KR20120096233A - Device for in vitro blood vessel formation - Google Patents

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Abstract

PURPOSE: An in vitro angiogenesis device and an in vitro angiogenesis method using the same are provided to form various blood vessels having desired shapes using cells and three dimensional hydrogel. CONSTITUTION: An in vitro angiogenesis device(1) comprises a substrate(100), a plurality of microstructures(120) which is projected on top of the substrate, a space part(130) which provides a space in which the hydrogel for cell adhesion is charged, and a cell adhesion part having first and second cell adhesion surface at both ends. The space is formed leaving intervals which are corresponded to the diameter of the blood vessel between micro structures. The hydrogel is collagen gel, fibrin gel, matrix gel, self assembly peptide gel or polyethylene glycol gel. The device additionally includes micro fluidic channels for injecting the injection fluid. The injection fluid comprises hydrogel, a first cell for the angiogenesis, a second cell for co-cultivation, an angiogenic factor or a culture medium. The micro fluidic channel comprises a first micro fluid channel(111) for providing the injection fluid to the first cell adhesion surface and a second micro fluidic channel for providing injection fluid to the second cell adhesion surface.

Description

생체 외 혈관 생성 장치{Device for In Vitro Blood Vessel Formation}Device for In Vitro Blood Vessel Formation

본 발명은 생체 외에서 혈관을 생성하기 위한 생체 외 혈관 생성 장치 및 이를 이용한 생체 외 혈관 생성 방법에 관한 것이다.The present invention relates to an in vitro blood vessel generating apparatus for generating blood vessels in vitro and an in vitro blood vessel generating method using the same.

혈관신생을 통한 암 전이 연구 또는 약물 테스트와 같은 혈관과 관련된 연구를 생체 외(in vitro)에서 효과적으로 수행하기 위해서는, 생체 외에서 실제 혈관과 유사한 혈관 구조를 구현해내는 것이 매우 중요하다.In order to effectively carry out blood vessel-related studies such as cancer metastasis research or drug testing in vitro, it is very important to implement a blood vessel structure similar to a real blood vessel in vitro.

종래의 혈관신생 관련 연구 방법 또는 약물 테스트 방법 중 대표적이라 할 수 있는 반 투과막(semi-permeable membrane) 위에 세포를 부착시켜 배양하는 시스템(Gastroenterology 96(3), 736-749,1989)은 시간과 노동력 그리고 비용이 많이 드는 단점이 있었으며, 특히 생체 내 환경과 달리 2차원으로 세포가 배양되었기 때문에 혈관을 형성할 수 없다는 문제가 있었다. Gastroenterology 96 (3), 736-749, 1989) is a system for attaching and culturing cells on a semi-permeable membrane, which is representative of conventional angiogenesis-related research or drug test methods. There were disadvantages in labor and cost, and there was a problem in that blood vessels could not be formed because cells were cultured in two dimensions unlike in vivo environment.

또한 실험용 쥐를 이용하여 쥐의 생체 내에서 혈관 내에 약물을 투여하고 약물을 테스트 하는 실험 방법(J. Pharm . Pharmacol . 53, 1007-1013, 2001)은 쥐를 해부하고 특정 장기를 판별하여 튜브를 연결하는 등 실험 과정이 복잡하고 시간과 비용이 많이 든다는 단점이 있었다. In addition, an experimental method of administering a drug into a blood vessel and testing a drug in vivo in a rat using a laboratory rat ( J. Pharm . Pharmacol . 53, 1007-1013, 2001) dissected the rat and determined a specific organ to determine the tube. There was a disadvantage in that the experimental process was complicated and time-consuming and expensive.

이에 동물 실험을 하지 않고서도 in vitro 상에서 실제 생체 내 환경과 유사한 환경에서 혈관과 관련된 연구 또는 약물 테스트를 수행할 수 있도록 생체 외에서 실제 혈관과 유사한 혈관을 생성하는 기술의 개발이 절실히 요구되고 있었다.Therefore, there is an urgent need to develop a technique for generating blood vessels similar to actual vessels in vitro so that blood vessel-related research or drug testing can be performed in vitro similar to the actual in vivo environment without animal experiments.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 생체 외에서 혈관을 생성할 수 있는 생체 외 혈관 생성 장치 및 이를 이용한 생체 외 혈관 생성 방법을 제공하고자 한다.In order to solve the above problems, the present invention is to provide an in vitro blood vessel generating apparatus that can generate blood vessels in vitro and an in vitro blood vessel generation method using the same.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 기판; 상기 기판 상에 돌출 형성되는 복수의 마이크로구조물(microstructure); 및 상기 마이크로구조물 사이에서 혈관 직경에 해당하는 거리만큼 간격을 두고 공간을 형성하며, 세포 부착을 위한 하이드로젤이 충전되는 공간을 제공하는 공간부를 포함하는 생체 외 혈관 생성 장치를 개시한다.In order to solve the above problems, the present invention is a substrate; A plurality of microstructures protruding from the substrate; And a space forming a space between the microstructures by a distance corresponding to the diameter of the blood vessel, and providing a space for filling the hydrogel for cell attachment.

또한 본 발명은 (a) 상기 생체 외 혈관 생성 장치의 공간부에 하이드로젤을 충전하여 양단에 세포 부착을 위한 제1 및 제2세포부착면을 갖는 세포부착부를 형성시키는 단계; (b) 상기 세포부착부의 제1 및 제2세포부착면에 세포 증식을 위하여 제1세포를 부착시키는 단계; 및 (c) 상기 생체 외 혈관 생성 장치에 배지 및 혈관생성인자를 첨가하여 상기 제1세포를 배양하고 혈관 생성을 유도하는 단계를 포함하는 생체 외 혈관 생성 방법을 개시한다.In another aspect, the present invention comprises the steps of: (a) filling the hydrogel into the space portion of the in vitro blood vessel generating device to form a cell attachment part having first and second cell attachment surfaces for cell attachment at both ends; (b) attaching a first cell to the first and second cell adhesion surfaces of the cell attachment part for cell proliferation; And (c) culturing the first cell and inducing angiogenesis by adding a medium and an angiogenesis factor to the in vitro vessel generating apparatus.

