KR20120095257A - A METHOD FOR PRODUCING PANCREAS β LIKE CELLS FROM ADULT STEM CELLS - Google Patents
A METHOD FOR PRODUCING PANCREAS β LIKE CELLS FROM ADULT STEM CELLS Download PDFInfo
- Publication number
- KR20120095257A KR20120095257A KR1020110014808A KR20110014808A KR20120095257A KR 20120095257 A KR20120095257 A KR 20120095257A KR 1020110014808 A KR1020110014808 A KR 1020110014808A KR 20110014808 A KR20110014808 A KR 20110014808A KR 20120095257 A KR20120095257 A KR 20120095257A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- cells
- stem cells
- medium
- differentiation
- activin
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0676—Pancreatic cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/117—Keratinocyte growth factors (KGF-1, i.e. FGF-7; KGF-2, i.e. FGF-12)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
- C12N2506/025—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells from extra-embryonic cells, e.g. trophoblast, placenta
Landscapes
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
본 발명은 성체 줄기세포로부터 췌장 베타 유사세포의 분화를 유도하여 췌장 베타 유사세포를 제조하는 방법, 상기 분화 유도용 조성물, 상기 방법에 의해 제조된 췌장 베타 유사세포 및 상기 췌장 베타 유사세포를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 치료용 세포치료제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 성체 줄기세포로부터 췌장 전구체 세포의 분화를 유도하여 췌장 전구체 세포를 제조하는 방법, 상기 분화 유도용 조성물, 및 상기 췌장 전구체 세포를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 치료용 세포치료제에 관한 것이다. 본 발명의 췌장 베타 유사세포를 제조하는 방법은 2단계 분화 유도 방법으로 단계별 분화법을 순차적으로 적용하여 분화의 효율성을 극대화하였으며, 그 유래가 다양한 성체 줄기세포로부터의 분화방법을 확립하여 당뇨병 질환에 대한 새로운 치료 대안을 제공한다.The present invention is a method for producing pancreatic beta-like cells by inducing differentiation of pancreatic beta-like cells from adult stem cells, the composition for inducing differentiation, the pancreatic beta-like cells and pancreatic beta-like cells prepared by the method as an active ingredient. It relates to a cell therapy for treating diabetes. The present invention also relates to a method for producing pancreatic precursor cells by inducing differentiation of pancreatic precursor cells from adult stem cells, the composition for inducing differentiation, and a cell therapeutic agent for treating diabetes comprising the pancreatic precursor cells as an active ingredient. . The method for producing pancreatic beta-like cells of the present invention was maximized the efficiency of differentiation by sequentially applying stepwise differentiation as a two-step differentiation induction method, and established a differentiation method from various adult stem cells to diabetic disease. To provide new treatment alternatives.
현재 당뇨병은 2억 명 이상의 환자들이 겪고 있는 질병이며, 2025년에 이르면 환자의 수가 2배로 증가될 것으로 예상되는 우리나라를 포함한 세계 각국에서 높은 발병률과 사망률 그리고 당뇨 질환으로 인한 합병증으로 문제가 되는 질환이다. 당뇨병은 인슐린을 분비하는 췌장 베타 세포의 문제로 의한 제 1형 당뇨병과 인슐린은 정상적으로 분비되나 인슐린에 대한 민감성의 감소로 인한 제 2형 당뇨병으로 분류된다. 이 중 인슐린 의존성인 제 1형 당뇨병은 췌장 내 베타세포의 자가면역반응에 의해 파괴되는 질병으로서 이 병에 걸린 환자는 지속적으로 인슐린 주사를 맞아야 하고 망막질환, 심장 및 신장 질환, 신경장애 등의 합병증에 의해 극심한 고통을 겪게 된다. 제 1형 당뇨병의 경우는 정상적인 인슐린 분비가 이루어진다면 질병의 치료가 가능하기 때문에 췌장 베타 세포를 이식하는 방법도 사용하고 있으나, 췌장 베타 세포의 이식의 경우 기증자의 수가 많지 않으며, 기증자를 찾는다고 하더라도 세포를 이식받을 환자와의 조직 거부 반응에 의한 문제점도 남아 있다. 이러한 문제점으로 제 1형 당뇨병의 경우 치료가 용이하지 못하다. 이러한 치료상의 문제점을 해결하기 위하여 줄기세포를 세포치료제로 활용한 당뇨병 치료에 대한 연구가 새롭게 각광받고 있다.
Diabetes is a disease that more than 200 million patients are suffering from, and it is a problem caused by high incidence, mortality rate and complications from diabetes in countries around the world, including Korea, where the number of patients is expected to double by 2025. . Diabetes is classified as
지금까지 보고된 연구 결과들은 배아 줄기세포를 이용하거나 성체 줄기세포 중에서 골수 유래 줄기세포 등을 이용하는 경우가 대부분이다. 종래의 보고에 따르면, 배아 줄기세포를 이용한 분화는 자연적으로 배아 줄기세포가 췌장 베타 세포로 분화하는 방식을 채택하고 있어, 분화된 췌장 세포의 수가 매우 적으며, 배아 줄기세포를 사용함에 따른 윤리적 문제와 암 발생 문제 및 원치 않는 조직으로 분화가 된다는 문제점이 있다. 성체 줄기세포 중 골수 유래 줄기세포는 침습적인 방법으로 세포를 획득해야 하는 점과 골수를 수급할 공여자가 많지 않다는 문제점이 있다. 또한, 성체 줄기세포를 이용한 췌장 베타 세포로의 분화법은 현재까지 배아 줄기세포의 분화법을 따르고 있는 실정이다. 이외에 랑게르한스섬 (pancreatic islet)을 직접 이식하는 경우가 당뇨병에서 효과가 있다고 알려져 있으나, 공여자의 부족과 랑게르한스섬에서 직접세포를 추출하고 증폭이 쉽지 않다는 점이 세포치료제로써의 한계가 있다.Most of the studies reported so far use embryonic stem cells or bone marrow-derived stem cells among adult stem cells. According to the conventional report, the differentiation using embryonic stem cells naturally adopts the method of differentiating embryonic stem cells into pancreatic beta cells, so the number of differentiated pancreatic cells is very small, and the ethical problem of using embryonic stem cells. And there is a problem that cancer is caused and differentiation into unwanted tissue. Among adult stem cells, bone marrow-derived stem cells have a problem in that they need to acquire cells in an invasive manner and there are not many donors to receive bone marrow. In addition, the differentiation of pancreatic beta cells using adult stem cells has been followed by the differentiation of embryonic stem cells. In addition, direct transplantation of pancreatic islets is known to be effective in diabetes. However, the lack of donors and the difficulty of directly extracting and amplifying cells from Langerhans is difficult as cell therapy.
이러한 문제를 해결해 줄 수 있는 한가지의 수단으로, 무한 증식력을 보유하는 줄기세포를 이용하는 방법에 많은 연구가 집중되고 있다. 줄기세포 (stem cells)는 스스로 복제하는 능력, 즉 자기복제 능력을 가지고 있으면서, 2가지 이상의 배엽 유래 세포로의 분화가 가능한 세포를 말한다. 줄기세포는 세포를 획득하는 소스 (source)에 따라서 성체 줄기세포 (adult stem cells)와 배아 줄기세포 (embryonic stem cells)로 구분할 수 있다. 이러한 줄기세포는 줄기세포 자체의 특이적인 능력인 분화능력, 즉 다양한 세포로 분화가 가능하고 특화될 수 있다는 점에서 많은 질병에서 세포치료제로 이용되는 연구가 이뤄지고 있다.As a means to solve this problem, a lot of research has been focused on how to use stem cells having infinite proliferation. Stem cells are cells that have the ability to replicate themselves, that is, to self-replicate, and to differentiate into two or more germ-derived cells. Stem cells can be divided into adult stem cells and embryonic stem cells, depending on the source from which the cells are obtained. These stem cells are being used as cell therapeutics in many diseases in that differentiation ability, that is, the specific ability of stem cells itself, that can differentiate into various cells and can be specialized.
이러한 줄기세포의 능력 때문에 줄기세포연구에 대한 관심은 고조되었으며, 지금까지는 치료가 불가능하거나 어려웠던 난치성 질병들에 연구가 진행되고 있다. 파킨슨병, 뇌손상 질병, 척수 손상 질병, 암 관련 질환, 당뇨병, 버거씨 병과 같은 질환에 줄기세포의 적용으로 인한 치료 가능성이 제시되고 있다.Interest in stem cell research has been raised due to the ability of such stem cells, and research is being conducted on refractory diseases that have been incurable or difficult until now. The possibility of treatment by stem cells for diseases such as Parkinson's disease, brain injury disease, spinal cord injury disease, cancer-related disease, diabetes and Burger's disease has been suggested.
줄기세포 중 배아 줄기세포의 경우는 분화능력이 우수하다. 특히 분화능력 중 전분화능 (pluripotency)이 가능하기 때문에 세포치료제로써 사용가능한 소스로 생각되었으며, 이에 많은 연구가 진행되었다. 그러나 배아 줄기세포의 경우는 줄기세포를 획득하는 것 자체가 배아를 이용해야 한다는 부분에서 상기에서 지적한 문제점과 같이, 많은 제한을 가지고 있다. 즉, 배아 줄기세포를 얻기 위해서 배아를 사용해야 한다는 점은 질병을 치료하기 위한 세포 수의 확보에 제한이 있다. 무엇보다 배아를 이용한 줄기세포의 사용은 윤리적인 문제를 피할 수 없다. 또한, 여러 동물실험에서도 증명된 바와 같이, 배아 줄기세포를 사용할 경우 암 발생에 대한 위험을 극복하기 어렵다는 문제점이 있다.Among the stem cells, embryonic stem cells have excellent differentiation ability. In particular, because of the differentiation ability (pluripotency) was considered as a source that can be used as a cell therapy, many studies have been conducted. However, in the case of embryonic stem cells, there are many limitations, such as the problem pointed out above in that the stem cell acquisition itself must use the embryo. In other words, the use of embryos to obtain embryonic stem cells is limited in securing the number of cells to treat the disease. Above all, the use of embryonic stem cells cannot avoid ethical problems. In addition, as demonstrated in several animal experiments, there is a problem that it is difficult to overcome the risk of cancer when using embryonic stem cells.
성체 줄기세포는 배아 줄기세포와 비교할 때, 분화능력은 다분화능 (multipotency)이라는 점에서 배아 줄기세포보다는 제한적이다. 하지만 배아 줄기세포가 당면한 윤리적인 문제를 극복할 수 있고, 동물에 배아 줄기세포를 투여 시 발생하는 암 발생에 대한 위험은 없다. 특히 성체 줄기세포는 그 소스가 다양한 장점이 있다. 이 중 태반 유래 상피 줄기세포는 성체 줄기세포로 최근에 다양한 연구가 활발히 진행되고 있다. 태반 유래 상피 줄기세포의 경우는 분만 시 나오는 태반에서 추출하게 되는데, 현재까지의 연구에 의하면 많은 양의 줄기세포를 추출할 수 있으며, 태반 자체가 폐기물로 분류되기 때문에 성체 줄기세포의 소스로 사용되기 충분하다. 즉, 이러한 태반 유래 상피 줄기세포는 다른 성체 줄기세포와는 달리 버려지는 자원을 활용하기 때문에 접근성이 용이하고, 활용성에서도 우수하다. 이러한 이유로 인해서 성체 줄기세포를 이용한 많은 연구들이 이뤄지고 있다. 그러나, 아직까지 태반 유래 상피 줄기세포를 이용한 췌장 베타 세포의 확립된 분화방법은 보고된 바가 없다.
