KR20120087860A - 신규한 징크 핑거 뉴클레아제 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 게놈 서열의 표적화된 절단과 표적화된 변경, 게놈영역 및 그 게놈영역과 상동성이 있는 외래성 폴리뉴클레오티드 사이 또는 게놈 서열의 표적화된 절단 부위의 비상동 말단 연결에 의한 표적화된 재조합 및 그를 위한 조성물에 관한 것이다.

Description

신규한 징크 핑거 뉴클레아제 및 이의 용도{A novel zinc finger nuclease and uses thereof}
본 발명은 게놈 서열의 표적화된 절단과 표적화된 변경 및 게놈영역과 상동성이 있는 외래성 폴리뉴클레오티드 사이 또는 표적화된 절단 부위의 비상동 말단 연결에 의한 표적화된 재조합을 위한 방법 및 그를 위한 조성물에 관한 것이다.
현재 유전공학에서 널리 유용하게 쓰이고 있는 도구로서 제한효소는 현재 분자생물학 연구의 가장 중요한 도구의 하나이다. 그러나 게놈 크기의 DNA를 다루기에 유용한 제한효소로서 새로운 DNA 염기서열의 인지와 "rare cutter", 즉 9bp 이상의 DNA를 인지하고 자를 수 있는 제한효소의 필요성이 대두됨에 따라 여러 가지 다양한 시도가 있어왔다. 그 중 징크 핑거 단백질(ZFPs)을 이용하는 징크 핑거 뉴클레아제 기술은 9bp 이상을 인지하는 징크 핑거 단백질을 이용하여 9 bp 이상의 DNA 염기서열을 인지하고 자를 수 있는 카이메릭 뉴클레아제(chimeric nuclease)의 DNA 인지 부위로 사용함으로써 다양한 DNA 염기서열을 인지하고 자를 수 있는 제한효소들에 관한 것이다. 징크 핑거 뉴클레아제는 세포 내에 도입되었을 때 유전체 상의 원하는 부분에 이중가닥손상(double strand break, DSB)을 유도할 수 있기 때문에 동물이나 식물 세포 또는 유기체에서 효과적인 유전정보조작의 도구로 사용될 수 있다. 세포에서 이중가닥손상이 발생하면 세포는 자체적으로 가지고 있는 수리 기작을 이용하여 손상된 부위를 고치게 된다. 이 때 손상된 부분과 유사한 DNA 서열을 가진 DNA(donor DNA)를 세포 내에 도입해 주면 세포는 이를 주형으로 사용하여 손상된 염색체 부분을 수리하는 상동재조합 (homologous recombination, HR) 방법을 이용한다. 이 때 공여자(donor) DNA에 원하는 염기서열을 넣어주면 유전체 상의 특정 부위에 원하는 대로 조작이 가능하게 된다. 한편, 공여자 DNA가 없을 경우에도 세포는 비상동 말단 연결 (non-homologous end joining, NHEJ) 방식으로 손상된 부위를 고치게 된다. 비상동 말단 연결은 끊어진 DNA 가닥을 바로 접합시켜서 원상태로 수리할 수도 있지만, 끊어진 DNA 가닥 말단에서 삽입(insertion)이나 결실(deletion)이 일어나는 오류가 발생하기 쉬운(error-prone) 방향으로 수리가 진행될 수도 있다. 따라서 징크 핑거 뉴클레아제를 이용하여 특정 유전자의 염기서열 부분에 이중가닥손상을 일으켜 비상동 말단 연결을 유도하면 원하는 유전자에 돌연변이를 일으키고 녹아웃(knock-out) 세포주를 만들 수 있다.
징크 핑거(ZFs)는, 진핵세포의 게놈 내에 암호화되어 있는 가장 풍부한 DNA-결합 모티프로서, 가장 잘 이해되고 있는 단백질-DNA 결합 메커니즘의 하나를 제공하고 있는 것으로 여겨진다 (Wolfe, S.A. et al., (2000) Annu . Rev . Biophys . Biomol. Struct ., 29, 183-212; Pabo, C.O. et al., (2001) Annu . Rev . Biochem ., 70, 313-340; Moore, M. et al., (2003) Brief Funct . Genomic . Proteomic ., 1, 342-355; 및 Klug, A. et al., (2005) FEBS Lett ., 579, 892-894). 엔지니어링된 징크 핑거 단백질(ZFPs) 들은 유전자 조절 및 게놈 편집을 위한 도구로서 중대한 잠재력을 가지고 있는데, 이는 그들이 어떠한 게놈 내에서 어떠한 실질적으로 원하는 위치로 기능적인 도메인들을 표적화 하는데 사용될 수 있기 때문이다. 징크 핑거 단백질들은 DNA 염기 서열을 인지할 때 가지는 아미노산 잔기들과 염기들간의 염기 특이적 상호작용 및 모듈화적인 구조적 특징 때문에 새로운 DNA 결합 특이성을 갖는 단백질을 디자인하기 위한 다양한 프레임워크를 제공한다.
효과적인 징크 핑거 뉴클레아제를 만들기 위해서는 유전체 상의 원하는 염기서열을 특이적으로 인식하는 징크 핑거 단백질을 만드는 것이 필요하고 이를 위해 SMD(site directed mutagenesis)를 이용하여 각 대응 아미노산을 하나씩 바꾸는 방법 및 파지 디스플레이와 같은 대규모 스케일에서 스크리닝하는 방법 등 생체 외와 생체 내에서 다양한 징크 핑거 선택 방법들이 사용되고 있다 (미국 특허 5,789,538호, 제5,925,523호, 제6,007,988호, 제6,013,453호 및 제6,200,759호; 국제공개특허 제WO 95/19431호, 제WO 96/06166호, 제WO 98/53057호, 제WO 98/54311호, 제WO 00/27878호, 제WO 01/60970호, 제WO 01/88197호 및 제WO 02/099084호 참고). 하지만 선택을 기반으로 한 방법들은 매우 많은 노동과 시간이 요구되며 훈련된 실험자를 필요로 한다. ZFN을 만드는 다른 방법은 일반적인 DNA 재조합 기술을 사용하여 이미 잘 알려져 있는 징크 핑거 모듈들을 조립하여 원하는 염기서열에 특이성을 가지는 징크 핑거 어레이를 만드는 방법이다. 각각의 징크 핑거 모듈은 DNA의 3bp(염기쌍)을 인식하고, 적절히 서로 결합될 때 야기되는 징크 핑거 어레이들은 더욱 긴 DNA 서열 모티프들을 특히 인식할 수 있다. 이러한 방법을 사용하면 누구나 손쉽게 원하는 염기서열을 특이적으로 인식하는 징크 핑거 뉴클레아제를 만들 수 있을 것이다. 이에 대해 일부 연구 그룹들이 멀티-핑거 어레이들을 위한 징크 핑거 모듈의 각각 상세화되고 특화된 별개의 아카이브들을 가지고 있다. 첫 번째는 스크립스 연구소(The Scripps Research Institute)의 바르바스 연구실(Barbas laboratory)의 바르바스 모듈로서, 이들 징크 핑거 모듈들은 파지 디스플레이 및 추상적인 디자인 방법의 조합을 사용하여 개발된 것이다. 모듈들은 모든 GNN 트리플렛, 대부분의 ANN 및 CNN 트리플렛 및 약간의 TNN 트리플렛의 인식에 유용하다. 이러한 바르바스 모듈들은 각각의 징크 핑거 모듈들이 실질적으로 완전한 위치상의 독립성을 갖는다는 가정하에서 개발되었다. 즉, 그들의 인식 능력은 어레이 내에서의 그들의 위치 또는 인접하는 징크 핑거들의 개성들에 의해 극적으로 영향을 받지는 않는다. 두 번째로 상가모 바이오사이언스 인크(Sangamo BioScience Inc.)에서 디자인한 상가모 모듈은 모든 GNN 트리플렛 및 더 작은 수의 비-GNN' 트리플렛에 대해 사용가능하다. 상가모 모듈들은 3-핑거 어레이 내의 모듈들의 위치는 그들의 인식 특성에 영향을 미칠 수 있다는 가정 하에서 개발되었다. 3-핑거 어레이 내에서의 세 위치 각각은 그러한 위치에서 주어진 트리플렛을 위해 개발된 별개의 징크 핑거 모듈을 갖는다. 그러나, 이러한 모듈들은 자연발생적인 모듈이 아닌 조작된 모듈로서 이러한 모듈을 사용하여 징크 핑거 뉴클레아제를 제조하는 것은 용이하지 않으며, 실제 사용 시 그 효율이 매우 낮다는 문제점이 있다. 특히, 상기 모듈은 기본적으로 GNN-반복 서열을 표적화하는 것을 특징으로 하나, 그러한 서열들은 관심이 있는 주어진 유전자 내에서 거의 희박하게 나타나 실제 절단하고자 하는 부위를 선택할 수 없는 문제점이 있을 수 있다. 예를 들어, 3-핑거 징크 핑거 뉴클레아제 쌍은 평균적으로 4096bp(46) 서열 내에서 단 한번 나타나는 GNN-반복 DNA 서열인, 5'-NNCNNCNNCNNNNNNGNNGNNGNN-3'을 표적화 하도록 디자인될 수 있다. 4-핑거 징크 뉴클레아제에 대한 GNN-반복 자리는 더욱 드물어서, 65,536bp(48) 서열에서 단지 한번 나타난다. 그러므로 그러한 자리들은 원하는 수많은 유전자 내에서 나타나지 않을 수도 있다. 이러한 견지에서, 본 발명의 징크 핑거 뉴클레아제는 대부분이 징크 핑거 뉴클레아제들의 대부분이 GNN-반복 서열을 인식하지 않고도 작용한다는 큰 차이점이 있다.
이와 같이, 표적화된 게놈의 편집을 가능하게 하는 징크 핑거 뉴클레아제 기술의 광범위한 적용은 기능적인 징크 핑거 뉴클레아제의 합성을 위한 편리하고, 신속하며 공중이 이용가능한 방법의 부재로 인해 방해를 받고 있다. 따라서, 본 발명자들은 매우 효율적이며, 실시하기 용이한 인간 세포 내의 몇몇 상이한 게놈성 자리의 DNA 서열을 수정할 수 있는 징크 핑거 뉴클레아제를 만들기 위해 예의 연구한 결과, 공중이 사용가능한 징크 핑거들을 사용하는 모듈성 조립 방법을 사용하여 징크 핑거 뉴클레아제를 제조할 수 있었으며, 그 제조된 징크 핑거 뉴클레아제를 이용하여 게놈서열의 표적화된 절단과 표적화된 변경 등이 종래의 방법에 비하여 보다 용이함을 발견하였다.
본 발명의 하나의 목적은 징크 핑거 도메인 및 절단 도메인을 포함하는 융합 단백질로서, 상기 징크 핑거 도메인은 3개 이상의 징크 핑거 모듈(zinc finger module)를 포함하며, 상기 징크 핑거 모듈 중 1 이상은 자연계에 존재하는 야생형 징크 핑거 모듈로부터 유래하며, 상기 융합 단백질은 세포염색질 내의 특정 영역을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 결합하여 절단하는 것을 특징으로 하는 징크 핑거 뉴클레아제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 징크 핑거 뉴클레아제를 이용하여 특정 영역 내의 세포염색질을 절단하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 징크 핑거 뉴클레아제를 이용하여 세포염색질에서 특정 영역 내의 제1 뉴클레오티드 서열을 교체하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 징크 핑거 뉴클레아제를 이용하여 세포염색질에서 특정 영역 내의 제1 뉴클레오티드 서열을 변경하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 징크 핑거 뉴클레아제를 이용한 유전자 치료 방법을 제공하는 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 징크 핑거 도메인 및 뉴클레오티드 절단 도메인을 포함하는 융합 단백질로서, 상기 징크 핑거 도메인은 3개 이상의 징크 핑거 모듈(zinc finger module)를 포함하며, 상기 징크 핑거 모듈 중 2 이상은 자연계에 존재하는 야생형 징크 핑거 모듈로부터 유래하며, 상기 융합 단백질은 세포염색질 내의 특정 영역을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 결합하여 절단하는 것을 특징으로 하는 징크 핑거 뉴클레아제(zinc finger nuclease; ZFN)에 관한 것이다.
본 발명의 징크 핑거 도메인(zinc finger domain)은 하나 또는 수 개의 징크 핑거 모듈을 통하여 서열 특이성을 갖는 방식으로 뉴클레오티드와 결합하는 단백질을 말한다. 징크 핑거 도메인은 최소 3개 이상의 징크 핑거 모듈을 포함한다. 징크핑거 도메인은 징크핑거 단백질 또는 ZFP로 간략히 표시되기도 한다.
본 발명의 징크 핑거 모듈이란 아연 이온과 배위결합을 하는 동안에 구조가 안정적인 도메인의 내부에 있는 아미노산 서열을 말한다. 본 발명의 징크 핑거 모듈은 자연계에 존재하는 야생형과 동일한 서열로 구성되거나 그 야생형 서열의 일부 아미노산을 다른 아미노산으로 치환한 임의적으로 변형된 서열을 가진다. 상기 야생형 징크 핑거 모듈은 어떠한 진핵세포, 예를 들어 진균(예로, 효모), 식물 또는 동물(예로, 인간이나 쥐와 같은 포유동물)로부터 유래할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 징크 핑거 모듈은 인간 등으로부터 유래한 도 1에 표시된 아미노산 서열을 포함한다.
징크 핑거 뉴클레아제의 징크 핑거 도메인은 DNA 3bp (염기쌍)를 인식하는 징크 핑거 모듈(zinc finger module)을 3개 이상 연결한 구조로 되어 있다. 각각의 모듈들은 독립적으로 DNA 염기서열을 인식하기 때문에, 예를 들어 3 또는 4개의 모듈로 구성된 징크 핑거 도메인은 9 또는 12 bp 서열에 결합할 수 있다. 따라서 다이머로 작용하는 징크 핑거 뉴클레아제의 경우 각각 3-4개의 징크 핑거 모듈로 구성된 징크 핑거 뉴클레아제 한 쌍은 18-24 bp을 특이적으로 인식할 것이다. 하나의 구체적 예로서, 본 발명의 징크 핑거 뉴클레아제의 징크 핑거 도메인은 3개 또는 4개, 바람직하게는 4개의 징크 핑거 모듈로 구성되어 있다. 또한, 하나의 바람직한 양태로서, 본 발명의 징크 핑거 뉴클레아제에 포함되는 징크 핑거 도메인은 바람직하게 4개의 징크 핑거 모듈을 포함한다. 구체적 실시에서, 3개의 징크 핑거 모듈을 포함하는 징크 핑거 뉴클레아제보다 4개의 징크 핑거 모듈을 포함하는 징크 핑거 뉴클레아제를 사용하는 경우 표적 부위의 절단 성공율이 3개의 징크 핑거 모듈은 9.1%임에 반하여 4개의 징크 핑거 모듈은 26%로 아주 높은 성공율을 나타냈다.