또한 상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 기판; 상기 기판 상에 돌출 형성되며, 혈관 직경에 해당하는 거리만큼 간격을 두고 상기 기판상에 배열되는 복수의 마이크로구조물(microstructure); 및 상기 마이크로구조물 사이의 공간에 하이드로젤이 충전되어 소정의 체적을 갖도록 형성되며, 양단에 세포 부착을 위한 제1 및 제2세포부착면을 갖는 세포부착부를 포함하는 생체 외 혈관 생성 장치를 개시한다.In addition, in order to solve the above problems, the present invention is a substrate; A plurality of microstructures protruding from the substrate and arranged on the substrate at intervals corresponding to the diameter of blood vessels; And a cell attachment part formed to have a predetermined volume by filling a hydrogel in a space between the microstructures and having a first and a second cell attachment surface for cell attachment at both ends thereof. .

또한 본 발명은 (a) 상기 생체 외 혈관 생성 장치의 세포부착부의 제1 및 제2세포부착면에 세포 증식을 위하여 제1세포를 부착시키는 단계; 및 (b) 상기 생체 외 혈관 생성 장치에 배지 및 혈관생성인자를 첨가하여 상기 제1세포를 배양하고 혈관 생성을 유도하는 단계를 포함하는 생체 외 혈관 생성 방법을 개시한다.In addition, the present invention (A) attaching the first cell for cell proliferation to the first and second cell adhesion surface of the cell attachment portion of the in vitro blood vessel generating device; And (b) culturing the first cell and inducing angiogenesis by adding a medium and an angiogenesis factor to the in vitro vessel generating apparatus.

상기와 같은 구성의 본 발명에 의하면, 생체 내 환경과 유사한 미세유체장치 내에서 세포와 소정의 체적을 갖는 하이드로젤을 이용하여 원하는 형태의 다양한 혈관을 형성할 수 있으므로, 생체 외에서 혈관과 관련된 다양한 연구를 수행할 수 있다. 기존의 실험 방법으로는 불가능했던 여러 가지 실험을 가능하게 할 뿐만 아니라 혈관과 암 전이 간에 상호작용에 대한 연구, 항암제 스크리닝, 뇌혈관과 뇌질병 간의 상호작용에 관한 연구 등 다양한 연구를 하나의 장치 안에서 구현시킬 수 있게 됨으로써 시간, 노동력, 비용을 크게 절감할 수 있다.According to the present invention configured as described above, since various blood vessels of a desired form can be formed by using a hydrogel having a predetermined volume with cells in a microfluidic device similar to the in vivo environment, various studies related to blood vessels in vitro Can be performed. In addition to enabling various experiments that were not possible with conventional experimental methods, various studies such as the study of interactions between blood vessels and cancer metastasis, screening of anticancer drugs, and the interaction between cerebrovascular and brain diseases are carried out in one device. Being able to implement it can save you a lot of time, labor and money.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 외 혈관 생성 장치를 개념적으로 나타낸 사시도.
도 2는 본 발명의 다른 실시예에 따른 생체 외 혈관 생성 장치를 개념적으로 나타낸 사시도.
도 3은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 생체 외 혈관 생성 장치를 개념적으로 나타낸 사시도.
도 4는 본 발명과 관련된 생체 외 혈관 생성 장치의 제작 과정의 일 예를 나타낸 흐름도.
도 5는 본 발명과 관련된 혈관 생성 과정을 나타낸 흐름도.
도 6은 본 발명에 따른 생체 외 혈관 생성 장치의 세포부착부에 세포가 부착되어 있는 상태를 보여주는 평면도.
도 7은 본 발명에 따라 생성된 혈관의 현미경 사진.
도 8은 도 6의 A-A' 및 B-B' 라인을 따르는 단면의 현미경 사진.
도 9는 도 6의 혈관의 Z축을 따라 절단된 단면의 현미경 사진.1 is a perspective view conceptually showing an in vitro blood vessel generating device according to an embodiment of the present invention.
Figure 2 is a perspective view conceptually showing an apparatus for generating blood vessels in vitro in accordance with another embodiment of the present invention.
3 is a perspective view conceptually showing an apparatus for generating an in vitro blood vessel according to another embodiment of the present invention;
Figure 4 is a flow chart showing an example of the manufacturing process of the in vitro blood vessel generating device related to the present invention.
5 is a flow chart showing a blood vessel generation process related to the present invention.
6 is a plan view showing a state in which cells are attached to the cell attachment part of the in vitro blood vessel generating device according to the present invention.
7 is a micrograph of blood vessels produced in accordance with the present invention.
8 is a micrograph of the cross section along the AA ′ and BB ′ lines of FIG. 6.
9 is a micrograph of the section taken along the Z axis of the blood vessel of FIG. 6.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 기판; 상기 기판 상에 돌출 형성되는 복수의 마이크로구조물(microstructure); 및 상기 마이크로구조물 사이에서 혈관 직경에 해당하는 거리만큼 간격을 두고 공간을 형성하며, 세포 부착을 위한 하이드로젤이 충전되는 공간을 제공하는 공간부를 포함하는 생체 외 혈관 생성 장치를 개시한다.In order to solve the above problems, the present invention is a substrate; A plurality of microstructures protruding from the substrate; And a space forming a space between the microstructures by a distance corresponding to the diameter of the blood vessel, and providing a space for filling the hydrogel for cell attachment.

또한 본 발명의 한 구체예에 따르면, 본 발명은 상기 공간부에 하이드로젤이 충전되어 소정의 체적을 갖도록 형성되며, 양단에 세포 부착을 위한 제1 및 제2세포부착면을 갖는 세포부착부를 추가로 포함하는 생체 외 혈관 생성 장치를 개시한다. In addition, according to one embodiment of the present invention, the present invention is formed so as to have a predetermined volume by filling a hydrogel in the space portion, the cell attachment portion having a first and second cell adhesion surface for cell attachment at both ends is added Disclosed is an apparatus for generating in vitro blood vessels.

상기 하이드로젤은 콜라겐 젤, 피브린 젤, 마트리젤 (Matrigel), 자가조립 펩타이드 젤 및 폴리에틸렌글리콜 젤 중 적어도 하나일 수 있다.The hydrogel may be at least one of collagen gel, fibrin gel, matrigel (Matrigel), self-assembled peptide gel and polyethylene glycol gel.

