence images of zebrafish incubated and injected zebrafish, respectively, using a DeltaVision RT imaging system equipped with an RD-TR-PE (λ ex 555 nm, λ em 617 nm) filter set. Applied Precision). Photoswitching of zebrafish cultured with the dendrimer nanoclusters 1b was performed without anesthesia in the 3 day old zebrafish in E3 medium (200 μL). In addition, zebrafish photoswitching in which the dendrimer nanocluster (1b) was injected was 4.2% (v / v) of tricaine (stock: 4.0 g of ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate in 1.0 L of deionized) in brine (200 μL). Zebrafish was used in anesthesia for 5 days in a solution containing water, pH 7.0). The photoswitching experiment of the living zebrafish was performed by the same method as Experimental Example 4, and the results are shown in FIG. 18.

<< 실험예Experimental Example 6>  6> 지브라피쉬의Zebrafish 절단된 부위별 박편에 대한 형광 현미경 촬영 Fluorescence microscopy of sliced slices

4일 된 지브라피쉬를 E3 배아용 배지(15 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 1 mM MgSO4, 1 mM CaCl2, 0.15 mM KH2PO4, 0.05 mM Na2HPO4, 0.7 mM NaHCO3, 10-5% methylene blue; pH 7.5)에 넣어두었다. 덴드리머 나노클러스터(1b)의 모액(10 mg/mL)을 E3배지를 사용하여 100 μg/mL로 희석시켰다. 상기 지브라피쉬를 Lab-Tek II 8-well 마이크로스코프 샘플 챔버(Nunc)로 옮기고 덴드리머 나노클러스터(1b) 용액 100 μg/mL로 처리하여 28 ℃에서 1시간 동안 배양하였다. 상기 지브라피쉬는 PBS로 세 차례 씻고 상온에서 4시간 동안 4% PFA의 PBS 용액으로 처리하여 고정시켰다. 이어서, 상기 지브라피쉬를 PBS로 세 차례 씻어 PFA를 제거하였고 30% 수크로스의 PBS 용액으로 처리하여 4 ℃에서 밤새 재워두었다. 그리고 PBS로 다시 세 차례 씻어내어 수크로스를 제거하였다. 액체 질소상에 또 다른 Lab-Tek II 8-well 마이크로스코프 샘플 챔버(Nunc)를 띄우고 이의 well 하나를 Tissue-Tek OCT 화합물로 절반 정도 채우고 고정화된 지브라피쉬를 상기 well에 조심스럽게 놓은 뒤 나머지 well 위의 빈 공간을 OCT 화합물로 완전히 채웠다. 이리하여 동결된 블락을 well로부터 꺼내어 동결된 상태에서 50 μm의 간격으로 잘라 각각 현미경용 슬라이드 글라스 위에 올렸다. 슬라이드 글라스에 놓인 샘플을 10시간 동안 대기에서 건조시키고 2-3 방울의 Universal Mount 배지(Invitron)로 처리한 뒤 커버 글라스로 덮었다(24 mm × 40 mm, Marienfeld; 24 mm × 60 mm, Deckglaser). 샘플이 고정된 뒤 각 박편의 형광 이미지를 RD-TR-PE (λex 555 nm, λem 617 nm) 필터 세트가 장착된 DeltaVision RT 이미징 시스템을 이용하여 얻어 그 결과를 도 19 및 20에 나타내었다. Four-day-old zebrafish were cultured in E3 embryo medium (15 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 1 mM MgSO 4 , 1 mM CaCl 2 , 0.15 mM KH 2 PO 4 , 0.05 mM Na 2 HPO 4 , 0.7 mM NaHCO 3 , 10 −). 5 % methylene blue; pH 7.5). The mother liquor (10 mg / mL) of the dendrimer nanoclusters (1b) was diluted to 100 μg / mL using E3 medium. The zebrafish was transferred to a Lab-Tek II 8-well microscope sample chamber (Nunc) and treated with 100 μg / mL of the dendrimer nanocluster (1b) solution and incubated at 28 ° C. for 1 hour. The zebrafish were washed three times with PBS and fixed by treating with 4% PFA solution of 4% PFA at room temperature. The zebrafish was then washed three times with PBS to remove PFA and treated with 30% sucrose PBS solution and left overnight at 4 ° C. And washed again three times with PBS to remove sucrose. Float another Lab-Tek II 8-well microscope sample chamber (Nunc) on liquid nitrogen, fill one of its wells halfway with Tissue-Tek OCT compound, carefully place the immobilized zebrafish in the well and place it on the other well. The empty space of was completely filled with OCT compound. Thus, the frozen blocks were removed from the wells and cut at 50 μm intervals in the frozen state, and placed on the microscope slide glass. Samples placed on slide glass were dried in air for 10 hours, treated with 2-3 drops of Universal Mount Medium (Invitron) and covered with cover glass (24 mm × 40 mm, Marienfeld; 24 mm × 60 mm, Deckglaser). After the samples were fixed, fluorescence images of each slice were obtained using a DeltaVision RT imaging system equipped with a RD-TR-PE (λ ex 555 nm, λ em 617 nm) filter set and the results are shown in FIGS. 19 and 20. .