상기 징크 핑거 도메인은 미리 정해진 뉴클레오티드 서열에 결합하도록 가공될 수 있다. 징크 핑거 단백질 설계를 위한 방법의 예로, 이에 한정되지 않지만, 디자인과 선택이 있다. 디자인된 징크 핑거 단백질은 자연상태에서 발견되는 단백질이 아니라 합리적인 척도에 따라 순이론적으로 디자인 또는 조성된 것이다. 디자인을 위한 합리적인 척도에는 치환법칙의 응용과 현존하는 징크 핑거 단백질 디자인 및 결합에 관한 데이터베이스의 정보처리를 위한 컴퓨터 알고리즘을 포함한다(대한민국 등록특허 제0766952호 등 참조). 선택된 징크 핑거 단백질은 자연상태에서 발견되는 단백질이 아니라 주로 위상 표시, 상호작용 트랩 또는 혼성 선택과 같은 실험 과정을 통해 산출된 결과물을 말한다.
상기 가공된 징크 핑거 도메인을 구성하는 징크 핑거 모듈 중 최소한 2개 또는 그 이상은 야생형 징크 핑거 모듈이 바람직하다. 보다 바람직하게는 3개 또는 그 이상의 야생형 징크 핑거 모듈을 포함한다. 하나의 구체적 실시에서, 본 발명자들은 본 발명의 징크 핑거 뉴클레아제와 종래의 파아지 발현(phage display) 또는 점 돌연변이에 의해 분리하여 조작된(engineered) 징크 핑거 뉴클레아제를 모듈 교환(module swap) 분석을 한 결과, 본 발명의 징크 핑거 뉴클레아제가 SSA 시스템에 의한 분석 및 T7E1 분석에서 뚜렷한 활성을 보이는 것을 발견하였다. 따라서 본 발명의 징크 핑거 뉴클레아제는 자연발생 모듈(naturally-occurring modules)을 포함하는 야생형 징크 핑거 모듈을 바람직하게 포함하여야 한다. 보다 바람직하게 본 발명의 징크 핑거 뉴클레아제는 표 2에 기재된 징크 핑거 도메인을 포함한다. 또한, 본 발명의 징크 핑거 뉴클레아제는 종래의 조작된 징크 핑거 뉴클레아제와 달리 GNN-반복 서열을 표적화하지 않는다. 구체적 실시에서, 하기 표 2에 기재된 징크 핑거 도메인에서와 같이, 본 발명의 징크 핑거 뉴클레아제는 CCR5 서열을 성공적으로 변경시킨 16개의 징크 핑거 뉴클레아제들 중에서 두 징크 핑거 뉴클레아제 (Z430R3 및 Z30F4)가 GNN 모티프가 없는 half-site 요소를 인식하고, 12개의 징크 핑거 뉴클레아제가 GNN 및 비 GNN 모티브들 양쪽으로 구성된 자리를 인식하는 반면, 단지 두 개의 징크 핑거 뉴클레아제(Z426F3 및 Z360R4)만이 GNN-반복 자리를 인식한다. GNN-반복 서열이 아닌 자리를 표적화할 수 있는 능력은 본 발명의 징크 핑거 뉴클레아제의 유용한 사용을 매우 넓히는 것이다.
본 발명의 용어 "절단(cleavage)"은 뉴클레오티드 분자의 공유결합된 백본의 연결을 해제하는 것을 의미하며, "절단 도메인(cleavage domain)"은 이러한 뉴클레오티드 절단을 위한 효소적 활성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 의미한다.
상기 절단 도메인은 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제로부터 얻을 수 있다. 절단 도메인을 얻어낼 수 있는 엔도뉴클레아제의 예로는, 이에 한정되지는 않지만, 제한성 엔도뉴클레아제 및 회귀성 엔도뉴클레아제가 있다. 이러한 효소들은 절단 도메인의 기원으로 사용할 수 있다. 또한, 상기 절단 도메인은 단일의 뉴클레오티드 서열을 절단할 수 있을 뿐만 아니라, 그 절단 도메인의 기원에 따라 이중 결합의 뉴클레오티드 서열을 절단할 수 있다. 이러한 의미에서 이중 결합된 뉴클레오티드 서열을 모두 절단하는 절단 도메인을 절단 하프 도메인으로 사용하기도 한다. 다만, 본원에서는 절단 도메인을 단일의 뉴클레오티드 서열 또는 이중 결합된 뉴클레오티드 서열에 편의상 혼용하여 사용할 수 있다.
절단 도메인(cleavage domain)은 모든 뉴클레아제 또는 그 부분에서 획득할 수 있다. 일반적으로, 만약 융합 단백질이 이중 결합된 뉴클레오티드 서열 모두를 절단할 수 있는 절단 하프 도메인으로 구성된다면, 절단을 위하여 두 개의 융합 단백질이 필요하다. 두 개의 절단 하프 도메인은 동일한 엔도뉴클레아제(또는 그 기작 부분)로부터 유래할 수 있고, 또는 각 절단 하프 도메인은 다른 엔도뉴클레아제(또는 그 기작 부분)로부터 유래할 수 있다. 또한, 두 개의 융합단백질의 결합으로 인한 절단 하프 도메인 두 개의 공간적 배치는, 예컨대 이합체화 반응을 통하여 절단 하프 도메인이 작용성 절단 도메인을 형성하게끔 한다. 따라서, 모든 정수 값의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍이 두 개 표적부위 사이에 개재할 수 있다(예로, 2 ~ 50 뉴클레오티드 또는 그 이상).
일반적으로, 각각 절단 하프 도메인으로 구성된 두 개의 융합단백질이 사용된다면, 각 융합단백질의 징크 핑거를 위한 주요한 접촉 나선은, 다른 DNA 나선 상에 있을 것이고 정반대의 배열을 보일 것이다. 즉, 한 쌍의 징크 핑거 도메인 및 절단 하프 도메인 융합의 경우, 표적 서열은 정반대의 나선 위에 있고 두 개의 단백질은 정반대의 배열로 결합한다.
제한 엔도뉴클레아제는 많은 부류의 종에 존재하고, DNA(인식 부위)와 서열 특이성 결합이 가능하며, 결합 부위의 근처에서 DNA를 절단할 수 있다. 어떤 제한 엔도뉴클레아제, 예를 들어 타입 IIs는 인식 부위가 제거된 부위에서도 DNA를 절단하여 분리된 결합 도메인과 절단 도메인을 가진다. 예를 들어, 타입 IIs 효소인 FokI는, 하나의 나선에서 인식 부위와 9 뉴클레오티드 떨어진 장소 및 다른 하나의 나선에서 인식 부위로부터 13 뉴클레오티드 떨어진 장소에서 DNA의 이중 나선 절단을 촉진한다. 따라서, 하나의 구체적 실시에서는, 융합 단백질은 최소한 하나의 타입 IIs 제한효소로부터의 절단 도메인(또는 절단 하프 도메인)과 하나 이상의 징크핑거 도메인을 구성한다.
타입 IIs 제한효소의 예는 FokI, AarI, AceIII, AciI, AloI, BaeI, Bbr7I, CdiI, CjePI, EciI, Esp3I, FinI, MboI, sapI, SspD51 등이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 보다 구체적인 예는 Roberts et al. (2003) Nucleic acid Res. 31:418-420 등을 참조할 수 있다. 하나의 구체적 실시에서는, 절단 도메인(또는 하프 절단 도메인)으로서 Type Ⅱs 제한 효소인 FokＩ에서 DNA 결합 도메인을 분리한 FokＩ 절단 도메인을 사용한다.
본 발명의 융합단백질은 상이한 2개 이상의 폴리펩타이드가 펩타이드 결합(peptide bond)을 통하여 한 가닥의 폴리펩타이드로 연결된 단백질을 의미한다. 상기 폴리펩타이드는 징크 핑거 도메인 및 뉴클레오티드 절단 도메인을 포함하며, 이는 뉴클레오티드 서열 내의 목적하는 부위를 임의적으로 절단할 수 있는 있다. 본 발명에서는 융합 단백질을 징크 핑거 뉴클레아제 또는 ZFN이라고도 혼용하여 칭한다.
융합단백질(또는 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드)을 디자인하고 구축하는 방법은 당해 기술분야에 널리 알려져 있다. 하나의 구체예에서, 징크핑거 도메인과 절단 도메인을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 구축하였다. 상기 폴리뉴클레오티드는 벡터에 삽입될 수 있으며, 삽입된 벡터는 세포 안으로 도입될 수 있다. 일반적으로 융합단백질(예로, ZFP-FokI 융합)의 징크 핑거 도메인은 융합단백질의 아미노 말단(N 말단) 근처에, 절단 하프 도메인은 카르복시 말단(C 말단) 근처에 위치한다. 이것은 FokI 제한효소에 의해 생성되는 자연적인 절단 도메인 이량체에서 절단 도메인의 상대적 위치를 반영하는데, 여기에서도 DNA 결합 도메인은 아미노 말단 근처에 위치하고, 절단 하프 도메인은 카르복시 말단 근처에 위치한다.
본 발명에서 "서열"이란 그 길이와 무관하게 뉴클레오티드 서열을 의미하는데, 이는 직선형, 원형 또는 가지형의 DNA 또는 RNA가 될 수도 있고, 단일 나선형이거나 이중 나선형일 수 있다.
본 발명에서 "결합"이란 서열 특이성, 또는 단백질과 핵산 사이 등과 같은 고분자간의 비공유 상호작용을 말한다. 상호작용이 전체적으로 보아서 서열 특이성을 가지는 한, 상호작용의 모든 구성체가 인산염 잔기와 접촉하는 등의 서열 특이성을 가질 필요는 없다. 이러한 상호작용은 일반적으로 해리 상수(Kd) 값이 10-6M-1 이하인 특성을 지닌다. 또한 친화도란 결합력을 의미하는데, 결합 친화도의 증가는 해리 상수(Kd)의 감소와 상관관계를 갖는다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 징크 핑거 뉴클레아제를 1쌍 이상 포함하는 특정 영역 내에서 뉴클레오티드 서열의 절단, 교체 또는 변경의 재조합을 위한 키트에 관한 것이다.
일반적으로, 이량체(dimmers)로서 기능을 하는 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN)의 경우 목적으로 하는 하나의 DNA 부위 (single DNA site)를 인지하기 위해서는 두 개의 ZFN 단위체(monomers)를 준비하는 것이 필요하다. 두 개의 ZFN 단위체를 구성하는 각 단위체는 두 개의 ZFN이 5 내지 6 bp 정도의 적당한 거리에서 분리되어 9 bp, 12 bp 또는 그 이상 중 하나의 DNA 인지부위에 결합하여 ZFN 쌍 (pairs)을 구성한다. 따라서, 하나의 단위체 (single half-site) 대해 동일하거나 유사한 DNA 결합 특이성을 가진 여러 가지 세트를 구성하는 복합적인 단위체를 형성하는 ZFN을 제작할 수 있다. 구체적인 예로서, 동일 또는 상이한 징크 핑거 도메인을 포함하는 ZFN 쌍을 표 2에 나타내었으나, 반드시 이로 한정되는 것은 아니다. 상기 단일 부위(single site)는 많은 조합을 이룰 수 있는 ZFN 쌍과 함께 목적이 될 수 있는 부분이다.
본 발명에서 사용된 용어 "교체"란 하나의 뉴클레오티드 서열이 서로 교체되는 것(즉, 정보를 지닌 서열의 교체)를 의미하며, 반드시 하나의 폴리뉴클레오티드가 다른 폴리뉴클레티드로 화학적 또는 물리적으로 교체되는 것만을 의미하는 것은 아니다. 본 발명에서 사용된 용어 "변경"이란 하나의 뉴클레오티드 서열 내에서 돌연변이 또는 비상동 말단 연결에 의하여 새로운 하나의 뉴클레오티드 서열로 변하는 것을 의미한다. 상기 돌연변이는 점 돌연변이, 치환, 결실, 삽입 등을 포함한다. 상기 교체 또는 변경에 의해 불완전한 유전 정보를 갖는 뉴클레오티드가 완전환 유전적 정보를 갖는 뉴클레오티드로 교체되거나 변경될 수 있으며, 또한 뉴클레오티드 서열의 돌연변이 등에 의하여 뉴클레오티드 서열에 인코딩된 펩티드를 기능적으로 불활성화할 수도 있다. 이러한 방법에 의하여, 상기 징크 핑거 뉴클레아제는 유전자 치료 수단으로 사용할 수 있다. 하나의 구체적 실시에서, 인체 면역 결핍 바이러스(human immunodeficiency virus; HIV)가 목적으로 하는 세포를 감염시키는데 필수적인 보조 수용체(major receptor)인 CCR 단백질을 코딩하는 케모카인(chemokine: C-C motif) 수용체 5(CCR5) 유전자를 표적으로 하여 비기능화할 수 있음을 확인하였다.
본 발명에서 "재조합"은, 예를 들어 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터에 관련하여 사용되었을 때, 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종성 핵산 또는 단백질의 도입, 또는 자생 핵산 또는 단백질의 변경에 의해 변형되거나, 또는 세포가 그렇게 변형된 세포로부터 유도된다는 것을 나타낸다. 따라서, 예를 들어 재조합 세포는, 세포의 자생(천연발생) 형태 내에서 발견되지 않는 유전자를 발현하거나, 또는 다른 방식으로 정상적 또는 비정상적으로 발현되거나 발현 중이거나 또는 전혀 발현되지 않은 자생 유전자의 제2 카피를 발현한다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 특정영역에서 절단하고자 하는 뉴클레오티드 서열을 선택하는 단계; (b) 3개 이상의 징크 핑거 모듈(zinc finger module)을 포함하고, 상기 징크 핑거 모듈 중 2 이상은 자연계에 존재하는 야생형 징크 핑거 모듈로부터 유래한 것을 특징으로 하는 징크 핑거 도메인이 상기 서열과 결합하도록 징크 핑거 모듈을 선택하고 징크 핑거 도메인을 제조하는 단계; (c) 상기 징크 핑거 도메인 및 이와 융합 단백질을 형성하는 뉴클레오티드 절단 도메인을 발현하는 단계를 포함하는 징크 핑거 뉴클레아제 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 징크 핑거 뉴클레아제를 제조하는 방법에서, 상기 (a) 단계는 특정 영역에서 절단하고자 하는 뉴클레오티드 서열을 선택하는 단계이다. 상기 뉴클레오티드 서열은 세포 내 또는 외에 존재할 수 있으며, 그 길이는 제한이 없다. 또한 상기 뉴클레오티드 서열은 선형 또는 원형 배치, 단일 사슬 또는 이중 사슬의 형태로 존재할 수 있다.