상기 생체 외 혈관 생성 장치는 주입유체를 주입하기 위한 미세유체채널을 추가로 포함할 수 있는데, 여기서 상기 주입유체는 하이드로젤, 혈관 생성을 위한 제1세포, 공동배양을 위한 제2세포, 혈관생성인자 및 배지 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 한다.The in vitro blood vessel generating apparatus may further include a microfluidic channel for injecting an infusion fluid, wherein the infusion fluid is a hydrogel, first cell for angiogenesis, second cell for coculture, angiogenesis It characterized in that it comprises at least one of the factor and the medium.

상기 미세유체채널은 마이크로구조물의 일측에 형성되고 제1세포부착면에 주입유체를 공급하기 위한 제1미세유체채널 및 마이크로필러의 타측에 형성되고 제2세포부착면에 주입유체를 공급하기 위한 제2미세유체채널을 포함할 수 있다. 이 때, 상기 제1 및 제2미세유체채널은 서로 연통되어 하나의 채널을 형성할 수 있다.The microfluidic channel is formed on one side of the microstructure and is formed on the first microfluidic channel for supplying the injection fluid to the first cell attachment surface and on the other side of the micropillar and for supplying the injection fluid to the second cell attachment surface. It may comprise two microfluidic channels. In this case, the first and second microfluidic channels may communicate with each other to form one channel.

본 발명에 따른 생체 외 혈관 생성 장치는 상기 기판 위에 상기 미세유체채널을 덮도록 설치되는 플레이트를 추가로 포함하고, 상기 플레이트에는 상기 미세유체채널과 연통되는 유체주입부 및 유체배출부가 형성되는 것을 특징으로 할 수 있다.In vitro blood vessel generating apparatus according to the present invention further comprises a plate installed to cover the microfluidic channel on the substrate, the plate is characterized in that the fluid injection portion and the fluid discharge portion in communication with the microfluidic channel is formed You can do

또한 본 발명은 (a) 기판; 상기 기판 상에 돌출 형성되는 복수의 마이크로구조물(microstructure); 및 상기 마이크로구조물 사이에서 혈관 직경에 해당하는 거리만큼 간격을 두고 공간을 형성하며, 세포 부착을 위한 하이드로젤이 충전되는 공간을 제공하는 공간부를 포함하는 생체 외 혈관 생성 장치의 공간부에 하이드로젤을 충전하여 양단에 세포 부착을 위한 제1 및 제2세포부착면을 갖는 세포부착부를 형성시키는 단계; (b) 상기 세포부착부의 제1 및 제2세포부착면에 세포 증식을 위하여 제1세포를 부착시키는 단계; 및 (c) 상기 생체 외 혈관 생성 장치에 배지 및 혈관생성인자를 첨가하여 상기 제1세포를 배양하고 혈관 생성을 유도하는 단계를 포함하는 생체 외 혈관 생성 방법을 개시한다.In addition, the present invention (a) a substrate; A plurality of microstructures protruding from the substrate; And forming a space between the microstructures by a distance corresponding to the diameter of the blood vessel, and providing a space in which the hydrogel for cell attachment is filled. Filling to form a cell attachment part having first and second cell adhesion surfaces for cell attachment at both ends; (b) attaching a first cell to the first and second cell adhesion surfaces of the cell attachment part for cell proliferation; And (c) culturing the first cell and inducing angiogenesis by adding a medium and an angiogenesis factor to the in vitro vessel generating apparatus.

이 때 상기 (a) 단계는, 예를 들어, 미세유체채널을 통하여 하이드로젤을 주입한 후 석션(suction)을 통해 상기 미세유체채널에 남아 있는 하이드로젤을 제거함으로써 수행할 수 있으며, 상기 마이크로구조물 사이에 마이크로인젝션을 통해 하이드로젤을 충전시키거나, 상기 마이크로구조물 사이의 하이드로젤만 우선 경화시키고 나머지는 제거하는 방법을 이용할 수도 있다.In this case, step (a) may be performed by, for example, injecting the hydrogel through the microfluidic channel and removing the hydrogel remaining in the microfluidic channel through suction, wherein the microstructure Filling the hydrogel through a micro-injection in between, or the method of curing only the hydrogel between the microstructure first, and remove the rest.

또한 본 발명은 (a) 상기 생체 외 혈관 생성 장치의 공간부에 하이드로젤이 충전되어 소정의 체적을 갖도록 형성되며 양단에 세포 부착을 위한 제1 및 제2세포부착면을 갖는 세포부착부를 추가로 포함하는 생체 외 혈관 생성 장치에 있어서, 상기 세포부착부의 제1 및 제2세포부착면에 세포 증식을 위하여 제1세포를 부착시키는 단계; 및 (b) 상기 생체 외 혈관 생성 장치에 배지 및 혈관생성인자를 첨가하여 상기 제1세포를 배양하고 혈관 생성을 유도하는 단계를 포함하는 생체 외 혈관 생성 방법을 개시한다.In another aspect, the present invention (a) the hydrogel is filled in the space portion of the in vitro blood vessel generating device is formed to have a predetermined volume and additionally the cell attachment portion having the first and second cell attachment surface for cell attachment at both ends. An apparatus for generating an in vitro blood vessel, comprising: attaching a first cell to cell attachment surfaces of the cell attachment part for first and second cell attachment surfaces; And (b) culturing the first cell and inducing angiogenesis by adding a medium and an angiogenesis factor to the in vitro vessel generating apparatus.

여기서, 상기 제1세포는 내피세포 (endothelial cell) 또는 상피세포 (epithelial cell) 일 수 있다.Here, the first cell may be an endothelial cell or an epithelial cell.

상기 (b) 단계의 전후로 상기 생체 외 혈관 생성 장치에 공동배양을 위한 제2세포를 주입하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 상기 제2세포는 성상세포(astrocyte), 아교세포(glial cell), 주피세포(pericyte), 섬유아세포(fibroblast) 및 평활근세포(smooth muscle cell, SMC) 중 적어도 하나일 수 있다.Before and after the step (b) may further comprise the step of injecting a second cell for co-culture to the in vitro blood vessel generating device, wherein the second cell is an astrocyte, glial cell (glial cell) ), At least one of pericyte, fibroblast, and smooth muscle cell (SMC).