Adult stem cells are more limited than embryonic stem cells in that their differentiation capacity is multipotency compared to embryonic stem cells. However, ethical problems faced by embryonic stem cells can be overcome and there is no risk of cancer from developing embryonic stem cells in animals. In particular, adult stem cells have various advantages in their sources. Of these, placental-derived epithelial stem cells are adult stem cells, and various studies have recently been actively conducted. Placenta-derived epithelial stem cells are extracted from the placenta during delivery. To date, studies have shown that a large amount of stem cells can be extracted, and since the placenta itself is classified as a waste, it is used as a source of adult stem cells. Suffice. In other words, the placenta-derived epithelial stem cells, unlike other adult stem cells, utilize easily discarded resources and are easily accessible and have excellent utility. For this reason, many studies using adult stem cells are being conducted. However, no established differentiation method of pancreatic beta cells using placental-derived epithelial stem cells has been reported.
이와 같은 배경하에서, 본 발명자들은 윤리적인 문제와 암 발생의 문제점을 극복할 수 있는 줄기세포의 소스로서 성체 줄기세포에 초점을 맞추어, 효율적이고 간단한 췌장 베타 세포로 분화시키는 능동적인 방법을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 성체 줄기세포를 액티빈-A, 부티르산 나트륨 및 KGF를 순차적으로 처리하여 췌장 베타 유사세포로 분화시키는 2단계 방법을 확립하고, 분화된 췌장 베타 유사세포가 인슐린 및 c-펩타이드를 분비하는 것을 확인한 후 본 발명을 완성하였다.Against this background, the present inventors focus on adult stem cells as a source of stem cells capable of overcoming ethical and cancer development problems, and to develop an active method for differentiating into efficient and simple pancreatic beta cells. As a result of our efforts, we established a two-step method of differentiating adult stem cells into pancreatic beta-like cells by sequentially treating activin-A, sodium butyrate and KGF, and differentiated pancreatic beta-like cells secrete insulin and c-peptide. After confirming that the present invention was completed.
본 발명은 이에 기초한 것으로, 성체 줄기세포를 EGM-2 배지를 기본으로 액티빈-A, 부티르산 나트륨 및 KGF를 순차적으로 처리하여 췌장 전구세포 및 췌장 베타 유사세포로 분화를 유도하는 2단계 분화 단계에 의한 췌장 전구세포 및 췌장 베타 유사세포의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한 상기 제조 방법에 사용되는 분화 유도용 조성물, 상기 제조 방법에 의해 제조된 췌장 전구세포 및 췌장 유사세포, 및 상기 췌장 전구세포 및 췌장 유사세포를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 치료용 세포치료제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
In accordance with the present invention, adult stem cells are sequentially treated with activin-A, sodium butyrate and KGF based on EGM-2 medium to induce differentiation into pancreatic progenitor cells and pancreatic beta-like cells. An object of the present invention is to provide a method for producing pancreatic progenitor cells and pancreatic beta-like cells. In addition, to provide a composition for inducing differentiation used in the production method, pancreatic progenitor cells and pancreas-like cells prepared by the production method, and the pancreatic progenitor cells and pancreas-like cells as an active ingredient for treating diabetes mellitus For the purpose of
본 발명은 (a) 성체 줄기세포를 액티빈-A를 포함하는 배지에서 배양하여 췌장 전구세포로 분화시키는 제1단계; 및 (b) 상기 제1단계의 분화된 세포를 KGF (Keratinocyte Growth Factor)를 포함하는 배지에서 배양하여 췌장 베타 유사세포로 분화시키는 제2단계를 포함하는, 성체 줄기세포로부터 췌장 베타 유사세포를 제조하는 방법을 제공한다.The present invention comprises the steps of: (a) culturing adult stem cells in a medium containing activin-A to differentiate into pancreatic progenitor cells; And (b) a second step of culturing the differentiated cells of the first step in a medium containing KGF (Keratinocyte Growth Factor) to differentiate into pancreatic beta-like cells, preparing pancreatic beta-like cells from adult stem cells. Provide a way to.
또한, 본 발명은 성체 줄기세포를 액티빈-A 및 부티르산 나트륨을 포함하는 배지, 및 액티빈-A 및 BSA를 포함하는 배지에서 배양하여 췌장 전구세포로 분화시켜서 췌장 전구세포를 제조하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for producing pancreatic progenitor cells by culturing adult stem cells in a medium containing activin-A and sodium butyrate, and in the medium containing activin-A and BSA to differentiate into pancreatic progenitor cells. do.
나아가, 본 발명은 EGM-2 배지에 액티빈-A 및 BSA를 포함하는, 성체 줄기세포로부터 췌장 전구세포 분화 유도용 키트를 제공한다.Furthermore, the present invention provides a kit for inducing pancreatic progenitor differentiation from adult stem cells, comprising activin-A and BSA in EGM-2 medium.
또한, 본 발명은 EGM-2 배지에 KGF 및 BSA를 포함하는, 췌장 전구세포로부터 췌장 베타 유사세포 분화 유도용 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for inducing pancreatic beta-like cell differentiation from pancreatic progenitor cells, comprising KGF and BSA in EGM-2 medium.
본 발명은 상기 췌장 베타 유사세포 제조 방법에 의해 제조된 췌장 베타 유사세포; 및 상기 췌장 베타 유사세포를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 치료용 세포치료제를 제공한다.The present invention provides pancreatic beta-like cells prepared by the method for producing pancreatic beta-like cells; And it provides a cell therapy for the treatment of diabetes comprising the pancreatic beta-like cells as an active ingredient.
본 발명은 상기 췌장 전구세포 제조 방법에 의해 제조된 췌장 전구세포; 및 상기 췌장 전구세포를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 치료용 세포치료제를 제공한다.The present invention is a pancreatic progenitor cell prepared by the method for producing pancreatic progenitor cells; And it provides a cell therapy for treating diabetes comprising the pancreatic progenitor cells as an active ingredient.
본 발명은 상기 당뇨병 치료용 세포치료제를 당뇨병에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 당뇨병 치료 방법을 제공한다.The present invention provides a method for treating diabetes comprising administering the cell therapy agent for treating diabetes to a subject suffering from diabetes.
하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 성체 줄기세포를 액티빈-A를 포함하는 배지에서 배양하여 췌장 전구세포로 분화시키는 제1단계; 및 (b) 상기 제1단계의 세포를 KGF (Keratinocyte Growth Factor)를 포함하는 배지에서 배양하여 췌장 베타 유사세포로 분화시키는 제2단계를 포함하는, 성체 줄기세포로부터 췌장 베타 유사세포를 제조하는 방법을 제공한다.In one embodiment, the present invention comprises the steps of (a) culturing adult stem cells in a medium containing activin-A to differentiate into pancreatic progenitor cells; And (b) culturing the cells of the first step in a medium containing keratinocyte growth factor (KGF) to differentiate into pancreatic beta-like cells, the method of producing pancreatic beta-like cells from adult stem cells. To provide.
본 발명에서 용어, "성체 줄기세포"란 발생과정이 진행되어 배아의 각 장기가 형성되는 단계 혹은 성체단계에서 나타나는 줄기세포를 지칭한다. 성체 줄기세포는 그 분화능이 일반적으로 특정 조직을 구성하는 세포로만 한정된다. 이러한 성체줄기세포는 성인이 된 후에도 대부분의 장기에 남아 정상적으로 혹은 병리적으로 발생하는 세포의 손실을 보충하는 역할을 담당한다. 이는 조직 내 존재하는 줄기세포를 분리해 체외에서 배양한 것으로 다능성 (multipotency)을 가지는 세포를 의미하며, 본 발명의 목적상 본 발명의 2단계 분화 유도 방법이 적용되는 성체 줄기세포는 그 예로 이에 제한되는 것은 아니나, 골수줄기세포, 망막줄기세포, 망막내 뮐러아교세포, 신경줄기세포, 태반 유래 상피 줄기세포, 와트슨 젤리 유래 줄기세포 또는 제대혈 유래 줄기세포 등이 있으며, 바람직하게는 태반 유래 상피 줄기세포, 와트슨 젤리 유래 줄기세포 또는 제대혈 유래 줄기세포일 수 있다. 본 발명의 바람직한 일 구현예에서 본 발명자들은 태반 유래 상피 줄기세포, 와트슨 젤리 유래 줄기세포 또는 제대혈 유래 줄기세포가 본 발명의 2단계 분화 방법에 의해 췌장 베타 유사세포로 분화하는 것을 확인하였다 (도 3 내지 9).In the present invention, the term "adult stem cells" refers to stem cells that appear during the development or development of each organ of the embryo or adult stage. Adult stem cells are generally limited to cells that make up a specific tissue. These adult stem cells remain in most organs after adulthood and play a role in supplementing the loss of normal or pathological cells. This means that the stem cells existing in the tissues are cultured in vitro and have a pluripotent (multipotency) cell. For the purpose of the present invention, adult stem cells to which the two-step differentiation induction method of the present invention is applied are examples thereof. Although not limited, there are bone marrow stem cells, retinal stem cells, intraretinal Müller cells, neural stem cells, placental-derived epithelial stem cells, Watson Jelly-derived stem cells or umbilical cord blood-derived stem cells, preferably placental-derived epithelial stem cells. It may be a Watson jelly-derived stem cells or umbilical cord blood-derived stem cells. In a preferred embodiment of the present invention, the inventors confirmed that placental-derived epithelial stem cells, Watson Jelly-derived stem cells, or cord blood-derived stem cells differentiate into pancreatic beta-like cells by the two-step differentiation method of the present invention (FIG. 3). To 9).
본 발명에서 동물이란 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개, 쥐, 랫트 및 고양이 등의 가축을 포함하며, 바람직하게는 인간이다.Animals in the present invention include not only humans and primates, but also domestic animals such as cattle, pigs, sheep, horses, dogs, mice, rats, and cats, and are preferably humans.