도 19 및 도 20에 나타난 바와 같이, 표면이 중성전하인 덴드리머 나노클러스터(1b)는 살아있는 지브라 피쉬에 피부 투과를 통해 각 부위로 골고루 흡수가 됨을 형광 사진으로 확인할 수 있다.As shown in FIG. 19 and FIG. 20, the dendrimer nanoclusters 1b having a neutral charge on the surface of the dendrimer nanoclusters 1b can be confirmed by fluorescence photographs of the zebra fish evenly absorbed into each site through skin permeation.

Claims (14)

하나의 덴드리머를 중심으로 복수개의 덴드리머가 중심부의 덴드리머를 둘러싸고있고, 상기 각각의 덴드리머는 광변색 물질 역할 또는 광스위칭이 가능한 적어도 하나의 가교제에 의해 이웃하는 적어도 하나의 덴드리머 말단에 연결되며, 상기 각각의 덴드리머 표면에는 상기 광변색 물질과 형광공명 에너지 전달(FRET) 반응을 수행할 수 있는 거리 이내에 위치하는 적어도 하나의 형광물질이 덴드리머 말단에 결합되어 있는 광변색화합물로 가교된 덴드리머 나노클러스터 구조에 기반한 고대비 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치.
A plurality of dendrimers surround a central dendrimer around a single dendrimer, each dendrimer being connected to at least one dendrimer end adjacent by at least one crosslinking agent capable of acting as a photochromic material or photoswitching, each of which The dendrimer surface of is based on a dendrimer nanocluster structure cross-linked with a photochromic compound in which at least one fluorescent material located within a distance capable of performing a fluorescence resonance energy transfer (FRET) reaction with the photochromic material is bound to a dendrimer end. Reversible fluorescence switch for high contrast biometric imaging.
제1항에 있어서, 상기 광변색 물질은 아조벤젠(azobenzene) 유도체, 스파이로파이란(spiropyran) 유도체, 디아릴에텐(diarylethene) 유도체 및 펄가이드(fulgide) 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나인 것을 특징으로 하는 광변색화합물로 가교된 덴드리머 나노클러스터 구조에 기반한 고대비 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치.
The method of claim 1, wherein the photochromic material is one selected from the group consisting of an azobenzene derivative, a spiropyran derivative, a diarylethene derivative, and a pulgide derivative. Reversible fluorescence switch for high contrast biological imaging based on dendrimer nanocluster structure cross-linked with a photochromic compound.
제2항에 있어서, 상기 광변색 물질은 하기 화합물 군으로부터 선택되는 어느 하나의 디아릴에텐 유도체임을 특징으로 하는 광변색화합물로 가교된 덴드리머 나노클러스터 구조에 기반한 고대비 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치:
Figure pat00020
,
Figure pat00021
,
Figure pat00022
,
Figure pat00023
,
Figure pat00024
,
Figure pat00025
,
Figure pat00026
,
Figure pat00027
,
Figure pat00028
,
Figure pat00029
또는
Figure pat00030