이하, 본 발명과 관련된 생체 외 혈관 생성 장치 및 이를 이용한 생체 외 혈관 생성 방법에 대하여 도면을 참조하여 보다 상세하게 설명한다. Hereinafter, an apparatus for generating an in vitro blood vessel and an method for generating an in vitro vessel using the same will be described in more detail with reference to the accompanying drawings.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 외 혈관 생성 장치를 개념적으로 나타낸 사시도이다.1 is a perspective view conceptually illustrating an apparatus for generating blood vessels in vitro according to an embodiment of the present invention.

도 1을 참조하면, 생체 외 혈관 생성 장치(1)는 기판(100), 상기 기판 상에 돌출 형성되는 복수의 마이크로구조물(120) 및 상기 마이크로구조물 사이에서 혈관 직경에 해당하는 거리만큼 간격을 두고 공간을 형성하며 세포 부착을 위한 하이드로젤이 충전되는 공간을 제공하는 공간부(130)를 포함한다.Referring to FIG. 1, the in vitro blood vessel generating apparatus 1 may be spaced apart by a distance corresponding to a diameter of a vessel between a substrate 100, a plurality of microstructures 120 protruding from the substrate, and the microstructures. It includes a space portion 130 that forms a space and provides a space in which the hydrogel for cell attachment is filled.

또한 도 2는 본 발명의 다른 실시예에 따른 생체 외 혈관 생성 장치를 개념적으로 나타낸 사시도이다.2 is a perspective view conceptually showing an apparatus for generating blood vessels in vitro according to another embodiment of the present invention.

도 2를 참조하면, 생체 외 혈관 생성 장치(1)는 기판(100), 상기 기판 상에 돌출 형성되는 복수의 마이크로구조물(120), 공간부(130) 및 상기 공간부에 하이드로젤이 충전되어 양단에 세포 부착을 위한 제1 및 제2세포부착면(141, 142)을 갖는 세포부착부(140)를 포함한다.Referring to FIG. 2, the ex vivo blood vessel generating apparatus 1 includes a substrate 100, a plurality of microstructures 120, a space 130, and a hydrogel filled in the space. And a cell attachment part 140 having first and second cell attachment surfaces 141 and 142 for cell attachment at both ends.

도 1 및 도 2에 따르면 상기 생체 외 혈관 생성 장치(1)는 혈관 생성을 위한 제1세포, 공동배양을 위한 제2세포, 혈관생성인자 또는 배지를 포함하는 주입유체를 주입하기 위한 미세유체채널을 추가로 포함한다. 여기서 상기 미세유체채널은 마이크로구조물(120)의 일측에 형성된 제1미세유체채널(111) 및 마이크로구조물(120)의 타측에 형성된 제2미세유체채널(112)로 이루어진 것을 특징으로 한다.1 and 2, the ex vivo blood vessel generating apparatus 1 includes a microfluidic channel for injecting an injection fluid including a first cell for generating blood vessels, a second cell for coculture, an angiogenesis factor or a medium. It further includes. The microfluidic channel may be formed of a first microfluidic channel 111 formed on one side of the microstructure 120 and a second microfluidic channel 112 formed on the other side of the microstructure 120.

도 1 및 도 2는 마이크로구조물(120)의 양측에 제1미세유체채널(111) 및 제2미세유체채널(112)이 각각 구비된 것으로 도시되어 있으나, 이는 개념적인 도시로서, 상기 제1미세유체채널(111) 및 제2미세유체채널(112)은 연통되어 하나의 채널을 형성할 수도 있다. 또한 제3미세유체채널, 제4미세유체채널 등이 추가로 구비되어 상기 제1미세유체채널(111) 또는 제2미세유체채널(112)과 연통되도록 배열될 수도 있다.1 and 2 show that the first microfluidic channel 111 and the second microfluidic channel 112 are provided on both sides of the microstructure 120, respectively. The fluid channel 111 and the second microfluidic channel 112 may communicate with each other to form one channel. In addition, the third microfluidic channel, the fourth microfluidic channel, etc. may be further provided and arranged to communicate with the first microfluidic channel 111 or the second microfluidic channel 112.

복수의 마이크로구조물(120)는 혈관 직경에 해당하는 거리만큼 간격(10)을 두고 기판상에 배열된다. 이는 마이크로구조물(120)의 사이의 공간에 하이드로젤이 충전되어 소정의 체적을 갖도록 함으로써, 하이드로젤의 양단에 세포를 입체적으로 부착시킬 수 있는 제1 및 제2세포부착면(141, 142)을 제공할 뿐만 아니라 제1 및 제2세포부착면(141, 142)에 부착된 세포들이 하이드로젤 내부로 뻗어나가면서 증식, 성장하여 세포 융합(vascular fusion) 및 신생혈관형성(angiogenesis) 과정을 거쳐 혈관을 생성할 수 있는 공간을 제공하기 위한 것이다. 따라서 상기 복수의 마이크로구조물 사이의 간격(10) 및 마이크로구조물(120)의 높이(20)는 생성하고자 하는 혈관의 직경이나 네트워크 구성에 상응하도록 조절할 수 있으며, 상기 마이크로구조물(120)의 길이(30)는 생성하고자 하는 혈관의 길이에 상응하도록 조절할 수 있다.The plurality of microstructures 120 are arranged on the substrate at intervals 10 by a distance corresponding to the vessel diameter. This is because the hydrogel is filled in the space between the microstructures 120 to have a predetermined volume, thereby providing the first and second cell attachment surfaces 141 and 142 capable of three-dimensionally attaching cells to both ends of the hydrogel. In addition to providing cells, the cells attached to the first and second cell adhesion surfaces 141 and 142 extend and grow inside the hydrogel to proliferate and grow to undergo blood vessels through vascular fusion and angiogenesis. This is to provide space that can be created. Therefore, the spacing 10 between the plurality of microstructures and the height 20 of the microstructures 120 may be adjusted to correspond to the diameter or network configuration of blood vessels to be generated, and the length 30 of the microstructures 120 may be adjusted. ) Can be adjusted to correspond to the length of the blood vessel to be created.

상기 복수의 마이크로구조물 사이의 간격(10) 및 마이크로구조물(120)의 높이(20)는 생성하고자 하는 혈관의 두께에 따라 조절할 수 있으며, 예를 들어 10 내지 500 ㎛, 10 내지 400 ㎛, 10 내지 300 ㎛, 또는 10 내지 200 ㎛일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.The spacing 10 between the plurality of microstructures and the height 20 of the microstructures 120 may be adjusted according to the thickness of blood vessels to be produced, for example, 10 to 500 μm, 10 to 400 μm, and 10 to 300 μm, or 10 to 200 μm, but is not limited thereto.