상기 (b) 단계는 특정 영역에서 절단하고자 하는 뉴클레오티드 서열과 결합하도록 징크 핑거 모듈을 선택하고 징크 핑거 도메인을 제조하는 단계이다. 상기 징크 핑거 도메인을 구성하는 3개 이상의 징크 핑거 모듈 중 2 이상은 자연계에 존재하는 야생형 징크 핑거 모듈로부터 유래하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 도 1에 개시된 징크 핑거 모듈이며, 보다 더 바람직하게는 표 2에 개시된 징크 핑거 모듈이다.
상기 (c) 단계는 징크 핑거 도메인 및 이와 융합 단백질을 형성하는 뉴클레오티드 절단 도메인을 발현하는 단계이다. 상기 발현은 상기 목적하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포 내 또는 세포 외 발현을 모두 포함한다. 세포 내 발현 방법은 당해 분야에 알려진 방법을 이용할 수 있으며, 그 예로는 벡터를 이용하는 방법이다. 상기 벡터는 예로 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 서열 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 분비를 위한 시그널 서열 등을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 징크 핑거 뉴클레아제를 이용하여 특정 영역 내의 세포염색질을 절단하는 방법에 관한 것이다.
하나의 구체적 양태로서, 본 발명은 (a) 특정 영역에서 절단하고자 하는 제1 뉴클레오티드 서열을 선택하는 단계; (b) 제1 뉴클레오티드 서열과 결합하는 본 발명의 상기 제1 징크 핑거 뉴클레아제를 선택하는 단계; (c) 상기 선택된 제1 징크 핑거 뉴클레아제를 상기 서열을 갖는 세포 내에서 발현시키거나 상기 세포 외에서 발현하여 상기 세포 내로 도입하는 단계; 및 (d) 상기 서열 내에서 발현되거나 도입된 제1 징크 핑거 뉴클레아제가 상기 서열과 결합하여 상기 특정 영역에서 세포염색질이 절단되는 단계를 포함하는 특정 영역 내의 세포염색질 절단 방법이다.
본 발명의 상기 제1 징크 핑거 뉴클레아제는 3개 이상의 징크 핑거 모듈(zinc finger module)를 포함하고, 상기 징크 핑거 모듈 중 2 이상은 자연계에 존재하는 징크 핑거 모듈로부터 유래한 것을 특징으로 한다.
다른 하나의 구체적 양태로서, 본 발명은 (a) 특정 영역에서 절단하고자 하는 제1 뉴클레오티드 서열을 선택하는 단계; (b) 제1 뉴클레오티드 서열과 결합하는 제1 징크 핑거 도메인 및 제1 뉴클레오티드 절단 도메인을 포함하는 본 발명의 제1 징크 핑거 뉴클레아제를 선택하는 단계; (c) 상기 선택된 제1 징크 핑거 뉴클레아제를 상기 서열을 갖는 세포 내에서 발현시키거나 상기 세포 외에서 발현하여 상기 세포 내로 도입하는 단계; 및 (d) 상기 서열 내에서 발현되거나 도입된 제1 징크 핑거 뉴클레아제가 상기 서열과 결합하여 상기 특정 영역에서 세포염색질이 절단되는 단계; (e) 제2 징크 핑거 도메인 및 제2 뉴클레오티드 절단 도메인을 포함하는 본 발명의 제2 징크 핑거 뉴클레아제를 선택하고 상기 서열을 갖는 세포 내에서 발현시키거나 세포 외에서 발현하여 상기 세포 내로 도입하는 단계; (f) 상기 세포 내에서 발현되거나 도입된 제2 징크 핑거 뉴클레아제는 상기 제1 징크 핑거 뉴클레아제가 결합한 제1 뉴클레오티드 서열로부터 2 내지 50 뉴클레오티드만큼 떨어져 있는 제2 뉴클레오티드 서열과 결합하는 단계를 포함하는 특정 영역 내의 세포염색질 절단 방법이다.
본 발명의 "세포염색질"은 세포의 게놈을 구성하는 핵단백질 구조를 말한다. 세포의 염색질은 핵산, DNA, 히스톤 및 비히스톤계 염색체 단백질을 포함한 단백질로 구성된다. 또한 세포염색질은 원핵세포, 진핵세포, 진균세포, 식물세포, 동물세포, 포유류 세포, 영장류 세포 및 인간 세포를 포함하는 모든 형태의 세포 내에 존재할 수 있다. 대부분의 진핵 세포염색질은 뉴클레오솜의 형태로 존재하는데, 뉴클레오솜 코어는 히스톤 H2A, H2B, H3, H4의 각각 두 개로 구성된 8량체와 결합된 DNA의 대략 150 염기쌍으로 구성되어 있다. 그리고 유기체에 따라서 길이가 다양한 연결자 DNA는 그 길이가 뉴클레오솜 코어 사이에 달한다. 히스톤 HI 분자는 일반적으로 연결자 DNA와 결합하여 있다. 본 발명의 목적상, 용어 "염색질"은 모든 형태의 세포 핵단백질, 원핵 및 진핵 모두를 포함하는 의미로 사용된다. 세포의 염색질은 염색체 및 에피솜의 염색질을 포함한다. 상기 염색체는 세포의 게놈의 전부 또는 부분을 구성하는 염색질 복합체를 말한다. 상기 에피솜은 복제성 핵산, 핵단백질 복합체 또는 세포의 염색체 핵형의 일부가 아닌 핵산으로 구성된 다른 구조체를 말하며, 이의 예로는 플라스미드 및 바이러스성 게놈이 있다.
다른 하나의 구체적 양태로서, 본 발명은 (a) 절단하고자 하는 특정영역을 선택하는 단계; (b) 상기 특정영역 내에서 제1 뉴클레오티드 서열과 결합하는 제1 징크 핑거 도메인을 제공하는 단계; (c) 상기 결합하는 서열로부터 2 내지 50 뉴클레오티드만큼 떨어져 있는 제2 뉴클레오티드 서열과 결합하는 제2 징크 핑거 도메인을 제공하는 단계; (d) 상기 제1 징크 핑거 도메인 및 제1 뉴클레오티드 절단 도메인을 포함하는 제1 징크 핑거 뉴클레아제, 및 상기 제2 징크 핑거 도메인 및 제2 뉴클레오티드 절단 도메인을 포함하는 제2 징크 핑거 뉴클레아제를 세포 내에서 동시 또는 별도로 발현시키는 단계를 포함하며,
상기 제1 및 제2 징크 핑거 도메인은 3개 이상의 징크 핑거 모듈(zinc finger module)를 포함하고, 상기 징크 핑거 모듈 중 2 이상은 자연계에 존재하는 징크 핑거 모듈로부터 유래한 것을 특징으로 하며,
상기 제1 징크 핑거 도메인은 상기 제1 뉴클레오티드 서열과 결합하며, 상기 제2 징크 핑거 도메인은 상기 제2 뉴클레오티드 서열과 결합하고, 상기 결합에 의해 상기 세포염색질이 특정영역 내에서 절단되도록 상기 뉴클레오티드 절단 도메인이 위치하게 되는 것을 특징으로 하는 특정 영역 내의 세포염색질 절단 방법에 관한 것이다.
본 발명의 징크 핑거 뉴클레아제를 이용하여 표적을 절단하려면 징크 핑거 도메인의 결합 부위가 절단 도메인의 절단 부위를 둘러싸고 있거나 결합 부위의 끝이 절단 부위로부터 1 내지 50 사이의 뉴클레오티드에 위치하여야 한다. 이러한 절단 부위를 맵핑하는 방법은 당해 기술분야에 널리 알려져 있다.
상기 방법에 의하여 뉴클레오티드가 절단되는 부위는 두 융합 단백질의 결합 부위 사이에 존재한다. DNA 이중 나선의 절단은 두 개의 단일 나선 각각의 절단 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 뉴클레오티드들로 시작하는 "닉"에 기인한다. 예를 들면, 자연적인 FokI 제한효소에 의한 이중 나선 DNA의 절단은 4개의 뉴클레오티드로 시작된 단일 나선의 절단에 기인한다. 따라서 절단은 반드시 각 나선의 DNA의 정확한 반대편에서 일어날 필요는 없다. 또한, 융합단백질의 구조와 표적 부위 사이의 거리가 절단이 하나의 뉴클레오티드 쌍 근처에서 일어날지 아니면 여러 부위에서 일어날지에 영향을 미칠 수 있다.
본 발명에서 "표적 부위"는 징크 핑거 도메인에 의해 인식되는 핵산 서열을 말한다. 단일 표적 부위는 전형적으로 약 6 또는 약 12 염기쌍을 가진다. 전형적으로 3개의 징크 핑거 모듈을 가지는 징크 핑거 단백질은 2개의 인접한 6 내지 10 염기쌍 표적 부위를 인식하며, 4개의 징크 핑거 모듈을 가지는 징크 핑거 단백질은 2개의 인접한 9 내지 12 염기쌍 표적 부위를 인식한다. 용어 "인접한 표적 부위"는 0 내지 약 5 염기쌍까지 분리되어 있는 비-오버랩 표적 부위를 의미한다.
상기에 기술한 바와 같이, 융합단백질은 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 형태로 도입될 수 있다. 예를 들면, 각각 전술한 폴리펩티드들 중 하나를 암호화하는 서열을 포함하는 두 개의 폴리뉴클레오티드는 세포 내로 도입될 수 있고 절단은 표적 서열 근처에서 일어난다. 한편, 두 개의 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 하나의 폴리뉴클레오티드도 세포 내로 도입될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 DNA, RNA, 또는 DNA나 RNA의 변성체 및 유사체 모두 가능하다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 징크 핑거 뉴클레아제를 이용하여 세포염색질에서 특정 영역 내의 제1 뉴클레오티드 서열을 교체하는 방법에 관한 것이다.
하나의 구체적 양태로서, 본 발명은 (a) 제1 징크 핑거 도메인이 특정 영역 내에서 9개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 제2 뉴클레오티드 서열과 결합하도록 가공하는 단계; (b) 제2 징크 핑거 도메인이 상기 제2 뉴클레오티드 서열로부터 2 내지 50 뉴클레오티드만큼 떨어져 위치하며 9개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 제3 뉴클레오티드 서열과 결합하도록 제공하는 단계; (c) 상기 제1 징크핑거 도메인 및 제2 뉴클레오티드 절단 도메인를 포함하는 제1 징크 핑거 뉴클레아제, 및 상기 제2 징크핑거 도메인 및 제3 뉴클레오티드 절단 도메인을 포함하는 제2 징크 핑거 뉴클레아제를 세포 내에서 발현시키는 단계; (d) 상기 세포를 상기 제1 뉴클레오티드 서열과 상동성이 있으나 동일하지는 않은 제4 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 접촉시키는 단계를 포함하며,
상기 제1 및 제2 징크 핑거 도메인은 3개 이상의 징크 핑거 모듈(zinc finger module)를 포함하고, 상기 징크 핑거 모듈 중 1 이상은 자연계에 존재하는 징크 핑거 모듈로부터 유래한 것을 특징으로 하며,
상기 제1 징크 핑거 뉴클레아제와 상기 제2 서열의 결합 및 상기 제2 징크 핑거 뉴클레아제와 상기 제3 서열의 결합에 의해 상기 세포염색질이 특정 영역 내에서 절단되고, 이로 인해 상기 제1 뉴클레오티드 서열과 상기 제4 뉴클레오티드 서열 사이의 상동 재조합이 용이하게 되어 상기 제1 뉴클레오티드 서열이 상기 제4 뉴클레오티드 서열로 교체되는 것을 특징으로 하는, 세포염색질에서 특정 영역 내의 제1 뉴클레오티드 서열 교체 방법에 관한 것이다.
상기 방법은 표적화된 재조합 효율을 높이고 비특이적인 삽입 빈도를 감소시키는 것을 특징으로 하는 표적 서열 변환 방법이다. 특히 상동 재조합은 세포 DNA의 이중 나선 절단에 의해 절단 부위 근처에서 수천 배 정도 증폭되며, 이런 표적화된 절단은 실질적으로 게놈의 어떤 부위에서나 상동 재조합을 통하여 서열의 변환이나 치환을 가능하게 한다.
상기 방법은 융합 단백질(징크 핑거 뉴클레아제) 뿐만 아니라 선택된 게놈 서열의 표적화된 치환을 위하여 도너 서열을 필요로 한다. 도너 서열은 융합 단백질의 발현 이전이나 동시 또는 이후 언제든 세포 내로 도입될 수 있다. 도너 서열은 치환될 게놈 서열과 전형적으로 일치할 필요는 없다. 예를 들어, 상동 재조합을 할 수 있는 충분한 유사성을 가지고 있는 한 도너 폴리뉴클레오티드 서열은 게놈 서열에 대하여 하나의 염기 변환, 삽입, 결핍, 역위, 또는 재배열 중에서 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 또한, 도너 서열은 유사한 두 영역을 측면에 가지는 비상동 서열을 가질 수 있다. 또한, 도너 서열은 세포염색질의 특정 영역과 비상동인 서열을 가질 수도 있다.
또한, 상기 방법에 있어서, 제1 뉴클레오티드 서열은 유전자 내에 돌연변이를 포함하는 서열이 바람직할 수 있다. 이 경우 도너 서열, 특히 제4 뉴클레오티드 서열은 상기 유전자의 야생형 서열인 것이 바람직할 것이다. 상기 돌연변이는 점 돌연변이, 치환, 결실 또는 삽입 등일 수 있다.
또한, 본 발명은 다른 하나의 구체적 양태로서, 상기 징크 핑거 뉴클레아제를 이용하여 세포염색질에서 특정 영역 내의 제1 뉴클레오티드 서열을 변경하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 (a) 제1 징크 핑거 도메인이 특정 영역 내에서 9개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 제2 뉴클레오티드 서열과 결합하도록 가공하는 단계; (b) 제2 징크 핑거 도메인이 상기 제2 뉴클레오티드 서열로부터 2 내지 50 뉴클레오티드만큼 떨어져 위치하며 9개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 제3 뉴클레오티드 서열과 결합하도록 제공하는 단계; (c) 상기 제1 징크 핑거 도메인 및 제2 뉴클레오티드 절단 도메인을 포함하는 제1 징크 핑거 뉴클레아제, 및 상기 제2 징크 핑거 도메인 및 제3 뉴클레오티드 절단 도메인을 포함하는 제2 징크 핑거 뉴클레아제를 세포 내에서 발현시키는 단계를 포함하며, 상기 제1 및 제2 징크 핑거 도메인은 3개 이상의 징크 핑거 모듈(zinc finger module)를 포함하고, 상기 징크 핑거 모듈 중 1 이상은 자연계에 존재하는 야생형 징크 핑거 모듈로부터 유래한 것을 특징으로 하며, 상기 제1 징크 핑거 뉴클레아제와 상기 제2 서열의 결합 및 상기 제2 징크 핑거 뉴클레아제와 상기 제3 서열의 결합에 의해 상기 세포염색질이 특정 영역 내에서 절단되고, 상기 절단 부위에서 상기 제1 뉴클레오티드 서열이 변경되는 것을 특징으로 하는 세포염색질에서 특정 영역 내의 제1 뉴클레오티드 서열 변경 방법에 관한 것이다.