(여기서, 상기 R1은 수소 또는 메틸이고; R2 및 R3는 수소, C1~C6의 직쇄 또는 측쇄 알킬 또는 비치환 또는 치환된 C5~C7의 아릴 또는 헤테로 아릴이고, 상기 R2 및 R3는 서로 동일 또는 상이할 수 있다.).
The reversible fluorescence switch for high-contrast biological imaging based on the dendrimer nanocluster structure crosslinked with a photochromic compound according to claim 2, wherein the photochromic material is any one of a diarylethene derivative selected from the following compound groups. :
Figure pat00020
,
Figure pat00021
,
Figure pat00022
,
Figure pat00023
,
Figure pat00024
,
Figure pat00025
,
Figure pat00026
,
Figure pat00027
,
Figure pat00028
,
Figure pat00029
or
Figure pat00030

Wherein R 1 is hydrogen or methyl; R 2 And R 3 is Hydrogen, C 1 -C 6 straight or branched chain alkyl or unsubstituted or substituted C 5 -C 7 aryl or hetero aryl, wherein R 2 and R 3 may be the same or different from each other.).
제3항에 있어서, 상기 디아릴에텐 유도체는 하기 화학식 3a인 것을 특징으로 하는 광변색화합물로 가교된 덴드리머 나노클러스터 구조에 기반한 고대비 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치:
[화학식 3a]
Figure pat00031

(여기서, 상기 R1은 제3항에서 정의한 바와 같고;
R4는 -OR5 또는 -NHR5이고;
R5는 수소 또는 C1~C6 직쇄 또는 측쇄 알킬 또는 비치환 또는 치환된 C5~C7의 아릴 또는 헤테로 아릴이다.).
The reversible fluorescent switch for high-contrast biological imaging based on the dendrimer nanocluster structure cross-linked with a photochromic compound according to claim 3, wherein the diarylethene derivative is a chemical formula 3a:
[Chemical Formula 3]
Figure pat00031