또한 상기 복수의 마이크로구조물(120)의 길이(30)는 생성하고자 하는 혈관의 길이에 따라 조절할 수 있으며, 결과적으로 생체 외 혈관 생성 장치(1) 내에서 마이크로구조물(120)의 간격, 높이 및 배열을 조절함으로써 원하는 두께, 길이 및 모양을 갖는 혈관을 생성할 수 있다.In addition, the length 30 of the plurality of microstructures 120 may be adjusted according to the length of the blood vessel to be generated, and as a result, the spacing, height and arrangement of the microstructures 120 in the in vitro blood vessel generation device 1. By adjusting the blood vessels can be created with the desired thickness, length and shape.

도 3은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 생체 외 혈관 생성 장치(1)를 개념적으로 나타낸 사시도이다. 3 is a perspective view conceptually showing the ex vivo blood vessel generating apparatus 1 according to another embodiment of the present invention.

본 실시예에 따르면, 상기 생체 외 혈관 생성 장치(1)는 미세유체채널(111, 112)을 통한 주입유체의 주입 및 배출을 용이하게 하기 위하여 도 3에 개시된 바와 같이 기판 위에 상기 미세유체채널을 덮도록 설치되는 플레이트(200)를 추가로 포함한다. 상기 플레이트(200)에는 상기 미세유체채널(111, 112)과 연통되는 유체주입부(113, 114) 및 유체배출부(115, 116) 가 형성된다. 상기 유체주입부 및 유체배출부의 수는 미세유체채널의 수에 따라 조절할 수 있다.According to the present embodiment, the ex vivo blood vessel generating apparatus 1 uses the microfluidic channel on a substrate as shown in FIG. It further includes a plate 200 installed to cover. The plate 200 has fluid injection portions 113 and 114 and fluid discharge portions 115 and 116 communicating with the microfluidic channels 111 and 112. The number of the fluid inlet and the fluid outlet may be adjusted according to the number of microfluidic channels.

도 3은 제1미세유체채널(111)과 연통되는 제1유체주입부(113) 및 제1유체배출부(115), 제2미세유체채널(112)과 연통되는 제2유체주입부(114) 및 제2유체배출부(116)가 형성된 것으로 도시되어 있으나, 이는 개념적인 도시로서, 상기 제1미세유체채널(111) 및 제2미세유체채널(112)이 연통되어 하나의 채널을 형성하는 경우에는 하나의 유체주입부와 하나의 유체배출부만 형성될 수 있다. 또한 제3미세유체채널, 제4미세유체채널 등이 추가로 구비되는 경우에는 제3미세유체채널과 연통되는 제3유체주입부 및 제3유체배출부, 제4미세유체채널과 연통되는 제4유체주입부 및 제4유체배출부 등이 추가로 구비될 수도 있다.3 illustrates a first fluid injection unit 113 and a first fluid discharge unit 115 communicating with the first microfluidic channel 111 and a second fluid injection unit 114 communicating with the second microfluidic channel 112. ) And a second fluid discharge part 116 are illustrated, which is a conceptual illustration, in which the first microfluidic channel 111 and the second microfluidic channel 112 communicate with each other to form one channel. In this case, only one fluid injection part and one fluid discharge part may be formed. In addition, when the third microfluidic channel, the fourth microfluidic channel, etc. are additionally provided, the third fluid injector and the third fluid discharge part communicating with the third microfluidic channel and the fourth microfluidic channel communicate with the fourth microfluidic channel. The fluid injection part and the fourth fluid discharge part may be further provided.

도 4는 본 발명과 관련된 생체 외 혈관 생성 장치의 제작 과정의 일 예를 나타낸 흐름도이다.4 is a flowchart illustrating an example of a manufacturing process of an apparatus for generating an in vitro blood vessel according to the present invention.

본 발명에 따른 생체 외 혈관 생성 장치는 예를 들어, 리소그래피(lithography) 방법, 몰딩 방법 등에 의해 제작할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.The apparatus for generating an in vitro blood vessel according to the present invention may be manufactured by, for example, a lithography method or a molding method, but is not limited thereto.

도시한 바와 같이, 먼저 실리콘 기판 위에 포토레지스트를 코팅 한다 (A). 포토레지스트는 UV가 조사된 부분만 경화되는 네거티브 포토레지스트인 SU-8을 사용할 수 있으며, 상기 스핀 코팅된 포토레지스트에 포토마스크를 이용하여 패턴을 만들고자 하는 부분만 UV를 조사해줌으로써 해당 부분의 포토레지스트만을 경화시킨다 (B). 이후 이를 현상(developing)하여 제1, 2 미세유체채널(111, 112) 및 마이크로구조물(120)에 해당하는 패턴만 실리콘 기판 위에 남게 한다. 제작된 패턴 위에 PDMS, 폴리우레탄 등의 경화 가능하며 틀을 형성할 수 있는 물질을 붓고 상기 형성된 패턴이 그 물질에 형성될 수 있도록 일정 시간 경화한 후 이를 실리콘 기판에 형성된 패턴으로부터 분리시킨다. 분리된 틀은 플라즈마(plasma) 처리 등 알맞은 표면처리 후에 슬라이드 글라스에 붙여 채널을 제작한다.As shown, first, a photoresist is coated on a silicon substrate (A). The photoresist may use SU-8, a negative photoresist that cures only the UV-irradiated portion, and irradiates UV to only the portion of the spin-coated photoresist to form a pattern using a photomask. Only cure (B). Thereafter, this is developed so that only the patterns corresponding to the first and second microfluidic channels 111 and 112 and the microstructure 120 remain on the silicon substrate. A curable and moldable material such as PDMS or polyurethane is poured onto the fabricated pattern and cured for a predetermined time so that the formed pattern is formed on the material, and then separated from the pattern formed on the silicon substrate. The separated mold is attached to the slide glass after proper surface treatment such as plasma treatment to produce a channel.

도 5는 본 발명과 관련된 혈관 생성 과정을 나타낸 흐름도이다.5 is a flowchart illustrating a blood vessel generation process related to the present invention.