본 발명에서 용어, "췌장 전구세포"란 췌장 발생에 관여하는 유전자를 발현하여 췌장을 이루는 모든 세포로 분화할 수 있는 다능성 (multipotency)을 보유하는 세포를 의미하며, 이는 췌장을 구성하는 여러 종류의 세포로 분화할 수 있는 다능성을 보유하고 있기 때문에 췌장 세포, 조직 또는 장기의 이식을 필요로 하는 각종 췌장 질환의 치료에 이용될 수 있다. 바람직하게는 췌장의 인슐린 분비가 문제되어 발생하는 제 1형 당뇨병의 치료에 이용될 수 있다.As used herein, the term "pancreatic progenitor cell" refers to a cell having a multipotency capable of expressing a gene involved in pancreas development and differentiating into all cells of the pancreas, which are various kinds constituting the pancreas. Because of its pluripotency to differentiate into cells, it can be used for the treatment of various pancreatic diseases requiring transplantation of pancreatic cells, tissues or organs. Preferably, the pancreas may be used for the treatment of
본 발명에서 용어, "췌장 베타 유사세포" 또는 "췌장 베타 세포"는 상호 교환되어 사용될 수 있으며, 이는 췌장의 랑게르한스섬을 구성하는 세포의 하나로, 인슐린을 생성 분비하는 세포이다. 췌장 베타 세포에 문제가 있을 경우, 인슐린의 생성에 문제가 있어 제 1형 당뇨병을 유발할 수 있다. 따라서, 이와 같은 세포는 췌장의 인슐린 분비가 문제되어 발생하는 제 1형 당뇨병의 치료에 이용될 수 있다.In the present invention, the term "pancreatic beta-like cell" or "pancreatic beta cell" may be used interchangeably, which is one of the cells constituting the islet of pancreatic islet, which is a cell that produces and secretes insulin. Problems with pancreatic beta cells can lead to insulin production, which can lead to
본 발명에 따라 성체 줄기세포를 췌장 베타 유사세포로 분화를 유도하여 췌장 베타 유사세포를 제조하는 방법은 2단계의 분화 유도 과정을 통하여 분화가 유도된다. 이와 같은 2단계의 분화 유도 단계에 대해서는 도 1에 간략히 도시하였다.According to the present invention, the method for producing pancreatic beta-like cells by inducing differentiation of adult stem cells into pancreatic beta-like cells is induced through differentiation induction process in two steps. Such two differentiation induction steps are briefly shown in FIG. 1.
바람직한 일 실시태양으로, (a) 성체 줄기세포를 액티빈-A를 포함하는 배지에서 배양하여 췌장 전구세포로 분화시키는 제1단계는 다시 (i) 액티빈-A 및 부티르산 나트륨 (sodium butyrate)을 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및 (ii) 액티빈-A 및 BSA (bovine serum albumin)를 포함하는 배지에서 배양하는 단계로 나뉘어질 수 있다. 액티빈-A 및 부티르산 나트륨은 내배엽 (endoderm)으로의 분화를 촉진시키며, BSA는 세포 성장을 촉진시켜 주는 역할을 한다. 즉, 성체줄기세포를 내배엽, 특히 췌장 내배엽 쪽으로 분화를 유도시킨 후, 많은 양의 세포가 분화될 수 있도록 세포 성장을 촉진시키는 BSA를 첨가하여, 다른 계열로의 분화 유도를 방지하였다.In a preferred embodiment, (a) the first step of culturing adult stem cells in a medium comprising activin-A to differentiate into pancreatic progenitor cells further comprises (i) activin-A and sodium butyrate. Culturing in a medium containing; And (ii) culturing in a medium comprising activin-A and bovine serum albumin (BSA). Activin-A and sodium butyrate promote differentiation into endoderm and BSA promotes cell growth. That is, after inducing adult stem cells into endoderm, especially pancreatic endoderm, BSA was added to promote cell growth so that a large amount of cells could be differentiated, thereby preventing induction of differentiation into other lines.
제1단계는 성체 줄기세포가 췌장 전구세포로 분화하기에 적절한 기간 동안 제한 없이 배양할 수 있으나, 바람직하게는 18시간 내지 84시간이고, 더 바람직하게는 3일일 수 있다. 상기 (i) 단계는 바람직하게는 18시간 내지 30시간이고, 더 바람직하게는 1일일 수 있다. 상기 (ii) 단계는 바람직하게는 42시간 내지 54시간이고, 더 바람직하게는 2일일 수 있다.In the first step, adult stem cells may be cultured without restriction for an appropriate period of time to differentiate into pancreatic progenitor cells, but preferably 18 hours to 84 hours, more preferably 3 days. Step (i) is preferably 18 hours to 30 hours, more preferably 1 day. Step (ii) is preferably 42 hours to 54 hours, more preferably 2 days.
제1단계의 액티빈-A의 농도는 성체 줄기세포를 췌장 전구세포로 분화시키기에 적당한 농도인 한 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 2 nM 내지 6 nM 이고, 더 바람직하게는 4 nM 일 수 있다. 상기 (i) 단계의 액티빈-A의 농도는 바람직하게는 2 nM 내지 6 nM 이고, 더 바람직하게는 4 nM 일 수 있으며, 부티르산 나트륨의 농도는 바람직하게는 0.5 mM 내지 1.5 mM이고, 더 바람직하게는 1 mM일 수 있다. 상기 (ii) 단계의 액티빈-A의 농도는 바람직하게는 2 nM 내지 6 nM 이고, 더 바람직하게는 4 nM 일 수 있으며, BSA의 농도는 바람직하게는 0.05wt% 내지 0.15wt%이고, 더 바람직하게는 0.1wt%일 수 있다.The concentration of activin-A in the first step may be used without limitation as long as it is a concentration suitable for differentiating adult stem cells into pancreatic progenitor cells, preferably 2 nM to 6 nM, more preferably 4 nM. have. The concentration of activin-A in step (i) is preferably 2 nM to 6 nM, more preferably 4 nM, the concentration of sodium butyrate is preferably 0.5 mM to 1.5 mM, more preferably Preferably 1 mM. The concentration of activin-A in the step (ii) is preferably 2 nM to 6 nM, more preferably 4 nM, the concentration of BSA is preferably 0.05wt% to 0.15wt%, more Preferably 0.1 wt%.
바람직한 일 실시태양으로, 상기 제1단계의 세포를 KGF (Keratinocyte Growth Factor)를 포함하는 배지에서 배양하여 췌장 베타 유사세포로 분화시키는 제2단계에 있어서, BSA를 추가로 포함할 수 있다.In a preferred embodiment, in the second step of culturing the cells of the first step in a medium containing KGF (Keratinocyte Growth Factor) to differentiate into pancreatic beta-like cells, BSA may be further included.
제2단계는 췌장 전구세포가 췌장 베타 유사세포로 분화하기에 적절한 기간 동안 제한 없이 배양할 수 있으나, 바람직하게는 66시간 내지 78시간이고, 더 바람직하게는 3일일 수 있다.In the second step, the pancreatic progenitor cells may be cultured without restriction for an appropriate period of time to differentiate into pancreatic beta-like cells, but preferably 66 hours to 78 hours, more preferably 3 days.
이와 같이, 본 발명의 분화 유도를 통한 췌장 베타 유사세포의 제조 방법은 2단계의 단순한 배양 및 최소 6일간 배양으로 성체 줄기세포로부터 췌장 베타 유사세포를 효율적으로 제조할 수 있으며, 이와 같은 방법은 본 발명자들에 의해 최초로 개발된 것이다.As described above, the method for producing pancreatic beta-like cells by inducing differentiation of the present invention can efficiently produce pancreatic beta-like cells from adult stem cells by simple two-step culture and at least 6 days of culture. It was first developed by the inventors.
제2단계의 KGF의 농도는 췌장 전구세포를 췌장 베타 유사세포로 분화시키기에 적당한 농도인 한 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 25 ng/㎖ 내지 75 ng/㎖ 이고, 더 바람직하게는 50 ng/㎖ 일 수 있다. BSA의 농도는 바람직하게는 0.5wt% 내지 1.5wt%이고, 더 바람직하게는 1.0wt%일 수 있다.The concentration of KGF in the second stage can be used without limitation as long as it is a concentration suitable for differentiating pancreatic progenitor cells into pancreatic beta-like cells, preferably 25 ng / ml to 75 ng / ml, more preferably 50 ng. / Ml. The concentration of BSA is preferably 0.5wt% to 1.5wt%, more preferably 1.0wt%.
상기 제1단계 및 제2단계에서 사용하는 기본 배지는 당업계에 공지된 줄기세포를 배양하는 배지라고 통상적으로 사용되는 줄기세포 배양용 배지들을 제한 없이 사용할 수 있으나, 그 예로 DMEM, DMEM/F12, α-MEM, EGM-2일 수 있으며, 바람직하게는 EGM-2이다. 또한 바람직하게 상기 제1단계 및 제2단계에서 사용하는 배지는 혈청을 포함하지 않는 무혈청 배지일 수 있다.The basal medium used in the first step and the second step may be used without limitation, a medium for stem cell culture that is commonly used as a medium for culturing stem cells known in the art, for example DMEM, DMEM / F12, α-MEM, EGM-2, preferably EGM-2. Also preferably, the medium used in the first and second steps may be a serum-free medium containing no serum.
본 발명에서 용어 "무혈청 배지"란 배양되는 세포를 오염시키거나 이식거부를 유발할 수 있는 외래종 또는 동종의 혈청을 포함하지 않는 임의의 세포 배양 배지를 의미하며, 혈청 대체물을 추가적으로 포함할 수 있다. 무혈청 배지의 예로서, 이에 제한되는 것은 아니나, 넉아웃 혈청 대체재 (knockout serum replacement) 등 통상적으로 구입할 수 있는 혈청 대체물을 사용할 수 있다. 상기와 같은 무혈청 배지의 사용은 혈청 배지 내에 존재하는 우태아혈청 (FBS) 또는 우혈청 (FCS)과 같은 소유래의 물질로 인한 광우병 바이러스 등을 비롯한 오염원을 포함하고 있을 가능성으로 인한 임상학적 적용에 있어서 발생할 수 있는 위험을 제거할 수 있다. 또한 무혈청 배지를 사용하는 경우, 혈청 내의 단백질이 항체 형성을 유도하여 이로 인한 이식된 세포의 이식 거부를 일으킬 위험 등을 제거할 수 있어서 본 발명의 분화 방법에 의해 제조된 췌장 전구 세포 또는 췌장 베타 유사세포를 췌장 관련 질환, 즉 당뇨병의 세포 치료제로 임상학적 위험 없이 적용할 수 있다. 또한 본 발명의 무혈청 배지는 혈청에 존재하는 다양한 성장인자 등이 존재하지 않아서, 본 발명이 목적하는 췌장 전구세포 또는 췌장 베타 유사세포로의 분화 유도를 더 효율적으로 할 수 있게 한다.As used herein, the term "serum-free medium" refers to any cell culture medium that does not include foreign or homologous serum that may contaminate the cultured cell or cause transplant rejection, and may further include a serum substitute. Examples of serum-free media include, but are not limited to, commercially available serum substitutes such as knockout serum replacement. The use of such serum-free media has clinical applications due to the possibility of containing contaminants, including mad cow disease virus due to proprietary materials such as fetal bovine serum (FBS) or bovine serum (FCS) present in serum medium. This can eliminate the risks that can arise. In addition, when serum-free medium is used, the pancreatic progenitor cells or pancreatic beta produced by the differentiation method of the present invention can be eliminated because the protein in serum can induce the formation of antibodies and thereby cause the rejection of transplanted cells. Like cells can be applied as a cell therapy for pancreatic related diseases, ie diabetes, without clinical risk. In addition, since the serum-free medium of the present invention does not have various growth factors and the like present in the serum, the present invention enables more efficient induction of differentiation into the desired pancreatic progenitor cells or pancreatic beta-like cells.