본 발명에서, 하나 또는 두 개 이상의 ZFP 또는 ZFP 융합단백질을 암호화하는 핵산은 복제 및 발현을 위해서 원핵세포 또는 진핵세포로 형질전환시키는 벡터로 클로닝될 수 있다. 벡터는 예를 들면, 플라스미드, 셔틀 벡터, 곤충 벡터 등의 진핵 벡터 또는 원핵 벡터를 포함한다. 식물세포, 동물세포, 바람직하게는 포유류 세포 또는 인간 세포, 균류 세포, 세균 세포 또는 원생동물 세포에 도입하기 위하여 ZFP를 암호화하는 핵산도 발현 벡터에 클로닝될 수 있다.
발현 벡터는 숙주 세포에서 특정한 핵산의 전사, 및 선택적으로 숙주 세포에서 발현 벡터의 통합 또는 복제를 허락하는 일련의 명시된 핵산 요소를 갖는, 재조합적 또는 합성적으로 생성된 핵산 구성물이다. 발현 벡터는 바이러스 또는 비-바이러스 기원의 플라스미드, 바이러스 또는 핵산 단편의 부분일 수 있다. 전형적으로, 발현 벡터는 "발현 카세트"를 포함하며, 이것은 프로모터에 작동가능하게 연결된 전사될 핵산을 포함한다. 또한, 용어 발현 벡터는 프로모터에 작동가능하게 연결된 네이키드 DNA를 포함한다.
클론된 유전자 또는 핵산을 발현시키기 위해 ZFP 또는 ZFP 융합단백질을 암호화하는 서열은 보통 직접 전사를 위한 프로모터를 가진 벡터에 서브클로닝된다. 적당한 세균 프로모터 또는 원핵 프로모터는 당해 분야에 널리 알려져 있다.
용어 "작동가능하게 연결된"은 핵산 발현 제어 서열(프로모터 또는 전사 인자 결합 부위의 어레이 등)과 제2 핵산 서열간의 기능적 결합을 의미한다.
본 발명에서 숙주 세포는 징크 핑거 뉴클레아제, 또는 징크 핑거 뉴클레아제를 코드화하는 발현 벡터 또는 핵산을 함유하는 세포를 의미한다. 숙주세포는 전형적으로 발현 벡터의 복제 및/또는 발현을 지원한다. 숙주세포는 E. coli와 같은 원핵세포, 또는 이스트, 진균, 원생동물, 고등 식물, 곤충과 같은 진핵 세포, 또는 양서류 세포, 또는 CHO, HeLa 293, COS-1, HEK와 같은 포유류 세포 등, 예를 들어 배양된 세포(시험관내), 이식편 및 1차 배양물(시험관내 및 생체외), 및 생체내 세포일 수 있다.
"핵산"은 단일- 또는 이중-가닥 형태의 디옥시리보뉴클에오티드 또는 리보뉴클레오티드, 및 그것들의 중합체를 의미한다. 이 용어는 공지의 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 주쇄 잔기 또는 결합을 함유하는 핵산을 포함하며, 이것은 합성적, 천연발생적, 및 비-천연발생적일 수 있고, 기준 핵산과 유사한 결합 특성을 가진다. 그러한 유사체의 예는, 제한 없이 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩티드-핵산(PNA)을 포함한다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 상호 교환가능하게 사용되며, 아미노산 잔기의 중합체를 의미한다. 또한, 이 용어들은 천연발생 아미노산 중합체 및 비-천연발생 아미노산 중합체 뿐만 아니라, 1개 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 천연발생 아미노산의 인공적 화학 의태체인 아미노산 중합체에도 적용한다.
용어 "아미노산"은 천연발생 및 합성 아미노산 뿐만 아니라, 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 의태체로 간주한다. 천연발생 아미노산은 유전 코드에 의해 코드화되는 것들 뿐만 아니라, 나중에 변형되는 아미노산, 예를 들어 히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는 천연발생 아미노산과 기본적 화학 구조가 동일한 화합물, 즉 수소에 결합된 α-탄소, 카르복실기, 아미노기, 및 R기, 예를 들어 호모세핀, 노르로이신, 메티오닌 술폭시드, 메틴오닌 메틸 술포늄을 가지는 화합물로 간주한다. 그러한 유사체는 변형된 R기(예를 들어, 노르로이신) 또는 변형된 펩티드 주쇄를 가지지만, 천연발생 아미노산과 기본적 구조는 동일하다. 아미노산 의태체는 아미노산의 일반적인 화학 구조와는 다른 구조를 가지지만, 천연발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화학적 화합물로 간주한다.
아미노산은 통상적으로 공지된 3-문자 기호, 또는 IUPAC-IUB Biochemical Nomenclatur Commission에 의해 추천된 1-문자 기호로 본원에서 간주될 수 있다. 마찬가지로, 뉴클레오티드도 통상적으로 승인된 단일-문자 코드에 의해 간주될 수 있다.
본 발명의 징크 핑거 뉴클레아제는 편리하고 신속하게 제조할 수 있으며, 게놈서열의 표적화된 절단과 표적화된 변경 등이 종래의 방법에 의하여 용이하여 특정 유전자의 녹아웃 등을 통한 유전자 치료 등에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 징크 핑거 뉴클레아제의 제조를 위해 사용된 징크 핑거의 기원, 아미노산 서열, 목적 부위 등을 나타낸 그림이다.
도 2는 발명자가 합성한 징크 핑거 뉴글레아제 중에서 대표적인 한 쌍의 아미노산 서열을 나타낸다. 세포 내 발현을 확인하기 위해 포함한 HA tag 서열과 핵내 전달 신호 서열에 밑줄을 그어 표시하였고 표적 염기서열과 특이적으로 결합할 것으로 예상되는 징크 핑거의 알파 헬릭스 부분을 고딕으로 나타내었다.
도 3은 CCR5 코딩 부위 내 ZFN 목적 부위에 대한 도식적인 개요를 나타낸 그림이다. ZRN 목적 부위는 박스 (boxes)로서 나타내었고, 숫자는 시작 코든 (start codon)에 비례하여 ZFN 목적 부위의 위치를 나타낸 것이다. 망상성 박스 (crosshatched box)는 ?32 변이의 위치를 표시한 것이다.
도 4는 실험적인 DNA 절단 분석을 나타낸 그림이다. DNA 절단 분석에 대한 도식적인 설명은 실험적인 전사와 번역 체계를 통하여 생산된 ZFNs를 사용하여 수행하였다.
도 5는 실험적인 DNA 절단 분석을 통한 전형적인 아가로즈 젤의 사진이다.
도 6은 cell-based single-strand annealing (SSA)를 사용한 ZFN 활성 평가를 위한 도식도이다. HEK293 세포의 게놈으로 형질전환한 ZFN 발현 플라스미드는 비활성 상태, 부분적으로 복제되어지고 파열되어진 상태인 luciferase 유전자를 포함하고 있다. 만약 ZFNs이 세포 내 목적 부위를 절단한다면, DNA는 SSA 메커니즘에 의해 효과적으로 복구되어지고 기능적 luciferase 유전자는 회복되어지게 된다.
도 7은 cell-based single-strand annealing (SSA)를 사용한 ZFN 활성 평가를 나타내는 그림이다. 세포의 luciferase 활성은 여러가지 ZFNs이 발현되었다는 것을 의미한다. P3 (노란색 막대)는 플라스미드가 없는 상태이며, 네거티브 대조군으로서 사용되었다. I-SceI의 인지 부위를 포함하고 있는 표적 염기서열은 파지티브 대조군으로서 사용되었다. 각각의 ZFN pair의 활성은 I-SceI 대조군에 비례하여 백분율 (percentage)로서 표시하였다. ZFN pairs와 그들의 구성 단위체 (constituent monomers)는 표시하였다. 추가적인 연구에 사용한 ZFN pairs는 녹색 삼각형 (green triangle)의 기호로 나타냈다. 평균값 (means)과 표준편차 (standard deviations: error bars)는 적어도 세 번의 독립적인 실험을 통해서 구한 것이다.
도 8은 인간 세포 내 ZFN-매개성 게놈 편집 (ZFN-mediated genome editing)의 T7E1 분석을 사용한 불일치 탐지 (mismatch detection) 의 도식도이다. 게놈의 DNA는 ZFNs을 인코딩하는 플라스미드와 함께 형질전환한 세포로부터 정제하였다. ZFN 인지부위를 포함하는 DNA 단편들은 PCR-증폭 (PCR-amplified)하였고, DNA amplicons은 열을 가해서 녹이고 (melted) 중합 (annealed) 하였다. 만약 DNA amplicons이 야생형 (wild-type)과 변이된 DNA 염기서열 둘다 포함하고 있다면, 이형접합체 (heteroduplexes)가 형성되어질 것이다. T7E1은 이형접합체를 인지하고 절단한다. 하지만 동형 접합체는 인지하고 절단하지 못한다. DNA 단편들은 아가로즈 젤 전기영동 (agarose gel electrophoresis)에 의해 평가하였다.
도 9는 T7E1 분석에 의해 인간 세포 내 ZFN-매개성 게놈의 변이를 나타낸 그림이다. ZFN pairs는 아가로즈 젤의 정상에 나타나고 있다. 결과산물인 DNA 밴드 (band)의 예상되는 위치는 젤 패널의 왼쪽에 화살표 (잘리지 않은 상태)와 각괄호 (잘린 상태)로 나타내었다. P3는 플라스미드가 없는 상태이며, 네거티브 대조군으로서 사용되었다. 상가모의 CCR5-targeting ZFN pair (Sangamo CCR5)는 본 분석에 포함되었다.
도 10은 Z836에 의해 표적되는 게놈의 부위에 대한 DNA 염기서열을 나타낸다. ZFN 인지 요소들은 밑줄을 그어 표시하였다. 삭제된 부위는 줄표 (dash)로 나타냈으며, 삽입된 염기들은 소문자 (small letters)로 표시하였다. 1개 이상의 변이가 탐지된 경우, 그 변이의 발생하는 수는 소괄호안에 표시되어져 있다. wt는 야생형 (wild-type)을 나타낸다.
도 11은 ZFN Z30 및 Z266의 표적 부위들에 대한 DNA 염기서열을 나타낸 그림이다. ZFN 인지 요소들은 밑줄을 그어 나타내었고, 결실은 점선으로 표시하였고, 삽입된 염기들은 소문자로 나타내었다. 하나 이상의 변이가 탐지된 경우에는 변이의 발생 수를 괄호안에 표시하였다.
도 12는 ZFN Z360 및 Z411의 표적 부위들에 대한 DNA 염기서열을 나타낸 그림이다. ZFN 인지 요소들은 밑줄을 그어 나타내었고, 결실은 점선으로 표시하였고, 삽입된 염기들은 소문자로 나타내었다. 하나 이상의 변이가 탐지된 경우에는 변이의 발생 수를 괄호안에 표시하였다.
도 13은 ZFN Z426 및 Z430의 표적 부위들에 대한 DNA 염기서열을 나타낸 그림이다. ZFN 인지 요소들은 밑줄을 그어 나타내었고, 결실은 점선으로 표시하였고, 삽입된 염기들은 소문자로 나타내었다. 하나 이상의 변이가 탐지된 경우에는 변이의 발생 수를 괄호안에 표시하였다.
도 14는 ZFN Z891의 표적 부위들에 대한 DNA 염기서열을 나타낸 그림이다. ZFN 인지 요소들은 밑줄을 그어 나타내었고, 결실은 점선으로 표시하였고, 삽입된 염기들은 소문자로 나타내었다. 하나 이상의 변이가 탐지된 경우에는 변이의 발생 수를 괄호안에 표시하였다.
도 15는 다양한 ZFN에 표적된 부위의 변이(mutation) 유형(types)을 나타낸 그림이다. 각각의 ZFN pair에 대한 결실, 삽입, 그리고 복합적인 변이의 수는 계산되었고, 그들의 변이 발생수는 백분율로 나타내었다.
도 16은 야생형과 obligatory 이형접합체의 ZFNs에 대한 시간 진행에 따른 분석 결과이다. T7E1 불일치 탐지 (mismatch detection) 분석은 다른 종류의 FokI 뉴클레아제 도메인을 처리한 세포로부터 분리한 DNA를 가지고 여러가지 시간 대에서 수행하였다. WT, 야생형 (wild-type) 뉴클레아제 도메인; RR/DD 또는 KK/EL, obligatory 이형접합체의 뉴클레아제 도메인들.
도 17은 야생형과 obligatory 이형접합체의 Z891 ZFN pair 모두 HEK293T/17 세포 내로 형질전환하고, 형질전환한 후 2일째에 세포 내의 53BP1 초점들 (foci)을 면역형광에 의해 탐지한 결과이다. 에토포사이드 (etophside) (1 μM)는 파지티브 대조군으로 사용되었다.
도 18은 도 16의 결과를 도시화한 것으로, 53BP1 초점 수에 대한 분포가 플롯화된 그림이다. 적어도 100개의 세포들은 2 번의 독립적인 측정에서 각 처리에 대해 분석되었다.
도 19는 돌연변이 클론들에 대한 DNA 염기서열을 나타낸 그림이다. 7 개의 돌연변이 클론들은 RR/DD ZFN 다이머를 처리한 세포들로부터 제한적 희석 (limiting dilution)에 의해 분리하였다. 이들 클론 세포 내 표적 부위의 DNA 염기서열은 나타내었다. 결실은 점선 (dash)으로 표시하였고, 삽입된 염기들은 소문자 (small letters)로 나타내었다. 클론 1a와 1b는 하나의 클론 (single clone)에서 양대립성형질 변이 (biallelic modifications)에서 생겨난 DNA 염기서열을 나타낸 것이다.
도 20은 CCR2 부위에서 T7E1 분석을 나타낸 그림이다. ZFN pairs를 처리한 세포에서 CCR2 코딩 지역에 상응하는 부위가 PCR로 증폭한 DNA (PCR-amplified DNA) (패널의 위)가 분석되었다. CCR2 부위에서 변이가 일으키도록 주어진 ZFN pairs는 +로 표시하였다. P3는 플라스미드가 없는 상태이며, 네거티브 대조군으로서 사용되었다. 상가모의 CCR5-targeting ZFN pair (Sangamo CCR5)는 본 분석에 포함되었다.
도 21은 CCR2 부분 (locus)에서 ZFNs의 off-target 효과로서, CCR5와 CCR2 부분에서 ZFN 인지 요소들 (recognition elements)을 나타낸 그림이다. ZFN pairs는 DNA 염기서열의 왼쪽에 표시하였다. CCR5와 CCR2 부분 사이에서 일치하는 염기의 수는 소괄호 안에 나타내었고, 불일치하는 염기들은 굵은 소문자 (bold letters)로 나타내었다. ZFN 인지 요소들의 half-site는 밑줄을 그어서 표시하였다.