도시한 바와 같이, 제1항에 따른 생체 외 혈관 생성 장치(1)의 마이크로구조물(120) 사이에 하이드로젤을 충전하여 소정의 체적을 갖도록 일정시간 동안 경화시켰다.As shown, the hydrogel was filled between the microstructures 120 of the in vitro blood vessel generating device 1 according to claim 1 and cured for a predetermined time to have a predetermined volume.

도 5는 제1 및 제2미세유체채널(111, 112)을 통하여 하이드로젤을 주입한 후 석션(suction)을 통해 상기 제1 및 제2미세유체채널(111, 112)에 남아 있는 하이드로젤을 제거함으로써 상기 마이크로구조물(120) 사이에 하이드로젤을 충전하는 것을 도시하고 있다. 다만 이러한 방식뿐만 아니라 상기 마이크로구조물(120) 사이에 마이크로인젝션을 통해 하이드로젤을 충전시키거나 마이크로구조물(120) 사이의 하이드로젤만 우선 경화시키고 나머지는 제거하는 방법을 이용할 수도 있다.FIG. 5 illustrates a hydrogel remaining in the first and second microfluidic channels 111 and 112 after suction by injecting a hydrogel through the first and second microfluidic channels 111 and 112. It is shown to fill the hydrogel between the microstructures 120 by removing. However, not only this method but also the method of filling the hydrogel through the microinjection between the microstructures 120 or curing only the hydrogels between the microstructures 120 and removing the rest may be used.

이 때, 상기 하이드로젤은 배지, 혈관생성인자 및 공동배양을 위한 제2세포 중 적어도 하나를 혼합한 혼합물의 형태로 충전될 수도 있다.At this time, the hydrogel may be filled in the form of a mixture of at least one of the medium, angiogenesis factors and second cells for co-culture.

상기 마이크로구조물(120) 사이의 공간에 충전되어 소정의 체적을 갖는 하이드로젤의 양단에는 세포 부착을 위한 제1 및 제2세포부착면(141, 142)을 갖는 세포부착부(140)가 형성된다.Cell attachment parts 140 having first and second cell attachment surfaces 141 and 142 for cell attachment are formed at both ends of the hydrogel having a predetermined volume filled in the space between the microstructures 120. .

따라서 상기 세포부착부(140)의 제1 및 제2세포부착면(141, 142)에 세포 증식을 위하여 제1세포(151)를 부착시키는 단계 및 상기 생체 외 혈관 생성 장치(1)에 배지 및 혈관생성인자를 첨가하여 상기 제1세포를 배양하고 혈관 생성을 유도하는 단계를 거쳐 생체 외에서 혈관을 생성할 수 있다.Therefore, attaching the first cells 151 to the first and second cell adhesion surfaces 141 and 142 of the cell attachment part 140 for cell proliferation and the medium and the in vitro blood vessel generation device 1. By adding an angiogenesis factor, the first cell may be cultured and blood vessels may be generated in vitro through a step of inducing angiogenesis.

상기 하이드로젤은 콜라겐 젤, 피브린 젤, 마트리젤, 자가조립 펩타이드 젤 및 폴리에틸렌글리콜 젤 중 적어도 하나일 수 있으며, 상기 제1세포는 내피세포 또는 외피세포일 수 있다.The hydrogel may be at least one of collagen gel, fibrin gel, matrigel, self-assembled peptide gel, and polyethylene glycol gel, and the first cell may be an endothelial cell or an endothelial cell.

본 실시예의 경우, 하이드로젤로서 피브린 젤을 사용하였으며, 제1세포(151)로서 HUVEC(Human Umbilical Vain Endothelial Cell)를 사용하였다. 미세유체채널을 통해 HUVEC를 포함하는 주입유체를 주입한 후 생체 외 혈관 생성 장치(1)를 좌우로 번갈아 세워가며 하이드로젤 양단의 제1 및 제2세포부착면(141, 142)에 HUVEC를 부착시켰다.In this embodiment, fibrin gel was used as a hydrogel, and HUVEC (Human Umbilical Vain Endothelial Cell) was used as the first cell 151. After injecting the injection fluid containing HUVEC through the microfluidic channel, HUVEC is attached to the first and second cell adhesion surfaces 141 and 142 on both ends of the hydrogel by alternating the in vitro blood vessel generating device 1 from side to side. I was.

이렇게 세포부착부(140)의 제1 및 제2세포부착면(141, 142)에 제1세포(151)를 부착시키고 난 후, 상기 생체 외 혈관 생성 장치(1) 내로 세포의 성장을 위한 배지, 혈관생성인자(VEGF, Vascular Endothelial Growth Factor) 또는 공동배양을 위한 제2세포를 각각 또는 함께 주입할 수 있다.After attaching the first cells 151 to the first and second cell attachment surfaces 141 and 142 of the cell attachment part 140, the medium for growth of cells into the in vitro blood vessel generation device 1 is described. , Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) or second cells for co-culture may be injected separately or together.

본 실시예의 경우, 혈관생성인자로서 VEGF(Vascular endothelial growth factor)를, 제2세포로서 Human Lung Fibroblast를, 세포성장배지로서 ECM-2 배지 (LONZA) 를 주입하였다.In this example, VEGF (Vascular endothelial growth factor) was used as angiogenesis factor, Human Lung Fibroblast was used as a second cell, and ECM-2 medium (LONZA) was used as a cell growth medium.

상기 배지, 혈관생성인자 및 공동배양을 위한 제2세포의 추가는 제1세포의 성장, 증식 및 혈관 생성에 적절한 환경을 제공하기 위한 것으로서 그 종류 및 조성은 당업자에 의하여 적절히 선택될 수 있다.The addition of the second cell for the medium, angiogenesis factor and co-culture is to provide an environment suitable for growth, proliferation and angiogenesis of the first cell, and the type and composition thereof may be appropriately selected by those skilled in the art.

상기 혈관생성인자는, 예를 들어 혈관내피세포성장인자(VEGF, Vascular endothelial growth factor) 또는 상피세포성장인자(EGF, Epidermal growth factor) 일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.The angiogenesis factor may be, for example, a vascular endothelial growth factor (VEGF) or an epidermal growth factor (EGF), but is not limited thereto.