본 발명의 바람직한 일 구현예에서, 본 발명자들은 인간 성체 줄기세포인 태반 유래 상피 줄기세포, 와트슨 젤리 유래 줄기세포, 및 제대혈 유래 줄기세포 각각을 무혈청 EGM-2 배지를 기본 배지로 하여, 4 nM의 액티빈-A 및 1 mM의 부티르산 나트륨을 1일간 처리한 후, EGM-2 기본 배지에 4 nM의 액티빈-A 및 0.1% BSA를 첨가한 분화배지를 2일간 처리하여 췌장 전구세포의 분화를 유도하는 제1단계를 거친 후, EGM-2 기본 배지에 50 ng/㎖의 KGF를 3일간 처리하여 췌장 베타 유사세포로 분화시키는 제2단계를 포함하는 2단계 분화 방법을 확립하였다. 각 단계별 췌장 베타 유사세포의 특이적인 유전자의 발현 양상을 RT-PCR로 확인한 결과, 췌장 전구세포 관련 유전자인 Nkk6.1이 제1단계에 발현되는 것을 확인하였으며, 성숙한 췌장 베타 세포 마커로 알려진 CX36, INS, GCG, PPY 등이 제2단계에서 발현하는 것을 확인하여 (도 3), 본 발명의 분화 유도 방법이 단시간 내에 간단한 방법으로 췌장 베타 유사세포 및 췌장 전구세포를 제조할 수 있음을 확인하였다. 아울러, mRNA 수준이 아닌 단백질 발현을 확인한 결과, c-펩타이드 및 인슐린을 제2단계에 의해 분화시킨 세포들이 발현하는 것을 확인하였으며 (도 4 내지 6), 배지 내로 인슐린 및 c-펩타이드를 분비하는 것을 확인하였다 (도 7 내지 9). 또한, 글루코스에 인슐린이 반응하는 것을 확인하여 (도 7 내지 9), 본 발명의 분화방법에 의해서 다양한 성체 줄기세포로부터 인체 내의 정상적인 기능을 하는 췌장 베타 유사세포를 제조할 수 있음을 확인하였다.
In a preferred embodiment of the present invention, the inventors of the present invention are human adult stem cells, placenta-derived epithelial stem cells, Watson Jelly-derived stem cells, and umbilical cord blood-derived stem cells, respectively, using serum-free EGM-2 medium as a base medium, 4 nM Differentiation of pancreatic progenitor cells by treatment of activin-A and 1 mM sodium butyrate for 1 day, followed by differentiation medium containing 4 nM of activin-A and 0.1% BSA in EGM-2 basal medium for 2 days. After the first step of inducing the two-step differentiation method comprising a second step of differentiating into pancreatic beta-like cells by treating the EGM-2 basal medium with 50 ng / ㎖ KGF for 3 days. As a result of confirming the expression of specific genes of pancreatic beta-like cells by each step by RT-PCR, it was confirmed that Nkk6.1, a pancreatic progenitor cell-related gene, was expressed in the first stage, and CX36, known as a mature pancreatic beta cell marker, Confirming that INS, GCG, PPY, etc. are expressed in the second step (Fig. 3), it was confirmed that the differentiation induction method of the present invention can be prepared in a short time pancreatic beta-like cells and pancreatic progenitor cells. In addition, as a result of confirming protein expression but not mRNA level, it was confirmed that the cells differentiated from c-peptide and insulin by the second step were expressed (FIGS. 4 to 6), and secreting insulin and c-peptide into the medium. It was confirmed (FIGS. 7-9). In addition, by confirming that insulin responds to glucose (FIGS. 7 to 9), it was confirmed that pancreatic beta-like cells having normal functions in the human body can be prepared from various adult stem cells by the differentiation method of the present invention.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 성체 줄기세포를 액티빈-A를 포함하는 배지에서 배양하여 췌장 전구세포로 분화시키는 단계를 포함하는, 췌장 전구세포를 제조하는 방법을 제공한다.As another aspect, the present invention provides a method for producing pancreatic progenitor cells comprising culturing adult stem cells in a medium comprising activin-A to differentiate into pancreatic progenitor cells.
상기 방법은 바람직하게는 (i) 액티빈-A 및 부티르산 나트륨 (sodium butyrate)을 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및 (ii) 액티빈-A 및 BSA (bovine serum albumin)를 포함하는 배지에서 배양하는 단계에 의해 수행되어질 수 있다.The method preferably comprises the steps of: (i) culturing in a medium comprising activin-A and sodium butyrate; And (ii) culturing in a medium comprising activin-A and bovine serum albumin (BSA).
액티빈-A, 부티르산 나트륨, BSA의 농도, 배양기간 등은 상기에서 설명한 바와 같다.
The concentration of activin-A, sodium butyrate, BSA, incubation period and the like are as described above.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 EGM-2 배지에 액티빈-A를 포함하는, 성체 줄기세포로부터 췌장 전구세포 분화 유도용 키트를 제공한다.As another aspect, the present invention provides a kit for inducing pancreatic progenitor differentiation from adult stem cells, comprising activin-A in EGM-2 medium.
본 발명에 따른 분화 유도용 키트에 포함된 배지는 다른 배지에 비해 세포 생존율이 우수하여 분화 효율을 극대화할 수 있다. 본 발명의 바람직한 일 구현예에서, 본 발명자들은 본 발명의 EGM-2 배지와 EBM-2 배지, low glucose DMEM 배지, high glucose DMEM 배지와의 분화 효율을 비교한 결과, EGM-2 배지를 사용할 경우에 분화 효율이 극대화된 것을 확인하여 (도 10), 본 발명의 배지가 최적의 배지임을 확인하였다.The medium contained in the kit for inducing differentiation according to the present invention can maximize the differentiation efficiency by excellent cell viability compared to other media. In one preferred embodiment of the present invention, the present inventors compared the differentiation efficiency of the EGM-2 medium and EBM-2 medium, low glucose DMEM medium, high glucose DMEM medium of the present invention, when using EGM-2 medium By confirming that the differentiation efficiency was maximized (FIG. 10), it was confirmed that the medium of the present invention is the optimal medium.
발명의 분화 유도용 키트에는 분화 유도용 배지 이외에 줄기세포의 배양에 필요한 것으로 당업계에 공지된 물질을 제한 없이 포함할 수 있다. The kit for inducing differentiation of the present invention may include, without limitation, a substance known in the art as required for the culture of stem cells in addition to the medium for inducing differentiation.
상기 분화 유도용 키트는 바람직하게는 액티빈-A 및 부티르산 나트륨을 포함하는 EGM-2 배지 및 액티빈-A 및 BSA를 포함하는 EGM-2 배지로 각각 분리된 것으로, 이들은 순차적으로 사용될 수 있다.The differentiation induction kit is preferably separated into EGM-2 medium containing activin-A and sodium butyrate and EGM-2 medium containing activin-A and BSA, respectively, which can be used sequentially.
더 바람직하게는 4 nM 액티빈-A 및 1 mM 부티르산 나트륨을 첨가한 EGM-2 배지를 1일간 처리하고, 4 nM 액티빈-A 및 0.1% BSA를 포함하는 EGM-2 배지를 2일간 처리하여 췌장 전구세포의 분화를 유도할 수 있다.
More preferably, EGM-2 medium containing 4 nM activin-A and 1 mM sodium butyrate was treated for 1 day, and EGM-2 medium containing 4 nM activin-A and 0.1% BSA was treated for 2 days. Can induce differentiation of pancreatic progenitor cells.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 EGM-2 배지에 KGF 및 BSA를 포함하는, 췌장 전구세포로부터 췌장 베타 유사세포 분화 유도용 조성물을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a composition for inducing pancreatic beta-like cell differentiation from pancreatic progenitor cells, comprising KGF and BSA in EGM-2 medium.
본 발명의 상기 분화 유도용 조성물은 다른 배지에 비하여 생존율이 우수하여 분화 효율을 극대화할 수 있다.The differentiation inducing composition of the present invention can maximize the differentiation efficiency by excellent survival rate compared to other media.
KGF는 췌장 전구세포를 췌장 베타 유사세포로 분화시키기에 적당한 농도인 한 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 25 ng/㎖ 내지 75 ng/㎖ 이고, 더 바람직하게는 50 ng/㎖ 일 수 있다. BSA의 농도는 바람직하게는 0.05% 내지 0.15%이고, 더 바람직하게는 0.1%일 수 있다.
KGF can be used without limitation so long as it is a concentration suitable for differentiating pancreatic progenitor cells into pancreatic beta-like cells, preferably 25 ng / ml to 75 ng / ml, more preferably 50 ng / ml. The concentration of BSA is preferably 0.05% to 0.15%, more preferably 0.1%.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 성체 줄기세포로부터 췌장 베타 유사세포를 제조하는 2단계 분화 방법에 의해 제조될 수 있는 췌장 베타 유사세포를 제공한다.As another aspect, the present invention provides a pancreatic beta-like cell which can be prepared by a two-step differentiation method for producing pancreatic beta-like cells from the adult stem cells.
본 발명에 의해 제조된 췌장 베타 유사세포는 하기의 특징을 갖는다:The pancreatic beta-like cells produced by the present invention have the following characteristics:
(a) Nkk6.1, NGN3, CX36, INS, GCG 및 PPY로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 발현함; (b) 인슐린을 분비함; 및 (c) c-펩타이드를 분비함.(a) expresses one or more genes selected from the group consisting of Nkk6.1, NGN3, CX36, INS, GCG and PPY; (b) secrete insulin; And (c) secrete c-peptide.
본 발명의 췌장 베타 유사세포는 췌장 전구세포 및 분화된 췌장 베타 유사세포의 마커인 Nkk6.1, NGN3, CX36, INS, GCG 또는 PPY을 발현하며 (도 3), 면역염색 및 ELISA 결과 c-펩타이드 (도 4 내지 9) 및 인슐린 (도 4 내지 9)이 검출된다. 이와 같은 결과는 본 발명의 방법에 의해 제조된 세포가 인슐린 생산 세포로의 성공적인 분화를 하였음을 뒷받침한다. c-펩타이드는 췌장 베타 유사세포의 인슐린 분비능을 알 수 있는 유용한 지표이다. 또한, 상기 분화들은 유세포 분석 또는 면역세포화학과 같은 기법을 사용하여 세포 표면 표지(예를 들어 조직-특이적 또는 세포-표지 특이적 항체로 세포를 염색함) 및 형태의 변화를 측정하면서, 광학 현미경 또는 공초점 현미경을 사용하여 세포의 형태를 조사함으로써, 또는 PCR 및 유전자-발현 프로파일과 같은 당해 분야에 익히 공지된 기법을 사용하여 유전자 발현양상의 변화를 측정함으로써 확인될 수 있다.
The pancreatic beta-like cells of the present invention express Nkk6.1, NGN3, CX36, INS, GCG or PPY, markers of pancreatic progenitors and differentiated pancreatic beta-like cells (FIG. 3), and immunostaining and ELISA result c-peptides. (FIGS. 4-9) and insulin (FIGS. 4-9) are detected. These results support the successful differentiation of cells produced by the methods of the invention into insulin producing cells. c-peptide is a useful indicator of the insulin secretion of pancreatic beta-like cells. The differentiation may also be performed using techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry to measure cell surface labeling (e.g., staining cells with tissue-specific or cell-labeling specific antibodies) and morphological changes, Or by examining the morphology of the cells using confocal microscopy, or by measuring changes in gene expression patterns using techniques well known in the art such as PCR and gene-expression profiles.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 성체 줄기세포로부터 췌장 전구세포를 제조하는 제1단계에 의해 제조될 수 있는 췌장 전구세포를 제공한다.As another aspect, the present invention provides a pancreatic progenitor cell that can be prepared by the first step of producing pancreatic progenitor cells from the adult stem cells.