도 22는 모듈 교환 분석을 위해 사용된 징크 핑거를 나타낸 그림이다.
도 23은 새로운 ZFNs가 동일한 염기서열을 인지하는 본 발명의 ZFNs을 기능적으로 대체할 수 있는지 시험하기 위한 모듈 교환 분석에 있어서 cell-based SSA system의 분석 결과를 나타낸 그림이다. “BR4”와 같이 “B”로 시작하는 명칭의 ZFN 단위체들은 오직 Barbas 모듈로만 구성되어 있는 것이고, “SR4”와 같이 “S”로 시작하는 명칭의 ZFN 단위체들은 상가모 모듈로만 구성된 것이다. 다양한 ZFNs는 세포의 루시퍼라제 활성을 발현하였다. P3 (노란색 막대)는 플라스미드가 없는 상태이며, 네거티브 대조군으로서 사용되었다. I-SceI의 인지 부위를 포함하는 목적 염기서열은 파지티브 대조군으로서 사용되었다. 각각의 ZFN pair의 활성은 I-SceI 대조군에 비례해서 백분율로서 평가되었다. ZFN pairs와 그들의 구성 단위체들이 표시되어 있다. 평균값 (means)과 표준편차 (standard deviations: error bars)는 적어도 세 번의 독립적인 실험을 통해서 구한 것이다.
도 24는 새로운 ZFNs가 동일한 염기서열을 인지하는 본 발명의 ZFNs을 기능적으로 대체할 수 있는지 시험하기 위한 모듈 교환 분석에 있어서 ZFN-매개성 게놈의 변이를 T7E1 분석에 의해 나타낸 그림이다. ZFN pairs와 그들의 구성 단위체들은 아가로즈 젤의 위에 표시되어 있다. Positive 유전자를 표적하는 결과를 일으키는 ZFN pairs는 “+”에 의해 표시되어 있다.
도 25는 본 발명의 ZFN 분석에 대한 요약이다. 각각의 분석에서 파지티브 결과를 보여주는 ZFN pairs의 수 또는 목적 부위를 보여주고 있다.
도 26은 다른 유형의 ZFNs의 성공 비율을 비교한 그림이다. 성공적인 ZFN pairs 또는 목적 부위는 T7E1 불일치 탐지 분석 (T7E1 mismatch detection assay)에서 파지티브 결과로 나타난 ZFNs로서 밝혀진 것이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.
실시예 1 : 징크 핑거 뉴클레아제 구성 및 이를 포함하는 플라스미드 제작
3- 또는 4-핑거 배열(arrays)를 인코드하는 DNA 단편들은 배 등(Bae, K.H. et al. Human zinc fingers as building blocks in the construction of artificial transcription factor. Nat Biotechnol 21, 275-280 (2003))에 기재된 방법에 의하여 조립하였다. 이들 조립된 3- 또는 4-핑거 배열 중에서 본 실험에서 사용하기 위한 다양한 DNA 결합 특이성을 가진 54개의 징크 핑거 모듈(이하, ZF 모듈이라 함)을 선택하였다. 그 선택된 ZF 모듈 및 이의 아미노산 서열을 도 1 및 2에 나타내었다. 그 선택된 54개의 ZF 모듈 중 31개의 ZF 모듈은 인간 유전자에 있는 DNA 서열로부터 유래된 것이고, 2개의 ZF 모듈은 초파리(Drosophila) 유전자에 있는 DNA 서열로부터 유래된 것이다(도 1). 상기 인간 및 초파리로부터 유래된 ZF 모듈은 본원에서 툴젠 모듈(ToolGen modules)이라고 편의상 호칭한다. 그 외 21개의 ZF 모듈은 파아지 발현 기술(Barbas modules)을 사용하여 ZF 변이체들의 라이브러리로부터 선택을 하거나 표적 특이적 돌연변이 기술(site-directed mutagenesis)(Sangamo modules)을 사용하여 제작되었다.
다음으로, 멀티-핑거 ZFN의 개발을 위해, 툴젠(ToolGen)에서 개발한 컴퓨터 알고리즘 (computer algorithm)을 사용하여 인간 유전자인 케모카인(chemokine: C-C motif) 수용체 5 (CCR5) 코딩 부위 (coding region)의 DNA 서열에서 잠재적인 ZFN 목적 부위를 탐색하였다. 그 탐색 결과를 기초로 본 발명자들은 상기 54개의 ZF 모듈을 조합한 208개의 징크 핑거 단백질 단위체들을 합성하였고 그 중 대표적인 한 쌍의 ZFN의 아미노산 서열을 도 2에 나타내었다. 이들 ZFN 단위체들을 이용해 CCR5 유전자 내 33개의 유전자 부위에 대해 315개의 ZFN 다이머들을 시험하였다(도 3 참조)
상기 제조된 3 또는 4개의 ZF 모듈로 구성된 징크 핑거 도메인을 플라보박테리움 오케아노코이테스(Flavobacterium okeanokoites) 게놈 DNA (genomic DNA)로부터 유래한 FokI 엔도뉴클레아제 도메인 (endonuclease domain)을 병합하고, 이들 병합된 서열을 pcDNA3.0 플라스미드(invitrogen)의 개조된 버전인 p3 클로닝 벡터 플라스미드에 재조합하였다.
실시예 2 : ZFN 활성에 대한 생체 외( in vitro )와 생체 내( in vivo ) 분석
2-1. 생체 외 유전자 절단 분석 ( In vitro digestion assay )
ZFNs의 생체 외 제한효소로서의 활성을 분석하기 위해, 생체 외 전사와 해독(in vitro transcription and translation; IVTT) 시스템을 사용하여 준비하였고, 그 준비된 ZFNs를 CCR5 코딩 서열을 포함하고 있는 DNA 조각과 함께 배양하였다. 구체적으로 상기 실시예 1에서 제작한 ZFNs는 TnT-Quick coupled transcription/translation system (Promega)를 사용하여 생체 외(in vitro)에서 제작사의 사용설명서에 기술된 방법(in vitro transcription and translation; IVTT)으로 유전정보의 전사(transcription)와 번역(translation) 과정을 진행하였다. 간략하게, ZFNs을 인코드하는 플라스미드 (각 0.5 ㎕)에 TnT Quick master mix (20 ㎕) 및 1 mM 메티오닌 (0.5 ㎕)을 부가한 후 그 반응물을 30?에서 90 분 동안 배양하였다. 그리고, CCR5 코딩 염기서열 (coding sequence)을 포함하는 목적 플라스미드(target plamid)는 제한효소(restriction enzyme)를 처리하여 선형화한 다음, 그 목적 플라스미드 (1 ㎍)를 상기 ZFN IVTT 분리물 (lysates) (각각 1 ㎕)과 함께 NEBuffer 4 (New England Biolabs)에서 37℃, 2시간 동안 배양시켜 처리하였다. 이 반응 혼합물에 65℃의 열을 가하여 불활성화시킨 후, 13,000 rpm에서 원심분리시켰다. 그 상청액(supernatant)은 아가로스 젤 분석을 위해 사용되었다. 도 4는 상기 실험 과정을 간략히 도시화하였으며, 그 실험 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에서 볼 수 있는 바와 같이, ZFN 쌍은 목적(target) DNA에 대해 40% 효율의 효과적인 부위 특이적 절단(site-specific cleavage)를 나타내었다.
2-2 : 단일 사슬 어닐링 시스템( single - strand annealing system )
다음으로, 본 발명자들은 인간 세포에서 ZFNs에 의해 절단된 DNA가 상동 재조합을 유도하는 것이 가능한지 확인하기 위하여 포유동물 세포에서 시험이 가능한 단일 사슬 어닐링(single-strand annealing; SSA) 시스템을 사용하여 시험하였다.
2-2-1. cell - based 분석에 사용한 리포터 플라스미드 제조
반딧불이 루시퍼라제 유전자의 3'-부분은 하기 표 1의 프라이머 1과 2를 사용하여 pGL3-control (Promega)로부터 증폭하였고, 증폭된 유전자 산물은 pcDNA5/FRT/TO (invitrogen)의 BamHI과 XhoI 부위 안으로 클로닝하였다. 하기 표 1의 프라이머 3과 4를 사용하여 증폭한 루시퍼라제 유전자의 5'-부분은 상기 플라스미드의 HindIII와 BamHI 부위 안으로 연속적으로 클로닝을 진행하였다. I-SceI 결합 부위는 하기 표 1의 프라이머 5와 6을 사용하여 리포터 플라스미드 (reporter plasmid)의 BamHI 부위 안으로 클로닝하였다. 프라이머 7과 8을 사용하여 증폭한 CCR5 코딩 염기서열은 리포터 플라스미드의 BamHI 부위 내로 클로닝하였다.
Figure pat00001
2-2-2. 세포 배양과 리포터 세포주 ( reporter cell line )의 설립
상기 실시예 1에서 제조된 징크 핑거 뉴클레아제를 코딩하는 서열을 가지는 플라스미드로 형질전환된 HEK293T/17 (ATCC, CRL-11268TM) 세포와 Flp-InTM T-REXTM 293 세포 (invitrogen)는 100 units/ml의 페니실린 (penicillin), 100 ㎍/ml의 스트렙토마이신 (streptomycin), 0,1 mM의 비필수 아미노산 (non-essential amino acids)과 10% 우태아혈청 (fetal bovine serum; FBS)이 첨가된 DMEM(Dulbecco modified Eagle medium)에서 배양하였다. 파열된 루시퍼라제 유전자를 인코딩하는 리포터 플라스미드는 사용자 설명서를 따라 Flp-InTM T-RexTM 293 세포 내로 지속적으로 통합되었다. 간단히 말해서, 세포에 리포터 플라스미드와 pOG44, Flp 재조합효소 발현 벡터를 함께 형질전환하였고, 하이그로마이신 B (hygromycin B)를 사용하여 선발하였다. 이렇게 파열된 루시퍼라제 유전자를 가지고 있는 클론 세포주를 확인하였고, SSA 분석을 하기 위해 사용되어졌다.
2-2-3. SSA system 을 사용한 Cell - based 분석
ZFN 발현 플라스미드 (각각 100 ng)는 리포펙타민 2000 (invitrogen)을 사용하기 위하여 체제를 갖춘 96-웰 플레이트의 각 웰에 있는 30,000 개의 리포터 세포 내로 형질전환 하였다. 48 시간 후에, 루시퍼라제 유전자는 독시사이클린 (doxycycline) (1 ㎍/ml)에 의해 유도되었다. 배양한지 24 시간 후에, 세포는 20 ㎕의 1 X lysis buffer (Promega)를 처리하여 용해시켰고, 루시퍼라제 활성은 2 ㎕의 세포 분리물(lysates)에 10 ㎕의 루시퍼라제 분석 시약 (Promega)을 부가하여 측정하였다.
2-2-4. 결과
인간 태아 신장 세포 (human embryonic kidney cells: HEK cells)에 형질전환 (transfection)한 ZFNs을 인코드한 플라스미드 (plasmid)의 유전자는 안정하게 통합되었고, 부분적으로 복제된 반딧불이 (firefly) 루시퍼라제 유전자는 CCR5 서열의 삽입에 의해 파괴되었다. 효과가 있는 ZFNs은 CCR5 서열 내에 double strand break (DSB)를 일으킬 것이고, 이어서 손상된 부분은 SSA를 통해 기능적인 루시퍼라제 유전자로 복구되는 과정이 뒤따르게 될 것이다. ZFNs에 의한 DNA 절단 효율은 루시퍼라제 효소 활성에 의해 측정될 수 있다. 고효율성인 메가뉴클레아제 (meganuclease)인 I-SceI은 양성대조군 (positive control)로 사용되었다. 상기 실험 과정을 도 6에 도시화하였으며, 그 구체적인 실험 결과를 도 7로 나타내었다.
도 7에서 보는 바와 같이, 많은 ZFN 다이머가 아주 의미있는 루시퍼라제 활성을 나타냈다. 315개의 ZFN 다이머에서 23개 다이머는 양성대조군 I-SceI과 비교하여, 15-57%의 루시퍼라제 활성을 보였다. 이러한 결과는 15% 보다 낮은 활성을 보이는 ZFN pairs도 세포 안에서 double strand break를 유도할 가능성이 있다는 것을 나타내고 있지만, 본 발명자들은 추가적인 연구를 하기 위하여 아주 높은 효소 활성을 나타낸 23 pairs에 중점을 두고 연구를 진행하였다. 23개의 ZFN 다이머들은 CCR5와 관련이 없는 DNA 서열에 의해 부분적으로 복제된 루시퍼라제 유전자를 파괴시킨 게놈을 보유하는 target-less reporter 세포를 사용하였을 때 뚜렷한 루시퍼라제 활성을 나타내지 않았다(실험결과는 나타내지 않음). 본 결과를 통해서 ZFN-매개성 DNA 복구 (ZFN-mediated DNA repair)는 CCR5-특이성이라는 것을 시사한다.
실시예 3 : ZFNs 를 처리한 HEK293 세포에서 돌연변이 탐색
ZFNs이 IVTT 분석에서 엔도뉴클레아제 활성을 나타내는지 혹은 세포에서 세포 내 목적으로 하는 유전자의 서열을 수정할 수 있었던 cell-based 분석을 통하여 루시퍼라제 활성을 유도하는지 연구하였다. ZFNs에 의해 유도된 double strand break는 오류발생이 쉬운 (error-prone) 비상동말단연결 (non-homologous end joining: NHEJ)에 의해 복구될 수 있다. 결과산물인 DNA는 DSB가 일어난 부위 가까이 조그마한 DNA 염기서열의 삽입/삭제 (insertion/deletion: indel 돌연변이)를 포함한다. 이러한 특정 부위의 DNA 염기서열의 삽입/삭제 돌연변이들은 mismatch-sensitive T7 endonuclease I (T7E1)와 함께 증폭된 DNA 조각들을 처리함으로써 실험적 (in vitro)으로 탐색할 수 있었다(그림 8 참조).