상기 제2세포는 성상세포, 아교세포, 주피세포, 섬유아세포 및 평활근세포 중 적어도 하나일 수 있다. 생성하고자 하는 혈관이 뇌혈관인 경우 성상세포, 아교세포, 주피세포 또는 섬유아세포인 것이 바람직하고, 생성하고자 하는 혈관이 뇌혈관 이외의 혈관인 경우에는 섬유아세포 또는 평활근세포인 것이 바람직하다.The second cell may be at least one of astrocytic cells, glial cells, epidermal cells, fibroblasts and smooth muscle cells. When blood vessels to be produced are cerebral vessels, it is preferable that they are astrocytes, glial cells, dermal cells or fibroblasts, and when blood vessels to be produced are blood vessels other than cerebrovascular vessels, fibroblasts or smooth muscle cells are preferable.

도 6는 본 발명에 따른 생체 외 혈관 생성 장치의 세포부착부에 세포가 부착되어 있는 상태를 보여주는 평면도이다.6 is a plan view showing a state in which cells are attached to the cell attachment part of the in vitro blood vessel generating device according to the present invention.

(A)는 하이드로젤 양단의 세포부착부(140)에 제1세포(151)가 부착되어 있는 상태를 보여준다.(A) shows a state in which the first cell 151 is attached to the cell attachment part 140 at both ends of the hydrogel.

(B)는 (A)의 상태에서, 추가로 제1미세유체채널(111)에 제2세포 및/또는 혈관생성인자(152)가 주입된 상태를 보여준다. 제2미세유체채널(112)이 추가로 구비된 경우, 제2미세유체채널(112)을 통해서도 제2세포 및/또는 혈관생성인자(152)를 주입할 수 있음은 당업자에게 자명하다.(B) shows a state in which the second cell and / or angiogenesis factor 152 is additionally injected into the first microfluidic channel 111 in the state of (A). If the second microfluidic channel 112 is further provided, it will be apparent to those skilled in the art that the second cell and / or angiogenesis factor 152 may be injected through the second microfluidic channel 112.

(C)는 하이드로젤의 양단의 세포부착부(130)에 제1세포(151)가 부착되고, 마이크로구조물(120) 사이에 하이드로젤과 혼합된 제2세포 및/또는 혈관생성인자(152)가 주입된 상태를 보여준다. (C) the first cell 151 is attached to the cell attachment portion 130 at both ends of the hydrogel, and the second cell and / or angiogenesis factor 152 mixed with the hydrogel between the microstructures 120. Shows the state of injection.

(D)는 (C)의 상태에서, 추가로 제1미세유체채널(111) 및 제2미세유체채널(112)에 제2세포 및/또는 혈관생성인자(152)가 주입된 상태를 보여준다.(D) shows a state in which the second cell and / or angiogenesis factor 152 is injected into the first microfluidic channel 111 and the second microfluidic channel 112 in the state of (C).

도 7은 본 발명에 따라 생성된 혈관을 염색한 뒤 형광현미경으로 관찰한 결과를 보여주는 사진이다. Figure 7 is a photograph showing the results observed with a fluorescent microscope after staining the blood vessels produced according to the present invention.

도 8은 도 7의 A-A' 및 B-B' 라인을 따르는 단면의 현미경 사진으로, 속이 빈 관 구조가 길이 방향으로 쭉 뻗어 혈관 구조를 형성하였음을 확인할 수 있다.Figure 8 is a micrograph of the cross-section along the lines A-A 'and B-B' of Figure 7, it can be seen that the hollow tube structure is extended in the longitudinal direction to form a vascular structure.

도 9은 도 7의 혈관의 Z축을 따라 아래에서 위로 (A → D) 절단된 단면의 현미경 사진이다. FIG. 9 is a micrograph of a section cut from bottom to top (A → D) along the Z axis of the blood vessel of FIG.

Hoechst33324 염색에 의한 파란색은 핵을 나타내며, 팔로이딘(phalloidin) 염색에 의한 초록색은 F-액틴(F-actin)을 나타내고, ZO-1 염색에 의한 붉은색은 치밀이음부(tight junction)을 나타낸다. 도 9를 통해 내피세포와 혈관벽 사이에 치밀이음부가 형성되어 실제 혈관과 유사한 구조가 형성되었음을 알 수 있다.The blue color by Hoechst33324 staining represents the nucleus, the green color by phalloidin staining is F-actin, and the red color by ZO-1 staining is tight junction. 9 shows that a dense joint is formed between the endothelial cells and the blood vessel wall, thereby forming a structure similar to the actual blood vessel.

이상에서는 본 발명에 따른 생체 외 혈관 생성 장치 및 이를 이용한 생체 외 혈관 생성 방법을 첨부한 도면들을 참조로 하여 설명하였으나,　본 발명은 본 명세서에 개시된 실시예와 도면에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 기술사상의 범위 내에서 당업자에 의해 다양한 변형이 이루어질 수 있다.In the above described with reference to the accompanying drawings an in vitro blood vessel generation apparatus and an in vitro blood vessel generation method using the same, the present invention is not limited by the embodiments and drawings disclosed herein, the present invention Various modifications can be made by those skilled in the art within the scope of the technical idea.

1: 생체 외 혈관 생성 장치 10: 마이크로구조물 사이의 간격
20: 마이크로구조물의 높이 30: 마이크로구조물의 길이
100: 기판
111: 제1미세유체채널 112: 제1미세유체채널
113: 제1유체주입부 114: 제2유체주입부
115: 제1유체배출부 116: 제2유체배출부
120: 마이크로구조물 130: 공간부
140: 세포부착부
141: 제1세포부착면 142: 제2세포부착면
151: 제1세포 152: 제2세포 및/또는 혈관생성인자1: in vitro blood vessel generating device 10: gap between microstructures
20: height of the microstructure 30: length of the microstructure
100: substrate
111: first microfluidic channel 112: first microfluidic channel
113: first fluid injection unit 114: second fluid injection unit
115: first fluid discharge unit 116: second fluid discharge unit
120: microstructure 130: space
140: cell attachment part
141: first cell adhesion surface 142: second cell adhesion surface
151: first cell 152: second cell and / or angiogenesis factor

Claims (13)