본 발명에 의해 제조된 췌장 전구세포는 하기의 특징을 갖는다.The pancreatic progenitor cells produced by the present invention have the following characteristics.
(a) Nkx6.1 및 NGN3 유전자를 발현함.(a) Expresses Nkx6.1 and NGN3 genes.
본 발명의 췌장 전구세포는 췌장 전구세포의 마커인 Nkk6.1, NGN3를 발현한다 (도 3). 상기 분화들은 유세포 분석 또는 면역세포화학과 같은 기법을 사용하여 세포 표면 표지(예를 들어 조직-특이적 또는 세포-표지 특이적 항체로 세포를 염색함) 및 형태의 변화를 측정하면서, 광학 현미경 또는 공초점 현미경을 사용하여 세포의 형태를 조사함으로써, 또는 PCR 및 유전자-발현 프로파일과 같은 당해 분야에 익히 공지된 기법을 사용하여 유전자 발현양상의 변화를 측정함으로써 확인될 수 있다.The pancreatic progenitor cells of the present invention express Nkk6.1, NGN3, markers of pancreatic progenitor cells (FIG. 3). The differentiation may be performed using techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry to measure cell surface labels (e.g., staining cells with tissue-specific or cell-label specific antibodies) and changes in morphology, with light microscopy or co-operation. This can be confirmed by examining the morphology of the cells using a focal microscope or by measuring changes in gene expression using techniques well known in the art such as PCR and gene-expression profiles.
본 발명의 방법에 따른 췌장 전구세포는 췌장 전구세포와 관련된 약물의 유효성 및 안전성 테스트에 사용될 수 있다.
Pancreatic progenitor cells according to the methods of the present invention can be used for testing the efficacy and safety of drugs associated with pancreatic progenitor cells.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 췌장 전구체 세포 또는 췌장 베타 유사세포를 포함하는 당뇨병 치료용 세포치료제를 제공한다.As another aspect, the present invention provides a cell therapy agent for treating diabetes, comprising the pancreatic precursor cells or pancreatic beta-like cells.
본 발명에서 용어 "세포치료제"란 사람을 포함한 동물로부터 분리, 배양 및 특수한 저작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식?선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 지칭한다. 세포치료제는 세포의 분화정도에 따라 크게 체세포치료제, 줄기세포치료제로 분류되며 본 발명은 특히 줄기세포치료제에 관한 것이다.As used herein, the term "cell therapeutic agent" refers to a medicinal product (US FDA regulation) used for the purpose of treatment, diagnosis, and prevention of cells and tissues prepared from isolation, culture, and special chewing from animals including humans. Refers to a drug used for therapeutic, diagnostic and prophylactic purposes through a series of actions, such as proliferating or screening living autologous, allogeneic, or heterologous cells in vitro or altering the biological characteristics of cells in order to restore function do. Cell therapy agents are largely classified into somatic cell therapy and stem cell therapy according to the degree of differentiation of cells, and the present invention relates in particular to stem cell therapy.
본 발명의 당뇨병 치료용 세포치료제란 체외에서 인간 또는 동물 유래의 성체 줄기세포로부터 췌장 전구세포의 분화를 유도하여 췌장 전구세포를 대량 증식 및 활성화시켜 당뇨병 환자에게 투여하여 췌장 베타세포로 성장시키거나 혹은 랑게르한스섬과 같은 세포집합체를 형성시켜 당뇨병 치료에 이용할 수 있도록 만든 세포치료제를 말한다. 또는 체외에서 인간 또는 동물 유래의 성체 줄기세포로부터 췌장 베타 유사세포로의 분화를 유도하여 췌장 베타 유사세포를 대량 증식 및 활성화시켜 당뇨병 환자에게 투여하여 당뇨병 치료에 이용할 수 있도록 만든 세포치료제를 말한다.Cell therapy for the treatment of diabetes mellitus of the present invention induces the differentiation of pancreatic progenitor cells from adult stem cells derived from humans or animals in vitro, thereby proliferating and activating pancreatic progenitor cells to be administered to diabetic patients to grow into pancreatic beta cells or It refers to cell therapies that can be used to treat diabetes by forming cell aggregates such as Langerhans Island. Or it refers to a cell therapy made in vitro to induce the differentiation of adult stem cells derived from human or animal from pancreatic beta-like cells to proliferate and activate pancreatic beta-like cells to be administered to diabetic patients for use in the treatment of diabetes.
본 발명의 당뇨병 치료용 세포치료제는 당업계에 일반적인 제형, 예컨대, 주사제의 형태로 제조될 수 있으며, 외과수술적으로 췌장부위에 직접 이식하거나, 정맥에 투여된 후 췌장부위로 이동할 수 있다. 본 발명의 세포치료제의 투여량은 환자의 중함정도, 투여경로, 환자의 나이 및 성, 및 질병의 정도에 따라 변할 수 있으나, 바람직하게는 평균 성인의 경우, 1 × 107 내지 1011 개 세포를 투여한다.
Cell therapy for the treatment of diabetes of the present invention may be prepared in the form of a formulation common in the art, for example, injectable, and may be surgically implanted directly into the pancreatic region, or may be intravenously administered and then moved to the pancreatic region. The dose of the cell therapy of the present invention may vary depending upon the degree of jungham degree, the route of administration the patient, the age and sex of the patient, and the disease, and preferably an average for an adult, 1 × 10 7 to 10 11 cells To administer.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 당뇨병 치료용 세포치료제를 당뇨병에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 당뇨병 치료 방법을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a method for treating diabetes comprising administering the cell therapy agent for treating diabetes to a subject suffering from diabetes.
본 발명의 세포치료제의 투여는 임의의 동물에 적용가능하며, 동물은 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개, 쥐, 랫트 및 고양이 등의 가축을 포함한다. 본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 세포치료제를 도입하는 것을 의미하며, 분화된 세포의 이식을 포함한다. 본 발명의 세포치료제의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 바람직하게는 랑게르한스 섬 내 조직에 투여될 수 있다.
Administration of the cell therapy of the present invention is applicable to any animal, and animals include humans and primates, as well as domestic animals such as cattle, pigs, sheep, horses, dogs, mice, rats, and cats. As used herein, the term "administration" means introducing the cell therapy of the invention into a patient in any suitable manner and includes the transplantation of differentiated cells. The route of administration of the cell therapy of the present invention may be administered through various routes as long as it can reach the target tissue, and preferably, may be administered to the tissue in the island of Langerhans.
본 발명의 성체 줄기세포로부터 췌장 베타 유사세포로의 분화 유도를 통한 췌장 베타 유사세포의 제조 방법은 암 발생 및 윤리적인 문제가 없는 성체 줄기세포를 소스로 하기 때문에, 실제 임상에 적용이 유리하다. 아울러, 본 발명의 분화 유도 방법은 2단계의 간편하고 효율적인 방법이며, 분화되어 제조된 췌장 베타 유사세포가 인슐린을 분비하며, 글루코스에 반응하는 인슐린이 증가하는 췌장 베타 유사세포로서, 당뇨병 치료에 사용 가능한 세포치료제로써 사용될 수 있다. 아울러, 분화 단계 중 중간 단계에서 얻어진 세포는 췌장전구세포로 이와 관련된 약물의 유효성 및 안전성 테스트에도 사용될 수 있다.
The method for producing pancreatic beta-like cells by inducing differentiation from adult stem cells to pancreatic beta-like cells of the present invention is advantageous in practical clinical practice because adult stem cells are free from cancer and ethical problems. In addition, the differentiation induction method of the present invention is a simple and efficient method of two steps, the pancreatic beta-like cells produced by differentiation secrete insulin, and pancreatic beta-like cells in which insulin increases in response to glucose, which is used to treat diabetes. It can be used as a possible cell therapy. In addition, the cells obtained in the intermediate stage of the differentiation stage can be used for pancreatic progenitor cells to test the efficacy and safety of the drug associated with them.
도 1은 본 발명의 성체 줄기세포로부터 췌장 베타 유사세포로의 단계적 분화 방법을 간략히 나타낸 모식도이다. 본 발명에서 사용한 각 분화 단계별로 적용되는 분화과정을 제1단계 (stage 1)부터 제2단계 (stage 2)까지 나타낸 것이다. 또한 각 분화 단계별 분화 적용 시간도 나타낸 것이다.
도 2는 성체 줄기세포의 미분화 단계에서부터 췌장 베타 유사세포로 분화를 단계별로 적용한 경우의 세포의 현미경 사진이다. 제대혈 유래 줄기세포(UCB-MSC), 와트슨 젤리 유래 줄기세포 (WJ-MSC) 및 태반 유래 상피 줄기세포 유래 줄기세포 (AESC) 에 대한 각각의 미분화 단계, 제1단계 및 제2단계의 현미경 사진이다. 스케일 바 (scale bar)는 각각 50 ㎛를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 분화 방법을 이용하여 미분화 단계에서부터 췌장 베타 유사세포로 분화 단계별로 RNA를 추출하여 RT-PCR 기법으로 췌장 베타 유사세포 관련 유전자의 발현 양상을 나타낸 도이다. 제대혈 유래 줄기세포(UCB-MSC), 와트슨 젤리 유래 줄기세포 (WJ-MSC) 및 태반 유래 상피 줄기세포 (AESC) 에 대한 각각의 미분화 단계, 제1단계 및 제2단계의 각 유전자의 RT-PCR을 통한 발현양상을 나타낸 도이다.
도 4, 5 및 6은 각각 제대혈 유래 줄기세포(도 4), 와트슨 젤리 유래 줄기세포 (도 5) 및 태반 유래 상피 줄기세포 (도 6)의 미분화 단계 및 췌장 베타 유사세포로 분화 적용 시 면역현광염색법을 이용하여 췌장 베타 세포 관련 단백질의 발현 양상을 나타낸 도이다.
도 7, 8 및 9는 각각 제대혈 유래 줄기세포(도 7), 와트슨 젤리 유래 줄기세포 (도 8) 및 태반 유래 상피 줄기세포 (도 9)의 미분화 단계 및 췌장 베타 유사세포로 분화 적용 시 ELISA 기법을 이용하여 인슐린 및 c-펩타이드의 분비량 및 글루코스 자극 시험 (glucose stimulation test)를 통하여 인슐린 반응 정도를 확인한 그래프이다.
도 10은 각각 EBM-2 배지, low glucose DMEM 배지, high glucose DMEM 배지, EGM-2 배지를 이용하여 본 발명의 2단계 분화 방법을 수행한 후, 미분화 단계에서부터 췌장 베타 유사세포로 분화 단계별로 RNA를 추출하여 RT-PCR 기법으로 췌장 베타 유사세포 관련 유전자의 발현 양상을 나타낸 도이다.Figure 1 is a schematic diagram showing the step-by-step differentiation method of adult stem cells from the pancreatic beta-like cells of the present invention. The differentiation process applied to each differentiation step used in the present invention is shown from the first stage (stage 1) to the second stage (stage 2). It also shows the differentiation application time for each differentiation step.