Wherein R 1 is as defined in claim 3;
R 4 is -OR 5 or -NHR 5 ;
R 5 is hydrogen or C 1 -C 6 straight or branched alkyl or unsubstituted or substituted C 5 -C 7 aryl or hetero aryl).
제4항에 있어서, 상기 디아릴에텐 유도체는 하기 화학식 3인 것을 특징으로 하는 광변색화합물로 가교된 덴드리머 나노클러스터 구조에 기반한 고대비 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치:
[화학식 3]
Figure pat00032
.
The reversible fluorescent switch for high-contrast biological imaging based on the dendrimer nanocluster structure cross-linked with a photochromic compound according to claim 4, wherein the diarylethene derivative is represented by the following Chemical Formula 3:
(3)
Figure pat00032
.
제1항에 있어서, 상기 덴드리머는 폴리아미도아민(PAMAM) 덴드리머, 폴리라이신 덴드리머, 폴리프로필렌이민(PPI) 덴드리머, 폴리에스터 덴드리머, 폴리그루타민산 덴드리머, 폴리아스파르트산 덴드리머, 및 폴리멜라민 덴드리머로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 광변색화합물로 가교된 덴드리머 나노클러스터 구조에 기반한 고대비 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치.
2. The dendrimer of claim 1, wherein the dendrimer consists of a polyamidoamine (PAMAM) dendrimer, a polylysine dendrimer, a polypropyleneimine (PPI) dendrimer, a polyester dendrimer, a polyglutamic acid dendrimer, a polyaspartic acid dendrimer, and a polymelamine dendrimer A reversible fluorescence switch for high contrast biological imaging based on a dendrimer nanocluster structure crosslinked with a photochromic compound, characterized in that it is any one selected from the group.
제6항에 있어서, 상기 덴드리머는 5세대 폴리아미도아민인 것을 특징으로 하는 광변색화합물로 가교된 덴드리머 나노클러스터 구조에 기반한 고대비 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치.
The reversible fluorescence switch for high contrast biological imaging based on the dendrimer nanocluster structure crosslinked with a photochromic compound according to claim 6, wherein the dendrimer is a fifth generation polyamidoamine.
제7항에 있어서, 상기 덴드리머는 독성을 나타내는 아민기가 표면에 노출되는 것을 방지하기 위해 덴드리머 표면을 구성하는 말단 아민기를 음이온성 또는 중성 잔기를 갖도록 개질시키는 것을 특징으로 하는 광변색화합물로 가교된 덴드리머 나노클러스터 구조에 기반한 고대비 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치.
The dendrimer crosslinked with a photochromic compound according to claim 7, wherein the dendrimer is modified to have anionic or neutral moieties which terminate the terminal amine group constituting the dendrimer surface to prevent exposure of the toxic amine group to the surface. Reversible fluorescence switch for high contrast biometric imaging based on nanocluster structures.
제8항에 있어서, 상기 음이온성 잔기는 카르복실레이트기이고, 중성 잔기는 메톡시폴리(에틸렌)글리콜기(mPEG) 또는 메톡시올리고(에틸렌)글리콜기(mOEG)인 것을 특징으로 하는 광변색화합물로 가교된 덴드리머 나노클러스터 구조에 기반한 고대비 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치.
9. The photochromic method according to claim 8, wherein the anionic moiety is a carboxylate group, and the neutral moiety is a methoxy poly (ethylene) glycol group (mPEG) or a methoxy oligo (ethylene) glycol group (mOEG). A reversible fluorescent switch for high contrast bioimaging based on dendrimer nanocluster structure crosslinked with a compound.
제1항에 있어서, 상기 형광물질은 시아닌(Cyanine, Cy) 시리즈, 알렉사플루오르(Alexa Fluor) 시리즈, 보디피(BODIPY) 시리즈, DY 시리즈, 로다민 유도체(rhodamine derivatives), 플루오레신 유도체(fluorescein derivatives) 또는 쿠마린 유도체(coumarin derivatives)인 것을 특징으로 하는 광변색화합물로 가교된 덴드리머 나노클러스터 구조에 기반한 고대비 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치.
The method of claim 1, wherein the fluorescent material is Cyanine (Cy) series, Alexa Fluor series (BODIPY) series, DY series, rhodamine derivatives (rhodamine derivatives), fluorescein derivatives (fluorescein) Reversible fluorescent switch for high-contrast biological imaging based on the dendrimer nanocluster structure cross-linked with a photochromic compound, characterized in that the derivatives) or coumarin derivatives.
제10항에 있어서, 상기 형광물질은 Cy(Cyanine) 시리즈인 것을 특징으로 하는 광변색화합물로 가교된 덴드리머 나노클러스터 구조에 기반한 고대비 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치.
11. The reversible fluorescent switch of claim 10, wherein the fluorescent material is Cy (Cyanine) series. The dendrimer nanocluster structure crosslinked with a photochromic compound according to claim 10, wherein the fluorescent material is Cy (Cyanine) series.
제11항에 있어서, 상기 형광물질은 Cy 시리즈 중 하나인 Cy3인 것을 특징으로 하는 광변색화합물로 가교된 덴드리머 나노클러스터 구조에 기반한 고대비 새애체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치.
12. The reversible fluorescent switch of claim 11, wherein the fluorescent material is Cy3, one of Cy series, based on a dendrimer nanocluster structure crosslinked with a photochromic compound.
제1항에 있어서, 상기 광변색화합물로 가교된 덴드리머 나노클러스터 구조에 기반한 고대비 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치는 고대비 영상(high-contrast imaging)이 유리한 기타의 생체 내 질병진단 영상화 방법과 결합하여 복합모드 영상을 얻을 목적으로 사용되는 것을 특징으로 하는 광변색화합물로 가교된 덴드리머 나노클러스터 구조에 기반한 고대비 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치.
The reversible fluorescence switch for high contrast bioimaging based on the dendrimer nanocluster structure crosslinked with the photochromic compound is combined with other in vivo disease diagnostic imaging methods where high-contrast imaging is advantageous. Reversible fluorescent switch for high-contrast biological imaging based on the dendrimer nanocluster structure cross-linked with a photochromic compound characterized in that it is used for the purpose of obtaining a composite mode image.
제13항에 있어서, 상기 기타의 생체 내 질병진단 영상화 방법은 자기공명영상화 방법(MRI), 컴퓨터 단층촬영 방법(CT), 양전자 방출 단층촬영 방법(PET), 단일 광자 방출 전산화 단층촬영 방법(SPECT)인 것을 특징으로 하는 광변색화합물로 가교된 덴드리머 나노클러스터 구조에 기반한 고대비 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치.The method of claim 13, wherein the other in vivo disease diagnosis imaging method is magnetic resonance imaging (MRI), computed tomography (CT), positron emission tomography (PET), single photon emission computed tomography (SPECT). Reversible fluorescence switch for high contrast biological imaging based on the dendrimer nanocluster structure cross-linked with a photochromic compound, characterized in that).
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