구체적으로, 96-well plate에서 사전 배양한 (pre-cultured) HEK293T/17 세포는 ZFN pair (각각 100 ng)를 인코딩하는 2 개의 플라스미드와 함께 Lipofectamine 2000 (invitrogen)을 사용하여 형질전환 시켰다. 배양한지 72 시간이 지난 후, 게놈의 유전자 (genomic DNA)는 사용자 설명서에 묘사한 바와 같이 G-spinTM Genomic DNA extraction kit (iNtRON BIOTECHNOLOGY)를 사용하여 ZFN-형질전환된 세포로부터 추출하였다. ZFN 목적 부위를 포함하는 게놈의 부분은 이형접합 DNA를 형성하도록 증폭하였고 (amplified), 열을 가하여 녹이고 (melted), 중합 (annealed) 하였다. 프라이머 9와 12는 Z30 부위를 위해 사용되었고, Z266과 Z360 부위를 위해 10과 12, Z410, Z426과 Z430 부위를 위해서는 11과 12 프라이머, Z836과 Z891부위를 위한 프라이머는 13과 14가 사용되었다(표 1 참조). 중합된 DNA는 37℃에서 15 분 동안 5 units의 T7 endonuclease 1 (New England BioLabs)을 처리하였고, 그리고 나서 2.5 배의 에탄올 (ethanol)을 첨가함으로써 침전시켰다. 침전된 DNA는 아가로즈 젤 전기영동으로 분석하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에서 보는 바와 같이, ZFN이 처리된 세포로부터 증폭된 DNA의 작은 조각들은 T7E1에 의해 절단 되었다. 각 ZFN pair는 그들 ZFNs가 목적으로 했던 8개의 다른 부위들을 실로 반영하며 특유의 절단 유형을 발생시켰다. 게다가 절단된 DNA 밴드들의 크기는 예상했던 바였다. T7E1 분석으로 시험했던 23개의 ZFN pairs 중에서, 21개의 ZFN pair는 예상했던 크기를 가진 구분이 가능한 DNA 밴드들을 나타내었다(실험결과는 나타내지 않음).
또한, 본 발명자들은 IVTT 분석에서 뚜렷한 엔도뉴클레아제 활성을 보여주지 않았거나, cell-based SSA system에서 의미있는 luciferase 활성을 나타내지 않았던 대표적인 ZFN pairs를 시험하기 위하여 T7E1 분석을 사용하였다. 하지만 IVTT 시험은 통과하였다. T7E1 분석 결과, 어떤 ZFN pairs도 탐지가능한 수준으로 DNA 돌연변이가 유도되지 않았다.
실시예 4 : ZFNs 에 의해 유도된 돌연변이에 대한 DNA 서열 분석
본 발명자들은 부가적인 연구를 위하여 CCR5 유전자의 다른 부위를 목적으로 하는 각각의 ZFN pairs 8개를 대표적으로 선택하였다(표 2 참조). 그들 8개의 개별적인 ZFNs 가운데 어느 것이 동형-다이머 (homo-dimers)로서 기능을 할 수 있는지 검사하였다. ZFN 단위체 단독에 대한 목적 유전자를 표적으로 하는 활성도는 T7E1 분석을 사용하여 평가하였다. 예상했던 바와 같이, ZFN 단위체들 중 아무것도 탐지가능한 DNA 절단을 일으키지 않았다(실험결과는 나타내지 않음).
Figure pat00002
그리고 나서 본 발명자들은 ZFNs에 의해 유도된 돌연변이들을 확인하는 것과 돌연변이 발생비율을 측정하기 위한 방법으로 DNA 염기서열을 분석하여 결정하였다. 각 8개의 ZFN pairs와 함께 형질전환했던 세포에서 증폭시켰던 DNA는 클로닝을 한 후, DNA 염기서열 분석을 진행하였다. 여러 가지 삽입/삭제 현상들이 DSBs 부위 근처에서 관찰되었다(도 10 내지 14 참조). 그들 돌연변이 양상들은 오류발생이 쉬운 비상동말단연결의 상징이다. 이들과 유사한 양상들은 다른 것에 의해 보고된 바가 있다(Bibikova, M., Golic, M., Golic, K.G. & Carroll, D. Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases. Genetics 161, 1169-1175 (2002); Morton, J., Davis, M.W., Jorgensen, E.M. & Carroll, D. Induction and repair of zinc-finger nuclease-targeted double-strand breaks in Caenorhabditis elegans somatic cells. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 16370-16375 (2006); Santiago, Y. et al. Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineered zinc-finger nucleases. Proc Natl Acad Sci U S A 105, 5809-5814 (2008)). 작은 부분의 삽입/삭제 돌연변이와 치환에 더하여, 본 연구진들은 2개의 ZFN pairs에서 상대적으로 큰 부분이 삽입된 DNA (각각 서로 다른 81 뉴클레오타이드)를 관찰하였다(도 11의 Z30과 도 12의 Z360 ZFN 참조). 이러한 DNA 염기서열 분석은 삽입된 염기서열이 ZFNs을 인코드한 plasmid로부터 존재한다는 결과를 나타냈다.
별개의 부위를 목적으로 하는 8개의 ZFN pairs는 2.4%에서 17%의 돌연변이율을 보여주었다(도 15 참조). 이는 전체 클론들이나 돌연변이 클론들까지 분리함으로써 평가되었다. ZFN에 의해 유도된 돌연변이의 높은 효율성은 10개 내지 100개의 single-cell로부터 유래한 콜로니들을 스크리닝 함으로서 분리할 수 있었다는 것을 나타낸다.
실시예 5 : ZFN 처리 후 클론 세포의 분리
5-1. 본 발명의 ZFN 의 off - target 효과
다른 연구자들의 선행연구에서 보여줬듯이(Szczepek, M. et al. Structure-based redesign of the dimerization interface reduces the toxicity of zinc-finger nucleases. Nat Biotechnol 25, 786-793 (2007); Miller, J.C. et al. An improved zinc-finger nuclease architecture for highly specific genome editing. Nat Biotechnol 25, 778-785 (2007)), 어떤 ZFNs은 off-target 효과(원래 의도한 표적이 아닌 다른 장소에 작용하는 효과)를 가지고 포유동물 세포에서 발현시켰을 때 세포독성을 나타낸다. 그러나 본 발명의 ZFNs를 형질전환한 HEK293 세포에서는 어떤 뚜렷한 성장지연이 나타나지 않는 것을 관찰했다. 하지만, 초기에 제한된 수의 단세포로부터 유래한 콜로니들을 스크리닝 하였을 때, ZFN 처리에 의해 염기서열이 수정된 게놈을 가진 클론의 돌연변이 세포들을 분리하는 것이 불가능하였다. 이와 같은 사실은 ZFN에 의해 유도된 돌연변이를 보유한 세포가 성장을 정상적으로 하지 못하게 되는 것(growth-impaired)을 암시한다.
따라서, 본 발명자들은 실제 돌연변이가 유발된 세포가 돌연변이가 되지 않은 세포에 비해 현저히 성장이 억제되는지 조사하기 위하여, ZFN을 포유동물 세포에 DNA transfection을 통해 도입한 후 3일, 6일, 그리고 9일째 되는 일자에 세포로부터 각각 DNA를 분리하여 T7E1 분석을 수행하였다. 그 분석을 위하여 대표적으로 Z891을 선택하여 T7E1 분석을 한 결과, 도 16에서 보는 바와 같이, 절단된 DNA 조각들은 3일째 되는 일자에 비해 6일째에 현저하게 감소하였고, ZFN을 처리한 이후 9일째 되는 일자에서는 아주 희미하게 탐지 가능한 정도였다. 이러한 결과는 ZFN이 세포독성 효과를 가지고 있어 ZFN에 의해 게놈 상에 돌연변이가 일어난 세포는 그렇지 않은 세포에 비해 성장이 억제되는 것을 시사한다.
5-2. 본 발명의 ZFN 이형 다이머의 off - target 효과
ZFNs의 off-target 효과는 이형 다이머만이 아니고 동형 다이머를 형성하는 ZFN들의 활성에 의해 크게 기인한다. 이러한 효과는 동형 다이머는 형성하지 않고 이형 다이머만을 형성하는 FokI 뉴클레아제 변형체를 사용함으로서 현저하게 감소되어질 수 있다. 따라서, ZFNs의 세포독성 효과를 감소하도록 본 연구진들은 소위 obligatory heterodimers를 준비(도 16에서 "RR/DD" 다이머들과 "KK/EL" 다이머들로써 나타냈음)하였고, T7E1 분석을 진행하였다. T7E1 분석 결과, 세포에 RR/DD ZFN pair를 형질전환했을 때, 절단된 DNA 조각들은 ZFN을 처리한 이후 9일까지 지속하여 남아있었다. 세포에서 DNA 절단 특이성을 증대시킨 ZFN으로부터 제작한 Obligatory heterodimeric ZFN이 세포독성을 감소시키는 것을 확인하기 위하여, ZFN을 처리한 세포에서 DSBs를 수선하는 단백질인 53BP1에 대한 항체(antibody)를 사용하여 DSB 정도를 분석하였다. 구체적으로, 53BP1을 위한 핵내 염색 (intranuclear stain)은 HEK293T/17 세포를 가지고 수행되었다. 슬라이드는 커버 (NUNC)가 장착된 Lab-Tek chamber 슬라이드를 사용하여 3.7% 포름알데하이드 (formaldehyde)로 고정 (fixing)시킨 세포를 부착시킴으로써 준비하였다. 세포는 상온 (room temperature: RT)에서 10분 동안 phosphate-buffered saline (PBS) 내에 0.2% Triton X-100을 처리함으로써 투과시켰다. 투과시킨 세포는 그 다음에 비특이적 염색 (nonspecific staining)을 방지하기 위해 5% bovine serum albumin (BSA)가 있는 상태에서 anti-53BP1 rabbit polyclonal 항체 (Bethyl Laboratories)와 반응시켰고, 뒤이어 Alexa Fluor 488-conjugated 이차 항체 (Invitrogen-Molecular Probes)를 반응시켰다. 슬라이드는 세포 핵 (cell nuclei)을 대비염색 (counterstain) 하도록 DAPI (Sigma)를 처리하여 탑재하였고, 면역형광현미경 (immunofluorescence microscope) (Carl Zeiss-LSM510) 방법으로 검사되었다. 그 결과를 도 17 및 18에 나타내었다. 도 17 및 18에서 보는 바와 같이, RR/DD ZFN pair를 처리한 세포에서는 야생형 (wild-type) ZFN pair를 처리한 세포와 비교했을 때, 53BP1 초점들 (foci)의 수가 현저하게 감소 되었다.
5-3. 본 발명의 ZFN 을 처리한 게놈의 유전자 변이 확인
다음으로, Z891 RR/DD ZFN pair를 발현시킨 HEK293 세포들 225개를 96-well plate를 이용해 단세포 콜로니(single-cell colonies)로 배양한 후 이들을 개별적으로 스크리닝하여 7개의 서로 다른 돌연변이 클론을 분리하였다. 상기 분리된 클론 세포로부터 ZFN을 처리한 게놈의 유전자 변이 (ZFN-induced genomic modifications)를 확인하기 위하여, 상기 클론 세포에서 CCR5 유전자의 DNA 염기서열을 분석하였다. ZFN에 의해 조작된 세포에서 게놈의 DNA 염기서열을 분석한 결과, 이들 7개의 클론들 중에서 6개 클론에서는 CCR5 대립유전자 중 한 군데에서 (monoallelic) 삭제 혹은 삽입이 일어났으며, 다른 한 개의 클론은 두 개의 대립유전자에서(biallelic) 변이를 보여주었다 (도 19 참조). 293 세포의 유전체는 부분적으로 세염색체(trisomy)를 나타내고 CCR5 유전자도 세 개 있다고 알려져 있다. 두 개의 CCR5 대립유전자 모두에서 돌연변이가 도입된 세포에서 다른 한 개의 CCR5는 야생형 서열을 보존하고 있는 것으로 확인되었다(도 19 참조). ZFN 처리에 의해 대립유전자 두 개에 동시에 돌연변이를 도입할 수 있다는 사실은 선택표지 (selection marker)를 사용하지 않고 한 단계에서 동종접합 녹아웃 세포(homozygous knout-out cell)를 분리할 수 있다는 것을 의미한다.
실시예 6: 동형 CCR2 부위에서 CCR -5 를 표적으로 하는 ZFNs 의 off - target 효과
CCR2 유전자는 CCR5 유전자에 대해 아주 높은 유사성 (highly homologous)을 가지고 있으며, CCR5 ZFN 인지 요소 (recognition elements)의 많은 부분이 CCR2 부위에 보존되어 있다. 그러므로 본 발명자들은 CCR5 부위에 대해 제작된 8 개의 ZFNs이 CCR2 부위에서 동형 또는 일치하는 염기서열을 또한 변이시킬 수 있는지 아닌지 검사하였다. CCR2 유전자에서 일치하는 인지 요소를 가지고 있는 3 개의 ZFN 쌍 (Z360, Z410 과 Z430)은 T7E1 분석에서 효과적인 유적적 변이를 유도할 수 있었다 (도 20 참조). 12-bp half-site를 구성하는 Z891 쌍의 인지 요소는 CCR5 유전자의 상응하는 부분과 완벽하게 일치하고, CCR2 유전자에서 1 개의 염기가 불일치하는 12-bp half-site를 가지고 있다. 예상한 대로, Z891 pair는 또한 CCR2 부위에서 목적으로 하는 유전자에 대해 정확한 표적 활성을 나타냈다. 반면에, 12-bp half-sites에서 1 개의 염기가 불일치하는 부위를 포함하는 CCR2 부위 내 인지 요소에 대한 상가모사의 CCR5를 표적으로 하는 ZFN pair를 시험하였고, 상가모사의 ZFN은 동형 CCR2 부위에서 off-target 유적적 변이를 보여주었다(도 20 참조). 반면에, Z30, Z266과 Z836의 ZFN pairs는 어떠한 탐지 가능한 ZFN 활성도 관찰되지 않았으며, 이들 ZFN pairs의 CCR2 부위에서 인지 요소는 적어도 2 개의 불일치를 나타냈다.
또한, Z891 쌍(pair)을 처리한 HEK293 세포의 형질전환에 의해 획득한 7 개의 돌연변이 클론 세포가 변이를 일으키고자 했던 목적으로 하는 의도된 CCR5 부위에 더하여 아주 높은 유사성을 가진 CCR2 부위의 DNA 염기서열에서도 돌연변이가 유도되는지 실험해 보았다. 그 결과를 도 21에 나타내었다. 도 20에서 볼 수 있는 바와 같이, Z891 쌍은 T7E1 분석에서 CCR5 부위 뿐만 아니라 CCR2 부분에 대해서도 목적으로 하는 유전자에 대해 정확한 표적 활성을 나타냈으나, CCR2 부위는 이들 클론 세포주들에서 변이가 일어나지 않았다. 이러한 결과는 원래 의도한 표적 장소와 유사한 동형 염기서열을 보유한 부위가 유전체 여러 장소에 있다고 하더라도 오직 의도된 부위에서만 변이가 일어난 세포를 만들 수 있고, 이를 여러 세포를 스크리닝해서 단일 클론 세포로 분리할 수 있음을 보여 준다.
실시예 7 : 모듈 교환 ( module swap ) 분석
본 발명자들은 모듈러 조립(modular assembly)을 통한 ZFNs의 제작이 왜 게놈 편집에 있어서 높은 성공율을 이끄는지 조사하였다. 구체적으로 본 발명의 ZFN과 동일한 DNA-결합 특이성을 나타낸 Barbas 또는 상가모(Sangamo)사의 모듈로부터 제작된 ZFN의 비교 실험(모듈 교환)을 하였다.