Figure 2 is a micrograph of the cells when the differentiation of adult stem cells from the stage of differentiation into pancreatic beta-like cells step by step. Micrographs of the respective undifferentiated, first and second stages for umbilical cord blood-derived stem cells (UCB-MSC), Watson Jelly-derived stem cells (WJ-MSC) and placental-derived epithelial stem cell-derived stem cells (AESC). . Scale bars each represent 50 μm.
Figure 3 is a diagram showing the expression of pancreatic beta-like cell-related gene expression by RT-PCR by extracting RNA from the stage of differentiation to differentiation into pancreatic beta-like cells using the differentiation method of the present invention. RT-PCR of each gene in the differentiation stage, the first stage and the second stage for umbilical cord blood-derived stem cells (UCB-MSC), Watson Jelly-derived stem cells (WJ-MSC) and placental-derived epithelial stem cells (AESC) It is a diagram showing the expression pattern through.
Figures 4, 5 and 6 shows the differentiation of cord blood-derived stem cells (Fig. 4), Watson Jelly-derived stem cells (Fig. 5) and placental-derived epithelial stem cells (Fig. 6) and differentiation into pancreatic beta-like cells. It is a diagram showing the expression pattern of pancreatic beta cell-related protein using the staining method.
7, 8 and 9 are the ELISA technique when applied to differentiation stages of the cord blood-derived stem cells (Fig. 7), Watson Jelly-derived stem cells (Fig. 8) and placental-derived epithelial stem cells (Fig. 9) and pancreatic beta-like cells, respectively. In the insulin and c-peptide secretion and glucose stimulation test (glucose stimulation test) is a graph confirming the degree of insulin response.
FIG. 10 shows a step-by-step step of differentiation into pancreatic beta-like cells from the undifferentiated phase after performing the two-stage differentiation method of the present invention using EBM-2 medium, low glucose DMEM medium, high glucose DMEM medium, and EGM-2 medium. Is a diagram showing the expression of pancreatic beta-like cell-related genes by RT-PCR technique.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These embodiments are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not construed as being limited by these embodiments.
실시예Example 1: 췌장 베타 유사세포로 분화를 위한 단계별 분화방법 1: Staged Differentiation Method for Differentiation into Pancreatic Beta-like Cells
본 발명자들은 인간 유래 성체줄기세포인 태반 유래 상피 줄기세포 (AESC)를 Toshio Miki et al. (Current Protocols in Stem Cell Biology, 1E.3.1-1e.3.9, 2007)의 방법으로, 와트슨 젤리 유래 줄기세포 (WJ-MSC)를 Giampiero La Rocca et al. (Histochemical Cell Biology, 131: 267-282, 2009)의 방법으로, 제대혈 유래 줄기세포 (UCB-MSC)를 Hyung-Sik Kim et al. (PLOS ONE 2010 Oct 22;5(10):e15369)의 방법으로 각각 분리하여, 췌장 베타 유사세포로 분화시키기 위하여 2단계의 분화 방법을 정립하였다. 본 발명에서는 분화 배지로 EGM-2 배지를 기본 분화 배지로 하였으며, 각 단계별로 순차적인 분화 유도 방법을 사용하여 췌장 베타 유사세포로 분화 유도하였다.The present inventors have described placental epithelial stem cells (AESC), which are adult stem cells derived from humans, from Toshio Miki et al. Watson Jelly-derived stem cells (WJ-MSCs) were prepared by Giampiero La Rocca et al. (Current Protocols in Stem Cell Biology, 1E.3.1-1e.3.9, 2007). (Histochemical Cell Biology, 131: 267-282, 2009) by using the method of umbilical cord blood-derived stem cells (UCB-MSC) Hyung-Sik Kim et al. (PLOS ONE 2010 Oct 22; 5 (10): e15369), respectively, were isolated and two differentiation methods were established to differentiate into pancreatic beta-like cells. In the present invention, EGM-2 medium was used as a differentiation medium, and differentiation was induced into pancreatic beta-like cells by sequential differentiation induction method for each step.
구체적으로 본 발명에서 사용한 단계별 분화 중 제1단계의 경우는 EGM-2 배지(Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2) (catalog#CC-4176, Lonza, Walkersville, MD, USA) plus growth factors EGEM-2 SingleQuots (catalog# CC-4176 (Lonza)))를 기본 배지로 하여, 4 nM의 액티빈-A (activin-A), 1 mM의 부티르산 나트륨 (sodium butyrate)을 1일간 처리하였다. 이후 기본 배지에 4 nM의 액티빈-A 및 0.1wt%의 BSA (bovine serum albumin)를 첨가한 분화 배지로 교체하여 2일간 분화를 유도하였다. 상기 제2단계는 KGF를 배지 1 ㎖ 당 50 ng의 농도로 처리하고, 1wt%의 BSA를 첨가한 분화 배지로 교체하여 3일간 분화 유도하였다. 이와 같은 본 발명의 분화 유도 방법을 도 1에 도시하였다. 상기 제1단계 내지 제2단계의 각 단계는 배지 자체를 교환하는 것으로, 상기 각 단계의 배지는 혈청을 첨가하지 않은 무혈청 배지이다.
Specifically, in the case of the first stage of differentiation used in the present invention, EGM-2 medium (Endothelial Cell) 4 nM with Basal Medium-2 (EBM-2) (catalog # CC-4176, Lonza, Walkersville, MD, USA) plus growth factors EGEM-2 SingleQuots (catalog # CC-4176 (Lonza)) Activin-A (activin-A), 1 mM sodium butyrate (sodium butyrate) was treated for 1 day. Thereafter, differentiation was induced by replacing the differentiation medium with 4 nM of activin-A and 0.1 wt% of BSA (bovine serum albumin) added to the basal medium. In the second step, KGF was treated at a concentration of 50 ng per ml of medium and replaced with differentiation medium to which 1 wt% of BSA was added to induce differentiation for 3 days. This differentiation induction method of the present invention is shown in FIG. Each step of the first to second step is to replace the medium itself, the medium of each step is a serum-free medium without the addition of serum.
실시예Example 2: 췌장 베타 유사세포로 각 단계별 분화유도시 세포모양 변화 확인 2: Pancreatic beta-like cells confirmed the change in cell shape of differentiation-inducing cells at each step
인간 유래 성체 줄기세포인 태반 유래 상피 줄기세포, 와트슨 젤리 유래 줄기세포, 및 제대혈 유래 줄기세포를 분리하여 미분화 상태와 본 발명에서 제시한 상기 실시예 1의 각 단계별의 분화 시 세포의 모양변화를 Olympus CKX41, 현미경으로 200배의 배율에서 관찰하였다.Olympus differentiation status and shape of cells during differentiation of each step of Example 1 presented in the present invention by separating human-derived adult stem cells, placental-derived epithelial stem cells, Watson jelly-derived stem cells, and umbilical cord blood-derived stem cells CKX41, and observed under a microscope 200 times magnification.
그 결과, 일반적인 배지를 사용한 경우는 인간 성체 줄기세포의 기본적인 모양을 유지하였으나, 단계적으로 분화를 유도함에 따라 형태의 변화를 관찰할 수 있었다. 구체적으로 제대혈 및 와트슨 젤리 유래 줄기세포의 경우는 분화 단계를 거치더라도 모양의 변화가 크게 없으나, 태반 유래 상피 줄기세포의 경우는 제1단계 분화에서는 세포가 미분화 세포와 비교 시 조금 더 커지고 납작해지는 모양을 나타냈으나, 제2단계 분화에서는 제1단계와 비교하여 세포가 조금 더 두꺼워지는 모양을 나타냈다 (도 2).
As a result, when the general medium was used, the basic shape of human adult stem cells was maintained, but the change in morphology was observed as the differentiation was induced step by step. Specifically, the umbilical cord blood and Watson Jelly-derived stem cells show no significant change in shape even after the differentiation stage, but in placental-derived epithelial stem cells, the cells become slightly larger and flatter than the undifferentiated cells in the first stage of differentiation. However, in the second stage of differentiation, the cells were slightly thicker than the first stage (FIG. 2).
실시예Example 3: 췌장 베타 유사세포로 분화 유도 시 각 단계별 특이 유전자 발현 양상 확인 3: Identification of specific gene expression patterns in each stage of induction of differentiation into pancreatic beta-like cells
인간 유래 성체 줄기세포에 단계별 분화 배지를 순차적으로 처리하고, 각 단계별 분화 유도법으로 상기 실시예 1에서 분화시킨 췌장 베타 유사세포의 각 분화 단계별로 췌장 베타 유사세포의 특이적인 유전자의 발현 양상을 확인하기 위해서 역전사-중합효소 연쇄반응 (RT-PCR, reverse-transcriptase polymerase chain reaction) 방법을 수행하였다. 유전자의 발현양상은 인간 성체 줄기세포인 태반 유래 상피 줄기세포, 와트슨 젤리 유래줄기세포 및 제대혈 유래 줄기세포의 미분화상태와 각 분화 단계별에서의 변화를 비교하였다. 각 분화 단계에서 세포의 RNA를 추출하기 위하여 TRIzol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA.)을 사용하였다. TRIzol Reagent으로 세포를 녹인 후, 클로로폼 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA.)과 이소프로파놀 (isopropanol) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA.)을 단계적으로 처리하여 순수한 RNA를 분리하였다. 추출한 RNA는 역전사 반응을 통하여 cDNA (complementary DNA)로 합성하였다. 합성한 cDNA는 하기 표 1에 제시한 조건에 맞추어 PCR로 증폭하였다. 하기 표 1은 역전사-중합효소 연쇄반응법을 이용하여 췌장 베타 세포로의 분화 여부를 확인하기 위한, 췌장 베타 세포관련 특이 유전자 프라이머의 명칭 및 관련 정보를 나타냈다.
Treatment of human-derived adult stem cells with stepwise differentiation medium in sequence, and identification of specific gene expression patterns of pancreatic beta-like cells in each step of differentiation of pancreatic beta-like cells differentiated in Example 1 by the step-wise differentiation induction method For this purpose, reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) was performed. The expression patterns of the genes were compared with the undifferentiated state of human adult stem cells, placental-derived epithelial stem cells, Watson Jelly-derived stem cells, and cord blood-derived stem cells. TRIzol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA.) Was used to extract the RNA of the cells in each differentiation step. After lysing the cells with TRIzol Reagent, pure RNA was isolated by gradual treatment with chloroform (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA.) And isopropanol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA.). The extracted RNA was synthesized into cDNA (complementary DNA) through reverse transcription. The synthesized cDNA was amplified by PCR according to the conditions shown in Table 1 below. Table 1 below shows the names and related information of pancreatic beta cell-related specific gene primers for confirming their differentiation into pancreatic beta cells using reverse transcriptase-polymerase chain reaction.
번호order
number
(℃)Temperature
(℃)
(bp)size
(bp)
Nestin
(Glucagon)Glucagon
(Glucagon)
NGN3
Nkx6.1
(Connexin 36, cx36)Connectin 36
(Connexin 36, cx36)
insulin
Pdx1
PPY
Nkx6.1
Sox17
Beta-actin
그 결과, 각 단계별로 분화를 유도함에 따라서 췌장 베타 전구세포 관련 유전자인 Nkx6.1 및 NGN3의 발현 양상을 확인하였다. 또한, 성숙한 췌장 베타 세포 마커로 알려진 Cx36, INS, GCG, PPY 등의 발현 양상도 확인하였다 (도 3). 이와 같은 결과는 본 발명의 분화법에 의해 분화된 세포가 췌장 베타 세포임을 시사하는 결과이다.