기판;
상기 기판 상에 돌출 형성되는 복수의 마이크로구조물(microstructure); 및
상기 마이크로구조물 사이에서 혈관 직경에 해당하는 거리만큼 간격을 두고 공간을 형성하며, 세포 부착을 위한 하이드로젤이 충전되는 공간을 제공하는 공간부를 포함하는 생체 외 혈관 생성 장치.Board;
A plurality of microstructures protruding from the substrate; And
An apparatus for generating in vitro blood vessels, including a space portion that forms a space at a distance corresponding to a diameter of blood vessels between the microstructures and provides a space in which a hydrogel for cell attachment is filled. 제1항에 있어서,
상기 공간부에 하이드로젤이 충전되어 소정의 체적을 갖도록 형성되며, 양단에 세포 부착을 위한 제1 및 제2세포부착면을 갖는 세포부착부를 추가로 포함하는 생체 외 혈관 생성 장치.The method of claim 1,
The hydrogel is filled in the space portion is formed to have a predetermined volume, and further comprising a cell attachment portion having a first and second cell attachment surface for cell attachment at both ends. 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 하이드로젤은 콜라겐 젤, 피브린 젤, 마트리젤, 자가조립 펩타이드 젤 및 폴리에틸렌글리콜 젤 중 적어도 하나인 생체 외 혈관 생성 장치.The method according to claim 1 or 2,
The hydrogel is at least one of collagen gel, fibrin gel, Matrigel, self-assembled peptide gel and polyethylene glycol gel in vitro blood vessel generating device. 제1항 또는 제2항에 있어서,
주입유체를 주입하기 위한 미세유체채널을 추가로 포함하는 생체 외 혈관 생성 장치.The method according to claim 1 or 2,
An in vitro blood vessel generating device further comprising a microfluidic channel for injecting an injection fluid. 제4항에 있어서,
상기 주입유체는 하이드로젤, 혈관 생성을 위한 제1세포, 공동배양을 위한 제2세포, 혈관생성인자 및 배지 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 외 혈관 생성 장치.The method of claim 4, wherein
The injection fluid is an in vitro blood vessel generating device comprising at least one of a hydrogel, a first cell for blood vessel generation, a second cell for co-culture, angiogenesis factor and medium. 제4항에 있어서,
상기 미세유체채널은
마이크로구조물의 일측에 형성되고, 제1세포부착면에 주입유체를 공급하기 위한 제1미세유체채널; 및
마이크로구조물의 타측에 형성되고, 제2세포부착면에 주입유체를 공급하기 위한 제2미세유체채널을 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 외 혈관 생성 장치.The method of claim 4, wherein
The microfluidic channel is
A first microfluidic channel formed on one side of the microstructure and configured to supply an injection fluid to the first cell attachment surface; And
Is formed on the other side of the microstructure, in vitro blood vessel generating apparatus comprising a second microfluidic channel for supplying the injection fluid to the second cell attachment surface. 제6항에 있어서,
상기 제1 및 제2미세유체채널은 서로 연통된 것을 특징으로 하는 생체 외 혈관 생성 장치.The method of claim 6,
The first and second microfluidic channels are in vitro blood vessel generating device, characterized in that in communication with each other. 제4항에 있어서,
상기 기판 위에 상기 미세유체채널을 덮도록 설치되는 플레이트를 추가로 포함하고,
상기 플레이트에는 상기 미세유체채널과 연통되는 유체주입부 및 유체배출부가 형성되는 것을 특징으로 하는 생체 외 혈관 생성 장치.The method of claim 4, wherein
Further comprising a plate installed on the substrate to cover the microfluidic channel,
The plate of the ex vivo blood vessel generating device, characterized in that the fluid injection portion and the fluid discharge portion is formed in communication with the microfluidic channel. (a) 제1항에 따른 생체 외 혈관 생성 장치의 공간부에 하이드로젤을 충전하여 양단에 세포 부착을 위한 제1 및 제2세포부착면을 갖는 세포부착부를 형성시키는 단계;
(b) 상기 세포부착부의 제1 및 제2세포부착면에 세포 증식을 위하여 제1세포를 부착시키는 단계; 및
(c) 상기 생체 외 혈관 생성 장치에 배지 및 혈관생성인자를 첨가하여 상기 제1세포를 배양하고 혈관 생성을 유도하는 단계를 포함하는 생체 외 혈관 생성 방법.(A) filling the hydrogel into the space portion of the ex vivo blood vessel generating device according to claim 1 to form a cell attachment portion having a first and a second cell attachment surface for cell attachment at both ends;
(b) attaching a first cell to the first and second cell adhesion surfaces of the cell attachment part for cell proliferation; And
(c) culturing the first cell and inducing angiogenesis by adding a medium and an angiogenesis factor to the in vitro vessel generating device. (a) 제2항에 따른 생체 외 혈관 생성 장치의 세포부착부의 제1 및 제2세포부착면에 세포 증식을 위하여 제1세포를 부착시키는 단계; 및
(b) 상기 생체 외 혈관 생성 장치에 배지 및 혈관생성인자를 첨가하여 상기 제1세포를 배양하고 혈관 생성을 유도하는 단계를 포함하는 생체 외 혈관 생성 방법.(a) attaching the first cell to the first and second cell adhesion surfaces of the cell attachment part of the in vitro blood vessel generating device according to claim 2 for cell proliferation; And
(b) culturing the first cell and inducing angiogenesis by adding a medium and an angiogenesis factor to the in vitro vessel generating device. 제9항 또는 제10항에 있어서,
상기 제1세포는 내피세포 또는 외피세포인 생체 외 혈관 생성 방법.11. The method according to claim 9 or 10,
The first cell is an endothelial cell or an in vitro blood vessel generation method. 제9항 또는 제10항에 있어서,
상기 생체 외 혈관 생성 장치에 공동배양을 위한 제2세포를 주입하는 단계를 추가로 포함하는 생체 외 혈관 생성 방법.11. The method according to claim 9 or 10,
And injecting a second cell for co-culture into the ex vivo blood vessel generating device. 제12항에 있어서,
상기 제2세포는 성상세포, 아교세포, 주피세포, 섬유아세포 및 평활근세포 중 적어도 하나인 생체 외 혈관 생성 방법.The method of claim 12,
The second cell is an in vitro blood vessel generation method of at least one of astrocytes, glial cells, dermal cells, fibroblasts and smooth muscle cells.
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