구체적으로, Barbas 또는 Sangamo 모듈로만 구성된 8 개의 새로운 ZFN 단위체를 준비하였고, 그들은 툴젠 모듈로만 구성된 6 개의 다른 ZFN 단위체들로 대체하였다(표 3 및 도 22 참조). 새롭게 제작된 ZFN 단위체들은 적절한 짝인 ZFN 단위체들과 쌍을 이루게 했고, 그 결과산물인 ZFN 쌍은 SSA와 T7E1 분석을 통해서 검사하였다. 도 23 및 24에서 보는 바와 같이, 새롭게 합성된 ZFN 단위체들 중 적어도 하나로 구성된 ZFN 쌍은 SSA system에서 어떤 뚜렷한 활성을 보여주지 못했다(도 23 참조). 게다가, 그들 중 어떤 ZFNs도 T7E1 분석에서 목적 유전자를 표적하는 활성을 나타내지 않았다(도 24 참조).
Figure pat00003
이러한 결과들은 본 발명의 기능적 ZF 배열(functional ZF arrays)의 모듈러 조립은 조작한 ZFs 보다 자연발생 모듈을 사용한 ZFs가 훨씬 신뢰할만한 구조를 구성한다는 것을 의미한다.
실시예 7 : 본 발명의 ZF 모듈 평가
본 발명자들이 제작한 315 개의 ZFN 쌍에 대한 통계학적 분석은 관심있는 추가적인 내재성 유전자에 대해 표적되어지는 변이를 위해 사용되어질 수 있는 새로운 ZFN을 제작하기 위한 근간으로 제공될 수 있다. 이를 위하여, 본 발명자들은 SSA 시스템 분석에서 긍정적으로 평가된 23개의 ZFN 쌍에서 각각의 ZF에 대해 발생빈도 (the number of occurrences)를 측정하였다. 그리고 나서 각각의 ZF를 위한 "활성지수(activity score)"는 전체 208 ZFN 단위체에서 모듈의 발생빈도를 가진 수를 구분함으로써 결정하였다(도 1 및 2). 예를 들어, "QNTQ"와 "RSHR"의 어떤 아주 높은 활성을 보이는 ZFs는 각각 50%와 38%의 활성지수를 가졌고, 그들의 높은 활성지수는 생체 내 부위 특이적인 뉴클레아제 활성을 예측해야 하는 때가 왔을 때 그들 모듈들이 믿을만하다는 것을 제안하고 있다. "QSNK"와 "rdae"와 같은 다른 ZFs는 본 분석에서 효력이 없는 모듈로서 존재한다는 것을 보여주었고, 활성지수는 0 (zero) 값을 나타냈다. 그들 2 종류의 ZFs는 각각 15 번 사용하였지만 그 모듈들을 포함하고 있는 ZFNs 중에 아무도 본 분석에서 활성을 보이지 않았다. 또한, 본 발명자들은 동일한 DNA 인지 특이성을 가진 ZFs의 활성지수를 비교하였다. 어떤 ZFs는 다른 표적에 상응하는 모듈보다 현저히 나았다. 예를 들면, "DSNR"과 "HSNK" 둘 다 동일한 GAC 염기서열을 인지한다. ZFNs의 구성에 있어 "DSNR" 사용은 많은 활성 뉴클레아제 (활성 지수 = 35%)를 생산하였지만, 반면에 "HSNK"의 결합은 단지 비활성 ZFNs만을 생산하였다(활성 지수 = 0%).
상기 통계학적 분석을 바탕에 두고, 미래의 유전자 편집 연구를 위해서 임의적으로 37 개의 ZFs (24 개의 툴젠 (ToolGen) 모듈, 1 개의 상가모 (Sangamo) 모듈, 12 개의 Barbas 모듈)을 사용할 수 있을 것이다(도 1 및 2 참조). 만약 본 발명자들이 실험을 진행하는데 있어서 그 37 개의 모듈만을 사용했다면, 이는 현재 비율 (24%)보다 훨씬 큰 53%의 전체적인 성공율 수치가 나오게 된다(도 26 참조). 그 37 개의 모듈 전체는 활성 ZFNs에서 적어도 한번씩은 발견되었다. 본 연구진들은 2 개 혹은 그 이상의 표적에 상응하는 ZFs가 존재하였을 때, 아주 높은 활성 지수를 가진 모듈을 선택하였다. 37 개의 ZFs는 전체적으로 3-bp sub-site를 64개 중 38개의 부위를 인식하였다. 주어진 1-kbp의 임의의 DNA 염기서열에 있어, 3-finger ZFN 다이머에는 88 [=(38/64)6 X 1000 X 2]의 잠재적인 표적 부위 (half sites 사이에 5 또는 6개의 염기서열을 가진 공간을 포함)를 예상할 수 있으며, 4-finger 다이머에는 31 개의 표적부위를 예상할 수 있다. 본 발명에 의한 방법으로 성공율을 9.1%에서 26%로 (만약 37 개의 ZFs를 사용한다면 실제 성공율은 현저하게 아주 높겠지만, 나머지는 효력이 없는 모듈로 낮은 값으로 측정됨) 가정하면, 1-kbp의 목적으로 하는 DNA 염기서열에서 평균적으로 ZFN-매개성 게놈 편집 (ZFN-mediated genome editing)은 8부위가 가능할 것이다. 이러한 결과는 대부분의 진핵생물 유전자는 본 발명의 ZFN 및 그 방법으로 표적이 가능하다는 것을 나타낸다.
상기한 징크 핑거 뉴클레아제 및 이의 용도 방법을 사용하여, 에이즈 환자들에서 HIV 감염에 저항성이 있는 T 세포를 제조하도록 CCR5 유전자를 녹아웃하는 등의 유전자 치료 등에 유용하게 사용할 수 있다.
<110> Toolgen, Inc. <120> A novel zinc finger nuclease and uses thereof <130> PA080500/KR-DIV-1 <160> 87 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 cgcggatcct gaactcctct ggatctactg 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ccgctcgagt tacacggcga tctttccgcc 30 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ctcggcctct gagctattcc 20 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 cgcggatcca caaccttcgc ttcaaaaaat 30 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gatcataggg ataacagggt aatg 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gatccattac cctgttatcc ctat 24 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ggggatccat ggattatcaa gtgtca 26 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 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<400> 21 Tyr Arg Cys Lys Tyr Cys Asp Arg Ser Phe Ser Ile Ser Ser Asn Leu 1 5 10 15 Gln Arg His Val Arg Asn Ile His 20 <210> 22 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KSNR zinc finger <400> 22 Tyr Gly Cys His Leu Cys Gly Lys Ala Phe Ser Lys Ser Ser Asn Leu 1 5 10 15 Arg Arg His Glu Met Ile His 20 <210> 23 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> QFNR zinc finger <400> 23 Tyr Lys Cys His Gln Cys Gly Lys Ala Phe Ile Gln Ser Phe Asn Leu 1 5 10 15 Arg Arg His Glu Arg Thr His 20 <210> 24 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> QNTQ zinc finger <400> 24 Tyr Thr Cys Ser Tyr Cys Gly Lys Ser Phe Thr Gln Ser Asn Thr Leu 1 5 10 15 Lys Gln His Thr Arg Ile His 20 <210> 25 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> QSHR2 zinc finger <400> 25 Tyr Lys Cys Gly Gln Cys Gly Lys Phe Tyr Ser Gln Val Ser His Leu 1 5 10 15 Thr Arg His Gln Lys Ile His 20 <210> 26 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> QSHT zinc finger <400> 26 Tyr Lys Cys Glu Glu Cys Gly Lys Ala Phe Arg Gln Ser Ser His Leu 1 5 10 15 Thr Thr His Lys Ile Ile His 20 <210> 27 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> QSHV zinc finger <400> 27 Tyr Glu Cys Asp His Cys Gly Lys Ser Phe Ser Gln Ser Ser His Leu 1 5 10 15 Asn Val His Lys Arg Thr His 20 <210> 28 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> QSNI zinc finger <400> 28 Tyr Met Cys Ser Glu Cys Gly Arg Gly Phe Ser Gln Lys Ser Asn Leu 1 5 10 15 Thr Ile His Gln Arg Thr His 20 <210> 29 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> QSNK zinc finger <400> 29 Tyr Lys Cys Glu Glu Cys Gly Lys Ala Phe Thr Gln Ser Ser Asn Leu 1 5 10 15 Thr Lys His Lys Lys Ile His 20 <210> 30 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> QSNR1 zinc finger <400> 30 Phe Glu Cys Lys Asp Cys Gly Lys Ala Phe Ile Gln Lys Ser Asn Leu 1 5 10 15 Ile Arg His Gln Arg Thr His 20 <210> 31 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> QSNV2 zinc finger <400> 31 Tyr Val Cys Ser Lys Cys Gly Lys Ala Phe Thr Gln Ser Ser Asn Leu 1 5 10 15 Thr Val His Gln Lys Ile His 20 <210> 32 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> QSSR1 zinc finger <400> 32 Tyr Lys Cys Pro Asp Cys Gly Lys Ser Phe Ser Gln Ser Ser Ser Leu 1 5 10 15 Ile Arg His Gln Arg Thr His 20 <210> 33 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> QSTR zinc finger <400> 33 Tyr Lys Cys Glu Glu Cys Gly Lys Ala Phe Asn Gln Ser Ser Thr Leu 1 5 10 15 Thr Arg His Lys Ile Val His 20 <210> 34 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> QTHQ zinc finger <400> 34 Tyr Glu Cys His Asp Cys Gly Lys Ser Phe Arg Gln Ser Thr His Leu 1 5 10 15 Thr Gln His Arg Arg Ile His 20 <210> 35 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> QTHR1 zinc finger <400> 35 Tyr Glu Cys His Asp Cys Gly Lys Ser Phe Arg Gln Ser Thr His Leu 1 5 10 15 Thr Arg His Arg Arg Ile His 20 <210> 36 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RDER1 zinc finger <400> 36 Tyr Val Cys Asp Val Glu Gly Cys Thr Trp Lys Phe Ala Arg Ser Asp 1 5 10 15 Glu Leu Asn Arg His Lys Lys Arg His 20 25 <210> 37 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RDER2 <400> 37 Tyr His Cys Asp Trp Asp Gly Cys Gly Trp Lys Phe Ala Arg Ser Asp 1 5 10 15 Glu Leu Thr Arg His Tyr Arg Lys His 20 25 <210> 38 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RDHR1 zinc finger <400> 38 Phe Leu Cys Gln Tyr Cys Ala Gln Arg Phe Gly Arg Lys Asp His Leu 1 5 10 15 Thr Arg His Met Lys Lys Ser His 20 <210> 39 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RDHT zinc finger <400> 39 Phe Gln Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu 1 5 10 15 Lys Thr His Thr Arg Thr His 20 <210> 40 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RDKR zinc finger <400> 40 Tyr Val Cys Asp Val Glu Gly Cys Thr Trp Lys Phe Ala Arg Ser Asp 1 5 10 15 Lys Leu Asn Arg His Lys Lys Arg His 20 25 <210> 41 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RSHR zinc finger <400> 41 Tyr Lys Cys Met Glu Cys Gly Lys Ala Phe Asn Arg Arg Ser His Leu 1 5 10 15 Thr Arg His Gln Arg Ile His 20 <210> 42 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RSNR zinc finger <400> 42 Tyr Ile Cys Arg Lys Cys Gly Arg Gly Phe Ser Arg Lys Ser Asn Leu 1 5 10 15 Ile Arg His Gln Arg Thr His 20 <210> 43 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VDYK zinc finger <400> 43 Phe His Cys Gly Tyr Cys Glu Lys Ser Phe Ser Val Lys Asp Tyr Leu 1 5 10 15 Thr Lys His Ile Arg Thr His 20 <210> 44 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VSNV zinc finger <400> 44 Tyr Glu Cys Asp His Cys Gly Lys Ala Phe Ser Val Ser Ser Asn Leu 1 5 10 15 Asn Val His Arg Arg Ile His 20 <210> 45 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VSSR zinc finger <400> 45 Tyr Thr Cys Lys Gln Cys Gly Lys Ala Phe Ser Val Ser Ser Ser Leu 1 5 10 15 Arg Arg His Glu Thr Thr His 20 <210> 46 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VSTR zinc finger <400> 46 Tyr Glu Cys Asn Tyr Cys Gly Lys Thr Phe Ser Val Ser Ser Thr Leu 1 5 10 15 Ile Arg His Gln Arg Ile His 20 <210> 47 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> WSNR zinc finger <400> 47 Tyr Arg Cys Glu Glu Cys Gly Lys Ala Phe Arg Trp Pro Ser Asn Leu 1 5 10 15 Thr Arg His Lys Arg Ile His 20 <210> 48 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rdnq zinc finger <400> 48 Phe Ala Cys Pro Glu Cys Pro Lys Arg Phe Met Arg Ser Asp Asn Leu 1 5 10 15 Thr Gln His Ile Lys Thr His 20 <210> 49 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> dghr zinc finger <400> 49 Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Asp Pro Gly His Leu 1 5 10 15 Val Arg His Gln Arg Thr His 20 <210> 50 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> dgnv zinc finger <400> 50 Phe Gln Cys Arg Ile Cys Met Arg Asn Phe Ser Asp Ser Gly Asn Leu 1 5 10 15 Arg Val His Ile Arg Thr His 20 <210> 51 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> sadr zinc finger <400> 51 Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Ser Pro Ala Asp Leu 1 5 10 15 Thr Arg His Gln Arg Thr His 20 <210> 52 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tldr zinc finger <400> 52 Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Thr His Leu Asp Leu 1 5 10 15 Ile Arg His Gln Arg Thr His 20 <210> 53 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> eshe zinc finger <400> 53 Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Glu Arg Ser His Leu 1 5 10 15 Arg Glu His Gln Arg Thr His 20 <210> 54 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> httn zinc finger <400> 54 Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser His Arg Thr Thr Leu 1 5 10 15 Thr Asn His Gln Arg Thr His 20 <210> 55 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rdev zinc finger <400> 55 Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Arg Arg Asp Glu Leu 1 5 10 15 Asn Val His Gln Arg Thr His 20 <210> 56 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> skae zinc finger <400> 56 Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Ser Lys Lys Ala Leu 1 5 10 15 Thr Glu His Gln Arg Thr His 20 <210> 57 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rdne zinc finger <400> 57 Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Arg Ala Asp Asn Leu 1 5 10 15 Thr Glu His Gln Arg Thr His 20 <210> 58 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tgne zinc finger <400> 58 Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Thr Ser Gly Asn Leu 1 5 10 15 Thr Glu His Gln Arg Thr His 20 <210> 59 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> thse zinc finger <400> 59 Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Thr Ser His Ser Leu 1 5 10 15 Thr Glu His Gln Arg Thr His 20 <210> 60 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> skhe zinc finger <400> 60 Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Ser Lys Lys His Leu 1 5 10 15 Ala Glu His Gln Arg Thr His 20 <210> 61 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rdte zinc finger <400> 61 Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Arg Asn Asp Thr Leu 1 5 10 15 Thr Glu His Gln Arg Thr His 20 <210> 62 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tnse zinc finger <400> 62 Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Thr Lys Asn Ser Leu 1 5 10 15 Thr Glu His Gln Arg Thr His 20 <210> 63 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hghe zinc finger <400> 63 Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser His Thr Gly His Leu 1 5 10 15 Leu Glu His Gln Arg Thr His 20 <210> 64 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> srta zinc finger <400> 64 Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Ser Arg Arg Thr Cys 1 5 10 15 Arg Ala His Gln Arg Thr His 20 <210> 65 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> qste zinc finger <400> 65 Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Gln Asn Ser Thr Leu 1 5 10 15 Thr Glu His Gln Arg Thr His 20 <210> 66 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rdae zinc finger <400> 66 Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Arg Asn Asp Ala Leu 1 5 10 15 Thr Glu His Gln Arg Thr His 20 <210> 67 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tgae zinc finger <400> 67 Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Thr Thr Gly Ala Leu 1 5 10 15 Thr Glu His Gln Arg Thr His 20 <210> 68 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rdnt zinc finger <400> 68 Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Arg Glu Asp Asn Leu 1 5 10 15 His Thr His Gln Arg Thr His 20 <210> 69 <211> 339 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Z891R4 <400> 69 Met Val Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Glu Leu Pro Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile Arg Ile Pro Gly Glu Lys Pro Tyr Lys 20 25 30 Cys Met Glu Cys Gly Lys Ala Phe Asn Arg Arg Ser His Leu Thr Arg 35 40 45 His Gln Arg Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Arg Cys Lys Tyr Cys 50 55 60 Asp Arg Ser Phe Ser Ile Ser Ser Asn Leu Gln Arg His Val Arg Asn 65 70 75 80 Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Arg Cys Lys Tyr Cys Asp Arg Ser 85 90 95 Phe Ser Ile Ser Ser Asn Leu Gln Arg His Val Arg Asn Ile His Thr 100 105 110 Gly Glu Lys Pro Tyr Thr Cys Ser Tyr Cys Gly Lys Ser Phe Thr Gln 115 120 125 Ser Asn Thr Leu Lys Gln His Thr Arg Ile His Thr Gly Glu Lys Gln 130 135 140 Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys Lys Ser Glu Leu Arg His Lys 145 150 155 160 Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile Glu Leu Ile Glu Ile Ala Arg 165 170 175 Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu Met Lys Val Met Glu Phe Phe 180 185 190 Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys His Leu Gly Gly Ser Arg Lys 195 200 205 Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly Ser Pro Ile Asp Tyr Gly Val 210 215 220 Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly Gly Tyr Asn Leu Pro Ile Gly 225 230 235 240 Gln Ala Asp Glu Met Gln Arg Tyr Val Glu Glu Asn Gln Thr Arg Asn 245 250 255 Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp Trp Lys Val Tyr Pro Ser Ser Val 260 265 270 Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser Gly His Phe Lys Gly Asn Tyr 275 280 285 Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn His Ile Thr Asn Cys Asn Gly Ala 290 295 300 Val Leu Ser Val Glu Glu Leu Leu Ile Gly Gly Glu Met Ile Lys Ala 305 310 315 320 Gly Thr Leu Thr Leu Glu Glu Val Arg Arg Lys Phe Asn Asn Gly Glu 325 330 335 Ile Asn Phe <210> 70 <211> 337 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Z891F4 <400> 70 Met Val Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Glu Leu Pro Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile Arg Ile Pro Gly Glu Lys Pro Phe Ala 20 25 30 Cys Pro Glu Cys Pro Lys Arg Phe Met Arg Ser Asp Asn Leu Thr Gln 35 40 45 His Ile Lys Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Lys Cys His Gln Cys 50 55 60 Gly Lys Ala Phe Ile Gln Ser Phe Asn Leu Arg Arg His Glu Arg Thr 65 70 75 80 His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Met Glu Cys Gly Lys Ala Phe 85 90 95 Asn Arg Arg Ser His Leu Thr Arg His Gln Arg Ile His Thr Gly Glu 100 105 110 Lys Pro Tyr Ser Cys Gly Ile Cys Gly Lys Ser Phe Ser Asp Ser Ser 115 120 125 Ala Lys Arg Arg His Cys Ile Leu His Thr Gly Glu Lys Gln Leu Val 130 135 140 Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys Lys Ser Glu Leu Arg His Lys Leu Lys 145 150 155 160 Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile Glu Leu Ile Glu Ile Ala Arg Asn Ser 165 170 175 Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu Met Lys Val Met Glu Phe Phe Met Lys 180 185 190 Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys His Leu Gly Gly Ser Arg Lys Pro Asp 195 200 205 Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly Ser Pro Ile Asp Tyr Gly Val Ile Val 210 215 220 Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly Gly Tyr Asn Leu Pro Ile Gly Gln Ala 225 230 235 240 Asp Glu Met Gln Arg Tyr Val Glu Glu Asn Gln Thr Arg Asn Lys His 245 250 255 Ile Asn Pro Asn Glu Trp Trp Lys Val Tyr Pro Ser Ser Val Thr Glu 260 265 270 Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser Gly His Phe Lys Gly Asn Tyr Lys Ala 275 280 285 Gln Leu Thr Arg Leu Asn His Ile Thr Asn Cys Asn Gly Ala Val Leu 290 295 300 Ser Val Glu Glu Leu Leu Ile Gly Gly Glu Met Ile Lys Ala Gly Thr 305 310 315 320 Leu Thr Leu Glu Glu Val Arg Arg Lys Phe Asn Asn Gly Glu Ile Asn 325 330 335 Phe <210> 71 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> yqrl zinc finger <400> 71 His Ile Cys His Ile Gln Gly Cys Gly Lys Val Tyr Gly Gln Arg Ser 1 5 10 15 Asn Leu Val Arg His Leu Arg Trp His 20 25 <210> 72 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> yrsl zinc finger <400> 72 His Ile Cys His Ile Gln Gly Cys Gly Lys Val Tyr Gly Arg Ser Asp 1 5 10 15 Ala Leu Thr Arg His Leu Arg Trp His 20 25 <210> 73 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rtqn zinc finger <400> 73 Phe Met Cys Thr Trp Ser Tyr Cys Gly Lys Arg Phe Thr Gln Ser Gly 1 5 10 15 Asn Leu Ala Arg His Lys Arg Thr His 20 25 <210> 74 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tsgv zinc finger <400> 74 Met Cys Thr Trp Ser Tyr Cys Gly Lys Arg Phe Thr Thr Ser Gly Asn 1 5 10 15 Leu Val Arg His Lys Arg Thr His 20 <210> 75 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tanr zinc finger <400> 75 Phe Ala Cys Pro Glu Cys Pro Lys Arg Phe Met Thr Ser Ala Asn Leu 1 5 10 15 Ser Arg His Ile Lys Thr His 20 <210> 76 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rdhr zinc finger <400> 76 Phe Ala Cys Pro Glu Cys Pro Lys Arg Phe Met Arg Ser Asp His Leu 1 5 10 15 Ser Arg His Ile Lys Thr His 20 <210> 77 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rdkr zinc finger <400> 77 Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Arg Ser Asp Lys Leu 1 5 10 15 Val Arg His Gln Arg Thr His 20 <210> 78 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> qsnr zinc finger <400> 78 Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Gln Ser Ser Asn Leu 1 5 10 15 Val Arg His Gln Arg Thr His 20 <210> 79 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tgnr zinc finger <400> 79 Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Thr Ser Gly Asn Leu 1 5 10 15 Val Arg His Gln Arg Thr His 20 <210> 80 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> dgnr zinc finger <400> 80 Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Asp Pro Gly Asn Leu 1 5 10 15 Val Arg His Gln Arg Thr His 20 <210> 81 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rder zinc finger <400> 81 Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Arg Ser Asp Glu Leu 1 5 10 15 Val Arg His Gln Arg Thr His 20 <210> 82 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tger zinc finger <400> 82 Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Thr Ser Gly Glu Leu 1 5 10 15 Val Arg His Gln Arg Thr His 20 <210> 83 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> qaha zinc finger <400> 83 Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Gln Leu Ala His Leu 1 5 10 15 Arg Ala His Gln Arg Thr His 20 <210> 84 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> qssa zinc finger <400> 84 Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Gln Lys Ser Ser Leu 1 5 10 15 Ile Ala His Gln Arg Thr His 20 <210> 85 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> qgne zinc finger <400> 85 Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Gln Ser Gly Asn Leu 1 5 10 15 Thr Glu His Gln Arg Thr His 20 <210> 86 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> qgha zinc finger <400> 86 Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Gln Ala Gly His Leu 1 5 10 15 Ala Ser His Gln Arg Thr His 20 <210> 87 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rdht zinc finger <400> 87 Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Arg Ser Asp His Leu 1 5 10 15 Thr Thr His Gln Arg Thr His 20

Claims (16)

  1. 징크 핑거 도메인 및 뉴클레오티드 절단 도메인을 포함하고 뉴클레아제 활성을 갖는 융합 단백질로서,
    상기 징크 핑거 도메인은 뉴클레오티드 서열에 결합하는 3개 이상의 징크 핑거 모듈을 조립하여 공학적으로 제조된 것이고,
    상기 징크 핑거 모듈 중 1 이상은 자연계에 존재하는 야생형 징크 핑거 모듈인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 징크 핑거 도메인은 3 또는 4개의 징크 핑거 모듈을 포함하는 것인 융합 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 상기 징크 핑거 모듈은 도 1에 기재된 모듈 중의 어느 하나인 융합 단백질.
  4. 제1항에 있어서, 이량체 형태로 작용하여 뉴클레오티드 서열을 절단하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  5. 제4항에 있어서, 표 2에 기재된 것 중의 어느 하나인 융합 단백질.
  6. 제1항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 절단 도메인은 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제로부터 나온 절단 도메인인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 융합 단백질을 1쌍 이상 포함하는, 표적 영역 내 뉴클레오티드 서열의 절단, 교체 또는 변경을 위한 키트.
  8. 제7항에 있어서, 상기 융합 단백질 쌍은 동일 또는 상이한 징크 핑거 도메인을 갖는 것을 특징으로 하는 키트.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된, 뉴클레아제 활성을 가진 융합 단백질을 제조하는 방법으로서,
    (a) 관심영역 내 뉴클레오티드 서열을 선택하는 단계;
    (b) 상기 서열에 결합하는 징크 핑거 모듈을 선택하고 3개 이상의 징크 핑거 모듈을 조립하되, 상기 징크 핑거 모듈 중 1 이상은 자연계에 존재하는 야생형 징크 핑거 모듈로부터 나온 것을 사용하여 징크 핑거 도메인을 공학적으로 제조하는 단계;
    (c) 상기 징크 핑거 도메인과 뉴클레오티드 절단 도메인을 포함하는 융합단백질을 발현시키는 단계를 포함하는, 융합 단백질 제조 방법.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 융합 단백질을 사용하여, 관심 영역 내 뉴크레오티드 서열을 절단하는 단계를 포함하는 관심 영역 내 뉴클레오티드 절단 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    제1융합 단백질 및 제2융합 단백질을 사용하고; 제1융합단백질은 제1징크 핑거 도메인 및 제1뉴클레오티드 절단 도메인을 포함하며; 제2융합단백질은 제2징크 핑거 도메인 및 제2뉴클레오티드 절단 도메인을 포함하고; 제1융합단백질이 제1뉴클레오티드 서열에 결합할 때, 제2융합단백질은 제1뉴클레오티드 서열로부터 2 내지 50 뉴클레오티드만큼 떨어져 있는 제2뉴클레오티드 서열과 결합하는 것이 특징인 뉴클레오티드 절단 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 제1 및 제2 뉴클레오티드 서열 사이에서 절단이 이루어지는 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드 절단 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 제1 및 제2 뉴클레오티드 절단 도메인은 동일한 엔도뉴클레아제에서 나온 것임을 특징으로 하는 뉴클레오티드 절단 방법.
  14. 관심 영역 내의 제1 뉴클레오티드 서열 교체 방법으로서,
    (a) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 제1융합 단백질 및 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 제2융합 단백질을 사용하여 제1 뉴클레오티드 서열을 절단하는 단계로서
    제1융합 단백질은 제1징크 핑거 도메인 및 제1뉴클레오티드 절단 도메인을 포함하며; 9개 이상의 뉴클레오티드를 갖는 제2 뉴클레오티드 서열에 결합하도록 제1징크 핑거 도메인이 공학적으로 제조된 것이고
    제2융합 단백질은 제2징크 핑거 도메인 및 제2뉴클레오티드 절단 도메인을 포함하며; 제2 뉴클레오티드 서열로부터 2 내지 50 뉴클레오티드만큼 떨어져 위치하며 9개 이상의 뉴클레오티드를 갖는 제3 뉴클레오티드 서열에 결합하도록 제2징크 핑거 도메인이 공학적으로 제조된 것인 단계;
    (b) 상기 제1 뉴클레오티드 서열과 동일하지는 않은 제4 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 첨가하는 단계를 포함하며;
    상기 제1융합 단백질과 상기 제2뉴클레오티드 서열의 결합 및 상기 제2융합 단백질과 상기 제3뉴클레오티드 서열의 결합에 의해 관심 영역 내 제1 뉴클레오티드 서열이 절단되고, 이로 인해 상기 제1 뉴클레오티드 서열과 상기 제4 뉴클레오티드 서열 사이의 상동성 재조합을 용이하게 하여 상기 제1 뉴클레오티드 서열을 상기 제4 뉴클레오티드 서열로 교체하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 관심 영역 내의 제1 뉴클레오티드 서열 변경 방법으로서,
    제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 제1융합 단백질 및 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 제2융합 단백질을 사용하여 제1 뉴클레오티드 서열을 절단하는 단계를 포함하며,
    제1융합 단백질은 제1징크 핑거 도메인 및 제1뉴클레오티드 절단 도메인을 포함하며; 9개 이상의 뉴클레오티드를 갖는 제2 뉴클레오티드 서열에 결합하도록 제1징크 핑거 도메인이 공학적으로 제조된 것이고,
    제2융합 단백질은 제2징크 핑거 도메인 및 제2뉴클레오티드 절단 도메인을 포함하며; 제2 뉴클레오티드 서열로부터 2 내지 50 뉴클레오티드만큼 떨어져 위치하며 9개 이상의 뉴클레오티드를 갖는 제3 뉴클레오티드 서열에 결합하도록 제2징크 핑거 도메인이 공학적으로 제조된 것이고,
    상기 제1융합 단백질과 상기 제2뉴클레오티드 서열의 결합 및 상기 제2융합 단백질과 상기 제3뉴클레오티드 서열의 결합에 의해 관심 영역 내 절단되고, 이로 인해 상기 절단 부위 내 제1 뉴클레오티드 서열을 변경하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드.

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