As a result, the expression patterns of pancreatic beta progenitor cell-related genes Nkx6.1 and NGN3 were confirmed as differentiation was induced at each stage. In addition, expression patterns of Cx36, INS, GCG, PPY, etc., known as mature pancreatic beta cell markers, were also confirmed (FIG. 3). These results suggest that the cells differentiated by the differentiation method of the present invention are pancreatic beta cells.
실시예Example 4: 췌장 베타 유사세포로 분화 유도 시 각 단계별 특이 단백질 발현 양상 확인 4: Identification of specific protein expression patterns at each stage when inducing differentiation into pancreatic beta-like cells
인간 유래 성체 줄기세포를 단계별 분화 배지로 순차적으로 처리하고, 각 단계별 분화 유도법으로 상기 실시예 1에서 분화시킨 췌장 베타 유사세포에 대하여 각 단계 별 분화 과정 중 췌장 베타 유사세포 관련 특이 단백질의 발현 양상을 확인하였다. 췌장 관련 특이 단백질을 확인하기 위하여 면역현광염색법 (ICC, immunocytochemistry)을 사용하였다. PFA (paraformaldehyde, 4%)로 각 분화 단계의 세포를 고정하였고, 확인하고자 하는 특이 단백질인 인슐린 (#ab8302, Abcam, Cambridge, MA, USA) 및 c-펩타이드 (4020-01, Linco)의 1차 항체를 처리하였다. 이후, 2차 항원으로 형광이 발현하는 항체를 처리하였으며, 세포의 핵을 관찰하기 위해서 Hoechst 염색을 하였다. 각 분화단계에 따라 확인하고자 하는 특이 단백질인 c-펩타이드 및 인슐린의 발현 양상은 CLSM (confocal laser microscope system)을 사용하여 확인하였다.Treatment of human-derived adult stem cells with a staged differentiation medium was performed sequentially, and pancreatic beta-like cells related to pancreatic beta-like cells differentiated in Example 1 by the differentiation-induced differentiation in each step were expressed. Confirmed. To identify pancreatic related specific proteins, immunocytoscopy (ICC, immunocytochemistry) was used. The cells of each differentiation stage were fixed with PFA (paraformaldehyde, 4%), and the primary protein of insulin (# ab8302, Abcam, Cambridge, MA, USA) and c-peptide (4020-01, Linco), the specific proteins to be identified Antibodies were treated. Subsequently, the secondary antigen was treated with an antibody expressing fluorescence, and Hoechst staining was performed to observe the nuclei of the cells. Expression of c-peptide and insulin, which are specific proteins to be identified according to each differentiation step, was confirmed using a confocal laser microscope system (CLSM).
인간 유래 성체 줄기세포 중 제대혈 유래 줄기세포의 미분화 상태와 제2단계 상태를 면역현광염색법으로 인슐린 및 c-펩타이드의 발현양상을 비교 분석한 결과, 미분화 상태와 비교하여 인슐린 및 c-펩타이드의 발현이 분화 유도 후 강하게 증가하는 양상을 확인하였다 (도 4). 와트슨 젤리 유래 줄기세포의 미분화 상태와 제2단계 상태를 면역현광염색법으로 인슐린 및 c-펩타이드의 비교 분석한 결과, 미분화 상태와 비교하여 인슐린 및 c-펩타이드의 발현이 분화 유도 후 강하게 증가하는 양상을 확인하였다 (도 5). 태반 유래 상피 줄기세포의 미분화 상태와 제2단계 상태를 면역현광염색법으로 비교 분석한 결과, 미분화 상태와 비교하여 인슐린 및 c-펩타이드의 발현이 분화 유도 후 강하게 증가하는 양상을 확인하였다 (도 6).
The expression of insulin and c-peptide by immunofluorescence staining was compared between the undifferentiated state and the second stage state of umbilical cord blood-derived stem cells in human-derived adult stem cells. After the differentiation induction was confirmed to increase strongly (Fig. 4). Comparative analysis of insulin and c-peptide by immunofluorescence staining of the undifferentiated state and the second-stage state of Watson jelly-derived stem cells showed that the expression of insulin and c-peptide increased strongly after induction of differentiation compared to the undifferentiated state. It was confirmed (FIG. 5). As a result of comparative analysis of the undifferentiated state and the second stage state of placental-derived epithelial stem cells by immunofluorescence staining, it was confirmed that the expression of insulin and c-peptide increased strongly after induction of differentiation compared to the undifferentiated state (FIG. 6). .
실시예Example 5: 췌장 베타 유사세포로 분화 유도 시 각 단계별에서 5: Induce differentiation into pancreatic beta-like cells at each stage ELISAELISA 기법을 이용한 인슐린 및 c- Insulin and c- 펩타이드의Peptide 발현 확인 Confirmation of expression
인간 유래 성체 줄기세포에 단계별 분화 배지를 순차적으로 처리하고, 각 단계별 분화 유도법으로 상기 실시예 1에서 분화시킨 췌장 베타 유사세포에 대하여, 각 단계별 분화 과정 중 췌장 베타 세포의 특징 중 하나인 인슐린 및 c-펩타이드의 분비 양상을 ELISA 기법으로 통해 확인하였다. 또한, 일정량의 글루코스 (15mM)를 미분화 단계 및 각 단계별 분화 과정에서 처리하여 인슐린의 반응을 확인 (glucose stimulation test)하는 시험을 진행하였다.Human pancreatic beta-like cells differentiated in Example 1 by sequentially processing differentiation medium to adult stem cells and inducing differentiation in each step, insulin and c, which are one of the characteristics of pancreatic beta cells during differentiation process Peptide secretion was confirmed by ELISA technique. In addition, a certain amount of glucose (15mM) was processed in the differentiation step and each step of differentiation process to test the response of insulin (glucose stimulation test) was conducted.
인간 유래 성체 줄기세포 중 제대혈 유래 줄기세포의 미분화 상태와 각 분화 단계 상태에서 인슐린 및 c-펩타이드 발현 양상을 비교한 결과, 분화 단계가 진행될수록 인슐린 및 펩타이드의 분비가 증가하였다. 아울러, 인슐린은 분화 단계가 진행됨에 따라 글루코스에 반응하는 것이 증가하였다 (도 7). 와트슨 젤리 유래 줄기세포의 미분화 상태와 각 분화 단계 상태에서 인슐린 및 c-펩타이드 발현 양상을 비교한 결과, 분화 단계가 진행될수록 인슐린 및 c-펩타이드의 분비가 증가하였다. 아울러, 인슐린은 분화 단계가 진행됨에 따라 글루코스에 반응하는 것이 증가하였다 (도 8). 태반 유래 상피 줄기세포의 미분화 상태와 각 분화 단계 상태에서 인슐린 및 c-펩타이드의 발현양상을 비교한 결과, 분화 단계가 진행될수록 인슐린 및 c-펩타이드의 분비가 증가하였다. 아울러, 인슐린은 분화 단계가 진행됨에 따라 글루코스에 반응하는 것이 증가하였다 (도 9). 이와 같은 결과는 본 발명의 분화 방법에 의해서 다양한 종류의 성체 줄기세포로부터 인슐린 및 c-펩타이드를 분비할 수 있는 췌장 베타 유사세포로 분화시킬 수 있음을 시사하는 것이며, 상기 췌장 베타 유사세포는 글루코스에 반응하는 인슐린이 증가하는 췌장 베타 유사세포로서, 인체 내의 정상적인 기능을 하는 췌장 베타 세포임을 시사하는 것이다. 이와 같은 기능을 하는 췌장 베타 유사세포는 인슐린 분비에 문제가 있는 제 1형 당뇨병의 치료제로 사용될 수 있으며, 본 발명의 분화 방법 및 본 발명에 의해서 제조된 췌장 베타 유사세포는 당뇨병 치료제로서 유용하게 이용될 수 있음을 뒷받침하는 것이다.
As a result of comparing the undifferentiated state of umbilical cord blood-derived stem cells and the expression level of insulin and c-peptide in each stage of differentiation, the secretion of insulin and peptide increased as the stage of differentiation progressed. In addition, insulin increased response to glucose as the differentiation step progressed (FIG. 7). As a result of comparing the undifferentiated state of the Watson Jelly-derived stem cells and the expression patterns of insulin and c-peptide in each differentiation stage, the secretion of insulin and c-peptide increased as the differentiation stage progressed. In addition, insulin increased response to glucose as the differentiation step progressed (FIG. 8). As a result of comparing the undifferentiated state of the placental-derived epithelial stem cells and the expression patterns of insulin and c-peptide in each differentiation stage, the secretion of insulin and c-peptide increased as the differentiation stage progressed. In addition, insulin increased response to glucose as the differentiation step progressed (FIG. 9). These results suggest that the differentiation method of the present invention can be used to differentiate pancreatic beta-like cells capable of secreting insulin and c-peptides from various kinds of adult stem cells. Pancreatic beta-like cells, which increase insulin in response, suggest that pancreatic beta cells function normally in the human body. The pancreatic beta-like cells having such a function can be used as a therapeutic agent for
실시예Example 6: 각 분화 배지의 분화 효율 비교 6: Comparison of Differentiation Efficiency of Each Differentiation Medium
상기 실시예 1과 동일하게 성체 줄기세포를 2단계 분화방법에 의해 췌장 베타 유사세포로 분화시키되, 비교군으로 EGM-2 배지 대신에 각각 EBM-2 배지, low glucose DMEM 배지, high glucose DMEM 배지를 사용하여 분화를 시켰다. EGM-2 배지와 상기 비교군 배지에서 배양한 각 단계의 세포에 대하여 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 인슐린, Pdx1, SOX17, β-액틴 유전자의 발현 양상을 확인하였다 (도 10).As in Example 1, adult stem cells were differentiated into pancreatic beta-like cells by a two-step differentiation method, and in contrast groups, EBM-2 medium, low glucose DMEM medium, and high glucose DMEM medium were used instead of EGM-2 medium. Differentiation was used. Expression of insulin, Pdx1, SOX17, and β-actin gene was confirmed in the same manner as in Example 3 with respect to the cells of each step cultured in the EGM-2 medium and the comparative group medium (FIG. 10).
그 결과, 비교군 보다 본 발명의 EGM-2 배지를 사용할 경우, 성숙한 췌장 베타 유사세포의 마커인 인슐린의 발현이 나타나는 것을 확인하여, 분화 효율이 극대화 되는 것을 알 수 있었다.
As a result, when using the EGM-2 medium of the present invention than the comparison group, it was confirmed that the expression of insulin, which is a marker of mature pancreatic beta-like cells, appeared to maximize the differentiation efficiency.
<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> A method for producing pancreas beta like cells from adult stem cells <130> PA100843/KR <160> 22 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for nestin <400> 1 aacagcgacg gaggtctcta 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for nestin <400> 2 ttctcttgtc ccgcagactt 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Glucagon <400> 3 aggcagaccc actcagtga 19 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Glucagon <400> 4 aacaatggcg acctcttctg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for NGN3 <400> 5 cgaatgcaca acctcaactc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for NGN3 <400> 6 agtcagcgcc cagatgtagt 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Nkx6.1 <400> 7 acacgagacc cactttttcc g 21 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Nkx6.1 <400> 8 tgctggactt gtgcttcttc aac 23 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Connexin 36 <400> 9 aacgccgcta ctctacagtc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Connexin 36 <400> 10 ttggccggga cacataacat 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer fod insulin <400> 11 ttcttctaca cacccaagac 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for insulin <400> 12 ctagttgcag tagttctcca 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Pdx1 <400> 13 ctcctacagc actccacctt 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Pdx1 <400> 14 ccgagtaaga atggctttat 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for PPY <400> 15 ctgctgctcc tgtccacctg 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for PPY <400> 16 ctccgagaag gccagcgtgt 20 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Nkx6.1 <400> 17 acacgagacc cactttttcc g 21 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Nkx6.1 <400> 18 tgctggactt gtgcttcttc aac 23 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Sox17 <400> 19 agattgaaaa aacacccagg 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Sox17 <400> 20 ttgttcagag atttgtttcc 20 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for beta-actin <400> 21 cggcatcgtc accaactggg a 21 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for beta-actin <400> 22 cgtagatggg cacagtgtgg g 21 <110> SNU R & DB FOUNDATION <120> A method for producing pancreas beta like cells from adult stem cells <130> PA100843 / KR <160> 22 <170> Kopatentin 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for nestin <400> 1 aacagcgacg gaggtctcta 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for nestin <400> 2 ttctcttgtc ccgcagactt 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Glucagon <400> 3 aggcagaccc actcagtga 19 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Glucagon <400> 4 aacaatggcg acctcttctg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for NGN3 <400> 5 cgaatgcaca acctcaactc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for NGN3 <400> 6 agtcagcgcc cagatgtagt 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Nkx6.1 <400> 7 acacgagacc cactttttcc g 21 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Nkx6.1 <400> 8 tgctggactt gtgcttcttc aac 23 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Connexin 36 <400> 9 aacgccgcta ctctacagtc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Connexin 36 <400> 10 ttggccggga cacataacat 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer fod insulin <400> 11 ttcttctaca cacccaagac 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for insulin <400> 12 ctagttgcag tagttctcca 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Pdx1 <400> 13 ctcctacagc actccacctt 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Pdx1 <400> 14 ccgagtaaga atggctttat 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for PPY <400> 15 ctgctgctcc tgtccacctg 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for PPY <400> 16 ctccgagaag gccagcgtgt 20 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Nkx6.1 <400> 17 acacgagacc cactttttcc g 21 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Nkx6.1 <400> 18 tgctggactt gtgcttcttc aac 23 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Sox17 <400> 19 agattgaaaa aacacccagg 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Sox17 <400> 20 ttgttcagag atttgtttcc 20 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for beta-actin <400> 21 cggcatcgtc accaactggg a 21 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for beta-actin <400> 22 cgtagatggg cacagtgtgg g 21
Claims (21)
(b) 상기 제1단계의 분화된 세포를 KGF (Keratinocyte Growth Factor)를 포함하는 배지에서 배양하여 췌장 베타 유사세포로 분화시키는 제2단계를 포함하는, 성체 줄기세포로부터 췌장 베타 유사세포를 제조하는 방법.
(a) a first step of culturing adult stem cells in a medium containing activin-A to differentiate into pancreatic progenitor cells; And
(b) preparing pancreatic beta-like cells from adult stem cells, comprising the second step of culturing the differentiated cells of the first step in a medium containing KGF (Keratinocyte Growth Factor) to differentiate into pancreatic beta-like cells. Way.
The method of claim 1, wherein the medium of the first and second stages is a serum-free medium, each of which does not contain serum.
(i) 액티빈-A 및 부티르산 나트륨 (sodium butyrate)을 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및
(ii) 액티빈-A 및 BSA (bovine serum albumin)를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 것인 방법.
The method of claim 1, wherein the first step
(i) culturing in a medium comprising activin-A and sodium butyrate; And
(ii) culturing in a medium comprising activin-A and bovine serum albumin (BSA).
The method of claim 1, wherein the second step is culturing in a medium containing KGF and BSA.
The method of claim 1, wherein the first step is 18 hours to 84 hours and the second step is 66 hours to 78 hours.
The method of claim 3, wherein step (i) is 18 to 30 hours and step (ii) is 42 to 54 hours.
The method of claim 1, wherein the concentration of activin-A is 2 nM to 6 nM and the concentration of KGF is 25 ng / ml to 75 ng / ml.
The method of claim 3, wherein the concentration of sodium butyrate is 0.5 mM to 1.5 mM and the concentration of BSA is 0.05 wt% to 0.15 wt%.
The method of claim 4, wherein the concentration of BSA is 0.5 wt% to 1.5 wt%.
The method of claim 1, wherein the medium of the first and second stages is independently Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2) medium.
The method of claim 1, wherein the stem cells are derived from humans.
The method of claim 1, wherein the adult stem cells are placental-derived epithelial stem cells, Watson Jelly-derived stem cells or umbilical cord blood-derived stem cells.
A method for producing pancreatic progenitor cells from adult stem cells, comprising culturing the adult stem cells in a medium containing activin-A to differentiate into pancreatic progenitor cells.
(i) 액티빈-A 및 부티르산 나트륨을 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및
(ii) 액티빈-A 및 BSA를 포함하는 배지에서 배양하여 성체 줄기세포를 췌장 전구세포로 분화시키는 단계인 것인 방법.
The method of claim 13, wherein the method is
(i) culturing in a medium comprising activin-A and sodium butyrate; And
(ii) culturing in a medium comprising activin-A and BSA to differentiate adult stem cells into pancreatic progenitor cells.
Kit for inducing pancreatic progenitor differentiation from adult stem cells, comprising activin-A in EGM-2 medium.
The kit of claim 15 comprising EGM-2 medium comprising activin-A and sodium butyrate, and EGM-2 medium comprising activin-A and BSA.
A composition for inducing pancreatic beta-like cell differentiation from pancreatic progenitor cells, comprising KGF and BSA in EGM-2 medium.
(a) Nkk6.1, NGN3, CX36, INS, GCG 및 PPY로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 발현함;
(b) 인슐린을 분비함; 및
(c) c-펩타이드를 분비함.
A pancreatic beta-like cell produced by the method of any one of claims 1 to 12 with the following characteristics:
(a) expresses one or more genes selected from the group consisting of Nkk6.1, NGN3, CX36, INS, GCG and PPY;
(b) secrete insulin; And
(c) secretes c-peptides.
(a) Nkx6.1 및 NGN3 유전자를 발현함.
Pancreatic progenitor cells produced by the method of claim 13 or claim 14 having the following characteristics:
(a) Expresses Nkx6.1 and NGN3 genes.
Cell therapy for diabetes treatment comprising pancreatic beta-like cells of claim 18 as an active ingredient.
Cell therapy for diabetes treatment comprising the pancreatic progenitor cells of claim 19 as an active ingredient.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020110014808A KR101334800B1 (en) | 2011-02-18 | 2011-02-18 | A method for producing pancreas β like cells from adult stem cells |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020110014808A KR101334800B1 (en) | 2011-02-18 | 2011-02-18 | A method for producing pancreas β like cells from adult stem cells |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20120095257A true KR20120095257A (en) | 2012-08-28 |
KR101334800B1 KR101334800B1 (en) | 2013-12-02 |
Family
ID=46885866
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020110014808A KR101334800B1 (en) | 2011-02-18 | 2011-02-18 | A method for producing pancreas β like cells from adult stem cells |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
KR (1) | KR101334800B1 (en) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2022065859A1 (en) * | 2020-09-24 | 2022-03-31 | 성균관대학교산학협력단 | Method for direct reprogramming from somatic cells into pancreatic beta cells by using microrna, and differentiation composition |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100895324B1 (en) * | 2007-05-08 | 2009-05-07 | 주식회사 휴림바이오셀 | Method for the differentiation of human adult stem cells into insulin-secreting cells |
-
2011
- 2011-02-18 KR KR1020110014808A patent/KR101334800B1/en active IP Right Grant
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2022065859A1 (en) * | 2020-09-24 | 2022-03-31 | 성균관대학교산학협력단 | Method for direct reprogramming from somatic cells into pancreatic beta cells by using microrna, and differentiation composition |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR101334800B1 (en) | 2013-12-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US10669526B2 (en) | Stem cells derived from pure chorionic trophoblast layer and cell therapy comprising same | |
JP6920363B2 (en) | Multifunctional immature dental pulp stem cells and therapeutic applications | |
EP2446892B1 (en) | Isolated adult pluripotent stem cells | |
JP3934539B2 (en) | Adult or postnatal tissue progenitor cells derived from placenta | |
US20060247195A1 (en) | Method of altering cell properties by administering rna | |
EP2468849B1 (en) | Process for production of bioartificial organ | |
JP2005523328A (en) | Placenta-derived stem cells and uses thereof | |
US20100035327A1 (en) | Use of rice-derived products in a universal cell culture medium | |
US10870830B2 (en) | Method for culturing differentiation-promoting and -sustaining spheroid form of tonsil-derived stem cells | |
CN105473134B (en) | Compositions and methods for induced tissue regeneration in mammalian species | |
KR20090109564A (en) | Method for production of mesenchymal cell, method for production of tooth, and mesenchymal cell for formation of tooth | |
KR101690872B1 (en) | A method for differentiation of tonsil-derived mesenchymal stem cell into insulin secretory cells | |
JP6545690B2 (en) | Stem cells derived from trophoblast basal layer and cell therapeutic agent containing the same | |
KR102104120B1 (en) | 3D bioprinting construct using human nasal inferior turbinate derived mesenchymal stem cell and uses thereof | |
Stacpoole et al. | Neural precursor cells cultured at physiologically relevant oxygen tensions have a survival advantage following transplantation | |
CN103459590A (en) | Pluripotent stem cell capable of being isolated from fat tissue or umbilical cord of biological body | |
KR20120006386A (en) | Stem cell derived from first trimester placenta and cellular therapeutic agents comprising the same | |
Saxena et al. | Role of stem cell research in therapeutic purpose--a hope for new horizon in medical biotechnology. | |
KR101334800B1 (en) | A method for producing pancreas β like cells from adult stem cells | |
Atala et al. | Tissue engineering applications of therapeutic cloning | |
Mummery | Stem cell research: immortality or a healthy old age? | |
Koh et al. | Therapeutic cloning applications for organ transplantation | |
CA2693382C (en) | Fused stem cells useful for the treatment of diabetes and methods thereof | |
CN115044534A (en) | Method for producing pancreatic islet beta cells in vitro by using BMP7 factor, pancreatic islet beta cells obtained by same and application thereof | |
KR20200049669A (en) | Composition for inducing dedifferentiation for insulin producing cells from human induced pluripotent stem cells and method for inducing insulin producing cells using the same |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A201 | Request for examination | ||
N231 | Notification of change of applicant | ||
E902 | Notification of reason for refusal | ||
E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
GRNT | Written decision to grant | ||
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20160826 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20170905 Year of fee payment: 5 |
|
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20180810 Year of fee payment: 6 |